CN113230394A

CN113230394A - 一种用于牛病毒性腹泻的rna疫苗及其构建方法

Info

Publication number: CN113230394A
Application number: CN202110483584.2A
Authority: CN
Inventors: 刘昕; 赖强; 王弋; 吴培枫; 陈怡林; 谢汝祝; 彭小珍
Original assignee: Guangzhou Yuanbo Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Yuanbo Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2021-04-30
Filing date: 2021-04-30
Publication date: 2021-08-10
Anticipated expiration: 2041-04-30
Also published as: CN113230394B

Abstract

本发明属于RNA疫苗的技术领域，具体涉及一种用于牛病毒性腹泻的RNA疫苗及其构建方法。所述RNA疫苗为采用包括5’UTR、牛病毒性腹泻病毒的E2蛋白、终止密码子、3’UTR以及polyA核酸的序列构成；采用脂质纳米颗粒包裹的RNA疫苗能够快速应对当前流行野毒株的BVDV新毒株，尤其是变异强毒株，所述纳米脂质颗粒包括BHEM‑Chol、PEG_5k‑b‑PLGA_11k、PLGA_11k聚合物的混合物；本发明制备的牛病毒性腹泻病毒RNA疫苗减少了新疫苗开发的研发及生产周期，为防控BVDV的爆发提供有效的技术手段；所述RNA疫苗可做到无细胞生产、且生产时无需导入有毒化学品，RNA疫苗的安全性较高。

Description

一种用于牛病毒性腹泻的RNA疫苗及其构建方法

技术领域

本发明属于RNA疫苗的技术领域，具体涉及一种用于牛病毒性腹泻的RNA疫苗及其构建方法。

背景技术

牛病毒性腹泻粘膜病有牛病毒性腹泻黏膜病病毒(BVDV)引起，该病普遍存在于世界各地的牛群中，牛病毒性腹泻病毒主要侵害牛，尤其是犊牛，引起以腹泻(急性感染症状)和黏膜病(慢性持续性感染症状)为临床特征的疾病，给养牛业带来的主要影响有腹泻、黏膜病、持续感染、免疫抑制等，并伴随严重的经济损失。1968年，科学家正式将由BVDV引起的疾病被命名为牛病毒性腹泻-黏膜病(Bovine viral diarrhea-Mucosal disease，BVD/MD)。BVDV除感染牛外，还可感染牛、鹿、羊、骆驼及其他野生动物，宿主相当广泛。既能水平传播也能垂直传播，公牛精液也有病毒存在，感染病毒的怀孕母牛以消化道溃疡为特征。世界动物卫生组织将BVD/MD列为必须上报疫病之一，我国进出口检疫定为二类传染病。我国上个世纪80年代报道分离到该病毒，随着我国养牛数量的增加和饲养方式的转变，我国养牛业受该病威胁增大。

BVDV属于黄病毒科瘟病毒属，含有单股正链RNA。BVDV分为2个基因型，分别为BVDV1和BVDV2，在抗原性上BVDV1和BVDV2有所不同，BVDV1型疫苗可诱导针对BVDV2型病毒的抗体，但抗体滴度要比同源病毒抗体滴度平均低1个log值。BVDV基因组上的大开放阅读框编码所有的病毒蛋白，它本身翻译为一个包含所有病毒蛋白的蛋白多聚体，其蛋白顺序为：N^pro-C-E^rns-E1-E2-P7-NS2/3-NS4A-NS4B-NS5a-NS5b，该多聚蛋白再由宿主细胞和病毒自身的多种蛋白酶进行裂解加工成结构蛋白和非结构蛋白。其中，E2蛋白是最重要的糖蛋白，具有重要的免疫调节结构，拥有可被宿主免疫系统识别的中和表位，是最主要的免疫原。而E2蛋白由于其免疫原性最强和良好的适应性，已经成为目前研究新型BVDV疫苗的首选。

牛病毒性腹泻粘膜病是全球性传染病，具有较高的感染率，我国二十几个省市自治区均存在本病，且在各易感动物群中的感染已呈日益扩大趋势，结合BVDV的毒株有高度的变异性及流行毒株的多样性的情况，使得很多市场上的疫苗失去保护效果，加大了防控的难度。临床上急需能够快速应对当前流行野毒株的BVDV新毒株疫苗。

现有疫苗的制备技术主要为弱毒苗、灭活苗。我国学者制备BVD弱毒冻干苗，选用Oregon C24V标准毒株作为毒株，但其副作用较大及成本较高等因素均未能投入生产。BVDV致病机理复杂，目前国内批准了相应的疫苗和药物，农业部公告第2411号(2016.06.01)和第2422号(2016.07.14)分别批准了牛病毒性腹泻黏膜病(1型)灭活疫苗(NM01株)和牛病毒性腹泻黏膜病-传染性鼻气管炎二联灭活疫苗(NMG株+LY株)。

随着基因工程技术和分子生物学技术的发展，人们开始把注意力转移到亚单位疫苗(E2蛋白)、活载体疫苗(禽痘病毒、水疱性口炎病毒、牛3型腺病毒和牛疱疹病毒Ⅰ型中的一种新型疫苗)及核酸疫苗等新型基因工程疫苗上。核酸疫苗是目前疫苗研究的新趋势并且具有许多优点。近年来，BVDV-E2基因疫苗是BVDV疫苗的研究的一个热门。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种用于牛病毒性腹泻的RNA疫苗及其构建方法，选取牛源的5’UTR、3’UTR与毒株的E2蛋白、终止密码子、polyA核酸序列串联，得到RNA疫苗，采用脂质纳米颗粒作为RNA疫苗的运送载体，所制备的脂质纳米颗粒包裹RNA疫苗能够快速应对当前流行野毒株的BVDV新毒株。

本发明的技术内容如下：

本发明提供了一种用于牛病毒性腹泻的RNA疫苗，所述RNA疫苗为采用包括5’UTR、牛病毒性腹泻病毒的E2蛋白、终止密码子、3’UTR以及polyA核酸的序列构成；

所述疫苗还包括纳米脂质颗粒，所述纳米脂质颗粒包裹RNA疫苗，所述纳米脂质颗粒包括BHEM-Chol、PEG_5k-b-PLGA_11k、PLGA_11k聚合物的混合物；

所述5’UTR、3’UTR的序列选取自牛源的牛血红蛋白或牛白蛋白，所选序列的同源性在50％～100％。

所述5’UTR、3’UTR分别选自七组不同的牛血红蛋白或牛血清白蛋白，其核酸序列分别为序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的七组；

所述5’UTR、3’UTR的七组序列选自GenBank中NCBI参考序列NM_001077422.3、NM_173917.2、NM_001014902.4、NM_001083768.2、NM_001110507.1、XM_024975648.1、NM_180992.2；

所述牛病毒性腹泻病毒的E2蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.15所示，其核酸序列如序列表SEQ ID NO.16所示；

所述RNA疫苗的核酸序列包括如序列表SEQ ID NO.17～23所示；

所述所述终止密码子，为TGA、TAA、TAG的自由组合，个数为1-10个；

所述polyA中的碱基A的个数为1-200个。

本发明还提供了一种用于牛病毒性腹泻的RNA疫苗的构建方法，包括如下步骤：

选取5’UTR、3’UTR、E2蛋白、终止密码子、polyA核酸序列合成RNA疫苗的核酸序列构建于载体上，转染到细菌得到重组菌，将重组菌进行质粒提取得到重组质粒，将重组质粒进行酶切、转录、纯化得到RNA疫苗核酸，所述RNA疫苗的核酸序列如序列表SEQ ID NO.17～23所示；

所述RNA疫苗包括由脂质纳米颗粒载体包裹，所述脂质纳米颗粒的制备原料包括聚合物PEG_5k-b-PLGA_11k、PLGA_11k和BHEM-Chol；

所述脂质纳米颗粒包裹RNA疫苗的操作为：将RNA疫苗核酸溶液与BHEM-Chol、PEG_5k-b-PLGA_11k、PLGA_11k混合，超声得到油相-水相的初乳液，加入无核酸酶水再超声乳化得到水相-油相-水相的复乳液，将复乳液中的有机溶液去除，浓缩，即得到脂质纳米颗粒包裹的RNA疫苗；

所述RNA疫苗核酸溶液为RNA疫苗核酸使用无核酸酶水溶解得到；

所述BHEM-Chol、PEG_5k-b-PLGA_11k、PLGA_11k使用之前分别溶于色谱级三氯甲烷溶液中。

本发明的有益效果如下：

本发明的用于牛病毒性腹泻的RNA疫苗，能够高效迅速地针对当下流行野毒株的BVDV新毒株，所得RNA疫苗成本低、生产效率高，且能同时诱导细胞免疫与体液免疫，所制备的脂质纳米颗粒包裹RNA疫苗能够快速应对当前流行野毒株的BVDV新毒株，尤其是变异强毒株，减少了新疫苗开发的研发及生产周期，为防控BVDV的爆发提供有效的技术手段；

本发明的用于牛病毒性腹泻的RNA疫苗的构建，选取牛源的5’UTR、3’UTR与毒株的E2蛋白、终止密码子、polyA核酸序列串联，得到RNA疫苗，采用脂质纳米颗粒作为RNA疫苗的运送载体，且脂质纳米颗粒包裹RNA疫苗的使用能够高效表达，利用了纳米脂质体作为载体进行递送，脂质纳米颗粒具有核酸包封率高，能够有效转染，组织穿透性增强，细胞毒性和免疫原性低等特点，所述RNA疫苗可做到无细胞生产、且生产时无需导入有毒化学品，受微生物污染的机会也相对较低，RNA疫苗的安全性相对较高。

附图说明

图1为转录纯化后的RNA疫苗的凝胶电泳图；

图2为脂质体颗粒包裹RNA疫苗的体外表达试验SDS-PAGE以及Western blot结果图；

图3为脂质体颗粒包裹RNA疫苗的抗体水平检测结果图；

图4为脂质体颗粒包裹RNA疫苗中和抗体滴度的测定结果图。

具体实施方式

以下通过具体的实施案例以及附图说明对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。

若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。

实施例

一种用于牛病毒性腹泻的RNA疫苗及其构建：

1)重组菌构建：

选取5’UTR、3’UTR、E2蛋白(BVDV(1型)中的Oregon C24V经典毒株E2蛋白(GenBank：L07496.1))、终止密码子、polyA核酸序列进行人工合成RNA疫苗的DNA于pUC57载体上，无缝克隆于pUC57的EcoRV酶切位点，并转化大肠杆菌DH5α，获得BVDV-E2-pUC57-DH5α；

所述E2蛋白可选用来自BVDV(2型)的，也可以是E2蛋白中的一段氨基酸序列或具有50-100％同源性的氨基酸序列，操作与上相同，在此不作重复赘述；

2)重组质粒

将获得的重组菌进行摇菌，按照常规方法提取质粒，参照质粒抽提试剂盒(

Plasmid MiniprEppendorf Kit I)说明书进行：

取菌液于1.5mL Ep管中12000r/min离心30s，弃上清；

加250μL溶液Ⅰ/RNase A，充分重悬菌泥；

加250μL溶液Ⅱ，颠倒4～6次混匀，室温作用2min至溶液变成澄清；

加350μL溶液Ⅲ，颠倒4～6次混匀以形成白色沉淀，12000r/min离心10min；

转移上清至DNA吸附柱中，室温静置2min，12000r/min离心1min，弃液；

加入500μL的Buffer HB，12000r/min离心1min，弃液；

加入750μL的DNA Wash Buffer，12000r/min离心1min，弃液；

重复该步骤一次，再空管12000r/min离心1min；

移至新的1.5mLEp管中，加入50～100μL的TE室温下放置2min，12000r/min离心1min，洗脱的质粒于-20℃保存备用，取少量于1.0％琼脂糖凝胶中低压电泳检测质粒效果。

3)酶切线性化、纯化

对重组质粒进行QuickCut MluI酶切，酶切反应体系见表1，如下：

表1酶切反应体系

将上述成分加入0.5mL的EP管中，混匀，37℃酶切15min。纯化试剂盒进行纯化回收线性化重组质粒。

根据OMEGA公司的Cycle-pure纯化试剂盒使用说明书，线性化质粒进行纯化回收，方法如下：

(1)将线性化质粒收集在一个1.5ml的EP管中；

(2)加入6倍体积的Buffer CP于装有PCR产物的EP管中，小心混匀；

(3)将上述混合液全部加至试剂盒配的有滤膜的管HiBind spin-column中，10000r/min离心1min，弃去离心出来的溶液；

(4)加入700μLSPW Buffer，等待2～3min，10000r/min离心1min，弃去离心出来的溶液；

(5)重复步骤(4)；

(6)空管10000r/min离心1min；

(8)弃去下面的离心管，将柱子放入新的干净的1.5mL离心管中，在柱子中央加入50μL DNA Elution Buffer，室温下放置2min，10000r/min离心1min，收集离心管中的液体即为回收的DNA片段，经琼脂糖凝胶电泳检测后即用或-20℃冰箱保存备用。提高洗脱液的温度至55℃～80℃，有利于提高DNA的洗脱效率。

4)体外转录

采用体外转录试剂盒(mMESSAGE mMACHINE^TMT7 ULTRA Transcription Kit)对线性化的质粒进行体外转录。

5)纯化

采用纯化试剂盒(MEGA clear^TMTranscription Clean-Up Kit)对转录的产物进行纯化处理，即得RNA疫苗(mRNA)。

取来自牛血红蛋白或牛血清白蛋白的参考序列NM_001077422.3、NM_173917.2、NM_001014902.4、NM_001083768.2、NM_001110507.1、XM_024975648.1、NM_180992.2序列的非翻译区的七组5’UTR、3’UTR，按照以上5个步骤制备成RNA疫苗核酸，纯化之后的RNA疫苗核酸进行1％琼脂凝胶电泳鉴定，如图1所示。

6)脂质纳米颗粒的制备

6.1)将-80℃冰箱保存的聚合物PEG_5k-b-PLGA_11k，PLGA_11k和BHEM-Chol取出，平衡到室温后在干燥环境下开封，分别以61.5mg/mL，39.0mg/mL和21.5mg/mL的浓度溶于色谱级三氯甲烷溶液中；

6.2)将-80℃冰箱保存的mRNA溶液在冰上融化，使用无核酸酶水(DEPC水)调整其浓度为4mg/mL，在50mL无菌离心管中，依次加入25μL mRNA(0.1mg)，100μL BHEM-Chol(2mg)，350μL PEG_5k-b-PLGA_11k(21.875mg)和50μL PLGA_11k(1.925mg)；

6.3)将该离心管置于冰水中，超声探头用DEPC水冲洗后放入离心管的溶液中，在80W功率和冰水浴条件下，以超声5s停2s的方式超声乳化溶液60s，得到油相-水相的初乳液。随后，将5mLDEPC水沿管壁加入到初乳液中，并在同样条件下，以超声10s停2s的方式再次乳化60s，形成水相-油相-水相的复乳液；

6.4)将复乳液转移到DEPC处理并高压过的无菌无核酸酶100mL圆底烧瓶中，使用旋转蒸发仪在低温条件下缓慢地减压旋蒸以除去乳液中的三氯甲烷，并浓缩其水溶液体积到1mL左右，制备好的脂质纳米颗粒包裹的mRNA转移到1.5mL EP管中保存于4C冰箱中待用。

7)检测细胞转染后的BVDV-E2-mRNA脂质体表达情况：

1、取24孔板，接种PK-15细胞(200000个细胞/孔)，采用含10％血清无抗培养基培养18小时；

2、当细胞贴壁融合度约达60％时，在转染前一小时更换为无血清的Opti-MEM培养基，转染脂质纳米颗粒BVDV-E2-mRNA(1μg RNA/孔)，培养6小时；

3、将培养基替换为新鲜的培养基，培养42小时。

4、1000g离心10min，收集上清液。

取上清液，进行非还原型SDS-PAGE，然后进行Western blot。Western blot采用的一抗为抗E2蛋白的鼠源单克隆抗体，二抗为抗鼠源抗体。

如图2所示，表明脂质纳米颗粒BVDV-E2-mRNA能够在PK-15细胞上高效表达，本发明所制备的用于牛病毒性腹泻的RNA疫苗具有良好的应用前景。

8)BVDV-S-mRNA疫苗免疫小鼠及其抗体的测定

将6-8周龄雄性BALB/c小鼠随机分为5组(每组5只)：BVDV-E2-mRNA1组、BVDV-E2-mRNA2组、BVDV-E2-mRNA3组、BVDV-E2-mRNA4组、BVDV-E2-mRNA5组、BVDV-E2-mRNA6组、BVDV-E2-mRNA7组、商品灭活疫苗组及PBS空白对照组。采用肌内免疫，试验第1天进行初次免疫，试验第28天进行加强免疫，BVDV-E2-mRNA中的各组组每次免疫剂量相同，均为20g，体积为200L，商品灭活疫苗组注射剂量也为200L、PBS空白注射组注射等体积的PBS(pH7.2，0.01M)。分别在二免14天后进行尾部采血，收集血清，用间接ELISA法测定抗体水平。如图3所示，结果显示BVDV-E2-mRNA1、BVDV-E2-mRNA2、BVDV-E2-mRNA3、BVDV-E2-mRNA4、BVDV-E2-mRNA5、BVDV-E2-mRNA6、BVDV-E2-mRNA7实验组产生的抗体水平高于商品化的灭活疫苗。

9)5、血清中和试验中中和效价及抗体滴度的测定

对第42d的血清进行血清中和试验，结果显示BVDV-E2-mRNA1、BVDV-E2-mRNA2、BVDV-E2-mRNA3、BVDV-E2-mRNA4、BVDV-E2-mRNA5、BVDV-E2-mRNA6、BVDV-E2-mRNA7实验组及商品化灭活疫苗组的中和抗体效价均显著高于PBS对照组。其中BVDV-E2-mRNA1组、BVDV-E2-mRNA2组、BVDV-E2-mRNA3组、BVDV-E2-mRNA4、BVDV-E2-mRNA5、BVDV-E2-mRNA6、BVDV-E2-mRNA7实验组中的中和抗体效价与灭活疫苗组相当，如下表所示：

表2疫苗的中和效价表

如图4可见，抗体滴度测定试验中BVDV-E2-mRNA1、BVDV-E2-mRNA2、BVDV-E2-mRNA3、BVDV-E2-mRNA4、BVDV-E2-mRNA5、BVDV-E2-mRNA6、BVDV-E2-mRNA7实验组及商品化灭活疫苗组中和抗体滴度均高于2⁴，表面本发明制备的牛病毒性腹泻RNA疫苗可以起到很好的保护作用，为BVDV的防控提供了有效的技术手段。

序列表

<110> 广州源博医药科技有限公司

<120> 一种用于牛病毒性腹泻的RNA疫苗及其构建方法

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> Sequence Artificial

<400> 1

actcttctgg tccagaccca gactctgaga gaacccacc 39

<210> 2

<211> 95

<212> DNA

<213> Sequence Artificial

<400> 2

gctggagcct cggcgacccc taccctggcc tggagccccc ttgcgctctg cgcactctca 60

cctcctgatc tttgaataaa gtctgagtgg gctgc 95

<210> 3

<211> 52

<212> DNA

<213> Sequence Artificial

<400> 3

acacttgctt ctgacacaac cgtgttcact agcaactaca caaacagaca cc 52

<210> 4

<211> 124

<212> DNA

<213> Sequence Artificial

<400> 4

gctccctttc ctgctttcca ggaaaggttt tttcatcctc agagcccaaa gattgaatat 60

ggaaaaatta tgaagtgttt tgagcatctg gcctctgcct aataaagaca tttattttca 120

ttgc 124

<210> 5

<211> 55

<212> DNA

<213> Sequence Artificial

<400> 5

cttacacttg cttctgacac aaccgtgttc actagcaact acacaaacag acacc 55

<210> 6

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<212> DNA

<213> Sequence Artificial

<400> 6

gctccccttc ctgattttca ggaaaggtct tttcatcctc agagcccaaa aactgaatat 60

ggaaaaatta tgaagcgttt tgtgcatctt gcctctgcct aataaagaca tttattttca 120

ttgcactggt gtattt 136

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> Sequence Artificial

<400> 7

ggcccctaaa gcacgccacg ccagcgtc 28

<210> 8

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<212> DNA

<213> Sequence Artificial

<400> 8

gttccgtgcc ccgcgggtct aggtctgcga aattcaataa acaggcctca gtaggctgg 59

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<212> DNA

<213> Sequence Artificial

<400> 9

aaaggccaca gcatccagca gcagcacaga cttgcttctg atgcttctgt gatcacctgt 60

aagctccaca acttgacatc 80

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<212> DNA

<213> Sequence Artificial

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atcctctttt caattcacca ttttgtgtcc ccagtgcctc ccttctgccc ttggggactg 60

gggtttggcc ttgagagccc agcttctgtt taataaagta cattctattc agtgatc 117

<210> 11

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<212> DNA

<213> Sequence Artificial

<400> 11

acaaccgtgt tcaccagcaa ctacacaaac agacacc 37

<210> 12

<211> 62

<212> DNA

<213> Sequence Artificial

<400> 12

gctccccttc ctgatttcca ggaaaggcct tttcatcctc agagcccaaa aactgaatat 60

gg 62

<210> 13

<211> 32

<212> DNA

<213> Sequence Artificial

<400> 13

atcttttcta tcaaccccaa aactttggca ca 32

<210> 14

<211> 187

<212> DNA

<213> Sequence Artificial

<400> 14

acacgacaca cactcaaggc atctcagcct acctgagagt aagagaaaag agaatgaaac 60

tagagcttat catctgtttt cttttctgtt gagtagttaa accaacactc tcactactaa 120

agaataaact ttaatatttt tgcgcttctt ttgttgttgc tacaattaat aaaaaatgaa 180

aagatct 187

<210> 15

<211> 351

<212> PRT

<213> Sequence Artificial

<400> 15

Met Val Gln Gly Ile Leu Trp Leu Leu Leu Ile Thr Gly Val Gln Gly

1 5 10 15

His Leu Asp Cys Lys Pro Glu Tyr Ser Tyr Ala Ile Ala Lys Ser Asp

20 25 30

Arg Ile Gly Leu Gln Gly Ala Glu Asp Leu Thr Thr Val Trp Lys Asp

35 40 45

Tyr Ser His Gly Met Thr Leu Glu Asp Thr Met Val Ile Ala Trp Cys

50 55 60

Lys Asp Gly Lys Leu Thr Tyr Tyr Ala Arg Cys Thr Arg Glu Thr Arg

65 70 75 80

Tyr Leu Ala Ile Leu His Ser Arg Ala Leu Pro Thr Ser Val Val Phe

85 90 95

Lys Lys Leu Phe Glu Gly Gln Gly Gln Glu Asp Thr Val Glu Met Asp

100 105 110

Asp Asn Phe Glu Phe Gly Leu Cys Pro Cys Asp Ala Lys Pro Ile Val

115 120 125

Arg Gly Thr Tyr Asn Thr Thr Leu Leu Asn Gly Pro Ala Phe Gln Met

130 135 140

Val Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly Thr Val Ser Cys Met Leu Ala Asn

145 150 155 160

Arg Asp Thr Leu Asp Thr Ala Val Val Arg Thr Tyr Arg Arg Ser Arg

165 170 175

Pro Phe Pro Tyr Arg Gln Gly Cys Ile Thr Gln Lys Thr Leu Gly Glu

180 185 190

Asp Leu Tyr Asp Cys Ile Leu Gly Gly Asn Trp Thr Cys Val Thr Gly

195 200 205

Asp Gln Leu Gln Tyr Thr Gly Gly Ser Val Glu Ser Cys Lys Trp Cys

210 215 220

Gly Phe Lys Phe Gln Lys Ser Glu Gly Leu Pro His Tyr Pro Ile Gly

225 230 235 240

Lys Cys Arg Leu Lys Asn Glu Thr Gly Tyr Arg Phe Val Asp Gly Thr

245 250 255

Ser Cys Asn Arg Glu Gly Val Ala Ile Val Pro Gln Gly Leu Val Lys

260 265 270

Cys Lys Ile Gly Asp Thr Ile Val Gln Val Ile Ala Leu Asp Thr Lys

275 280 285

Leu Gly Pro Met Pro Cys Lys Pro Tyr Glu Ile Ile Pro Ser Glu Gly

290 295 300

Pro Val Glu Lys Thr Ala Cys Thr Phe Asn Tyr Thr Arg Thr Leu Lys

305 310 315 320

Asn Lys Tyr Phe Glu Pro Arg Asp Ser Tyr Phe Gln Gln Tyr Met Leu

325 330 335

Lys Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp Phe Asp Leu Glu Val Thr Asp His

340 345 350

<210> 16

<211> 1053

<212> DNA

<213> Sequence Artificial

<400> 16

atggtacagg gcatcctatg gctactactg ataacaggag tgcaggggca cctagactgc 60

aaacctgaat actcatatgc catagccaag agtgatagaa ttggcctaca aggagctgaa 120

gaccttacta ctgtttggaa ggattactca catggaatga cactggaaga cacaatggtc 180

atagcatggt gcaaagatgg taagttaaca tattatgcaa ggtgcactag ggaaaccaga 240

tatcttgcaa ttttgcattc aagagcctta ccgaccagtg tggtattcaa aaaacttttc 300

gaggggcaag ggcaagagga cacagtcgaa atggatgaca actttgaatt tggactctgc 360

ccatgcgatg ccaaacccat agtaagaggg acttacaata caacactgct aaacggacca 420

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agagacaccc tagacacagc agtagtacgg acgtatagaa ggtccagacc attcccttat 540

aggcaaggct gtattaccca aaagaccctg ggggaggatc tctatgactg tattcttgga 600

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tgcaagtggt gtggttttaa attccaaaaa agtgagggac taccacacta ccccattggc 720

aagtgtaggt tgaagaacga gactggctac agattcgtgg atggtacctc ttgcaacaga 780

gaaggtgtgg ccatagtgcc acaaggactg gtaaagtgta agataggaga cacaattgta 840

caggtcatag ctcttgacac caaacttggg cctatgcctt gcaagccata tgagatcata 900

ccaagcgagg ggcctgtgga aaagacggcg tgcaccttca actacacaag gacattgaaa 960

aataaatatt ttgagcccag agacagttac ttccaacaat atatgctaaa aggagagtat 1020

caatactggt ttgacctgga ggtcactgac cat 1053

<210> 17

<211> 1266

<212> DNA

<213> Sequence Artificial

<400> 17

actcttctgg tccagaccca gactctgaga gaacccacca tggtacaggg catcctatgg 60

ctactactga taacaggagt gcaggggcac ctagactgca aacctgaata ctcatatgcc 120

atagccaaga gtgatagaat tggcctacaa ggagctgaag accttactac tgtttggaag 180

gattactcac atggaatgac actggaagac acaatggtca tagcatggtg caaagatggt 240

aagttaacat attatgcaag gtgcactagg gaaaccagat atcttgcaat tttgcattca 300

agagccttac cgaccagtgt ggtattcaaa aaacttttcg aggggcaagg gcaagaggac 360

acagtcgaaa tggatgacaa ctttgaattt ggactctgcc catgcgatgc caaacccata 420

gtaagaggga cttacaatac aacactgcta aacggaccag ccttccagat ggtatgcccc 480

ataggttgga cagggactgt gagctgtatg ttagctaata gagacaccct agacacagca 540

gtagtacgga cgtatagaag gtccagacca ttcccttata ggcaaggctg tattacccaa 600

aagaccctgg gggaggatct ctatgactgt attcttggag gaaactggac ttgtgtaact 660

ggggaccaac tacaatacac aggaggctct gttgaatctt gcaagtggtg tggttttaaa 720

ttccaaaaaa gtgagggact accacactac cccattggca agtgtaggtt gaagaacgag 780

actggctaca gattcgtgga tggtacctct tgcaacagag aaggtgtggc catagtgcca 840

caaggactgg taaagtgtaa gataggagac acaattgtac aggtcatagc tcttgacacc 900

aaacttgggc ctatgccttg caagccatat gagatcatac caagcgaggg gcctgtggaa 960

aagacggcgt gcaccttcaa ctacacaagg acattgaaaa ataaatattt tgagcccaga 1020

gacagttact tccaacaata tatgctaaaa ggagagtatc aatactggtt tgacctggag 1080

gtcactgacc attgataata agctggagcc tcggcgaccc ctaccctggc ctggagcccc 1140

cttgcgctct gcgcactctc acctcctgat ctttgaataa agtctgagtg ggctgcaaaa 1200

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260

aaaaaa 1266

<210> 18

<211> 1305

<212> DNA

<213> Sequence Artificial

<400> 18

acacttgctt ctgacacaac cgtgttcact agcaactaca caaacagaca ccatggtaca 60

gggcatccta tggctactac tgataacagg agtgcagggg cacctagact gcaaacctga 120

atactcatat gccatagcca agagtgatag aattggccta caaggagctg aagaccttac 180

tactgtttgg aaggattact cacatggaat gacactggaa gacacaatgg tcatagcatg 240

gtgcaaagat ggtaagttaa catattatgc aaggtgcact agggaaacca gatatcttgc 300

aattttgcat tcaagagcct taccgaccag tgtggtattc aaaaaacttt tcgaggggca 360

agggcaagag gacacagtcg aaatggatga caactttgaa tttggactct gcccatgcga 420

tgccaaaccc atagtaagag ggacttacaa tacaacactg ctaaacggac cagccttcca 480

gatggtatgc cccataggtt ggacagggac tgtgagctgt atgttagcta atagagacac 540

cctagacaca gcagtagtac ggacgtatag aaggtccaga ccattccctt ataggcaagg 600

ctgtattacc caaaagaccc tgggggagga tctctatgac tgtattcttg gaggaaactg 660

gacttgtgta actggggacc aactacaata cacaggaggc tctgttgaat cttgcaagtg 720

gtgtggtttt aaattccaaa aaagtgaggg actaccacac taccccattg gcaagtgtag 780

gttgaagaac gagactggct acagattcgt ggatggtacc tcttgcaaca gagaaggtgt 840

ggccatagtg ccacaaggac tggtaaagtg taagatagga gacacaattg tacaggtcat 900

agctcttgac accaaacttg ggcctatgcc ttgcaagcca tatgagatca taccaagcga 960

ggggcctgtg gaaaagacgg cgtgcacctt caactacaca aggacattga aaaataaata 1020

ttttgagccc agagacagtt acttccaaca atatatgcta aaaggagagt atcaatactg 1080

gtttgacctg gaggtcactg accattgatg agctcccttt cctgctttcc aggaaaggtt 1140

ttttcatcct cagagcccaa agattgaata tggaaaaatt atgaagtgtt ttgagcatct 1200

ggcctctgcc taataaagac atttattttc attgcaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1305

<210> 19

<211> 1320

<212> DNA

<213> Sequence Artificial

<400> 19

cttacacttg cttctgacac aaccgtgttc actagcaact acacaaacag acaccatggt 60

acagggcatc ctatggctac tactgataac aggagtgcag gggcacctag actgcaaacc 120

tgaatactca tatgccatag ccaagagtga tagaattggc ctacaaggag ctgaagacct 180

tactactgtt tggaaggatt actcacatgg aatgacactg gaagacacaa tggtcatagc 240

atggtgcaaa gatggtaagt taacatatta tgcaaggtgc actagggaaa ccagatatct 300

tgcaattttg cattcaagag ccttaccgac cagtgtggta ttcaaaaaac ttttcgaggg 360

gcaagggcaa gaggacacag tcgaaatgga tgacaacttt gaatttggac tctgcccatg 420

cgatgccaaa cccatagtaa gagggactta caatacaaca ctgctaaacg gaccagcctt 480

ccagatggta tgccccatag gttggacagg gactgtgagc tgtatgttag ctaatagaga 540

caccctagac acagcagtag tacggacgta tagaaggtcc agaccattcc cttataggca 600

aggctgtatt acccaaaaga ccctggggga ggatctctat gactgtattc ttggaggaaa 660

ctggacttgt gtaactgggg accaactaca atacacagga ggctctgttg aatcttgcaa 720

gtggtgtggt tttaaattcc aaaaaagtga gggactacca cactacccca ttggcaagtg 780

taggttgaag aacgagactg gctacagatt cgtggatggt acctcttgca acagagaagg 840

tgtggccata gtgccacaag gactggtaaa gtgtaagata ggagacacaa ttgtacaggt 900

catagctctt gacaccaaac ttgggcctat gccttgcaag ccatatgaga tcataccaag 960

cgaggggcct gtggaaaaga cggcgtgcac cttcaactac acaaggacat tgaaaaataa 1020

atattttgag cccagagaca gttacttcca acaatatatg ctaaaaggag agtatcaata 1080

ctggtttgac ctggaggtca ctgaccattg atgagctccc cttcctgatt ttcaggaaag 1140

gtcttttcat cctcagagcc caaaaactga atatggaaaa attatgaagc gttttgtgca 1200

tcttgcctct gcctaataaa gacatttatt ttcattgcac tggtgtattt aaaaaaaaaa 1260

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320

<210> 20

<211> 1216

<212> DNA

<213> Sequence Artificial

<400> 20

ggcccctaaa gcacgccacg ccagcgtcat ggtacagggc atcctatggc tactactgat 60

aacaggagtg caggggcacc tagactgcaa acctgaatac tcatatgcca tagccaagag 120

tgatagaatt ggcctacaag gagctgaaga ccttactact gtttggaagg attactcaca 180

tggaatgaca ctggaagaca caatggtcat agcatggtgc aaagatggta agttaacata 240

ttatgcaagg tgcactaggg aaaccagata tcttgcaatt ttgcattcaa gagccttacc 300

gaccagtgtg gtattcaaaa aacttttcga ggggcaaggg caagaggaca cagtcgaaat 360

ggatgacaac tttgaatttg gactctgccc atgcgatgcc aaacccatag taagagggac 420

ttacaataca acactgctaa acggaccagc cttccagatg gtatgcccca taggttggac 480

agggactgtg agctgtatgt tagctaatag agacacccta gacacagcag tagtacggac 540

gtatagaagg tccagaccat tcccttatag gcaaggctgt attacccaaa agaccctggg 600

ggaggatctc tatgactgta ttcttggagg aaactggact tgtgtaactg gggaccaact 660

acaatacaca ggaggctctg ttgaatcttg caagtggtgt ggttttaaat tccaaaaaag 720

tgagggacta ccacactacc ccattggcaa gtgtaggttg aagaacgaga ctggctacag 780

attcgtggat ggtacctctt gcaacagaga aggtgtggcc atagtgccac aaggactggt 840

aaagtgtaag ataggagaca caattgtaca ggtcatagct cttgacacca aacttgggcc 900

tatgccttgc aagccatatg agatcatacc aagcgagggg cctgtggaaa agacggcgtg 960

caccttcaac tacacaagga cattgaaaaa taaatatttt gagcccagag acagttactt 1020

ccaacaatat atgctaaaag gagagtatca atactggttt gacctggagg tcactgacca 1080

ttgatgagtt ccgtgccccg cgggtctagg tctgcgaaat tcaataaaca ggcctcagta 1140

ggctggaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200

aaaaaaaaaa aaaaaa 1216

<210> 21

<211> 1326

<212> DNA

<213> Sequence Artificial

<400> 21

aaaggccaca gcatccagca gcagcacaga cttgcttctg atgcttctgt gatcacctgt 60

aagctccaca acttgacatc atggtacagg gcatcctatg gctactactg ataacaggag 120

tgcaggggca cctagactgc aaacctgaat actcatatgc catagccaag agtgatagaa 180

ttggcctaca aggagctgaa gaccttacta ctgtttggaa ggattactca catggaatga 240

cactggaaga cacaatggtc atagcatggt gcaaagatgg taagttaaca tattatgcaa 300

ggtgcactag ggaaaccaga tatcttgcaa ttttgcattc aagagcctta ccgaccagtg 360

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actttgaatt tggactctgc ccatgcgatg ccaaacccat agtaagaggg acttacaata 480

caacactgct aaacggacca gccttccaga tggtatgccc cataggttgg acagggactg 540

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ggtccagacc attcccttat aggcaaggct gtattaccca aaagaccctg ggggaggatc 660

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caggaggctc tgttgaatct tgcaagtggt gtggttttaa attccaaaaa agtgagggac 780

taccacacta ccccattggc aagtgtaggt tgaagaacga gactggctac agattcgtgg 840

atggtacctc ttgcaacaga gaaggtgtgg ccatagtgcc acaaggactg gtaaagtgta 900

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gcaagccata tgagatcata ccaagcgagg ggcctgtgga aaagacggcg tgcaccttca 1020

actacacaag gacattgaaa aataaatatt ttgagcccag agacagttac ttccaacaat 1080

atatgctaaa aggagagtat caatactggt ttgacctgga ggtcactgac cattgatgaa 1140

tcctcttttc aattcaccat tttgtgtccc cagtgcctcc cttctgccct tggggactgg 1200

ggtttggcct tgagagccca gcttctgttt aataaagtac attctattca gtgatcaaaa 1260

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320

aaaaaa 1326

<210> 22

<211> 1228

<212> DNA

<213> Sequence Artificial

<400> 22

acaaccgtgt tcaccagcaa ctacacaaac agacaccatg gtacagggca tcctatggct 60

actactgata acaggagtgc aggggcacct agactgcaaa cctgaatact catatgccat 120

agccaagagt gatagaattg gcctacaagg agctgaagac cttactactg tttggaagga 180

ttactcacat ggaatgacac tggaagacac aatggtcata gcatggtgca aagatggtaa 240

gttaacatat tatgcaaggt gcactaggga aaccagatat cttgcaattt tgcattcaag 300

agccttaccg accagtgtgg tattcaaaaa acttttcgag gggcaagggc aagaggacac 360

agtcgaaatg gatgacaact ttgaatttgg actctgccca tgcgatgcca aacccatagt 420

aagagggact tacaatacaa cactgctaaa cggaccagcc ttccagatgg tatgccccat 480

aggttggaca gggactgtga gctgtatgtt agctaataga gacaccctag acacagcagt 540

agtacggacg tatagaaggt ccagaccatt cccttatagg caaggctgta ttacccaaaa 600

gaccctgggg gaggatctct atgactgtat tcttggagga aactggactt gtgtaactgg 660

ggaccaacta caatacacag gaggctctgt tgaatcttgc aagtggtgtg gttttaaatt 720

ccaaaaaagt gagggactac cacactaccc cattggcaag tgtaggttga agaacgagac 780

tggctacaga ttcgtggatg gtacctcttg caacagagaa ggtgtggcca tagtgccaca 840

aggactggta aagtgtaaga taggagacac aattgtacag gtcatagctc ttgacaccaa 900

acttgggcct atgccttgca agccatatga gatcatacca agcgaggggc ctgtggaaaa 960

gacggcgtgc accttcaact acacaaggac attgaaaaat aaatattttg agcccagaga 1020

cagttacttc caacaatata tgctaaaagg agagtatcaa tactggtttg acctggaggt 1080

cactgaccat tgatgagctc cccttcctga tttccaggaa aggccttttc atcctcagag 1140

cccaaaaact gaatatggaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1228

<210> 23

<211> 1348

<212> DNA

<213> Sequence Artificial

<400> 23

atcttttcta tcaaccccaa aactttggca caatggtaca gggcatccta tggctactac 60

tgataacagg agtgcagggg cacctagact gcaaacctga atactcatat gccatagcca 120

agagtgatag aattggccta caaggagctg aagaccttac tactgtttgg aaggattact 180

cacatggaat gacactggaa gacacaatgg tcatagcatg gtgcaaagat ggtaagttaa 240

catattatgc aaggtgcact agggaaacca gatatcttgc aattttgcat tcaagagcct 300

taccgaccag tgtggtattc aaaaaacttt tcgaggggca agggcaagag gacacagtcg 360

aaatggatga caactttgaa tttggactct gcccatgcga tgccaaaccc atagtaagag 420

ggacttacaa tacaacactg ctaaacggac cagccttcca gatggtatgc cccataggtt 480

ggacagggac tgtgagctgt atgttagcta atagagacac cctagacaca gcagtagtac 540

ggacgtatag aaggtccaga ccattccctt ataggcaagg ctgtattacc caaaagaccc 600

tgggggagga tctctatgac tgtattcttg gaggaaactg gacttgtgta actggggacc 660

aactacaata cacaggaggc tctgttgaat cttgcaagtg gtgtggtttt aaattccaaa 720

aaagtgaggg actaccacac taccccattg gcaagtgtag gttgaagaac gagactggct 780

acagattcgt ggatggtacc tcttgcaaca gagaaggtgt ggccatagtg ccacaaggac 840

tggtaaagtg taagatagga gacacaattg tacaggtcat agctcttgac accaaacttg 900

ggcctatgcc ttgcaagcca tatgagatca taccaagcga ggggcctgtg gaaaagacgg 960

cgtgcacctt caactacaca aggacattga aaaataaata ttttgagccc agagacagtt 1020

acttccaaca atatatgcta aaaggagagt atcaatactg gtttgacctg gaggtcactg 1080

accattgatg aacacgacac acactcaagg catctcagcc tacctgagag taagagaaaa 1140

gagaatgaaa ctagagctta tcatctgttt tcttttctgt tgagtagtta aaccaacact 1200

ctcactacta aagaataaac tttaatattt ttgcgcttct tttgttgttg ctacaattaa 1260

taaaaaatga aaagatctaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1348

Claims

1.一种用于牛病毒性腹泻的RNA疫苗，其特征在于，所述RNA疫苗为采用包括5’UTR、牛病毒性腹泻病毒的E2蛋白、终止密码子、3’UTR以及polyA核酸的序列构成。

2.由权利要求1所述的用于牛病毒性腹泻的RNA疫苗，其特征在于，所述疫苗还包括纳米脂质颗粒，所述纳米脂质颗粒包裹RNA疫苗。

3.由权利要求1所述的用于牛病毒性腹泻的RNA疫苗，其特征在于，所述5’UTR、3’UTR的序列选取自牛源的牛血红蛋白或牛白蛋白，所选序列的同源性在50％～100％。

4.由权利要求1所述的用于牛病毒性腹泻的RNA疫苗，其特征在于，所述5’UTR、3’UTR包括七组序列，其核酸序列分别为序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的七组。

5.由权利要求1所述的用于牛病毒性腹泻的RNA疫苗，其特征在于，所述RNA疫苗的核酸序列包括如序列表SEQ ID NO.17～23所示。

6.由权利要求1所述的用于牛病毒性腹泻的RNA疫苗，其特征在于，所述终止密码子，为TGA、TAA、TAG的自由组合，个数为1-10个。

7.由权利要求1所述的用于牛病毒性腹泻的RNA疫苗，其特征在于，所述polyA中的碱基A的个数为1-200个。

8.一种权利要求1～7任一项所述的用于牛病毒性腹泻的RNA疫苗的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：选取5’UTR、3’UTR、E2蛋白、终止密码子、polyA核酸序列合成RNA疫苗的核酸序列构建于载体上，转染到细菌得到重组菌，将重组菌进行质粒提取得到重组质粒，将重组质粒进行酶切、转录、纯化得到RNA疫苗核酸。

9.由权利要求8所述的用于牛病毒性腹泻的RNA疫苗的构建方法，其特征在于，所述RNA疫苗包括由脂质纳米颗粒载体包裹，所述脂质纳米颗粒的制备原料包括聚合物PEG_5k-b-PLGA_11k、PLGA_11k和BHEM-Chol。

10.由权利要求8所述的用于牛病毒性腹泻的RNA疫苗的构建方法，其特征在于，所述脂质纳米颗粒包裹RNA疫苗的操作为：将RNA疫苗核酸溶液与BHEM-Chol、PEG_5k-b-PLGA_11k、PLGA_11k混合，超声得到油相-水相的初乳液，加入无核酸酶水再超声乳化得到水相-油相-水相的复乳液，将复乳液中的有机溶液去除，浓缩，即得到脂质纳米颗粒包裹的RNA疫苗。