MX2007009124A

MX2007009124A - Metodos y dispositivos para caracterizar particulas en medios transparentes y turbios.

Info

Publication number: MX2007009124A
Application number: MX2007009124A
Authority: MX
Inventors: Enrico Gratton; Guido Motolese; Abdel Tahari
Original assignee: Univ Illinois
Priority date: 2005-01-31
Filing date: 2006-01-27
Publication date: 2007-10-08
Also published as: EP1846751A4; CN101147055A; CA2596121A1; EP1846751B1; KR20070107743A; AU2006210424A1; WO2006084283A2; WO2006084283A3; US7973294B2; BRPI0606807A2; JP2008536093A; EP1846751A2; US20090230324A1; US7528384B2; US20060256338A1

Abstract

La invencion provee metodos y dispositivos para detectar, identificar, clasificar y caracterizar particulas en una muestra fluida. Se proveen analizadores opticos que tienen un contenedor para muestra con movimiento de rotacion y/o translacion para medir las concentraciones de particulas fluorescentes presentes en concentraciones muy bajas y para caracterizar las particulas fluorescentes con base al tamano, forma, constante de difusion y/o composicion. Se proveen analizadores opticos de barrido que utilizan tecnicas de analisis de datos por reconocimientos de patron y deteccion mediante canales multiples.

Description

MÉTODOS Y DISPOSITIVOS PARA CARACTERIZAR PARTÍCULAS EN MEDIOS TRANSPARENTES Y TURBIOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención al campo de análisis de partículas. De manera más específica, la presente invención provee métodos, dispositivos y componentes de dispositivos ópticos para analizar, detectar, medir la concentración de, y clasificar partículas, incluyendo células, microorganismos, moléculas y agregados biológicamente significativos y complejos de los mismos, en medios transparentes, medios de dispersión y/o medios ópticamente opacos .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN A lo largo de las últimas décadas, los métodos de análisis ópticos han surgido como herramientas analíticas útiles y ampliamente aplicables para detectar y caracterizar componentes traza en una amplia variedad de medios. En los métodos de análisis ópticos, se provee radiación electromagnética a una muestra e interactúa con los componentes de la muestra. La interacción entre la radiación electromagnética incidente y la muestra genera radiación electromagnética dispersada, transmitida y/o emitida que es captada y detectada. Las intensidades, distribución de longitud de onda, estados de polarización, ángulos de dispersión o cualquier combinación de estas propiedades de la luz detectada provee información referente a la composición, concentración, estado físico y/o entorno químico de los componentes de la muestra. Los métodos de análisis ópticos que han demostrado ser especialmente útiles para caracterizar componentes traza incluyen técnicas de espectroscopia por absorción y por emisión, métodos de análisis por dispersión Raman y Mié, métodos de espectroscopia de resonancia magnética y técnicas de espectroscopia óptica multi-dimensional . Los métodos analíticos ópticos proveen un número de beneficios particularmente convenientes para caracterizar componentes celulares y no celulares de sistemas biológicos. Primero, los métodos analíticos ópticos se pueden aplicar a una amplia gama de sistemas biológicos y materiales biológicos, debido a que la mayoría de moléculas biológicamente significativas, tales como péptidos, oligonucleótidos y lípidos, y agregados de los mismos absorben, dispersan y/o afectan los estados de polarización de la radiación electromagnética en las regiones ultravioleta, visible e infrarrojo. Segundo, muchos métodos de análisis ópticos proveen medios selectivos y sensitivos para identificar y caracterizar materiales biológicos, particularmente los métodos que emplean técnicas de marcado óptico selectivas tales como marcado fluorescente o etiquetado en infrarrojo. Tercero, los métodos ópticos con frecuencia constituyen métodos de caracterización no destructivos, con lo cual se permite que los componentes de una muestra biológica sean analizados sin afectar en forma significativa sus actividades biológicas, composiciones o estados físicos. Cuarto, los métodos de análisis ópticos proveen detección in si tu, en tiempo real en sistemas estáticos y fluidos. Por último, la reciente disponibilidad de fotodetectores sensibles de bajo costo y fuentes ópticas estables que funcionan en las regiones ultravioleta, visible e infrarrojo del espectro electromagnético hacen que los análisis de alto rendimiento que utilizan métodos ópticos sean practicables tanto desde el punto de vista comercial como técnico. Como resultado de estos beneficios, los métodos de análisis ópticos son utilizados ampliamente para identificar, clasificar y categorizar materiales biológicos. Por ejemplo, la citometria de flujo óptica ha demostrado ser útil en una gama de diversos escenarios experimentales incluyendo aplicaciones de determinación inmunológica de fenotipo, análisis de ADN, pruebas funcionales, clasificación celular, análisis cuantitativo de particulas celulares y no celulares, y diagnóstico clínico y terapia. En citometría de flujo, se inyecta una suspensión que comprende partículas celulares y/o no celulares de interés en una corriente de fluido con un flujo más rápido, lo cual provee una envoltura alrededor de las partículas con lo cual se produce el flujo laminar. La el flujo envolvente es bombeado mucho más rápido que la muestra en un procedimiento conocido como enfocamiento hidrodinámico, lo cual reduce al minimo el taponamiento y centra en forma precisa los flujos de particulas de la muestra en un volumen de análisis pequeño. El flujo laminar continuo de las partículas segrega espacialmente las partículas de modo tal que éstas pasan a través de una región de detección óptica en la cual éstas son caracterizadas. En la región de detección óptica, las particulas interactúan, de preferencia una a la vez, con uno o más haces incidentes de radiación electromagnética, tal como luz láser que tiene una distribución de longitud de onda seleccionada, con lo cual se genera radiación electromagnética dispersada, transmitida y/o emitida que es detectada como una función del tiempo. Las mediciones ópticas típicamente utilizadas en los sistemas de citometría de flujo ópticos convencionales para caracterizar material celular incluyen intensidades de luz dispersada delantera de ángulo bajo para caracterizar el diámetro celular e intensidades de luz dispersada ortogonal para determinar la cantidad de estructuras granulares en una célula. Los métodos de detección fluorescentes son ampliamente utilizados en sistemas de citometría de flujo ópticos convencionales, particularmente en combinación con técnicas de marcado fluorescente selectivas, en las cuales las intensidades de fluorescencia correspondientes a una pluralidad de distribuciones de longitud de onda son detectadas en forma simultánea para cada partícula que pasa a través de la región de detección óptica. Las sondas marcadas y una plétora de colorantes fluorescentes, tinciones y de intercaladores ayudan en la detección de una amplia variedad de tipos celulares y componentes celulares. En algunos métodos, se utilizan anticuerpos fluorescentes para medir las densidades de receptores de superficie específicos de los analitos celulares, y por lo tanto para distinguir subpoblaciones de tipos celulares diferenciados. Los componentes intracelulares también se detectan y cuantifican en forma rutinaria utilizando sondas fluorescentes en combinación con citometría de flujo óptica, incluyendo ADN intracelular total, secuencias de nucleótido especificas en ADN o ARNm, péptidos y proteínas seleccionados y ácidos grasos libres. Por lo tanto, las técnicas de citometría de flujo ópticas permiten que se puedan distinguir células individuales con base a un número grande de parámetros, tales como su ubicación en la corriente de fluido, tamaño, cantidad de estructuras granulares, y la presencia y abundancia de marcadores detectables. Como resultado de esta capacidad, los citómetros de flujo ópticos con frecuencia se utilizan para generar un perfil diagnóstico de una población de partículas en una muestra biológica. Por ejemplo, la citometría de flujo se ha utilizado en forma efectiva para medir el decline o mantenimiento de células del sistema inmune durante el curso de tratamiento para infección de VIH y para determinar la presencia o ausencia de células de tumor para la prognosis y diagnosis de pacientes con cáncer. Aunque la citometria de flujo óptica es una técnica poderosa y versátil para identificar y caracterizar componentes de muestras biológicas, ésta tiene un número de limitaciones y deficiencias significativas. Primero, el intervalo dinámico de los citómetros de flujo ópticos convencionales con respecto al tamaño de las particulas analizadas es estrecho. Como resultado de esta limitación, con frecuencia se requiere de un número de citómetros de flujo diferentes para estudiar sistemas biológicos que comprenden una distribución de células que tienen tamaños diferentes. En segundo lugar, el funcionamiento adecuado de un citómetro de flujo requiere que no existan agregados celulares u otros restos presentes en la muestra sometida a análisis, debido a que éstos pueden bloquear o afectar en forma perjudicial las condiciones de flujo laminar de la celda de flujo. Por lo tanto, es necesario filtrar cuidadosamente las muestras y los flujos envolventes para evitar obstrucción del flujo. La filtración necesaria con frecuencia es problemática para ser efectuada en forma efectiva sin afectar las condiciones de flujo en un modo perjudicial. En tercer lugar, los citómetros de flujo convencionales comprenden instrumentación compleja que requiere de operadores altamente capacitados para el funcionamiento adecuado. La alineación y calibración de los citómetros de flujo no son tareas sencillas, y necesitan ser efectuadas con frecuencia para lograr la clasificación óptica y resolución exacta y adecuada. Cuarto, el funcionamiento correcto de un citómetro de flujo requiere que la celda de flujo se limpie frecuentemente y que la tubería se purgue y desinfecte para evitar la acumulación de y contaminación por películas biológicas. La limpieza y desinfección son particularmente importantes cuando se utilizan estos métodos para caracterizar muestras que contienen microorganismos. Quinto, la muestra bajo investigación se pierde después del análisis en muchos sistemas de citometría de flujo, y por lo tanto, no se puede someter a análisis adicionales utilizando técnicas complementarias. Esto es una desventaja significativa cuando se analizan muestras disponibles únicamente en cantidades pequeñas o muestras difíciles de obtener. Por último, el costo sustancial de los citómetros de flujo comercialmente disponibles, incluso sistemas que no tengan capacidad de clasificación celular, además de las limitaciones significativas en cuanto a su portabilidad, son desventajas que han evitado el uso generalizado de esta tecnología fuera de instituciones clínicas y de investigación grandes. Se apreciará a partir de lo anterior que actualmente existe una necesidad en la técnica respecto a métodos y dispositivos ópticos para identificar y caracterizar componentes de la muestra presentes en cantidades extremadamente bajas, particularmente componentes traza de muestras biológicas. Son necesarios métodos y dispositivos para análisis ópticos que provean un intervalo dinámico grande con respecto a la distribución de tamaño, composición y estado físico de las partículas analizadas. Además, se necesitan métodos y dispositivos para análisis ópticos sean menos susceptibles a la acumulación de y contaminación por películas biológicas que los citómetros de flujo ópticos convencionales, y que no requieran de una filtración previa problemática de las muestras sometidas a análisis. Por último, se necesitan dispositivos para análisis ópticos sencillos y portátiles para analizar muestras biológicas, que puedan ser operados por técnicos sin entrenamiento exhaustivo.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención provee métodos, dispositivos y componentes de dispositivos ópticos para analizar partículas en muestras, particularmente partículas fluorescentes presentes en abundancias bajas. La presente invención provee dispositivos de microscopía confocal de barrido y métodos de análisis para detectar, medir la concentración de, y clasificar particulas, incluyendo células, microorganismos, moléculas y agregados biológicamente significativos y complejos de los mismos, en medios transparentes, medios dispersantes y/o medios ópticamente opacos. Los métodos y dispositivos de la presente invención pueden detectar, identificar y clasificar partículas que tengan un intervalo amplio de tamaños utilizando períodos de barrido de muestra cortos (por ejemplo menores de 1 minuto aproximadamente) . Es un objetivo de la presente invención, proveer dispositivos para análisis ópticos y métodos de análisis que puedan detectar partículas presentes en las muestras en concentraciones extremadamente bajas, tales como concentraciones atomolares o menores, y clasificarlas con exactitud con respecto a las características físicas, químicas y/u ópticas. Es otro objetivo la presente invención proveer sistemas y métodos de análisis ópticos que no requieran filtración de la muestra y que no den como resultado pérdida o degradación de una muestra durante el análisis. Es incluso otro objetivo de la presente invención proveer dispositivos para análisis ópticos mecánicamente simples, mecánicamente robustos, de bajo costo, y altamente portátiles que puedan ser operados fácilmente por técnicos sin entrenamiento exhaustivo. En un aspecto, la presente invención provee analizadores ópticos y métodos para analizar particulas, tales como partículas fluorescentes, presentes en una muestra. En una modalidad de este aspecto de la presente invención, el analizador óptico comprende un contenedor por lo menos parcialmente transparente para contener la muestra que contiene las partículas; una fuente óptica para generar luz de excitación, medios para captar la fluorescencia, medios para mover el contenedor y un fotodetector. El uso de una cubeta óptica, tal como una cubeta cilindrica, como un contenedor por lo menos parcialmente transparente para contener la muestra que contiene las particulas es benéfico para algunas aplicaciones de este aspecto de la presente invención. En una modalidad, se provee a la muestra luz de excitación colimada generada por la fuente óptica, tal como un láser o una lámpara. La interacción de la luz de excitación y la muestra ocasiona que por lo menos una porción de las particulas en la muestra genere fluorescencia . Los medios para captar la fluorescencia, tal como una lente, elemento de fibra óptica reflector, microscopio confocal o guía de onda, se colocan en comunicación óptica con la muestra y se configuran de manera tal que ésta capte en forma selectiva la fluorescencia proveniente de un volumen de observación dentro de la muestra y colocada dentro del contenedor. En modalidades útiles para analizar partículas en medios turbios, el volumen de observación se coloca cercano a (por ejemplo dentro de aproximadamente 500 mieras o en algunas aplicaciones dentro de aproximadamente 200 mieras) de la pared de dicho contenedor por lo menos parcialmente transparente que contiene la muestra. Los medios para mover el contenedor están conectados en forma operativa al contenedor de modo tal que éstos puedan mover el contenedor en un modo que transporte por lo menos una porción de las partículas en la muestra a través del volumen de observación. Los medios de ejemplo para mover el contenedor útiles en algunas modalidades pueden girar y/o desplazar (por ejemplo desplazar verticalmente, desplazar horizontalmente o ambos) el contenedor en una manera que provea un volumen de observación estadísticamente independiente durante un periodo de barrido de muestra dado, y, opcionalmente, proveen medios para transportar las partículas a través del volumen de observación una partícula a la vez. El fotodetector se provee en comunicación óptica con los medios para captar la fluorescencia y pueden recibir la fluorescencia proveniente del volumen de observación, medir las intensidades de fluorescencia proveniente del volumen de observación y generar un perfil temporal de la fluorescencia. De manera opcional, se proveen una o más aberturas, tal como una ranura o pluralidad de ranuras, entre la muestra y el fotodetector para asegurar que la fluorescencia que se origina desde el volumen de observación sea detectada por el fotodetector y la fluorescencia proveniente de otras regiones del mismo no sea detectada. De manera opcional, se provee un filtro óptico de excitación entre la fuente óptica y la muestra y/o se provee un filtro óptico de emisión entre la muestra y el fotodetector. En algunas modalidades, el análisis del perfil temporal generado por el fotodetector provee una medición de la concentración, distribución de tamaño y/o distribución de brillantez de las particulas en la muestra. En una modalidad, la presente invención provee un dispositivo para análisis óptico que combina un microscopio confocal de barrido novedoso y un procesador que tiene un algoritmo de reconocimiento de patrón que puede detectar, contar y/o clasificar las partículas fluorescentes presentes a concentraciones bajas en una muestra fluida. En una modalidad de este aspecto, la presente invención provee un dispositivo para análisis óptico para determinar la concentración de partículas en una muestra fluida que comprende un contenedor por lo menos parcialmente transparente para contener la muestra fluida, una fuente óptica para generar luz de excitación, un microscopio confocal, medios para mover al contenedor que contiene la muestra, un fotodetector y un procesador que tiene un algoritmo de reconocimiento de patrón. En esta modalidad de la presente invención, el microscopio confocal se provee en comunicación óptica con la fuente óptica de manera tal que éste reciba la luz de excitación. El microscopio confocal enfoca la luz de excitación en la muestra contenida en dicho contenedor por lo menos parcialmente transparente, con lo cual ocasiona que las partículas en la muestra generen fluorescencia, y también capta la fluorescencia proveniente de un volumen de observación en la muestra. El fotodetector está provisto en comunicación óptica con el microscopio confocal, recibe por lo menos una porción de la fluorescencia proveniente del volumen de observación y mide su intensidad como una función del tiempo, con lo cual genera un perfil temporal de la fluorescencia proveniente del volumen de observación. En una modalidad, se provee una abertura confocal enfrente del fotodetector que tiene una ranura o área puntiforme que provee un volumen de observación que tiene un volumen que se selecciona a partir del intervalo de aproximadamente 1 x 102 µm3 hasta aproximadamente 1 x 108 µm3. En una modalidad, la abertura confocal es una ranura que tiene una anchura que se selecciona a partir del intervalo de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 100 mieras. Los medios para mover el contenedor están conectados en forma operativa al contenedor de modo tal que puedan mover el contenedor durante el análisis óptico. En una modalidad, los medios para mover al contenedor giran y/o trasladan el contenedor a lo largo de una trayectoria selecta durante el análisis óptico que transporta (o barre) la muestra que contiene las partículas a través del volumen de observación durante un periodo de barrido de muestra seleccionado, por ejemplo brindando rotación y/o desplazamiento del contenedor en las direcciones vertical y/u horizontal. De manera opcional, los medios para mover al contenedor hacen girar -al contenedor durante el análisis óptico, con lo cual varían en forma sistemática la orientación de las partículas sometidas a análisis con respecto al eje de propagación de la luz de excitación a medida que éstas son transportadas a través del volumen de observación. Los medios para mover al contenedor pueden proveer cualquier movimiento del contenedor, cíclico o no cíclico, que transporte en forma efectiva la muestra que contiene partículas a través del volumen de observación, hacen girar al contenedor o proveen una combinación de movimiento tanto de traslación como de rotación. En una modalidad, los medios para mover al contenedor son un motor, componentes electrónicos de conmutación y/o un mecanismo de placa giratoria excéntrica que pueda hacer girar, desplazar verticalmente y/o desplazar horizontalmente al contenedor que contiene la muestra fluida. Los medios para mover al contenedor preferidos para algunas aplicaciones proveen movimiento de rotación a una velocidad rotacional que se puede ajustar en forma selectiva, lo que provee desplazamiento vertical que tiene una trayectoria y velocidad de desplazamiento que se pueden ajustar en forma selectiva y/o provee desplazamiento horizontal que tiene una trayectoria y velocidad de desplazamiento que se puedan ajustar en forma selectiva. En una modalidad, la velocidad de desplazamiento vertical del contenedor se selecciona a través del intervalo de aproximadamente 0.01 cm/s hasta aproximadamente 5 cm/s y/o la velocidad de rotación del contenedor se selecciona a partir del intervalo de aproximadamente 0.1 revoluciones por segundo hasta aproximadamente 10 revoluciones por segundo. El procesador, tal como una computadora u otro equivalente de hardware, que tiene un algoritmo de reconocimiento de patrón está provisto en comunicación de por lo menos una via con el fotodetector para recibir una señal de salida correspondiente al perfil temporal generado por el fotodetector. La operación del algoritmo de reconocimiento de patrón analiza el perfil temporal, con lo cual se determina la concentración de partículas en la muestra. En una modalidad, el algoritmo de reconocimiento de patrón iguala los rasgos en el perfil temporal con patrones predeterminados que corresponden a las intensidades de fluorescencia dependientes del tiempo de las partículas que pasan a través del volumen de observación. Los patrones predeterminados útiles en la presente invención comprenden una distribución de intensidades como una función del tiempo, y se pueden determinar empíricamente (por ejemplo midiendo los perfiles temporales de fluorescencia correspondientes a la muestra bien caracterizada que contiene partículas fluorescentes (por ejemplo muestras que contienen glóbulos marcados en forma fluorescente)) o se puede calcular desde el inicio. Los algoritmos de reconocimiento de patrón de la presente invención pueden ser un componente de un algoritmo de filtración de datos más grande, que identifica los rasgos en un perfil temporal que corresponden a las partículas que pasan a través del volumen de observación. En algunas modalidades, los algoritmos de reconocimiento de patrón y los algoritmos para filtración de datos de la presente invención también pueden analizar perfiles temporales a través de técnicas de espectroscopia de correlación de fluorescencia y análisis de histograma de conteo de fotones. Los eventos de detección de partícula discreta se identifican estableciendo una comparación entre la amplitud y la forma de un rasgo en el perfil temporal y un patrón predeterminado. La concentración de partículas se determina calculando el número de patrones predeterminados que coinciden con los rasgos en el perfil temporal para un periodo de barrido de muestra dado. En una modalidad, esto se efectúa haciendo funcionar un algoritmo de filtro que efectúa un cálculo de mínimos cuadrados en cada punto de un vector grande. El algoritmo calcula la mejor amplitud del filtro que reduzca al minimo la chi cuadrada local, en la cual la amplitud es un multiplicador de la intensidad del filtro. La chi cuadrada se calcula ponderando la diferencia entre los datos sin tratar y el ajuste a los patrones predeterminados con la suma del nivel de ruido especificado en la ventana de ruido y una estimación de la desviación estándar que explica la raíz cuadrada del número de conteos en el punto particular del vector grande. Las concentraciones se extraen del perfil temporal analizado dividiendo el número de coincidencias entre el volumen de muestra analizado durante un periodo de barrido de muestra seleccionado, el cual se puede calcular en forma exacta con conocimiento del tamaño del volumen de observación, velocidad de movimiento del contenedor (por ejemplo, velocidad de desplazamiento vertical y horizontal) y la duración del periodo de barrido de muestra. Una característica funcional importante del análisis de datos en la presente invención utilizando reconocimiento de patrón es que éste puede corregir con exactitud respecto a cambios en la transmitancia, absorbancia y/o dispersión de fluorescencia y luz de excitación mediante una cubeta en movimiento (por ejemplo, que gire, se traslade o se desplace) que contiene la muestra sometida a análisis. En algunas modalidades, esta corrección aumenta (amounts) para corregir respecto a cambios en la fluorescencia de fondo y/o luz de excitación dispersada proveniente del volumen de observación como una función del tiempo. Por consiguiente, el análisis de reconocimiento de patrón en la presente invención incrementa la exactitud y reproducibilidad de las mediciones efectuadas utilizando una instrumentación óptica para barrido en la cual el contenedor de la muestra se mueve durante la iluminación y análisis óptico. De manera opcional, el funcionamiento del algoritmo de reconocimiento de patrón clasifica las particulas en la muestra con base a una o más características físicas tales como tamaño, forma y velocidad de difusión, propiedades ópticas tales como brillantez, y/o propiedades químicas tales como la presencia y/o abundancia de biomoléculas de interés fluorescentes y/o marcadas en forma fluorescente (por ejemplo péptidos, proteínas, lípidos, ARNm, oligonucleótidos o agregados y complejos de los mismos) . Las características del ensamble de partículas, tales como la distribución de tamaño de partícula y la distribución de brillantez, se determinan mediante análisis de las amplitudes y formas de las distribuciones de intensidad de los patrones predeterminados igualados con los rasgos en el perfil temporal. La anchura de los patrones predeterminados que coinciden con los rasgos en el perfil temporal, por ejemplo la anchura completa a la mitad del máximo, se pueden correlacionar en forma positiva con el tiempo de residencia de las partículas en el volumen de observación. De manera alternativa, se puede determinar el tamaño de las partículas que pasan a través del volumen de observación variando la anchura de un patrón preseleccionado para igualar en forma cuantitativa los rasgos en el perfil temporal. En otra modalidad, la brillantez integrada de los rasgos en el perfil temporal y/o los patrones predeterminados igualados con los rasgos en el perfil temporal provee mediciones de las características físicas, ópticas y/o químicas de las partículas, tales como el tamaño y forma de las partículas en la región de observación. El uso de un algoritmo de reconocimiento de patrón para el análisis de datos de fluorescencia es benéfico debido a que éste incrementa la sensibilidad y expande la capacidad funcional de los métodos y dispositivos de análisis ópticos de la presente invención. Primero, el uso de un algoritmo de reconocimiento de patrón permite la detección de partículas que tienen baja brillantez a concentraciones tan bajas como 10 partículas por mililitro utilizando períodos de barrido de muestra menores de un minuto. Esto provee una mejora en la sensibilidad de aproximadamente un factor de 108 en comparación con los métodos de microscopía confocal de barrido convencionales. Segundo, los algoritmos de reconocimiento de patrón de la presente invención permiten que las partículas se clasifiquen con base al tamaño con cualquier exactitud de aproximadamente 10%. Asimismo, el uso de un procesador que tiene un algoritmo de reconocimiento de patrón provee métodos de análisis de tamaño que pueden clasificar partículas con base al tamaño a través de un intervalo dinámico amplio de tamaños, tal como un intervalo de aproximadamente 250 nanómetros hasta decenas de mieras. Por último, los algoritmos de reconocimiento de patrón también proveen clasificación exacta de partícula tomando como base otros atributos de partícula importantes tales como la constante de difusión, forma, brillantez y composición. Otra ventaja de esta estrategia de análisis de datos es que los patrones predeterminados útiles para análisis a través de reconocimiento de patrón y su uso en dichos algoritmos de análisis no dependen fuertemente de la composición de la partícula o de la composición del medio en el cual están dispersas las partículas. En la presente invención, las mediciones de concentración implican identificar el número de eventos de detección de partícula y una determinación del volumen neto de muestra escudriñada durante un periodo de barrido de muestra. Los eventos de detección de partícula se identifican comparando un patrón predeterminado con un rasgo en el perfil temporal observado de fluorescencia proveniente de un volumen de observación. Los patrones predeterminados de la presente invención se pueden escalar, normalizar y/o corregir para dar cuenta de las diferencias en las velocidades de difusión y transporte de las partículas en la muestra en forma empírica o teórica con el conocimiento del tipo de partículas presentes en una muestra y las propiedades físicas, tales como densidad y fuerza iónica, del medio que contiene las partículas. Por lo tanto, las técnicas de la presente invención permiten la determinación de la concentración de partículas sin procedimientos de calibración elaborados que dependan fuertemente de la naturaleza precisa del sistema sometido a análisis. En el contexto de clasificación de partícula, los métodos y dispositivos de la presente invención emplean un procedimiento de calibración que relaciona la amplitud y forma de los patrones predeterminados igualados con los rasgos en el perfil temporal. Por ejemplo, se puede deducir el tamaño de la partícula por el tiempo que ésta toma para pasar a través del volumen confocal. En principio, dado el tamaño de la ranura, el aumento óptico y la velocidad de rotación, se puede obtener el tamaño sin una calibración a priori . Sin embargo, también se puede utilizar en la presente invención la calibración con particulas de tamaño conocido . La combinación de un microscopio confocal y medios para mover el contenedor por lo menos parcialmente transparente que contiene la muestra provee medios efectivos para transportar volúmenes sustanciales (por ejemplo mililitros) de la muestra fluida a través del volumen de observación sin requerir el uso de un sistema fluido. En el contexto de esta descripción el término barrer se refiere a conducir o transportar la muestra que contiene partículas a través de un volumen de observación de un microscopio confocal de modo tal que las particulas puedan ser detectadas y/o caracterizadas ópticamente. Además, barrer en la presente descripción también se puede referir al movimiento del contenedor transparente de modo tal que se cambie la posición de una partícula en el volumen de observación con respecto al eje óptico de la luz de excitación, por ejemplo mediante rotación del contenedor de la muestra. En una modalidad de la presente invención, el contenedor se hace girar y desplazar verticalmente en forma simultánea para proveer el barrido de la muestra sometida a análisis. El desplazamiento vertical del contenedor genera una trayectoria del contenedor que pasa las particulas a través del volumen de observación y asegura que el volumen de muestra barrido analizado durante el barrido de la muestra sea estadísticamente independiente. En el contexto de esta descripción, "independencia estadística" con respecto a los volúmenes de observación analizados mediante los dispositivos y métodos de la presente invención se refiere al hecho de que la probabilidad de observar las mismas partículas en la misma configuración durante barridos subsiguientes sea excesivamente pequeña (por ejemplo menor de 0.01%) y en algunos casos sea insignificante (por ejemplo, menor de 0.0001%). Además de transportar las partículas a través del volumen de observación, la rotación del contenedor también varía sistemáticamente la posición de las partículas con respecto al eje óptico de la luz de excitación, con lo cual se proveen medios para escudriñar la posición de las partículas durante la detección óptica. La rotación del contenedor durante el análisis óptico, por lo tanto, provee medios para caracterizar particulas como una función de la posición rotacional en la región de observación con respecto al eje de propagación de la luz de excitación. En particular, la rotación del contenedor permite que las partículas se caractericen desde una pluralidad de perspectivas ópticas (es decir, los ejes que pasan a través de la partícula) lo que provee información adicional referente al tamaño, forma y composición de las partículas. La combinación de rotación (aproximadamente 5 hasta aproximadamente 10 revoluciones por segundo) y la inversión vertical más lenta (aproximadamente 2.5 hasta 5 cm/s aproximadamente) de una cubeta cilindrica provee una trayectoria de contenedor útil para medir la concentración de partículas en una muestra a concentraciones sub-atomolares y para clasificarlas con respecto al tamaño.

El volumen neto de muestra fluida transportada a través del volumen de observación durante el análisis óptico (por ejemplo, mediante rotación, desplazamiento vertical y/o desplazamiento horizontal) depende de la longitud del periodo de barrido, y de la velocidad de movimiento del contenedor que contiene la muestra y del tamaño del volumen de observación. El tamaño del volumen de observación se controla mediante el tamaño de la abertura confocal utilizada en el microscopio confocal, particularmente el tamaño de una abertura confocal posicionada entre la muestra y el fotodetector. Volúmenes de observación más pequeños son benéficos para incrementar la relación señal a fondo y para asegurar que las partículas pasen a través del volumen de observación y se detecten una a la vez. El uso de volúmenes de observación más pequeños, sin embargo, requiere de períodos de barrido de muestra más largos para analizar volúmenes de muestra netos equivalentes como los analizados en sistemas que utilizan volúmenes de observación más grandes. Por consiguiente, la selección del volumen de observación y de los tiempos de barrido de muestra representan un intercambio en los atributos de desempeño de estos dispositivos. En algunas aplicaciones, el mejor compromiso es utilizar la abertura confocal más grande que provea la detección y caracterización exactas de las partículas de interés. Al incrementar el volumen de observación (utilizando una abertura confocal más amplia) , el volumen total barrido para un tiempo de corrida determinado es más grande. De manera alternativa, las muestras sometidas a análisis óptico se pueden diluir antes del análisis para lograr una concentración que asegure que las partículas sean transportadas a través de un volumen de detección una a la vez. La dilución de muestra también puede ser útil cuando se caracterizan partículas dispersas en medios altamente dispersantes o absorbentes. Esta combinación de componentes de dispositivo para escudriñar una muestra durante el análisis óptico provee un número de beneficios tangibles en los métodos y dispositivos de este aspecto de la presente invención. Primero, el uso de un microscopio confocal en combinación con medios para mover el contenedor de muestra provee medios para transportar las partículas a través de una región de observación al tiempo que se evita la necesidad de generar un flujo de fluido. Como resultado, la muestra sometida a análisis no requiere prefiltración exhaustiva para evitar problemas asociados con el flujo y taponamiento de la muestra, como en los sistemas de citometría de flujo ópticos. Además, la muestra nunca entra a las piezas móviles (workings) interiores del dispositivo, lo que hace que los sistemas de análisis de la presente invención sean menos susceptibles a problemas asociados con contaminación, crecimiento bacteriano y formación de bio-películas . Asimismo, la muestra no se pierde, daña o degrada durante el análisis óptico, lo cual permite que la muestra se pueda someter a análisis adicionales y complementarios después de la detección y caracterización mediante los presentes métodos. Segundo, el uso de un microscopio confocal permite el uso de volúmenes de observación muy pequeños, tan pequeños como picolitros, los cuales son útiles para asegurar que las particulas pasen a través de la región de observación una a la vez y para mejorar la relación señal a ruido. Sin embargo, el desplazamiento vertical y rotación del contenedor permite que se puedan caracterizar volúmenes grandes de muestra, tales como volúmenes de muestra iguales a 1 mililitro aproximadamente hasta 10 mililitros aproximadamente, utilizando períodos de barrido de muestra relativamente cortos, tales como periodos de barrido iguales a un 1 aproximadamente hasta 100 segundos aproximadamente. Tercero, el uso de un microscopio confocal permite que se puede seleccionar un foco de iluminación de modo tal que la región de observación se posicione relativamente cercana (por ejemplo 50 mieras aproximadamente hasta 500 mieras aproximadamente) a las paredes del contenedor que contiene la muestra. Esta característica permite que se puedan analizar en forma efectiva los componentes de medios parcialmente transparentes y/o altamente dispersantes, por ejemplo, medios turbios, utilizando los dispositivos y métodos de la presente invención. Cuarto, el uso de un microscopio confocal en combinación con medios para mover al contenedor de la muestra provee medios para transportar la muestra que contiene particulas a través de una región de observación sin requerir sistemas ópticos complejos que comprendan componentes ópticos móviles, tales como fuentes ópticas, fotodetector o espejos dicróicos de traslación. Este aspecto de la presente invención es conveniente debido a que éste provee un sistema experimental mecánicamente robusto, sencillo que no requiere realineación óptica repetida entre barridos. En otro aspecto, la presente invención provee métodos y dispositivos para detectar y medir en forma selectiva la concentración de partículas en una muestra fluida, y métodos y dispositivos de análisis óptico con capacidad de discriminación entre partículas que tengan propiedades físicas y/o propiedades químicas diferentes. En algunas modalidades de este aspecto de la presente invención, la especificidad de detección se provee tratando la muestra con una o más sondas fluorescentes, tales como colorantes fluorescentes, tintas, marcas covalentes y/o intercaladores, que se asocian selectivamente (en forma covalente o no covalente) con componentes específicos de una muestra, tales como proteínas intracelulares o intracelulares unidas a superficie, péptidos, lípidos, oligonucleótidos o cualesquiera agregados o complejos de los mismos. Por ejemplo, los métodos y dispositivos presentes son muy adecuados para análisis de muestras fluidas que han sido tratadas con una pluralidad de sondas fluorescentes diferentes, tales como fluoróforos de ácido nucleico y anticuerpos fluorescentes, que se asocian en forma selectiva con componentes diferentes de una muestra. En esta modalidad, la excitación simultánea o en forma secuencial con luz de distribuciones de longitud de onda diferentes, y la detección de fluorescencia a una pluralidad de longitudes de onda diferentes permite la detección y cuantificación discriminada de partículas en una muestra que se asocian en forma selectiva con una o más sondas fluorescentes. De manera alternativa, la especificidad de detección se provee en algunos métodos y dispositivos de la presente invención con base en las constantes de difusión de las partículas que pasan a través del volumen de observación. En estas modalidades de la presente invención, se analizan las distribuciones de intensidad de los rasgos en un perfil temporal de fluorescencia proveniente de la observación para determinar la constante de difusión asociada con una partícula detectada. Por ejemplo, en algunos casos la anchura de un rasgo en el perfil temporal o patrón predeterminado igualado con un rasgo en el perfil temporal está correlacionada positivamente con la constante de difusión o tiempo de residencia de las partículas en el volumen de observación. Debido a que tipos diferentes de partículas, tales como partículas de tamaño, forma o carga eléctrica diferentes, tienen constantes de difusión diferentes, esta capacidad funcional de la presente invención provee medios para discriminar entre tipos de partícula diferentes en una muestra. De manera alternativa, la especificidad de detección se provee en algunos métodos y dispositivos de la presente invención con base a la brillantez de partícula medida. En estas modalidades, se determinan las intensidades integradas totales de los rasgos en el perfil temporal y se utilizan para diferenciar tipos diferentes de partículas. En algunos casos, por ejemplo, este aspecto de la presente invención provee medios para distinguir partículas, tales como células o microorganismos, tomando como base la presencia y abundancia de moléculas biológicas específicas, tales como proteínas, péptidos, lípidos y oligonucleótidos, los cuales se unen selectivamente a una o más sondas fluorescentes administradas a la muestra. En otro aspecto, la presente invención provee analizadores ópticos de canales múltiples que pueden monitorear en forma simultánea y de manera independiente la fluorescencia proveniente de una pluralidad de sondas fluorescentes diferentes asociadas con las partículas transportadas a través de una región de observación. En una modalidad, se provee una pluralidad de fotodetectores, elementos para discriminación de longitud de onda y aberturas confocales correspondientes en comunicación óptica con un microscopio confocal, y una pluralidad de sondas fluorescentes que tienen diferentes longitudes de onda de excitación y/o emisión a la muestra fluida sometida a análisis. La composición de cada sonda fluorescente se selecciona de manera tal que ésta se asocie selectivamente con los materiales de interés en la muestra, por ejemplo utilizando una pluralidad de fluoróforos de ácido nucleico o anticuerpos fluorescentes diferentes que se unan selectivamente a proteínas o péptidos unidos a superficie o intracelulares diferentes. La excitación mediante luz proveniente de una o más fuentes ópticas ocasiona que las partículas marcadas con una o más sondas emitan fluorescencia. Las intensidades y distribución de longitud de onda de la fluorescencia dependen de las abundancias e identidades de las sondas fluorescentes asociadas con las particulas, y por lo tanto, se pueden utilizar para clasificar las partículas tomando como base la composición. Se provee una pluralidad de fotodetectores con elementos para discriminación de longitud de onda, tales como filtros ópticos, rejillas, prismas, monocromadores o reflectores dicróicos, de modo tal que cada uno pueda detectar la fluorescencia que se origina a partir de una sonda fluorescente seleccionada y no detecte la fluorescencia que se origina a partir de otras sondas fluorescentes asociadas con la partícula. Por consiguiente, cada fotodetector en este arreglo óptico genera de manera independiente un perfil temporal de fluorescencia proveniente del volumen de observación que corresponde a una sonda fluorescente seleccionada. Esta modalidad de la presente invención es benéfica debido a que ésta provee buena especificidad de detección, debido a que las partículas de interés se pueden marcar con más de una sonda fluorescente que emita en regiones diferentes del espectro electromagnético. El análisis de la salida de dos o más fotodetectores respecto a eventos de detección coincidentes permite la detección y cuantificación discriminada de las particulas de interés. En otro aspecto, la presente invención provee analizadores ópticos de canales múltiples en los cuales se provee una pluralidad de fotodetectores teniendo cada uno una abertura confocal con tamaño diferente (por ejemplo ranura) en comunicación óptica con el microscopio confocal. En esta modalidad, los fotodetectores detectan la luz proveniente de los volúmenes de observación que tienen volúmenes focales efectivos diferentes. Los volúmenes de observación analizados simultáneamente en la presente invención se pueden posicionar de modo tal que se traslapen, y en algunas modalidades están colocados en forma concéntrica. El análisis simultáneo de los perfiles temporales de fluorescencia para volúmenes de observación correspondientes a volúmenes focales efectivos diferentes ayuda a resolver de manera más exacta la distribución de tamaño de las partículas en la muestra debido a que el tamaño de la partícula puede cambiar el tiempo de tránsito a través de la ranura confocal. Se pueden utilizar diferentes aberturas confocales para determinar el tamaño y/o brillantez de la partícula en forma más exacta. Asimismo, se puede determinar la posición de la partícula a lo largo del eje óptico utilizando los sistemas de canales múltiples de esta modalidad. La presente invención también incluye métodos y dispositivos que emplean métodos de análisis estadístico además de, o aparte de, las técnicas de análisis de reconocimiento de patrón. En una modalidad, por ejemplo, la presente invención provee dispositivos y métodos en los cuales se analiza un perfil temporal observado a través de la operación de un algoritmo de análisis de histograma de fotones que genera un histograma de los fotones detectados. Los histogramas de conteo de fotones adquiridos utilizando este método de análisis caracterizan la distribución de amplitud de las fluctuaciones de luz fluorescente que emana del volumen de observación, y se relacionan con la distribución de probabilidad para detectar un número dado de fotones por tiempo de muestreo. Para una sola especie de partículas fluorescentes, un histograma de conteo de fotones se puede caracterizar mediante dos parámetros: el número promedio de partículas en el volumen de observación, y la brillantez de partícula, el cual se define como el número promedio de fotones detectados por tiempo de muestreo por partícula. Además, es posible utilizar el análisis de histograma de conteo de fotones para distinguir especies fluorescentes diferentes presentes en una muestra si éstas tienen magnitudes de brillantez lo suficientemente separadas. De manera alternativa, la presente invención provee dispositivos y métodos en los cuales se analiza un perfil temporal observado mediante la operación de un algoritmo de análisis de correlación de fluorescencia. Un algoritmo de análisis de correlación de fluorescencia de ejemplo de la presente invención determina la auto-correlación temporal de las fluctuaciones en fluorescencia, lo cual provee una medida de la duración temporal de las fluctuaciones de fluorescencia como una función del tiempo. Este análisis provee información relacionada con el número de moléculas en el volumen de observación, y los procesos y parámetros que determinan las fluctuaciones en la fluorescencia observada, tales como las constantes de difusión y las velocidades de difusión de las partículas detectadas . En otro aspecto, los dispositivos y métodos de análisis óptico de la presente invención tienen capacidad de control de retroalimentación de bucle cerrado con base a las señales de control derivadas de los perfiles de intensidad de fluorescencia de las partículas que pasan a través del volumen de observación. Este aspecto de la invención provee dispositivos y métodos de análisis ópticos en los cuales las partículas seleccionadas en una muestra fluida se pueden detectar y caracterizar múltiples veces. En modalidades de este aspecto de la presente invención, la muestra que contiene las particulas es transportada a través del volumen de observación mediante translación del contenedor que contiene la muestra a lo largo de una trayectoria de contenedor seleccionada. Se capta la fluorescencia proveniente de las partículas en la región de observación con lo cual se genera un perfil temporal, el cual se analiza en tiempo real mediante un procesador. El procesador tiene un algoritmo de reconocimiento de patrón para analizar el perfil temporal y está provisto en comunicación de por lo menos una vía con un controlador que puede ajustar en forma selectiva la trayectoria del contenedor en movimiento. Las características de la partícula se determinan en tiempo real mediante análisis del perfil temporal y sirven como la base de una o más señales de control provistas al controlador. En una modalidad, las señales de control se proveen al controlador lo cual indica una nueva trayectoria del contenedor que puede transportar una partícula seleccionada a través de la región de observación una multitud de veces durante un periodo de barrido de muestra. Por ejemplo, las características físicas o químicas de una partícula detectada pueden indicar que se requiere análisis óptico adicional para clasificar de manera adecuada la partícula, y por lo tanto, el procesador genera señales de control que inician una trayectoria de contenedor modificada que puede transportar la partícula de interés a través del volumen de observación, proveyendo, de esta manera, uno o más eventos de detección de partícula adicionales. La presente invención también provee sistemas de medición de partícula integrados que pueden proveer mediciones integradas de las concentraciones de las partículas introducidas a una muestra fluida sometida a análisis óptico. En este aspecto de la presente invención, el contenedor que contiene la muestra está conectado en forma operativa a los medios para introducir las partículas en la muestra. En una modalidad, por ejemplo, se provee un tubo al contenedor para burbujear gas a través de la muestra o para introducir fluidos, de manera continua o mediante goteo, antes de y/o durante el análisis óptico. Puede estar conectado al contenedor un sistema para introducción de fluido que pueda proveer gotas de liquido que contengan partículas a la muestra. En estas modalidades, las partículas se proveen sistemáticamente al contenedor, en forma continua o a tiempos discretos. El dispositivo para análisis óptico de la presente invención sondea periódicamente o en forma continua la muestra, con lo cual provee caracterización de las partículas en una muestra como una función del tiempo. En una modalidad, por ejemplo, un sistema de medición de partícula integrado de la presente invención provee mediciones de la concentración, distribución de tamaño, composición, brillantez o cualquier combinación de estas características de las partículas que se acumulan en la muestra fluida. Este aspecto de la invención es particularmente útil para detectar patógenos y/o contaminantes en muestras ambientales, tales como muestras de aire ambiental o en muestras de agua. Los métodos y dispositivos de la presente invención se pueden aplicar ampliamente al análisis óptico de partículas sometidas a emisión mediante procedimientos de fotoluminiscencia, quimioluminiscencia y o electroluminiscencia en un volumen de observación de un microscopio confocal. Por ejemplo, los dispositivos y métodos de la presente invención son útiles para identificar, clasificar y/o determinar la concentración de partículas que puedan ser sometidas a quimioluminiscencia y/o bioluminiscencia . En estos aspectos de la presente invención, se capta, se detecta y analiza la emisión proveniente de las partículas que pasan a través del volumen de observación de un microscopio confocal, sin la necesidad de proveer luz de excitación a la muestra. La fluorescencia en los presentes métodos puede ser excitada por procedimientos de absorción de un solo fotón o mediante procedimientos de absorción de fotones múltiples. Una ventaja provista por el uso de excitación mediante fotones múltiples en los métodos de la presente invención, tal como esquemas de excitación con dos fotones, es que se puede captar, detectar y analizar la fluorescencia proveniente de volúmenes de observación muy pequeños que tienen intensidades de luz de excitación lo suficientemente grandes para generar absorción apreciable de fotones múltiples . Los métodos y dispositivos de la presente invención son útiles para caracterizar muestras que comprenden una amplia variedad de materiales incluyendo, pero sin limitarse a, líquidos, coloides, dispersiones, suspensiones, emulsiones, soles y mezclas. Los métodos y dispositivos de la presente invención son útiles para detectar componentes fluorescentes naturales y marcados en forma fluorescente en medios altamente transparentes, medios parcialmente transparentes y en medios altamente dispersantes. La presente invención provee métodos de análisis ópticos no destructivos, particularmente muy adecuados para el análisis de muestras biológicas, tales como fluidos corporales, suspensiones tisulares, alimentos y bebidas, fluidos generados a partir de sistemas de expresión, tales como sistemas de expresión recombinantes, y muestras derivadas a partir de los mismos. Los métodos de la presente invención pueden detectar y clasificar materiales biológicos a concentraciones bajas incluyendo, pero sin limitarse a, células procariotas, células eucariotas, bacterias, virus, moléculas biológicas tales como proteínas, péptidos, oligonucleótidos, ADN, ARNm, lipidos y todos los agregados y complejos de los mismos. Este elevado grado de versatilidad con respecto a la composición de materiales analizados mediante los dispositivos y técnicas de la presente invención los hace adecuados para una amplia gama de aplicaciones incluyendo, pero sin limitarse a, caracterización de material celular y microorganismos, identificación de moléculas biológicas presentes en muestras biológicas, análisis de materiales presentes en comestibles, detección de patógenos en muestras, análisis de muestras biológicas para aplicaciones de diagnóstico clínico y terapéuticas, análisis cuantitativo de alto rendimiento de muestras, y pruebas funcionales para monitoreo de velocidades de expresión de proteina. En otra modalidad, la presente invención provee un método para analizar particulas en una muestra que comprende los pasos de: (i) proveer la muestra que contiene partículas en un contenedor por lo menos parcialmente transparente; (ii) dirigir luz de excitación sobre la muestra, con lo cual se ocasiona que por lo menos una porción de -las partículas en la muestra genere fluorescencia; (iii) captar la fluorescencia proveniente de un volumen de observación en la muestra y dirigir la fluorescencia proveniente del volumen de observación hacia un fotodetector; (iv) mover el contenedor con lo cual se hacen pasar las particulas en la muestra a través del volumen de observación; y (v) medir la intensidad de la fluorescencia proveniente del volumen de observación como una función del tiempo utilizando el fotodetector, con lo cual se genera un perfil temporal de la fluorescencia correspondiente a partir del volumen de observación. Los métodos opcionales de este aspecto de la presente invención también pueden comprender el paso de analizar el perfil temporal utilizando un algoritmo de reconocimiento de patrón. En otro aspecto, la presente invención provee un método para determinar la concentración de partículas en una muestra que contiene las partículas que comprende los pasos de: (1) proveer la muestra que contiene las partículas en un contenedor por lo menos parcialmente transparente; (2) dirigir luz de excitación hacia un microscopio confocal en comunicación óptica con la muestra que contiene las partículas; (3) enfocar la luz de excitación sobre la muestra utilizando el microscopio confocal, con lo cual se hace que las particulas generen fluorescencia; (4) captar la fluorescencia proveniente de un volumen de observación en la muestra utilizando el microscopio confocal; (5) trasladar el contenedor con lo cual se hacen pasar las particulas en la muestra a través del volumen de observación; (6) medir la intensidad de la fluorescencia proveniente del volumen de observación como una función del tiempo utilizando un fotodetector posicionado en comunicación óptica con el microscopio confocal, con lo cual se genera un perfil temporal de la fluorescencia correspondiente proveniente del volumen de observación; y (7) analizar el perfil temporal utilizando un algoritmo de reconocimiento de patrón con lo cual se determina la concentración y tamaño de las partículas en la muestra a partir del perfil temporal.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura ÍA provee un diagrama esquemático de una vista superior en planta de un dispositivo para análisis óptico de la presente invención para medir la concentración de partículas fluorescentes en una muestra fluida. La figura IB muestra una vista lateral expandida de un contenedor que comprende una cubeta cilindrica, y también indica los ejes de rotación y de desplazamiento vertical coincidentes útiles en algunos métodos de la presente invención. La figura 2 provee una fotografía de un dispositivo para análisis óptico de la presente invención que comprende un microscopio de barrido confocal en combinación con un procesador que tiene un algoritmo de reconocimiento de patrón. La figura 3 muestra un ejemplo de perfil temporal de fluorescencia de partículas que se mueven a través del volumen de observación generado utilizando el analizador óptico. La figura 4A muestra un perfil temporal (gráfica superior) generado por el analizador óptico y los patrones predeterminados correspondientes (gráfica intermedia) igualados con los rasgos en el perfil temporal. En la figura 4A también se muestran los valores de chi cuadrada (gráfica inferior) asociados con cada patrón igualado al perfil temporal. La figura 4B provee una gráfica traslapada que muestra un rasgo (curva A) observado en el perfil temporal y un patrón predeterminado (curva B) ajustado para que coincida con el rasgo. La figura 4C muestra la distribución de intensidad para un patrón individual en una escala expandida y la figura 4D muestra una distribución de tamaño obtenida para análisis de una muestra heterogénea. La figura 5 provee un diagrama esquemático de un analizador óptico de canales múltiples de la presente invención. La figura 6 provee un diagrama de flujo funcional que ilustra los pasos en un ejemplo de algoritmo de reconocimiento de patrón de la presente invención. La figura 7 muestra un ejemplo de histograma de corriente de fotones generado por los dispositivos y métodos de la presente invención para una muestra que contiene esferas fluorescentes. La figura 8 muestra una gráfica de conteos totales (picos en el perfil temporal de fluorescencia) como una función de concentraciones de partícula generados por los dispositivos y métodos de la presente invención para una muestra que contiene esferas fluorescentes.

La figura 9 muestra un ejemplo de histograma de corriente de fotones generado por los métodos de la presente invención para una muestra de leche que contiene células somáticas. La figura 10 muestra una gráfica de cuentas totales (picos en el perfil temporal de fluorescencia alrededor del valor umbral) como una función de las concentraciones de células somáticas que se genera utilizando los métodos y dispositivos de la presente invención. La figura 11 muestra el resultado de un estudio de concentración-dilución utilizando el dispositivo para análisis óptico de la presente invención que emplea análisis de datos de reconocimiento de patrón. La figura 12 muestra la calibración generada a partir de los perfiles temporales de fluorescencia correspondiente a la fluorescencia significativamente más tenue de las bacterias. La figura 13 provee un histograma de amplitud (es decir distribución de intensidad) , el cual demuestra la capacidad de los métodos de la presente invención para clasificar partículas tomando como base su distribución de intensidad. Las figuras 14A y 14B muestran los perfiles temporales de fluorescencia para las muestras de control y AD, respectivamente. La figura 14C muestra una imagen casi 3-D generada a partir de un barrido 3-D, e indica el número de oligómeros fluorescentes grandes (manchas blancas alargadas) . La figura 15 provee una gráfica de correlación de concentración y tamaño de agregado para las muestras de control y las muestras AD. Las figuras 16A-16D ilustran en forma esquemática el uso de una abertura confocal de ranuras múltiples en la presente invención para determinar las posiciones de partícula en el volumen de observación. Las figuras 16A y 16B representan esquemáticamente modalidades de la presente invención utilizando una abertura confocal de ranura individual y las figuras 16C y 16D representan modalidades de la presente invención que utilizan una abertura confocal de ranura doble.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Con referencia a las figuras, números similares indican elementos similares y el mismo número que aparezca en más de una figura se refiere al mismo elemento. Además, de aquí en adelante, se aplican las siguientes definiciones : "Fluido" y "muestra fluida" se utilizan en forma sinónima y se refieren a cualquier material que se pueda ajustar a la forma de un contenedor en el cual éste está contenido. Los fluidos que se pueden utilizar con los métodos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, líquidos y mezclas de más de un liquido, coloides tales como espumas, emulsiones, soles, dispersión de partículas, suspensiones de partículas y cualquier combinación de los mismos. Los fluidos en la presente descripción incluyen fluidos biológicos tales como orina, sangre, fluido espinal, componentes sanguíneos celulares y no celulares incluyendo plasma, muestras que contengan plaquetas, muestras que contengan glóbulos rojos, muestras que contengan glóbulos blancos, extractos de tejido y suspensiones de tejido, comestibles, medios de fermentación generados a partir de métodos de recombinación, materiales producidos mediante técnicas recombinantes incluyendo materiales terapéuticos y para diagnóstico, materiales producidos a partir de animales y plantas transgénicas incluyendo materiales terapéuticos y para diagnóstico, leche y productos lácteos, agua, bebidas, productos químicos y farmacéuticos, y vacunas. "Partículas" se refiere a materiales solubles e insolubles presentes en una muestra. Particulas en la presente descripción incluye, pero no se limita a, moléculas, iones, polímeros, moléculas biológicas, células tales como células eucariotas y procariotas, componentes de células, micro-organismos tales como bacterias y virus, patógenos y todos los componentes, complejos y agregados de los mismos. "Moléculas biológicas" se refiere a moléculas que son producidas por un organismo o que son importantes para un organismo vivo, incluyendo, pero sin limitarse a, proteínas, péptidos, hormonas peptídicas, lípidos, moléculas de ADN, moléculas de ARN, oligonucleótidos, carbohidratos, polisacáridos; glucoproteinas, lipoproteinas, azúcares y derivados, variantes, agregados y complejos de los mismos, incluyendo análogos marcados de los mismos que tengan una o más marcas fluorescentes. "Particulas fluorescentes" se refiere a partículas que pueden generar fluorescencia cuando son excitadas por luz de excitación, e incluye particulas intrínsecamente fluorescentes y partículas que son fluorescentes debido a su asociación (covalente o no covalente) con uno o más fluoróforos incluyendo particulas marcadas en forma fluorescente, partículas teñidas, partículas etiquetadas en forma fluorescente, y partículas asociadas con un intercalador o colorante. Las partículas fluorescentes pueden estar asociadas con un solo fluoróforo o con una pluralidad de fluoróforos. Las partículas fluorescentes se pueden marcar o etiquetar selectivamente con fluoróforos que se asocien en forma selectiva con un tipo específico de partícula o elementos específicos de dichas partículas, tales como proteínas y/u oligonucleótidos. "Perfil temporal de fluorescencia" se refiere a la distribución de la intensidad de fluorescencia como una función del tiempo. "Rasgos" en un perfil temporal de fluorescencia se refiere a porciones de un perfil temporal caracterizadas por cambios en intensidad como una función del tiempo, de preferencia para algunas aplicaciones cambios estadísticamente significativos en intensidad como una función del tiempo. Los rasgos de un perfil temporal de fluorescencia pueden resultar de la presencia de y/o del paso de una o más partículas a través del volumen de observación de los dispositivos y métodos de la presente invención. "Comunicación óptica" y "ópticamente acoplado" se utilizan de manera sinónima en la presente descripción y se refieren a una configuración de dos o más elementos de dispositivo en los cuales la luz se puede propagar desde un elemento hacia otro elemento. Los elementos de dispositivo se pueden acoplar ópticamente en forma directa o indirecta utilizando una variedad de componentes de dispositivo incluyendo, pero sin limitarse a, guías de onda, elementos de fibra óptica, reflectores, filtros, prismas, lentes, rejillas y cualquier combinación de dichos componentes de dispositivo.

Los términos "intensidad" e "intensidades"se refieren a la amplitud o amplitudes del vector de campo eléctrico o magnético de la luz, tal como luz de excitación o fluorescencia. Los términos "intensidad" e "intensidades" se pueden referir de manera alternativa a la amplitud o amplitudes de la señal generada por un fotodetector después de detectar la luz, por ejemplo la amplitud o amplitudes de la corriente generada por un fotodiodo o un tubo fotomultiplicador . Los términos "radiación electromagnética" y "luz" se utilizan de manera sinónima en la presente solicitud y se refieren a ondas de campos eléctrico y magnético. La radiación electromagnética útil para afectar las partículas fluorescentes en los dispositivos y métodos de la presente invención incluye luz ultravioleta, luz visible, infrarrojo cercano, infrarrojo lejano o una combinación de las mismas. "Parcialmente transparente" se refiere a la propiedad de un material, dispositivo o componentes de dispositivo que pueda transmitir por lo menos una porción de la radiación electromagnética que incide sobre el mismo. "Translación" se refiere al desplazamiento de un dispositivo o componente de dispositivo, tal como el movimiento de un contenedor por lo menos parcialmente transparente para contener una muestra sometida a análisis. La translación puede comprender cualquier tipo de movimiento incluyendo, pero sin limitarse a, desplazamiento vertical, desplazamiento horizontal, movimiento orbital circular, movimiento orbital elíptico, movimiento parabólico, movimiento lineal y cualquier combinación de los mismos. La translación puede proveer movimiento cíclico o movimiento no cíclico. "Patrón predeterminado" se refiere a la forma funcional de una distribución de intensidades como una función del tiempo que está igualada o ajustada a los rasgos en un perfil temporal. Los patrones predeterminados utilizados para igualar los rasgos se pueden obtener mediante métodos desde el inicio, tal como utilizando una función de Gauss o de Lorentz apropiadamente escalada o normalizada, o se pueden derivar empíricamente, por ejemplo, midiendo las distribuciones de intensidad correspondientes al paso de las partículas que tienen tamaño, forma y brillantez conocidas a través del volumen de observación. Los patrones predeterminados se pueden escalar, normalizar o ajustar para optimizar una igualación del patrón predeterminado con un rasgo en un perfil temporal de fluorescencia. La forma funcional de los patrones predeterminados útiles en la presente invención depende de un número de parámetros experimentales que caracterizan la detección óptica y el sistema de caracterización incluyendo, pero sin limitarse a, la alineación de los componentes ópticos de excitación y detección, y la anchura de la abertura posicionada enfrente del fotodetector. Además, la forma funcional de patrones predeterminados útiles en la presente invención también puede depender de las características de las partículas sometidas a detección y/o caracterización, tal como el tamaño de una partícula con relación al volumen de la función de distribución de punto del microscopio confocal, la forma de una partícula y la brillantez de una partícula. En la siguiente descripción, se indican numerosos detalles específicos de los dispositivos, componentes de dispositivo y métodos de la presente invención con el fin de proveer una explicación completa de la naturaleza precisa de la invención. Sin embargo, será evidente para los expertos en la técnica que la invención se puede practicar sin estos detalles específicos. Esta invención provee métodos y dispositivos para detectar, identificar, clasificar y caracterizar partículas en una muestra fluida. De manera particular, la presente invención provee dispositivos de microscopía de barrido confocal que utilizan técnicas de análisis de datos de reconocimiento de patrón para medir las concentraciones de partículas fluorescentes presentes en concentraciones muy bajas y para caracterizar las partículas fluorescentes con base al tamaño, forma, constante de difusión y/o composición. La figura ÍA provee un diagrama esquemático de una vista superior en planta de un dispositivo para análisis óptico de la presente invención para medir la concentración de partículas fluorescentes en una muestra fluida. El dispositivo para análisis óptico 100 comprende una fuente óptica 110, un microscopio confocal 120, y un contenedor por lo menos parcialmente transparente 130, tal como una cubeta óptica, para contener la muestra fluida 135 que contiene las partículas, medios para mover el contenedor 140, un fotodetector 150 y un procesador que tiene un algoritmo de reconocimiento de patrón 160. En la modalidad mostrada en la figura ÍA, el microscopio confocal 120 comprende un elemento de colimación (por ejemplo un agujero puntiforme o una ranura) 170, reflector dicróico 180, primera lente del objetivo 190, segunda lente del objetivo 200 y la abertura confocal 210 (por ejemplo un agujero puntiforme o una ranura) . De manera opcional, el dispositivo para análisis óptico 100 también puede comprender el filtro de emisión 212, el filtro de excitación 214, el convertidor analógico a digital 220, la pantalla 230 y el controlador de dispositivo 240. La fuente óptica 110 genera luz de excitación (representada esquemáticamente mediante la linea punteada 300) la cual se provee al microscopio confocal 120. La luz de excitación pasa opcionalmente a través del elemento de colimación 170, con lo cual se genera luz de excitación colimada que es dirigida hacia el espejo dicróico 180. Por lo menos una porción de la luz de excitación colimada pasa a través de la primera lente del objetivo 190, la cual enfoca la luz de excitación sobre la muestra 135. La luz de excitación enfocada es transmitida por lo menos parcialmente a través de la pared el contenedor 130 y es enfocada en un volumen de observación pequeño 270 posicionado dentro de la muestra 135. La luz de excitación 300 provista a la muestra excita las partículas fluorescentes, las cuales generan fluorescencia. Una porción de la fluorescencia proveniente del volumen de observación 270 (representada esquemáticamente por la línea segmentada 310) es recolectada por el microscopio confocal 120 y provista al fotodetector 150, el cual mide la intensidad de fluorescencia 310 como una función del tiempo. Aunque la fluorescencia 310 típicamente se propaga a lo largo de un eje de propagación coincidente con el eje de propagación de la luz de excitación 300, ésta se representa en la figura ÍA (y también en la figura 5) como ligeramente desplazada de la luz de excitación 300 para proveer medios para distinguir la luz de excitación de la fluorescencia para poder describir mejor estas figuras. En la modalidad ilustrada en la figura ÍA, la fluorescencia 310 proveniente del volumen de observación 270 es reflejada por el reflector dicróico 180, pasa a través de la segunda lente del objetivo 200 y la abertura confocal 210, y su imagen se forma sobre la superficie de detección (por ejemplo fotocátodo o fotodiodo) del fotodetector 150. El uso de la abertura confocal 210 evita que la luz de fluorescencia que no se origina desde el plano focal de la primera lente del objetivo llegue a la superficie de detección del fotodetector 150. La presente invención incluye modalidades que no tienen un elemento de colimación 170, particularmente cuando la fuente óptica 110 comprende un láser que provee un haz de luz de excitación que está espacialmente colimada sin la necesidad de colimación adicional . Durante el análisis óptico, los medios para mover al contenedor 140 mueven el contenedor 130 a lo largo de una trayectoria seleccionada, con lo cual transportan la muestra que contiene partículas a través del volumen de observación 270. De preferencia para algunas aplicaciones, las partículas son transportadas dentro y fuera del volumen de observación una a la vez. En la modalidad ilustrada en la figura ÍA, los medios para mover el contenedor 140 hacen girar simultáneamente al contenedor 130 alrededor de un eje de rotación que pasa a través del centro del contenedor e intersecta al eje de propagación de la luz de excitación y desplaza verticalmente al contenedor 130 a lo largo de un eje, por ejemplo un eje sustancialmente paralelo a o coincidente con el eje de rotación del contenedor 140. La rotación del contenedor 130 se ilustra esquemáticamente mediante la flecha 350 y el desplazamiento vertical del contenedor 130 se ilustra esquemáticamente mediante la flecha 360 (véase figura IB) . La figura IB muestra una vista lateral expandida del contenedor 130 que comprende una cubeta cilindrica. La figura IB también indica el volumen de observación 270 en la muestra 135. En la figura IB también se muestra el eje de rotación-desplazamiento vertical 385 y el eje de propagación 384 de la luz de excitación. Como se ilustra esquemáticamente mediante las flechas 350 y 360, el contenedor 130 se gira en forma simultánea alrededor del eje de rotación-desplazamiento vertical 385 y se desplaza verticalmente a lo largo del eje de rotación-desplazamiento vertical 385. Esta combinación de rotación y traslación vertical del contenedor 130 transporta la muestra que contiene particulas a través del volumen de observación 270 y varía en forma sistemática la posición de las particulas en el volumen de observación 270 con relación al eje de propagación 384 de la luz de excitación. En modalidades útiles para optimizar las relaciones señal a ruido correspondientes a las intensidades de fluorescencia medidas, se puede ajustar en forma selectiva la velocidad de rotación y/o desplazamiento vertical. La presente invención incluye modalidades en las cuales el contenedor 130 se mueve en una manera diferente a la de la combinación de rotación y desplazamiento vertical, incluyendo traslación que provee desplazamiento horizontal en combinación con rotación, desplazamiento vertical o tanto rotación como desplazamiento vertical. De manera opcional, la luz de excitación 300 se hace pasar a través del filtro de excitación 214 colocado enfrente de la fuente óptica 110 que es capaz de transmitir longitudes de onda de luz que puedan excitar las particulas en la muestra y que puedan prevenir sustancialmente la transmisión de longitudes de onda de luz correspondientes a la fluorescencia 310 generadas después de excitar las partículas fluorescentes. De manera opcional, la fluorescencia 310 se hace pasar a través del filtro de emisión 212 posicionado enfrente del fotodetector 150 que puede transmitir longitudes de onda de luz correspondientes a la fluorescencia 310 y que pueda evitar sustancialmente la tradición de longitudes de onda de luz correspondientes a las longitudes de onda de excitación de las partículas fluorescentes en la muestra. De manera opcional, el reflector dicróico 180 tiene capacidad de discriminación de longitud de onda, por ejemplo trasmitiendo en forma preferente luz excitación 300 y reflejando en forma preferente la fluorescencia 310. La discriminación de longitud de onda provista por el filtro de excitación 214, filtro de emisión 212, reflector dicróico 180 o cualquier combinación de estos componentes ópticos incrementa la sensibilidad general del dispositivo para análisis óptico 100 con respecto a la detección, medición de la concentración de y análisis de las particulas. La intensidad de fluorescencia 310 es detectada por el fotodetector 150 como una función del tiempo, con lo cual se genera un perfil temporal de fluorescencia proveniente del volumen de observación 270. En la modalidad ilustrada en la figura 1, las señales de salida correspondientes a la foto-corriente del fotodetector 150 se transforman desde una señal analógica a una señal digital mediante el convertidor analógico a digital 220, y las señales de salida son dirigidas hacia el procesador 160, tal como una microcomputadora, que tenga un algoritmo de reconocimiento de patrón. Las flechas mostradas en la figura 1 indican la comunicación de señales de salida que se originan desde el fotodetector 150. La operación del algoritmo de reconocimiento de patrón, iguala los patrones predeterminados con los rasgos en el perfil temporal, y cuenta el número de coincidencias durante un tiempo de barrido de muestra determinado. Los patrones predeterminados utilizados para igualar los rasgos se pueden derivar utilizando métodos desde el principio, tal como utilizando una función Gaussiana o Lorentziana escalada o normalizada apropiadamente, o se pueden derivar empíricamente, por ejemplo, midiendo las distribuciones de intensidad correspondientes al paso de las partículas que tienen tamaño, forma y brillantez conocidas a través del volumen de observación. Debido a que las características igualadas a los patrones predeterminados corresponden a partículas detectadas en la muestra, se puede extraer una medición de la concentración de las particulas con el conocimiento del volumen neto de muestra que pasa a través del volumen de observación durante un periodo de barrido de muestra dado. En una modalidad, el volumen neto de muestra que pasa a través del volumen de observación durante un periodo de barrido de muestra dado se determina multiplicando la longitud neta de la trayectoria del contenedor 130 para un periodo de barrido de muestra dado por el volumen de la función de distribución de punto del microscopio confocal 120. El uso de un microscopio confocal que tenga un volumen de función de distribución de punto igual a 1 x 106 µm3 aproximadamente y tiempos de barrido de muestra del orden de 1 minuto permite que se pasen volúmenes netos del orden de mililitros a través de la región de observación. En algunas aplicaciones, se prefiere el uso de volúmenes de observación que tengan un volumen de la función de distribución de punto que se selecciona a través del intervalo de aproximadamente 1 x 105 µm3 aproximadamente hasta 5 x 107 µm3 aproximadamente. Los algoritmos de reconocimiento de patrón de la presente invención pueden ser un componente de un algoritmo de filtración de datos que identifica y cuenta los rasgos en un perfil temporal correspondiente al paso de las partículas a través de un volumen de observación. De manera opcional, la operación del algoritmo de reconocimiento de patrón también clasifica las particulas en la observación con base al tamaño y/o forma. En una modalidad, la clasificación se logra evaluando la amplitud y forma de patrones predeterminados igualados con los rasgos en el perfil temporal. Por ejemplo, la anchura del patrón predeterminado igualado con los rasgos en el perfil temporal se correlaciona con el tiempo de residencia de una partícula en el volumen de observación, tamaño de una partícula, forma de una partícula, o la constante de difusión de una partícula. De manera opcional, la operación del algoritmo de reconocimiento de patrón también clasifica las particulas en el volumen de observación con base a la brillantez de partícula determinando la intensidad total integrada de los patrones predeterminados igualados con los rasgos en el perfil temporal. En algunos casos, la discriminación de partículas con base a la brillantez provee información relacionada con las identidades y abundancia de moléculas unidas a marcas fluorescentes selectivas, tales como marcas de anticuerpo fluorescentes o sondas de ADN fluorescentes. De manera opcional, la operación del algoritmo de reconocimiento de patrón también genera uno o más indicadores estadísticos que caracterizan la calidad del ajuste de los patrones predeterminados al perfil temporal observado, por ejemplo suministrando parámetros, tales como valores de chi cuadrada, que indican la significancia estadística de cada rasgo igualado. En una modalidad, el algoritmo de reconocimiento de patrón de la presente invención calcula la chi cuadrada para cada coincidencia ponderando la diferencia entre un rasgo y el patrón predeterminado igualado con el rasgo con una estimación de la desviación estándar de cada medición. De manera opcional, la operación del algoritmo de reconocimiento de patrón también genera una salida que presenta los datos procesados y los resultados, tal como concentración de partículas, distribución de tamaño de las particulas y/o distribución de brillantez de las partículas, en un formato que puede ser fácilmente evaluado por un operador. En una modalidad, por ejemplo, el algoritmo de reconocimiento de patrón genera un histograma que muestra el número de rasgos igualados correspondientes a las intensidades máximas o intensidades totales integradas de los rasgos igualados. Con referencia de nuevo a la figura ÍA, el dispositivo para análisis óptico 100 comprende también opcionalmente el controlador de dispositivo 240 y/o la pantalla 230. El controlador de dispositivo 240 está conectado en forma operable a los medios para mover el contenedor 140 y está provisto en comunicación de por lo menos una vía con el procesador 160. En una modalidad, el controlador de dispositivo recibe las señales de salida del procesador 160 (mostrado esquemáticamente como una flecha) y puede generar una trayectoria selecta del contenedor 130 que tiene una velocidad de desplazamiento seleccionada, por ejemplo una trayectoria que pasa en forma repetida una partícula seleccionada de interés a través del volumen de observación 270. La pantalla 230 se provee en comunicación de por lo menos una vía con el procesador 160 y puede desplegar los datos de fluorescencia no procesados, datos procesados tales como un perfil temporal igualado con patrones predeterminados y otros resultados del funcionamiento del algoritmo de reconocimiento de patrón tal como el número de rasgos igualados con los patrones predeterminados, la concentración de particulas, la distribución de tamaño de las partículas, la distribución de brillantez de las partículas y los indicadores estadísticos que caracterizan la calidad del ajuste al perfil temporal observado. La figura 2 provee una fotografía de un dispositivo para análisis óptico de la presente invención que comprende un microscopio de barrido confocal en combinación con un procesador que tiene un algoritmo de reconocimiento de patrón. El aparato mostrado en la figura 2 comprende un microscopio confocal pequeño que tiene una geometría horizontal y un instrumento mecánico que sujeta una cubeta cilindrica (de aproximadamente 1 cm de diámetro) con dos motores que proveen movimientos de rotación (aproximadamente 5 revoluciones por segundo) y una inversión vertical más lenta (aproximadamente 2.5 cm por segundo) . El barrido vertical lento es útil para asegurar la independencia estadística de los volúmenes de observación explorados en barridos verticales subsiguientes. El foco de iluminación está centrado aproximadamente a 200 µm de la pared de la cubeta dentro de la muestra. Para generar luz de excitación, se provee una fuente óptica que comprende una lámpara de halógeno acoplada a un filtro pasabanda de 525 nm con FWHM de 60 nm, un láser de ion de argón (Stabilite 2017, Spectra-Physics) que provee luz de excitación de 515 nm, o un láser de neodimio-itrio que provee luz de excitación de 532 nm. La potencia radiante de la fuente óptica requerida para detectar partículas en esta configuración experimental es menor de 1 mW. La lente de objetivo provista es Kyowa 20x (N.A. 0.40). Se provee un filtro óptico de emisión de paso largo enfrente del fotodetector para evitar la detección de cualquier luz de excitación reflejada por el espejo dicróico. La detección de fluorescencia se logra utilizando un fotodetector que comprende un tubo foto-multiplicador (PMT) HC120 (Hamamatsu) . La señal proveniente del PMT es alimentada a una tarjeta de adquisición A/D de 12 bits de canal doble. La foto-corriente se muestrea con una resolución de tiempo variable (1/40 kHz = 0.025 ms o menos) . El trazo de tiempo de la señal que da la foto-corriente por bandeja de tiempo como una función de tiempo se almacena en la computadora y se analiza utilizando software para análisis comprensivo al que se hace referencia como simFCS. Entre muchas otras funciones, simFCS calcula la función de auto-correlación y el histograma de conteo de fotones. En simFCS también se incluye un programa de filtro de correlación que tiene un algoritmo de reconocimiento de patrón de paso de partícula. La función del filtro es la de comparar • un patrón predeterminado con los rasgos en el perfil temporal. La anchura del patrón comparado con los rasgos en el perfil temporal se correlaciona con el tiempo de tránsito de la partícula a través del volumen de iluminación. El sistema está configurado de tal manera que se obtiene un histograma de eventos positivos y se puedan observar las coincidencias individuales. El programa de filtro de correlación basado en el reconocimiento de patrón de paso de partícula permite la detección a nivel sub-atomolar de particulas con baja brillantez durante menos de un minuto de tiempo de barrido. En la presente invención, el volumen total que se analiza durante el análisis óptico es proporcional al periodo total de barrido de muestra (o tiempo de detección) . El volumen estimado de la función de distribución de tiempo (VPSF) en el microscopio confocal se define mediante la expresión: VPSF = (Lx) x (Ly) x (Lz) (I) en la cual Lx es la longitud de la observación a lo largo de la dirección X, Ly es la longitud de la observación a lo largo de la dirección Y, y L2 es la longitud de la observación a lo largo de la dirección Z. Cuando se provee una ranura rectangular en frente del fotodetector, Lx y Ly corresponden a los ejes que son ortogonales al eje de propagación de la luz de excitación y se calculan utilizando las dimensiones físicas de la ranura y el factor de aumento del microscopio confocal, y L2 corresponde a un eje paralelo al eje de propagación de la luz de excitación y se calcula utilizando los componentes ópticos del sistema. En una modalidad en la cual Lx, Ly y Lz son iguales a 70 mieras, 500 mieras y 150 mieras, respectivamente, la ecuación I provee un volumen de la función de distribución de punto igual a 5 x 106 mieras3.

VPSF = (70/rn?)x(500/fln)x(150/an) = 5 x 106( m)3 La longitud total (L) de la trayectoria del contenedor por lo menos parcialmente transparente que contiene la muestra para un esquema de movimiento que implica rotación e inversión vertical se calcula utilizando la expresión: L = p(dcubeta)(Vr)(t) (ID en la cual dCUeta es el diámetro de la cubeta, Vr es la velocidad de rotación de la cubeta y "t" es el periodo de barrido de la muestra (o tiempo de detección) . Para un periodo de barrido de la muestra igual a 100 segundos, un diámetro de cubeta igual a 1 centímetro y una velocidad de rotación que sea igual a 5 revoluciones por segundo, la ecuación II provee un valor de la longitud total de la trayectoria igual a 1.6 x 107 µm: l x l04 µm L = p (l cm) (100 segundos) = 1.6 x 107 µm segundo 1 cm El volumen total (V) explorado durante un periodo de barrido de la muestra es provisto por la expresión : V = (L) x (Sección transversal) (III) en la cual L es la longitud total de la trayectoria y Sección transversal es la sección transversal de la región de observación, tal como la sección transversal de la región de observación a lo largo de un eje paralelo a y/o coincidente con el eje de propagación de la luz de excitación. En una modalidad en la cual Ly y Lz son iguales a 500 mieras y 150 mieras, respectivamente, la Sección transversal es provista por la expresión: Sección transversa 1 = (Ly) x (Lz) = (500 µm) x (150 µm) = 7.5 x 10 µm ' La sustitución de una Sección transversal de 7.5 x 104 mieras2 y la longitud total de la trayectoria (L) de 1.6 x 107 µm (véase cálculo anterior) en la ecuación III da como resultado un volumen total (V) explorado durante el barrido igual a 1.2 ml lcm V = (1.6 x 107 µm) x (7.5 x 104µm2) x = 1.2 cm3 = 1.2 ml. \ x 104 µm.

Por lo tanto, se explora más de 1 ml de volumen durante un tiempo de medición de 100 segundos en esta configuración experimental. Este cálculo ilustra la capacidad de los dispositivos y métodos de la presente invención para detectar concentraciones muy bajas (un poco por mililitro) en tiempos de barrido razonablemente cortos. Es importante hacer notar que el fluido de la muestra nunca "entra" a las piezas interiores del dispositivo. No es necesaria una filtración cuidadosa para evitar el taponamiento. No es necesaria la limpieza frecuente para evitar la contaminación o el crecimiento bacteriano. La muestra tampoco se pierde como en la citometría de flujo. Esta permanece en la cubeta y, por lo tanto, se puede someter a otras pruebas si se desea. Este atributo de la presente invención es una ventaja significativa cuando se trabaja con muestras difíciles de obtener. La figura 3 muestra un ejemplo de perfil temporal de fluorescencia de una partícula que se mueve a través del volumen de observación generado utilizando el analizador óptico de la presente invención. El eje "y" corresponde a la intensidad en unidades arbitrarias y el eje x corresponde al tiempo en unidades arbitrarias. El perfil temporal mostrado en la figura 3 se adquiere utilizando una combinación de rotación del contenedor que contiene la muestra a una velocidad de rotación igual a 300 rotaciones por minuto (5 rev/sec) e inversión vertical del contenedor que contiene la muestra a una velocidad de aproximadamente 1 cm por segundo. Los rasgos en el perfil temporal en los tiempos iguales a 9,230 y 9,520 aproximadamente corresponden al paso de las particulas a través del volumen de observación. La figura 4A muestra un perfil temporal (gráfica superior) generado por el analizador óptico y correspondiente a patrones predeterminados (gráfica intermedia) igualados con los rasgos en el perfil temporal. En la figura 4A también se muestran los valores de chi cuadrada (gráfica inferior) asociados con cada patrón igualado al perfil temporal. La figura 4B provee una gráfica traslapada que muestra un rasgo (curva A) observado en un perfil temporal y un patrón predeterminado (curva B) ajustado para que coincida con el rasgo. La forma del patrón predeterminado igualado con el rasgo es definida por una función Gaussiana. El uso de una función Gaussiana provee una primera aproximación para el transporte de una partícula a través del volumen de observación. Los métodos de la presente invención también incluyen el uso de patrones predeterminados que tienen una funcionalidad más compleja, dependiendo del sistema y de la aplicación. La figura 4C muestra la distribución de intensidad para un patrón individual en una escala expandida y la figura 4D despliega una distribución de tamaño obtenida para el análisis de una muestra heterogénea. La figura 5 provee un diagrama esquemático de un analizador óptico de canales múltiples de la presente invención. El analizador de canales múltiples 600 también comprende divisores de haz 601, lentes de objetivo 610 adicionales, aberturas confocales 620 adicionales, filtros ópticos de emisión 630 adicionales y fotodetectores 640 adicionales. Los divisores de haz 601 están posicionados de modo tal que éstos reflejen la fluorescencia proveniente del volumen de observación 270. Como se indica en la figura 5, esta luz reflejada se hace pasar a través de las lentes de objetivo 610 adicionales y las aberturas confocales 620 adicionales, y se refleja sobre los fotodetectores 640 adicionales, que pueden medir las intensidades de fluorescencia como una función del tiempo. En modalidades de la presente invención útiles para monitorear en forma simultánea y de manera independiente la fluorescencia proveniente de una pluralidad de sondas fluorescentes diferentes asociadas con las particulas en la región de observación, el fotodetector 150 y los fotodetectores 640 adicionales están provistos cada uno con diferentes filtros ópticos de emisión 630 que transmiten luz que tiene distribuciones de longitud de onda seleccionadas. Esta modalidad de la presente invención, por lo tanto, genera una pluralidad de perfiles temporales de fluorescencia que corresponden a señales provenientes de sondas fluorescentes diferentes los cuales se pueden analizar para proveer información útil para clasificar particulas con base a la composición. De manera alternativa, en otras modalidades de la presente invención, el fotodetector 150 y los fotodetectores 640 adicionales están provistos cada uno con una abertura confocal de un tamaño diferente. Esta modalidad de la presente invención, por lo tanto, genera una pluralidad de perfiles temporales de fluorescencia que corresponden a volúmenes de observación de tamaños diferentes, los cuales se pueden analizar para proveer información útil para clasificar partículas con base al tamaño y/o forma. La figura 6 provee un diagrama de flujo funcional que ilustra los pasos en un algoritmo de reconocimiento de patrón de ejemplo. Como se muestra en esta figura, se selecciona primero un tipo de función, tal como una función Gaussiana, para que sirva como la base de patrones predeterminados que se utilizan para ajustar los rasgos en el perfil temporal. Después, se aplica el filtro a un segmento del perfil temporal de fluorescencia que tiene una longitud seleccionada, tal como una longitud aproximadamente igual a la del patrón. Se varía la intensidad del patrón predeterminado y se obtiene un ajuste 1 por mínimos cuadrados dentro de un conjunto de límites de parámetro. Si se obtiene una coincidencia, el rasgo se registra como un evento de detección de partícula y se guarda la intensidad. Si también se desea una distribución de tamaño, se efectúa un barrido de la anchura del patrón entre un conjunto de anchura máximo y mínimo y se guarda la anchura correspondiente al mejor ajuste. Este procedimiento se repite después para el siguiente intervalo de tiempo del perfil temporal. Los métodos y dispositivos de la presente invención pueden utilizar una amplia gama de componentes de dispositivo ópticos, eléctricos y mecánicos. Las fuentes ópticas útiles en los métodos de la presente invención pueden comprender fuentes coherentes de banda estrecha, tales como rayos láser, y fuentes de lámpara de banda estrecha. De manera alternativa, se pueden utilizar lámparas de banda ancha como fuentes ópticas en la presente invención con la condición que se provea un elemento para filtración de longitud de onda, tal como un filtro de interferencia óptica, rejillas de difracción o monocrómetro, para lograr radiación de excitación que tenga una distribución de longitud de onda lo suficientemente estrecha para permitir la detección sensible de emisión proveniente de las partículas en la región de observación. Las fuentes ópticas incluyen, pero no se limitan a, rayos láser, lámparas de banda estrecha (lámpara de arco de mercurio) , lámparas de banda ancha (por ejemplo lámpara de deuterio, lámparas de xenón, lámpara de halógeno o lámpara fluorescente, uno o más diodos emisores de luz (LEDs) . La presente invención es compatible con microscopios ópticos confocales convencionales que comprenden un elemento de colimación (por ejemplo un agujero puntiforme o ranuras) en comunicación óptica con una fuente de luz, reflector dicróico, lentes' de objetivo y abertura confocal (por ejemplo agujero puntiforme o ranura) en comunicación óptica con un fotodetector. El uso de un elemento de colimación (por ejemplo agujero puntiforme o ranura) en comunicación óptica con una fuente de luz es opcional en la presente invención, particularmente para modalidades en las cuales la fuente óptica es una fuente óptica espacialmente coherente que tiene un tamaño de punto pequeño, tal como una fuente láser. Los microscopios confocales que proveen un volumen focal que tiene una posición fija se pueden utilizar en la presente invención, así como microscopios confocales que provean un volumen focal que tenga una posición selectivamente variable, por ejemplo, mediante rotación de un reflector dicróico. Los microscopios confocales en la presente invención pueden tener una abertura confocal que tenga un tamaño constante o un tamaño que se pueda variar en forma selectiva y se pueda proveer en geometrías ópticas horizontales o verticales. Los contenedores útiles en los métodos y dispositivos de la presente invención incluyen contenedores que tienen cualquier forma que exhiba por lo menos transmisión parcial de luz de excitación y emisión a partir de las particulas. Los contenedores útiles para aplicaciones de análisis óptico que requieren de sensibilidades de detección grandes son altamente transmisores de la luz de excitación y la luz emitida. El uso de un contenedor, tal como una cubeta cilindrica o celda óptica, que tenga una transmitancia de luz de excitación y emisión a partir de las partículas que sea sustancialmente constante (por ejemplo constante hasta dentro de 10% aproximadamente o de preferencia para algunas aplicaciones constante hasta dentro de 5% aproximadamente) como una función de la posición de rotación es particularmente útil para mediciones de clasificación de particulas en las cuales el contenedor se hace girar durante el análisis óptico. Se pueden utilizar cualesquiera medios para mover al contenedor que contiene la muestra en la presente invención que provean translación, rotación o ambos del contenedor, incluyendo motores, componentes electrónicos para conmutación y/o mecanismos de placa de rotación excéntrica. Se prefiere el uso de medios para mover el contenedor que contiene la muestra que no sean susceptibles a fluctuaciones y/o vibraciones mecánicas para algunas aplicaciones. Los métodos y dispositivos de análisis óptico de la presente invención, sin embargo, no son muy susceptibles a errores introducidos a partir de fluctuaciones y/o vibraciones mecánicas que ocurren en escalas de tiempo significativamente más largas (es decir por lo menos un factor de 3) que la escala de tiempo del paso de las partículas a través del volumen de observación. Se puede utilizar cualquier dispositivo para detección de patrón en la presente invención incluyendo, pero sin limitarse a, tubos fotomultiplicadores, fotodiodos tales como un fotodiodo en avalancha y detectores de foto-conductores. Los fotodetectores útiles en la presente invención se pueden proveer con amplificadores de señal, terminadores, sistemas de conversión analógica a digital, sistemas de filtración electrónicos o cualesquiera equivalentes conocidos en la técnica. Los fotodetectores de la presente invención se pueden configurar para conteo de fotones. Los presentes métodos y dispositivos de la presente invención son susceptibles de automatización asistida por computadora y, por lo tanto, son muy adecuados para análisis óptico de alto rendimiento de un número grande de muestras. Los procesadores útiles en la presente invención incluyen microcomputadoras, computadoras de uso general o sistemas de procesamiento que puedan ejecutar software de aplicación. Los ejemplos de computadoras que se pueden utilizar en los presentes métodos incluyen microcomputadoras, tales como una computadora personal de IBM o un equivalente apropiado de la misma, y computadoras para estación de trabajo. De preferencia, los algoritmos de reconocimiento de patrón de la presente invención están incorporados en un medio legible por computadora, tal como un disco compacto para computadora (CD-ROM) , dispositivo de memoria temporal o disco flexible. Además, el medio legible por computadora puede estar en forma de un disco duro o chip de memoria, tal como memoria de acceso aleatorio o memoria de solo lectura. Como será apreciado por un experto en la técnica, el código de software para computadora que incorpora los métodos de análisis de datos y algoritmos de reconocimiento de patrón de la presente invención se puede escribir utilizando cualquier lenguaje de programación. Los ejemplos de lenguajes incluyen, pero no se limitan a, C o cualesquiera versiones de C, Perl, Java, Pascal, o cualesquiera equivalentes de los mismos. Aunque es preferido para algunas aplicaciones de la presente invención que se utilice una computadora para lograr todos los pasos de los presentes métodos, se contempla que se puede utilizar una computadora para efectuar únicamente algún paso o series de pasos seleccionados en los métodos de la presente invención. Los términos y expresiones que se han utilizado en la presente invención se utilizan como términos de descripción y no de limitación, y no existe intención en el uso de dichos términos y expresiones para excluir cualesquiera equivalentes de los rasgos mostrados y descritos o porciones de los mismos, pero se reconoce que son posibles varias modificaciones dentro del campo de la invención reclamada. Por lo tanto, se debe entender que aunque la presente invención se ha descrito específicamente mediante modalidades preferidas y características opcionales, los expertos en la técnica pueden recurrir a la modificación y variación de los conceptos descritos en la presente invención, y que se considera que dichas modificaciones y variaciones están dentro del campo de esta invención como queda definido por las reivindicaciones anexas. Las modalidades especificas provistas en la presente invención son ejemplos de modalidades útiles de la presente invención y será evidente para el experto en la técnica que la presente invención se puede efectuar utilizando un número grande de variaciones de los dispositivos, componentes de dispositivo, pasos de los métodos indicados en la presente descripción. Los métodos y dispositivos útiles para los presentes métodos pueden incluir un número grande de elementos y componentes de dispositivo opcionales incluyendo, pero sin limitarse a elementos de fibra óptica, controladores de temperatura, filtros ópticos tales como FP etalons, filtros de corte de paso alto y filtros de corte de paso bajo, elementos de colimación tales como lentes y reflectores colimadores, generadores de pulso de disparo, rayos láser, monocrómetros, prismas, rejillas de difracción, elementos para enfoque tales como lentes y reflectores para enfoque, reflectores, polarizadores, acopladores y transmisores de fibra óptica, controladores de temperatura, detectores de temperatura, fuentes ópticas de banda ancha y fuentes ópticas de banda estrecha. Las siguientes referencias se refieren en términos generales al procesamiento de señal digital y al reconocimiento de patrón (1 ) Algorithms and Applications, John G. Proakis, Dimitris G. Manolakis, Prentice Hall, 3a edición, 1995; (2) Discrete Time Signal Processing, 2a edición, A. Oppenheim, R. Schafer, y J. Buck, Prentice-Hall, 1999; (3) Discrete-Time Processing of Speech Signáis, J. R. Deller, Jr . , J. H. L. Hansen, y J. G. Proakis, IEEE Press, 1999 y (4) Pattern Classification (2001) por Duda, Hart y Stork, Wiley-Interscience. Las siguientes referencias se refieren a métodos de análisis para interpretación de datos de fluorescencia utilizando análisis de histograma de conteo de fotones y análisis espectroscópico de correlación de fluctuación: (1) "The Photon Counting Histogram in Fluorescence Fluctuation Spectroscopy", Y. Chen, J. D. Muller, PT . C. So y E. Gratton, Biophys. J. , Julio 1999, pgs . 553 - 567, Vol. 77, No. 1; (2) patente E.U.A. No. 6,794,659; (3) "Two photon fluorescence correlation spectroscopy: method and application to the intracellular environment" , K.M. Berland, P.T.C. So, y E. Gratton, Biophys. J. , 1995, Vol 68, pgs 694 - 701; (4) "Fluorescence Correlation spectroscopy. I. Conceptual Basis and Theory", E.L. Elson y D. Magde, Biopolymers, 1974, Vol 13, pgs. 1 - 27; (5) "Fluorescence Correlation spectroscopy. II. An Experimental Realization", D. Magde, E.L. Elson y W.W. Webb, Biopolymers, 1974, Vol 13, pgs. 29 - 61; (6) "Fluorescence correlation spectroscopy: inception, biophysical experimentations and prospectus", W.W. Webb, Appl. Opt . , 2001 , Vol 40, pgs. 3969 - 3983; y (7) Fluorescence-intensity distribution analysis and its application in biomolecular detection technology", P. Kask, K. Palo, D. Ullmann y K. Gall, Proc. Nati. Acad. Sci, 1999, USA, Vol. 96, pgs 13756 - 13761.

Declaraciones referentes a incorporación para referencia y variaciones Todas las referencias citadas a través de toda esta solicitud, por ejemplo documentos de patente incluyendo patentes expedidas o concedidas o equivalentes; publicaciones de solicitud de patente; y documentos de literatura de tipo no patente u otro material fuente quedan incorporadas en la presente invención para referencia en sus totalidades, como si se incorporaran individualmente para referencia, hasta el grado en que cada referencia no sea por lo menos parcialmente inconsistente con la descripción en esta solicitud (por ejemplo, una referencia que sea parcialmente inconsistente queda incorporada para referencia excepto por la porción parcialmente inconsistente de la referencia) . Se puede utilizar cada formulación o combinación de componentes descrita o ejemplificada en la presente invención para practicar la invención, a menos que se indique lo contrario. Cada vez que se dé un intervalo en la descripción, por ejemplo, un intervalo de temperatura, un intervalo de tiempo, o un intervalo de composición o concentración, se pretende que todos los intervalos y subintervalos intermedios, así como todos los valores individuales incluidos en los intervalos dados queden incluidos en la descripción. Se entenderá que se pueden excluir de las reivindicaciones de la presente invención cualesquiera sub-intervalos o valores individuales en un intervalo o sub-intervalo que estén incluidos en la descripción de la presente invención. Todas las patentes y publicaciones mencionadas en la descripción son indicativas de los niveles de habilidad de los expertos en la técnica a la cual pertenece la invención. Las referencias citadas en la presente invención quedan incorporadas para referencia en la misma en sus totalidades para indicar el estado de la técnica a partir de su fecha de publicación o de presentación y se pretende que esta información se pueda utilizar en la presente, si fuera necesario, para excluir modalidades específicas que estén en la técnica antecedente. Tal como se utiliza en la presente invención, "que comprende" es sinónimo de "que incluye", "que contiene", o "caracterizado porque" y es incluyente o de extremo abierto y no excluye elementos o pasos de método adicionales, no indicados. Tal como se utiliza en la presente invención, "que consiste de" excluye cualquier elemento, paso, o ingrediente no especificado en el elemento de la reivindicación. Tal como se utiliza en la presente invención, "que consiste esencialmente de" no excluye materiales o pasos que no afecten materialmente las características básicas y novedosas de la reivindicación. En cada caso en la presente invención cualquiera de los términos "que comprende", "que consiste esencialmente de" y "que consiste de" se puede remplazar con cualquiera de los otros dos términos . La invención descrita en forma ilustrativa en la presente invención se puede practicar adecuadamente en ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones que no estén descritos específicamente en la presente invención. El experto en la técnica apreciará que se pueden utilizar materiales de partida, materiales, reactivos, métodos de síntesis, métodos de purificación, métodos analíticos, métodos de prueba, y métodos diferentes de aquellos ejemplificados de manera específica en la práctica de la invención sin recurrir a experimentación indebida. Se pretende que todos los equivalentes funcionales conocidos en la técnica, de cualesquiera de dichos materiales y métodos queden incluidos en esta invención. Los términos y expresiones que se han empleado se utilizan como términos de descripción y no de limitación, y no existe la intención en el uso de dichos términos y expresiones de excluir cualesquiera equivalentes de las características mostradas y descritas o porciones de las mismas, pero que son posibles varias modificaciones dentro del campo de la invención reclamada. Por lo tanto, se debe entender que aunque la presente invención se ha descrito específicamente mediante modalidades preferidas y características opcionales, los expertos en la técnica pueden recurrir a la modificación y variación de los conceptos descritos en la presente invención, y se considera que dichas modificaciones y variaciones están dentro del campo de esta invención como queda definido por las reivindicaciones anexas .

EJEMPLO 1 Análisis de esferas fluorescentes en medios transparentes y turbios Para confirmar la capacidad de medir con exactitud las concentraciones de partículas en las muestras, se utiliza un dispositivo para análisis óptico de la presente invención para determinar la concentración de esferas fluorescentes de color naranja, de 1.0 µm de diámetro (Molecular Probes, F-8820) tanto en una solución amortiguada transparente como en una solución de Liposina (20% en peso diluida 1:80) que comprenden una muestra dispersante. Se utiliza una lámpara pequeña de halógeno combinada con un filtro verde (525 ± 60 nm) como la fuente óptica para proveer luz de excitación en estas mediciones. En estas muestras se pueden medir concentraciones de esferas fluorescentes de color naranja tan bajas como de unos cuantos cientos de esferas por mililitro utilizando el dispositivo para análisis óptico de la presente invención empleando un tiempo de barrido de muestra de 1 minuto. La figura 7 muestra un ejemplo de histograma de corriente de fotones y la figura 8 muestra una gráfica de cuentas totales (picos en el perfil temporal de fluorescencia) como una función de las concentraciones de partículas generadas utilizando los métodos y dispositivos de la presente invención. Como se muestra en la figura 8, existe un ajuste lineal muy bueno a través del intervalo amplio de concentraciones examinado. Los resultados de este estudio demuestran que los métodos y dispositivos de la presente invención son bastante adecuados para determinar las concentraciones de partículas fluorescentes en muestras ópticamente transparentes y dispersantes. Con el fin de detectar y medir en forma reproducible concentraciones incluso más bajas, por ejemplo concentraciones tan bajas como de unas cuantas partículas por mililitro, se utiliza un programa de filtro de correlación que tiene un algoritmo de reconocimiento de patrón para analizar los perfiles temporales de fluorescencia que se generan utilizando los métodos de la presente invención. El histograma de conteo de fotones incluye contribuciones provenientes del fondo y efectos de la rotación mecánica además de la señal proveniente de las partículas de interés. La filtración simple de datos (tal como filtración de datos de paso bajo) no es suficiente para obtener la sensibilidad de detección elegida como blanco, particularmente cuando se trabaja con particulas tenues en un medio dispersante. El programa de filtro de correlación que tiene un algoritmo de reconocimiento de patrón reconoce el paso de la partícula de interés en el volumen de iluminación durante el barrido y registra el evento como un acierto, junto con su amplitud de intensidad y opcionalmente su intensidad total integrada. Para evaluar la efectividad del algoritmo de reconocimiento de patrón, se efectúa una calibración del instrumento utilizando fluoroesferas fluorescentes. La figura 11 muestra el resultado de un estudio de concentración-dilución utilizando el dispositivo para análisis óptico de la presente invención empleando análisis de datos de reconocimiento de patrón. La figura 11 muestra una saturación del número de eventos (particulas) detectados a medida que se incrementa la concentración. Esto es un resultado esperado debido a que a concentración elevada se incrementa la probabilidad de la presencia simultánea de más de una partícula en el volumen de observación. La corrección respecto al efecto de saturación, sin embargo, se efectúa en forma sencilla reduciendo el volumen de observación, cambiando el agujero puntiforme en el lado de emisión, efectuando una linealización de la curva tomando en cuenta la probabilidad de apilamiento, o simplemente diluyendo la muestra antes del análisis óptico. Sin embargo, en la parte de concentración baja de la curva, no es necesaria una corrección respecto a los efectos de saturación. En este régimen, la linealidad es excelente hasta concentraciones muy bajas (pocas por ml) , como se muestra mediante el recuadro en la figura 11. Para estas mediciones, se emplea un tiempo e barrido de aproximadamente un minuto.

EJEMPLO 2 Análisis de la cuenta de célula somática en leche La mastitis es la enfermedad más costosa del ganado lechero. Los cálculos de las pérdidas totales causadas por esta enfermedad en los EE.UU. están en el intervalo de 1,500 a 3,000 millones de dólares anualmente. Debido a que las cuentas de células en la leche están cercanamente asociadas con la salud de la ubre, la cuenta de célula somática (SCC) es aceptada como una medida estándar internacional de calidad de la leche. Como resultado, actualmente se necesitan métodos y dispositivos de bajo costo, confiables y portátiles para medir la cuenta de célula somática en leche. Se confirma experimentalmente la capacidad de los dispositivos de análisis ópticos de la presente invención para determinar la concentración de células somáticas en leche. En esta medición, se obtiene leche fresca a partir de la Unidad de Investigación sobre Ganado Lechero de la Universidad de Illinois. Las muestras de leche se diluyen hasta 1/4 en solución reguladora TRIS antes del análisis. Inicialmente los experimentos se efectúan en una muestra que comprende leche de una vaca sometida a tratamiento para mastitis. Se determina que la cuenta de célula somática correspondiente a la leche proveniente de esta fuente es de aproximadamente 1,000,000 de células por mililitro. En estos experimentos, se efectúan diez diluciones para permitir el análisis de muestra diluida que tiene cuentas de célula somática que varían de desde aproximadamente 105 células por ml hasta aproximadamente 106 células por ml . Se agrega un detergente (Triton-X 100) a las muestras antes del análisis óptico para lisar las membranas celulares. Además, se agrega bromuro de etidio (Molecular Probes, E-1305) a una concentración de 10 micromolar para marcar en forma fluorescente las células somáticas. El bromuro de etidio agregado se asocia con el ADN en las células, en donde su fluorescencia se incrementa por un factor de aproximadamente veinte con respecto al de la forma libre. La figura 9 muestra un ejemplo de histograma de corriente de fotones generado por los métodos de la presente invención para una muestra de leche que contiene células somáticas. El ensanchamiento del histograma en la figura 9 claramente depende de la concentración de particulas fluorescentes en la muestra. Para generar una curva de calibración útil para este sistema, se fija un umbral de intensidad de fluorescencia estableciendo cuales rasgos en el perfil temporal de fluorescencia son identificados como una detección positiva de una célula somática. La figura 10 muestra una gráfica de las cuentas totales (picos en el perfil temporal de fluorescencia alrededor del umbral) como una función de las concentraciones de célula somática generada utilizando los métodos y dispositivos de la presente invención. Como se muestra en la figura 10, existe un ajuste lineal muy bueno a través del intervalo útil de concentraciones examinadas. Asimismo, el análisis repetido de los datos no tratados indica que la linealidad de la curva de calibración no es muy sensible a la elección del umbral de intensidad de fluorescencia.

EJEMPLO 3 Análisis óptico de bacterias E. col± Se confirma experimentalmente la capacidad de la presente invención para medir la concentración de microorganismos, tales como bacterias. En estos experimentos, se dejan multiplicar las bacterias E. coli durante varias horas en Caldo Luria a una temperatura de 37 °C y agitación de 300 rotaciones por minuto en una incubadora con agitador (New Brunswick Scientific, C24) . Después se utiliza una solución reguladora MOPS para las diluciones de la muestra. Las bacterias se marcan con Naranja Sytox ("Sytox Orange"), una sonda de ADN. La figura 12 muestra la calibración generada a partir de los perfiles temporales de fluorescencia correspondientes a la fluorescencia significativamente más tenue de las bacterias. Como se muestra en la figura 12, se pueden medir concentraciones muy por debajo de 100 por mililitro empleando un tiempo de barrido de 1 minuto. Además, el software utilizado para el análisis de datos también ejecuta un análisis de intensidad. La figura 13 provee un histograma de amplitud (es decir distribución de intensidad) , el cual demuestra la capacidad de los métodos de la presente para clasificar particulas tomando como base su distribución de intensidad.

EJEMPLO 4 Detección óptica de agregados de proteina Aß Un objetivo de la presente invención es detectar y medir las concentraciones de agregados de proteínas en muestras biológicas, tales como fluidos corporales. Para evaluar esta aplicación de la presente invención, se •confirma experimentalmente la capacidad de los dispositivos y métodos de análisis ópticos de la presente invención para medir concentraciones bajas de agregados de oligómeros de amiloide ß. Se marcan muestras de fluido cerebroespinal provenientes de individuos con enfermedad de Alzheimer y de individuos de control con edades igualadas obtenidas en la autopsia (n=19 con Alzheimer; n=21 de Control intervalo promedio postmortem <3.5 hrs) con Aß (1-42) de humano-fluoresceína (1-42) (FL42) (Anaspec, Inc.) y se analizan mediante FCS de conformidad con los métodos modificados de Pitschke. Se utiliza excitación de dos fotones (780 nm, láser de Ti: zafiro, sincronizados en cuanto a modo, pulsos de 150 fs, 6-9 mW en la muestra) para reducir el daño por fotones a la sonda y para definir mejor el volumen de muestreo. La detección se efectúa con un fotodiodo de avalancha EG&G modelo SPCM-AQR-15 que se hace funcionar en el modo de conteo de fotones. La iluminación láser se enfoca en una gota de muestra de 10 µl en un portaobjetos de 8 cámaras (LabTech cat. 15541 ) a través de un objetivo de aceite 40X NA=1.4. Se utilizan detección de molécula individual y análisis de correlación de fluoresceína y fluoresceína-lisozima para calibrar los instrumentos. Las velocidades de muestreo de datos de 16 bits varían desde 16 hasta 32 kHz para discernir eventos de molécula individual. Se diluye FL-42 en NaPi 10 mM - 0.2% p/v de SDS, pH 7.5 hasta 100 nM y 0.02% de SDS en la muestra de CSF para marcar los complejos oligoméricos endógenos. Se observan partículas brillantes grandes en las muestras de enfermedad de Alzheimer (AD) por encima del fondo de péptido fluorescente libre. Ni las muestras de CSF sin marcar ni FL-42 100 nM en NaPi 10 mM, pH 7.5 generan los oligómeros grandes brillantes observados en las muestras de CSF marcadas a lo largo del tiempo de las mediciones. Los oligómeros brillantes grandes se detectan como eventos raros, concentración en número calculada < 1 pM. Estos oligómeros grandes se difunden lentamente y la mayoría del tiempo de muestreo transcurre como espera entre eventos. Se puede anticipar que la combinación de concentración baja y difusión lenta de los oligómeros podría requerir días para una sola determinación con estadísticas suficientes. Con el fin de recolectar suficientes eventos para efectuar comparaciones significativas en tiempo mínimo, se evalúan varios paradigmas de barrido con haz para incrementar el volumen muestreado y el mismo tiempo retener la resolución para distinguir moléculas individuales. Sin barrido la imagen confocal monitorea continuamente un volumen de ~ 1 fl. Escudriñar el punto focal en un circulo de 20 µm de diámetro con un periodo de 4 mseg muestrea un volumen de ~ 0.5 pl. El barrido en retícula 45 X 45 µm en X- Y y 60 µm en el eje Z en incrementos de 3 µm muestrea ~ 120 pl. Las figures 14A y 14B muestran perfiles temporales de fluorescencia para el control y las muestras AD, respectivamente, obtenidas utilizando un microscopio de barrido confocal convencional que opera en el modo de excitación de dos fotones. La figura 14A corresponde control estático y AD (20 min) y la figura 14B corresponde al barrido con haz de la muestra AD 3-D (barrido en retícula XY + escalón z ; 90 seg. Los picos intensos en la figura 14A se interpretan como complejos de Aß grandes, oligoméricos tomando como base su difusión lenta, como se indica mediante las anchuras de pico medidas. En esta muestra pequeña de muestras de CSF de autopsia, el grupo de control (n=22, Desv. est. promedio de los picos 3.105 + 0.648) se puede distinguir del grupo de individuos AD (n=18, Desv. est. promedio de los picos 6.053 ± 0.800) a p=0.00346. Aunque los grupos son separables, las poblaciones se traslapan, debido en parte al número pequeño de eventos observado. El barrido 3-D mostrado en la figura 14B se convierte en una imagen casi 3-D. La figura 14C muestra una imagen casi 3-D generada a partir de un barrido 3-D, e indica el número de oligómeros fluorescentes grandes (manchas blancas alargadas) . El programa de filtro de correlación que tiene un algoritmo de reconocimiento de patrón se utiliza para analizar los perfiles temporales de fluorescencia adquiridos utilizando los métodos y dispositivos de la presente invención y para determinar la distribución de tamaños para las partículas alargadas, tal como los polímeros y agregados de amiloide ß. La figura 15 provee una gráfica de correlación de concentración y tamaño de agregado para las muestras de control y las muestras de AD.

EJEMPLO 5 Analizador óptico que tiene una apertura confocal de ranuras múltiples para mejor determinación de ubicación y brillantez intrinseca De manera opcional, los analizadores ópticos y métodos de análisis de la presente invención utilizan una configuración óptica de abertura confocal de ranuras múltiples. Los analizadores de este aspecto de la presente invención pueden medir la posición y/o trayectoria de las partículas en el volumen de observación, además de proveer mediciones de la concentración de partícula, brillantez de partícula y/o caracterización de tamaño. Este aspecto funcional de la presente invención permite el análisis óptico exacto utilizando volúmenes de observaciones grandes, con lo cual se permite el análisis de volúmenes de muestra grandes durante el barrido óptico. La determinación de la posición y/o trayectoria de la partícula en estas modalidades provee sensibilidad incrementada para detectar partículas y caracterizar partículas con respecto a la brillantez debido a que la información de posición adquirida durante el análisis elimina y/o reduce al mínimo las incertidumbres referentes a las intensidades o brillantez absoluta de las partículas detectadas. En esta modalidad de la presente invención, se provee una abertura confocal de ranuras múltiples entre la muestra y el fotodetector de manera tal que por lo menos una porción de la fluorescencia proveniente del volumen de observación pase a través de la abertura confocal de ranuras múltiples antes de ser detectada por el fotodetector. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "abertura confocal de ranuras múltiples" se refiere a un componente de dispositivo que comprende una pluralidad de ranuras y/o agujeros puntiformes, los cuales están distribuidos espacialmente en forma simétrica o asimétrica enfrente del fotodetector y los cuales permiten la transmisión por lo menos parcial de la fluorescencia incidente. Las aberturas confocales de ranuras múltiples pueden tener cualquier número de ranuras y/o agujeros puntiformes que provean la detección óptica exacta y/o caracterización de las partículas, y las ranuras o agujeros puntiformes provistos pueden tener las mismas áreas o áreas diferentes. El uso de una abertura confocal de ranuras dual (es decir que tiene dos ranuras) que comprende dos ranuras confocales que tienen sustancialmente las mismas áreas de ranura (por ejemplo, dentro de 10% aproximadamente) es benéfico para algunas aplicaciones de análisis óptico. En modalidades de este aspecto la presente invención, la abertura confocal de ranuras múltiples puede ser un componente de un microscopio confocal . Las aberturas confocales de ranuras múltiples para algunas aplicaciones de la presente invención comprenden una pluralidad de ranuras que tienen anchuras que se seleccionan a través del intervalo de aproximadamente 5 mieras hasta aproximadamente 100 mieras que están separadas a igual distancia una de la otra por distancias que se seleccionan a través del intervalo de 5 mieras aproximadamente hasta 500 mieras aproximadamente. Las aberturas confocales de ranuras múltiples útiles para algunas aplicaciones de la presente invención comprenden una pluralidad de ranuras que están simétricamente distribuidas enfrente de un fotodetector. En los analizadores y métodos de análisis de la presente invención se utiliza una abertura confocal de ranuras múltiples para incrementar la determinación de posiciones y/o trayectorias de partículas fluorescentes con respecto al centro del perfil de iluminación. La configuración de ranuras múltiples presente emplea ranuras múltiples enfrente de un solo fotodetector, en oposición a una sola ranura colocada enfrente de un solo detector. Las figuras 16A - 16D ilustran en forma esquemática y comparan el uso de aberturas confocales de ranura individual y de ranuras múltiples en la presente invención para determinar las posiciones y/o trayectorias de partícula en el volumen de observación. Las figures 16A y 16B muestran modalidades de la presente invención que utilizan una abertura confocal de ranura individual y las figuras 16C y 16D muestran modalidades de la presente invención que utilizan una abertura confocal de ranura doble. Las figuras 16A y 16B muestran una primera trayectoria de partícula (16 A) que pasa exactamente en el centro del volumen confocal y una segunda trayectoria de partícula (16B) que pasa lejos del centro del volumen confocal. Las figuras 16A y 16B (parte superior de estos paneles) también indican los perfiles temporales de fluorescencia pronosticados para cada configuración de abertura confocal de ranura individual. Una comparación de las figuras 16A y 16B muestra que a medida que la partícula pasa lejos del centro del volumen de observación, se incrementa la anchura del perfil temporal de fluorescencia. Por lo tanto, la medición de las anchuras de los rasgos del perfil temporal provee medios para determinar la posición y/o trayectoria de la partícula. La incorporación de una abertura confocal de ranuras múltiples sustancialmente incrementa la precisión y exactitud de las posiciones y/o trayectorias de partícula medidas. Las figuras 16C y 16D muestran una primera trayectoria de partícula (16 C) que pasa exactamente en el centro del volumen de observación y una segunda trayectoria de partícula (16D) que pasa lejos del centro del volumen de observación. Las figuras 16C y 16D (parte superior de estos paneles) también indican los perfiles temporales de fluorescencia pronosticados para cada configuración de abertura confocal de ranura doble. La figura 16C muestra que cuando la partícula pasa exactamente a través del centro del volumen de observación (es decir el volumen confocal) el perfil temporal se caracteriza por dos picos agudos idénticos. Como se indica en la figura 16D, sin embargo los dos picos se ensanchan y eventualmente se unen en un solo pico ancho (16D) en el perfil temporal de fluorescencia a medida que la trayectoria de la partícula se aleja del centro del volumen de observación. Esta transición de dos picos a un solo pico en el perfil temporal de fluorescencia provee medios útiles para caracterizar la posición y/o trayectoria de la partícula. En una modalidad, por ejemplo, se utiliza la separación en tiempo entre picos en un perfil temporal observado correspondiente a un evento de detección dado para caracterizar en forma cuantitativa la posición de la partícula en el volumen de observación (por ejemplo, la posición de la partícula a lo largo del eje Z como se muestra en las figuras 16A-16D) . El tiempo que separa los dos máximos en un perfil temporal adquirido utilizando una geometría óptica de abertura confocal de ranuras múltiples provee información importante útil para medir la posición de la partícula, trayectoria de la partícula y/o intensidad de brillantez con exactitud incrementada. Los cambios en la forma y separación de los picos observados utilizando una geometría óptica de abertura confocal de ranuras múltiples también se pueden utilizar en la presente invención para determinar la forma de la partícula. Cuando una partícula pasa a través del volumen de observación, la fluorescencia medida depende de la brillantez (o intensidad) intrínseca de la partícula y de la posición específica de su trayectoria en el perfil de iluminación, siendo más alta la brillantez mientras más cerca esté del centro del volumen confocal. En una modalidad, el sistema puede analizar perfiles temporales de fluorescencia diferentes generados utilizando la configuración de ranuras múltiples (por ejemplo midiendo la separación en tiempo de dos o más picos en un perfil temporal observado) y asignando en forma apropiada la posición de la partícula a lo largo del eje Z (como se identifica en las figuras 16A-16D) . Una vez que se conoce la posición de la partícula a lo largo del eje Z (como se identifica en las figuras 16A-16D) , se puede calcular la intensidad/brillantez de la partícula con exactitud incrementada. Utilizando está nueva estrategia, sigue existiendo indeterminación, simetría de reflexión con respecto al plano focal, lo cual no afecta el cálculo de la intensidad de iluminación. El análisis de los perfiles temporales generados utilizando una geometría óptica de abertura confocal de ranuras múltiples se puede analizar utilizando una variedad de métodos que incluyen, pero no se limitan a, técnicas de análisis de datos por reconocimiento de patrón, análisis de histograma de conteo de fotones y métodos de espectroscopia de correlación de fluctuación.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1.- Un dispositivo para analizar partículas en una muestra; dicho dispositivo comprende: un contenedor por lo menos parcialmente transparente para contener dicha muestra que contiene dichas partículas; una fuente óptica para generar luz de excitación que se provee a dicha muestra, con lo cual se ocasiona que por lo menos una porción de dichas partículas genere fluorescencia; medios para captar la fluorescencia proveniente de un volumen de observación posicionado dentro de dicho contenedor; medios para mover dicho contenedor, con lo cual se transporta por lo menos una porción de dichas partículas a través de dicho volumen de observación; y un fotodetector en comunicación óptica con dichos medios para captar fluorescencia para recibir y medir las intensidades de por lo menos una porción de dicha fluorescencia proveniente de dicho volumen de observación; con lo cual se genera un perfil temporal de dicha fluorescencia .

2.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dichos medios para mover dicho contenedor hacen girar al contenedor alrededor de un eje de rotación que pasa a través del centro de dicho contenedor.

3.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque dichos medios para mover dicho contenedor hacen girar al contenedor a una velocidad que se selecciona a partir del intervalo de aproximadamente 0.1 revoluciones por segundo hasta aproximadamente 10 revoluciones por segundo.

4.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dichos medios para mover dicho contenedor provee movimiento de translación de dicho contenedor en una dirección vertical.

5.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque dichos medios para mover dicho contenedor invierte verticalmente dicho contenedor a una velocidad que se selecciona a partir del intervalo de aproximadamente 0.01 centímetros por segundo hasta aproximadamente 5 centímetros por segundo.

6.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dichos medios para mover dicho contenedor simultáneamente hacen girar e invierten verticalmente dicho contenedor.

7. - El dispositivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dichos medios para mover dicho contenedor son un motor, componentes electrónicos para conmutación o un dispositivo de placa giratoria excéntrica.

8. - El dispositivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dichos medios para captar fluorescencia proveniente de dicho volumen de observación son un microscopio confocal.

9.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicha fuente óptica genera luz de excitación que está espacialmente colimada.

10.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho volumen de observación está posicionado a una distancia de una pared de dicho contenedor que se selecciona a partir del intervalo de aproximadamente 100 mieras hasta aproximadamente 2000 mieras.

11.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho volumen de observación tiene un volumen que se selecciona a partir del intervalo de aproximadamente 1 x 102 µm3 hasta aproximadamente 1 x 108 µm3.

12.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dichos medios para mover dicho contenedor hacen pasar las partículas a través de dicho volumen de observación una partícula a la vez.

13.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 1, que comprende también un procesador que tiene un algoritmo de reconocimiento de patrón para recibir y analizar dicho perfil temporal generado por dicho fotodetector.

14.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque dicho algoritmo de reconocimiento de patrón iguala rasgos en dicho perfil temporal con patrones predeterminados, caracterizado porque dichos patrones predeterminados corresponden a las intensidades de fluorescencia dependientes del tiempo de las partículas que pasan a través de dicho volumen de observación.

15.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque dichos patrones predeterminados se determinan empíricamente.

16.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque un patrón predeterminado se iguala con un rasgo de dicho perfil temporal cuando las intensidades como una función del tiempo del patrón predeterminado y del perfil temporal están dentro de aproximadamente 20% uno del otro.

17.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque un patrón predeterminado se iguala con un rasgo de dicho perfil temporal cuando la anchura del patrón predeterminado se correlaciona con el tiempo de vuelo de una partícula que pasa a través de dicho volumen de observación.

18.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque dicho algoritmo de reconocimiento de patrón cuenta el número de coincidencias entre los rasgos de dicho perfil temporal y dichos patrones predeterminados .

19.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el número de coincidencias entre los rasgos de dicho perfil temporal y dicho patrón predeterminado es proporcional a la concentración de las partículas en dicha muestra.

20.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque dicho algoritmo de reconocimiento de patrón iguala rasgos en dicho perfil temporal con patrones predeterminados, caracterizado porque dichos patrones predeterminados corresponden a las intensidades de fluorescencia dependientes del tiempo de las partículas que pasan a través de dicho volumen de observación y porque la anchura de dichos patrones predeterminados igualada con los rasgos en dicho perfil temporal es proporcional al tamaño de dichas partículas.

21.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque dicho algoritmo de reconocimiento de patrón genera una salida que comprende un histograma de rasgos igualados que tienen intensidades integradas totales diferentes.

22.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dichas partículas son partículas marcadas en forma fluorescente, partículas intrínsecamente fluorescentes o tanto partículas marcadas en forma fluorescente como partículas intrínsecamente fluorescentes.

23.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dichas partículas se seleccionan a partir del grupo que consiste de: células; virus; bacterias; proteínas; péptidos; agregados de proteína; oligonucleótidos, ADN, complejos de ADN-proteína, ARN, complejos de ARN-proteína, esferas; partículas metálicas; partículas magnéticas; y glóbulos recubiertos con anticuerpo.

24.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho contenedor es una cubeta cilindrica.

25.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 1, que comprende un fotodetector adicional, caracterizado porque dicho fotodetector detecta en forma selectiva fluorescencia proveniente de dicha región de observación que tiene una primera distribución de longitud de onda y dicho fotodetector adicional detecta en forma selectiva luz que tiene una segunda distribución de longitud de onda, y porque dicha primera distribución de longitud de onda es diferente de dicha segunda distribución de longitud de onda.

26.- Un dispositivo para analizar partículas en una muestra; dicho dispositivo comprende: un contenedor por lo menos parcialmente transparente para contener dicha muestra que contiene dichas partículas; una fuente óptica para generar luz de excitación que se provee a dicha muestra, con lo cual se ocasiona que por lo menos una porción de dichas partículas genere fluorescencia; medios para captar la fluorescencia que comprenden un elemento para captación del luz en comunicación óptica con una primera abertura confocal y una segunda abertura confocal, caracterizado porque dicha primera abertura confocal tiene un área de sección transversal que es diferente a la de dicha segunda abertura confocal; un primer fotodetector para detectar fluorescencia proveniente de un primer volumen de observación posicionado dentro de dicho contenedor, dicho primer fotodetector posicionado para detectar la fluorescencia que pasa a través de dicha primera abertura confocal, con lo cual se genera un primer perfil temporal de dicha fluorescencia; un segundo fotodetector para detectar fluorescencia proveniente de un segundo volumen de observación posicionado dentro de dicho contenedor, dicho segundo fotodetector posicionado para detectar la fluorescencia que pasa a través de dicha segunda abertura confocal, con lo cual se genera un segundo perfil temporal de dicha fluorescencia; y medios para mover dicho contenedor, con lo cual se transporta por lo menos una porción de dichas partículas a través de dicho primer volumen de observación y dicho segundo volumen de observación.

27.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque dicha primera abertura confocal tiene un área de sección transversal más pequeña que la de dicha segunda abertura confocal, y porque dicho primer volumen de observación está posicionado dentro de dicho segundo volumen de observación.

28.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque dichos medios para captar la fluorescencia proveniente de dicho volumen de observación son un microscopio confocal.

29.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 26, que comprende también un procesador que tiene un algoritmo de reconocimiento de patrón para recibir y analizar dichos primero y segundo perfiles temporales generados por dichos primero y segundo fotodetectores.

30.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el análisis de dichos primero y segundo perfiles temporales por dicho algoritmo de reconocimiento de patrón determina la distribución de tamaños de dichas partículas.

31.- Un método para analizar partículas en una muestra que contiene dichas partículas, dicho método comprende los pasos de: proveer dicha muestra que contiene partículas en un contenedor por lo menos parcialmente transparente; dirigir luz de excitación sobre dicha muestra, con lo cual se ocasiona que por lo menos una porción de dichas partículas en dicha muestra genere fluorescencia; captar la fluorescencia proveniente de un volumen de observación en dicha muestra y dirigir dicha 10 fluorescencia proveniente de dicho volumen de observación sobre un fotodetector; mover dicho contenedor con lo cual se hace pasar las partículas en dicha muestra a través de dicho volumen de observación; y medir la intensidad de dicha fluorescencia proveniente de dicho volumen de observación como una función del tiempo utilizando dicho fotodetector, con lo cual se genera un perfil temporal de dicha fluorescencia proveniente de dicho volumen de observación.

32.- El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque dicho paso de analizar dicho perfil temporal utilizando un algoritmo de reconocimiento de patrón determina la concentración de particulas en dicha muestra, la distribución de tamaños de las partículas en dicha muestra o ambas.

33.- El método de conformidad con la reivindicación 31, que comprende también el paso de marcar en forma fluorescente dichas partículas en dicha muestra.

34.- El método de conformidad con la reivindicación 31, que comprende también el paso de proveer un microscopio confocal en comunicación óptica con dicha muestra; caracterizado porque dicho microscopio confocal se utiliza para efectuar dichos pasos de dirigir la luz de excitación sobre dicha muestra, captar dicha fluorescencia proveniente de un volumen de observación y dirigir dicha fluorescencia proveniente de dicho volumen de observación hacia un fotodetector.

35.- El método de conformidad con la reivindicación 31, que comprende también el paso de analizar dicho perfil temporal utilizando un algoritmo de reconocimiento de patrón.

36.- El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque dicho paso de analizar dicho perfil temporal utilizando dicho algoritmo de reconocimiento de patrón comprende el paso de igualar rasgos en dicho perfil temporal con patrones predeterminados .

37.- El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque dicho paso de analizar dicho perfil temporal utilizando dicho algoritmo de reconocimiento de patrón también comprende el paso de contar el número de coincidencias entre los rasgos en dicho perfil temporal y dichos patrones predeterminados, con lo cual se determina un número neto de partículas detectadas durante dicho intervalo de tiempo de detección.

38.- El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque dicho paso de analizar dicho perfil temporal utilizando dicho algoritmo de reconocimiento de patrón también comprende el paso de dividir el número neto de particulas detectadas durante dicho intervalo de tiempo de detección entre un volumen total de muestra barrida durante dicho intervalo de tiempo de detección.

39.- El método de conformidad con la reivindicación 38, dicho contenedor es cilindrico, caracterizado porque dicho paso de trasladar dicho contenedor comprende simultáneamente hacer girar e invertir verticalmente dicho contenedor, y porque dicho paso de analizar dicho perfil temporal utilizando dicho algoritmo de reconocimiento de patrón también comprende el paso de determinar una longitud total de una trayectoria de dicho volumen de observación en dicha muestra utilizando la expresión: L = p(d)(Vr)(t) ; en la cual d es el diámetro del contenedor, Vr es la velocidad de rotación del contenedor y t es el intervalo de tiempo de detección seleccionado.

40.- El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque dicho volumen total (V) de muestra barrida durante dicho intervalo de tiempo de detección se provee utilizando la expresión: V = (L) x (Sección transversal) ; en la cual L es la longitud de dicha trayectoria seleccionada y Sección transversal es un área de sección transversal del volumen de observación a lo largo de un eje paralelo al eje de propagación de dicha luz de excitación.

41.- El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la intensidad de dicha fluorescencia proveniente de dicho volumen de observación se detecta como una función del tiempo para un periodo de detección que se selecciona a partir del intervalo de aproximadamente 0.5 segundos hasta aproximadamente 10 minutos.

42.- Un dispositivo para analizar partículas en una muestra; dicho dispositivo comprende: un contenedor por lo menos parcialmente transparente para contener dicha muestra que contiene dichas partículas; una fuente óptica para generar luz de excitación que se provee a dicha muestra, con lo cual se ocasiona que por lo menos una porción de dichas partículas genere fluorescencia; medios para captar la fluorescencia proveniente de un volumen de observación posicionado dentro de dicho contenedor; medios para mover dicho contenedor, con lo cual se transporta por lo menos una porción de dichas partículas a través de dicho volumen de observación; un fotodetector en comunicación óptica con dichos medios para captar fluorescencia para recibir y medir las intensidades de por lo menos una porción de dicha fluorescencia proveniente de dicho volumen de observación; con lo cual se genera un perfil temporal de dicha fluorescencia; y una abertura confocal de ranuras múltiples posicionada entre dicha muestra y dicho fotodetector de manera tal que la fluorescencia pase a través de dicha abertura confocal de ranuras múltiples y sea recibida por dicho fotodetector.

43.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque dichos medios para captar fluorescencia y dicha abertura confocal de ranuras múltiples son componentes de un microscopio confocal.

44.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque dicha abertura confocal de ranuras múltiples es una abertura confocal de ranura doble.

45.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 42, que comprende también un procesador que tiene un algoritmo de reconocimiento de patrón para recibir y analizar dicho perfil temporal generado por dicho fotodetector.

46.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque dicho algoritmo de reconocimiento de patrón determina la posición de dichas partículas en dicha observación.

47.- Un sistema integrado de medición de partícula para analizar partículas en una muestra; dicho dispositivo comprende: un contenedor por lo menos parcialmente transparente para contener dicha muestra que contiene dichas partículas; una fuente óptica para generar luz de excitación que se provee a dicha muestra, con lo cual se ocasiona que por lo menos una porción de dichas partículas genere fluorescencia; medios para captar la fluorescencia proveniente de un volumen de observación posicionado dentro de dicho contenedor; medios para mover dicho contenedor, con lo cual se transporta por lo menos una porción de dichas partículas a través de dicho volumen de observación; un fotodetector en comunicación óptica con dichos medios para captar fluorescencia para recibir y medir las intensidades de por lo menos una porción de dicha fluorescencia proveniente de dicho volumen de observación; con lo cual se genera un perfil temporal de dicha fluorescencia; y medios para introducir particulas en la muestra conectados en forma operativa a dicho contenedor por lo menos parcialmente transparente de modo tal que las particulas se provean a dicha muestra.

48.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque dichos medios para introducir partículas son una entrada que pueda proveer un líquido que contenga partículas o un gas que contenga partículas a dicha muestra.

49.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque dichos medios para introducir partículas a dicha muestra son una entrada que provee un líquido que contenga partículas en forma continua o mediante goteo a dicha muestra.

50.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque dichos medios para introducir partículas a dicha muestra son un tubo que puede burbujear un gas que contenga partículas a través de dicha muestra .