ITMI20120298A1 - Dispositivo e procedimento per rilevare la presenza di particelle fluorescenti disperse in concentrazioni molto basse in un mezzo liquido contenuto in una cuvetta. - Google Patents

Description

"DISPOSITIVO E PROCEDIMENTO PER RILEVARE LA PRESENZA DI PARTICELLE FLUORESCENTI DISPERSE IN CONCENTRAZIONI MOLTO BASSE IN UN MEZZO LIQUIDO CONTENUTO IN UNA CUVETTA"

DESCRIZIONE

Il presente trovato riguarda un dispositivo e procedimento per rilevare la presenza di particelle fluorescenti disperse in concentrazioni molto basse in un mezzo liquido contenuto in una cuvetta. Più particolarmente, il trovato riguarda un dispositivo e un procedimento per rilevare la concentrazione di micro o nanoparticelle quali, ad esempio, cellule, batteri, virus o macromolecole.

Come è noto, per rilevare la concentrazione di particelle fluorescenti disperse in un mezzo liquido contenuto in una cuvetta, la tecnica, come descritto ad esempio nel brevetto statunitense n.

7.973.294, consiste nel far passare nel fuoco dell'obiettivo di un microscopio di fluorescenza ad asse orizzontale il campione contenuto in una cuvetta cilindrica. La cuvetta viene fatta ruotare su se stessa e contemporaneamente viene mossa di moto alternativo lungo il suo asse verticale. La rotazione ha lo scopo di esplorare il campione entro la cuvetta, mentre il moto verticale alternativo serve ad evitare di esplorare sempre lo stesso volume di campione, essendo la velocità di diffusione delle particelle molto bassa rispetto alla velocità di rotazione della cuvetta.

La tecnica sopra descritta per esplorare il campione è molto efficace in quanto fornisce in poche decine di secondi una misura della concentrazione delle particelle contenute nel liquido in esame. La linearità della misura è particolarmente buona alle basse concentrazioni.

Tuttavia, quando le concentrazioni scendono al di sotto di un certo valore, ad esempio nell'ordine di una decina di particelle per millilitro, la misura condotta per un tempo predeterminato non è più sufficientemente affidabile, dato che il contenuto della cuvetta non riesce a scorrere tutto davanti all'obiettivo, vincendo la tendenza delle particelle, che di solito hanno una densità superiore a quella del liquido in cui sono sospese, a scendere verso il fondo della cuvetta.

Questo inconveniente è particolarmente sentito qualora si abbia a che fare con campioni nei quali è importante determinare la presenza anche di una sola particella, come per esempio nel caso di alcuni tipi di batteri nell'acqua potabile.

Compito precipuo del presente trovato è quello di realizzare un dispositivo e procedimento per rilevare la presenza di particelle fluorescenti disperse in concentrazioni molto basse in un mezzo liquido contenuto in una cuvetta, che consentano di rilevare tale concentrazione anche con concentrazioni molto basse delle particelle contenute nel liquido in esame.

Nell'ambito di questo compito, uno scopo del presente trovato è quello di realizzare un dispositivo e procedimento per rilevare la presenza di particelle fluorescenti disperse in concentrazioni molto basse in un mezzo liquido contenuto in una cuvetta, in cui il movimento di traslazione verticale della cuvetta non sia necessario al fine di rilevare correttamente le concentrazioni .

Un altro scopo del presente trovato è quello di realizzare un dispositivo e procedimento per rilevare la presenza di particelle fluorescenti disperse in concentrazioni molto basse in un mezzo liquido, che sia particolarmente adatto per rilevare la concentrazione di particelle quando queste ultime sono disperse a bassa concentrazione entro il mezzo liquido.

Non ultimo scopo del presente trovato è quello di realizzare un dispositivo e procedimento per rilevare la presenza di particelle fluorescenti che siano di elevata affidabilità, di relativamente semplice realizzazione ed a costi competitivi.

Questo compito, nonché questi ed altri scopi che meqlio appariranno in sequito, sono raqqiunti da un dispositivo per rilevare la presenza di particelle fluorescenti disperse in concentrazioni molto basse in un mezzo liquido contenuto in una cuvetta, comprendente una cuvetta atta a contenere un mezzo liquido con particelle fluorescenti disposte in esso, detta cuvetta essendo qirevole attorno al proprio asse, caratterizzato dal fatto di comprendere mezzi atti a generare un flusso entro detta cuvetta, detti mezzi atti a generare un flusso essendo atti ad essere immersi stazionari in detta cuvetta quando detta cuvetta è posta in rotazione attorno al proprio asse, per generare un flusso del liquido contenuto in detta cuvetta.

Ulteriori caratteristiche e vantaggi del trovato risulteranno maggiormente dalla descrizione di una forma di realizzazione preferita, ma non esclusiva, del dispositivo secondo il presente trovato, nonché del relativo procedimento, illustrata a titolo indicativo e non limitativo negli uniti disegni, in cui:

la figura 1 illustra in vista prospettica il dispositivo secondo il trovato;

la figura 2 illustra in vista prospettica, in dettaglio, un particolare del dispositivo secondo il trovato;

la figura 3 illustra sotto forma di schema a blocchi un esempio di apparecchiatura in cui viene impiegato il dispositivo secondo il trovato; e le figure da 4 a 7 illustrano prove sperimentali effettuate con il dispositivo secondo il trovato.

Con riferimento alle figure, il dispositivo secondo il trovato, globalmente indicato dal numero di riferimento 1, comprende una cuvetta 2 di forma ad esempio cilindrica, come illustrato nella figura 1, al cui interno sono atti ad essere inseriti mezzi di generazione di un flusso del liquido contenuto nella cuvetta.

I mezzi, indicato dal numero di riferimento 3, sono opportunamente costituiti da una sorta di madrevite internamente cava. Il canale definito entro la madrevite è indicato dal numero di riferimento 4 .

La madrevite è sospesa stazionaria entro la cuvetta 2. La cuvetta 2 viene posta in rotazione attorno al proprio asse e, per effetto di tale rotazione, si genera un flusso del liquido contenuto nella cuvetta 2, in modo che questo sia forzato a passare davanti ad un obiettivo, come illustrato nella figura 3.

In particolare, i mezzi atti a generare un flusso di fluido entro la cuvetta possono essere realizzati da un tubo cilindrico 5 all'esterno del quale è avvolto a spirale un piano inclinato 20, che assomiglia al verme di una vite, e quindi il tutto ha le sembianze di una madrevite.

La parte superiore dei mezzi atti a generare un flusso 3 è provvista di mezzi di connessione 6 che permettono di connettere i mezzi di generazione di flusso 3 alla struttura dello strumento di misura, mantenendoli sospesi all'interno della cuvetta rotante 2.

In sostanza, quindi, i mezzi generatori di flusso sono costituiti dal tubo cilindrico 5 con rispettivo piano inclinato 20 avvolto a spirale esternamente al tubo cilindrico, che sono sospesi entro la cuvetta 2 che è riempita di liquido.

La cuvetta 2 messa in rotazione attorno al suo asse non è in questo caso dotata di moto alternativo lungo il suo asse, ma è unicamente soggetta ad un moto rotatorio.

La rotazione della cuvetta 2 trascina in rotazione la soluzione in essa contenuta che, se il senso di rotazione della cuvetta è contrario al senso di avvolgimento del piano 20 attorno al canale centrale 4, è costretta dal verme della vite a scorrere verso l'alto, creando una depressione al fondo della cuvetta 2 e una sovrappressione al piano libero.

La differenza di pressione fra il fondo e la sommità della cuvetta 2 forza la soluzione contenuta nella cuvetta a discendere attraverso il canale 4 realizzato all'interno del tubo cilindrico 5, ristabilendo così un equilibrio dinamico.

Il senso di circolazione del fluido all'interno della cuvetta 2, ascendente verso l'esterno e discendente nel canale 4 e viceversa, è determinato dal senso di rotazione della cuvetta 2 che può essere concorde o discorde al senso di avvolgimento del verme.

La portata del flusso deve risultare determinata dalla velocità di rotazione della cuvetta 2 e dall'inclinazione del piano 20 avvolto a spirale attorno al tubo centrale 5, mentre nessuna influenza deve essere esercitata dalla perdita di carico del canale centrale, la cui sezione è opportuno che sia leggermente sovradimensionata in modo tale che il flusso risultante sia sufficientemente ordinato.

La figura 3 illustra schematicamente la strumentazione impiegata per determinare l'efficienza del dispositivo secondo il trovato nel rilevare la concentrazione di particelle.

Il numero di riferimento 10 indica una sorgente laser che emette un'onda laser che passa attraverso uno specchio dicroico 11 per arrivare ad eccitare batteri resi fluorescenti da un anticorpo specifico marcato con probe fluorescente sospeso nel liquido contenuto nella cuvetta 2.

Lo specchio dicroico 11 riflette verso un sensore PMT 12 la lunghezza d'onda di fluorescenza emessa dai batteri marcati.

Il sensore 12 converte il segnale ottico ricevuto in un segnale elettrico che viene acquisito da un'elettronica di acquisizione 13, elaborato da mezzi di elaborazione 14, e analizzato mediante mezzi di analisi 15.

Partendo da una concentrazione iniziale di circa 2000 batteri per millilitro, sono state condotte misure dimezzando ogni volta la concentrazione, fino ad arrivare a una concentrazione di pochi batteri per mi.

La misura è stata condotta cinque volte, ed è stata fatta una media aritmetica dei contenuti trovati .

Per lo stesso campione, per ogni concentrazione, è stata effettuata una serie di cinque misure facendo ruotare la cuvetta 2 mentre questa era dotata di movimento alternativo lungo il suo asse di rotazione (quindi secondo la soluzione della tecnica nota, in assenza di mezzi generatori di flusso) , e una serie di cinque misure facendo ruotare la cuvetta non dotata di moto verticale, ossia la cuvetta secondo il trovato, ed immergendo nella soluzione i mezzi di generazione di flusso come precedentemente descritto.

I risultati di ogni misura sono indicati nei grafici delle figure da 4 a 7. Si osserva che, a concentrazioni maggiori, i conteggi ottenuti nelle misure con la vite sono inferiori a quelli ottenuti con la vite, mentre il comportamento si inverte alle concentrazioni molto basse.

Il minor numero di conteggi nelle misure con la vite a concentrazione maggiore è dovuto alla minore velocità di rotazione della colonna liquida in presenza della vite, che ne ostacola il movimento e, quindi, alla minore quantità di liquido scansito, nel medesimo tempo, rispetto alla quantità di liquido scansito in assenza della vite.

È stato determinato il tempo necessario a scansire una quantità di liquido prolungando il tempo delle misure con la vite alle concentrazioni più elevate, fino ad ottenere lo stesso numero di conteggi ottenuti nelle misure senza vite. Questa procedura assicura che nelle due serie di misure, senza vite e con vite, si scansisca la stessa quantità di soluzione.

Si è in pratica constatato come il dispositivo secondo il trovato permetta di rilevare la concentrazione di particelle fluorescenti disperse in un mezzo liquido contenuto in una cuvetta senza ricorrere alla movimentazione della cuvetta lungo il suo asse verticale, ma utilizzando mezzi atti a generare un flusso entro la cuvetta.

Le misure ottenute a concentrazioni basse sono molto più affidabili rispetto a quanto ottenuto nei dispositivi di tipo noto.

Il dispositivo e il procedimento così concepiti sono suscettibili di numerose modifiche e varianti, tutte rientranti nell'ambito delle allegate rivendicazioni; inoltre, tutti i dettagli potranno essere sostituiti da altri elementi tecnicamente equivalenti.

In pratica, i materiali impiegati, nonché le dimensioni e le forme contingenti, potranno essere qualsiasi a seconda delle esigenze e dello stato della tecnica.

Claims (9)

1. RIVENDICAZIONI 1. Dispositivo (1) per rilevare la presenza di particelle fluorescenti disperse in concentrazioni molto basse in un mezzo liquido contenuto in una cuvetta, comprendente una cuvetta (2) atta a contenere un mezzo liquido con particelle fluorescenti disposte in esso, detta cuvetta essendo qirevole attorno al proprio asse, caratterizzato dal fatto di comprendere mezzi (3) atti a qenerare un flusso entro detta cuvetta (2), detti mezzi atti a qenerare un flusso essendo atti ad essere immersi stazionari in detta cuvetta quando detta cuvetta (2) è posta in rotazione attorno al proprio asse, per qenerare un flusso del liquido contenuto in detta cuvetta (2).
2. 2. Dispositivo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detti mezzi (3) atti a qenerare un flusso entro detta cuvetta comprendono un corpo tubolare (5) al cui esterno è avvolto a spirale un piano inclinato (20).
3. 3. Dispositivo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto corpo tubolare (5) è internamente cavo.
4. 4. Dispositivo secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detto corpo tubolare (5) è provvisto di mezzi di connessione (6) atti a permettere la sospensione di detto corpo tubolare (5) all'interno di detta cuvetta rotante (2).
5. 5. Dispositivo secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che il senso di avvolgimento di detto piano inclinato (20) è concorde con il senso di rotazione di detta cuvetta (2).
6. 6. Dispositivo secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che il senso di avvolgimento di detto piano inclinato (20) è discorde rispetto al senso di rotazione di detta cuvetta (2).
7. 7. Procedimento per rilevare la presenza di particelle fluorescenti disperse in concentrazioni molto basse in un mezzo liquido contenuto in una cuvetta, comprendente le seguenti fasi: predisporre una cuvetta (2) contenente un mezzo liquido con particelle fluorescenti disperse in esso; porre in rotazione detta cuvetta (2) attorno al suo asse; caratterizzato dal fatto di comprendere una fase che consiste nell 'immergere in detta cuvetta (2) mezzi (3) atti a generare un flusso del mezzo liquido contenuto nella cuvetta, in modo che si generi una circolazione di fluido entro detta cuvetta, detti mezzi (3) di generazione di flusso essendo sospesi stazionari entro detta cuvetta (2).
8. 8. Procedimento secondo la rivendicazione 7, caratterizzato dal fatto che detti mezzi (3) atti a generare un flusso del fluido contenuto entro detta cuvetta comprendono un corpo tubolare (5) al cui esterno è avvolto a spirale un piano inclinato (20), il senso di avvolgimento del piano (20) attorno al corpo tubolare (5) essendo concorde con il senso di rotazione di detta cuvetta (2).
9. 9. Procedimento secondo la rivendicazione 7, caratterizzato dal fatto che detti mezzi (3) atti a generare un flusso entro detta cuvetta (2) comprendono un corpo tubolare (5) all'esterno del quale è avvolto a spirale un piano inclinato (20), il senso di avvolgimento di detto piano inclinato essendo discorde rispetto al senso di rotazione di detta cuvetta (2).