KR20170023180A - 호스트-게스트 금속 유기 구조체 시스템 - Google Patents

Abstract

본 발명은 캡슐 구조체의 형성을 촉진하는 생체분자를 MOF 전구체와 용액 중에서 조합하는 단계를 포함하는, 생체분자를 캡슐화하는 구조체를 가진 금속 유기 구조체 (MOF)의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

호스트-게스트 금속 유기 구조체 시스템 {HOST-GUEST METAL ORGANIC FRAMEWORK SYSTEMS}

본 발명은 일반적으로 호스트-게스트 금속 유기 구조체 (MOF) 시스템에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 생체분자를 포함하는 MOF 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

MOF는, 다관능성 유기 리간드에 의해 배위 결합된, 금속 이온, 예를 들어 금속 이온 또는 금속 산화물을 포함하는 금속 클러스터로 형성된, 하이브리드 배위 구조체이다. 그 결과 다공성이 높을 수 있는 1차, 2차 또는 3차 구조가 구축된다.

MOF의 다공성은 채널로 연결된 케이지 형태에 공간적으로 배치된 공동 (cavity)으로서 시각화될 수 있다. 금속 이온과 유기 리간드에 대한 구체적인 선택에 따라, 개방형 마이크로포어와 메조포어 형태의 공동을 가진 MOF를 이용할 수 있다.

공동의 고유한 크기 특징과 공간적인 분포는 MOF에게 수천 ㎡/g 수준의 표면적을 제공해준다. 유익하게는, 공동 표면의 화학적 특성 역시 MOF 구조체의 유기 카운터파트에 적용되는 전통적인 유기 화학을 이용해 맞춤형으로 조정될 수 있다.

MOF는, 이의 고유한 다공성 특징으로 인해, 그 내부에 원하는 구성 성분을 넣어 호스트-게스트 MOF 시스템을 형성하는, 이상적인 다공성 매트릭스이다. 이 시스템은 게스트 종들의 특성에 따라 기체 저장/분리 디바이스, 촉매, 약물 전달, 광전자 및 감지용으로 활용하기에 매우 매력적이다. 그 예로, MOF 매트릭스는 MOF 구조체를 통해 특정 화학 종의 확산을 허용함으로써, 그 내부에 들어 있는 화학 활성 종과 만나게 하여 특이적인 화학적 반응을 촉진하는 크기-선택형 필터로서 작용할 수 있다.

호스트-게스트 MOF 시스템은, 예를 들어 공업적인 규모의 효소 촉매, 약물 전달 시스템, 고 민감성 바이오-분석 및 바이오-센서에 매우 활용가능할 것이므로, 호스트-게스트 MOF 시스템을 제조하는데 있어 특히 매력적인 게스트 유형은 생체분자이다. 전형적으로, 이러한 활용을 위해서는 생물학적으로 활성인 종을 생물학적 활성을 손상시키지 않으면서 지지체 상에서 안정화시켜야 한다.

그러나, 이러한 시스템의 개발은 여전히 초기 단계에 불과하다. 생체분자를 캡슐화하는 MOF를 수득하기 위해 이용가능한 방식들은 대부분 기-형성된 MOF에 대상 생체분자를 침투시키는 방법 (합성 후 침투)을 기초로 한다.

합성 후 침투 방법의 예는 Vasiliki Lykourinou, Yao Chen, Xi-Sen Wang, Le Meng, Tran Hoang, Li-June Ming, Ronald L. Musselman, and Shengqian Ma, 'Immobilization of MP-11 into a Mesoporous Metal-Organic Framework, MP-11@mesoMOF: A New Platform for Enzymatic Catalysis', Journal of the American Chemical Society, 133 (2011), 10382; Yao Chen, Vasiliki Lykourinou, Carissa Vetromile, Tran Hoang, Li-June Ming, Randy W. Larsen, and Shengqian Ma,' How Can Proteins Enter the Interior of a MOF? Investigation of Cytochrome c Translocation into a MOF Consisting of Mesoporous Cages with Microporous Windows', Journal of the American Chemical Society, 134 (2012), 13188; Yao Chen, Vasiliki Lykourinou, Tran Hoang, Li-June Ming, Shengqian Ma, 'Size-selective biocatalysis of myoglobin immobilized into a mesoporous metal-organic framework with hierarchical pore sizes', Inorganic Chemistry, 51 (2012), 9156에서 찾을 수 있다.

그러나, 이런 방법들은, 예를 들어, MOF 구조체 안에 침투시킬 수 있는 생체분자의 양, 크기 및 타입 등의 몇가지 한계를 가진다. 또한, 침투된 MOF 내부에서 생체분자의 분포가 호스트 구조체 전체적으로 균일하지 않다. 아울러, 합성 후 침투 방법은 게스트 생체분자의 특이적인 생활성의 소실을 야기할 수도 있다.

따라서, 상기한 한가지 이상의 문제를 해결하는, MOF 구조체 안에 생체분자를 캡슐화하기 위한 대안 프로토콜의 개발 가능성이 남아있는 실정이다.

본 발명은, 용액 중에서 캡슐 구조체의 형성을 촉진하는 생체분자와 MOF 전구체를 조합하는 단계를 포함하는, 생체분자를 캡슐화하는 구조체를 가진 MOF의 제조 방법을 제공한다.

본 발명은, 생체분자가 용액 중에서 MOF 전구체와 조합되었을 때, MOF의 형성을 촉진 또는 촉발할 수 있다는 놀라운 효과를 토대로 한다. 즉, 생체분자가 이를 둘러싼 구조체 형성에 시드 (seed)로서 효과적으로 작용하여, 생체분자가 캡슐화되는 구조체를 형성할 수 있다는 것을 확인하였다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 생체분자는 구조체를 형성하기 위한 이질적인 핵생성 센터 (heterogeneous nucleation centre)로서 작용하는 것으로 보인다.

생체분자는, 유익하게는, 생체분자의 부재시에는 MOF가 형성될 수 없는 조건에서, 용액 중에서 MOF의 형성을 촉진한다. 예를 들어, MOF의 형성은 유익하게는 실온에서 촉진될 수 있다.

아울러, 생체분자에 의해 촉진되는 MOF 형성은 신속할 수 있으며, 전형적으로 MOF 형성과 생체분자의 캡슐화는 수분내에 이루어진다. 이는 본 발명을 산업적인 스케일로 활용하는데 특히 유익하다.

본 발명은 유익하게는 구조체 내부에 생체분자의 균일한 분포를 제공할 수 있으며, 그래서 전통적인 합성 후 함침 방법을 통해 제조되는 MOF/생체분자 시스템과 비교해, 형성되는 MOF는 캡슐화되는 생체분자를 단위 중량 또는 단위 부피 당 더 많이 포함시킬 수 있다.

다양한 범위의 생체분자들이 본 발명에 따라 이용될 수 있다.

일 구현예에서, 생체분자는 아미노산, 펩타이드, 단백질 또는 핵산이다.

당해 기술 분야의 당업자라면, 단백질 및 핵산과 같은 생체분자의 생활성이 분자의 입체 구조와 밀접하게 관련있다는 것을 알 것이다.

유익하게는, 본 발명에 따른 생체분자의 캡슐화는 생체분자의 천연 구조를 유지시킬 수 있다. 즉, 캡슐화된 생체분자는 본래의 생활성을 유지할 수 있다. 그래서, 캡슐 구조체는 유익하게는 생체분자에 대해 보호 지지체를 제공해준다. 구조체의 보호력은 구조체와 게스트 생체분자 간의 전하에 의한 상호작용에 기인한 것으로 보이며, 그래서 생체분자의 안정성이 상당히 강화된다.

본 발명은 다양한 여러가지 MOF들에 적용가능하다. 예를 들어, MOF는 비정질 또는 결정질일 수 있다. 또한, MOF는 메조-MOF 또는 마이크로-MOF일 수 있다.

일 구현예에서, MOF는 결정질 MOF이다. MOF의 결정질 특성은 구조체 내부의 고유 공동 (intrinsic cavity)의 규칙적이고 공간적으로 질서정연한 분포로부터 기인한다. 고유 공동의 크기는 각각의 구체적인 결정질 MOF의 특징으로서, 수개의 단위 (unit)에서부터 수십 옹스트롬(Å)에 이르는 범위일 수 있다. 고유 공동들의 크기 분포도는 매우 좁을 수 있으며, 그래서 이러한 물질은 예를 들어 여과 또는 흡수되는 물질의 정확한 크기 선택성이 요구되는 용도에 적합할 수 있다.

또한, 본 발명은, 유익하게는, 고유 공동과 생체분자 간의 상대적인 치수와 상관없이, 결정질 MOF 안에 생체분자를 캡슐화할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 구조체의 고유 공동 보다 상당히 큰 단백질 또는 핵산과 같은 생체분자를 결정질 MOF 안에 캡슐화할 수 있다. 본 방법은 전통적인 합성 후 침투 방법과 같은 방법으로는 불가능한 독특한 MOF를 제공할 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한, 용액 중에 MOF 전구체를 캡슐 구조의 형성을 촉진하는 생체분자와 조합하는 단계를 포함하며, 생체 분자가 구조체의 고유 공동의 최대 공동 직경 보다 큰 최소 치수를 가지는, (i) 고유 공동 영역을 한정하며, (ii) 생체분자를 캡슐화하는 구조체를 가진 결정질 MOF의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은, 생체 분자가 구조체의 고유 공동의 최대 공동 직경 보다 큰 최소 치수를 가지는, (i) 고유 공동 영역을 한정하며, (ii) 생체분자를 캡슐화하는 구조체를 가진 결정질 MOF를 제공한다.

본 발명에 따라 형성되는 MOF는, MOF 안에 게스트 생체분자가 균일하게 분산된 연속적인 호스트 매트릭스 상을 형성하는, 독특한 바이오-컴포지트 (bio-composite)로서 가시화될 수 있다.

일 구현예에서, 생체분자는 단백질 또는 핵산이다.

또한, 놀랍게도, 생체분자가 형성되는 MOF의 카이네틱스, 형태 및 결정화도에 영향을 미칠 수 있는 것으로 확인되었다.

캡슐화된 생체분자의 생화학적 특징들이 유익하게는 보존될 수 있어, 본 발명의 MOF/생체분자 시스템은 유익하게는 높은 생활성, 예외적인 보호력과 촉발제-방출 특성을 가질 수 있으며, 산업-스케일의 효소 촉매, 효소 치료 산업 (enzyme industrial remediation), 약물 전달 시스템, 고 민감성 생물-분석법 및 바이오센서에 잠재적인 적용가능성을 제공할 수 있다. 본 발명의 MOF/생체분자 시스템은 또한 의학 분야와 연구 분야에서 일반적으로 활용될 수 있다.

본 발명에 대한 다른 측면들 및/또는 구현예들은 아래에서 보다 상세하게 논의된다.

이제 본 발명의 구현예들은 하기 비-제한적인 도면을 참조하여 설명될 것이다.
도 1은 (a) ZIF-8과 (b) ZIF-65의 고유 공동을 개략적으로 도시한 것이다.
도 2는 구조체 안에 캡슐화된 생체분자를 가진 MOF의 합성 예를 개략적으로 도시한 것이다.
도 3은 다양한 아미노산을 이용해 시딩된 ZIF-8의 형성 효율을 나타낸 것이다. 효율은 실시예 1에 기술된 바와 같은 광 산란 측정법 (optical scattering measurement)으로 측정된다.
도 4는 (a-k) (a) 소 혈청 알부민 (BSA), (b) 오발부민 (OVA), (c) 리보뉴클레아제 A, (d) 인간 혈청 알부민 (HSA), (e) 피롤로퀴놀린 퀴논 의존적인 글루코스 데하이드로게나제 ((PQQ)GDH), (f) 리파제, (g) 헤모글로빈, (h) 리소자임, (i) 인슐린, (j) 호스래디시 퍼옥시다제 (HRP), (k) 본 발명의 일 구현예 방법에 따라 합성된 트립신, (m) 우레아제 및 (n) 올리고뉴클레오티드가 캡슐화된 ZIF-8에 대한 주사 전자 현미경 (SEM) 사진들을 도시한 것이다. 도 (4)(l)은 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)-표지된 소 혈청 알부민 (BSA) 생체분자가 캡슐화된 ZIF-8 결정의 발광 사진이다. 사진은 공초점 주사 레이저 현미경 (CLSM, 메인 이미지)을 이용해 기록하였다. 도 4에서 스케일 바 (Scale bar)는 1 ㎛이다.
도 5는 생체분자가 캡슐화된 ZIF-8의 X선 회절 (XRD) 패턴을 도시한 것이다. 샘플은 실시예에 기술된 바와 같이 본 발명의 구현예에 따라 수득하였으며, XRD 패턴은 순수 ZIF-8의 모의 회절 패턴과 비교한다.
도 6은 (a) BSA@ZIF-8, (b) HRP@ZIF-8 및 (c) 우레아제@ZIF-8 샘플에 대해 측정한 소각 X선 산란 (SAXS) 데이타를 도시한 것이다.
도 7은 발광 FITC-표지된 BSA@ZIF-8 결정의 공초점 주사 레이저 현미경 사진들을 취합한 것이다. 일련의 사진들은 z 축을 따라 초점면을 126 nm 증분으로 이동시켜 수득한 연속 사진이다.
도 8은 (a) 도 7의 FITC-표지된 BSA@ZIF-8 결정에 대한 차등 간섭 위상차 (DIC) 사진; (b) 동일 샘플의 3D 평면도 (top view)의 CLSM 사진; (c, d) z 축을 따라 도 7의 사진들을 겹쳐 수득하여 각각 x 및 y 방향으로 관찰한 도 7의 연속 사진들에 대한 3D 재구성 결과를 도시한 것이다.
도 9는 단백질분해제의 존재시 및 끓는 물에 처리한 후 (PQQ)GDH@ZIF-8 대 유리형 (PQQ)GDH의 정규화된 생성물 변환율 (normalized product conversion)을 도시한 것이다.
도 10은 80℃ 수중에서 1시간 수열 처리하기 전과 처리한 이후의 우레아제@ZIF-8 대 유리형 우레아제의 정규화된 생성물 변환율을 도시한 것이다.
도 11은 (a-d) 본 발명의 구현예에 따라 먼저 MOF 안에 캡슐화한 단백질의 pH-촉발성 방출을 개략적으로 예시한 것이다. 도 11(e)는 여러 pH에서 시간에 따른 BSA 방출을 보여주는 해당 실험 데이타를 도시한 것이다. 도 11(f-i)는 효소를 함유한 MOF와 다른 단백질을 함유한 MOF의 혼합물에 대해 수행된 비슷한 pH-강하 검사를 나타낸 것이다. 도 11(j)는 트립신이 캡슐화된 ZIF-8과 DQ-오발부민 (DQ-OVA)이 캡슐화된 ZIF-8의 혼합물에서 측정한 해당 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 pH 6.0에서 BSA@ZIF-8 결정의 시간 경과에 따른 점진적인 분해를 보여주는 SEM 사진이다.
도 13은 MOF 전구체 (80 mM HmIm 및 아연 아세테이트 20 mM)에 대해 BSA의 양을 증가시키면서 본 발명의 구현예에 따라 제조한 생체분자를 함유한 ZIF-8의 SEM 사진을 도시한 것이다. 사진은 실온에서 (a) 1 mg, (b) 5 mg, (c) 10 mg 및 (d) 20 mg BSA를 이용해 제조된 샘플에 대한 사진이다.
도 14는 실온에서 BSA 양을 늘리면서 제조한 BSA가 캡슐화된 ZIF-8 샘플에서 측정된 XRD 회절 패턴을 도시한 것이다.
도 15는 BSA의 양 증가에 따른 제조되는 BSA@ZIF-8의 포어 크기 분포를 나타낸 것이다.
도 16은 전통적인 방법으로 합성하고, 비교예 1에 따라 FITC-표지된 BSA를 합성 후 침투시킨, 순수 ZIF-8 결정의 (a) DIC 및 (b) CLSM 사진을 도시한 것이다.
도 17은 BSA (적색), BSA@ZIF-8 (오렌지색), 1시간 동안 70℃에서 SDS (10%) 용액으로 헹군 BSA@ZIF-8 MOF (노란색), ZIF-8 (녹색), BSA 수용액 (1mg mL^{- 1})에 노출시킨 ZIF-8 (청색) 및 BSA 용액과 인큐베이션한 다음 1시간 동안 70℃에서 SDS (10%) 용액으로 헹군 ZIF-8 (보라색)에 대한 푸리에 변환 적외선 (FTIR) 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 18은 열 처리 전과 처리 후에 측정한, ZIF-8으로 캡슐화된 호스래디시 효소 (HRP)의 효소 효율을, 유리형 HRP를 동일한 열 처리 전과 후에 측정한 효소 활성과 비교하여 도시한 것이다.
일부 도면들은 유색 표시 또는 유색 물체를 포함하고 있다. 도면의 유색 버전은 요청시 입수가능하다.

본 발명은 생체분자를 캡슐화하는 구조체를 가진 MFO의 제조 방법을 제공한다.

MOF 구조체의 형성이 생체분자에 의해 촉진될 수 있는 한, 본 발명에서 이용가능한 MOF의 조성은 특별히 제한되지 않는다.

본 발명은 다양한 여러가지 MOF에 적용가능하다. 예를 들어, MOF는 비정질이거나 또는 결정질일 수 있다. 또한, MOF는 메조-MOF 또는 마이크로-MOF일 수 있다.

본 발명에 따른 MOF는 하나 이상의 유기 리간드와 배위된 2 이상의 금속 클러스터를 가진 MOF를 포함한다.

본원에서, '금속 클러스터'라는 표현은 하나 이상의 금속 또는 준금속의 하나 이상의 원자 또는 이온을 포함하는, 금속 모이어티를 의미하는 것으로 의도된다. 이 정의는 유기 리간드 또는 공유 결합된 기를 선택적으로 포함하는 하나의 원자 또는 이온 및 원자들 또는 이온들로 된 군을 포괄한다. 즉, '금속 이온'이라는 표현은, 예를 들어, 금속 이온들, 준금속 이온들 및 금속 산화물들을 포함한다.

MOF 구조의 일부를 형성하는 적절한 금속 이온은 안티늄족 원소 및 란탄족 원소 및 이들의 조합을 비롯해, IUPCA 원소 주기율표의 1족부터 16족의 금속으로부터 선택될 수 있다. 금속 이온은 Li⁺, Na⁺, K⁺, Rb⁺, Be^{2 +}, Mg^{2 +}, Ca^{2 +}, Sr^{2 +}, Ba^{2 +}, Sc³⁺, Y³⁺, Ti^{4 +}, Zr^{4 +}, Hf^{4 +}, V⁵⁺, V⁴⁺, V³⁺, V²⁺, Nb^{3 +}, Nb^{5 +}, Ta^{5 +}, Cr^{6 +}, Cr^{3 +}, Mo^{6 +}, Mo^{3 +}, W⁶⁺, W³⁺, Mn^{4 +}, Mn^{3 +}, Mn^{2 +}, Re^{7 +}, Re²⁺, Fe^{3 +}, Fe^{2 +}, Ru^{4 +}, Ru^{3 +}, Ru^{2 +}, Os^{3 +}, Os^{2 +}, Co^{3 +}, Co^{2 +}, Rh^{3 +}, Rh^{2 +}, Rh⁺, Ir^{4 +}, Ir^{2 +}, Ir⁺, Ni^{2 +}, Pd^{4 +}, Pd^{2 +}, Pt^{4 +}, Pt^{2 +}, Cu^{2 +}, Cu⁺, Ag⁺, Au⁺, Zn^{2 +}, Cd^{2 +}, Hg^{2 +}, B³⁺, Al^{3 +}, Ga³⁺, In^{3 +}, TI³⁺, Si^{4 +}, Si^{2 +}, Ge^{4 +}, Ge^{2 +}, Sn^{4 +}, Sn^{2 +}, Pb^{4 +}, Pb^{2 +}, As^{5 +}, As^{3 +}, Sb^{5 +}, Sb^{3 +}, Bi⁵⁺, Bi^{3 +}, La^{3 +}, Ce^{3 +}, Ce^{4 +}, Pr^{3 +}, Pr^{4 +}, Nd^{3 +}, Sm^{3 +}, Sm^{2 +}, Eu^{3 +}, Eu^{2 +}, Gd^{3 +}, Tb^{3 +}, Tb^{4 +}, Dy³⁺, Ho^{3 +}, Er^{3 +}, Tm^{3 +}, Tm^{2 +}, Yb^{3 +}, Yb^{2 +}, Lu^{3 +}, Th⁴⁺, U⁶⁺, U⁵⁺, U⁴⁺, U³⁺ 및 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다.

적합한 금속 이온과 배위하는 유기 리간드는 옥살산, 말론산, 숙신산, 글루타르산, 프탈산, 이소프탈산, 테레프탈산, 시트르산, 트리메스산, 1,2,3-트리아졸, 피로다이아졸 또는 스쿠아르산으로부터 유래될 수 있다.

본 발명의 목적에 적합한 유기 리간드로는 WO 2010/075610 및 Filipe A. Almeida Paz, Jacek Klinowski, Sergio M. F. Vilela, Joao P. C. Tome, Jose A. S. Cavaleiro, Joao Rocha, 'Ligand design for functional metal-organic frameworks', Chemical Society Reviews, 2012, Volume 41, pages 1088-1110에 열거된 유기 리간드 등이 있으며, 상기 문헌들의 내용은 그 전체가 본 명세서에 포함된다.

일부 구현예들에서, MOF는 란탄족 원소 (Ln) MOF이며, 예를 들어 Er(bdc), Dy(bdc), Tb(bpdc), Gd(bpdc) 및 Tb(bpydc), Tb(bdc), Eu(bdc), Gd(bdc) 또는 Ln(bpedc)이며, 여기서 bdc = 1,4-벤젠다이카르복실레이트, bpdc = 4,4'-바이페닐다이카르복실레이트, bpydc = 2,2'-바이피리딘-5,5'-다이카르복실레이트, bpedc = 바이페닐에텐-4,4'-다이카르복실레이트이다.

일부 구현예들에서, MOF는 MC-MOF라고 하는 혼성 컴포넌트 MOF (mixed component MOF)로부터 선택된다. MC-MOF는 2종 이상의 유기 리간드 및/또는 금속을 특징으로 하는 구조를 가진다. MC-MOF는, MOF 전구체와 생체분자가 조합되는 용액 중에 여러가지 유기 리간드 및/또는 금속을 바로 사용하거나, 또는 형성된 MOF의 유기 리간드 및/또는 금속 종을 합성한 다음 후 치환함으로써 수득할 수 있다. MC-MOF에 대한 구체적인 예들은 A.D. Burrows, CrystEngComm 2011, Volume 13, pages 3623-3642에서 찾을 수 있으며, 이 문헌의 내용은 그 전체가 본 명세서에 포함된다.

일부 구현예들에서, MOF는 아연 이미다졸레이트 구조체 (ZIF: zinc imidazolate framework)이다. ZIF는, (i) 생리 조건에서 장기간 안정적이고, (ii) 이의 금속-유기 리간드 결합이 pH 반응성 특성을 가져, pH-유도성 약물 전달 용도에 촉발제로서 사용가능하며, (iii) 세포독성이 미미하기 때문에, 생물학적 용도로 특히 적합한 MOF의 하위 유형이다. 아울러, ZIF는 수중에서 합성가능하며, 수중에서 심지어 고온에서도 장기간 (예, 수 주간) 화학적으로 안정적이다. ZIF의 수중 안정성으로 인해, ZIF는 생물학적 환경에서 사용하기 위한 생체분자를 호스팅하는 바람직한 매트릭스이다.

ZIF 구조체는 유기 이미다졸레이트 유기 리간드들로 연결된 사면체 형태로 배위된 전이 금속 이온 (예, Fe, Co, Cu, Zn)이 특징적이며, 따라서 3차원의 다공성 고형체를 형성한다. 제올라이트와 유사하게, ZIF는 열 안정성과 화학적 안정성이 우수하다. 전구체의 선택에 따라, 현재 본 발명에 따르면, 생체분자의 선택에 따라, 수많은 ZIF 토폴로지 (topology)들을 합성할 수 있다.

이에, 본 발명에 따라 제조될 수 있는 MOF는 카르복실레이트-계 MOF, 헤테로사이클릭 아졸레이트-계 MOF, 금속-시아니드 MOF일 수 있다. 본 발명에 따라 제조될 수 있는 MOF에 대한 구체적인 예로는, CD-MOF-1, CD-MOF-2, CD-MOF-3, CPM-13, FJI-1, FMOF-1, HKUST-1, IRMOF-1, IRMOF-2, IRMOF-3, IRMOF-6, IRMOF-8, IRMOF-9, IRMOF-13, IRMOF-20, JUC-48, JUC-62, MIL-101, MIL-100, MIL-125, MIL-53, MIL-88 (MIL-88A, MIL-88B, MIL-88C, MIL-88D 시리즈 등), MOF-5, MOF-74, MOF-177, MOF-210, MOF-200, MOF-205, MOF-505, MOROF-2, MOROF-1, NOTT-100, NOTT-101, NOTT-102, NOTT-103, NOTT-105, NOTT-106, NOTT-107, NOTT-109, NOTT-110, NOTT-111, NOTT-112, NOTT-113, NOTT-114, NOTT-140, NU-100, rho-ZMOF, PCN-6, PCN-6', PCN9, PCN10, PCN12, PCN12', PCN14, PCN16, PCN-17, PCN-21, PCN46, PCN66, PCN68, PMOF-2(Cu), PMOF-3, SNU-5, SNU-15', SNU-21S, SNU-21H, SNU-50, SNU-77H, UiO-66, UiO-67, soc-MOF, sod-ZMOF, TUDMOF-1, UMCM-2, UMCM-150, UTSA-20, ZIF-2, ZIF-3, ZIF-4, ZIF-8, ZIF-9, ZIF-10, ZIF-11, ZIF-12, ZIF-14, ZIF-20, ZIF-21, ZIF-23, ZIF-60, ZIF-61, ZIF-62, ZIF-64, ZIF-65, ZIF-67, ZIF-68, ZIF-69, ZIF-70, ZIF-71, ZIF-72, ZIF-73, ZIF-74, ZIF-75, ZIF-76, ZIF-77 또는 ZIF-90와 같이 당해 기술 분야에 일반적으로 공지된 것이 있다.

일 구현예에서, MOF는 비정질이다.

비정질 MOF (aMOF)의 경우, 금속 클러스터와 유기 리간드는 검출가능한 공간적인 질서가 없는 구조체를 형성한다. aMOF의 공동은 원자들의 불규칙한 공간 분포로 인해 형성되며, MOF 구조체 내에 랜덤 방식으로 공간적으로 배치된다. 원자들의 불규칙적인 정렬은, 확산 산란으로 유발되는 넓은 '험프 (hump)'가 특징적인 X선 회절 패턴을 발생시키며, 따라서 XRD 회절 측정으로는 서로 구별하기 거의 어렵다.

본원에 열거된 임의의 MOF는 aMOF일 수 있다. aMOF의 특징 및 특성은, 예를 들어 Thomas D. Bennett, Anthony K. Cheetham, 'Amorphous Metal-Organic Frameworks', Accounts of Chemical Research 2014, 47, 1555에 기술되어 있으며, 그 내용 전체가 본 명세서에 포함된다.

aMOF의 공동 크기 분포는 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 기법으로 측정할 수 있다. 예를 들어, BET (Brunauer Emmet and Teller) 방법에 기반한 측정법이 Brunauer, S., Emmett, P., and Teller, E. 'Adsorption of gases in multimolecular layers' Journal of the American Chemical Society (1938), 60, 309-319에 제시되어 있다. 여러가지 기체들 (예, 질소, 수소, 아르곤, 헬륨, 탄소 다이옥사이드, H₂0 및 메탄)이 프로브로서 사용될 수 있지만, 기체 프로브로서 질소가 가장 일반적이다.

aMOF의 종류에 따라, 생체분자가 캡슐화된 형성된 구조체의 공동은 예를 들어, BET 측정에서 500 Å 이하의 크기를 가진다.

일 구현예에서, MOF는 결정질이다.

결정질 MOF의 경우, 금속 클러스터가 유기 리간드와 배위 결합되어, 클러스터/유기 리간드 배열로 된 반복 유닛으로 형성된 기하학적으로 규칙적인 네트워크를 형성한다.

결정질 MOF는 통상적으로 공지된 결정학적인 특징 규명 기법으로 규명하였을 때 회절 패턴을 나타낸다. 이는, 예를 들어, X선 분말 회절 (XPD), 그레이징 입사 X-선 회절, 소각 X선 산란 (SAXS), 단결정 X선 회절, 전자 회절, 중성자 회절 및 물질의 결정학 분야의 당업자에게 공지된 기타 기법을 포함한다.

MOF의 결정질 특성은 구조체를 형성하고 있는 고유 공동들의 규칙적이고 공간적으로 질서정연한 분포로부터 기인한다.

본원에서 '고유 공동'이라는 표현은 MOF의 본질적인 특성으로 인해 결정질 MOF에 특이적인, 빈 공간들이 상호연결된 질서정연한 네트워크를 의미하는 것으로 의도된다. 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이, MOF의 고유 공동 네트워크는 MOF의 금속 클러스터 및 유기 리간드의 특이적인 공간적인 배치로부터 기인하며, 임의의 원시 (pristine) 결정질 MOF에 따라 고유하다.

결정질 MOF의 고유 공동은 윈도우 또는 채널로 상호 연결된 규칙적으로 분포된 케이지들에 의해 형성된 것으로서 가시화될 수 있다. 결정질 MOF에서 케이지 및 윈도우/채널의 구체적인 형태는 MOF 구조를 형성하는 화학 종들의 공간적인 배치에 의해 결정된다. 즉, '고유 공동'이라는 표현은 구체적으로는 천연 MOF 구조체의 케이지 및 윈도우/채널이 전체적으로 질서정연하게 배치된 네트워크를 의미한다.

결정질 MOF의 '고유 공동'의 의미를 추가로 정의하기 위해, 도 1을 참조한다. 도 1은 예시적인 이미다졸레이트 구조체 ZIF-8과 ZIF-65의 슈퍼-셀의 고유 공동을 개략적으로 도시한다. 각 슈퍼-셀은 (ZIF-8의 경우) 윈도우 또는 (ZIF-65의 경우) 채널들로 연결된 케이지 9개로 형성된 것으로 나타난다. 도 1의 슈퍼-셀의 실제 화학 구조는 슈퍼-셀의 코너에 아연 이온이 있고, 유기 리간드가 연결 에지에 존재하는 것으로 그려볼 수 있다.

본 발명에 따르면, 결정질 MOF의 고유 공동의 크기는 수학적 모델로 정량한다. 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이, 결정질 MOF의 화학적인 3차 구조는 MOF 구조체를 구성하는 원자들의 특이적인 공간 분포에 기반한 수학적인 모델에 의해 재현할 수 있다. 이 모델로, 고유 공동의 크기, 즉 '최대 공동 직경' (LCD)을 나타내는 파라미터를 추정할 수 있으며, 이때 최대 공동 직경은 임의의 구조체 원자들과 겹쳐지지 않게 MOF 고유 공동 안의 어떤 공간 지점에서 삽입할 수 있는 최고 구형 프로브의 직경을 의미한다.

결정질 MOF의 고유 공동의 LCD 값은 S. Nair and D. S. Sholl, Journal of the American Chemical Society, 132 (2010), 7528에 기술된 공정에 따라 계산되는 것으로 본원에서 의도되며, 이 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

고유 공동은, 결정질 MOF의 종류에 따라, 약 5 Å 내지 약 500 Å, 약 5 Å 내지 약 100 Å, 약 5 Å 내지 약 50 Å, 약 5 Å 내지 약 40 Å, 약 5 Å 내지 약 30 Å, 약 5 Å 내지 약 20 Å, 약 5 Å 내지 약 15 Å, 약 5 Å 내지 약 12 Å, 약 5 Å 내지 약 10 Å, 약 5 Å 내지 약 9 Å, 약 5 Å 내지 약 8 Å, 약 5 Å 내지 약 7 Å, 또는 약 5 Å 내지 6 Å 범위에 포함되는 LCD 값으로 특정될 수 있다.

본 발명은 마이크로-MOF 및 메조-MOF 둘다에 적용가능하다. 이는 전형적으로 생체분자를 메조-MOF의 고유 공동으로 침투시키는 것으로 한정되는, 기존의 후 침투 방법과는 대비된다.

본원에서, 용어 '마이크로-MOF'는 BET에 의해 측정된 공동의 크기 (aMOF의 경우) 또는 고유 공동의 LCD (결정질 MOF의 경우)가 2 nm 미만인 MOF를 지칭한다. 용어 '메조-MOF'는 BET에 의해 측정된 공동의 크기 (aMOF의 경우) 또는 고유 공동의 LCD (결정질 MOF의 경우)가 2 nm - 50 nm인 MOF를 지칭한다.

MOF가 생체분자를 캡슐화하는 한 MOF의 크기는 특별히 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, MOF는 최대 직경이 약 10 nm - 약 500 ㎛, 약 25 nm - 약 250 ㎛, 약 50 nm - 약 100 ㎛, 약 50 nm - 약 50 ㎛, 약 50 nm - 약 25 ㎛, 약 50 nm - 약 10 ㎛, 약 50 nm - 약 5 ㎛, 약 50 nm - 약 2.5 ㎛, 약 50 nm - 약 1 ㎛ 또는 약 50 nm - 약 0.5 ㎛ 범위인 입자 형태로 제공된다.

본원에서, 용어 '생체분자' 및 이의 변형어는 살아있는 유기체로부터 단리된 임의의 화합물 뿐만 아니라 합성 또는 재조합 유사체 또는 모방체, 유도체, 돌연변이 또는 변이체 및/또는 이들의 생활성 단편을 포함한다.

예를 들어, 생체분자는 단백질, 펩타이드, 핵산, 뉴클레오티드 또는 아미노산일 수 있다.

본원에서, 생체분자를 언급하는데 사용되는 용어 '생활성의' 및 '생활성'과 같은 변형어는 생체분자와 하나 이상의 타겟 간의 상호작용을 비롯하여, 생체분자 자체의 특징적인 임의의 생체내 또는 시험관내 활성을 의미한다.

예를 들어, 생활성은 항원에 대한 항체의 선택적인 결합, 효소의 효소 활성 등을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 활성은, 비제한적인 예로, 선택적으로 다른 생체분자 또는 타겟 분자와의 결합, 융합, 결합 형성, 조합, 접근, 촉매 또는 화학 반응을 포함할 수 있다.

본 발명의 방법은 생체분자를 MOF 전구체와 용액 중에서, 예를 들어 도 2의 개락도에 예시된 바와 같이 조합하는 단계를 포함한다.

MOF 전구체는 적절한 용매 내에서 본원에 열거된 금속 이온을 용액 중에 제공하는 당해 기술 분야에 공지된 화합물들을 포함한다. 그러한 화합물은 금속-클로라이드, -나이트레이트, -아세테이트, -설페이트, -하이드로겐 설페이트, -브로마이드, -카보네이트, -포스페이트 및 이들의 유도체, 예를 들어 모노- 및 폴리-수화물 유도체 등의 해당 금속 이온의 염일 수 있다.

적합한 금속 염에 대한 예로는, 비제한적으로, 코발트 나이트레이트 (Co(NO₃)₂·xH₂O), 아연 나이트레이트 (Zn(NO₃)₂·xH₂O), 철(III) 나이트레이트 (Fe(NO₃)₃·xH₂O), 알루미늄 나이트레이트 (Al(NO₃)₃·xH₂O), 마그네슘 나이트레이트 (Mg(NO₃)₂·xH₂O), 칼슘 나이트레이트 (Ca(NO₃)₂·xH₂O), 베릴륨 나이트레이트 (Be(NO₃)₂·xH₂O), 유로퓸 나이트레이트 (Eu(NO₃)₃·xH₂O), 테르븀 나이트레이트 (Tb(NO₃)₃·xH₂O), 이테르븀나이트레이트 (Yb(NO₃)₃·xH₂O), 디스프로슘 (dysprosium) 나이트레이트 (Dy(NO₃)₃·xH₂O), 에르븀 나이트레이트 (Er(NO₃)₃·xH₂O), 갈륨 나이트레이트 (Ga(NO₃)₃·xH₂O), 가돌리늄 나이트레이트 (Gd(NO₃)₃·xH₂O), 니켈 나이트레이트 (Ni(NO₃)₂·xH₂O), 납 나이트레이트 (Pb(NO₃)₂·xH₂O), 카드뮴 나이트레이트 (Cd(NO₃)₂·xH₂O), 망간(II) 나이트레이트 (Mn(NO₃)₂·xH₂O), 코발트 클로라이드 (CoCl₂·xH₂O), 아연 클로라이드 (ZnCl₂·xH₂O), 철(III) 클로라이드 (FeCl₃·xH₂O), 철(II) 클로라이드 (FeCl₂·xH₂O), 알루미늄 클로라이드 (AlCl₃·xH₂O), 마그네슘 클로라이드 (MgCl₂·xH₂O), 칼슘 클로라이드 (CaCl₂·xH₂O), 베릴륨 클로라이드 (BeCl₂·xH₂O), 유로퓸 클로라이드 (EuCl₃·xH₂O), 테르븀 클로라이드 (TbCl₃·xH₂O), 이테르븀클로라이드 (YbCl₃·xH₂O), 디스프로슘 클로라이드 (DyCl₃·xH₂O), 에르븀 클로라이드 (ErCl₃·xH₂O), 갈륨 클로라이드 (GaCl₃·xH₂O), 가돌리늄 클로라이드 (GdCl₃·xH₂O), 니켈 클로라이드 (NiCl₂·xH₂O), 납(II) 클로라이드 (PbCl₂·xH₂O), 카드뮴 클로라이드 (CdCl₂·xH₂O)), 망간(II) 클로라이드 (MnCl₂·xH₂O), 코발트 아세테이트 (Co(CH₃COO)₂·xH₂O), 아연 아세테이트 (Zn(CH₃COO)₂·xH₂O), 철(III) 아세테이트 (Fe(CH₃COO)₃·xH₂O), 철(II) 아세테이트 (Fe(CH₃COO)₂·xH₂O), 알루미늄 아세테이트 (Al(CH₃COO)₃·xH₂O), 마그네슘 아세테이트 (Mg(CH₃COO)₂·xH₂O), 칼슘 아세테이트 (Ca(CH₃COO)₂·xH₂O), 베릴륨 아세테이트 (Be(CH₃COO)₂·xH₂O), 유로퓸 아세테이트 (Eu(CH₃COO)₃·xH₂O), 테르븀 아세테이트 (Tb(CH₃COO)₃·xH₂O), 이테르븀아세테이트 (Yb(CH₃COO)₃·xH₂O), 디스프로슘 아세테이트 (Dy(CH₃COO)₃·xH₂O), 에르븀 아세테이트 (Er(CH₃COO)₃·xH₂O), 갈륨 아세테이트 (Ga(CH₃COO)₃·xH₂O), 가돌리늄 아세테이트 (Gd(CH₃COO)₃·xH₂O), 니켈 아세테이트 (Ni(CH₃COO)₂·xH₂O), 납(II) 아세테이트 (Pb(CH₃COO)₂·xH₂O), 카드뮴 아세테이트 (Cd(CH₃COO)₂·xH₂O), 망간(II) 아세테이트 (Mn(CH₃COO)₂·xH₂O), 코발트 설페이트 (CoSO₄·xH₂O), 아연 설페이트 (ZnSO₄·xH₂), 철(III) 설페이트 (Fe₂(SO₄)₃·xH₂O), 철(II) 설페이트 (FeSO₄·xH₂), 알루미늄 설페이트 (Al₂(SO₄)₃·xH₂O), 마그네슘 설페이트 (MgSO₄·xH₂), 칼슘 설페이트 (CaSO₄·xH₂), 베릴륨 설페이트 (BeSO₄·xH₂), 유로퓸 설페이트 (Eu₂(SO₄)₃·xH₂O), 테르븀 설페이트 (Tb₂(SO₄)₃·xH₂O), 이테르븀설페이트 (Yb₂(SO₄)₃·xH₂O), 디스프로슘 설페이트 (Dy₂(SO₄)₃·xH₂O), 에르븀 설페이트 (Er₂(SO₄)₃·xH₂O), 갈륨 설페이트 (Ga₂(SO₄)₃·xH₂O), 가돌리늄 설페이트 (Gd₂(SO₄)₃·xH₂O), 니켈 설페이트 (NiSO₄·xH₂), 납 설페이트 (PbSO₄·xH₂), 카드뮴 설페이트 (CdSO₄·xH₂), 망간(II) 설페이트 (MnSO₄·xH₂), 코발트 하이드록사이드 (Co(OH)₂·xH₂O), 아연 하이드록사이드 (Zn(OH)₂·xH₂O), 철(III) 하이드록사이드 (Fe(OH)₃·xH₂O), 철(III) 옥사이드:하이드록사이드 (FeO(OH)·xH₂O), 철(II) 하이드록사이드 (Fe(OH)₂·xH₂O), 알루미늄 하이드록사이드 (Al(OH)₃·xH₂O), 마그네슘 하이드록사이드 (Mg(OH)₂·xH₂O), 칼슘 하이드록사이드 (Ca(OH)₂·xH₂O), 베릴륨 하이드록사이드 (Be(OH)₂·xH₂O), 유로퓸 하이드록사이드 (Eu(OH)₃·xH₂O), 테르븀 하이드록사이드 (Tb(OH)₃·xH₂O), 이테르븀하이드록사이드 (Yb(OH)₃·xH₂O), 디스프로슘 하이드록사이드 (Dy(OH)₃·xH₂O), 에르븀 하이드록사이드 (Er(OH)₃·xH₂O), 갈륨 하이드록사이드 (Ga(OH)₃·xH₂O), 가돌리늄 하이드록사이드 (Gd(OH)₃·xH₂O), 니켈 하이드록사이드 (Ni(OH)₂·xH₂O), 납 하이드록사이드 (Pb(OH)₂·xH₂O), 카드뮴 하이드록사이드 (Cd(OH)₂·xH₂O), 망간(II) 하이드록사이드 (Mn(OH)₂·xH₂O), 코발트 브로마이드 (CoBr₂·xH₂O), 아연 브로마이드 (ZnBr₂·xH₂O), 철(III) 브로마이드 (FeBr₃·xH₂O), 철(II) 브로마이드 (FeBr₂·xH₂O), 알루미늄 브로마이드 (AlBr₃·xH₂O), 마그네슘 브로마이드 (MgBr₂·xH₂O), 칼슘 브로마이드 (CaBr₂·xH₂O), 베릴륨 브로마이드 (BeBr₂·xH₂O), 유로퓸 브로마이드 (EuBr₃·xH₂O), 테르븀 브로마이드 (TbBr₃·xH₂O), 이테르븀브로마이드 (YbBr₃·xH₂O), 디스프로슘 브로마이드 (DyBr₃·xH₂O), 에르븀 브로마이드 (ErBr₃·xH₂O), 갈륨 브로마이드 (GaBr₃·xH₂O), 가돌리늄 브로마이드 (GdBr₃·xH₂O), 니켈 브로마이드 (NiBr₂·xH₂O), 납 브로마이드 (PbBr₂·xH₂O), 카드뮴 브로마이드 (CdBr₂·xH₂O), 망간(II) 브로마이드 (MnBr₂·xH₂O), 코발트 카보네이트 (CoCO₃·xH₂O), 아연 카보네이트 (ZnCO₃·xH₂O), 철(III) 카보네이트 (Fe₂(CO₃)₃·xH₂O), 알루미늄 카보네이트 (Al₂(CO₃)₃·xH₂O), 마그네슘 카보네이트 (MgCO₃·xH₂O), 칼슘 카보네이트 (CaCO₃·xH₂O), 베릴륨 카보네이트 (BeCO₃·xH₂O), 유로퓸 카보네이트 (Eu₂(CO₃)₃·xH₂O), 테르븀 카보네이트 (Tb₂(CO₃)₃·xH₂O), 이테르븀카보네이트 (Yb₂(CO₃)₃·xH₂O), 디스프로슘 카보네이트 (Dy₂(CO₃)₃·xH₂O), 에르븀 카보네이트 (Er₂(CO₃)₃·xH₂O), 갈륨 카보네이트 (Ga₂(CO₃)₃·xH₂O), 가돌리늄 카보네이트 (Gd₂(CO₃)₃·xH₂O), 니켈 카보네이트 (NiCO₃·xH₂O), 납 카보네이트 (PbCO₃·xH₂O), 카드뮴 카보네이트 (CdCO₃·xH₂O), 망간(II) 카보네이트 (MnCO₃·xH₂O) 및 이의 혼합물이 있으며, 이때 x는 0 - 12의 범위이다.

또한, MOF 전구체는 MOF 구조체에서 금속 이온 클러스터와 배위 결합하는 본원에 기술된 유형의 유기 리간드를 포함한다. 유기 리간드는 금속 이온과 배위 결합할 수 있는 2 이상의 화학 모이어티를 가진 분자이다. 일부 구현예에서, 이러한 기들은 카르복실레이트, 포스포네이트, 설포네이트, N-헤테로사이클릭 기 및 이들의 조합을 포함한다.

적합한 유기 리간드로는, WO 2010/075610 및 Filipe A. Almeida Paz, Jacek Klinowski, Sergio M. F. Vilela, Joao P. C. Tome, Jose A. S. Cavaleiro, Joao Rocha, Ligand design for functional metal-organic frameworks, Chemical Society Reviews, 2012, Volume 41, pages 1088-1110에 열거된 리간드가 있으며, 그 내용은 전체가 본 명세서에 포함된다.

유리 리간드 전구체에 대한 예로는, 비제한적으로, 4,4',4''-[벤젠-1,3,5-트리틸-트리스(에틴-2,1-다이일)]트리벤조에이트, 바이페닐-4,4'-다이카르복실레이트, 4,4',4''-[벤젠-1,3,5-트리틸-트리스(벤젠-4,1-다이일)]트리벤조에이트, 1,3,5-벤젠트리벤조에이트, 1,4-벤젠다이카르복실레이트, 벤젠-1,3,5-트리스(1H-테트라졸), 1,3,5-벤젠트리카르복시산, 테레프탈산, 이미다졸, 벤즈이미다졸, 2-니트로이미다졸, 2-메틸이미다졸 (HmIm), 2-에틸이미다졸, 5-클로로 벤즈이미다졸, 퓨린, 푸마르산, 알파-사이클로덱스트린, 베타-사이클로덱스트린, 감마-사이클로덱스트린 1,4-비스(1-이미다졸릴)벤젠), 4,4'-비스피리딜, 1,4-다이아자바이사이클로[2.2.2]옥탄, 2-아미노-1,4-벤젠다이카르복실레이트, 2-아미노-1,4-벤젠다이카르복시산, 4,4'-아조벤젠다이카르복실레이트, 4,4'-아조벤젠다이카르복시산, 아닐린-2,4,6-트리벤조에이트, 아닐린-2,4,6-트리벤조산, 바이페닐-4,4'-다이카르복시산, 1,1'-바이페닐-2,2',6,6'-테트라카르복실레이트, 1,1'-바이페닐-2,2',6,6'-테트라카르복시산, 2,2'-바이피리딜-5,5'-다이카르복실레이트, 2,2'-바이피리딜-5,5'-다이카르복시산, 1,3,5-트리스(4-카르복시페닐)벤젠, 1,3,5-트리스(4-카르복실레이트페닐)벤젠, 1,3,5-벤젠트리카르복실레이트, 2,5-다이하이드록시-1,4-벤젠다이카르복실레이트, 2,5-다이하이드록시-1,4-벤젠다이카르복시산, 2,5-다이메톡시-1,4-벤젠다이카르복실레이트, 2,5-다이메톡시-1,4-벤젠다이카르복시산, 1,4-나프탈렌다이카르복실레이트, 1,4-나프탈렌다이카르복시산, 1,3-나프탈렌다이카르복실레이트, 1,3-나프탈렌다이카르복시산, 1,7-나프탈렌다이카르복실레이트, 1,7-나프탈렌다이카르복시산, 2,6-나프탈렌다이카르복실레이트, 2,6-나프탈렌다이카르복시산, 1,5-나프탈렌다이카르복실레이트, 1,5-나프탈렌다이카르복시산, 2,7-나프탈렌다이카르복실레이트, 2,7-나프탈렌다이카르복시산, 4,4',4''-니트릴로트리스벤조에이트, 4,4',4''-니트릴로트리스벤조산, 2,4,6-트리스(2,5-다이카르복실페닐아미노)-1,3,5-트리아진, 2,4,6-트리스(2,5-다이카르복실레이트페닐아미노)-1,3,5-트리아진, 1,3,6,8-테트라키스(4-카르복시페닐)피렌, 1,3,6,8-테트라키스(4-카르복실레이트페닐)피렌, 1,2,4,5-테트라키스(4-카르복시페닐)벤젠, 1,2,4,5-테트라키스(4-카르복실레이트페닐)벤젠, 5,10,15,20-테트라키스(4-카르복시페닐)포르피린, 5,10,15,20-테트라키스(4-카르복실레이트페닐)포르피린, 아데닌, 아데니네이트, 푸마레이트, 1,2,4,5-벤젠테트라카르복실레이트, 1,2,4,5-벤젠테트라카르복시산, 1,3,5-벤젠트리벤조산, 3-아미노-1,5-벤젠다이카르복시산, 3-아미노-1,5-벤젠다이카르복실레이트, 1,3-벤젠다이카르복시산, 1,3-벤젠다이카르복실레이트, 4,4',4''-[벤젠-1,3,5-트리틸-트리스(에틴-2,1-다이일)]트리벤조산, 4,4',4''-[벤젠-1,3,5-트리틸-트리스(벤젠-4,1-다이일)]트리벤조산, 옥살산, 옥살레이트, 푸마르산, 푸마레이트, 말레산, 말리에이트, trans,trans-무코닉산, trans,trans-무코네이트, cis,trans-무코닉산, cis,trans-무코네이트, cis,cis-무코닉산, cis,cis-무코네이트, 피라졸, 2,5-다이메틸피라졸, 1,2,4-트리아졸, 3,5-다이메틸-1,2,4-트리아졸, 피라진, 2,5-다이메틸피라진, 헥사메틸렌테트라아민, 니코틴산, 니코티네이트, 이소니코틴산, 이소니코티네이트, 4-(3,5-다이메틸-1H-피라졸)-벤조산, 2,5-푸란다이카르복시산, 2,5-푸란다이카르복실레이트, 3,5-다이메틸-4-카르복시피라졸, 3,5-다이메틸-4-카르복실레이트피라졸, 4-(3,5-다이메틸-1H-피라졸-4-일)-벤조산, 4-(3,5-다이메틸-1H-피라졸-4-일)-벤조에이트 및 이의 혼합물 등이 있다.

유기 리간드는 또한 관능화된 유기 리간드일 수 있는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 본원에 열거된 유기 리간드들 중 어느 하나는 2-아미노테레프탈산, 우레탄-, 아세트아미드- 또는 아미드- 등과 같이, 아미노-에 의해 추가로 관능화될 수 있다. 유기 리간드는 MOF 형성을 위한 전구체로서 사용되기 전에 관능화되거나, 또는 다른 예로 조립된 MOF 그 자체에 브릿지된 유기 리간드를 관능화하도록 화학적으로 처리될 수 있다.

당해 기술 분야의 당업자는, MOF를 합성하기 위해 사용되는 유기 리간드를 미리-관능화하거나 또는 기-형성된 MOF를 후-관능화함으로써, MOF를 관능기로 관능화할 수 있는 적절한 화학 프로토콜을 알 것이다.

MOF 상에 공급될 수 있는 적절한 관능기로는 -NHR, -N(R)₂, -NH₂, -NO₂, -NH(아릴), 할라이드, 아릴, 아랄킬, 알케닐, 알키닐, 피리딜, 바이피리딜, 테르피리딜, 아닐리노, -O(알킬), 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알키닐, 설폰아미도, 하이드록실, 시아노, -(CO)R, -(SO₂)R, -(CO₂)R, -SH, -S(알킬), -SO₃H, -SO^3-M⁺, -COOH, COO^-M⁺, -PO₃H₂, -PO₃H^-M⁺, -PO3^2-M²⁺, -CO₂H, 실릴 유도체, 보란 유도체, 페로센 및 기타 메탈로센 등이 있으며, 여기서 M은 금속 원자이고, R은 C_1-10 알킬이다.

(i) MOF 전구체가 용매에 용해가능하며, (ii) 생체분자가 용매와 함께 사용가능한 한, MOF 전구체와 생체 분자가 조합되는 용액의 제조에 사용될 수 있는 용매는 특별히 제한되지 않는다. 즉, 용매는 전형적으로 생체분자의 생활성에 좋지 않은 영향을 미치지 않는 것일 것이다.

사용될 수 있는 용매의 예로는 메탄올, 에탄올 다이메틸 설폭사이드 (DMSO), 아세톤, 물 및 이들의 혼합물 등이 있다.

일부 구현예들에서, 생체분자와 MOF 전구체의 조합이 이루어지는 용액은 수용액, 예를 들어 탈이온수 또는 생리 완충액 (KH₂PO₄, NaH₂PO₄, K₂HPO₄, Na₂HPO₄, Na₃PO₄, K₃PO₄, NaCl, KCl, MgCl₂, CaCl₂, 등의 하나 이상의 염을 포함하는 물)이다.

용액에 존재하는 MOF 전구체의 농도는, MOF가 형성되는 한, 특별히 한정되지 않는다.

용액내 MOF 전구체의 농도는 약 0.001 M - 1 M, 약 0.01 M - 0.5 M, 약 0.01 M - 0.2 M, 약 0.02 M - 0.2 M, 약 0.02 M - 0.15 M, 약 0.05 M - 0.15 M, 약 0.08 M - 0.16 M 범위일 수 있다. 그 값은 MOF 전구체와 생체분자를 함유한 용액 총 부피에 대한 유기 리간드의 농도 뿐 아니라 금속 염의 농도를 의미한다.

유리 리간드의 농도와 금속 염의 농도 간의 비율은, 본 발명에 따라 생체분자와의 조합에 의해 MOF의 형성이 촉진되는데 적합한 비율인 한, 특별히 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 유기 리간드 : 금속 염의 비율은 60:1 - 1:60 (mol : mol), 30:1 - 1:30, 10:1 - 1:10, 5:1 - 1:5, 2.5:1 - 1:2.5, 2:1 - 1:2 또는 1.5:1 - 1:1.5의 범위일 수 있다.

본 발명의 방법에 따르면, 생체분자는 캡슐 구조체의 형성을 촉진한다.

생체분자가 캡슐 구조체의 형성을 '촉진한다'라는 것은 생체분자 그 자체가 용액 중에서 MOF 전구체와 조합되었을 때 MOF 구조체의 형성을 야기, 유도 또는 촉발시킨다는 것을 의미한다. 생체분자가 구조체의 형성을 촉진한 결과로서, MOF 구조체는 생체분자를 둘러싸면서 성장하여, 궁극적으로 생체분자를 둘러싼 캡슐을 형성하게 된다.

이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 생체분자 유발성 MOF 형성은 특정 생체분자의 전하, 친수성/소수성 특성 또는 킬레이팅성 (chelating ability)과 관련있을 수 있다. 캡슐 MOF의 형성은, 예를 들어, 분자간의 수소 결합 및 소수성 상호작용에 기인한, 생체분자의 MOF 전구체에 대한 친화성에 의해 촉진된다. NMR 분광측정 및 원소 분석을 통해, 각 생체분자가 용액 중에서 MOF 전구체와 조합되었을 때 MOF 전구체와 배위할 수 있는 것으로, 검증되었다.

(금속 염 전구체의 용해로부터 유래되는) 금속 양이온과 유기 리간드의 국소 농도 증가는, MOF 구조체의 핵생성 전 (pre-nucleation)에 클러스터의 형성을 가능하게 해줄 것이다.

친수성 분자와 음으로 하전된 도메인 또는 모이어티 (예, 카르복시기, 하이드록시기, 아미노기 등)를 가진 분자들이, 보다 강한 소수성 특징과 양으로 하전된 모이어티를 가진 분자들에 비해, MOF의 핵을 형성하는 개선된 핵 형성력을 나타내는 것으로, 확인되었다. 이에, 생체분자의 음으로 하전된 도메인이 용액 중에서 MOF 금속 전구체로부터 제공되는 양으로 하전된 금속 이온을 끌어당겨, MOF 형성의 초기 단계에 금속-유기 리간드 클러스터를 안정시키는데 기여하는 것으로, 추정해 볼 수 있다.

용액 중에서 MOF 전구체를 생체분자와 조합하는 것은, 놀랍게도, MOF 구조체의 형성을 유발하기에 충분하다. MOF 형성을 촉발하기 위한 다른 인자나 시약은 필요없다. 예를 들어, (전형적으로 오븐, 예를 들어 마이크로웨이브 오븐, 핫 플레이트 또는 가열 멘틀과 같은 열 소스의 사용이 요구되는) 전통적인 용매열 (solvothermal) MOF 합성 방법에서 통상적으로 행해지는 바와 같은, 용액에 대한 열 적용이 필요한 것은 아니다.

이에, 일부 구현예에서, 캡슐 구조체의 형성은 100℃ 미만, 90℃ 미만, 75℃ 미만, 50℃ 미만 또는 35℃ 미만의 용액 온도에서 행해진다. 즉, 용액의 온도는 -50℃ 내지 75℃, -50℃ 내지 50℃ 또는 -50℃ 내지 30℃일 수 있다.

일부 구현예들에서, 본 방법은 실온에서 수행된다. 본원에서, '실온'이라는 표현은 약 20℃ 내지 25℃ 온도 범위를 포괄하는 것으로 이해될 것이며, 평균 약 23℃이다. 항체, 파이브로넥틴 당단백질, 단백질분해 효소 및 콜라겐과 같은 열 민감성 단백질의 경우에는 이 온도 보다 낮은 온도에서 본 방법을 수행하는 것이 좋다.

MOF 전구체와 생체분자가 용액으로 투입될 수 있는 순서는 특별히 제한되지 않는다.

예를 들어, 금속 전구체를 함유한 용액을 먼저 유기 리간드가 함유된 용액과 혼합하고, 금속 염과 유기 리간드가 함유된 이 용액에, 생체분자가 함유된 별개의 용액을 후속적으로 도입한다.

다른 예로, 생체 분자와 유기 리간드가 함유된 용액을 먼저 준비한 다음, 금속 전구체가 함유된 별개의 용액에 이를 도입할 수도 있다.

또한, 생체분자와 금속 전구체가 함유된 용액을 먼저 준비한 다음, 유기 리간드가 함유된 별개의 용액에 이를 도입할 수도 있다.

또 다르게는, 금속 전구체, 유기 리간드 및 생체분자가 각각 함유된 각각의 용액을 한꺼번에 동시에 혼합할 수도 있다.

일 구현예에서, MOF 전구체를 포함하는 용액에 생체분자를 첨가한다.

본 발명의 방법에 따른 MOF의 형성은 유익하게는 신속하다. 사용되는 MOF 전구체 타입과 사용되는 생체분자의 타입에 따라, 생체분자와 MOF 전구체를 용액에 함께 투입할 때, 약 1초, 10초, 1분, 10분, 30분, 60분 또는 2시간내에 MOF가 형성될 수 있는 것으로 확인되었다. 동일한 시간, 온도 및 MOF 전구체 농도 조건에서, MOF 전구체 만을 함유한 (즉, 생체분자는 없음) 용액에서는 MOF가 형성되지 않는다는 것도 확인되었다. 다시 말해, 생체분자 자체가 MOF 형성을 촉진하는 것으로 확인되었다.

MOF 구조체 안에 캡슐화된 생체분자는 유익하게는 그 구조체의 전체 공간 전역에 균일하게 분포할 수 있다. 구조체내 생체분자의 분포 프로파일은 공초점 현미경 방출 측정으로 측정할 수 있다. 생체분자의 분포는, 형광 염료로 표지된 캡슐화된 생체분자를 가진 MOF의 임의 평면을 스캐닝하는 공초점 주사 레이저 현미경 (CLSM)을 이용해 기록된 방출 신호의 세기가, 염료의 최적 여기 파장에서 0.12 ㎛씩 증가시키면서 스캐닝하는 경우, 염료의 최적 방출 파장에서 측정하였을 때 10%를 초과하는 편차를 보이지 않는다면, 구조체의 용적 전체에 '균일한'것으로 간주될 것이다.

본 발명과는 대조적으로, 합성 후 침투 방법을 이용해 MOF 안에 생체분자를 침투시키는 방법은 구조체 부피 전체로 생체분자를 균일하게 분포시키기가 본질적으로 불가능하다.

또한, 본 발명의 방법을 통해 수득되는 MOF 내에 캡슐화된 생체분자의 균일한 분포는, 본질적으로, 합성 후 침투 방법에 따른 기-형성된 MOF에 침투시킬 수 있는 단위 용적 당 생체분자의 양과 비교해, MOF 구조체내 캡슐화된 생체분자를 단위 용적 당 더 많은 양으로 제공할 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 방법은, 캡슐화된 단백질의 양 (mg)과 제조된 MOF의 중량 (mg) 간의 비율로 표현하면, 약 1% wt - 약 32% wt의 생체분자, 약 5% wt - 약 30% wt의 생체분자 또는 약 10% wt - 20% wt의 생체분자가 캡슐화된 MOF를 제공할 수 있다. 캡슐화된 단백질의 양은 캡슐화 전과 캡슐화 이후에 액체 용액 샘플에 대해 수행되는 용액 중의 단백질에 대한 UV-Vis 스펙트로스코피 흡광 측정치로부터 유추된다.

생체분자가 '캡슐화된' MOF 구조체는, 구조체가 생체분자를 둘러싸고 있는 것을 의미한다.

유익하게는, 본 발명의 방법은, MOF가, 생체분자를 천연적인 입체 구조 (native conformation) 형태로 캡슐화하는 구조체를 가질 수 있게 한다. 본원에서 '천연적인 입체 구조'라는 표현은 생체분자의 생활성을 초래하는 3차 입체 구조를 의미하는 것으로 사용된다.

예를 들어, 펩타이드, 단백질 또는 핵산 등의 생체분자의 천연적인 입체 구조는 최저 엔탈피 분자 입체 구조를 취하기 위해 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오티드의 자발적이거나 또는 유도된 폴딩 (assisted folding)에 의해 형성된다. 이러한 입체 구조는 폴리펩타이드와 폴리뉴클레오티드를 각각 형성하는 아미노산과 뉴클레오티드의 특이적인 화학적 특징과 서열에 기반하여 형성된다.

MOF는, 생체분자를 천연적인 입체 구조로 캡슐화함으로써, 유익하게는 생체분자의 생활성을 유지시킨다. 이는, (i) 캡슐화된 생체분자가 유리형 생체분자의 생활성과 동일한 생활성 특성을 나타내거나, 또는 (ii) 캡슐화된 생체분자가 외부 환경으로부터 물리적으로 차단되기 때문에 마스킹된 생활성을 나타낸다는 것을 의미한다. 그러나, (ii)에서, 생체분자의 생활성은 유익하게는 구조체의 용해/파괴시 이용될 수 있다.

구조체 안에 캡슐화된 생체분자는, 예를 들어, 용매의 pH 변화를 유도함으로써, 용매에 현탁된 MOF를 용해함으로써, 용매로 방출시킬 수 있다. 이런 방식에 따르면, MOF는 예를 들어 살아있는 유기체로의 약물 전달 용도로 이용가능한 캡슐화된 생체분자의 pH-유도성 타겟화된 방출에 양호한 후보물질일 수 있다. 다른 예로, 이러한 경미한 적용이 리간드-금속 입체화학에 입체구조 변화를 촉발시킬 수 있으며, 따라서 고유 공동 크기에 변화를 유발하여, 생체분자 카고 (cargo)의 방출이 발생할 수 있다.

pH-촉발성 생체분자의 방출에 기반한 방식에 이용될 수 있는 MOF의 예로는, 특정 pH 값에 안정적이지만 다른 특정 pH 값에서는 용해되는 MOF를 포함한다. 예를 들어, MOF는 역치 pH 값 보다 높은 pH에서 안정적일 수 있다. 이 경우, 생체분자는 MOF가 현탁된 용액으로 검출가능한 수준으로 방출되지 않는다. 그러나, pH가 역치 보다 낮은 수준으로 떨어지면 MOF는 용해되어, 생체분자가 용액으로 방출될 수 있다.

예를 들어, 일부 ZIF는 세포외 pH (약 7.4)에서 안정적이지만 pH가 6.5 아래로 떨어지면, 예를 들어 세포내 pH (약 6)가 되면, 용해된다. 이로 인해 구조체 안에 보호됨으로써 자신의 생활성을 유지하고 있는 캡슐화된 생체분자의 방출이 이루어질 수 있다.

이런 맥락에서, 특정 pH에서 용매 내에서의 MOF의 안정성은, 용해시 MOF에 의해 용매로 방출되는 금속의 양으로 측정한다. 용매 중의 금속 이온의 농도는, MOF를 pH 조건에 2시간 동안 노출시키기 전과 노출 후에 수행되는, 유도 결합 플라즈마 (ICP)에 의해 측정한다. 용액 중의 금속 이온의 측정 농도가 2시간 후 최초 값에서 15% 미만의 차이를 보인다면, 그 MOF는 '안정적'인 것으로 간주될 것이다.

MOF 구조체는 유익하게는 유리된 형태, 즉 MOF 안에 캡슐화되지 않은 생체분자를 파괴하는 환경 조건으로부터 캡슐화된 생체분자를 보호할 수 있다. 즉, 캡슐 구조체는 다양한 환경 조건에서 생체분자의 안정성을 개선한다. 예를 들어, 캡슐화된 생체분자는 최대 90℃의 온도에 1시간을 초과하는 기간 동안 노출시킨 후에도 자신의 생활성을 보존하는 것으로, 확인되었다.

또한, 본 발명은, 유익하게는, 고유 공동과 생체분자 간의 상대적인 치수 (relative dimension)와 상관없이, 생체분자를 결정질 MOF 안에 캡슐화할 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 방법은 구조체의 고유 공동 보다 상당히 큰 생체분자를 결정질 MOF 안에 캡슐화할 수 있다. 이 방법은 전통적인 합성 후 침투 방법 보다 우수한 등의 독특한 MOF를 제공할 수 있다.

이에, 또한, 본 발명은, 용액 중에서 MOF 전구체를 캡슐 구조체의 형성을 촉진하는 생체분자와 조합하는 단계를 포함하는, (i) 고유 공동 영역을 한정하며, (ii) 생체분자를 캡슐화하는 구조체를 가진 결정질 MOF의 제조 방법을 제공하며, 상기 생체분자는 구조체의 임의의 고유 공동의 최대 공동 직경 (LCD) 보다 큰 최소 치수를 가진다.

또한, 본 발명은, 생체 분자가 구조체의 임의의 고유 공동의 최대 공동 직경 (LCD) 보다 큰 최소 치수를 가지는, (i) 고유 공동 영역을 한정하며, (ii) 생체분자를 캡슐화하는 구조체를 가진 결정질 MOF를 제공한다.

생체분자의 최소 치수는 당해 기술 분야의 당업자에게 널리 공지된 기법들을 이용함으로써 측정할 수 있다.

생체분자가 XRD 특징을 규명하기 위한 목적으로 결정화될 수 있는 단백질 또는 핵산일 경우, '최소 치수'라는 표현은 그 단백질 또는 핵산의 대응되는 단백질 데이타 뱅크 (PDB) 파일로부터 수득되는 단백질 또는 핵산의 (분자량이 아닌) 임의 치수에 대한 최소 값을 의미한다.

당해 기술 분야에 공지된 바와 같이, 단백질 또는 핵산의 PDB 파일은 단백질 또는 핵산의 결정화된 형태를 대상으로 수행된 XRD 및 NMR 측정을 통해 결정된, 단백질 또는 핵산을 형성하고 있는 각 원자의 공간적인 분포를 담고 있다. 단백질 또는 핵산의 결정화는 당업자에게 공지된 절차에 따라 달성된다.

당해 기술 분야에 공지된 바와 같이, PDB 파일은 3D 편집 소프트웨어로 읽어 형성된 단백질 또는 핵산 구조에 대한 3D 시각화를 입수할 수 있다. 3D 시각화 소프트웨어는 'a x b x c' 포맷으로 일련의 3개의 길이 값으로 모델링된 단백질 또는 핵산의 기하학적 크기를 정확하게 측정할 수 있다. 따라서, 이런 맥락에서, 단백질 또는 핵산의 '최소 치수'는 a, b 및 c 중 최소 값이다.

XRD 및 NMR 측정을 위해 결정화할 수 없는 단백질 또는 핵산 등의 생체분자의 경우, '최소 치수'라는 표현은 Harold P. Erickson, 'Size and Shape of Protein Molecules at the Nanometer Level Determined by Sedimentation, Gel Filtration, and Electron Microscopy', Biological Procedures Online, Volume 11, Number 1에 상세히 언급된 절차에 따라 측정된 단백질 또는 핵산의 스톡스 반경 (Stokes radius)을 지칭한다.

생체분자의 최소 치수가 결정형 구조체의 임의의 고유 공동의 LCD 보다 크다면, 결정질 MOF의 고유 공동의 LCD와 관련된 생체분자의 크기에는 제한이 없다.

생체분자가 결정질 MOF 구조체 안에 캡슐화되는 한, 생체분자의 최소 치수는 유익하게는 결정질 MOF의 고유 공동의 LCD 보다 큰 임의의 수준일 수 있다. 예를 들어, 생체분자의 최소 치수는 구조체의 임의 고유 공동의 LCD 보다 적어도 1.5, 2, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500, 750 또는 1,000배 클 수 있다.

생체분자는, 예를 들어, 생체분자와 캡슐화 구조체 간의 상대적인 움직임 (relative movement)이 저해되도록, MOF 구조체 안에 상대적으로 조밀하게 (tight) 캡슐화될 수 있다. 생체분자는, 자기-한정된 공동 안에 이질적이고 비연속적인 게스트 상으로서, MOF 구조체 안에 배치되는 것으로 보인다. 즉, 생체분자는 MOF 구조체의 고유 공동들 안에 배치되는 것은 아니다. 실제, SAXS 측정에서, MOF 구조체 내부에 이러한 자기-한정된 공동이 존재하는 것으로 확인되며, 이러한 자기-한정된 공동은 캡슐화된 생체분자의 크기 보다 17% 내지 30% 범위로 큰 것으로 확인된다.

생체분자는, MOF 구조체 안에 조밀하게 캡슐화됨으로써, 이 구조체와 상호작용할 수 있다. 생체분자와 구조체 간의 가능성있는 상호작용은, 생체분자의 음으로 하전된 도메인과 구조체의 금속 이온 간의 이온 배위 또는 이들 간의 혼성 이온/공유결합성 상호작용일 수 있다. 예를 들어, 단백질이 캡슐화된 ZIF-8에 대한 FTIR 측정에서, 단백질 백본의 카르보닐 기와 ZIF-8 구조체의 Zn^{2 +} 이온 간에 상호작용 가능성이 확인되었다. 이들 상호작용은 MOF 구조체 안에 캡슐화되었을 때 다양한 환경 조건에서 생체분자의 물리적 및 화학적 안정성 개선에 기여하는 것으로 보인다.

결정형 구조체의 임의의 고유 공동의 최대 공동 직경 보다 큰 최소 치수를 가진 생체분자의 캡슐화가 가능하므로, 합성 후 침투 방법의 본질적인 한계를 극복할 수 있다.

합성 후 침투 방법의 맥락에서, 입수가능한 결정질 MOF/생체분자 시스템 다수는, 결정질 MOF 구조체의 고유 공동의 치수 대비 생체분자의 크기에 관한 고려사항들로 인해 제한된다. 즉, 보고된 합성 후 침투 방법은, 생체분자가 구조체 전역으로 확산되기에 충분히 작고 구조체의 고유 공동이 생체분자를 공간적으로 수용하기에 충분히 큰, 결정질 MOF/생체분자 시스템만 합성할 수 있다.

따라서, 합성 후 침투 방법에 의해 수득가능한, 결정질 MOF와 생체분자의 입수가능한 조합들은 제한적이다. 예를 들어, 가장 일반적인 유형의 MOF로서 포어 크기가 전형적으로 2 nm (20 Å) 보다 작은 마이크로-포러스 MOF는, 본질적으로, 최소 치수가 통상 2 nm를 초과하는, 효소를 비롯한 단백질 또는 핵산 등의 대부분의 생체분자를 침투시키기에 부적절하다.

일 구현예에서, 생체분자는 아미노산이다.

본원에서, '아미노산'이라는 표현은 염기성 아미노 기 (NH₂)와 산성 카르복시 기 (COOH)를 모두 가진 유기 산을 지칭한다. 이 표현은 가장 넓은 의미로 사용되며, 단일 투여 아미노산, 이의 생리학적 활성형 염 또는 에스테르, 이의 다양한 염들과의 조합, 이의 호변이성질체 형태, 폴리머 형태 및/또는 이성질체 형태, 이의 유사체 형태, 이의 유도체 형태 및/또는 탈카르복시화 생성물 등의 이의 수많은 여러가지 화학적 형태의 아미노산을 지칭할 수 있다.

본 발명에 이용가능한 아미노산의 예로는, 비제한적인 예로, 아그마틴 (agmatine), 베타 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 라이신, 메티오닌, 페닐베타 알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린을 포함한다.

MOF 형태를 제공하는 한, MOF 전구체와 함께 용액 중에 존재하는 아미노산의 농도는 특별히 제한되지 않는다.

용액 중의 아미노산의 적절한 농도는 약 0.1 - 100 mg/mL, 약 0.1 - 75 mg/mL, 약 0.1 - 50 mg/mL, 약 0.1 - 25 mg/mL, 약 0.2 - 25 mg/mL, 약 0.25 - 25 mg/mL, 약 0.25 - 20 mg/mL, 약 0.25 - 15 mg/mL, 약 0.25 - 10 mg/mL, 및 약 0.025 - 1.5 mg/mL 등의 범위일 수 있다.

일 구현예에서, 생체분자는 단백질이다.

본원에서, 용어 '단백질'은 아미노산 잔기들로 된 폴리머, 이의 변이체 및 합성 유사체를 지칭한다. 즉, 이 용어는, 하나 이상의 아미노산 잔기가 대응되는 천연적으로 형성되는 아미노산 폴리머의 화학적 유사체와 같은 비-천연적인 합성 아미노산인, 아미노산 폴리머 뿐만 아니라 천연적으로 형성되는 아미노산 폴리머에도 적용된다. 본원에서, 용어 '단백질'은 효소도 포괄한다.

단백질은 통상적으로 고유한 3-차원의 구조로 폴딩된다. 단백질은 여러가지 3차원 형태들을 취할 수 있다. 단일 단백질 분자의 전체 형상은 '3차원 구조'로서 식별된다. 단백질의 기본적인 생활성 기능은 이의 3차원 구조에 의해 결정/제어된다.

본 발명에 따르면, 단백질은 치료학적 또는 예방학적 단백질들로부터 선택될 수 있다. 이러한 것으로는 혈장 단백질, 호르몬 및 성장인자, 세포외 단백질 및 백신용 단백질 항원을 포함할 수 있다. 이는 또한 화장품 및 식품에 사용하기에 구조적으로 유용한 단백질들로부터 선택될 수 있다.

혈장 단백질의 예로는, 비제한적으로, 알부민 (HSA), 헤모글로빈, 트롬빈, 파이브로넥틴, 파이브리노겐, 면역글로불린, 응고 인자 (FX, FVIII, FIX) 등이 있다.

세포외 단백질의 예로는, 비제한적으로, 콜라겐, 엘라스틴, 케라틴, 액틴, 투불린, 미오신, 키네신 및 디네인 (dynein) 등이 있(으며, 일부 경우에는 구조 단백질로서 언급됨)다.

호르몬 및 성장인자의 예로는, 비제한적으로, 인슐린, EGF, VEGF, FGF, 인슐린 유사 성장인자, 안드로겐, 에스트로겐 등이 있다.

항원 단백질의 예로는, 비제한적으로, 오발부민 (OVA), 키폴 림펫 헤모시아닌, 소 혈청 알부민 (BSA) 및 면역글로불린 등이 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 단백질은 효소를 포함한다. 본원에서, 용어 '효소'는 촉매 작용을 통해 유기 물질에 화학적인 변화를 일으킬 수 있는 살아있는 세포로부터 기원한 단백질 또는 인공적으로 합성된 단백질을 지칭한다.

효소는 식품, 직물, 동물 사료, 퍼스널 케어 및 디터전트, 바이오리메디에이션 (bioremediation) 및 촉매 등의 다수 분야에서 상업적으로 사용가능하다. 이러한 활용 분야에서, 구조 및 활성의 보존, 생활성 프로파일과 방출 프로파일의 보존 및 캡슐화 담체의 채택 모두 이들의 상업적인 활용에 일부 역할을 담당한다. 또한, 효소는 이의 고 민감도로 인해 생의학용 디바이스 및 센서에도 사용가능하다.

따라서, 본 발명에 이용가능한 효소는 이의 최종 사용 용도에 따라 분류될 수 있다.

식품 산업에 사용되는 효소의 예로는, 비제한적으로 펙티나제, 레닌, 리그닌-변형 효소, 파파인, 리파제, 아밀라제, 펩신 및 트립신 등이 있다.

직물 산업에 사용되는 효소의 예로는, 비제한적으로, 엔도글루카제, 옥시다제, 아밀라제, 프로테아제, 셀룰라제 및 자일라나제 등이 있다.

생의학/센서 산업에 사용되는 효소의 예로는, 비제한적으로, 데하이드로게나제, 리파제, 포스래디시 퍼옥시다제 (HRP), 우레아제 및 RNA 또는 DNA 효소, 예컨대 리보뉴클레아제 등이 있다.

전구체로부터 MOF를 형성하는 한, MOF 전구체와 함께 용액 중에 존재하는 단백질 농도는 특별히 제한되지 않는다.

용액내 단백질의 적정 농도는, 약 0.1 - 20 mg/mL, 약 0.15 - 10 mg/mL 약 0.15 - 7.5 mg/mL, 약 0.2 - 5 mg/mL, 약 0.25 - 5 mg/mL, 약 0.03 - 5 mg/mL, 약 0.025 - 2.5 mg/mL, 약 0.025 - 2 mg/mL, 약 0.025 - 1.5 mg/mL, 또는 약 0.025 - 1.25 mg/mL 범위일 수 있다.

일 구현예에서, 생체분자는 핵산이다.

본원에서, '핵산'이라는 표현은, '폴리뉴클레오티드'라는 용어와 동의어로서, 공지된 모든 생명 형태의 필수적인 폴리머 거대분자 또는 거대 생물 분자를 지칭하며, 비제한적으로, DNA (cDNA, cpDNA, gDNA, msDNA, mtDNA), 올리고뉴클레오티드 (이중 가닥 또는 단일 가닥), RNA (센스 RNA, 안티센스 RNA, mRNA (pre-mRNA/hnRNA), tRNA, rRNA, tmRNA, piRNA, aRNA, RNAi, Y RNA, gRNA, shRNA, stRNA, ta-siRNA, SgRNA, Sutherland RNA, 소형 간섭 RNA (siRNA), 이중 가닥 RNA (dsRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), piwi-상호작용 RNA (PiRNA), micro RNA (miRNA), 핵소체내 소형 RNA (SnoRNA: small nucleolar RNA), 소형 핵 (SnRNA) 리보자임, 앱타머, DNAzyme, 리보뉴클레아제-타입 컴플렉스 및 본원에 언급된 기타 분자를 포함할 수 있다.

의심의 여지를 없애기 위해, '핵산'이라는 표현은 비-천연적인 변형된 형태 뿐 아니라 천연적으로 형성되는 형태도 포괄한다.

일부 구현예들에서, 핵산 분자는 약 8 - 약 80개의 뉴클레오베이스 (즉, 연속 연결된 핵산 약 8 내지 약 80개)를 포함한다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 본 발명이 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80개의 뉴클레오베이스 길이의 핵산 분자를 포함함을 인지할 것이다.

MOF가 형성되는 한, MOF 전구체와 함께 용액 중에 존재하는 핵산의 농도는 특별히 제한되지 않는다.

용액내 핵산의 적정 농도는, MOF 전구체와 핵산을 포함하는 용액의 총 부피에 대해 약 0.001 - 100 μM, 약 2 - 50 μM, 약 2 - 10 μM, 약 3 - 5 μM, 약 3.45 - 5 μM 또는 약 3.45 - 4 μM 범위이다.

본 발명의 구체적인 구현예들이 이제 아래 비-제한적인 실시예들로 설명될 것이다.

실시예

생체분자

실시예에 사용되는 아미노산은 알라닌, 메티오닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 글리신, 세린, 시스테인, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파르트산, 글루탐산이다.

실시예에 사용되는 단백질은 DQ-오발부민 (계란 난백 유래, DQ-OVA, MW ~44 kDa), 소 혈청 알부민 (소 혈청 유래, BSA, Fraction V, MW ~66 kDa), 인간 혈청 알부민 (인간 혈청 유래, HSA, MW ~66 KDa), 오발부민 (계란 난백 유래, OVA, MW ~44 kDa), 헤모글로빈 (소 혈액 유래, MW ~64.5 kDa), 및 인슐린 (소 췌장 유래, MW ~5.8 kDa)이다. 바람직한 구현예의 효소는 트립신 (소 췌장 유래, MW ~23.8 kDa), 글루코스 데하이드로게나제 피롤로퀴놀린 퀴논 ((PQQ)GDH, 글루코노박터 서브옥시단스 (Gluconobacter suboxydans) 유래, MW ~100 kDa), 리소자임 (계란 난백 유래, MW ~14.3 kDa), 호스래디시 퍼옥시다제 (HRP, 아모라시아 루스티카나 (Amoracia rusticana) 유래, Type II, MW ~44 kDa), 리보뉴클레아제 A (소 췌장 유래, Type I-AS, MW ~13.7 kDa), 리파제 (슈도모나스 세팍시아 (Pseudomonas cepacia) 유래, MW ~34 kDa), 및 우레아제 (카나발리아 엔시포르미스 (Canavalia ensiformis) 유래, Type III, 단일 서브유닛의 MW ~ 90.8 kDa, 6개의 서브유닛의 MW ~544.6 kDa)이다.

이들 바람직한 구현예에 사용되는 핵산은 Cy3-표지된 올리고뉴클레오티드이다.

단백질 데이타 뱅크로부터 입수된 전형적인 크기 (unit cell, a x b x c, Å): DQ-OVA 및 OVA: 62.9 x 84.7 x 71.5; BSA: 217.8 x 44.9 x 143.06; HSA: 54.84 x 55.62 x 120.27; 헤모글로빈: 63.1 x 82.91 x 53.65; 인슐린: 81.56 x 81.56 x 33.54; 트립신: 76.9 x 53.4 x 46.6; (PQQ)GDH: 60.59 x 158.72 x 221.39; 리소자임: 77.93 x 77.93 x 36.96; HRP: 40.04 x 66.81 x 116.36; 리보뉴클레아제 A: 100.74 x 32.82 x 72.69; 리파제: 244.33 x 244.33 x 244.33; 우레아제: 138.57 x 138.57 x 198.35.

Cy3-표지된 올리고뉴클레오티드 (50 bases, MW: 16 kDa)는 Trilink Biotechnologies Inc. (San Diego, California, USA) 사에서 구입하였다. DQ-오발부민 (DQ-OVA)은 Life Technologies (VIC, Australia) 사에서 구입하였다. 기타 반응 시약들은 모두 Sigma-Aldrich 사에서 구입하였고, 추가로 변형시키지 않고 사용하였다.

MOF

실시예 사용된 MOF는 ZIF-8 (LCD 11.3 Å), HKUST-1 (LCD 13.2 Å), Eu(bdc) (bdc = 1,4-벤젠트리카르복실레이트 MOF, LCD <1 Å), Tb(bdc) (LCD [Tb(BDC)의 최대 공동 직경 값 삽입] Å, MIL-88A (LCD [MIL-88A의 최대 공동 직경 값 삽입] Å).

FITC -표지된 단백질의 합성

일부 실시예들에서는, 단백질을 FITC로 표지하였다. FITC 1 mg과 BSA 35 mg을 MOPS 완충제 (CAS 1132-61-2, 10 mM, pH 7.0) 2.5 mL에 용해하고, 가볍게 교반하면서 실온에서 2시간 두었다. 혼합물을 GE Healthcare illustra NAP-25 컬럼 (GE Healthcare Life sciences, NSW, Australia)을 통과시켜, FITC-표지된 BSA를 회수하였다.

실시예 1

아미노산@ZIF -8

ZIF-8을 제조하기 위해, 해당 전구체 반응 시약 용액에, 아미노산 20개를, 총 20개의 실험에서 각각의 실험에 아미노산 각각 하나씩, 시딩하였다. 각 아미노산을 등량 (0.02 g)으로 HmIm 수용액 (160 mM, 2 mL)에 먼저 투입하였다. 이들 제1 용액들을 이후 각각 MOF 금속 전구체를 함유한 수용액 (즉, 아연 아세테이트, 40 mM, 2 mL)과 각각 혼합하였다.

여러가지 아미노산-함유 MOF 전구체 용액들에서 유의한 pH 변화는 관찰되지 않았다. 이들 용액을 실온에서 유지시켰다. 용액의 시간 경과에 따른 불투명성 증가는 ZIF-8 결정이 형성되었음을 의미한다. 결정의 특성을 NMR, SEM 및 PXRD 측정으로 검증하였다. ZIF-8 형성 속도는 사용된 아미노산에 따라 좌우된다.

UV-Vis 스펙트로미터로 측정한 광 산란을 결정화 효율/속도 판별을 위한 질적 파라미터로 사용하였으며, 아미노산을 ZIF-8 전구체와 조합하여 10분 후 수행하였다. 그 결과는 도 3에 취합하여 나타낸다.

분말 XRD 분석을 통해, 형성된 결정들이 시뮬레이션한 ZIF-8과 표준 프로토콜로 합성한 ZIF-8 둘다에서 동일한 피크를 가지는 것으로 확인되었다. 도 3에서, MOF 결정 형성을 시딩하는 개개 아미노산의 효율은 아미노산의 측기의 특성에 따라 그룹으로 나타낸다.

결정의 형성은 아미노산의 전하 및 친수성과 밀접하게 관련있는 것으로 확인되었다: 친수성이 가장 높고 음으로 하전된 아미노산이 보다 소수성이고 양으로 하전된 아미노산 보다 ZIF-8 결정 형성을 유도하는 능력이 우수하였다. 이들 결과는, 음으로 하전된 분자가 양 전하를 띄는 Zn^{2 +} 이온을 끌어당겨 핵 형성 단계 중에 Zn-HmIm 클러스터의 안정화에 일조함으로써, ZIF-8 결정 형성을 촉진한다는 가설을 도출하였다.

실시예 2

단백질@ZIF-8

적절한 단백질 및 효소 10 mg을 탈이온수 중의 2-메틸이미다졸 (160 mM, 20 mL, pH 10.3) 용액에 첨가하였다. 인슐린의 경우, 인슐린 10 mg을 물에 첨가하고, HCl (20 mM)로 pH 3-4로 적정하여 인슐린을 완전히 용해시키고, 다시 pH 10.3으로 적정한 다음 2-메틸이미다졸 (160 mM)을 첨가하였다. 탈이온수에 용해된 또 다른 아연 아세테이트 용액 (40 mM, 20 mL)을 준비하였다. 이들 2가지 용액을 합친 다음 10초간 교반하였다. 수득한 용액을 실온 (23℃)에서 12시간 동안 에이징하였다. 형성된 석출물을 10분간 6000 rpm으로 원심분리하여 회수한 다음 탈이온수 또는 에탄올 중에서 헹구고, 원심분리하였다.

ZIF-8 내 단백질의 캡슐화 효율 (wt%)을 FITC-표지된 단백질을 이용해 미리 측정한 캘리브레이션 곡선을 이용해 형광 분광측정법으로 결정하였다.

단백질 캡슐화 효율: BSA ca. 100%, HSA ca. 100%, ca. 100%, 리소자임 ca. 96%, HRP ca. 100%, 리보뉴클레아제 A ca. 86%, 헤모글로빈 ca. 90 %, 트립신 ca. 96%, 리파제 ca. 88%, 인슐린 ca. 86%, (PQQ)GDH ca. 82%, 우레아제 ca. 95%.

BSA@ZIF-8 MOF 형성 카이네틱스

BSA의 경우, ZIF-8 전구체 용액에 단백질을 첨가한 지 1초 이내에 ZIF-8이 형성된다.

BSA를 첨가하면, MOF 전구체 및 BSA의 용액은 거의 순식간에 (1초) 투명성이 감소되고, 불투명성이 반응 최대 30초까지 높아진다.

BSA를 첨가하지 않은 경우, 투명성의 변화는 검출되지 않는데, 그 이유는 MOF 구조체가 평가한 어떤 반응 기간 동안에도 (최장 30일) 성장하지 않기 때문이다. X선 산란 분석에서, BSA 부재시 ZIF-8 전구체를 투입한 즉시 소형 입자 (관성 반경, R_g = 35 nm)가 수용액 중에 형성되었지만 극소량으로 형성되어, 구조체 성장을 촉진할 만큼 충분히 많지 않은 것으로 확인되었다. 이와는 반대로, BSA를 사용한 경우, 약 30초 후 더 큰 MOF 입자 (R_g = 100 nm)가 형성되고, 동시에 소형 입자는 고갈되었다 (SAXS 데이타로부터 R_g를 결정하는 과정은 하기에 상세히 기술됨).

BSA 존재시, 용액은 거의 즉각적으로 투명성은 떨어지고 불투명도는 계속 증가한다. BSA 부재시에는, 투명도 변화는 검출되지 않으며, 조사한 어떤 반응 기간에도 ZIF-8의 형성은 차단된다. 이 혼합물은 1달 이상 동안 투명성 및 무색 상태를 유지하였으며, 주사 전자 현미경 (SEM) 조사에서 이 조건에서는 결정이 형성될 수 없는 것으로 검증되었다.

BSA-함유 용액의 불투명성은 산재된 입자의 형성과 관련있으며, 이는 석출 및 분석할 수 있다.

XRD 분석을 통해, 도 5에 나타낸 바와 같이, 합성한 모든 종들에서, 측정된 회절 패턴들은 순수 ZIP-8의 시뮬레이션한 회전 패턴과 일치하므로, 개개 미립자는 결정질 ZIF-8인 것으로 검증되었다.

생체분자를 함유한 샘플로부터 단리된 결정에 대한 시차 주사 현미경 (SEM) 분석에서는, 도 4(a-k)에 나타낸 바와 같이, 사용된 생체분자의 유형에 대한 ZIF-8 결정의 형태 의존성을 확인할 수 있었다. 그 형태는 사용된 생체분자에 따라 입방체 내지 별 모양의 ZIF-8 입자 범위를 나타낸다. 즉, 결정의 형태를 제어하는 제어력은 생체분자가 MOF 결정의 형태를 템플레이팅 (templating)하는 역할을 한다는 것을 시사해준다.

ZIF-8 안에 캡슐화된 FITC-표지된 생체분자로부터의 빛 방출은 공초점 현미경을 이용해 검출할 수 있다 (도 4(l)). 도 4(l)의 인서트는 FITC-표지된 생체분자가 캡슐화된 ZIF-8 결정의 현탁물이 담긴 바이얼의 카메라 이미지를 보여준다.

ZIF-8 구조체 내부의 생체분자의 공간적인 분포는, 도 4(l), 7 및 8에 나타낸 바와 같이, FITC-표지된 BSA가 캡슐화된 ZIF-8에 대해 공초점 레이저 현미경 검경을 수행함으로써 조사할 수 있다. 사진들에서 스캐닝한 ZIF-8 결정 단면 각각에 대한 균일한 방출 신호를 인지할 수 있어, 형광-표지된 BSA가 균등하고 균일하게 각각의 결정에 분포되어 있음이 검증된다.

BSA@ZIF-8, HRP@ZIF-8 및 우레아제@ZIF-8의 SAXS 측정

BSA@ZIF-8의 계층적인 포어 구조 (hierarchical pore structure)를 소각 X선 산란 (SAXS)에 의해 조사하였다. 호주 신크로트론 시설의 SAXS 빔라인에서 신크로트론 SAXS 데이타를 수집하였다. 세척 및 건조한 샘플에 캐필러리 (capillary)를 로딩하였다. 샘플을 SAXS/WAXS 빔라인 (9.3 keV, 검출기로서 Pilatus 1M을 이용한 2675 mm camera length, 전송 모드)을 사용해 조사하였다. 각 SAXS 분석에서, 각 캐필러리 당 4번의 측정값 (다른 위치)을 평균하고, 빈 캐필러리에 대한 백그라운드를 제하였다. Scatterbrain 소프트웨어를 사용해 평균값 산출 및 백그라운드 제외 과정을 수행하였다.

자기-한정된 공동 (즉, MOF 구조체의 고유 공동이 아니라 생체분자가 캡슐화된 구조체의 공동) 크기 (관성 반경, R_g) 값을 통합 모델에서 Guinier knee 피팅을 사용해 측정하였다. Beaucage 등 (Beaucage, G. Small-Angle Scattering from Polymeric Mass Fractals of Arbitrary Mass-Fractal Dimension. J. Appl . Crystallogr. 29, 134-146 (1996))은 상호 배타적인 산란 현상 (mutually exclusive scattering event)으로부터 Guinier의 법칙과 구조적으로 한정된 power-law (structurally limited power laws)을 도출할 수 있는 방법을 기술하고 있다. 가장 단순한 사례에서, 관찰되는 산란은 2가지 컴포넌트의 합으로서,

여기서, G는 클래식 Guinier 전인자 (prefactor)이고, B는 지수 P가 하락하는 영역으로 특정된 power-law 산란 유형에 특이적인 전인자이다. 운동량 전달 (momentum transfer) q는 (길이)^-1 단위이며, 큰 q 산란은 짧은 길이 스케일을 프로빙 (probing)한다. 표면 프랙탈 (surface fractal)의 경우,

이며,

여기서 R_g는 큰 미립자의 관성 반경 (radius of gyration)이다. 오차 함수 (eft)는 다수의 피팅 프로그램 (예, Igor)에서 이용가능하거나, 또는 점증적 전개 (asymptotic expansion)를 이용해 계산할 수 있다.

도 6(a)는 BSA@ZIF-8 바이오컴포지트에서 수득되는 데이타를 도시한 것이다. 관찰된 Guinier knee는 통합 모델을 이용해 BSA의 최대 치수 (Rg 약 30 Å, E. Mylonasa et al Accuracy of molecular mass determination of proteins in solution by small-angle X-ray scattering, Journal of Applied Crystallography 2007, volume 40, s245에 따른 1N5U PBD 데이타로부터 유추) 보다 약간 큰 35 (± 5) Å의 관성 반경 (R_g)에 피팅시킬 수 있다.

생체분자를 수용하기에 충분한 크기를 가지는 이러한 반경을 가진 포어는, 순수 ZIF-8에서 검출되지 않는다. 이 데이타는, 생체분자가 자기-한정된 공동 안에 이질적이고 비-연속적인 게스트 상으로서 MOF 구조체 안에 놓이며, 즉, 생체분자가 MOF 구조체의 고유 공동 안에 배치되는 것이 아니라는 본원의 내용을 뒷받침해준다.

HRP@ZIF-8 및 우레아제@ZIF-8 샘플에 대한 SAXS 분석을 통해 수득된 데이타는 도 6(b)와 6(c)에 도시된다. 이들 도는 HRP@ZIF-8 및 우레아제@ZIF-8의 세기 (카운트) 대비 Q(Å^-1) 곡선을 도시한다. 실험 데이타의 통합 피트와 Guinier 컴포넌트의 통합 피트는, HRP@ZIF-8의 경우 R_g = 45 Å, 우레아제@ZIF-8의 경우에는 R_g = 68 Å인, 각 생체분자 보다 큰, 자기-한정된 공동을 ZIF-8 안에 새롭게 형성시킴을 보여준다.

실시예 3

DNA@ZIF-8

올리고뉴클레오티드 (20.8 μM) 200 ㎕를, 탈이온수 중의 2-메틸이미다졸 (160 mM, 0.5 mL) 용액에 첨가하였다. 별도로 탈이온수에 용해된 아연 아세테이트 용액 (40 mM, 0.5 mL)을 준비하였다. 이 2가지 용액을 합하여, 10초간 볼텍싱하였다. 혼합물을 실온에서 12시간 에이징하였다. 형성된 석출물을 6000 rpm에서 20분간 원심분리하여 수득하고, 이를 에탄올 중에서 세척 및 원심분리하였다. ZIF-8 내 DNA 로딩 효율 (75% wt)을, 전구체 용액 중의 DNA 농도와 수득된 결정체의 상층액 중의 DNA 농도를 측정함으로써, 미리-측정한 캘리브레이션 곡선으로부터 561 nm에서 방출 (Cy3 방출 최대치)을 수집하는 형광 스펙트로포토미터를 이용해 결정하였다.

탈이온수 중의 2-메틸이미다졸 (160 mM, 20 mL) 용액에 각 아미노산 (6.67 mM)을 첨가하여, 아미노산에 의해 유도되는 ZIF-8을 합성하였다. 탈이온수에 용해된 별도의 아연 아세테이트 용액 (40 mM, 20 mL)도 준비하였다. 이 2가지 용액을 합하여, 10초간 볼텍싱하였다. 혼합물을 실온에서 10분간 에이징하였다. 형성된 석출물을 20000 g에서 10분간 원심분리하여 수득하고, 이를 에탄올 중에서 세척 및 원심분리하였다.

실시예 4

HKUST -1의 바이오시딩 ( bioseeding )

벤젠-1,3,5-트리카르복시산 (btc)을 에탄올 (53.45 mM, 20 mL)에 용해하였다. 이와는 별도로 탈이온수에 용해된 구리 (II) 나이트레이트 용액 (40.09 mM, 20 mL)을 준비하였다. 이 2가지 용액을 합하여, 10초간 볼텍싱하였다. 그런 후, BSA 용액 (MQ 중의, 10mg/mL) 120 ㎕을 혼합물에 첨가하였다. 이 혼합 용액을 실온에서 12시간 동안 에이징하였다. 현탁액을 20분간 6000 rpm으로 원심분리한 다음, 세척 완충제로서 에탄올을 사용하여 원심분리-세척 사이클을 3회 수행하였다. 수율: 11%.

실시예 5

Eu - BDC 및 Tb - BDC의 바이오시딩

다이소듐 테레프탈레이트 염을 Daiguebonne, C. et al. "Structural and Luminescent Properties of Micro- and Nanosized Particles of Lanthanide Terephthalate Coordination Polymers" Inorganic Chemistry 47, 3700-3708 (2008)에 언급된 공정에 따라 준비하였다. 테레프탈산 5 g을 수산화나트륨 2.32 g이 첨가된 탈이온수에 용해하였다. 제조된 용액을 증발시켜 건조시키고, 고형물을 에탄올에 재현탁하여 1시간 동안 환류한 다음, 여과, 수세 및 건조를 수행하였다. 테레프탈산의 다이소듐 염을 이후 BSA 200 mg이 용해된 탈이온수 (10 mM, 20 mL)에 용해하였다. 또한, 탈이온수에 EuCl₃.6H₂O 또는 TbCl₃.6H₂O를 용해하였다 (10 mM, 20 mL). 란탄족 원소의 염 용액과 BSA 리간드 용액을 혼합하고, 10초간 볼텍싱하였다. 용액을 12시간 동안 천천히 교반한 다음, 20분간 6000 rpm으로 원심분리하여 침전시킨 후 이를 세척하고 에탄올 중에서 원심분리하는 과정을 3번 반복하였다.

MIL-88A의 바이오시딩

BSA를 다양한 양 (2, 4, 8, 16 mg/mL)으로 탈이온수 중의 푸마르산 용액 (25 mM)에 용해하였다. 이와는 별도로 FeCl₃·6H₂O (25 mM) 용액을 준비하고, 이를 BSA-함유 푸마르산 용액과 동량으로 즉시 혼합한 다음 10초간 볼텍싱하였다. 혼합 용액을 실온에서 7일간 에이징하였다. 현탁액을 20분간 6000 rpm으로 원심분리한 다음, 세척 완충제로서 에탄올을 사용하여 원심분리-세척 사이클을 3회 수행하였다.

실시예 6

HRP@ZIF-8의 생활성

실시예 2에서 수득한 HRP@ZIF-8 결정을 먼저 소듐 도데실 설페이트 (SDS, 탈이온수 중의 10 % w/w, 2 mL) 용액에 70℃에서 10분간 재분산시켜, 결정 표면 상의 유리 효소를 제거하였다. 수소 도너로서 피로갈롤을 이용해 과산화수소의 분해 속도를 측정함으로써 HRP의 활성을 측정하였으며, 피로갈롤은 Chance, B. & Maehly, A. C. in Methods in enzymology Volume 2, 764-775 (Academic Press, 1955)에 언급된 절차에 따라 노란색을 띄는 생성물인 푸르푸로갈린으로 변환될 수 있다. 전형적인 분석에서, 76 ㎕ KH₂PO₃ (100 mM, pH 6.0), 38 ㎕ H₂O₂ (탈이온수 중의 5% w/w), 76 ㎕ 피로갈롤 (탈이온수 중의 5% w/w) 및 1.8 mL of PBS 완충제 (pH 7.4)를 함유한 용액 A를 제조하였다.

용액 A에, HRP@ZIF-8 결정 0.1 mg을 첨가하고, 즉시 이 용액의 흡광도를 UV-Vis를 이용해 420 nm에서 30초씩 증가시키면서 모니터링하였다. 대조군 실험으로, HRP@ZIF-8 결정 1 mg을 먼저 탈이온수 (1 mL)에 다시 분산시키고, 1시간 90℃에서 인큐베이션하였다. 수득된 용액 100 ㎕를 용액 A에 첨가하고, 즉시 이 용액의 흡광도를 UV-Vis를 이용해 420 nm에서 30초씩 증가시키면서 모니터링하였다. 유리형 HRP를 이용한 효소 활성 분석에서, 용액 A로 투입된 유리형 효소의 양은, 로딩 효율로부터 측정된 바와 같이, HRP@ZIF-8에 로딩된 효소의 양과 동일하게 조정하였다.

실시예 7

( PQQ )GDH@ZIF-8의 생활성

실시예 2에서 수득한 (PQQ)GDH@ZIF-8 결정을 SDS (탈이온수 중의 10 % w/w, 2 mL) 용액에 70℃에서 10분간 재분산시켜, 결정 표면 상의 유리 효소를 제거하였다. 전형적인 분석으로, 글루코스 1 mL (10 mM MOPS 완충제 중의 20 mM, pH 7.0), 2,6-다이클로로인도페놀 10 ㎕ (탈이온수 중의 0.1 mM), 페나진 메토설페이트 10 ㎕ (탈이온수 중의 0.06 mM)를 함유한 용액 B를 제조하였다. 용액 B에, (PQQ)GDH@ZIF-8 결정 0.1 mg을 첨가하고, 즉시 이 용액의 흡광도를 UV-Vis를 이용해 600 nm에서 30초씩 증가시키면서 모니터링하였다. 대조군 실험으로, (PQQ)GDH@ZIF-8 결정 1 mg을 먼저 탈이온수 (1 mL)에 다시 분산시키고, 1시간 동안 90℃에서 인큐베이션하였다. 수득된 용액 100 ㎕를 용액 B에 첨가하고, 즉시 이 용액의 흡광도를 UV-Vis를 이용해 600 nm에서 30초씩 증가시키면서 모니터링하였다. 유리형 (PQQ)GDH를 이용한 효소 활성 분석에서, 용액 B로 투입된 유리형 효소의 양은, 로딩 효율로부터 측정된 바와 같이, (PQQ)GDH@ZIF-8에 로딩된 효소의 양과 동일하게 조정하였다.

도 9는 단백질분해제의 존재 하에 끓는 물에서 수열 처리한 후 (PQQ)GDH@ZIF-8 대 유리형 (PQQ)GDH의 정규화된 생성물 변환율 (normalized product conversion)을 도시한 것이다. (PQQ)GDH의 활성은 전자 어셉터로서 페나진 메토설페이트를 이용해 측정하였다.

우레아제@ZIF-8의 생활성

45℃ 이상에서 변성되는 우레아제는, MOF 구조체 안에 캡슐화되는 경우, 최대 80℃에서도 보호할 수 있다. 우레아제의 크기 (약 600 kDa, 177.9A 유체역학 (hydrodynamic)) 및 알코올 (예, 메탄올) 존재 조건에서의 빠른 분해로 인해, 제시된 방법은 생체거대분자에 대한 호스트로서 MOF를 사용하고자 하거나 및/또는 유기 용매를 사용하고자 하는 기존에 보고된 방법의 제약을 극복할 수 있다.

우레아제@ZIF-8의 활성은, 우레아가 암모니아로 변환됨으로써 발생되는 pH 증가를 pH 지시제로서 페놀 레드를 사용해 측정함으로써, 확인하였다. 페놀 레드 용액은, 페놀레드 10 mg을 NaOH 용액 284 ㎕ (0.1M)에 용해한 다음 탈이온수로 최종 부피 10 mL을 만들어, 제조하였다. 전형적인 분석에서, 페놀 레드 용액 10 ㎕, 우레아 용액 990 ㎕ (0.5 M) 및 ZIF-8@우레아제를 UV-Vis 큐벳에 넣고, 이 용액의 흡광도를 UV-Vis에 의해 560 nm에서 30초씩 늘리면서 모니터링하였다.

도 10은 1시간 동안 80℃에서 수열 처리 전과 후의 우레아제@ZIF-8 대 유리형 우레아제의 정규화된 생성물 변환율을 도시한다. 실험들은 3세트로 수행하였다. 우레아제 활성은 우레아제가 암모니아로 변환된 결과로서 pH 지시제로서 페놀 레드를 사용해 측정하였다. 하프 타임은 기질 최대 변환율의 절반에 도달하는데 걸리는 시간이고; V₀는 효소의 초기 기질 변환율이다.

실시예 8

pH- 촉발성 단백질 방출

테스트 공정은 도 11(a-d)에 예시된다. 실시예 2의 합성에 사용된 BSA를 표지함으로써 제조된 FITC-BSA@ZIF-8 1 mg을 pH 7.4 또는 pH 6.0으로 적정된 pH-적정된 PBS 2 mL에 37℃에서 가볍게 교반하면서 분산시켰다. 24시간 동안, 일정한 간격으로 결정 분산물을 10분간 20000 g로 원심분리하고, 상층물의 형광 세기를 형광 스펙트로포토미터를 사용해 모니터링함으로써 방출된 FITC-BSA의 형광 세기를 분석하였다. 측정 데이타는 도 11(e)에 나타낸다.

pH-촉발에 의한 효소 방출 및 방출된 효소의 생활성

호스트 종으로서 ZIF 이용시 제공되는 또 다른 이점은, Zn 이온과 HmIm 유기 리간드 간의 배위 결합이 생리학적으로 관련된 조건들에서 pH-의존적이라는 것이다. 즉, 구조체가 특정 pH 값에서는 용해되어, 캡슐화된 생체분자가 외부 환경으로 방출될 수 있다. 이는, 예를 들어, 효소를 특정 pH 값으로 특정되는 특수 위치에서 방출시켜야 하는, 약물 전달 용도에 특히 유용하다.

이는 FITC-표지된 BSA@ZIF-8 샘플 결정에서 실험적으로 증명되었는데, 특이적인 pH-유도성 방출 프로파일이 측정되었다. 도 11(a-d)는 이 테스트를 예시한 것이다. pH 7.4 (즉, 세포외 pH)에서는, 24시간 동안 결정으로부터 BSA가 10% 미만으로 방출되며, 이는 결정이 안정적으로 유지됨을 입증하는 것이다. 그러나, pH 6.0 PBS (즉, 세포내 환경)에서는, 약 24시간 후, MOF 구조체가 점차 용해됨으로써 BSA가 다량 방출되었다 (도 11(e)).

pH-촉발에 의한 반응성 생체분자의 동일 용액으로의 방출

캡슐화된 분자가 본래의 생활성을 유지하는지를 입증하기 위해, 비슷한 pH-방출 테스트를 도 11(f-i)에 예시된 테스트에 따라, DQ-오발부민 (DQ-OVA)이 캡슐화된 ZIF-8과 혼합하여, 효소, 즉 트립신이 캡슐화된 ZIF-8에 대해 수행하였다. DQ-OVA는 형광을 나타내는 단백질 기질이며, 트립신에 의해 DQ-OVA는 효소적인 단백질 분해를 겪게 되면 고형광성 염료로 표지된 펩타이드가 생겨난다. 따라서, 트립신과 오발부민이 둘다 MOF로부터 방출된다면, 효소는 방출된 단백질 오발부민을 절단하는 촉매 활성을 발휘할 수 있다. 생체분자를 함유한 MOF 배치 2종은 각각 세척한 다음 혼합하여 pH 7.4의 현탁물을 만들었다. 이 바이오-관능화된 ZIF-8 용액으로부터 방출되는 형광 세기를 스펙트로플루오로미터를 사용해 측정하였으며, 시간 경과에 따른 약간의 변화가 확인되었다 (도 11(j)).

테스트 공정은 도 11(f-i)에 나타낸다. 트립신@ZIF-8 1 mg과 DQ-OVA@ZIF-8 1 mg을 pH 7.4 또는 pH 6.0으로 적정된 PBS 2 mL에 37℃에서 가볍게 교반하면서 분산시켰다. DQ-OVA가 트립신에 의해 단백질분해됨으로써, 용액 중에 BODIPY 염료로부터 방출되는 형광을 형광 스펙트로포토미터를 사용해 계속 모니터링하였다. 측정 데이타는 도 11(j)에 나타낸다.

트립신 또는 DQ-OVA가 임베딩된 MOF 결정은 pH 6.0에 노출되면, MOF가 분해되기 시작하고, 따라서 각 생체분자가 용액으로 방출된다. 용액 중에서 생체분자들이 반응하여, DQ-OVA에 대한 트립신의 단백질분해 활성으로 인해 염료로 표지된 펩타이드가 형성되고 그로 인해 형광 세기는 증가한다 (도 11(j)).

도 12는 pH 6.0에서 시간 경과에 따른 점진적인 BSA@ZIF-8 결정의 분해를 보여주는 SEM 사진이다.

실시예 9

BSA 농도를 증가시키면서 ZIF -8 형성

본 실험은 캡슐화될 수 있는 생체분자의 양을 다양하게 하기 위해 수행하였다. 또한, 그 결과, 단백질 양을 달리함으로써, MOF 결정화도를 조정할 수 있는 것으로 나타났다. BSA@MOF 샘플을 실시예 2에 따라 제조하였으나, 단 BSA의 양을 증가시키면서 수개의 배치를 제작하였다. 특히, 샘플은 HmIm (160 mM, 2 mL) 수용액에 용해된 BSA 1 mg, 5 mg, 10 mg 및 20 mg을 이용해 제조하였고, 그런 후 실온에서 아연 아세테이트 수용액 (40 mM, 2 mL)과 혼합하였다. 제조된 BSA@MOF에 대해 SEM, XRD 및 Brunauer-Emmett-Teller (BET)로 조사하였다.

그 결과는 도 13, 14 및 15에 취합하여 나타낸다.

도 13은, BSA의 양을 증가시켜 합성한, BSA가 캡슐화된 ZIF-8의 SEM 사진을 도시한다. 1 mg (a), 5 mg (b), 10 mg (c), 및 20 mg (d)의 BSA를 HmIm 수용액 (160 mM, 2 mL)에 용해한 다음 아연 아세테이트 수용액 (40 mM, 2 mL)과 실온에서 혼합하였다.

도 14는 바이오시딩 프로세스에 사용되는 BSA의 양적 증가에 따른 결정화도의 감소를 보여주는 XRD 패턴을 도시한다. 1 mg (청색), 5 mg (녹색), 10 mg (오렌지색) 및 20 mg (적색)의 BSA를 HmIm 수용액 (160 mM, 2 mL)에 용해한 다음 아연 아세테이트 수용액 (40 mM, 2 mL)과 실온에서 혼합하였다. XRD 스펙트럼은, 생성물이 전구체 용액 중의 BSA 양 차이에 따라 결정질 (ZIF-8)에서 거의 비정질로 바뀔수 있다는 것을 보여준다. 이들 결과는, 상당량의 단백질이 임의 타입의 결정질 MOF를 형성하는 능력에 영향을 미치지 않으면서도 MOF 안으로 캡슐화될 수 있다는 것을 시사해준다.

실시예 10

단백질@ZIF-8의 BET 특징

BSA를 여러가지 함량으로 사용해 제조한, BSA가 캡슐화된 ZIF-8의 포어 크기 분포를 도 15에 도시된 BET 측정 데이타를 이용해 측정하였다. BSA의 양 증가에 따라 포어 용적은 점차적으로 감소한다. 포어 크기에 명백한 시프트는 없었는데, 이는 ZIF-8이 생체분자를 둘러싸 형성됨을 시사한다. 포어 너비 약 13.8 Å에 피크 중심이 위치한 2번째 피크는 ZIF-8 구조체의 고유 공동이 아니라, 오히려 샘플내 ZIF-8 응집체가 존재함을 보여준다. 이 응집체는 개개 ZIF-8 결정들이 함께 팩킹되어 형성된 것이다. 이 응집체는 응집체를 형성하고 있는 이웃한 결정들 간에 평균 13.8 Å 크기의 공간을 가지는 것으로 특정된다. 첫번째 피크는 포어 직경이 약 11이며, 이는 LCD 예측과 충분히 부합된다.

또한, BET를 이용해 BSA, HSA, OVA, 트립신, (PQQ)GDH, 헤모글로빈, 리소자임, HRP, 리보뉴클레아제 A 등의 여러가지 단백질이 시딩된 ZIF-8의 접근가능한 표면적을 조사하였다. plain ZIF-8의 BET를 비교용으로 제공하였다. 상기 열거된 단백질을 이용해 실시예 2에 기술된 바와 같이 합성하였다.

BET 표면적을 Micromeritics 6 port ASAP 2420 분석기를 사용해 -196℃에서 질소 흡착으로 측정하였다. 샘플을 분석하기 전 진공 하에 8시간 동안 120℃에서 탈기시켰다. 포어 분포는 밀도 함수 이론 (Density Functional Theory)을 이용해 결정하였다. 이는 포어 크기 분포를 실험적으로 측정하는 전형적인 방법이다. 그 결과는 Haldoupis, S. Nair and D. S. Sholl, Journal of the American Chemical Society, 132 (2010), 7528에 개괄된 바와 같이, LCD 값 등의 수학적으로 도출된 값과 일치한다.

1 mg (a) BSA, (b) HSA, (c) OVA, (d) 트립신, (e) (PQQ)GDH, (f) 헤모글로빈, (g) 리소자임, (h) HRP, (i) 리보뉴클레아제 A를 이용한 ZIF-8 바이오시딩에 대한 77K에서의 BET N₂ 흡착/탈착 커브는 각각 다음과 같은 표면적을 제공하였다: (a) 1381, (b) 1025, (c) 1031, (d) 1307, (e) 1278, (f) 1329, (g) 1370, (h) 1376, 및 (i) 1404 m² g^-1.

실시예 11

올리고뉴클레오티드를 이용한 ZIF -8 시딩 (활성, SEM , CLSM )

Cy3-올리고뉴클레오티드 (20.8 μM) 200 ㎕를 탈이온수 중의 2-메틸이미다졸 용액 (160 mM, 0.5 mL)에 첨가하였다. 별도로 탈이온수에 용해된 아연 아세테이트 용액 (40 mM, 0.5 mL)을 준비하였다. 이들 2종의 용액을 혼합하고, 10초간 볼텍싱하였다. 혼합물을 실온에서 24시간 에이징하였다. 형성된 석출물을 10분간 16000 rpm로 원심분리하여 회수한 다음, 이를 에탄올 중에서 세척 및 원심분리하였다. ZIF-8의 DNA 로딩 효율 (75%)을, 전구체 용액 중의 DNA 농도와 수득된 결정체의 상층액 중의 DNA 농도를 측정함으로써, 미리-측정한 캘리브레이션 곡선으로부터 561 nm에서 방출 (Cy3 방출 최대치)을 수집하는 형광 스펙트로포토미터를 이용해 결정하였다.

비교예 1

ZIF -8 합성 후 BSA 침투

순수 ZIF-8 배치를 본원에 언급된 표준 공정에 따라 제조한 다음, FITC-표지된 BSA 용액에 노출시켰다. FITC-표지된 BSA에 노출시킨 순수 ZIF-8에 대한 공초점 현미경 검경을 수행하여, MOF 내부의 단백질 분산성을 검증하였다.

CLSM을 Leica TCS SP5를 사용해 수행하였다. 합성 후 침투시킨 샘플은 도 16에 나타낸 방출 특징을 나타내었다. 침투된 샘플의 방출을 도 7 및 8에 나타낸 본 발명에 따라 제조된 BSA@ZIF-8의 방출과 비교할 수 있다. 방출 신호 대부분이 결정의 표면에서 검출되므로, 간단하게 BSA는 ZIF-8 샘플 내부로 확산되지 않았다.

또한, 침투시킨 MOF (종래 기술)와 본 발명에 따라 제조된 BSA 함유 MOF에서 내부 단백질 분포를 추가로 비교하기 위해 FTIR을 이용하였다. 측정 데이타는 도 17에 나타낸다. 즉, 아래 샘플들을 조사하였다:

1) 순수 BSA;

2) BSA@ZIF-8;

3) 실시예 2의 공정에 따라 제조하고 계면활성제로 세척한, BSA@ZIF-8;

4) 순수 ZIF-8;

5) BSA를 합성 후 침투시킨, 기-형성된 순수 ZIF-8;

6) BSA를 합성 후 침투시키고 계면활성제로 세척한, 기-형성된 순수 ZIF-8.

도 17의 스펙트럼을 참조해 보면, 단백질 (BSA)의 특징적인 아미드 I (1655 cm^-1) 피크와 아미드 II (1548 cm^-1) 피크가 BSA@ZIF-8 (오렌지색)과 BSA 용액 중에 인큐베이션한 ZIF-8 (청색)에서 검출되었다. 그러나, SDS로 세척한 후에는 아미드 피크들은 본 발명에 따라 제조된 BSA@ZIF-8 결정에서만 검출되었는데, 이는 BSA 용액에 후속적으로 노출시킨 ZIF-8의 경우 단백질이 씻겨나갔다는 것을 의미한다. 시딩된 ZIF-8 내부에 BSA가 있다는 것을 의미하는 또 다른 표시는, 대부분 단백질에 속하는 화학적 기로부터 기원한 3600-2800 cm^-1 범위의 광역 밴드이다.

계면활성제 (소듐 도데실 설페이트, SDS) 세척은, BSA 용액에 후속적으로 노출시킨 ZIF-8의 경우, 스펙트럼 모델이 아미드와 관련된 스펙트럼 모드가 없어짐을 보여준다. 시딩된 BSA@ZIF-8의 경우 여전히 진동 모드가 존재하는데, 이는 단백질이 ZIF-8 안에 있으며, 즉 캡슐화되어 있으며, 공간적인 제약으로 조밀하게 결합되어 있을 수 있다는 것을 검증해준다.

비교예 2

고온 노출 전 및 노출 후의 HRP@CaCO ₃ 및 HRP@SiO ₂ 입자 vs HRP@ZIF-8 및 (PQQ)GDH의 생활성

HRP-로딩된 CaCO₃ 입자를 기존에 보고된 방법에 따라 합성하였다 (Volodkin, D. V. Larionova, N. I. & Sukhorukov G. B. 'Protein Encapsulation via Porous CaCO3 Microparticles Templating' Biomacromolecules 5, 1962-1972 (2004), and Petrov A. I., Volodkin D. V. & Sukhorukov G. B. 'Protein―Calcium Carbonate Coprecipitation: A Tool for Protein Encapsulation', Biotechnology Progress, 21, 918-925 (2005)).

합성은 전통적인 단백질-로딩된 CaCO₃ 입자의 생활성과 본 발명에 따라 제조된 단백질이 캡슐화된 MOF의 생활성을 비교하기 위해 수행하였다.

Na₂CO₃ (탈이온수 중의 330 mM) 용액을, HRP (탈이온수 중의 2 mg/mL)이 함유된 동일 부피의 CaCl₂ (330 mM) 용액과 빨리 혼합한 다음 실온에서 30초간 왕성하게 교반하였다. 수득된 용액을 교반하지 않고 15분간 에이징하였다. 형성된 석출물을 수중에서 2분간 1000 g로 원심분리하여 회수하였다. CaCO₃ 입자내 HRP 로딩 효율을, 전구체 용액 중의 HRP 농도와 수득된 입자의 상층액 중의 HRP 농도를 측정함으로써, 미리-측정한 캘리브레이션 곡선으로부터 280 nm에서 형광 스펙트로포토미터를 이용해 측정하였다. 로딩 효율: 28 wt%.

HRP-로딩된 SiO₂ 입자를 제조하기 위해, 입자의 표면을 아미노프로필트리에톡시실란 (APTES)으로 변형시켰다. 실리카 입자 (평균 포어 크기 7 nm SBA-15, ACS Material, LLC; 포어 크기 20, 50 및 100 nm, TESSEK Ltd.) 10 mg을 0.5 mL APTES가 첨가된 톨루엔 (5 mL)에 현탁하였다. 실온에서 12시간 동안 교반한 후, APTES-변형된 실리카 입자를 에탄올과 물로 연속 세척/원심분리 사이클로 3회 세척한 다음, 마지막으로 MES 완충제 (1 mL, 0.1 M, pH 5)에 분산시켰다.

그런 후, 실리카 입자 현탁액에 HRP (1 mg)와 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필) 카르보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC, 1 mg)를 투입하여, 일정하게 천천히 교반하면서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 효소 로딩 효율: 82.0% (7 nm 포어 SiO₂), 68.8% (20 nm 포어 SiO₂), 69.1% (50 nm 포어 SiO₂), 66.2% (100 nm 포어 SiO₂).

HRP-로딩된 ZIF-8, CaCO₃ 및 SiO₂ 입자들을, 입자 표면 상의 유리형 효소를 제거하기 위해, 10분간 70℃에서 SDS (탈이온수 중의 10 %w/w, 2 mL) 용액에 다시 분산시켰다. 전형적인 생활성 분석에서, 용액 A에 투입되는 ZIF-8, CaCO₃ 및 SiO₂ 입자의 양은 로딩 효율로부터 결정된 바와 같이, 입자 내부로 로딩되는 효소의 양과 동일하게 조정하였다. 입자를 용액 A에 첨가한 다음, 즉시 용액의 흡광도를 30초씩 늘이면서 UV-Vis로 420 nm에서 모니터링하였다. 대조군 실험에서는, ZIF-8, CaCO₃ 및 SiO₂ 입자를 탈이온수 (1 mL)에 다시 분산시킨 다음, 생활성 분석을 개시하기 전에 1시간 동안 90℃에서 인큐베이션하였다.

유의미하게도, MOF 결정은 고온에서 생체분자를 보호하는 튼튼한 장벽처럼 작용한다. ZIF-8 결정 안에 임베딩된 HRP는 피로갈롤의 존재 시 효소적 반응을 유도하고 (유리형 효소의 활성의 88.5%, 도 18(a)), (PQQ)GDH는 글루코스에 대한 반응을 진행한다 (유리형 효소의 활성의 74.2%, 도 18(b)).

MOF 바이오컴포지트를 90℃에서 1시간 수열 처리한 결과, 생활성이 매우 약간 감소된다 (즉, 전체 효율은 HRP의 경우 82.3%, (PQQ)GDH)의 경우 68.2%로, 여전히 높음). 중요하게도, 용액 중에서 유리형 효소에 대한 동일한 열 처리는, HRP의 경우 불과 6%, (PQQ)GDH)의 경우 6%로 이의 효율을 약간 떨어뜨려, MOF의 상당한 보호 역할이 부각되었다.

그러나, CaCO₃ 및 SiO₂ 입자를 1시간 동안 90℃에서 처리한 후에는, 안에 함유된 효소의 효소 활성의 상당한 감소가 기록된 반면, MOF 입자는 효소 활성이 상당히 감소되지 않는 것으로 입증되었다 (도 18(c)).

추가적인 실험으로, 유리형 HRP, HRP@CaCO₃, HRP@SiO₂ 및 HRP@ZIF-8 바이오컴포지트들을 또한 1시간 동안 끓는 물에 침지하였다. 유리형 효소는 활성을 완전히 상실한 반면, HRP@CaCO₃는 기질을 39%, HRP@SiO₂ 컴포지트는 65% (7 nm 포어), 44% (20 nm 포어), 17% (50 nm 포어) 및 13% (100 nm 포어)로 각각 변환하였다. 이들 값은 동일 조건에서 ZIF-8에 의해 보호된 HRP에서 달성되는 변환율 88%에 비하면 상당히 낮은 수치이다.

또 다른 실험 세트로, 동일 시스템들을 끓는 DMF (153℃)에 1시간 동안 침지하였다. 다시, 유리형 효소는 활성을 완전히 상실한 반면, 카보네이트 및 실리카 입자 내에 임베딩된 효소는 각각 32% 및 22%의 기질 변환율을 나타내었다. 이 조건에서, MOF 컴포지트는 90%의 변환율을 나타내었는데, 이는 MOF 층의 현저한 보호성을 다시 입증해준다.

본 실험은, MOF 구조체가 효소를 열 분해로부터 보호한다는 탁월한 특성을 입증해준다 (보호시 상대적인 이동 110%). 이는, MOF가 생체분자를 둘러싸 보다 조밀하게 조립되어 (전형적으로, CaCO₃는 20-70 nm 범위의 포어 크기를 가짐 [ref A.I. Petrov, D. V. Volodkin, G.B. Sukhorukov Biotechnol. Prog. 2005, 21, 918-925, Yu-Ho Won, Ho Seong Jang, Ding-Wen Chunga, Lia A. Stanciu J. Mater. Chem., 2010, 20, 7728-7733]), 바이오거대분자를 열에 의한 비-폴딩으로부터 보호함을 시사한다.

CaCO₃ 및 SiO₂와 비교해, 캡슐 MOF에 의해 부여되는 탁월한 안정성은, 따라서 MOF 구조체에 의한 생체분자의 타이트한 캡슐화와 직접적으로 관련있을 수 있다.

본 명세서와 후술한 청구항 전체에서, 문맥상 그렇지 않은 경우를 제외하고는, '포함한다'라는 용어와 '포함한다' 및 '포함하는' 등의 변형어는 언급된 정수 또는 단계 또는 정수 또는 공정의 그룹의 포괄을 내포하는 것으로 이해될 것이나, 임의의 다른 정수 또는 공정 또는 정수 또는 공정의 그룹을 배제하는 것은 아닌 것으로 이해될 것이다.

본 명세서에서 임의의 기존 간행물 (또는 이로부터 유래된 정보) 또는 공지된 임의의 사실에 대한 언급은, 기존 간행물 (또는 이로부터 파생된 정보) 또는 공지된 사실이 본 명세서와 관련된 활동 분야에서 상식의 일부를 형성한다는, 인정 또는 용인으로서 또는 어떤 형태의 암시로서 인정되지 않으며, 인정되어서는 안된다.

Claims (18)

1. 생체분자 (bio-molecule)를 캡슐화하는 구조체를 가진 금속 유기 구조체 (MOF: Metal Organic Framework)의 제조 방법으로서,
   용액 중에 생체분자와 MOF 전구체를 조합하는 단계를 포함하며,
   상기 생체분자가 캡슐 구조체의 형성을 촉진하는, 유기 구조체의 제조 방법.
2. 고유 공동 (intrinsic cavity) 영역을 한정하며 생체분자를 캡슐화하는 구조체를 가진 결정질 금속 유기 구조체 (MOF)의 제조 방법으로서,
   용액 중에 캡슐 구조체의 형성을 촉진하는 생체분자와 MOF 전구체를 조합하는 단계를 포함하며,
   상기 생체분자가, 상기 구조체의 최소 치수 (smallest dimension)가 임의의 고유 공동의 최대 공동 직경 (LCD) 보다 큰, 유기 구조체의 제조 방법.
3. 제2항에 있어서,
   상기 생체분자의 최소 치수가 상기 구조체의 고유 공동의 LCD 보다 1.5배 이상 큰, 제조 방법.
4. 제2항 또는 제3항에 있어서,
   상기 LCD가 5 Å 내지 500 Å인, 제조 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 있어서,
   상기 생체분자가 단백질, 핵산, 아미노산 또는 이들의 조합인, 제조 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한항에 있어서,
   상기 생체분자가 효소 단백질인, 제조 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한항에 있어서,
   상기 생체분자가 단백질이고, 상기 용액에서의 상기 생체분자의 농도가 0.1 내지 20 mg/mL인, 제조 방법.
8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한항에 있어서,
   상기 생체분자가 아미노산이고, 상기 용액에서의 상기 생체분자의 농도가 0.1 내지 100 mg/mL인, 제조 방법.
9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한항에 있어서,
   상기 생체분자가 핵산이고, 상기 용액에서의 상기 생체분자의 농도가 0.001 내지 100 μM인, 제조 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 용액에서의 상기 MOF 전구체의 농도가 약 0.001 M 내지 1 M인, 제조 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 캡슐 구조체의 형성이 75℃ 보다 낮은 용액 온도에서 수행되는, 제조 방법.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 MOF는 MOF의 중량을 기준으로 상기 생체분자를 1 wt% 내지 32 wt%로 캡슐화하는, 제조 방법.
13. 고유 공동 영역을 한정하며 생체분자를 캡슐화하는 구조체를 가진 결정질 금속 유기 구조체 (MOF)의 제조 방법으로서,
    상기 생체분자의 최소 치수가, 상기 구조체의 임의의 고유 공동의 최대 공동 직경 (LCD) 보다 큰, 결정질 금속 유기 구조체.
14. 제13항에 있어서,
    상기 생체분자가 단백질, 핵산, 아미노산 또는 이들의 조합인, 결정질 금속 유기 구조체.
15. 제14항에 있어서,
    상기 생체분자가 효소 단백질인, 결정질 금속 유기 구조체.
16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 MOF의 중량을 기준으로 상기 생체분자를 1% wt 내지 32% 캡슐화하는, 결정질 금속 유기 구조체.
17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 LCD가 5 Å 내지 500 Å인, 결정질 금속 유기 구조체.
18. 제13항 내지 제17항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 생체분자의 최소 치수가 상기 구조체의 고유 공동의 LCD 보다 1.5배 이상 큰, 결정질 금속 유기 구조체.

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