CN109833468A - 一种金属有机框架-超氧化物歧化酶组装体、制备方法及其在制备治疗帕金森药物中的应用 - Google Patents

Abstract

一种金属有机框架‑超氧化物歧化酶组装体、制备方法及其在制备治疗帕金森药物中的应用，属于生物技术领域。本发明利用仿生矿化组装策略将SOD酶分子固载到金属‑有机框架ZIF‑8之中，SOD的氨基和ZIF‑8的锌离子之间形成配位键，从而实现以酶为基质构建金属有机框架‑SOD酶组装体(SOD@ZIF‑8)。本发明有效提升了SOD酶分子的温度稳定性及pH耐受性；以该SOD@ZIF‑8组装体为治疗药物，在细胞水平上，能够有效清除MPP⁺刺激所产生的活性氧，从而缓解活性氧所造成的细胞凋亡；在动物水平上，该组装体静脉给药后能够显著缓解MPTP作用所构建的帕金森模型小鼠的运动能力障碍，提高脑黑质区域酪氨酸羟化酶的表达水平，具有良好的治疗效果。

Description

一种金属有机框架-超氧化物歧化酶组装体、制备方法及其在 制备治疗帕金森药物中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及基于仿生矿化技术构建的一种金属有机框架-超氧化物歧化酶(SOD)组装体、制备方法及其在制备治疗帕金森药物中的应用。

背景技术

帕金森是近年来备受关注的一类神经退行性疾病，其病理为脑黑质区域的多巴胺能神经元的退化，进一步导致运动机能障碍，临床上表现为静止性震颤、运动迟缓和肌强直。脑重量仅占体重的2％左右，但是却消耗20％左右的代谢氧。由于神经元细胞产生的还原型谷胱甘肽不足，导致脑清除代谢产生的活性氧的能力有限。因此，神经元是最容易受到过量产生的活性氧以及抗氧化剂缺乏影响的细胞，也是对氧化损伤最敏感的细胞。研究发现，脑中过量产生的活性氧得不到及时清除，是导致帕金森疾病的一个重要原因。

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)是1938年首次从牛红血球中分离得到的，至今人们对SOD的研究已有七十多年的历史。SOD是抗氧化酶家族的重要成员，是抗氧化系统的第一道防线，因此，SOD对于由过量产生的活性氧而造成的多种疾病具有显著的抵抗或缓解作用。尽管SOD具有上述重要的作用，其体内治疗仍存在诸多瓶颈：稳定性差、胃肠道吸收能力差、主动跨膜能力差等。酶组装技术是解决上述问题的一条有效途径，其能够赋予酶分子良好的催化活力、稳定性、对环境的高度抗性及高效入胞能力。

金属-有机框架材料(Metal-Organic Framework，MOF)是由无机金属和有机配体通过配位键结合而成的一类多孔材料，具有孔径可调节，表面积较大，功能多样性等优良性能，在气体储存、分离纯化、催化、生物医学以及传感等领域备受关注。同时，MOF也成为酶固定化研究的一种有效材料，以MOF为材料进行酶固定化的方式主要有吸附、共价偶联、扩散及共沉淀。

仿生矿化技术起源于对生物矿物形成过程和机制的阐明，是利用共沉淀方式进行酶固定化的一种类型。2014年，Lyu等人(F.Lyu,Y.Zhang,R.N.Zare,J.Ge and Z.Liu,NanoLett.,2014,14,5761.)首次报道通过共沉淀的方式将蛋白分子固载到一类金属-有机框架材料ZIF-8之中，之后细胞色素c、辣根过氧化物酶和酯酶等相继被固载到ZIF-8之中。与其它酶固定化策略相比，仿生矿化技术具有如下优势：作用条件更温和，对酶构象和活性影响更小，生物相容性和稳定性更好。因此，采用仿生矿化的酶组装策略能够将分子量较大的酶固载到MOF材料中，并提升酶的催化性能，最终拓宽酶在生物催化及生物医学工程等领域中的应用。

发明内容

本发明首次利用仿生矿化组装策略将SOD酶分子固载到金属-有机框架ZIF-8之中，仿生矿化原理为SOD的氨基和ZIF-8的锌离子之间形成配位键，从而实现以酶为基质构建金属有机框架-SOD酶组装体(SOD@ZIF-8)。利用本发明所制备的SOD@ZIF-8为药物，分别在细胞水平和动物水平上评价其对帕金森的治疗效果(细胞水平上以1-甲基-4苯基-吡啶离子(MPP⁺)刺激人神经母瘤细胞(SHSY-5Y)为模型；动物水平上以1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)刺激C57BL/6J雄性小鼠为模型)。细胞方面，MPP⁺剂量为2～3mM，SOD@ZIF-8的含量为50-80μg/mL；动物方面，MPTP的剂量为35～50mg/kg/天，连续注射4～7天，SOD给药剂量为2～5kU/kg。

本发明所述的基于仿生矿化原理的一种金属有机框架-SOD酶组装体(SOD@ZIF-8)的制备方法，其特征在于：在20～30℃条件下，将二甲基咪唑水溶液加入到溶有SOD的醋酸锌水溶液中，再加入甲醇；然后在20～30℃条件下充分反应24～36h，反应结束后，反应体系经6000～8000r/min离心5～10min，收集沉淀，沉淀产物经蒸馏水洗涤3～5次，冻干后的粉末即为本发明所述的金属有机框架-SOD酶组装体(SOD@ZIF-8)。

上述方法中，二甲基咪唑水溶液中，二甲基咪唑的浓度为120～200mM；SOD的醋酸锌水溶液中，醋酸锌的浓度范围为20～100mM，SOD的浓度为0.2～0.6mg/mL；二甲基咪唑与醋酸锌的摩尔比为2～6：1，二甲基咪唑与SOD的摩尔比为1：6000～32000；二甲基咪唑水溶液和溶有SOD的醋酸锌水溶液的总体积为4～10mL，甲醇的体积为200～400μL；

本发明所采用的仿生矿化酶组装策略相较于其他MOF固载酶的方法具有以下优点：合成过程简单，合成条件温和；对酶活性影响小，能够更好地保护酶分子的稳定性；能够担载分子量较大的酶分子。

通过对本发明所构建的金属有机框架-SOD酶组装体(SOD@ZIF-8)的酶活性研究发现，其具有很好的酶催化活性，原因在于本发明所采用的仿生矿化酶组装策略条件温和。同时，与游离酶相比，固载后的酶组装体具有更强的抵抗高温和酸碱环境的能力。

目前关于ZIF-8固载酶分子的报道多数是微米级的，然而微米级的药物尺寸过大，静脉注射会造成血管阻塞，所以微米级的纳米药物不适合通过静脉注射的方式进行给药。本发明通过仿生矿化固定化的策略成功构建了纳米级组装体SOD@ZIF-8，适合于体内给药和药物入胞。细胞水平研究发现，SOD@ZIF-8可以有效地清除MPP⁺刺激产生的活性氧，从而有效缓解过量产生的活性氧所引起的细胞凋亡，对细胞起到有效的保护作用。帕金森模型小鼠的体内研究发现，静脉注射金属有机框架-SOD酶组装体(SOD@ZIF-8)能够有效缓解帕金森小鼠的运动功能障碍，对帕金森疾病有着明显的治疗作用。

综上，本发明通过仿生矿化组装的策略成功制备了具有优良酶学性能的纳米级金属有机框架-SOD酶组装体-SOD@ZIF-8，细胞水平和动物水平抗帕金森研究表明，该体系具有良好的疾病治疗效果，有望成为一种有效治疗帕金森疾病的新型治疗酶制剂。

附图说明

图1：实施例1合成的SOD@ZIF-8的扫描电镜照片。

图2：实施例2合成的SOD@ZIF-8的扫描电镜照片。

图3：SOD@ZIF-8、ZIF-8以及游离SOD的红外光谱图。图中横坐标为检测波数。

图4：温度(a)和pH(b)对SOD@ZIF-8和SOD酶活性的影响示意图。图中横坐标分别为温度和pH，纵坐标为相对酶活性。

图5：胰蛋白酶对SOD@ZIF-8和SOD稳定性影响的SDS-PAGE电泳分析图。图中条带1为蛋白marker，条带2为未经过胰蛋白酶处理的SOD，条带3为经过胰蛋白酶处理的SOD，条带4为未经过胰蛋白酶处理的SOD@ZIF-8，条带5为经过胰蛋白酶处理的SOD@ZIF-8。

图6：利用本发明所构建的SOD@ZIF-8对MPP⁺刺激产生的活性氧清除效果图。图中纵坐标为活性氧探针DCF的相对荧光强度。

图7：利用本发明所构建的SOD@ZIF-8缓解MPP⁺刺激造成细胞凋亡效果的流式细胞术研究图。图中(a)为对照组，(b)为MPP⁺组，(c)为MPP⁺+ZIF-8组，(d)为MPP⁺+SOD组，(e)为MPP⁺+SOD@ZIF-8组。横坐标和纵坐标分别为试剂盒中含有的检测染料Annexin V-FITC和PI。

图8：利用本发明所构建的SOD@ZIF-8对帕金森模型小鼠转棒行为的影响图。图中纵坐标为小鼠在转棒上的停留时间，单位为秒。

图9：利用本发明所构建的SOD@ZIF-8对小鼠脑黑质区域酪氨酸羟化酶(TH)的表达水平的蛋白质免疫印迹分析图。图中β-actin为内参蛋白。1-5道分别代表Control、MPTP+SOD@ZIF-8、MPTP+SOD、MPTP和MPTP+ZIF-8组。

具体实施方式

下面给出的实施例子是对本发明作进一步说明，以便于本专业技术人员更全面地理解本发明。但所给出的实施例不能理解为对本发明保护范围的限制，因而该专业的技术人员根据上述发明内容所做出的非本质的改进和调整也应属于本发明保护范围。

实施例1

将2mL二甲基咪唑水溶液(160mM)加入到溶有1mg SOD的2mL醋酸锌水溶液(40mM)中，溶液温度均为25℃。二甲基咪唑与SOD的摩尔比为1：8000。然后加入200μL甲醇引发反应，25℃下反应32h。体系经8000rpm/min离心5min，收集沉淀，沉淀物经蒸馏水洗涤3次，冻干，即为终产物SOD@ZIF-8，产物质量为10mg。

从图1合成产物的扫描电镜发现，采用上述方法合成的SOD@ZIF-8为近似菱形的纳米级粒子，形貌规整，其粒径在200～400nm之间。

实施例2

将4mL二甲基咪唑水溶液(160mM)加入到溶有2mg SOD的4mL醋酸锌水溶液(40mM)中，溶液温度均为25℃。二甲基咪唑与SOD的摩尔比为1：8000。然后加入400μL甲醇引发反应，25℃下反应32h。体系经8000rpm/min离心5min，收集沉淀，沉淀物经蒸馏水洗涤3次，冻干，即为终产物SOD@ZIF-8，产物质量为20mg。

从图2合成产物的扫描电镜发现，采用上述方法，等比例扩大反应物投入量之后合成的SOD@ZIF-8为近似菱形的纳米级粒子，形貌规整，其粒径在200～400nm之间。在粒径与形貌方面与采用实施例1方法所合成的SOD@ZIF-8一致。

实施例3

将实施例1中合成的SOD@ZIF-8、ZIF-8以及游离SOD在100℃下充分干燥后，进行红外光谱分析。

如图3所示，金属有机框架-SOD酶组装体(SOD@ZIF-8)的红外光谱中存在1460-1560cm^-1和1640-1700cm^-1处的酰胺I带和II带的特征吸收，为所担载SOD酶的特征振动，而ZIF-8的红外光谱中不存在上述特征振动，证明SOD酶成功地通过仿生矿化的方式固载进ZIF-8中。

实施例4

采用邻苯三酚自氧化法和总SOD活性检测试剂盒分别评价温度及pH对实施例1中合成的SOD@ZIF-8催化活性和稳定性的影响。

从图4可以发现，在高温(温度高于50℃)以及碱性pH条件下，SOD@ZIF-8的酶活性都要明显优于游离SOD。以上结果表明，与游离SOD相比，通过仿生矿化组装策略所构建的金属有机框架-SOD酶组装体(SOD@ZIF-8)具有更强的抵抗高温及碱性环境的能力。

实施例5

将游离SOD以及实施例1中合成的SOD@ZIF-8(SOD当量为6μg)分别用1.25％的胰蛋白酶在室温下处理1.5h。其中SOD@ZIF-8经过胰蛋白酶处理之后，6000rpm/min离心10min收集沉淀，并用超纯水洗涤3次，然后加入15μL浓度为1M的盐酸孵育1h裂解ZIF-8矿化层，最后加入15μL浓度为1M的氢氧化钠溶液中和盐酸。上述处理后的SOD@ZIF-8以及游离SOD分别加入含有溴酚蓝的蛋白质上样缓冲液中，100℃加热10min之后进行SDS-PAGE电泳鉴定，每孔上样量为10μL。

SDS-PAGE电泳结果如图5所示，游离SOD经过胰蛋白酶处理之后，产生明显的断裂条带，而处理后SOD@ZIF-8仍保持完成的SOD条带大小，无断裂条带出现。以上研究表明，ZIF-8矿化层能够很好地保护SOD分子，使其免受胰蛋白酶的降解和破坏，极大提高了SOD的稳定性。

实施例6

以MPP⁺刺激之后的人神经母瘤细胞系SHSY-5Y作为帕金森模型，在细胞水平上评价SOD@ZIF-8(实施例1中合成)对MPP⁺刺激所导致的活性氧产生的抑制效果。将SHSY-5Y细胞(实验室冻存)以1.2×10⁵/孔的细胞密度铺6孔板，12h后进行给药处理，作用24h之后，用MPP⁺刺激细胞2h产生活性氧。细胞分为5个组，每组设置3个平行孔，分别为Control(未进行刺激，磷酸盐缓冲液给药)，MPP⁺(MPP⁺刺激，磷酸盐缓冲液给药)，MPP⁺+SOD(MPP⁺刺激，SOD给药)，MPP⁺+SOD@ZIF-8(MPP⁺刺激，SOD@ZIF-8给药)和MPP⁺+ZIF-8(MPP⁺刺激，ZIF-8给药)。每孔中MPP⁺的含量均为3mM，SOD@ZIF-8的含量为60μg/mL，各个组之间SOD和ZIF-8的含量一致。MPP⁺刺激之后，收集细胞并按照活性氧检测试剂盒的说明装载探针DCF，即细胞收集后悬浮于稀释过的探针DCF溶液中，细胞浓度为10⁷；37℃孵育20min，期间每隔4min颠倒混匀一下，使细胞和探针充分接触。上述步骤完成后，流式细胞仪检测SHSY-5Y细胞内活性氧探针的荧光。

从图6可以清楚观察到，MPP⁺刺激SHSY-5Y细胞之后，细胞内荧光强度明显提高，约为未刺激组的8倍，表明经MPP⁺刺激后细胞内活性氧水平显著升高。SOD@ZIF-8作用后，荧光度值降低到未刺激组的3倍左右，表明纳米组装体具有良好的细胞内活性氧抑制能力；然而，游离SOD并不能明显抑制活性氧的产生(荧光度值是未刺激组的6倍左右)。因此，相较于游离SOD，SOD@ZIF-8能够更有效地抑制由于MPP⁺刺激所导致的人神经母瘤细胞SHSY-5Y内活性氧的产生。

实施例7

以MPP⁺刺激后的人神经母瘤细胞系SHSY-5Y作为帕金森模型，在细胞水平上评价SOD@ZIF-8(实施例1中合成)对帕金森疾病的治疗效果。SHSY-5Y细胞以1.2×10⁵/孔的密度铺6孔板，12h后进行给药处理，作用24h之后用MPP⁺刺激细胞24h。细胞分为5个组，每组设置3个平行孔，分别为Control(未进行刺激，生理盐水给药)，MPP⁺(MPP⁺刺激，生理盐水给药)，MPP⁺+SOD(MPP⁺刺激，SOD给药)，MPP⁺+SOD@ZIF-8(MPP⁺刺激，SOD@ZIF-8给药)和MPP⁺+ZIF-8(MPP⁺刺激，ZIF-8给药)。每孔中MPP⁺的含量均为2mM，SOD@ZIF-8的含量为60μg/mL，各个组之间SOD和ZIF-8的含量一致。MPP⁺刺激之后，根据Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒的使用说明书进行检测：使用质量体积分数为0.25％的胰蛋白酶消化贴壁细胞，之后2000g离心5min收集细胞，用预冷的磷酸盐缓冲液洗涤细胞两次；之后采用50μL染色溶液对细胞进行染色，其中包括2μL Annexin V-FITC和2μL PI，混匀后于4℃避光条件下孵育30min；最后以Annexin V结合缓冲液将体系稀释至400μL，通过流式细胞仪检测SHSY-5Y细胞的凋亡情况。

如图7所示，SOD@ZIF-8可以明显的缓解由于MPP⁺刺激所造成的细胞凋亡(细胞凋亡由25.17％降低至8.68％)，接近未用MPP⁺刺激组的水平(4.31％)。以上结果结合实施例6中的结果共同说明，相较于游离SOD，SOD@ZIF-8能够更好地清除细胞内活性氧，缓解由活性氧造成的细胞凋亡，从而发挥对人神经母瘤细胞系SHSY-5Y的保护作用。

实施例8

以MPTP腹腔注射C57BL/6J雄性小鼠(20-22g)的方式构建帕金森疾病动物模型，MPTP的剂量为35mg/kg/day，连续注射5天。为了保证构建结果的一致性，在建模前一周，将小鼠置于转棒仪上，进行预训练，分别以恒速8r/min、16r/min、24r/min，以及匀加速4-44r/min/5min进行练习，连续训练5天，淘汰未达到均一水平的小鼠。MPTP注射结束后的第4天开始给药治疗，分为5个组：Control(不注射MPTP，生理盐水给药)，MPTP(注射MPTP，生理盐水给药)，MPTP+SOD(注射MPTP，SOD给药)，MPTP+SOD@ZIF-8(注射MPTP，SOD@ZIF-8给药，SOD@ZIF-8由实施例1中合成)和MPTP+ZIF-8(注射MPTP，ZIF-8给药)，每组6只。给药组的SOD含量均为每次2kU/kg，给药方式为每隔一天给药一次，连续给药5次。处理之后的第5天，进行转棒实验检测小鼠运动协调能力，以40r/min的转速进行实验，记录小鼠在转棒上的停留时间。总共检测3次，每次检测间隔2h，3次的平均值记为最终结果。最终结果以停留时间(sec)表示，

研究结果如图8所示。MPTP+SOD@ZIF-8组的小鼠在转棒仪上的停留时间显著高于MPTP组、MPTP+ZIF-8及MPTP+SOD组，表明SOD@ZIF-8能够很好地改善帕金森模型小鼠的运动功能障碍。

实施例9

酪氨酸羟化酶(TH)表达量的下降是MPTP引起的帕金森疾病的一项重要指标。按照实施例8中的方法对C57BL/6J雄性小鼠进行处理之后的第5天，将小鼠处死并取出小鼠脑部的黑质区域，在冰上将黑质剪成1mm³左右的小块并在液氮中充分研磨30min。然后加入750μL预冷的磷酸盐缓冲液，12000r/min离心5min，弃上清之后，立即加入500μL RIPA裂解液和5μL蛋白酶抑制剂PMSF，混合物充分混匀后，冰浴1h。最后，样品在12000r/min的转速下离心15min，得到的蛋白样品采用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白浓度测试，之后采用蛋白质印迹技术进行蛋白表达水平分析。

从图9可以发现，SOD@ZIF-8(实施例1中合成)和游离SOD给药后，小鼠脑黑质区域酪氨酸羟化酶(TH)的表达量显著升高，表明SOD@ZIF-8能够有效治疗由MPTP刺激所引起的帕金森疾病。

Claims (4)

1.一种金属有机框架-超氧化物歧化酶组装体的制备方法，其特征在于：在20～30℃条件下，将二甲基咪唑水溶液加入到溶有SOD的醋酸锌水溶液中，再加入甲醇；然后在20～30℃条件下充分反应24～36h，反应结束后，反应体系经6000～8000r/min离心5～10min，收集沉淀，沉淀产物经蒸馏水洗涤3～5次，冻干后的粉末即为金属有机框架-SOD酶组装体。

2.如权利要求1所述的一种金属有机框架-超氧化物歧化酶组装体的制备方法，其特征在于：二甲基咪唑水溶液中，二甲基咪唑的浓度为120～200mM；SOD的醋酸锌水溶液中，醋酸锌的浓度范围为20～100mM，SOD的浓度为0.2～0.6mg/mL；二甲基咪唑与醋酸锌的摩尔比为2～6：1，二甲基咪唑与SOD的摩尔比为1：6000～32000；二甲基咪唑水溶液和溶有SOD的醋酸锌水溶液的总体积为4～10mL，甲醇的体积为200～400μL。

3.一种金属有机框架-超氧化物歧化酶组装体，其特征在于：是由权利要求1或2所述的方法制备得到。

4.权利要求3所述的一种金属有机框架-超氧化物歧化酶组装体在制备治疗帕金森药物中的应用。