CN112029758A - 一种多酶固定化材料及其制备方法和应用 - Google Patents

一种多酶固定化材料及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多酶固定化材料及其制备方法和应用，包括如下步骤：1)将酶Ⅰ、2‑甲基咪唑、硝酸锌分散于水中，并混合搅拌反应得到悬浮液；通过离心分离得到沉淀，并将沉淀分散于十二烷基磺酸钠水溶液中继续搅拌，随后用水将反应产物过滤洗涤，冷冻干燥；2)将步骤1)中的产物分散于盐酸多巴胺的Tris‑HCl缓冲液中；搅拌反应得变色产物，将变色产物通过Tris‑HCl缓冲液洗涤，再次分散于溶有酶Ⅱ的Tris‑HCl缓冲液中，搅拌反应；将反应终产物洗涤，冷冻干燥，得到颗粒内部与颗粒表层同时分布有不同酶分子的多酶固定化材料。本发明工艺简单，条件温和，极大的保留了酶的功能特性，提升了联级反应的催化效率。

Description

一种多酶固定化材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种应用于联级催化反应的多酶固定化材料的制备方法，属于生物材料技术领域。
背景技术
细胞的代谢通常需要在连续的反应链中进行，需要利用多种或多个酶协同催化完成；前一个酶反应的产物往往是后一个酶反应的底物，从而使代谢过程有序进行。这种由多酶联级催化形成的反应链统称为多酶催化体系。随着生物技术的进步，构建体外多酶联级反应在生物医学、生物传感器和生物转化领域飞速发展。传统细胞多步代谢过程产率低下，往往伴随着于中间体的形成和意想不到的副产物，并且需要额外的营养物质的供给来保证细胞的正常生长。然而，通过体外酶系统合成路线的灵活设计和优化可以很好地解决上述问题。
然而，在体外多酶固定化的过程中，不同作用力的共同影响与相互制约必然增大制备过程的复杂度，难以形成可控的构型；并且，材料制备中需要考虑酶的活性和稳定性，使得设计工艺的选择受限。因此如何选择合适的固定化方式，使其能够在室温、中性和常压条件下对酶进行温和、高效固定化是构建多酶催化微反应体系的关键。
发明内容
为了克服现有技术的缺点，本发明提供了一种聚多巴胺包覆MOF纳米复合材料，用于脂肪酶和葡萄糖氧化酶双酶的定位组装。结合多酶位置分布，以实现在多级反应中，多酶间的高效协同，底物、中间产物的可控传递的技术问题。
本发明的另一目的在于提供所述的方法制备的应用于联级催化反应的多酶固定化材料。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种多酶固定化材料的制备方法，包括如下步骤：
1)将酶Ⅰ、2-甲基咪唑、Zn(NO3)2·6H2O分散于水中，并混合搅拌反应得到悬浮液；通过离心分离得到沉淀，并将沉淀分散于十二烷基磺酸钠水溶液中继续搅拌，随后用水将反应产物过滤洗涤，冷冻干燥；
2)将步骤1)中的产物分散于盐酸多巴胺的Tris-HCl缓冲液中；搅拌反应得变色产物，将变色产物通过Tris-HCl缓冲液洗涤，再次分散于溶有酶Ⅱ的Tris-HCl缓冲液中，搅拌反应；将反应终产物洗涤，冷冻干燥，得到颗粒内部与颗粒表层同时分布有不同酶分子的多酶固定化材料。
优选地，所述的酶Ⅰ为脂肪酶和葡萄糖氧化酶中的一种，酶Ⅱ为另一种。
优选地，所述脂肪酶为米赫根毛霉脂肪酶、黑曲霉脂肪酶、南极假丝酵母脂肪酶、念珠菌脂肪酶中的一种或两种以上。
优选地，步骤1)所述酶Ⅰ、2-甲基咪唑、Zn(NO3)2·6H2O与水的质量比为(0.03-0.2):(2-4):(0.1-0.8):(1000-2000)；沉淀物与十二烷基磺酸钠的质量比为(5-10):(100-200)。
优选地，步骤1)所述混合搅拌反应的速度是200-400rpm，反应时间为0.5-2h，反应温度为20-30℃；沉淀物与十二烷基磺酸钠的搅拌速度为200-500rpm，搅拌时间为10-20min，搅拌温度为40-60℃。
优选地，所述步骤1)中的产物与盐酸多巴胺、Tris-HCl缓冲液的质量比为:(1-5):(0.5-1):(1000-2000)；酶Ⅱ与Tris-HCl缓冲液的质量比为:(0.5-1):(1000-2000)。
优选地，步骤2)第一次搅拌反应的搅拌速度为200-400rpm，搅拌时间为1-5h，搅拌温度为20-30℃；所述Tris-HCl缓冲液的浓度为0.02-0.05mol/L，pH值为7.5-8.5。
步骤2)第二次搅拌反应的时间为0.5-2h，反应温度为20-30℃，搅拌速度为200-500rpm。
优选地，步骤1)所述离心分离的转速为3000-5000rpm，时间为2-5min；过滤洗涤次数为3-5次；步骤2)变色产物洗涤的条件为：离心转速为3000-5000rpm，时间为2-5min，洗涤次数为3-5次；终产物洗涤的条件为：离心转速为3000-5000rpm，时间为2-5min，洗涤次数为3-5次。
上述方法制得的多酶固定化材料在酶催化制备吡啶氮氧化物中的应用。
本发明建立在MOFs生物矿化作用与多巴胺高效的生物粘附特性的基础上，通过温和的处理工艺实现了聚多巴胺包覆金属有机骨架(MOFs)纳米复合材料，用于脂肪酶和葡萄糖氧化酶双酶分别在材料内部与表面的定位组装。
本发明相对于现有技术有如下优点及效果：
1)无需复杂的工艺，条件温和，操作简便，极大的保留了酶的功能特性。
2)利用MOFs生物矿化作用与多巴胺高效的生物粘附，实现对多酶的定位组装，相比于传统无规则固定化方式，分隔式的多酶定位分布提升了联级反应的催化效率。
附图说明
图1为实施例1制得多酶固定化材料的扫描电镜图片，放大20000倍。
图2为实施例1制得多酶固定化材料的透射电镜图片，放大4000倍。
图3为实施例1制得多酶固定化材料的激光共聚焦图(通过异硫氰酸荧光素染色内部脂肪酶)。
图4为实施例1制得多酶固定化材料的激光共聚焦图(通过异硫氰酸荧光素染色外层葡萄糖氧化酶)。
具体实施方式
以下结合具体实施例来对发明作进一步说明，但不限于此。本发明所用酶均购自sigma公司。
实施例1
(1)将30mg南极假丝酵母脂肪酶、2g 2-甲基咪唑以及100mg Zn(NO3)2·6H2O溶于1L蒸馏水。随后，在20℃下以200rpm的转速搅拌反应0.5h。所得悬浮液首先以3000rpm的转速、2min离心时间离心洗涤3次，然后将沉淀分散于100mL质量分数2.5％的十二烷基磺酸钠水溶液中，并在40℃下持续搅拌10min，搅拌速度为200rpm；最后用蒸馏水将产物过滤洗涤3次并冷冻干燥。
(2)取步骤(1)中的产物10mg、盐酸多巴胺5mg分散于10mL Tris-HCl缓冲液中(0.02mol/L,pH 7.5)。在20℃下，以200rpm持续搅拌1h。随后，将变色产物通过Tris-HCl缓冲液洗涤并以3000rpm的转速、2min离心时间离心洗涤3次。并再次分散于10mL溶有5mg葡萄糖氧化酶的Tris-HCl缓冲液中，在20℃下以200rpm的转速搅拌反应0.5h。最后用蒸馏水将产物过滤洗涤3次并冷冻干燥。得应用于联级催化反应的多酶固定化材料。图1为制得复合纳米颗粒的扫描电镜图片，放大20000倍。图2为制得复合纳米颗粒的透射电镜图片，放大4000倍，表面的覆盖的膜层结构即为多巴胺形成的共聚物。图3为制得多酶固定化材料的激光共聚焦图，通过异硫氰酸荧光素染色内部脂肪酶，可发现颗粒内部有荧光现象。图4为制得多酶固定化材料的激光共聚焦图，通过异硫氰酸荧光素染色外层葡萄糖氧化酶，可发现颗粒外层有荧光现象。
实施例2
(1)将200mg葡萄糖氧化酶、4g 2-甲基咪唑以及800mg Zn(NO3)2·6H2O溶于2L蒸馏水。随后，在30℃下以400rpm的转速搅拌反应2h。所得悬浮液首先以5000rpm的转速、5min离心时间离心洗涤5次，然后将沉淀分散于200mL质量分数5％的十二烷基磺酸钠水溶液中，并在60℃下持续搅拌20min，搅拌速度为500rpm；最后用蒸馏水将产物过滤洗涤5次并冷冻干燥。
(2)取步骤(1)中的产物50mg、盐酸多巴胺10mg分散于20mL Tris-HCl缓冲液中(0.05mol/L,pH 8.5)。在30℃下，以400rpm持续搅拌5h。随后，将变色产物通过Tris-HCl缓冲液洗涤并以5000rpm的转速、5min离心时间离心洗涤5次。并再次分散于20mL溶有10mg黑曲霉脂肪酶的Tris-HCl缓冲液中，在30℃下以500rpm的转速搅拌反应2h。最后用蒸馏水将产物过滤洗涤5次并冷冻干燥。得应用于联级催化反应的多酶固定化材料。
实施例3
(1)将30mg念珠菌脂肪酶、3g 2-甲基咪唑以及500mg Zn(NO3)2·6H2O溶于1.5L蒸馏水。随后，在25℃下以400rpm的转速搅拌反应1h。所得悬浮液首先以4000rpm的转速、3min离心时间离心洗涤4次，然后将沉淀分散于200mL质量分数5％的十二烷基磺酸钠水溶液中，并在45℃下持续搅拌15min，搅拌速度为400rpm；最后用蒸馏水将产物过滤洗涤4次并冷冻干燥。
(2)取步骤(1)中的产物20mg、盐酸多巴胺8mg分散于15mL Tris-HCl缓冲液中(0.03mol/L,pH 8)。在25℃下，以300rpm持续搅拌2h。随后，将变色产物通过Tris-HCl缓冲液洗涤并以4000rpm的转速、4min离心时间离心洗涤4次。并再次分散于15mL溶有8mg葡萄糖氧化酶的Tris-HCl缓冲液中，在25℃下以300rpm的转速搅拌反应1h。最后用蒸馏水将产物过滤洗涤4次并冷冻干燥。得应用于联级催化反应的多酶固定化材料。
无规则固定1
(1)将30mg南极假丝酵母脂肪酶、5mg葡萄糖氧化酶、2g 2-甲基咪唑以及100mg Zn(NO3)2·6H2O溶于1L蒸馏水。随后，在20℃下以200rpm的转速搅拌反应0.5h。所得悬浮液首先以3000rpm的转速、2min离心时间离心洗涤3次，然后将沉淀分散于100mL质量分数2.5％的十二烷基磺酸钠水溶液中，并在40℃下持续搅拌10min；搅拌速度为200rpm；最后用蒸馏水将产物过滤洗涤3次并冷冻干燥。
(2)取步骤(1)中的产物10mg、盐酸多巴胺5mg分散于10mLTris-HCl缓冲液中(0.02mol/L,pH 7.5)。在20℃下，以200rpm持续搅拌1h。随后，将变色产物通过Tris-HCl缓冲液洗涤并以3000rpm的转速、2min离心时间离心洗涤3次并冷冻干燥。得应用于联级催化反应的无规则固定化材料1。
无规则固定2
(1)将2g 2-甲基咪唑以及100mg Zn(NO3)2·6H2O溶于1L蒸馏水。随后，在20℃下以200rpm的转速搅拌反应0.5h。所得悬浮液首先以3000rpm的转速、2min离心时间离心洗涤3次，并冷冻干燥。
(2)取步骤(1)中的产物10mg、盐酸多巴胺5mg分散于10mL Tris-HCl缓冲液中(0.02mol/L,pH 7.5)。在20℃下，以200rpm持续搅拌1h。随后，将变色产物通过Tris-HCl缓冲液洗涤并以3000rpm的转速、2min离心时间离心洗涤3次。并再次分散于10mL溶有5mg葡萄糖氧化酶和30mg南极假丝酵母脂肪酶的Tris-HCl缓冲液中，在20℃下以200rpm的转速搅拌反应0.5h。最后用蒸馏水将产物过滤洗涤3次并冷冻干燥。得应用于联级催化反应的无规则固定化材料2。
单酶活力稳定性测定
葡萄糖氧化酶活测定方法。将60mg葡萄糖、20μg过氧化物酶和1.2mg ABTS溶于2mLPBS缓冲溶液(50mM,pH 7.0)。为启动氧化反应，向溶于中加入2μg自由态葡萄糖氧化酶和含有相同酶含量的实施例1,2,3制备的颗粒。采用分光光度计法，在420nm波长处，连续测定吸光度5min，计算酶活性。通过测定葡萄糖在25℃下的初始氧化速率来计算葡萄糖氧化酶活的活性。一个单位的葡萄糖氧化酶活性(U)被定义为1μmol葡萄糖在1min被氧化为葡萄糖酯所需要的酶量。葡萄糖氧化酶的比活(U/mg)由5min内的产物生成量决定。所有的反应都至少重复三次。
脂肪酶活测定方法。将6mmol乙酸对硝基苯酯溶于2mL PBS缓冲溶液(50mM,pH7.0)。为启动水解反应，向溶于中加入2μg自由态脂肪酶和含有相同酶含量实施例1,2,3制备的颗粒。采用分光光度计法，在410nm波长处，连续测定吸光度5min，计算酶活性。通过测定乙酸对硝基苯酯在25℃下的初始水解速率，确定脂肪酶的活性。一个单位的脂肪酶活性(U)被定义为1μmol乙酸对硝基苯酯在1min水解为对硝基苯酚所需要的酶量。脂肪酶的比活(U/mg)由5min内的产物生成量决定。所有的反应都至少重复三次。
未经处理酶的活性记为100％，分别将载酶颗粒通过5wt％H2O2接触1h，或37℃水溶液浸滞1h处理，得到活性与未经处理的活性比记为残留相对活性。
酶载碳酸钙(CaCO3)颗粒的合成方法。将Na2CO3(330mM)水溶液与等体积的含酶分子(脂肪酶或葡萄糖氧化酶，2mg/mL)的CaCl2(330mM)的水溶液快速混合。在室温下剧烈搅拌30s。然后在不搅拌的情况下使溶液老化15min。通过在水中以5000rpm离心2min来回收获得产物。
酶载二氧化硅(SiO2)颗粒的合成方法。将10mgSiO2颗粒(平均孔径50nm孔径)悬浮在含有0.5mL氨基丙基三乙氧基硅烷改性(APTES)的甲苯(5mL)中。在室温下搅拌12h后，APTES改性的SiO2颗粒通过乙醇和水连续离心洗涤3次，并最终分散在2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液(1mL，0.1M，pH 5)中。然后将脂肪酶或葡萄糖氧化酶(1mg)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC，1mg)引入二氧化硅颗粒悬浮液中，并在持续缓慢搅拌下温育2h，即可得到最终产物。
表1单酶活力稳定性测定结果
Figure BDA0002628730940000061
由表1可知，在5wt％H2O2溶液浸滞1h和37℃正常浸滞1h后，游离葡萄糖氧化酶和脂肪酶的活性降低90％左右。而当双酶分别固定在材料的表面或内部以后，不管是在37℃浸滞1h或者是与5wt％H2O2接触1h后，葡萄糖氧化酶和脂肪酶的活性均保留80％以上。同时，作为对比的酶载碳酸钙颗粒和酶载二氧化硅颗粒，酶活的保留率都低于70％，证明本发明方法固定化后的葡萄糖氧化酶和脂肪酶对温度和H2O2具有优异的耐受性。
联级催化效率测定
吡啶转化为吡啶氮氧化物的反应是一个典型的双相化学-酶催化反应。水相中葡萄糖氧化酶催化葡萄糖生成H2O2，脂肪酶在H2O2的存在下在界面上与油相中的乙酸乙酯发生生物催化反应，生成过氧酸；随后过氧酸作为中间产物与溶于油相的吡啶发生化学反应从而生吡啶氮氧化物。实验中，水相为1mL溶有200mg/mL葡萄糖的磷酸缓冲液(50mM,pH7.0)；有机相则由1mL溶有10μL/mL吡啶的乙酸乙酯构成。分别将含有相同酶量的实施例1，以及无规则固定1和2中制备的多酶固定材料加入到上述两相体系中，均质搅拌形成Pickering乳液，以启动界面生物催化。随后，反应在37℃并伴随缓慢搅拌(200rpm)下进行。每间隔20min，有机相通过4000rpm离心回收。产物吡啶氮氧化物通过1H NMR进行定量分析。
表2多酶固定化材料催化吡啶实验转化率结果
Figure BDA0002628730940000071
由表2可知，在催化吡啶实验中，实施例1、2、3的转化率要大大高于含有相同载酶量的无规则固定1与2的转化率。说明相对于传统对双酶的无规则固定化方式，通过对多酶的定位组装，能够提升联级反应的催化效率。

Claims (10)

1.一种多酶固定化材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将酶Ⅰ、2-甲基咪唑、Zn(NO3)2·6H2O分散于水中，并混合搅拌反应得到悬浮液；通过离心分离得到沉淀，并将沉淀分散于十二烷基磺酸钠水溶液中继续搅拌，随后用水将反应产物过滤洗涤，冷冻干燥；
2)将步骤1)中的产物分散于盐酸多巴胺的Tris-HCl缓冲液中；搅拌反应得变色产物，将变色产物通过Tris-HCl缓冲液洗涤，再次分散于溶有酶Ⅱ的Tris-HCl缓冲液中，搅拌反应；将反应终产物洗涤，冷冻干燥，得到颗粒内部与颗粒表层同时分布有不同酶分子的多酶固定化材料。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的酶Ⅰ为脂肪酶和葡萄糖氧化酶中的一种，酶Ⅱ为另一种。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述脂肪酶为米赫根毛霉脂肪酶、黑曲霉脂肪酶、南极假丝酵母脂肪酶、念珠菌脂肪酶中的一种或两种以上。
4.根据权利要求1或2或3所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述酶Ⅰ、2-甲基咪唑、Zn(NO3)2·6H2O与水的质量比为(0.03-0.2):(2-4):(0.1-0.8):(1000-2000)；沉淀物与十二烷基磺酸钠的质量比为(5-10):(100-200)。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述混合搅拌反应的速度是200-400rpm，反应时间为0.5-2h，反应温度为20-30℃；沉淀物与十二烷基磺酸钠的搅拌速度为200-500rpm，搅拌时间为10-20min，搅拌温度为40-60℃。
6.根据权利要求1或2或3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中的产物与盐酸多巴胺、Tris-HCl缓冲液的质量比为:(1-5):(0.5-1):(1000-2000)；酶Ⅱ与Tris-HCl缓冲液的质量比为:(0.5-1):(1000-2000)。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤2)第一次搅拌反应的搅拌速度为200-400rpm，搅拌时间为1-5h，搅拌温度为20-30℃；所述Tris-HCl缓冲液的浓度为0.02-0.05mol/L，pH值为7.5-8.5。
步骤2)第二次搅拌反应的时间为0.5-2h，反应温度为20-30℃，搅拌速度为200-500rpm。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述离心分离的转速为3000-5000rpm，时间为2-5min；过滤洗涤次数为3-5次；步骤2)变色产物洗涤的条件为：离心转速为3000-5000rpm，时间为2-5min，洗涤次数为3-5次；终产物洗涤的条件为：离心转速为3000-5000rpm，时间为2-5min，洗涤次数为3-5次。
9.权利要求1～8任意一项所述方法制得的多酶固定化材料。
10.权利要求9所述多酶固定化材料在酶催化制备吡啶氮氧化物中的应用。
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