CN116251624A - SOD人造酶的制备、提高Mn基仿酶SOD活性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种SOD人造酶的制备，以及一种提高Mn基仿酶SOD活性的方法，属于生物催化剂领域。本发明提供一种SOD人造酶的制备方法，所述制备方法为：先制得Mn‑BTC配位聚合物，然后将Ru或Ir团簇均匀负载在所述Mn‑BTC配位聚合物中，利用Ru或Ir团簇激活所述Mn‑BTC配位聚合物的SOD活性，从而制得一种SOD人造酶。本发明选择Mn为活性中心，先构造Mn‑BTC配位聚合物，然后使用Ru或Ir等过渡金属团簇掺杂Mn‑BTC配位聚合物制得了SOD人造酶，利用过渡金属团簇调控Mn‑BTC活性中心的电子结构，从而有效激活Mn‑BTC的SOD活性，制得了一种SOD人造酶。

Description

SOD人造酶的制备、提高Mn基仿酶SOD活性的方法
技术领域
本发明涉及一种SOD人造酶的制备，以及一种提高Mn基仿酶SOD活性的方法，属于生物催化剂领域。
背景技术
天然酶（特别是金属酶）中金属活性位点的配位几何结构是其体内催化动力学和热力学的基础。根据辅助因子的不同，天然SOD酶可分为四种类型：CuZn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD、Ni-SOD，其中，人线粒体锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD），其活性中心MnⅢ，在反坐轴方向，与一个溶剂分子（OH‾）和组氨酸（His 27）配位，在赤道平面，与两个组氨酸（His 75）和一个冬氨酸（Asp160）配位，构成一个五配位的三角双锥结构，催化•O2‾歧化转变为H2O2。
随着纳米技术与材料科学的不断发展，迄今为止，已发现约100种纳米酶具有类似SOD酶的活性，其中大部分是由过渡金属(如Fe、Co等)和碳、氮、氧、硫等元素组成。这其中，对机制研究较为深入和应用较为广泛的有二氧化铈纳米酶、碳材料和一些金属及金属氧化物材料。但是，纳米酶发挥SOD酶活性的催化机理尚不清楚，现有的SOD纳米酶活性也不高，目前尚未有能与天然SOD酶活性相媲美的纳米酶被开发出来，因此，开发能够提高SOD纳米酶活性的有效策略非常重要。研究发现，影响纳米酶SOD酶活性的因素有很多，包括纳米材料的物理和化学性质，如纳米材料的大小、形状、活性中心的数量和价态、包层和外部修饰以及不同的反应体系和环境等。
发明内容
针对上述缺陷，本发明选择Mn为活性中心，先构造Mn-BTC配位聚合物模拟天然Mn-SOD，然后使用Ru或Ir等过渡金属团簇掺杂制得了SOD人造酶M@Mn-BTC（Ru@Mn-BTC，Ir@Mn-BTC），利用过渡金属团簇调控Mn-BTC活性中心的电子结构，从而有效激活Mn-BTC的SOD活性，所得M@Mn-BTC可以进一步作为抗氧化仿酶材料用于纳米催化治疗脑缺血再灌注损伤。实验结果表明，Ru或Ir团簇的掺杂能够有效激活Mn-BTC中Mn的仿SOD酶活性，制得了一种SOD人造酶。
本发明的技术方案：
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种SOD人造酶的制备方法，所述制备方法为：先制得Mn-BTC配位聚合物，然后将Ru或Ir团簇均匀负载在所述Mn-BTC配位聚合物中，利用Ru或Ir团簇激活所述Mn-BTC配位聚合物的SOD活性，从而制得一种SOD人造酶。
进一步，所述制备方法中，通过离子交换法将Ru或Ir团簇均匀负载在所述Mn-BTC配位聚合物中。
更进一步，将Ru或Ir团簇均匀负载在所述Mn-BTC配位聚合物中的方法为：
将Mn-BTC于醇类溶剂中充分分散；然后加入钌盐，常温搅拌反应12～24h；反应结束后用醇类溶剂抽滤洗涤得产物；所得产物经干燥制得所述SOD人造酶；其中，所述Mn-BTC和钌盐的质量比为：40～50mg：10～5mg；或：
将Mn-BTC于醇类溶剂中充分分散；然后加入铱盐，于120～200℃（优选160℃）搅拌反应12～24h；反应结束后用醇类溶剂抽滤洗涤得产物；所得产物经干燥制得所述SOD人造酶；其中，所述Mn-BTC和铱盐的质量比为：40～50mg：10～5mg。
进一步，所述钌盐为：钌的氯化盐、醋酸盐或乙酰丙酮盐等。
进一步，所述铱盐为：铱的氯化盐、醋酸盐、乙酰丙酮盐或氯铱酸等。
进一步，所述Mn-BTC配位聚合物采用下述方法制得：将四水硝酸锰和均苯三甲酸分别于醇类溶剂中充分溶解；然后将两种溶液滴加、搅拌混匀；最后将所得混合液于120～200℃（优选160℃）反应12～24h（优选12 h）；冷却到室温后，用醇类溶剂抽滤洗涤除去未反应的硝酸锰和均苯三甲酸；所得产物经真空干燥制得的棕色粉末即为所述Mn-BTC配位聚合物；其中，四水硝酸锰和均苯三甲酸的质量比为：100～200 mg：45～90 mg。
进一步，所述醇类溶剂为乙醇或甲醇。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种提高Mn基仿酶SOD活性的方法，所述方法为：先制得Mn-BTC配位聚合物，然后使用Ru或Ir团簇掺杂所述Mn-BTC配位聚合物，利用Ru或Ir激活Mn-BTC配位聚合物中Mn的SOD活性，从而提高了Mn基仿酶的SOD活性。
本发明的有益效果：
本发明选择Mn为活性中心，先制备Mn-BTC配位聚合物，然后使用Ru或Ir等过渡金属团簇掺杂Mn-BTC配位聚合物制得了SOD人造酶M@Mn-BTC（Ru@Mn-BTC，Ir@Mn-BTC）；实验结果表明，Ru或Ir团簇的掺杂能够有效激活Mn-BTC中Mn的仿SOD酶活性，制得了一种SOD人造酶。所得M@Mn-BTC可以进一步作为抗氧化仿酶材料用于纳米催化治疗脑缺血再灌注损伤。
附图说明
图1: 实施例1所得Ru@Mn-BTC仿酶材料合成示意图。
图2: Mn-BTC、RuSA@Mn-BTC、Ru@Mn-BTC XRD图（a）和FT-IR图（b）。
图3: Mn-BTC（a）、RuSA@Mn-BTC（b）和Ru@Mn-BTC（c）的SEM图。
图4: Ru@Mn-BTC的HR-TEM（a-b）和AC-TEM（c-d）图。
图5: Ru@Mn-BTC不同标尺的EDS能谱图。
图6: Mn-BTC（a）、RuSA@Mn-BTC（b）和Ru@Mn-BTC（c）的XPS谱图。
图7: Mn-BTC（a）、RuSA@Mn-BTC（b）和Ru@Mn-BTC（c）的高分辨XPS C 1s谱图；Mn-BTC、RuSA@Mn-BTC、Ru@Mn-BTC的高分辨XPS O 1s（d）、Mn 2p（e）和Ru 3p（f）谱图。
图8:（a）不同材料催化H2O2产O2活性图；（b）不同材料（1）对照，（2）RuSA@Mn-BTC，（3）Mn-BTC，（4）Ru@Mn-BTC的SOD活性图；（c）Ru@Mn-BTC的CAT稳态动力学的Michaelis-Menten曲线和双倒数曲线图；（d）基于TON和V max对比各类仿酶纳米材料CAT活性图。
图9:（a）不同材料催化H2O2产O2活性图；（b）不同材料（1）对照，（2）Mn-BTC，（3）IrSA@Mn-BTC，（4）Ir@Mn-BTC的SOD活性，图中百分比表示对•O2‾的清除率；（c）基于TON 和V max对比各类仿酶纳米材料CAT活性图。
图10: 不同浓度Ru@Mn-BTC处理的PC12细胞存活率图。
图11: 在含H2O2的培养基中，（a）经不同条件处理后细胞内ROS的荧光显微镜图（标尺50 µm）；（b）经不同条件处理后PC12细胞中ROS水平的荧光强度图；（c）不同处理条件下不同荧光强度的细胞数量统计图。
图12: 在含X-XO的培养基中，（a）经不同条件处理后细胞内ROS的荧光显微镜图（标尺50 µm）；（b）经不同条件处理后PC12细胞中ROS水平的荧光强度图；（c）不同处理条件下不同荧光强度的细胞数量统计图。
图13: PC12细胞的流式细胞凋亡分析图。
图14: TTC染色的冠状脑载玻片代表性图。
图15: 梗死体积定量分析图。
实施方式
本发明开发了一种激活模拟天然SOD酶结构的Mn-BTC配位聚合物纳米材料活性的方法，通过掺杂过渡金属团簇到Mn-BTC上得到M@Mn-BTC（Ru@Mn-BTC，Ir@Mn-BTC），利用过渡金属团簇调控Mn-BTC活性中心的电子结构，从而有效激活Mn-BTC的SOD活性。
实验结果表明，由于Mn-BTC配位聚合物具有与天然SOD酶类似的配位环境，其本身具有一定的仿SOD活性，掺杂了Ru、Ir纳米团簇后，所制备的Ru@Mn-BTC/Ir@Mn-BTC展现出更高的仿SOD的活性，同时还兼具优异的仿CAT活性，证明Ru、Ir团簇的掺杂有效激活了Mn-BTC的仿SOD酶活性。另外，细胞实验结果表明， M@Mn-BTC具有优异的生物相容性（10～100 µg/mL），可以通过清除过量的ROS（H2O2和•O2‾）改善氧化应激引起的损伤，抑制细胞凋亡，达到较好的细胞保护效果。进而，构建大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型研究Ru@Mn-BTC对脑缺血再灌注损伤的治疗效果。通过抗氧化作用和抑制氧化应激引发的神经细胞凋亡，Ru@Mn-BTC可以显著保护MCAO大鼠，减少梗死体积；即所得M@Mn-BTC可以进一步作为抗氧化仿酶材料用于纳米催化治疗脑缺血再灌注损伤。
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实例范围之中。
实施例1 Ru@Mn-BTC人造酶的制备
Mn-BTC配位聚合物的制备：称取192 mg四水硝酸锰和87.5 mg均苯三甲酸分别于25 mL乙醇搅拌30 min中，使其充分溶解；随后，将两种溶液滴加混合，搅拌30 min；最后，所得混合液水热（160 ℃）反应12 h；待其冷却到室温后，用乙醇抽滤洗涤除去未反应的硝酸锰和均苯三甲酸。产物60 ℃真空干燥，获得棕色粉末Mn-BTC。
采用溶剂热法制备Ru@Mn-BTC人造酶：称取制得的Mn-BTC（50 mg）加入到含25 mL乙醇玻璃瓶中，搅拌30 min，使其充分分散；随后，吸取RuCl3 • H2O（10 mg/mL，0.5 mL）到上述混合体系中，常温搅拌过夜（约12 h）；反应结束后，用乙醇抽滤洗涤，所得产物于60 ℃真空干燥。
实施例2 Ir@Mn-BTC人造酶的制备
Ir@Mn-BTC仿酶材料制备：称取Mn-BTC（50 mg）加入到含40 mL乙醇水热釜内胆中，搅拌30 min，使其充分分散，之后加入0.5 mL的IrCI3·H2O (10 mg/mL)，160 ℃水热12 h，用乙醇抽滤洗涤，60 ℃真空干燥。
对比例1 RuSA@Mn-BTC单原子人造酶的制备
与实施例1相比，通过改变RuCl3•H2O添加比例，RuCl3•H2O的添加量为：10 mg/mL，0.1 mL；合成单原子单原子人造酶RuSA@Mn-BTC。
对比例2 IrSA@Mn-BTC单原子人造酶的制备
与实施例2相比，通过改变IrCl3•H2O的添加比例，IrCl3•H2O的添加量为：10 mg/mL，0.1 mL；合成单原子人造酶IrSA@Mn-BTC。
试验例1 Ru@Mn-BTC合成及结构表征
如图1所示，通过典型的溶剂热法制备以Mn为金属节点、1,3-均苯三甲酸（BTC）为有机配体联接桥的三维Mn-BTC配位聚合物；其中，每个Mn中心与来自两个螯合BTC配体的四个氧原子和来自两个桥接BTC配体的两个氧原子连接。采用离子交换的方法取代部分Mn原子，进一步合成Ru团簇掺杂Mn-BTC仿酶材料（Ru@Mn-BTC）。
实施例和对比例所合成的催化剂的结构主要通过XRD、FT-IR、SEM、HR-TEM、HAADF-STEM、XPS表征。
如图2所示，Mn-BTC掺杂Ru后，RuSA@Mn-BTC和Ru@Mn-BTC具有相似的XRD（图2a）和FT-IR（图2b）谱图，说明Ru掺杂对Mn-BTC结构没有显著的影响。其中在FT-IR图中，伸缩振动峰（1350～1700 cm-1）归属于Mn-BTC的COO-基团。
Mn-BTC及Ru@Mn-BTC仿酶材料的形貌及微观结构利用SEM、HR-TEM和HAADF-STEM进行分析。如图3a～c所示，Mn-BTC、RuSA@Mn-BTC和Ru@Mn-BTC的SEM图像显示平均粒径为300nm的均匀球状形貌。HR-TEM图像进一步表明，Ru@Mn-BTC呈现球状形貌，而且没有观察到明显的Ru颗粒（图4a，4b）。HAADF-STEM图（图4c）显示，原子分散的Ru原子和由大量无晶格的密集Ru原子组成的团簇均匀分散在Mn-BTC基材上；沿着图4c中线条箭头方向线扫描所得强度分布表明，Ru团簇的大小约为1.4 nm（图4d）。EDS Mapping谱图（图5）进一步表明，Ru@Mn-BTC中C、O、Mn、Ru元素分布均匀，且观察到由原子分散Ru形成的金属团簇。
然后，采用XPS分析Mn-BTC，RuSA@Mn-BTC和Ru@Mn-BTC化学成分和电子结构。如图6a～c和表1所示，RuSA@Mn-BTC和Ru@Mn-BTC的XPS谱图表明C、O、Mn、Ru元素共存。对比Mn-BTC的XPS谱图，Ru掺杂后，RuSA@Mn-BTC和Ru@Mn-BTC的全谱中可以明显观察到Ru 3p谱图，进一步证明Ru掺杂成功。XPS分谱进一步研究元素价态及电子结构。在高分辨C 1s谱图（图7a-c）中，主要包含三个特征峰，分别为C-C，C=C（284.8 eV）、C-O（286.2 eV）和C=O（288.3 eV）。此外，RuSA@Mn-BTC（图7b）和Ru@Mn-BTC（图7c）的C 1s谱图中，观察发现另一个归属于Ru 3d的特征峰（282.0 eV），这也表明Ru成功掺杂于Mn-BTC中。O 1s谱图（图7d）中，三个峰主要归属于Mn-O、C-O和C=O。与Mn-BTC相比，RuSA@Mn-BTC和Ru@Mn-BTC的O 1s谱峰向低结合能偏移约0.2 eV，说明具有Ru-O配位产生。Mn 2p谱图（图7e）显示两个特征峰归属于Mn 2p 3/2和Mn2p 1/2。其中，Ru@Mn-BTC中的Mn 2p结合能高于Mn-BTC，表明Mn与Ru之间存在较强的电子相互作用，Mn失去电子，Ru得到电子。而RuSA@Mn-BTC中的Mn 2p结合能低于Mn-BTC，表明Mn与Ru之间存在较强的电子相互作用，Mn得到电子，Ru失去电子。在Ru 3p谱图（图7f）中，RuSA@Mn-BTC的Ru 3p谱图中，462.9 eV和485.5 eV的Ru 3p峰归属于Ru3+3p 3/2和Ru3+3p 1/2，证实RuSA@Mn-BTC中Ru元素为氧化态而非金属态。而Ru@Mn-BTC的Ru 3p谱图中461.3 eV处特征峰归属于金属Ru，说明Ru团簇的产生。
表1. Mn-BTC、RuSA@Mn-BTC和Ru@Mn-BTC元素含量（XPS分析）
Figure SMS_1
试验例2 Ru@Mn-BTC和Ir@Mn-BTC的酶活性测试
1、测试方法：
1.1 H2O2仿酶催化测试
H2O2分解生成O2也被应用去模拟CAT酶的活性。 通过测定催化反应中消耗的H2O2含量或者通过催化反应过程中产生的O2来评判CAT活性。
O2产生：依次量取pH=7.4的PBS缓冲液（20 mL）、仿酶材料分散液（20 μL，10 mg/mL）于50 mL离心管中，然后插入溶氧仪电极，添加H2O2 （0.2 mL，10 M H2O2），立即开始测试（测试时间间隔：5 s，测试总时长：5 min）。
仿CAT催化稳态动力学：
通过改变H2O2的浓度研究Ru@Mn-BTC仿酶材料的催化H2O2产O2动力学。将不同体积的H2O2（10 M）和仿酶材料分散液（20 μL，10 mg/mL）混合于50 mL离心管中，用PBS缓冲液（pH=7.4）到20 mL，然后用溶氧仪进行测试（测试时间间隔：5 s，测试总时长：5 min）。
通过每一个H2O2浓度对应的时间-产氧量曲线计算初始反应速率（V 0 ）。
进一步，利用米氏（Michaelis–Menten）方程将催化反应速率（V 0 ）和不同底物（H2O2或TMB）浓度[S]进行拟合。米氏方程如下：
Figure SMS_2
其中：V 0代表初始反应速率；V max代表最大反应速率；K m代表米氏常数
接着，利用双倒数曲线（Lineweaver-Burk plot）进一步求得V max和K m，双倒数方程如下：
Figure SMS_3
最后，通过方程（3）计算仿酶材料催化活性TON。
Figure SMS_4
其中，TON代表单位催化活性中心对底物的最大转换数量；E0代表催化活性中心摩尔浓度。
1.2 SOD仿酶催化测试
黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶（X-XO）法：分别依次取1 mL PBS缓冲液（pH=7.4）、10 μL仿酶材料（10 mg/mL）和120 μL X-NaOH溶液（0.01 M）于2 mL 离心管中，XO预热后加取880 μLXO溶液（46 μL，0.5 U 的XO 分散于4.354 mL PBS，预热37℃）加入上述混合液中，于37℃反应20 min；然后立即加入20 μL NBT溶液（10 mg/mL），5 min后用酶标仪在550 nm处测定混合液吸光度。
2、测试结果：
如图8a所示，与Mn-BTC和RuSA@Mn-BTC相比，Ru@Mn-BTC表现了最高的H2O2清除活性（图8a），产氧实验证实了Ru@Mn-BTC能够快速催化H2O2转变为O2。如图8c所示，基于典型的Michaelis-Menten曲线和双倒数曲线，我们计算了Ru@Mn-BTC的产氧动力学参数（V max=34.5µM/s、K m=393 mM和TON=5.33 s-1），与近期报道的部分生物催化剂相比，Ru@Mn-BTC的仿CAT活性远高于目前报道的大部分生物催化剂（图8d）。
在生理环境中，SOD催化•O2 -转变为H2O2，这在生物体中具有非常重要的作用。因此，本发明采用•O2‾清除实验（X-XO法）评估Ru@Mn-BTC的SOD活性。XO可以利用O2分子作为电子受体催化氧化X生成•O2‾活性氧，原位产生的•O2‾进一步与还原性的NBT发生显色反应生成蓝色的甲臜（特征吸收峰：λ=550 nm）。如图8b所示，相比于空白对照组（未添加任何催化剂），相比Mn-BTC和RuSA@Mn-BTC，Ru@Mn-BTC在550 nm处的吸光度最小，表明Ru@Mn-BTC展现最优异的SOD仿酶活性，Ru纳米团簇的掺杂有效激活了模拟天然SOD酶结构的Mn-BTC的仿SOD活性。
如图9a所示，与Mn-BTC和IrSA@Mn-BTC相比，Ir@Mn-BTC表现了最高的H2O2清除活性，产氧实验证实了Ir@Mn-BTC能够快速催化H2O2转变为O2。如图9b所示，相比于空白对照组，Ir@Mn-BTC在550 nm处的吸光度相比Mn-BTC、IrSA@Mn-BTC最小，表明Ir@Mn-BTC展现最优异的SOD仿酶活性，Ir纳米团簇的掺杂也有效激活了模拟天然SOD酶结构的Mn-BTC的仿SOD活性。此外还计算了产氧动力学参数，与近期报道的部分生物催化剂相比，Ir@Mn-BTC的仿CAT活性远高于目前报道的大部分生物催化剂（图9c）。
试验例3 Ru@Mn-BTC的生物相容性
进一步，本发明还分析了人造酶在细胞微环境和炎症组织中抗氧化应激的抗氧化活性。大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤PC12细胞系具有神经内分泌细胞的一般特征，广泛应用于神经生理学和神经药理学的研究。因此，本发明以ROS氧化损伤的PC12细胞作为脑缺血再灌注损伤缺血性损伤的细胞模型，研究了Ru@Mn-BTC对PC12细胞抗 H2O2和•O2‾诱导的氧化损伤的保护作用。
1、测试方法：
采用CCK8法对Ru@Mn-BTC的体外细胞毒性进行评价。首先，将PC12细胞接种于96孔板中，每个孔板计算为：100*104个/mL，于100 μL新鲜完全培养基中孵化24 h。随后，分别在各孔板中添加不同浓度的Ru@Mn-BTC（0、10、20、40、60、80、100 μg/mL），孵化4～6 h后，加入100 μL配置好的CCK-8检测液，继续于37 ℃避光条件下孵育0.5～1 h。最后测定450nm吸光度（OD），计算细胞存活率。
2、测试结果：
如图10所示，Ru@Mn-BTC在工作浓度（10～100 µg/mL）范围内没有明显的细胞毒性。
试验例4 Ru@Mn-BTC的细胞水平ROS清除活性
1、测试方法：
X-XO模型：首先，将接种密度为25 × 104 个/mL的PC12细胞置于12孔板中孵育17h。随后，10 mg Ru@Mn-BTC 分散于1 mL PBS（pH=7.4）溶液中制备成原液，取5 μL加入到1mL 1640完全培养基中，并加入对应的孔板中（对照和X-XO组不添加），孵育3 h。接着，吸出孔板中的培养基，分别向各孔板中加1mL DCFH-DA工作液（6 μL添加到12 mL无血清培养基中），避光37 ℃孵育20 min。最后，吸出DCFH-DA工作液，PBS洗涤两次。取1 mL X-XO 工作液（9 mL 完全培养基，360 µL X溶液与2.64 mL预热的XO均匀混合）加入相应孔中（对照组不加），避光条件刺激20 min。PBS洗涤，荧光显微镜观察。
H2O2模型：除了刺激过程中X-XO变为H2O2外，其余类似于X-XO模型。
2、测试结果：
如图11所示，在H2O2环境中，H2O2组可以观察到较多绿色荧光信号；同时与对照组相比，H2O2诱导的PC12细胞内ROS可在Ru@Mn-BTC处理后有效清除（荧光信号减弱），而纯的Mn-BTC对ROS没有明显的清除活性（图11a）。同时，我们还利用荧光成像技术检测了经Ru@Mn-BTC处理后H2O2损伤的PC12细胞中ROS水平的荧光强度。定量分析（图11b，11c）结果显示，Ru@Mn-BTC组的ROS含量最低，表明其可以通过清除细胞内和线粒体中ROS，有效应对细胞的氧化应激。
同理，在X-XO环境下（图12a），X和XO相互作用可以显著促进PC12细胞内ROS（•O2‾）产生（即20 min产生140% •O2‾）。然而，与Mn-BTC或Ru@Mn-BTC共孵育后，X-XO处理的PC12细胞中•O2‾的含量显著减少。且定量分析（图12b，12c）结果也表明，Mn-BTC或Ru@Mn-BTC在细胞模型中具有有效的•O2‾清除作用，其中Ru@Mn-BTC清除•O2‾效果最明显，进一步证明了Ru团簇的掺杂有效激活了Mn-BTC的仿SOD酶活性。
可见，与体外ROS清除活性类似，Ru@Mn-BTC在细胞内也具有较好的ROS清除活性。
然后，本发明进一步采用流式细胞仪检测H2O2或X-XO作用下PC12细胞凋亡情况。如图13所示，Ru@Mn-BTC可以略微降低H2O2或X-XO诱导的PC12细胞凋亡。可见，由于Ru@Mn-BTC具有强的ROS清除活性，进而赋予保护PC12细胞免受X-XO诱导的氧化损伤效果。
试验例5 Ru@Mn-BTC的活体脑缺血再灌注损伤治疗
1、测试方法：
通过构建MCAO模型诱发缺血性卒中和缺血/再灌注。MCAO模型制备结束后，静置24小时，对随机选取的3只大鼠腹腔注射10%水合氯醛使其麻醉，并断头处死，对提取的组织进行TTC染色。具体步骤如下：
（1）用止血钳小心剥去颅骨，0.9%生理盐水冲洗脑组织至表面无明显血迹，然后放入冰冻的培养皿表面，-20℃快速冷冻20 min；（2）准备12孔板，每个孔加入2 mL TTC染料，锡箔纸包裹避光；（3）将冷冻完毕的脑取出，按照从额部至枕部的顺序均匀做冠状切片，每片厚度2 mm左右；（4）将切好的脑片小心移到相应的孔中，放入37℃孵箱染色20 min，每5min翻面以确保染色均匀；（5）拿出后用生理盐水洗净后即可拍照记录，并通过ImageJ软件分析大鼠脑缺血再灌注损伤的梗死面积占整个脑组织体积的百分比。
2、测试结果：
为了进一步证实Ru@Mn-BTC在体内的治疗作用，采用MCAO模型建立大鼠脑缺血损伤模型。2，3-氯化三苯基四氮唑是脂溶性光敏感复合物，它是呼吸链中吡啶-核苷结构酶系统的质子受体，能与正常组织中的脱氢酶反应而呈红色。正常脑组织中的脱氢酶可以将TTC还原成不溶性的红色稳定的三苯基甲瓉，如果脑组织细胞死亡或活力衰退，则不能染色或染色较浅。24h后，取大鼠脑切片，用TTC染色。MCAO模型中，大鼠中风后，给其注射生理盐水不同仿酶材料。结果表明（图14和图15），与注射生理盐水相比，Ru@Mn-BTC处理的大鼠对缺血性损伤的易损性较低，脑梗死体积较小。
综上可知，本发明先构建了一种Mn基配位聚合物Mn-BTC，其中Mn活性位点可以模仿天然Mn-SOD金属位点配位环境从而具有一定的SOD活性；并通过Ru、Ir纳米团簇的掺杂调控Mn-BTC活性中心的电子结构，激活Mn-BTC的SOD活性，促使Ru@Mn-BTC表现出更高的仿SOD活性；即本发明首次指出了Ru或Ir团簇对Mn-BTC配位聚合物的掺杂能够提高Mn-BTC的SOD活性，开发了一种能够激活Mn-BTC配位聚合物的有效策略，并且所得人造酶同时展现出优异的CAT活性。细胞实验和动物实验结果表明，Ru@Mn-BTC和Ir@Mn-BTC具有优异的生物相容性，可以通过清除过量的H2O2和•O2‾，改善氧化应激环境，抑制细胞凋亡，达到高效治疗脑缺血再灌注损伤的效果。

Claims (8)

1.一种SOD人造酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：先制得Mn-BTC配位聚合物，然后将Ru或Ir团簇均匀负载在所述Mn-BTC配位聚合物中，利用Ru或Ir团簇激活所述Mn-BTC配位聚合物的SOD活性，从而制得一种SOD人造酶。
2.根据权利要求1所述的一种SOD人造酶的制备方法，其特征在于，通过离子交换法将Ru或Ir团簇均匀负载在所述Mn-BTC配位聚合物中。
3.根据权利要求2所述的一种SOD人造酶的制备方法，其特征在于，将Ru或Ir团簇均匀负载在所述Mn-BTC配位聚合物中的方法为：
将Mn-BTC于醇类溶剂中充分分散；然后加入钌盐，常温搅拌反应12～24h；反应结束后用醇类溶剂抽滤洗涤得产物；所得产物经干燥制得所述SOD人造酶；其中，所述Mn-BTC和钌盐的质量比为：40～50mg：10～5mg；或：
将Mn-BTC于醇类溶剂中充分分散；然后加入铱盐，于120～200℃搅拌反应12～24h；反应结束后用醇类溶剂抽滤洗涤得产物；所得产物经干燥制得所述SOD人造酶；其中，所述Mn-BTC和铱盐的质量比为：40～50mg：10～5mg。
4.根据权利要求3所述的一种SOD人造酶的制备方法，其特征在于，所述钌盐为：钌的氯化盐、醋酸盐或乙酰丙酮盐。
5.根据权利要求3所述的一种SOD人造酶的制备方法，其特征在于，所述铱盐为：铱的氯化盐、醋酸盐、乙酰丙酮盐或氯铱酸。
6.根据权利要求1～5任一项所述的一种SOD人造酶的制备方法，其特征在于，所述Mn-BTC配位聚合物采用下述方法制得：将四水硝酸锰和均苯三甲酸分别于醇类溶剂中充分溶解；然后将两种溶液滴加、搅拌混匀；最后将所得混合液于120～200℃反应12～24h；冷却到室温后，用醇类溶剂抽滤洗涤除去未反应的硝酸锰和均苯三甲酸；所得产物经真空干燥制得的棕色粉末即为所述Mn-BTC配位聚合物；其中，四水硝酸锰和均苯三甲酸的质量比为：100～200 mg：45～90 mg。
7.根据权利要求6所述的一种SOD人造酶的制备方法，其特征在于，所述醇类溶剂为乙醇或甲醇。
8.一种提高Mn基仿酶SOD的方法，其特征在于，所述方法为：先制得Mn-BTC配位聚合物，然后使用Ru或Ir团簇掺杂所述Mn-BTC配位聚合物，利用Ru或Ir激活Mn-BTC配位聚合物中Mn的SOD活性，从而提高了Mn基仿酶的SOD活性。
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