CN115945220A - 一种Ir金属基生物催化剂及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种Ir金属基生物催化剂及其制备方法和用途，属于生物催化材料领域。本发明通过采用卟啉或其衍生物（如5,10,15,20‑4吡啶基卟啉（TPyP））和铱盐（如三氯化铱（IrCl3））进行配位并进一步通过水热法，合成Ir金属团簇通过Ir‑N键连接卟啉形成的配位聚合物（TPyP‑Ir）生物催化剂。所得生物催化剂具有优异的POD、OXD和酸性条件下的CAT活性，经过超声照射可明显促进催化剂的卟啉基催化生成单线态氧，其具有协同抗肿瘤作用，可以用于化动力和声动力联合治疗卵巢癌的生物催化剂。
Description
技术领域
本发明涉及一种Ir金属基生物催化剂及其制备方法和用途，属于生物催化材料领域。
背景技术
卵巢癌（ovarian cancer）被认为是最具侵袭性的妇科肿瘤，以上皮性卵巢（Epithelial ovarian cancer，EOC）癌为主。虽然卵巢癌发病率次于宫颈癌和子宫内膜癌，但死亡率却高居妇科肿瘤首位，因此被称为“沉默的杀手”。我国女性卵巢癌新发病例为52100例/年，死亡病例达22500例/年。全球范围内卵巢癌新发病例和死亡病例人数逐年上升，2020年新发病例超过31万例，新增死亡人数接近21万。由于解剖位置深在，早期多无明显临床症状，超过80%以上的患者发现时已为中晚期。手术治疗联合以铂类药物为基础的化疗目前仍是卵巢癌最主要的治疗手段。但临床数据显示，理想的肿瘤细胞减灭术大约只有10%~20%（CA: A Cancer Journal for Clinicians），而化疗药物杀死癌细胞的同时也会导致不同程度的副作用，如骨髓抑制、消化道反应等。同时，由于肿瘤复发和化疗耐药的影响，晚期卵巢癌患者整体预后不佳，5年生存率不到30%（随着肿瘤疾病研究的不断深入，许多创新和高效的治疗方式也被不断提出和尝试）。
另外一方面，卵巢癌化疗的一线方案主要包括铂类药物（顺铂、卡铂）在内的联合化疗。该方案的缺点：顺铂是主要作用于G2/M期的细胞周期非特异性药物，并存在许多副反应（肾脏毒性、神经毒性、骨髓抑制、恶心呕吐）；对铂类药物过敏及耐药患者比例不断增加；高复发率（卵巢癌细胞大部分仍处于休眠阶段，并逃避抑制这些药物的作用。肿瘤复发是在药物的细胞毒性作用消退后，由非增殖细胞引起。G0细胞对化疗不敏感，往往成为日后癌症复发的根源）。
声动力治疗（Sonodynamic therapy，SDT）作为新兴的无创治疗手段而备受关注。1989年，Yumita等人基于光动力疗法（photodynamic therapy,PDT）提出了SDT。目前，声动力（SDT）已经被作为治疗局部肿瘤的潜在临床方法，即利用超声激发产生更高的活性氧（ROS），如单线态氧、羟基自由基等。通过对时间和空间管理，ROS可以精确地在肿瘤组织中产生，从而最大限度地减少副作用。要实现声动力效果，声敏剂是必不可少的。卟啉及其衍生物是最常见的被广泛应用的有机和生物相容性的声敏剂。另一方面，利用肿瘤微环境(TME)的酸性和过氧化氢(H2O2)过表达这两种独特特征，纳米材料催化的化学动力学治疗(CDT)已成为一种新的、有前景的基于ROS的治疗模式。
发明内容
针对上述缺陷，本发明通过采用卟啉或其衍生物（如5,10,15,20-4吡啶基卟啉（TPyP））和铱盐（如三氯化铱（IrCl3））进行配位并进一步通过水热法，合成Ir金属团簇通过Ir-N键连接卟啉形成的配位聚合物（TPyP-Ir）生物催化剂。所得生物催化剂具有优异的POD、OXD和酸性条件下的CAT活性，经过超声照射可明显促进催化剂的卟啉基催化生成单线态氧，其具有协同抗肿瘤作用，可以用于化动力和声动力联合治疗卵巢癌的生物催化剂。
本发明的技术方案：
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种Ir金属基生物催化剂，所述催化剂为Ir金属团簇通过Ir-N键连接卟啉形成的配位聚合物。
进一步，所述配位聚合物为非晶结构，同时所述Ir金属团簇为纳米级晶体结构。
进一步，所述Ir金属基生物催化剂具有POD、OXD和酸性条件下的CAT活性。所述酸性条件下的CAT活性是指可在酸性条件下产氧，从而缓解肿瘤微环境乏氧情况。
进一步，所述Ir金属基生物催化剂为块状材料。
本发明要解决的第二个技术问题是提供上述Ir金属基生物催化剂的制备方法，所述制备方法为：将卟啉或其衍生物与铱盐的共混溶液经水热法制得所述生物催化剂。
进一步，所述卟啉选自：具有吡啶基的卟啉，更进一步的，所述卟啉为5,10,15,20-4吡啶基卟啉、四-(2-吡啶基)卟啉、5,15-二(4-吡啶基)-10,20-二苯基卟啉中的至少一种。
进一步，所述铱盐为IrCl3。
进一步，所述卟啉和铱盐的摩尔比为1 :0.5~ 4；摩尔比优选为1:2。
进一步，所述卟啉与铱盐的共混溶液采用下述方法制得：将卟啉或其衍生物、高分子表面活性剂和酸充分溶解后形成溶液A；将铱盐溶解于去离子水中，得到溶液B；随后，在剧烈搅拌下，将溶液B加入溶液A中，搅拌得共混溶液。
其中，剧烈搅拌是为了使溶液A和B充分混合。
进一步，所述水热法的条件为：在80 ~ 200℃下反应6 ~ 15h；
更进一步，所述Ir金属基生物催化剂的制备方法为：先将卟啉或其衍生物和稳定调节剂溶解于酸中，超声溶解20 ~ 60min后搅拌混匀得到溶液A；再将金属盐溶解在去离子水中得到溶液B；剧烈搅拌下，将溶液B缓慢加入到溶液A中，搅拌20 ~ 60min后，在80~200℃下反应6~15h；最后经洗涤、离心、烘干、研磨，得到金属卟啉配位聚合物。
进一步，作为优选方案，超声溶解时间为30min，搅拌时间为30min，180℃下反应12h。
进一步，所述高分子表面活性剂为聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。
进一步，所述金属盐为：三氯化铱水合物。
进一步，所述酸为盐酸，作为优选方案，所述盐酸的浓度为0.01M。
进一步，所述离心采用去离子水离心洗涤至少三次，离心转速为7000~10000rpm(优选为8000rpm)，每次离心时间为8~15min(优选为10min)。
进一步，所述烘干指在40~60℃(优选为60℃)，干燥至少24h。
本发明要解决的第三个技术问题是提供所述Ir金属基生物催化剂在制备具有抗氧化功能的生物材料中的用途。
进一步的，本发明公开了所述Ir金属基生物催化剂用于制备肿瘤治疗药物或抗氧化药物中的用途。进一步，本发明催化剂与SDT联合作用能够达到良好的协同处理效果，能够实现有效杀伤肿瘤细胞并有效激活体内免疫的治疗目的。
本发明要解决的第四个技术问题是提供了一种增强所述Ir金属基生物催化剂活性的方法。
进一步，所述增强活性的方法在于利用超声照射处理，所述超声照射条件为功率0.5 ~2.5 W/cm2，频率0.8~ 1.5 MHz，占空比20 ~40%，时间30 s~120 s；超声条件优选为：功率0.8 W/cm2，频率1 MHz，占空比30%，时间60 s。
本发明有益效果：
1、本发明Ir金属基生物催化剂具有POD、OXD活性；且本发明Ir金属基生物催化剂具有超高的POD活性，同等条件下，TPyP-Ir的POD活性远远优于其他金属卟啉配位聚合物，如TPyP-Pd、TPyP-Pt、TPyP-Rh和TPyP-Ru。
2、本发明Ir金属基生物催化剂具有在酸性条件下的CAT活性，即可在酸性条件下产氧，缓解肿瘤微环境乏氧情况。
3、本发明Ir金属基生物催化剂具有优异的产氧性能，其在超声作用下产生1O2，产生的活性氧可以对肿瘤细胞具有直接的杀伤作用。
4、本发明Ir金属基生物催化剂为声敏剂，在超声照射作用下，可明显促进卟啉基声敏剂催化生成单线态氧，具有协同抗肿瘤作用，可大幅提升对肿瘤的抑制和清除作用。
5、本发明Ir金属基生物催化剂利用卟啉的共轭有机结构将CDT和SDT集成在一个纳米平台的材料上，能够达到良好的协同处理效果，实现有效杀伤肿瘤细胞并有效激活体内免疫的治疗目的。声动力可以诱导肿瘤细胞免疫原性细胞死亡，即在细胞死亡的同时，细胞表面能诱导具有免疫原性的蛋白分子在细胞表面表达，随后激发机体抗肿瘤免疫反应并诱导细胞毒性T细胞（CTL），产生强大的抗肿瘤免疫反应并可以引起长期的免疫应答，更有效地杀伤肿瘤细胞，从而达到更理想的抗肿瘤作用。
6、本发明Ir金属基生物催化剂利用一锅法自组装形成，方法简单便捷。
附图说明
图1为TPyP-Ir的合成示意图。
图2a为TPyP-Ir的SEM图，图2b为TPyP-Ir的HAADF-STEM图，图2c 为TPyP-Ir中Ir纳米团簇的粒径统计图，图2d为对应的EDX元素映射图，图2e为选区电子衍射图，图2f为TPyP-Ir的AC HAADF-STEM图，图2g为f中Ir纳米团簇的Ir原子强度分布图。
图3a为TPyP-Ir的FT-IR谱图，图3b为TPyP-Ir的局部放大FT-IR谱图。
图4为TPyP-Ir的XRD谱图。
图5a为TPyP-Ir的XPS光谱图，图5b为TPyP-Ir的Ir 4f谱图，图5c为TPyP-Ir的N 1s谱图。
图6a为TPyP-Ir与对照样Ir箔和IrO2的Ir L3边XANES光谱图，图6b为TPyP-Ir中Ir的平均价态图，图6c为TPyP-Ir和Ir箔、IrO2的EXAFS光谱的傅里叶变换图。
图7a为Ir箔的Ir L3边EXAFS的小波变换图，图7b为IrO2的Ir L3边EXAFS的小波变换图，图7c为TPyP-Ir的Ir L3边EXAFS的小波变换图。
图8a为TPyP和TPyP-Ir在H2O2存在下孵育TMB溶液后的紫外-可见光谱图，图8b为TPyP和TPyP-Ir在652 nm处对应的峰值强度图，其中，最终浓度: NaOAc−HOAc缓冲液(100mM, pH 4.5)，材料(0.025 mg·mL-1)， H2O2(12.5 mM)， TMB (0.024 mg·mL-1)，图8c为TPyP和TPyP-Ir与TMB溶液共同孵育后的紫外-可见光谱图，图8d为TPyP和TPyP-Ir在652 nm处对应的峰值强度图。
图9a为不同浓度H2O2下，TPyP-Ir在652 nm处的紫外吸收峰值随时间变化图，图9b为以H2O2为底物TPyP-Ir的Lineweaver–Burk图，图9c为 TPyP-Ir的Vmax和TON值与最近报道的其他催化剂的比较图。
图10为 TPyP-Ir催化氧化TMB过程中的自由基猝灭试验图。
图11为 DPA探针检测1O2图，图11a为 超声刺激催化氧化DPA图:表明TPyP-Ir在US(1.0 MHz, 2 W cm-2)下产生1O2，图11b为DPA探针检测TPyP-Ir在378 nm处对应的峰值强度图，图11c为在US(1.0 MHz，2 W cm-2)下，用HE探针测定催化剂的荧光强度随时间变化程度图，图11d为HE探针检测TPyP-Ir在610 nm处对应的峰值强度图。
图12a为pH 4.5条件下，TPyP-Ir在不同H2O2浓度下的产氧特性图，图12b和图12c为以H2O2为底物的TPyP-Ir的Michaelis-Menten动力学分析图和Lineweaver-Burk图，图12d和12e为以H2O2为底物的TPyP-Ir在超声(1.0 MHz, 2 W cm-2)下的Michaelis-Menten动力学分析图和Lineweaver-Burk图，图12f为在超声(1.0 MHz，2 W cm-2)作用下，以H2O2为底物的TPyP-Ir的Vmax和TON对比图。
图13为POD活性测试图。
图14为体外生物安全性检测图，图14A为荧光显微镜图，其中显示TPyP-Ir与HUVECs共孵育24 h后，不同浓度组别细胞显示为被标记为绿色荧光的活细胞较多，被标记为红色荧光的死细胞较少（标尺：50 μm），图14B细胞存活率定量统计图, 图14C为红细胞血液相容性图，其中：SPSS为阴性对照组，纯水为阳性对照组，图14D为酶标仪545 nm处血溶血率统计分析图，表明各组别溶血率均小于5%。
图15为荧光显微镜图。
图16为活细胞和死细胞进行计数后进行统计分析图。
图17为Annexin V/PI细胞凋亡检测流式分析图。
图18 为DCF荧光强度的半定量分析图。
图19为CRT及HMGB-1免疫荧光结果分析图，图19A为激光共聚焦观察不同组别细胞表面CRT荧光信号表达的强弱图（标尺：20 μm），图19B为用Image J对细胞表面CRT荧光强度进行定量后统计分析图，图19C为激光共聚焦观察不同实验组细胞核内HMGB-1荧光信号强弱图（标尺：20 μm），图19D为用Image J对细胞核内HMGB-1荧光强度进行定量后统计分析图。
图20A为显微镜下观察各组别Tranwell小室中RAW 264.7发生迁移的数量图（标尺：200 μm），图20B为用Image J对迁移的细胞进行计数后统计分析图，图20C为流式细胞术检测各实验组巨噬细胞CD86、iNOS、CD163标记物表达情况图，图20D为CD86+巨噬细胞/CD163+巨噬细胞比值统计分析图，图20E为iNOS+巨噬细胞/CD163+巨噬细胞比值统计分析图。
图21为 TPyP-Ir 与SDT联合作用体内抗肿瘤免疫效果图，图21A为治疗结束后各实验组小鼠移植瘤解剖图，图21B为接种及治疗后小鼠体重图，图21C为治疗结束后各实验组小鼠移植瘤质量图。
图22为肿瘤切片H&E染色、Ki67染色、Tunel染色和CRT染色图。
图23为小鼠心、肝、脾、肺、肾等主要正常器官的H&E染色图。
图24为肿瘤凋亡和细胞增殖水平图， 图24A为Ki-67染色图，图24B为Tunel染色图，图24C为CRT荧光强度定量分析图。
图25a为淋巴结DC细胞成熟度流式直观图，图25b为淋巴结DC细胞成熟度统计学分析图。
图26脾脏T淋巴细胞流式分析，图26A为CD3+CD4+TT细胞以及CD3+CD8+细胞流式直观图，图26B为CD3+CD4+T细胞统计学分析图, 图26C为CD3+CD8+T细胞统计学分析图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实例范围之中。
本发明实施例中所用原料与试剂见表1。
表1原料及其纯度、生产厂家信息表
上述所有原料购买后未做其他处理。除非另行说明，其他未提到的药品均来自于中国阿拉丁试剂公司；本章所使用的溶剂均来自于成都科龙试剂公司。此外，本章所用的去离子水均为成都优普生物科技公司所产的超纯水机自制。
实验主要仪器见表2。
表2 实验仪器及其型号、厂家信息表
实施例1 TPyP-Ir的合成
首先，将5,10,15,20-4吡啶基卟啉（TPyP）（0.06 g, 0.096 mmol）和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）（M.W. 10000, 30 mg）一起搅拌溶解在30 ml 0.01 M的稀盐酸中，超声溶解30 min后搅拌过夜形成溶液A。将IrCl3（60 mg, 0.192 mmol）溶解在30 ml去离子水中得到溶液B。随后，在剧烈搅拌下，将溶液B缓慢加入到溶液A中，搅拌30 min后，将混合溶液加入到100ml水热釜中，在180℃下反应12 h。得到的悬浮液用去离子水在8000 r下离心洗涤三次，然后在60 ℃烘箱中干燥过夜，得到的褐色产物研磨成粉末，然后密封保存，即为TPyP-Ir。
对比例1~4
采用上述实施例中的方法，改变金属盐及其用量，制备得到TPyP-Pd（对比例1）、TPyP-Pt（对比例2）、 TPyP-Rh（对比例3）、TPyP-Ru（对比例4），以及设置空白对照TPyP（control组）。
试验例1 材料形貌和结构表征
在水热条件下，TPyP与Ir前驱体（IrCl3）合成了Ir纳米团簇负载的卟啉基无定型配位聚合物（图1）。可以在扫描电子显微镜（SEM）中观察到TPyP-Ir的结构为块状结构(图2a)。利用透射电镜（TEM）、高角度环形暗场扫描透射电子显微镜（HAADF-STEM）和能量色散x射线光谱（EDX）元素映射进一步观察了TPyP-Ir的形态(图2b和图2d)。从STEM图以可以发现，Ir纳米团簇均匀分布在卟啉基配位聚合物中，其平均直径为1.76 nm，尺寸分布较窄，图2c为TPyP-Ir中Ir纳米团簇的粒径统计图，HAADF-STEM图像(图2b)中也可以看到Ir纳米团簇的聚集亮点。同时， EDX元素映射(图2d)显示了TPyP-Ir中Ir以聚集的形式在空间均匀分布，并且，C、N、Ir元素也呈现均匀分布的特点。此外，选区电子衍射（SAED）图(图2e)表明了TPyP-Ir的非晶结构（图2e）。球差校正的高角度环形暗场扫描透射电子显微镜（AC HAADF-STEM）图像(图2f)结合傅里叶变换（FFT），清楚地显示了Ir纳米团簇的纳米级晶体结构。在0.116、0.136、0.212和0.194 nm处测量了Ir的（311）、（220）、（111）和（200）晶面间距（图2g）。
利用红外光谱研究了TPyP-Ir的化学结构，如图3a的TPyP-Ir的FT-IR谱图，图3b的TPyP-Ir的局部放大FT-IR谱图所示，根据TPyP 的傅里叶变换红外光谱，3315 cm-1为TPyP卟啉环上的N-H伸缩振动吸收峰，1593 cm-1是卟啉环骨架的振动吸收峰，1466 cm-1为吡啶环骨架的振动吸收峰，1351 cm-1是吡咯环上C=N伸缩振动吸收峰；971 cm-1和799 cm-1分别是卟啉和吡啶环的C-H弯曲振动吸收峰。如图3a中，TPyP-Ir在3315 cm-1处的峰消失和1290cm-1处新的峰形成，说明TPyP中卟啉环上的N-H消失，M-C形成，Ir成功在卟啉环中配位。广谱XRD谱图显示了TPyP-Ir的非晶结构，同时证明了Ir纳米团簇具有FCC结构，峰值为40.7°，与（111）晶面相匹配（图4）。
为了阐明TPyP-Ir的电子结构，我们对其进行了x射线吸收光谱（XAS）和x射线光电子能谱（XPS）测量。XPS证明TPyP-Ir样品中存在C、N和Ir元素，其中Ir原子含量为2.76%（图5a）。根据窄扫XPS光谱进一步分析了Ir的价态，谱图证明Ir主要以0价Ir（60.88 eV）和4价Ir（61.87 eV）的形式存在，这与Ir团簇和Ir的配位状态相符合（图5b）。在高分辨的N 1s光谱中，TPyP-Ir的N峰均向高结合能方向移动，说明Ir与卟啉N的成功配位（图5c）。
XAS进一步分析了材料的精细结构。如图6a所示，Ir的L3-edge x射线吸收近边结构（XANES）曲线显示，TPyP-Ir的白线峰强度位于金属Ir和IrO2之间，表明Ir元素的氧化电子结构。Ir的价态分析表明，TPyP-Ir中Ir的平均价态为1.26，高于零价的Ir箔，低于正四价的IrO2（图6b）。如图6c所示，利用扩展x射线吸收精细结构（FT-EXAFS）的傅里叶变换分析来研究Ir原子的配位环境。TPyP-Ir有两个主要的波峰，分别位于~1.63和2.56 Å，这与Ir-N配位和Ir-Ir配位结构相关联。对Ir箔、IrO2和TPyP-Ir进行Ir L边震荡的Morlrt小波变换（WT，κ=3，σ=1），进一步验证了TPyP-Ir中的Ir-N键和Ir-Ir键的存在。如图7所示，以Ir箔等高线图（R=2.59 Å,k=12.10 Å-1）(图7a)和IrO2等高线（R=1.62 Å,k=7.58 Å-1）(图7b)为对照, TPyP-Ir中R空间和K空间的两个分辨谱分别为（R=2.56 Å,k=10.64 Å-1）（R=1.63 Å,k=6.14 Å-1），分别对应了Ir-Ir键和Ir-N键（图7c），与上述结果相符合。
试验例2 体外性能表征
2.1 试验方法
过氧化物酶（POD）活性检测
为了检测TPyP-Ir配位聚合物的过氧化物酶活性，以TMB为底物检测H2O2的分解。先将25 μL TPyP-Ir（4 mg/mL）加入到1926 μL醋酸钠/醋酸（NaOAc/HOAc）缓冲液（0.1 M，pH4.5）中，随后加入25 μL H2O2（100 mM）和24 μL TMB（10 mg/mL，DMF做溶剂），并充分混合。室温下孵育10 min后，取200 μL用酶标仪测量其在652 nm处的吸光度。
过氧化物酶稳态动力学计算
室温下测试TPyP-Ir的稳态动力学。先将25 μL TPyP-Ir（4 mg/mL）加入到1000 μLNaOAc/HOAc缓冲液（0.1 M，pH 4.5）中，随后加入24 μL TMB（10 mg/mL，DMF做溶剂）和不同浓度的H2O2，用NaOAc/HOAc缓冲液定容至2 mL充分混合，用酶标仪记录反应溶液120s内每隔2s在652 nm处的吸光度。将反应速率和底物浓度在Michaelis-Menten方程中拟合，计算动力学常数（Vmax和Km），Michaelis-Menten方程如下：
式中，V0为初始反应速率，Vmax为最大反应速率。其中，Vmax是在饱和底物条件下得到的。[S]为底物浓度。Km为米氏常数，表示初始反应速率达到其最大反应速率的一半时的底物浓度。M-PorBC的催化活性定义如下：
其中，Kcat表示反应常数，其值为每个活性催化中心的最大转化底物量（TON）。E0为金属活性中心的摩尔浓度。
氧化物酶（OXD）活性检测
检测TPyP-Ir配位聚合物的氧化物酶活性时，在不加入H2O2的情况下，检测TPyP-IrTMB的氧化情况。先将25 μL TPyP-Ir（4 mg/mL）加入到1949 μL醋酸钠/醋酸（NaOAc/HOAc）缓冲液（0.1 M，pH 4.5）中，随后加入24 μL TMB（10 mg/mL，DMF做溶剂），并充分混合。室温下孵育10 min后，取200 μL用酶标仪测量其在652 nm处的吸光度。
氢乙啶(HE)检测•O2 -
HE是一种特异性的探针，可以与•O2 -反应生成荧光乙锭在470 nm激发，在610 nm发射。首先将1.5 mL 100 μg·mL-1 TPyP-Ir缓冲液(1.0 M乙酸盐缓冲液(pH 4.5))与1.5 μL0.1 M H2O2溶液在37℃下混合40 min，然后向体系中加入1.5 mL 1 mg·mL-1的HE-乙醇溶液。随后，将溶液涡旋并保持40分钟不受干扰，然后进行荧光测量。
9,10-蒽醌（DPA）检测1O2
将50 μg mL−1TPyP-Ir与1 μg mL−1DPA按体积比1:40混合，检测1O2，然后用紫外-可见分光光度计进行分析。记录TPyP-Ir在有无US下对DPA的分解率，用DPA在378 nm处的吸光度在说明材料的生成1O2效果。
酸性条件下O2生成检测及动力学测试
将100 mM H2O2和10 μg/mL TPyP-Ir混合在20 mL PBS中，使用溶解氧计(INESA,JPSJ-605F)每10 s测量一次O2浓度，直至600 s。将10 μg/mL的TPyP-Ir和不同浓度的H2O2混合在PBS中，得到20 mL溶液，分别在30 s和1 min测定O2浓度，以对应的H2O2浓度绘制反应速率，并拟合Michaelis-Menten曲线。采用Lineweaver-Burk图确定Vmax和Km(式(1))。根据式(2)计算周转数TON，其中[S]为H2O2浓度，[E0]为材料中金属的摩尔浓度。
2.2 试验结果：
在成功表征了TPyP-Ir的形貌和化学结构后，我们进一步用典型的TMB比色法研究其仿过氧化物酶（POD）和氧化物酶（OXD）性能。具有POD活性的催化剂可以通过催化H2O2底物分解H2O2快速催化TMB（无色）的氧化生成oxTMB（蓝色），使652 nm处的吸光度显著增加。图8a为TPyP和TPyP-Ir在H2O2存在下孵育TMB溶液后的紫外-可见光谱。图8b为TPyP和TPyP-Ir在652 nm处对应的峰值强度。最终浓度: NaOAc−HOAc缓冲液(100 mM, pH 4.5)，材料(0.025mg·mL-1)， H2O2(12.5 mM)， TMB (0.024 mg·mL-1)。OXD活性检测。图8ab显示了TPyP-Ir在652 nm处显示特征吸光度，表明其超高的POD活性。类似地，具有OXD活性的催化剂可以在没有H2O2存在下，利用空气中的氧气催化无色的TMB氧化生成蓝色的oxTMB。图8c为TPyP和TPyP-Ir与TMB溶液共同孵育后的紫外-可见光谱。图8d为TPyP和TPyP-Ir在652 nm处对应的峰值强度。最终浓度: NaOAc−HOAc缓冲液(100 mM, pH 4.5)，材料(0.025 mg·mL-1)，TMB(0.024 mg·mL-1)。如图8cd所示，TPyP-Ir相较于TPyP在652 nm出有较高的特征吸收峰，说明TPyP-Ir有较高的OXD活性。
随后，基于TPyP-Ir超高的POD活性，我们进一步探究了TPyP-Ir的POD动力学。图9a展示了在不同浓度H2O2下，TPyP-Ir在652 nm处的吸收峰值随时间变化情况。以TMB和H2O2为底物测定稳态催化动力学，然后用线性双倒数图确定最大速度(Vmax)和Michaelis-Menten常数(Km)并计算出TPyP-Ir在室温下的Vmax为1.15 × 10-6M s-1，Km为0.404 μM (图9b)。此外。根据XPS数据计算出的Ir wt%为21%，计算其TON为115.56 × 10-3s-1，远大于近期报道的POD催化剂（图9c）。
随后，用自由基猝灭试验鉴别TPyP-Ir催化底物H2O2产生的活性氧种类，其中叔丁醇(TBA)猝灭•OH，苯醌(BQ)猝灭•O2 -, NaN3猝灭1O2。如图10所示，•O2 -和1O2是TPyP-Ir催化H2O2的主要活性氧产物。
超声增强材料体外产活性氧性能
受TPyP-Ir强催化活性启发，首先使用9,10-二苯蒽醌(DPA)法评估TPyP-Ir介导的SDT效应产生1O2的能力。简而言之，特征峰在378 nm处的DPA在1O2作用下会被氧化为无特征峰的9,10-二苯蒽醌(DPO2)。如图11a和图11b所示，与H2O2组、H2O2+US组和TPyP-Ir+H2O2组相比，TPyP-Ir+H2O2+US组在378 nm处的吸光度明显减小，DPA被氧化为DPO2，说明超声辐照明显增强了材料生成1O2的能力。此外，还使用HE探针法研究超声增强TPyP-Ir生成•O2 -能力。如图11 c和图11d所示，在没有超声存在下，TPyP-Ir的产•O2 -较弱，随着超声时间的延长，其在610处的吸光度明显增强，说明TPyP-Ir在US辐照下可以提高其•O2 -生成效果。
另一方面，通过测量TPyP-Ir对H2O2的分解产氧能力，进一步评估其仿过氧化氢酶（CAT）活性（图12a）。在仅孵育40s时，随TPyP-Ir浓度的增加，可溶性O2浓度逐渐增加，表明TPyP-Ir在酸性条件下对H2O2有有效的酶解作用。根据稳态动力学研究了US辐照对TPyP-Ir的仿CAT活性的影响，将反应速率与底物(H2O2)浓度绘制为Michaelis - Menten曲线，并计算CAT活性的稳态动力学参数（图12 b-e）。如图12f所示，无超声辐照下，TPyP-Ir CAT活性的Vmax和Km分别为195.31 μM/s和499.03 mM，相应的TON为13.04 ms-1。而超声辐照下，TPyP-Ir CAT活性的Vmax和Km分别为117.92 μM/s和287.458 mM，相应的TON为7.88 ms-1，这有可能是因此在US存在下，O2转化为1O2。
随后，我们探究了不同贵金属（Pd、Pt、Rh和Ru）配位聚合物是否有同样优异的性能，采用TPyP-Ir的合成方法，得到了TPyP-Pd、TPyP-Pt、TPyP-Rh和TPyP-Ru。测试它们的POD活性（图13），结果表明，只有TPyP-Ir具有高效的POD活性，其他贵金属没有此活性。
试验例3 细胞实验
3.1 试验方法
细胞毒性
人脐静脉内皮细胞(HUVECs)按照1×104个/孔的密度接种于96孔板后培养24小时，24小时后弃去孔板中的培养基，然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗。然后将含TPyP-Ir浓度分别为0，25、50、100 μg/mL的完全培养基加入96孔板，孵育24小时后利用活/死荧光染色法检测TPyP-Ir的细胞毒性。
溶血实验
收集新西兰大白兔血细胞，与浓度分别为25、50、100的TPyP-Ir在37℃下培养60min，然后离心吸取上清液检测溶血情况。分别以PBS培养液中的血细胞和不添加TPyP-Ir的蒸馏水中的血细胞作为阴性对照和阳性对照。
摄取实验
将含TPyP-Ir的水相与含有Cy5荧光染料的有机相混合后挥发有机相，制备Cy5荧光标记的TPyP-Ir（Cy5/TPyP-Ir）。将ID8细胞按照5×105个/孔的密度接种于24孔板后培养24小时，将培养基更换为含Cy5/TPyP-Ir浓度分别为0，25、50、100 μg/mL的完全培养基。孵育24小时后利用流式检测仪检测ID8细胞内荧光强度从而分析细胞对Cy5/TPyP-Ir的摄取能力。
活/死荧光检测
将ID8细胞按照5×105个/孔的密度接种于24孔板后培养24小时，加入含TPyP-Ir(100µg mL-1)的完全培养基(pH 6.5)与ID8细胞共孵育24小时，然后进行US照射(0.8 MHz,1 W/cm2，30 s，30% 占空比)；用钙黄素-AM(活细胞，绿色)染色30分钟，碘化丙啶(死细胞，红色)染色2-5min；在显微镜下观察ID8细胞存活情况，并计算活细胞及死细胞的比例。
流式检测细胞凋亡
将ID8细胞按照5×105个/孔的密度接种于24孔板后培养24小时，加入含TPyP-Ir(100µg mL-1)的完全培养基(pH 6.5)与ID8细胞共孵育24小时，然后进行US照射(0.8 MHz,1 W/cm2, 30 s, 30% 占空比)。处理结束后，收集细胞并分别利用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(北京4A生物技术有限公司)对细胞进行荧光标记及流式分析。根据细胞被标记情况将细胞群划分为4个象限:活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞。
细胞内ROS生成的检测
将ID8细胞按照5×105个/孔的密度接种于24孔板后培养24小时，加入含TPyP-Ir(100µg mL-1)的完全培养基(pH 6.5)与ID8细胞共孵育24小时，然后进行US照射(0.8 MHz,1 W/cm2, 30 s, 30% 占空比)。处理结束后，将DCFH-DA作为ROS荧光探针与ID8细胞在37℃、避光条件下共孵育30分钟。PBS洗涤后，使用Olympus IX 83全自动倒置荧光显微镜检测细胞内ROS荧光强度。
免疫原性死亡诱导
将ID8细胞按照5×105个/孔的密度接种于共聚焦皿培养24小时，加入含TPyP-Ir(100µg mL-1)的完全培养基(pH 6.5)与ID8细胞共孵育24小时，然后进行US照射(0.8 MHz,1 W/cm2，30 s，30% 占空比)。处理结束后，固定细胞然后依次孵育CRT免疫荧光一抗及二抗。在共聚焦显微镜下观察细胞内CRT表达水平差异。
巨噬细胞激活
将ID8细胞按照5×105个/孔的密度接种于24孔板后培养24小时，加入含TPyP-Ir(100µg mL-1)的完全培养基(pH 6.5)与ID8细胞共孵育24小时，然后进行US照射(0.8 MHz,1 W/cm2，30 s，30% 占空比)。处理结束后，将培养上清加入巨噬细胞RAW 264.7中，继续孵育24小时。然后分别利用iNOS和CD163荧光标记抗体对M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞进行表型标记。通过流式分析检测M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞比例。
肿瘤模型
雌性C57BL/6小鼠购自北京华富康生物科技有限公司。用细针将处于对数生长期的ID8细胞100 μL(约1×108个细胞)注射于近背部前肢皮下，形成均匀的皮眼窝，形成小鼠卵巢癌ID8细胞皮下瘤模型。
体内抗肿瘤效果验证
当肿瘤体积达到150~ 200mm3时，进行原位肿瘤治疗。根据不同的治疗方法将小鼠分为4组:(1)对照组：PBS组；(2) US（US是指超声照射处理）；(3) TPyP-Ir；(4) TPyP-Ir+US。每组6只小鼠。超声条件：功率2.5 W/cm2，频率1 MHz，占空比30%、时间2分钟。原位注射Pd-Pta /Por (10mg/kg)，瘤内注射8小时后进行超声干预，每2天进行一次。在固定时间点测量荷瘤小鼠体重，绘制体重随时间变化曲线。用游标卡尺测量肿瘤长和宽，并计算肿瘤体积（体积=长度×宽度2/2，），绘制肿瘤体积相对变化的曲线，计算出肿瘤生长抑制率，公式:抑瘤率=(对照组肿瘤体积-实验组肿瘤体积)/ 对照组肿瘤体积×100%。对于H&E、Ki 67、Tunnel、CRT、HMGB1染色，在动物解剖后的离体组织中进行，同时分别取淋巴结及脾脏进行体内免疫激活检测。
统计学分析
采用SPSS 22.0进行统计分析。连续变量表示为平均值±标准差。当数据符合正态分布且满足方差齐性时，两组均值比较采用t检验;多组间均值比较采用单因素方差分析(one-way analysis of variance, ANOVA)检验，两两比较采用LSD检验。如果不满足上述条件, Wilcoxon秩和检验将用于两组之间的比较, Kruskal Wallis秩和检验可用于多个组之间的比较，和Nemenyi测试将用于两组之间的比较。所有检验均为双侧检验，p＜0.05为有统计学意义。
3.2 细胞试验结果：
受TPyP-Ir优异的体外生物催化性能的启发，我们在细胞水平评估了TPyP-Ir与声动力联合抗肿瘤免疫治疗的效果。首先，在 HUVECs中利用钙黄素乙酰氧甲基(Calcein-AM)和碘化丙啶(PI)检测TPyP-Ir的细胞毒性。当TPyP-Ir浓度小于200 µg/mL时，24小时内对正常细胞无明显的毒性作用 (图14A和图14B)。此外，溶血实验表明，当TPyP-Ir浓度小于200µg/mL时，溶血率低于5%(图14C和图14D)。这些结果表明了它们在体外治疗中的良好的生物安全性。
为了检测TPyP-Ir与声动力协同作用后对ID8细胞杀伤能力，利用Calcein-AM和PI染料将不同措施干预后的细胞进行荧光标记；如图15所示，空白对照组（Control组）及单纯US组细胞几乎无损伤，TPyP-Ir组死亡细胞逐渐增多，而TPyP-Ir + US组死亡细胞最多。同时，对死亡细胞的定量分析如图16所示，表明TPyP-Ir和SDT协同能够实验有效的抗肿瘤治疗。
然后，利用荧光素-annexin V和碘化丙啶(PI)染色分析流式细胞术分析抗肿瘤机制。根据荧光标记情况将细胞群划分为4个象限：活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞。定量分析各组凋亡细胞比例(图17)。结果表明TPyP-Ir+US细胞凋亡率显著(高达70%左右)，而Control组及单纯US组细胞几乎没有凋亡，TPyP-Ir处理组细胞凋亡率较低（约23%）。
以2,7-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)荧光显微镜观察细胞内活性氧(ROS)的产生。DCFH-DA能与活性氧(ROS)反应生成具有绿色荧光的2,7-二氯荧光素(DCF)。如图18所示，Control组及单纯US组仅有极少数细胞发出绿色荧光。TPyP-Ir处理组细胞荧光强度高于Control组及单纯US；而TPyP-Ir + US组的荧光明显高于Control组、US组以及TPyP-Ir。图18中对DCF荧光强度的半定量分析也显示Pd-Pta/Por+US+L基团的平均荧光强度最高。
此外，为了评估TPyP-Ir 与SDT联合作用后诱发免疫原性死亡（ICD）的能力，首先利用钙网蛋白CRT外翻情况检测不同干预后ID8细胞释放损伤相关分子模式（DAPMs）的情况。免疫荧光染色及半定量分析结果如图19，图19A为激光共聚焦观察不同组别细胞表面CRT荧光信号表达的强弱图（标尺：20 μm），图19B为用Image J对细胞表面CRT荧光强度进行定量后统计分析图，图19C为激光共聚焦观察不同实验组细胞核内HMGB-1荧光信号强弱图（标尺：20μm），图19D为用Image J对细胞核内HMGB-1荧光强度进行定量后统计分析图。其中显示，Control组细胞表面几乎不表达CRT，单纯US组细胞表面CRT极少量表达，但表达量与Control组相比无统计学差异，TPyP-Ir组细胞表面CRT表达相较于Control组明显增多，TPyP-Ir + US组表面CRT表达量为四组中最多，且均有统计学差异。
其次，我们坚持了不同措施干预后巨噬细胞极化能力的差异，利用流式分析检测巨噬细胞向M1型及M2型表型极化的比例，结果如图20，图20A为显微镜下观察各组别Tranwell小室中RAW 264.7发生迁移的数量图（标尺：200 μm），图20B为用Image J对迁移的细胞进行计数后统计分析图，图20C为流式细胞术检测各实验组巨噬细胞CD86、iNOS、CD163标记物表达情况图，图20D为CD86+巨噬细胞/CD163+巨噬细胞比值统计分析图，图20E为iNOS+巨噬细胞/CD163+巨噬细胞比值统计分析图。其中，Control组及单纯US组干预后的ID8细胞培养上清几乎不会对巨噬细胞的表型产生影响，而TPyP-Ir处理后的细胞上清与RAW264.7共孵育后，能在一定上促进巨噬细胞向M1型转换，而TPyP-Ir + US组，处理后的细胞上清与RAW 264.7共孵育后，M1型巨噬细胞所占比例明显高于其余三组。
受体外协同治疗效果的启发，我们进一步评估了TPyP-Ir 与SDT联合作用体内抗肿瘤免疫效果，如图21所示，我们在雌性C57BL/6小鼠体内对同源肿瘤移植进行TPyP-Ir联合SDT抗肿瘤效果评价。治疗期间每两天记录每只小鼠的体重和肿瘤体积，图21A为治疗结束后各实验组小鼠移植瘤解剖图，图21B为接种及治疗后小鼠体重图，各组间体重无显著差异。与Control组及单纯US组，TPyP-Ir组肿瘤生长受到一定抑制，而TPyP-Ir + US组肿瘤抑制效果最强，可达50%(图21C)。通过分析不同组别肿瘤的平均体积也证实了这种联合治疗方法的有效性。
如图22显示，对各组肿瘤切片进行苏木精和伊红(H&E)染色，显示其良好的抑瘤效果。Control组和单纯US组肿瘤细胞维持正常形态，未见明显组织损伤; TPyP-Ir肿瘤轻度破坏，而TPyP-Ir + US组肿瘤细胞核明显凝聚，具有典型的组织病理学损伤。此外，如图23所示，治疗后小鼠心、肝、脾、肺、肾等主要正常器官的H&E染色图像未见明显组织损伤，提示TPyP-Ir和SDT联合治疗的方法具有较高的安全性。
采用末端脱氧核苷酸转移酶dUTP末端标记(TUNEL)和Ki-67染色分别研究肿瘤凋亡和细胞增殖水平。Ki67染色结果见图24A，显示TPyP-Ir + US 组阳性细胞比例最低，且明显低于其余三组。而Tunel染色结果显示TPyP-Ir + US组阳性细胞比例最高，且明显低于其余三组(图24B)。钙网蛋白(CRT)暴露在细胞表面是免疫原性细胞死亡的一个明显的生物标志物。一旦到达肿瘤细胞表面，CRT就充当了“eat me”的信号，刺激巨噬细胞和树突状细胞吞噬死亡的细胞及其凋亡碎片。TPyP-Ir + US所引起的CRT信号强度远高于其他组（图24C）。同时，从肿瘤区域巨噬细胞浸润情况分析可知，TPyP-Ir + US处理后巨噬细胞向M1型转换的比例明显增加，并高于其他三组，能够有效发挥抗肿瘤性能。同时，利用流式细胞术分析了小鼠脾脏中CD4+及CD8+T细胞数量以及淋巴结中DCs细胞成熟情况，结果如图25所示，图25a为淋巴结DC细胞成熟度流式直观图，图25b为淋巴结DC细胞成熟度统计学分析图，结果表明TPyP-Ir+US组CD11c+CD80+CD86+DC淋巴细胞比例明显高于对照组，说明TPyP-Ir与US联用后促成熟能力进一步增强。图26展示了TPyP-Ir与US联合作用后，对小鼠体内T淋巴细胞的激活情况，图26A为CD3+CD4+TT细胞以及CD3+CD8+细胞流式直观图，图26B为CD3+CD4+T细胞统计学分析图, 图26C为CD3+CD8+T细胞统计学分析图，结果表明TPyP-Ir + US组治疗后，小鼠脾脏中CD4+及CD8+T细胞数量明显增加，DCs细胞成熟度明显增高，体内免疫系统被激活。
这些检测结果明确证实了TPyP-Ir 与SDT联合作用能够达到良好的协同处理效果，能够实现有效杀伤肿瘤细胞并有效激活体内免疫的治疗目的。
Claims (10)
1.一种Ir金属基生物催化剂，其特征在于：所述催化剂为Ir金属团簇通过Ir-N键连接卟啉形成的配位聚合物。
2.根据权利要求1所述的Ir金属基生物催化剂，其特征在于：所述配位聚合物为非晶结构；或：
所述Ir金属团簇为纳米级晶体结构；或：
所述催化剂为块状材料。
3.根据权利要求1或2所述的Ir金属基生物催化剂，其特征在于：所述催化剂具有POD、OXD和酸性条件下的CAT活性。
4.权利要求1~3任一项所述的Ir金属基生物催化剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：将卟啉或其衍生物与铱盐的共混溶液经水热法制得所述生物催化剂。
5.根据权利要求4所述的Ir金属基生物催化剂的制备方法，其特征在于：所述卟啉为具有吡啶基的卟啉；或：
所述铱盐为IrCl3；或：
所述卟啉和铱盐的摩尔比为1 :0.5~ 4；或：
所述水热法的条件为：在80 ~ 200℃下反应6 ~ 15h。
6.根据权利要求5所述的Ir金属基生物催化剂的制备方法，其特征在于：所述卟啉为5,10,15,20-4吡啶基卟啉、四-(2-吡啶基)卟啉、5,15-二(4-吡啶基)-10,20-二苯基卟啉中的至少一种；或：
所述卟啉和铱盐的摩尔比为1 : 2；或：
所述卟啉与铱盐的共混溶液采用下述方法制得：将卟啉或其衍生物、高分子表面活性剂和酸充分溶解后形成溶液A；将铱盐溶解于去离子水中，得到溶液B；随后，在剧烈搅拌下，将溶液B加入溶液A中，搅拌得共混溶液；或：
所述高分子表面活性剂为聚乙烯吡咯烷酮；或：
所述酸为盐酸，所述盐酸的浓度为0.01M。
7.Ir金属基生物催化剂在制备具有抗氧化功能的生物材料中的用途，其特征在于：所述Ir金属基生物催化剂为权利要求1~3中任一项所述的Ir金属基生物催化剂，或采用权利要求4~6中任一项所述方法制备得到的催化剂。
8.根据权利要求7所述的Ir金属基生物催化剂在制备具有抗氧化功能的生物材料中的用途，其特征在于：所述Ir金属基生物催化剂用于制备肿瘤治疗药物或抗氧化药物。
9.一种增强Ir金属基生物催化剂活性的方法，其特征在于：所述增强活性的方法在于利用超声照射处理；所述Ir金属基生物催化剂为权利要求1~3中任一项所述的Ir金属基生物催化剂，或采用权利要求4~6中任一项所述方法制备得到的催化剂。
10.根据权利要求9所述的一种增强Ir金属基生物催化剂活性的方法，其特征在于，所述超声照射条件为：功率0.5 ~2.5 W/cm2，频率0.8~ 1.5 MHz，占空比20 ~ 40%，时间30 s~120s。
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