ES2595631B1 - Procedimiento general de obtención de biocatalizadores que comprende la inmovilización de enzimas durante la síntesis de materiales metalo-orgánicos - Google Patents

Procedimiento general de obtención de biocatalizadores que comprende la inmovilización de enzimas durante la síntesis de materiales metalo-orgánicos Download PDF

Info

Publication number
ES2595631B1
ES2595631B1 ES201530756A ES201530756A ES2595631B1 ES 2595631 B1 ES2595631 B1 ES 2595631B1 ES 201530756 A ES201530756 A ES 201530756A ES 201530756 A ES201530756 A ES 201530756A ES 2595631 B1 ES2595631 B1 ES 2595631B1
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
enzyme
solution
mof
synthesis
biocatalyst
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn - After Issue
Application number
ES201530756A
Other languages
English (en)
Other versions
ES2595631A1 (es
Inventor
Elsa CASTRO MIGUEL
Victoria GASCÓN PÉREZ
Manuel SÁNCHEZ SÁNCHEZ
Rosa María Blanco Martín
Manuel DÍAZ GARCÍA
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Original Assignee
Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC filed Critical Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority to ES201530756A priority Critical patent/ES2595631B1/es
Priority to PCT/ES2016/070397 priority patent/WO2016193516A1/es
Publication of ES2595631A1 publication Critical patent/ES2595631A1/es
Application granted granted Critical
Publication of ES2595631B1 publication Critical patent/ES2595631B1/es
Withdrawn - After Issue legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J37/00—Processes, in general, for preparing catalysts; Processes, in general, for activation of catalysts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/04—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel or hollow fibres
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2235/00—Indexing scheme associated with group B01J35/00, related to the analysis techniques used to determine the catalysts form or properties
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2235/00—Indexing scheme associated with group B01J35/00, related to the analysis techniques used to determine the catalysts form or properties
    • B01J2235/15—X-ray diffraction
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J35/00—Catalysts, in general, characterised by their form or physical properties
    • B01J35/70—Catalysts, in general, characterised by their form or physical properties characterised by their crystalline properties, e.g. semi-crystalline

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Procedimiento general de obtención de biocatalizadores que comprende la inmovilización de enzimas durante la síntesis de materiales metalo-orgánicos.#La presente invención propone un procedimiento general de obtención de biocatalizadores que comprende la inmovilización in-situ de enzimas, en la mesoporosidad intercristalina formada por la agregación de nanocristales durante la síntesis de un material metalo-orgánico (MOF). El procedimiento de la invención permite alcanzar un alto contenido de enzima sobre el soporte, minimizar la reducción de la eficiencia catalítica en relación con la de la misma enzima libre y reducir las pérdidas por lixiviado, solventando de esta forma las limitaciones identificadas en los métodos de obtención de biocatalizadores conocidos basados en la inmovilización de enzimas in-situ. La invención también se refiere a los biocatalizadores directamente obtenidos por el procedimiento.

Description

5
10
15
20
25
30
35
PROCEDIMIENTO GENERAL DE OBTENCION DE BIOCATALIZADORES QUE COMPRENDE LA INMOVILIZACION DE ENZIMAS DURANTE LA SINTESIS DE MATERIALES METALO-ORGANICOS
DECRIPCION
SECTOR DE LA INVENCION
La presente invention se engloba dentro del ambito del desarrollo de catalizadores que pueden ser de aplicacion en muy diferentes campos, como por ejemplo, qulmico, farmaceutico, agricola, energetico y biotecnologico. Especlficamente se refiere a un procedimiento de obtencion de biocatalizadores que es general, y que permite la inmovilizacion de cualquier enzima durante la slntesis de materiales metalo-organicos nanocristalinos (MOFs), aprovechando la mesoporosidad intercristalina, generada por aglomeracion o agregacion de nanocristales.
ESTADO DE LA TECNICA
La inmovilizacion sobre soportes solidos de enzimas permite su heterogeneizacion, es decir, tener la biomolecula soportada en fase solida. La obtencion de biocatalizadores solidos favorece, entre otros aspectos, la separacion de dichas enzimas del medio de reaccion y su reutilizacion en sucesivos ciclos de reaccion.
La naturaleza qulmica y las propiedades texturales de los materiales utilizados como soportes confieren distintas propiedades al catalizador final. La union de una enzima sobre un soporte preexistente (en adelante inmovilizacion post-slntesis) puede llevarse a cabo a traves de enlaces covalentes o no covalentes, y en cualquier caso es conveniente una elevada afinidad qulmica entre ambas especies. Para alojar altas cargas de una enzima el soporte debe ofrecer una alta superficie especlfica, por lo que son deseables materiales que presenten alta porosidad con diametro de poro superior a las dimensiones moleculares de la enzima a inmovilizar.
Estas dos caracterlsticas (naturaleza qulmica y propiedades texturales) restringen las
posibilidades de hallar un metodo general o universal para inmovilizar cualquier enzima,
independientemente de sus caracterlsticas, y hace necesario un diseno "a medida” de
2
5
10
15
20
25
30
acuerdo con la composition qulmica de la superficie de la enzima y con sus dimensiones moleculares.
Como alternativa a la inmovilizacion post-slntesis, la posibilidad de atrapamiento de la enzima durante el proceso de slntesis del soporte, en adelante inmovilizacion in-situ (asl es singularmente conocida la slntesis de materiales sillceos en presencia de enzimas) ha sido explorada por varias vlas.
Entre los materiales porosos con proyeccion mas emergente, destacan los materiales metalo-organicos (MOFs). En el contexto de una posible aplicacion en la inmovilizacion de enzimas, estos materiales cumplen con las dos premisas principales anteriormente indicadas (superficie especlfica y diametro de poro). Asl, por un lado, su versatilidad estructural es tal que, a diferencia de otros materiales microporosos convencionales, algunas de sus estructuras poseen poros que se adentran ampliamente en el intervalo de los mesoporos (Deng et al., Science, 2012, 336, 1018). Por otro lado, su versatilidad de composicion, que abarca la practica totalidad de los elementos de la Tabla Periodica o de las funcionalidades organicas conocidas, garantiza la posibilidad de disenar MOFs, que en caso de ser necesarios sean afines qulmicamente hacia cada enzima a traves del control de la hidrofobicidad o de la presencia/concentracion de cargas electrostaticas y/o grupos funcionales predisenados en el entorno poroso.
Dentro de la literatura patente son conocidos procedimientos de obtencion de biocatalizadores que comprenden la inmovilizacion post-slntesis de enzimas en MOFs. Asl, es especialmente destacable el documento WO2012174402A2 que refiere la mezcla de un MOF mesoporoso como el Tb-mesoMOF, con una solucion conteniendo la enzima microperoxidasa-11, y que se incuba durante aproximadamente de 10 a 150 horas a una temperatura aproximada de 37 grados centlgrados, consiguiendo la inmovilizacion de la enzima en las celdas nanoscopicas del MOF. Por su parte, el documento US2014342429A1 trata sobre un metodo para inmovilizar cualquier tipo de biomolecula, incluyendo enzimas, sobre materiales porosos como los MOFs, y singularmente sobre el MOF MIL-53(Al).
Por su parte, dentro de la literatura no patente tambien se divulga la obtencion de biocatalizadores que comprenden MOFs sobre los que posteriormente se incorporan enzimas de tamano pequeno con un diametro inferior a 3,3 nm (Deng et al., Science, 2012,
5
10
15
20
25
30
336, 1018; Lykourinou et al., J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 10382; Chen et al., J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 13188).
Sin embargo, la inmovilizacion post-slntesis en MOFs presenta varias limitaciones. En primer lugar, la inmensa mayorla de los materiales MOFs son microporosos por lo que no poseen poros suficientemente grandes para inmovilizar enzimas en su interior, y los que los poseen requieren de un gran esfuerzo en su preparation, porque estan constituidos por ligandos organicos no comerciales, caros y diflciles de sintetizar, necesariamente en pasos previos a la formation del propio MOF (Deng et al., Science, 2012, 336, 1018). En segundo lugar, los poros que ofrecen estos MOFs no son suficientemente grandes para que muchas biomoleculas difundan a su traves, y por tanto, el metodo esta lejos de poder considerarse universal.
En lo que respecta a la inmovilizacion in-situ de enzimas sobre MOFs, en el estado de la tecnica unicamente se conoce el documento de Shieh et al. (J. Am. Chem. Soc. 2015, 137, 4276) que difunde un metodo para sintetizar MOFs en presencia de una enzima a temperatura ambiente y en condiciones acuosas, y que consiste en mezclar una disolucion acuosa de nitrato de zinc con otra disolucion acuosa conteniendo imidazolato-2- carboxaldehido (ICA), catalasa y un agente tamponador. Sin embargo, el catalizador asl obtenido se caracteriza por estar formado por microcristales; una muy reducida eficiencia de encapsulation que se situa en un 5% en peso de la enzima (lo que se corresponded aproximadamente con un porcentaje de incorporation de la enzima inferior al 64%, considerando un rendimiento inferior al 100% y una completa formacion del MOF); y ademas una muy reducida eficiencia catalltica de la enzima encapsulada (33 veces inferior a la de la misma enzima libre).
En base a lo anterior, se considera de interes un procedimiento general, sencillo y rapido, que basandose en la inmovilizacion in-situ de enzimas, durante la formacion de MOFs, permita obtener biocatalizadores con alta carga enzimatica, con una alta capacidad de retention de enzima y con una eficiencia catalltica que no se vea excesivamente mermada con respecto a la actividad de la biomolecula sin inmovilizar.
EXPLICACION DE LA INVENCION
5
10
15
20
25
30
En un primer aspecto la invention se refiere a un procedimiento de obtencion de un biocatalizador porque comprende:
a) sintetizar parcial o totalmente un material metalo-organico (MOF) en presencia de al menos una enzima, hasta obtener un solido y,
b) aislar el solido sintetizado segun la etapa a), preferentemente por centrifugation o filtration,
y donde el MOF sintetizado inmoviliza la enzima en la mesoporosidad intercristalina formada entre cristales o entre dominios aglomerados o agregados de partlculas nanocristalinas de tamano homogeneo.
Preferentemente, la mesoporosidad intercristalina comprende al menos un, y preferentemente mas de uno, volumen hueco entre 2 y 50 nm.
El procedimiento de la invencion se caracteriza porque en la etapa (a), la slntesis del MOF comprende poner en contacto dos disoluciones en presencia de al menos una enzima, donde dichas disoluciones pueden ser acuosas, organicas o una mezcla acuosa-organica, y donde preferentemente la primera disolucion es una disolucion de una fuente metalica y la segunda, una disolucion de ligando organico.
La segunda disolucion de ligando organico se elige entre una disolucion acuosa de una sal de ligando organico o una disolucion acuosa de ligando organico protonado en presencia de un agente desprotonante.
Preferentemente el procedimiento de la invencion se desarrolla a temperaturas entre 4 y 70 °C y mas preferentemente entre 20 y 30 °C.
Preferentemente la enzima que se utiliza es p-glucosidasa.
En un segundo aspecto, la invencion se refiere al biocatalizador directamente obtenido por el procedimiento del primer aspecto de la invencion
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
5
10
15
20
25
30
El problema tecnico que resuelve la presente invention es el desarrollo de un procedimiento general o universal, sencillo, rapido y economico, que pueda ser utilizado de forma extensiva para obtener biocatalizadores que comprenden un soporte MOF y cualquier enzima que se inmovilice en el mismo durante su slntesis, y que resuelva los problemas detectados en el estado de la tecnica para otros biocatalizadores que se basan en la inmovilizacion in-situ, singularmente la reducida capacidad de carga enzimatica, la limitada capacidad de retention de las enzimas inmovilizadas, y una excesiva merma de la eficiencia catalltica con respecto a la de la biomolecula sin inmovilizar.
La presente invencion se basa en un procedimiento de inmovilizacion in-situ de la enzima p- glucosidasa de Aspergillus niger (p-Glu) sobre distintos MOFs, que permite obtener biocatalizadores que se caracterizan por comprender partlculas policristalinas formadas por nanocristales (de unos 40 nm) de tamano homogeneo, que en su agregacion generan volumenes huecos, estables y ordenados mesoporos (entre 2 y 50 nm de diametro), y que les permiten inmovilizar en su interior una importante cantidad de la enzima, que alcanza al menos un 15% en peso de la enzima y mas de un 86% de la enzima expuesta en el medio de reaction ver Ejemplos 1 a 5) y adicionalmente, reduce las perdidas por lixiviado de las mismas (ver Ejemplo 6).
Por otra parte, las condiciones de reaccion que se emplean en esta invencion para obtener los biocatalizadores, favorecen el mantenimiento de la actividad catalltica de las enzimas confiriendoles una elevada eficiencia catalltica (ver Ejemplos 1 a 5), obteniendo valores muy superiores a los indicados por Shieh et al. (J. Am. Chem. Soc. 2015, 137, 4276) que registraron una eficiencia 33 veces inferior en el biocatalizador con respecto a la enzima libre, mientras que siguiendo el procedimiento que se incluye en la presente invencion la calda es solo de unas 6-12 veces comprobado para la enzima p-glucosidasa en medio acuoso (Ejemplos 1-3), incluso considerando que la actividad de la enzima libre se ha medido en condiciones optimizadas de pH, dilution, concentration de tampones, mientras que la actividad del biocatalizador se ha medido tomando directamente una allcuota (suspension) del sistema de slntesis (y, por tanto, en presencia de una base, sin control de pH, sin presencia de tampones, etc.).
5
10
15
20
25
30
35
Finalmente, el procedimiento de obtencion de biocatalizadores que se incluye en la invention, permite la estabilizacion de la estructura y de la actividad de la enzima durante al menos 48 horas en medios a priori poco propicios para ella, como por ejemplo la N,N- dimetilformamida, donde la enzima libre es completamente inactivada tras pocos minutos (ver Ejemplos 4 y 5).
Ciertos ejemplos de realization de esta invencion se describen con detalle en este documento (ver Ejemplos 1 a 5). Sin embargo, la presente invencion puede llevarse a cabo en un amplio rango de realizaciones mas alla de las explicitamente descritas.
En un primer aspecto, la invencion se refiere a un procedimiento de obtencion de un biocatalizador, en adelante procedimiento de obtencion de la invencion, que comprende las siguientes etapas:
a) sintetizar parcial o totalmente un material metalo-organico (MOF) en presencia de al menos una enzima, hasta obtener un solido, y
b) aislar el solido sintetizado segun la etapa a),
y donde el MOF sintetizado inmoviliza la enzima, en la mesoporosidad intercristalina formada entre nanocristales o entre nanodominios aglomerados o agregados en partlculas micrometricas.
Es precisamente el hecho de que la inmovilizacion se produza en esta mesoporosidad intercristalina, es decir, en volumenes mesoporosos huecos, estables y ordenados, delimitada por la aglomeracion de nanocristales, a diferencia de la (micro)porosidad intrlnseca a la estructura cristalina de un MOF, lo que le confiere al procedimiento de obtencion de la invencion sus considerables ventajas tecnicas.
El documento de Sanchez-Sanchez et al. (Green Chem. 2015, 17, 1500)de los propios
inventores, reivindica un procedimiento de preparation de MOFs, que se preparan en agua y
a temperatura ambiente utilizando sales como fuente de los ligandos organicos o, en su
defecto, de la forma protonada de los correspondientes ligandos organicos previamente
desprotonada por la accion de una base. Estos MOFs, que son los que se usan como base
en la presente invencion, se caracterizan por carecer de poros intercristalinos
7
5
10
15
20
25
30
suficientemente grandes para encapsular biomoleculas del tamano de las enzimas. Ademas, los cristales que forman estos materiales son nanocristalinos con una gran tendencia a aglomerarse o agregarse entre si en el medio de reaccion, dando lugar a partlculas lo suficientemente compactas como para poder considerarse no disgregables en sus cristales o dominios cristalinos, y que contienen mesoporos entre los cristales, lo que potencialmente cubre los tamanos requeridos para albergar un amplio rango de enzimas en su interior.
En la presente invention por “mesoporosidad intercristalina” se entiende la presencia en el MOF de al menos un, y preferentemente mas de uno, volumen hueco intercristalino, estable, ordenado y en el rango de los mesoporos, que se establece entre partlculas formadas por aglomeracion o agregacion de cristales o dominios de partlculas nanoporosas de tamano homogeneo, lo suficientemente compactas como para poder considerarse no disgregables en sus cristales o dominios cristalinos.
Segun la clasificacion de la IUPAC y en el contexto de esta patente, se entiende por mesoporo todo volumen hueco en un material cuyo diametro esta comprendido entre 2 y 50 nm, que preferentemente tendran una distribution de poro que se ajuste a las dimensiones de la enzima a inmovilizar (en el caso de la p-glucosidasa con valores cercanos a 10 nm). A los poros por debajo de 2 nm se les denomina microporos.
La mesoporosidad intercristalina en partlculas solidas, a diferencia de la porosidad intrlnseca a la estructura cristalina, es la generada por la aglomeracion o agregacion de cristales. Por tanto, tiene una distribucion de poro mucho mas ancha que la Intrinseca y, mas importante, esta bajo control experimental pues depende de la modification de las condiciones de preparation del MOF, y por lo tanto, puede cubrir la totalidad de los tamanos requeridos para albergar cualquier tipo de enzima en su interior.
Por “biocatalizador” se entiende el solido que se sintetiza en la etapa a) y que se alsla en la etapa b) del procedimiento de obtencion de la invencion, y que es un material compuesto que comprende, un soporte MOF y al menos una enzima, que se inmoviliza en la mesoporosidad intercristalina del MOF durante la slntesis total o parcial del mismo.
Por “MOF o material metalo-organico” se entiende un material hlbrido organico-inorganico en el que atomos metalicos o metaloides o clusteres de esos atomos se enlazan entre si a
5
10
15
20
25
30
traves de ligandos organicos, al menos bidentados, para dar lugar a redes cristalinas tridimensionales porosas. El metodo es aplicable a cualquier MOF preparado con ligandos organicos que contienen preferentemente grupos carboxllicos a traves de los que se coordina a los metales. Preferentemente, los materiales MOF usados son el MIL-53(Al), su homologo estructural NH2-MIL-53(Al) y el Mg-MOF-74, todos ellos de pequeno tamano de partlcula. En los dos primeros casos, los atomos metalicos que forman en MOF son Al (como Al3+) y los ligandos organicos son tereftalato o 2-amino-tereftalato, respectivamente. En el caso del Mg-MOF-74, el metal es Mg (con carga formal 2+) y el ligando es 2,5- dihidroxitereftalato.
Por “inmovilizacion” se entiende, en este documento, la sujecion de al menos una enzima, y preferentemente mas de una, preferentemente en la mesoporosidad intercristalina del material MOF, y que se favorece frente a otras como el embebimiento. Por “embebimiento” se entiende la inmovilizacion de la enzima al ser atrapada por cristales de MOF en el proceso de crecimiento cristalino, de forma que en el biocatalizador final queda accesible unicamente a traves de los (micro)poros intrlnsecos del MOF.
Preferentemente, la slntesis del MOF de la etapa a) del procedimiento de obtencion de la invention comprende la mezcla, en presencia de al menos una enzima, de dos disoluciones, una primera disolucion o disolucion de una fuente metalica, que preferentemente tiene un pH acido, y otra segunda disolucion o disolucion del ligando organico.
En el ambito de la invencion por “primera disolucion o disolucion de fuente metalica” se entiende una disolucion de una sal metalica, preferentemente en un disolvente polar como el agua. Ejemplos de disolucion de fuente metalica que se incluyen en el ambito de la invencion son una disolucion acuosa de una sal de aluminio, o una disolucion de una sal de magnesio en N,N-dimetilformamida, y preferentemente disoluciones de nitrato de aluminio nonahidratado o de acetato de Mg tetrahidratado.
Por “segunda disolucion o disolucion de ligando organico” se entiende una disolucion de la fuente de ligando organico, ya sea una sal o el acido, en un disolvente preferentemente en un disolvente polar como el agua. Si se usa el acido como fuente organica en agua se necesita un agente desprotonante. Ejemplos de disolucion de ligando organico que se incluyen en el ambito de la invencion son disolucion acuosa de ligandos organicos que
5
10
15
20
25
30
contienen al menos dos grupos de acidos carboxliicos por molecula y preferentemente acido 2-aminotereftalico o acido 2,5-dihidroxitereftalico.
El procedimiento de obtencion de la invention se puede lleva a cabo utilizando disoluciones acuosas, disoluciones organicas o disoluciones que son mezcla acuosas-organicas.
Preferentemente, la segunda disolucion se selecciona entre una disolucion acuosa de una sal de ligando organico o un ligando organico protonado en presencia de un agente desprotonante, con un pH (preferentemente neutro o basico) que al menos garantice la desprotonacion o activation de dos grupos funcionales que se han de coordinar posteriormente a metales para formar los materiales MOF.
Por su parte, el agente desprotonante se selecciona, preferentemente, de entre una base fuerte, una base media o una base debil. Ejemplos de base fuerte que se incluyen en el ambito de la invencion son los hidroxidos alcalino y preferentemente el hidroxido de sodio. Ejemplos de base media que se incluyen en el ambito de la invencion son las aminas, preferentemente la trietilamina. Ejemplo de base debil que se incluyen en el ambito de la invencion es el hidroxido de amonio o amoniaco.
Por “enzima” se entiende cualquier molecula de naturaleza proteica que cataliza reacciones qulmicas. Puede ser inmovilizada, y el biocatalizador puede ser utilizado en el ambito de la industria (qulmica, farmaceutica o alimentaria, entre otras), preferentemente respecto a la enzima soluble. Ejemplos de enzimas que pueden utilizarse en la invencion son cualquiera de las enzimas existentes en la naturaleza, con muy diversas actividades catallticas. Preferentemente, la enzima es p-glucosidasa.
El procedimiento de la invencion prefiere temperatura entre 4 y 70 °C, y preferentemente entre 20 y 30 °C, es decir aquellas demandadas por las enzimas para conservar su estructura y, por ende, su actividad catalltica.
La enzima se anade en el transcurso de la slntesis del MOF segun la etapa a) del procedimiento de obtencion de la invencion, una vez que las dos disoluciones se han mezclado, para evitar las condiciones que le puedan ser adversas. Sin embargo, tambien es posible anadir la enzima sobre cualquiera de las dos disoluciones atendiendo a que la
5
10
15
20
25
30
35
viabilidad de la enzima (especialmente actividad catalltica) se resienta lo menos posible, es decir, preferentemente, la enzima se anade sobre la disolucion cuyo pH este mas proximo a la estabilidad enzimatica, que vaya a sufrir menos cambios (abruptos) de pH o que no contengan especies qulmicas que puedan favorecer la desnaturalizacion de la enzima o la inactivacion de sus centros activos. La enzima se anade en cualquiera de los formatos conocidos en el estado de la tecnica, y preferentemente como una disolucion acuosa procedente de un extracto, que puede comprender otras sustancias qulmicas. Esas sustancias qulmicas o la propia enzima pueden afectar diferentes aspectos de la slntesis del MOF, tales como el tamano de partlcula (y, por tanto, de los poros intercristalinos), la cinetica del proceso o la presencia o abundancia de impurezas formadas, o la actividad catalltica de la enzima inmovilizada.
Preferentemente, una de las disoluciones que se utilizan para la slntesis del MOF segun la etapa a) del procedimiento de obtencion de la invention se anade gota a gota sobre la otra, manteniendo el sistema bajo agitation. Esta adicion conlleva la formation de un solido bien sea durante el transcurso de la adicion o tras un tiempo que puede llegar a alcanzar desde 1 segundo hasta las 350 h. El solido formado es el biocatalizador, que comprende parte o la totalidad de la enzima, y se separa de la mezcla de reaction en la etapa b) del procedimiento de obtencion de la invencion preferentemente por centrifugation o por filtracion tras un tiempo, comprendido entre 1 segundo y 200 horas despues de terminar la adicion de una disolucion sobre la otra.
El procedimiento de obtencion de la invencion incluye la posibilidad de utilization simultanea de distintas enzimas. As! por ejemplo, es factible emplear mas de una clase distinta de enzima de las que se citan en este documento.
Alternativamente, el procedimiento de obtencion de la invencion comprende una etapa adicional o etapa c) que comprende el secado del solido aislado segun la etapa b) bajo condiciones compatibles con la conservation de la estructura y propiedades de la enzima incluyendo la actividad catalltica.
En una realization particular del procedimiento de obtencion de la invencion, la disolucion de
la fuente metalica es una disolucion acuosa de nitrato de aluminio nonahidratado, la
disolucion del ligando organico es una disolucion acuosa de acido 2-aminotereftalico, el
agente desprotonante se selecciona entre trietilamina, hidroxido sodico y amonlaco, la
11
5
10
15
20
25
30
enzima es p-glucosidasa de Aspergillus niger que se anade sobre la disolucion del ligando organico y la temperatura de reaccion es 25 °C.
En otra realization particular del procedimiento de obtencion de la invention, la disolucion de la fuente metalica es una disolucion de acetato de Mg tetrahidratado sobre N,N- dimetilformamida, la disolucion del ligando organico es una disolucion acido 2,5- dihidroxitereftalico sobre N,N-dimetilformamida, la enzima es p-glucosidasa de Aspergillus niger que se anade sobre la disolucion de la fuente metalica y la temperatura de reaccion es 25 °C. En esta realizacion, se consigue la estabilizacion de la estructura de la enzima y el mantenimiento de su actividad catalltica durante 48 horas, mientras que la misma enzima en estado libre en el mismo reactivo es completamente inactiva tras pocos minutos.
Adicionalmente, el procedimiento de obtencion de la invencion puede comprender otra etapa en la que el solido aislado segun la etapa b) o secado segun la etapa c) se expone nuevamente a al menos una enzima, para incrementar la carga enzimatica del mismo utilizando un procedimiento de inmovilizacion post-slntesis, ya que en el procedimiento de inmovilizacion in-situ las enzimas podrlan hacer de agente mesoporogeno, creando mesoporos de mayor tamano.
El efecto tecnico conseguido en los biocatalizadores obtenidos por el procedimiento de obtencion de la invencion queda de manifiesto a traves de las tecnicas de caracterizacion flsico-qulmica y bioqulmica que se recogen en los Ejemplos 1 a 6, singularmente en lo referente a la alta cantidad de enzima inmovilizada, a la alta capacidad de retention de la enzima y la reduction de la merma de la eficiencia catalltica con respecto a la de la biomolecula sin inmovilizar. La alta eficiencia de inmovilizacion enzimatica se basa en el hecho de que la formation del material MOF se da preferentemente por la formation instantanea de una disolucion coloidal al mezclarse la disolucion metalica y la disolucion de ligando organico, como consecuencia del gran numero de nucleos de MOFs que precipitan o cristalizan al encontrase el cation metalico y el anion organico. Precisamente por estar tan favorecida la nucleacion, los nucleos son abundantes y apenas crecen porque el metal y el ligando organico se agotan en la formacion del resto de nucleos, formandose as! nanopartlculas en suspension con aspecto de coloide. El posterior aislamiento del solido de la disolucion preferentemente por centrifugation, hace que la enzima tambien se recupere en el solido, lo que unido a la afinidad entre la biomolecula y el material MOF puede dar
5
10
15
20
25
30
altas cargas de biomoleculas inmovilizadas, de hasta el 100 % de la enzima presente en el medio.
En un segundo y ultimo aspecto, la invencion se refiere al biocatalizador directamente obtenido por el procedimiento de la invencion.
BREVE DESCRIPCION DEL CONTENIDO DE LAS FIGURAS
Figura 1. Difractogramas de rayos X de polvo normalizados de la muestra de NH2-MIL- 53(Al) (gris) y del biocatalizador p-Glu@NH2-MIL-53(Al)-NaOH-24h (negro).
Figura 2. Termogramas (llneas solidas) y sus derivadas (llneas discontinuas) del extracto de enzima soluble de p-Glu (gris claro), del material MOF NH2-MIL-53(Al) preparado en ausencia de enzima (gris), y del biocatalizador p-Glu@NH2-MIL-53(Al)-NaOH-24h (negro).
Figura 3. Difractogramas de rayos X de polvo normalizados de la muestra de NH2-MIL- 53(Al) (gris) y del biocatalizador p-Glu@NH2-MIL-53(Al)-TEA-48h (negro).
Figura 4. Termogramas (llneas solidas) y sus derivadas (llneas discontinuas) del extracto de enzima soluble de p-Glu (gris) y del biocatalizador p-Glu@NH2-MIL-53(Al)-TEA-48h (negro).
Figura 5. Difractogramas de rayos X de polvo normalizados de los biocatalizadores p- Glu@NH2-MIL-53(Al)-NH3-1h (gris) y -24h (negro).
Figura 6. Termogramas (llneas solidas) y sus derivadas (llneas discontinuas) del extracto de enzima soluble de p-Glu (gris) y del biocatalizador p-Glu@NH2-MIL-53(Al)-NH3-24h (negro).
Figura 7. Difractogramas de rayos X de polvo normalizados del material Mg-MOF-74 (gris) y del biocatalizador p-Glu@Mg-MOF-74-24h (negro).
Figura 8. Gel de electroforesis de: 1) referencia de alto peso molecular; 2) extracto soluble de la enzima p-Glu; 3) biocatalizadores p-Glu@NH2-MIL-53(Al)-NaOH-1h; 4) p-Glu@NH2- MIL-53(Al)-NaOH-24h; 5) p-Glu@NH2-MIL-53(Al)-TEA-2h; 6) p-Glu@NH2-MIL-53(Al)-TEA-
5
10
15
20
25
30
48h; 7) p-Glu@Mg-MOF-74-2h; 8) p-Glu@Mg-MOF-74-24h; 9) p-Glu@NH2-MIL-53(Al)-NH3- 1h; y 10) p-Glu@NH2-MIL-53(Al)-NH3-24h.
Figura 9. Gel de electroforesis de: 1) referenda de alto peso molecular; 2) extracto soluble de la enzima p-Glu; 3) biocatalizador p-Glu@Mg-MOF-74-5min; 4) p-Glu@Mg-MOF-74-20h.
Figura 10. Esquema de la reaccion test catalltica de hidrolisis de pNPG en presencia de la enzima p-glucosidasa.
MODOS DE REALIZACION DE LA INVENCION
Ejemplo 1. Procedimiento de obtencion de un biocatalizador p-Glu@NH2-MIL-53(Al)- NaOH-24h, que comprende la sintesis del sistema NH2-MIL-53(Al) utilizando NaOH como agente desprotonante y en presencia de la enzima p-Glucosidasa
En este ejemplo se muestra como obtener un biocatalizador inmovilizando la enzima p- glucosidasa de Aspergillus niger (P-glu) durante la formation del sistema MOF NH2-MIL- 53(Al) en el que se utilizo como base hidroxido sodico (NaOH). La enzima p-Glucosidasa de Aspergillus niger presenta unas dimensiones aproximadas de ~12,3 nm x ~10.7 nm x ~8,1 nm, un peso molecular ~240 KDa, y un punto isoelectrico 4,2.
La primera disolucion se preparo con 2,005 g de nitrato de aluminio nonahidratado (Al(NO3)39H2O) (fuente metalica) y 6,012 g de agua desionizada, dando un pH de 2,0. Por otro lado, la segunda disolucion se preparo con 0,483 g del ligando organico acido 2- aminotereftalico NH2-H2BDC, 5,206 g de disolucion 1 M de NaOH y 10,462 g de agua desionizada, dando una disolucion clara en pocos minutos con un pH de 6,1. A continuation, sobre la segunda disolucion se anadieron 2,75 ml de extracto enzimatico de p-Glucosidasa (EC 3.2.1.21) de Novozymes, suministrada como preparation enzimatica llquida (Novozym 188), con una concentration del extracto de p-Glucosidasa medida mediante analisis Bradford de 14,54 mg/ml, lo que modifico el pH hasta 5,6. Seguidamente, la primera disolucion se anadio sobre la segunda disolucion, bajo agitation, lo que provoco la formacion de un solido amarillento en suspension practicamente de inmediato y a temperatura ambiente (25 °C), dando un pH de 3,1. Al cabo de un tiempo que oscilo entre 1 y 24 horas, se tomaron diferentes alicuotas (suspension), de las que se separo el
5
10
15
20
25
30
biocatalizador denominado p-Glu@NH2-MIL-53(Al)-NaOH-nh, del sobrenadante (disolucion) por centrifugacion (13.400 rpm durante 90 segundos).
Se midio la actividad catalltica tanto de la suspension como del sobrenadante en la hidrolisis de para-nitrofenil-beta-D-glucopiranosido (pNPG) 10 mM disuelto en tampon acido fosforico / citrato trisodico 0,1 M pH 5,0, para dar p-nitrofenol y beta-D-glucosa. La actividad catalltica se midio por espectrofotometrla a 405 nm, con un espectrofotometro diodo array (Agilent 8453 UV-Vis) provisto de termostatizacion y de un dispositivo de agitacion magnetica para mantener las muestras en suspension homogenea durante los ensayos. La actividad enzimatica se midio en todo caso por el aumento de absorbancia por minuto a 405 nm producido por la liberation de p-nitrofenol debida a la action de la enzima p-glucosidasa (Figura 10) a 35 °C y a un pH de 5,0. Para ello, sobre las cubetas de ensayo conteniendo 1,5 ml de tampon a pH 5,0 y 0,5 ml de pNPG 10 mM, se anadieron 100 pl de enzima soluble o 100 pl de la suspension, o 100 pl del sobrenadante o 100 pl de una resuspension de p- glucosidasa inmovilizada. El coeficiente de extincion molar del p-nitrofenol medido en estas condiciones fue de 240 M-1cm-1.
Cuando la actividad catalltica de los sobrenadantes obtenidos a partir de alicuotas tomadas a diferentes tiempos se mantuvo constante o nula, se dio por finalizado el proceso de inmovilizacion de la enzima. La concentracion de enzima no inmovilizada presente en el sobrenadante as! como en la disolucion enzimatica inicial se determinaron mediante analisis Bradford.
Una vez finalizado el seguimiento de la inmovilizacion (tras 24 horas), el solido restante se filtro a vaclo utilizando una placa Vidra FOC (666/1) de tamano de poro 4 y papel de filtro Millipore 0,45 pm HV. El biocatalizador obtenido una vez seco, pesado y molido, se resuspendio (10 mg en 5 mL de buffer) y se ensayo su actividad catalltica en la misma reaccion anteriormente indicada.
En la Tabla 1 se muestra el porcentaje de enzima p-Glu inmovilizada, determinada mediante analisis de Bradford midiendo la concentration de protelna inicial en la disolucion enzimatica y de protelna en el sobrenadante al cabo de 1 y 24 horas. Al cabo de 1 h, se inmovilizo el 33 % de la enzima presente en el medio, mientras que al cabo de 24 h se inmovilizo el 96 % de la enzima. Estos porcentajes de inmovilizacion enzimatica evolucionaron en paralelo con la
5
10
15
20
25
30
presencia de la fase NH2-MIL-53(Al) en el solido recuperado, que con el tiempo fue creciendo progresivamente en detrimento de la fase correspondiente al ligando organico protonado (Sanchez-Sanchez et al., Green Chem. 2015, 17, 1500), lo que evidencio que es la fase MOF y no la fase puramente organica la que contribuye a la inmovilizacion de la enzima.
Tabla 1. Porcentajes de inmovilizacion (por analisis Bradford); carga enzimatica, actividad catalltica y eficiencia catalltica (por espectrofotometrla); y contenido de azufre (por analisis qulmico elemental CHNS) de los biocatalizadores p-Glu@NH2-MIL-53(Al)-NaOH-1h y -24h.
Muestraa
Enzima inmovilizada (%)b / Sd (%) Actividad Eficiencia
Carga enzimatica (mg/g)c catallticae catallticaf
1 h
33 / 28 -g 6 0,21
24 h
96 / 79 0,14 31 0,39
a La muestra se designa como nh (numero de horas de slntesis) del biocatalizador p- Glu@NH2-MIL-53(Al) -NaOH-nh.
b Porcentaje de enzima inmovilizada en el solido frente al total de enzima anadido. c mg de enzima por g de biocatalizador.
d Porcentaje de S en la muestra segun analisis elemental CHNS.
e Actividad catalltica (expresada en unidades de actividad U por g de biocatalizador y calculada segun la ecuacion 2), en la hidrolisis de para-nitrofenil-beta-D-glucopiranosido liberando paranitrofenol.
f Eficiencia catalltica (expresada en unidades de actividad U por mg de enzima y calculada segun la ecuacion 3) en la hidrolisis de para-nitrofenil-beta-D-glucopiranosido liberando paranitrofenol. g No medido.
La carga enzimatica (Tabla 1) se determino a partir de los miligramos de protelna en el medio de slntesis (calculada a partir de analisis Bradford) y de los gramos de biocatalizador obtenido despues de filtrar la disolucion final de slntesis. Se expresa como mg de protelna/g de biocatalizador recuperado. La presencia de enzima en el biocatalizador tambien se detecto cualitativamente mediante analisis qulmico elemental CHNS (Tabla 1), que da los contenidos de carbono, hidrogeno, nitrogeno y azufre. Estos analisis se llevaron a cabo en
5
10
15
20
25
30
un equipo Analizador Elemental LECO CHNS-932. La presencia/ausencia de azufre en el biocatalizador es particularmente informativa por formar parte de la enzima y no del material MOF estudiado. En buen acuerdo con lo estimado a partir del metodo Bradford, en el biocatalizador p-Glu@NH2-MIL-53(Al)-NaOH-24h el contenido de azufre fue 0,14%.
Adicionalmente, la Tabla 1 tambien muestra la actividad catalltica (expresada en U/g biocatalizador) y la eficiencia catalltica (en U/mg de protelna) del biocatalizador obtenido tras ser resuspendido y calculadas a partir de las ecuaciones 2 y 3 siguientes, respectivamente.
A(U/mL} =
pta (flfllqflnfci) » VMBHfaCml^ »1HHH
A (tt/s btorat)
sUota0nL
A (C/lH£ P«fc) =
AQS/g bipeat;}
CaisaamkifiJcH (mg prot/g aoporte)
donde U son las unidades de actividad catalltica de la enzima definidas como transformation de 1 pmol de sustrato por minuto.
Por otra parte, el biocatalizador p-Glu@NH2-MIL-53(Al)-NaOH-24h obtenido, una vez seco, se caracterizo con diversas tecnicas flsico-qulmicas, tales como la difraccion de rayos X de polvo usando un difractometro de rayos X Policristal X'Pert Pro PANalytical, para su identification estructural. La Figura 1 compara los difractogramas de rayos X de polvo del biocatalizador p-Glu@NH2-MIL-53(Al)-NaOH-24h y del MOF homologo en ausencia de enzima. El difractograma del material que no contuvo enzima es el tlpico de un NH2-MIL- 53(Al) nanocristalino preparado a temperatura ambiente (Sanchez-Sanchez et al., Green Chem. 2015, 17, 1500). La adicion del extracto enzimatico hizo que aparecieran algunos picos estrechos e intensos, que se han atribuido al ligando protonado NH2-H2BDC, en consonancia con la bajada del pH que provoca esa adicion en la mezcla global. La nanocristalinidad es condicion indispensable para que las particulas formadas por su agregacion contengan porosidad intercristalina en el rango de los mesoporos.
5
10
15
20
25
30
Finalmente, tambien se registro el termograma (TGA) y se calculo su derivada (DTG) del MOF NH2-MIL-53(Al) sin enzima, del biocatalizador p-Glu@NH2-MIL-53(Al)-NaOH-24h y del extracto de la enzima p-Glu, en un equipo Perkin-Elmer TGA7 con un barrido de temperaturas de 20-900 °C a una velocidad de calentamiento de 20 °C/min bajo corriente de aire seco, y su derivada (DTG) se presenta en la Figura 2.
Hubo un 2,9 % de perdida de peso (190-271 °C) en el extracto enzimatico asignado a la enzima. En el biocatalizador p-Glu@NH2-MIL-53(Al)-NaOH-24h, se detecto una perdida global de peso de un 88 %; en el intervalo de temperaturas entre 152-246 °C la perdida de peso fue del 9,5 %, mientras que en el MOF sin enzima no se produjo una perdida de peso apreciable en ese intervalo, lo que sugiere la presencia de enzima en el biocatalizador.
Ejemplo 2. Procedimiento de obtencion del biocatalizador p-Glu@NH2-MIL-53(Al)-TEA- 48h, que comprende la sintesis del sistema NH2-MIL-53(Al) utilizando TEA como agente desprotonante y en presencia de la enzima p-Glucosidasa
En este experimento se muestra como obtener un biocatalizador inmovilizando la misma enzima p-Glucosidasa de Aspergillus niger utilizada en el Ejemplo 1, durante la formation de un sistema MOF NH2-MIL-53(Al) en el que se utiliza como base trietilamina (TEA).
La primera disolucion se preparo con 2,000 g de nitrato de aluminio nonahidratado (Al(NO3)39H2O) (fuente metalica) y 6,030 g de agua desionizada, dando un pH de 2,0. Por otro lado, la segunda disolucion se preparo con 0,483 g del ligando organico acido 2- aminotereftalico NH2-H2BDC, 0,538 g de TEA y 13,246 g de agua desionizada, dando una disolucion clara en pocos minutos con un pH de 6,1. A continuation, sobre la segunda disolucion se anadieron 2,75 mL de extracto enzimatico de p-Glucosidasa (EC 3.2.1.21) de Novozymes, suministrada como preparation enzimatica llquida (Novozym 188), con una concentration del extracto de p-Glucosidasa medida mediante analisis Bradford de 14,54 mg/ml, lo que modifico el pH de la mezcla hasta 5,5. Seguidamente, la primera disolucion se anadio gota a gota sobre la segunda disolucion, bajo agitation, lo que provoco la formacion de un solido amarillento en suspension practicamente de inmediato y a temperatura ambiente (25 °C), dando un pH de 3,1. Al cabo de un tiempo que oscilo entre 5 minutos y 48 horas, se tomaron diferentes alicuotas (suspension), de las que se separo el biocatalizador
5
10
15
20
25
30
denominado p-Glu@NH2-MIL-53(Al)-TEA-nh, del sobrenadante (disolucion) por
centrifugacion(13.400 rpm durante 90 segundos).
Se midio la actividad catalltica, siguiendo los mismos pasos experimentales descritos en el ejemplo 1 anterior, excepto que los tiempos de toma de muestra fueron 2 y 48 horas, respectivamente, para los biocatalizadores p-Glu@NH2-MIL-53(Al)-TEA-2h y -48h.
El uso de TEA como agente desprotonador del ligando organico del MOF tambien resulto en una inmovilizacion eficiente de la enzima p-Glu (el 99 % de la enzima expuesta al cabo de 48 horas se ha encapsulado). La eficiencia catalltica del biocatalizador resultante (0,87 U/mg de enzima) (Tabla 2), fue significativamente superior a la obtenida en el biocatalizador p- Glu@NH2-MIL-53(Al)-NaOH-24h (0,39 U/mg de enzima, Tabla 1), lo que sugiere que bases mas debiles se prefieren a bases fuertes en la desprotonacion del ligando organico del MOF cuando se procede a la inmovilizacion in-situ de la enzima, presumiblemente por la repercursion negativa que estas bases puedan tener en la actividad intrlnseca de la enzima.
En buen acuerdo con lo estimado a partir del metodo Bradford, el contenido de azufre en el biocatalizador p-Glu@NH2-MIL-53(Al)-TEA-48h fue casi cinco veces superior al de su homologo p-Glu@NH2-MIL-53(Al)-TEA-2h (Tabla 2).
Tabla 2. Porcentajes de inmovilizacion (por analisis Bradford); carga enzimatica, actividad catalltica y eficiencia catalltica (por espectrofotometrla); y contenido de azufre (por analisis qulmico elemental CHNS) de los biocatalizadores p-Glu@NH2-MIL-53(Al)-TEA-2h y p- Glu@NH2-MIL-53(Al)-TEA-48h.
Muestraa
Enzima inmovilizada (%)b / Carga enzimatica (mg/g)c Sd (%) Actividad catallticae Eficiencia catallticaf
2h
17 / 18 0,04 40 2,22
48h
99 / 108 0,16 94 0,87
a La muestra se designa como nh (numero de horas de slntesis) del biocatalizador p- Glu@NH2-MIL-53(Al)-TEA-nh.
b Porcentaje de enzima inmovilizada en el solido frente al total de enzima anadido. c mg de enzima por g de biocatalizador.
5
10
15
20
25
30
d Porcentaje de S en la muestra segun analisis elemental CHNS.
e Actividad catalrtica (expresada en unidades de actividad U por g de biocatalizador y calculada segun la ecuacion 2 del Ejemplo 1), en la hidrolisis de para-nitrofenil-beta-D- glucopiranosido liberando paranitrofenol
f Eficiencia catalrtica (expresada en unidades de actividad U por mg de enzima y calculada segun la ecuacion 3 del Ejemplo 1) en la hidrolisis de para-nitrofenil-beta-D-glucopiranosido liberando paranitrofenol
La Figura 3 compara los difractogramas de rayos X de polvo del biocatalizador p-Glu@NH2- MIL-53(Al)-TEA-48h y del MOF homologo obtenido en ausencia de enzima en el medio de smtesis, NH2-MIL-53(Al). Se puede apreciar que la presencia de la enzima p-Glu introdujo cambios en la naturaleza cristalina de la fase MOF formada, de manera que el difractograma obtenido es el tipico de un NH2-MIL-53(Al) nanocristalino ( Sanchez-Sanchez et al., Green Chem. 2015, 17, 1500), con alguna impureza de ligando organico protonado. Puesto que el difractograma del biocatalizador es muy similar al del material MOF sin enzima, particularmente en terminos de anchura de las bandas, su tamano de cristal debe ser tambien muy similar y, por tanto, su mesoporosidad intercristalina.
Finalmente, tambien se determino el termograma (TGA) y su derivada (DTG) del biocatalizador p-Glu@NH2-MIL-53(Al)-TEA-48h y del extracto de la p-Glu, que se presenta en la Figura 4. En la curva TGA del extracto enzimatico, se pueden diferenciar dos perdidas de peso globales: la primera entre 30 y 190 °C (87,1 %), que se atribuye al agua, y la segunda entre 190 y 271 °C (2,9 %), que se atribuye a la enzima. En el termograma del biocatalizador p-Glu@NH2-MIL-53(Al)-TEA-48h, se detecta la perdida de peso que se produjo entre 166 y 242 °C (7 %), que por analogia con el del extracto enzimatico, se asigna a la perdida de la enzima.
Ejemplo 3. Procedimiento de obtencion del biocatalizador p-Glu@NH2-MIL-53(Al)-NH3- 24h, que comprende la smtesis del sistema NH2-MIL-53(Al) utilizando NH3 como agente desprotonante y en presencia de la enzima p-Glucosidasa
En este experimento se muestra como obtener un biocatalizador inmovilizando la misma enzima p-Glucosidasa de Aspergillus niger de los ejemplos anteriores, durante la formacion de un sistema MOF NH2-MIL-53(Al) en el que se utiliza como base NH3.
5
10
15
20
25
30
La primera disolucion se preparo con 2,041 g de nitrato de aluminio nonahidratado (Al(NO3)39H2O) (fuente metalica) y 6,023 g de agua desionizada. Por otro lado, la segunda disolucion se preparo con 0,482 g del ligando organico acido 2-aminotereftalico NH2-H2BDC, 0,362 g de disolucion acuosa de NH3 al 25 % y 10,008 g de agua desionizada. La mezcla a temperatura ambiente (25 °C) tardo varias horas en alcanzar la disolucion, que finalmente fue anaranjada. A continuation se anadieron 2,75 ml de extracto enzimatico (concentration = 14,54 mg enz/ml) sobre la segunda disolucion y despues se anadio la primera disolucion sobre la mezcla de la segunda disolucion y la enzima.
Al cabo de una hora, se tomo una muestra, que se centrifugo a 13400 rpm durante 90 segundos. Se separo el sobrenadante para medir su actividad enzimatica y la concentracion de protelnas mediante analisis Bradford de igual forma que en los ejemplos anteriores. El solido restante se filtro a vaclo, obteniendo el solido seco que se etiqueto como p-Glu@NH2- MIL-53(Al)-NH3-1h, se peso, se molio y se resuspendio para medir su actividad enzimatica. Al cabo de 24 h se centrifugo el resto de la muestra y se filtro a vaclo. Se separo el sobrenadante, y el solido seco se etiqueto como p-Glu@NH2-MIL-53(Al)-NH3-24h.
En este caso la eficiencia catalltica de los biocatalizadores p-Glu@NH2-MIL-53(Al)-NH3-nh supero la de cualquier otro biocatalizador descrito en los ejemplos anteriores, lo que de nuevo sugiere que bases menos fuertes (el amonlaco es menos fuerte que la amina TEA) afecta menos a la actividad intrlnseca de la enzima.
Tabla 3. Porcentajes de inmovilizacion (por analisis Bradford); carga enzimatica, actividad catalltica y eficiencia catalltica (por espectrofotometrla); y contenido de azufre (por analisis qulmico elemental CHNS) de los biocatalizadores p-Glu@NH2-MIL-53(Al)-NH3-1h y -24h.
Muestraa
Enzima inmovilizada (%)b / Sd (%) Actividad Eficiencia
Carga enzimatica (mg/g)c catallticae catallticaf
1h
- / -g -g 18 0,03
24h
98 / 56 0,13 51 0,91
a La muestra se designa como nh (numero de horas de slntesis) del biocatalizador p- Glu@NH2-MIL-53(Al)-NH3-nh.
5
10
15
20
25
30
b Porcentaje de enzima inmovilizada en el solido frente al total de enzima anadido. c mg de enzima por g de biocatalizador.
d Porcentaje de S en la muestra segun analisis elemental CHNS.
e Actividad catalltica (expresada en unidades de actividad U por g de biocatalizador y calculada segun la ecuacion 2 del Ejemplo 1), en la hidrolisis de para-nitrofenil-beta-D- glucopiranosido liberando paranitrofenol.
f Eficiencia catalltica (expresada en unidades de actividad U por mg de enzima y calculada segun la ecuacion 3 del Ejemplo 1) en la hidrolisis de para-nitrofenil-beta-D-glucopiranosido liberando paranitrofenol. g No medido.
La Figura 5 muestra los difractogramas de rayos X de los biocatalizadores p-Glu@NH2-MIL- 53(Al)-NH3-1h y -24h. En los dos difractogramas se identifican dos fases: la correspondiente a un NH2-MIL-53(Al) nanocristalino con mesoporosidad intercristalina y la del ligando organico NH2-H2BDC. Como ocurre en los ejemplos anteriores, la fase NH2-MIL-53(Al) fue aumentando en detrimento de la NH2-MIL-53(Al) con el tiempo de slntesis.
Por su parte, la Figura 6 muestra los perfiles termogravimetricos (TG) del biocatalizador p- Glu@NH2-MIL-53(Al)-NH3-24h y el extracto enzimatico de p-glucosidasa. En el biocatalizador, hay una perdida global de peso de un 88 %; en el intervalo de temperaturas entre 187-278 °C la perdida de peso es del 18,2 %.
La secuencia de los ejemplos experimentales 1, 2 y 3 pone de manifiesto como el cambio de la naturaleza de la base usada para desprotonar el ligando organico acido 2-amino-terftalico (NH2-H2BDC), que forma el MOF NH2-MOF-53(Al) nanocristalino a temperatura ambiente y en agua por simple contacto con una disolucion acuosa de Al, afecta a la eficiencia de inmovilizacion de la enzima p-Glucosidasa de Aspergillus niger. No menos importante, tambien afecta a la actividad catalltica por unidad enzimatica inmovilizada, presumiblemente como consecuencia de la influencia de estos parametros en las propiedades flsico-qulmicas del soporte MOF tales como superficie especlfica, tamano y distribution de los poros intercristalinos, o tamano de los aglomerados o agregados de los nanocristales.
5
10
15
20
25
30
Ejemplo 4. Procedimiento de obtencion del biocatalizador p-Glu@Mg-MOF-74-24h, que comprende la sintesis del sistema Mg-MOF-74 utilizando N,N-dimetilformamida como disolvente y en presencia de la enzima p-Glucosidasa.
En el presente experimento se muestra como obtener un biocatalizador inmovilizando la enzima p-Glu durante la formation del sistema MOF-74 nanocristalino preparado con Mg a temperatura ambiente (25 °C) en N,N-dimetilformamida (DMF) como disolvente, y que en ausencia de enzima contiene una aceptable mesoporosidad ordenada (Dlaz-Garcla et al., Cryst. Growth Des., 2014, 14, 2479).
Para obtener la primera disolucion se anadieron 0,561 g de acetato de Mg tetrahidratado sobre 10,013 g de DMF, que se disolvieron en pocos minutos. Por otro lado, para obtener la segunda disolucion se disolvieron 0,202 g de acido 2,5-dihidroxitereftalico (dhtp) en 10,021 g de DMF. Sobre la primera disolucion se anadio 0,5 ml del mismo extracto enzimatico conteniendo p-Glu en una concentration de 14,54 mg enzima/ml de los ejemplos anteriores, e inmediatamente la segunda disolucion gota a gota. Se tomo una muestra a las 2 horas y se centrifugo durante 15 segundos a 12.500 rpm obteniendo as! el sobrenadante. El solido se filtro a vaclo y se etiqueto como p-Glu@Mg-MOF-74-2h. La reaction se prolongo durante 24 horas, tras la que se recupero segun el mismo procedimiento el biocatalizador solido p- Glu@Mg-MOF-74-24h.
En este caso no se anadio ninguna base porque no se necesito la previa desprotonacion del ligando organico para la formacion del MOF-74 a temperatura ambiente (Dlaz-Garcla et al., Cryst. Growth Des., 2014, 14, 2479).
La Tabla 4, ademas de ratificar la presencia de la enzima p-Glu en los biocatalizadores p- Glu@Mg-MOF-74, indica que esa enzima conservo cierta actividad catalltica a pesar de haber estado en DMF, medio que le es muy adverso, tal como se pone de manifiesto en la perdida total de la actividad del extracto enzimatico en DMF durante 10 minutos. Esto sugiere que el material Mg-MOF-74, en este caso, no fue un simple anfritrion de la enzima p- Glu que inmoviliza, sino que ademas de alguna forma le ayudo a conservar su actividad enzimatica frente al disolvente inhibidor de esa actividad, DMF. Por otra parte, la eficiencia de inmovilizacion enzimatica fue altlsima desde los primeros minutos, probablemente como consecuencia de que la mezcla de disoluciones de metal y ligando organico provoco la
5
10
15
20
25
formation de una suspension practicamente coloidal, que dejo pocas posibilidades a la enzima para no formar parte del solido, una vez recuperado el material MOF.
Tabla 4. Porcentajes de inmovilizacion (por analisis Bradford); carga enzimatica, actividad catalltica y eficiencia catalltica (por espectrofotometrla); y contenido de azufre (por analisis qulmico elemental CHNS) del extracto enzimatico tras someterse en una disolucion de DMF durante 10 minutos, y de los biocatalizadores p-Glu@Mg-MOF-74-2h y -24h.
Muestraa
Enzima inmovilizada (%)b / Sd (%) Actividad Eficiencia
Carga enzimatica (mg/g)c catallticae catallticaf
2h
86 / 112 -g 18 0,16
24h
86 / 113 0,10 7 0,06
P-Gluh
0 0,00
a La muestra se designa como nh (numero de horas de slntesis) del biocatalizador p- Glu@Mg-MOF-74-nh
b Porcentaje de enzima inmovilizada en el solido frente al total de enzima anadido. c mg de enzima por g de biocatalizador.
d Porcentaje de S en la muestra segun analisis elemental CHNS.
e Actividad catalltica (expresada en unidades de actividad U por g de biocatalizador y calculada segun la ecuacion 2 del Ejemplo 1), en la hidrolisis de para-nitrofenil-beta-D- glucopiranosido liberando paranitrofenol.
f Eficiencia catalltica (expresada en unidades de actividad U por mg de enzima y calculada segun la ecuacion 3 del Ejemplo 1) en la hidrolisis de para-nitrofenil-beta-D-glucopiranosido liberando paranitrofenol. g No medido.
h Extracto de la enzima p-Glu tras 10 minutos en DMF.
En la Figura 7 se comparan los difractogramas de un Mg-MOF-74 preparado a temperatura ambiente segun se ha publicado (Dlaz-Garcla et al., Cryst. Growth Des., 2014, 14, 2479), pero conteniendo 0,5 ml de agua para igualar la anadida con el extracto enzimatico, y del biocatalizador p-Glu@Mg-MOF-74-2h. Los dos difractogramas son tlpicos de una estructura MOF-74 de muy pequeno tamano de cristal, y que contiene una mesoporosidad intercristalina.
5
10
15
20
25
Ejemplo 5. Procedimiento de obtencion del biocatalizador p-Glu@Mg-MOF-74-20h, que comprende la sintesis del sistema Mg-MOF-74 utilizando N,N-dimetilformamida y en presencia de una mayor cantidad de enzima que el Ejemplo 4.
En este experimento se repiten las mismas condiciones que en el Ejemplo 4, con la diferencia de que se utiliza una mayor cantidad de la enzima p-Glu. Para la primera disolucion se anadieron 0,566 g de acetato de Mg tetrahidratado sobre 10,015 g de DMF, que se disolvieron en pocos minutos. Por otro lado, se disolvieron 0,211 g de acido 2,5- dihidroxitereftalico (dhtp) en 10,013 g de DMF para formar la segunda disolucion. Sobre la primera disolucion, se anadieron 0,5 ml de extracto enzimatico, conteniendo p-Glu en una concentration de 24,76 mg enzima/ml, e inmediatamente la segunda disolucion gota a gota.
Se tomo una muestra a los 5 minutos y se centrifugo durante 15 segundos a 12500 rpm obteniendo asl el sobrenadante. El solido se filtro a vaclo y se etiqueto como p-Glu@Mg- MOF-74 -5min. La reaction se prolongo durante 20 horas, tras la que se recupero segun el mismo procedimiento el biocatalizador solido p-Glu@Mg-MOF-74-20h.
La Tabla 5 indica que cuando se tuvieron en el medio de reaccion mas cantidad de enzima (12,8 mg de enzima frente a 7,27 mg en el Ejemplo 4) se alcanzaron porcentajes de inmovilizacion enzimatica superiores (93 % en el ejemplo 5 frente al 86 % en el Ejemplo 4), lo que indica que no se ha alcanzado la saturation del sistema, es decir, potencialmente se podrla seguir incrementando la cantidad de enzima ofrecida en el medio.
Tabla 5. Porcentajes de inmovilizacion (por analisis Bradford); carga enzimatica, actividad catalltica y eficiencia catalltica (por espectrofotometrla); y contenido de azufre (por analisis qulmico elemental CHNS) de los biocatalizadores p-Glu@Mg-MOF-74 -5min y -20h.
Muestraa
Enzima inmovilizada (%)b / Sd (%) Actividad Eficiencia
Carga enzimatica (mg/g)c catallticae catallticaf
5min
93 / 79 -g 2 0,02
20h
92 / 276 0,33 4 0,01
5
10
15
20
25
30
a La muestra se designa como nmin o nh (numero de minutos/horas de slntesis) del biocatalizador p-Glu@Mg-MOF-74-nmin -nh.
b Porcentaje de enzima inmovilizada en el solido frente al total de enzima anadido. c mg de enzima por g de biocatalizador.
d Porcentaje de S en la muestra segun analisis elemental CHNS.
e Actividad catalltica (expresada en unidades de actividad U por g de biocatalizador y calculada segun la ecuacion 2 del Ejemplo 1), en la hidrolisis de para-nitrofenil-beta-D- glucopiranosido liberando paranitrofenol.
f Eficiencia catalltica (expresada en unidades de actividad U por mg de enzima y calculada segun la ecuacion 3 del Ejemplo 1) en la hidrolisis de para-nitrofenil-beta-D-glucopiranosido liberando paranitrofenol. g No medido.
La Tabla 5, ademas de ratificar la presencia de la enzima p-Glu en los biocatalizadores p- Glu@Mg-MOF-74, indica que esa enzima conservo cierta actividad catalltica a pesar de haber estado en DMF igual que se habla observado en el Ejemplo 4. Nuevamente el material Mg-MOF-74 no fue un simple anfritrion de la enzima p-Glu que inmoviliza, sino que ademas de alguna forma le ayudo a conservar su actividad enzimatica frente al disolvente inhibidor de esa actividad, DMF.
Ejemplo 6. Electroforesis en geles de poliacrilamida de los biocatalizadores obtenidos en los Ejemplos 1 a 5.
Con todos los biocatalizadores obtenidos en los Ejemplos 1 a 5, se llevo a cabo la electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) con SDS (dodecilsulfato sulfato sodico). Los biocatalizadores se someten a las condiciones desnaturalizantes de la tecnica (SDS, mercaptoetanol, 100 °C, 5 min) que inducen la perdida completa de la estructura tridimentsional de la protelna, que queda reducida a la cadena lineal de aminoacidos y en esta forma deberla poder ser liberada facilmetne del entramado del MOF. Los sobrenadantes se someten a electroforesis para investigar la presencia de bandas de protelna en el gel. Las Figuras 8 y 9 recogen la electroforesis correspondiente a los biocatalizadores de los ejemplos 1 a 5, todos ellos preparados con Beta-glu. Se observo la banda correspondiente a la enzima en el biocatalizador con el material Mg-MOF-74, lo que certifica su presencia. Sin embargo, no se aprecio banda proteica en los biocatalizadores
NH2-MIL-53(Al), lo que no puede significar ausencia de protelna, ya que esta ha sido detectada por el resto de las tecnicas empleadas (determination de la actividad enzimatica del biocatalizador, analisis Bradford, analisis qulmico elemental CHNS, como se indican en las Tablas 1 a 3, y mediante termogravimetrla (mostradas en las Figuras 2, 4 y 6)). Lo que 5 puede indicar es que la cadena proteica esta mas fuertemente retenida qulmicamente por interaction con el material, y mas protegida frente al lixiviado.
10

Claims (14)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    REIVINDICACIONES
    1. - Procedimiento de obtencion de un biocatalizador, caracterizado por que comprende las siguientes etapas:
    a) sintetizar parcial o totalmente un material metalo-organico (MOF) en presencia de al menos una enzima hasta obtener un solido y,
    b) aislar el solido sintetizado segun la etapa a),
    y donde se inmoviliza in-situ a la enzima durante la slntesis del MOF en al menos uno de los volumenes huecos de diametro entre 2 y 50 nm de la mesoporosidad intercristalina formados entre cristales o entre dominios aglomerados o agregados de partlculas nanocristalinas de tamano homogeneo
  2. 2. - Procedimiento segun la reivindicacion 1, caracterizado por que en la etapa (a), la slntesis del MOF comprende poner en contacto una primera disolucion de una fuente metalica y otra segunda disolucion de ligando organico, en presencia de al menos una enzima.
  3. 3. - Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado por que en la etapa (a) las disoluciones son acuosas.
  4. 4. - Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado por que en la etapa (a) las disoluciones son organicas o una mezcla acuosa-organica.
  5. 5. - Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que en la etapa (a) la segunda disolucion de ligando organico se elige entre una disolucion acuosa de una sal de ligando organico o una disolucion acuosa de ligando organico protonado en presencia de un agente desprotonante.
  6. 6. - Procedimiento segun la reivindicacion 5, caracterizado por que el agente desprotonante se selecciona de entre una base fuerte, una base media o una base debil.
    5
    10
    15
    20
    25
    30
  7. 7. - Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que la etapa (a) se lleva a cabo a una temperatura entre 4 y 70 °C y preferentemente entre 20 y 30 °C.
  8. 8. - Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que en la etapa (a) la enzima se anade sobre cualquiera de las dos disoluciones, antes de la slntesis del MOF.
  9. 9. - Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que en la etapa (a) la enzima se anade sobre la mezcla de las dos disoluciones, antes de la slntesis del MOF.
  10. 10. - Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por que la enzima es p-glucosidasa.
  11. 11. - Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque el aislamiento del solido de la etapa (b) se lleva a cabo por centrifugacion o filtracion.
    12- Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado por que adicionalmente comprende una etapa (c) de secado del solido aislado en la etapa (b).
  12. 13. - Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado por que la primera disolucion de la fuente metalica es una disolucion acuosa de nitrato de aluminio nonahidratado, la segunda disolucion del ligando organico es una disolucion acuosa de acido 2-aminotereftalico y un agente desprotonante, la temperatura de reaccion 25 °C y la enzima es p-glucosidasa de Aspergillus niger que se anade sobre la disolucion del ligando organico.
  13. 14. - Procedimiento segun la reivindicacion 13, caracterizada por que el agente desprotonante se selecciona entre trietilamina, hidroxido sodico y amonlaco.
  14. 15. - Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado por que la primera disolucion de la fuente metalica es una disolucion de acetato de Mg tetrahidratado sobre N,N-dimetilformamida, la segunda disolucion del ligando organico es una disolucion
    acido 2,5-dihidroxitereftalico sobre N,N-dimetilformamida, la temperatura de reaccion 25 °C y la enzima es p-glucosidasa de Aspergillus niger que se anade sobre la disolucion de la fuente metalica.
    5 16.- Biocatalizador obtenido por el procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1
    a 15.
ES201530756A 2015-05-29 2015-05-29 Procedimiento general de obtención de biocatalizadores que comprende la inmovilización de enzimas durante la síntesis de materiales metalo-orgánicos Withdrawn - After Issue ES2595631B1 (es)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES201530756A ES2595631B1 (es) 2015-05-29 2015-05-29 Procedimiento general de obtención de biocatalizadores que comprende la inmovilización de enzimas durante la síntesis de materiales metalo-orgánicos
PCT/ES2016/070397 WO2016193516A1 (es) 2015-05-29 2016-05-26 Procedimiento general de obtención de biocatalizadores que comprende la inmovilización de enzimas durante la síntesis de materiales metalo-orgánicos

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES201530756A ES2595631B1 (es) 2015-05-29 2015-05-29 Procedimiento general de obtención de biocatalizadores que comprende la inmovilización de enzimas durante la síntesis de materiales metalo-orgánicos

Publications (2)

Publication Number Publication Date
ES2595631A1 ES2595631A1 (es) 2017-01-02
ES2595631B1 true ES2595631B1 (es) 2017-10-26

Family

ID=57440413

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES201530756A Withdrawn - After Issue ES2595631B1 (es) 2015-05-29 2015-05-29 Procedimiento general de obtención de biocatalizadores que comprende la inmovilización de enzimas durante la síntesis de materiales metalo-orgánicos

Country Status (2)

Country Link
ES (1) ES2595631B1 (es)
WO (1) WO2016193516A1 (es)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109082420B (zh) * 2018-08-21 2021-08-03 江苏大学 金属有机框架材料固定化β-葡萄糖苷酶及其制备方法和应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9404105B2 (en) * 2011-06-16 2016-08-02 University Of South Florida Polyhedral cage-containing mesoporous metal-organic frameworks as platform for biocatalysis, methods of making these frameworks, and methods of using these frameworks
WO2014117225A1 (en) * 2013-02-04 2014-08-07 Paolo Falcaro Metal organic frameworks
TWI461530B (zh) * 2013-05-16 2014-11-21 中原大學 分子固定方法及其系統
KR102322537B1 (ko) * 2014-07-03 2021-11-05 커먼웰쓰 사이언티픽 앤 인더스트리알 리서치 오거니제이션 호스트-게스트 금속 유기 구조체 시스템

Also Published As

Publication number Publication date
ES2595631A1 (es) 2017-01-02
WO2016193516A1 (es) 2016-12-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Užarević et al. Mechanochemical and solvent-free assembly of zirconium-based metal–organic frameworks
Wen et al. Multifunctional amino-decorated metal–organic frameworks: nonlinear-optic, ferroelectric, fluorescence sensing and photocatalytic properties
Ren et al. Immobilized carbonic anhydrase on mesoporous cruciate flower-like metal organic framework for promoting CO2 sequestration
Fujiwara et al. Calcium carbonate microcapsules encapsulating biomacromolecules
Liu et al. User-tailored metal–organic frameworks as supports for carbonic anhydrase
EP2763999B1 (en) Water soluble metal-organic frameworks
Zhang et al. Boronic acid functionalized magnetic nanoparticles via thiol–ene click chemistry for selective enrichment of glycoproteins
Vahed et al. (Fe) MIL-100-Met@ alginate: a hybrid polymer–MOF for enhancement of metformin's bioavailability and pH-controlled release
Chen et al. Amino acid mediated mesopore formation in LTA zeolites
Ali et al. Synthesis of paramagnetic dendritic silica nanomaterials with fibrous pore structure (Fe 3 O 4@ KCC-1) and their application in immobilization of lipase from Candida rugosa with enhanced catalytic activity and stability
Rashid et al. Magnesium silicate
CN101745353B (zh) 用于组氨酸标签蛋白纯化的磁性微球及其制备和应用方法
ES2595631B1 (es) Procedimiento general de obtención de biocatalizadores que comprende la inmovilización de enzimas durante la síntesis de materiales metalo-orgánicos
US20210162338A1 (en) Water capture
Qi et al. Controlled synthesis of NbO-type metal-organic framework nano/microcrystals with superior capacity and selectivity for dye adsorption from aqueous solution
Zheng et al. Amino/quaternary ammonium groups bifunctionalized large pore mesoporous silica for pH-responsive large drug delivery
Wang et al. A highly porous 4, 4-paddlewheel-connected NbO-type metal–organic framework with a large gas-uptake capacity
Kamran et al. Adsorption of folic acid, riboflavin, and ascorbic acid from aqueous samples by Fe 3 O 4 magnetic nanoparticles using ionic liquid as modifier
Xu et al. Synthesis of mono-dispersed mesoporous SBA-1 nanoparticles with tunable pore size and their application in lysozyme immobilization
US11298676B2 (en) Porous material for storing of molecules and its use
Zou et al. A dual enzyme-containing microreactor for consecutive digestion based on hydrophilic ZIF-90 with size-selective sheltering
Shu et al. Isolation of hemoglobin with metal–organic frameworks Y (BTC)(H2O) 6
Beheshti et al. Selective high adsorption capacity for Congo red dye of a new 3D supramolecular complex and its magnetic hybrid
Dubey et al. Can enantiomer ligands produce structurally distinct homochiral MOFs?
Datt et al. Development of porous nanomaterials for applications in drug delivery and imaging

Legal Events

Date Code Title Description
FG2A Definitive protection

Ref document number: 2595631

Country of ref document: ES

Kind code of ref document: B1

Effective date: 20171026

FA2A Application withdrawn

Effective date: 20180320