TWI461530B - 分子固定方法及其系統 - Google Patents

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TWI461530B
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/06—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier attached to the carrier via a bridging agent

Description

分子固定方法及其系統
金屬有機骨架材料(Metal Organic Frameworks，簡稱MOFs)係由特定材料所構成的高結晶性複合錯合物，通常形成微觀的支架結構，此支架結構上可細分為鏈結點(linker)與支架邊，鏈結點常為有機分子所構成有機配位基(organic ligand)，而支架邊常由金屬離子或金屬簇團(cluster)而形成二級的結構單元(second-building unit，簡稱SBU)所構成，因此有機分子與金屬之間的作用(例如：結合方式與位向)均可顯著影響材料的形狀與孔洞特性，故藉由前述分子的配位鍵結與組合，便能製備出具有特定性質的金屬有機骨架材料。金屬有機骨架材料的多孔特性賦予其廣大的應用潛力，例如氣體儲存、氣體分離、感知(sensing)、吸附、分離與催化等傳統工業應用；此外，金屬有機骨架材料在生物醫學方面的應用，例如藥物輸送(drug delivery)，也開始受到矚目。
生物反應系統通常使用天然催化劑例如：蛋白質酶(enzyme)及細胞，作為生物催化反應(Biocatalysis)的催化劑，而現今生物反應系統已廣泛使用於化學工業、食品工業及醫藥產業。針對蛋白質酶的生物反應系統而言，為達到較佳的催化效率，同時考量經濟成本以及材料回收再利用的效益，將蛋白質酶固定附載(immobilization)於固態載體上乃有效的選擇之一。舉例言之，蛋白水解酶(proteases)中最廣泛使用的酶為胰蛋白酶(trypsin)，經常應用於分解蛋白質成小片段胜肽(peptides)供蛋白質譜分析以及相關的工業生 產工序。傳統上使用胰蛋白酶溶液進行分解蛋白質的程序通常需時18小時以上，存有費時且效率不佳的缺點；近來開始採用將蛋白質酶固定附載(immobilization)於固態載體上，可提升酶-受質比值(enzyme-to-substrate ratio；亦常表示為[E]/[S])、再生性(reusability)、高水解催化能力，並且縮減反應時間，均能有效改善生物催化反應的效能。
因此將蛋白質酶固定附載(immobilization)於固態載體方法之品質攸關前述生物反應系統的實際效能。具體而言，通常會針對特定的酶與受質種類，選用適當的基材(support)承載蛋白質酶，使蛋白質酶附載於固態載體上，蛋白質酶因而可穩定地發揮催化效果執行生物反應，同時更可延伸應用至非生理環境條件(non-physiological)的反應環境中，使生物反應系統的用途更加廣泛。例如：在蛋白質酶與基材之間實施密集多點的共價結合，可增加蛋白質酶的剛性，使蛋白質酶在較嚴苛的反應環境(例如較極端的溫度條件或非水性溶液的溶劑條件)中仍能穩定發揮催化的能力；然而，不適當的蛋白質酶固定附載可能會改變蛋白質酶的構型與功能，反而會減損蛋白質酶原有的效能。
關於固態載體之基材的材料多元，目前較廣為使用的材料包含奈米粒子、聚合物、無機化合物，均可用作生物反應的基材，以建構生物反應器(bioreactor)。其中，根據近期S.Hudson等人(Chem.Rev.,2012,112,724-781)指出，中孔洞的矽酸鹽化合物(mesoporous silicates)因其於重複使用時會產生酶流失(enzyme leaching)的效應，故其應用於生物反應器中作為生物反應催化劑的預期成效尚未獲得充分實證。此外，亦常有人採用材料合成後修飾方法對材料進行改質，然而此方法對於固態的基材與酶之間的穩定性亦尚有爭議，故仍有改善的需求。
另一方面，現今的蛋白質酶固定附載於固態載體的基材之方法多半採用化學共價鍵結方法將蛋白質酶聯接至基材；甚少採用「吸附方法」(adsorption)進行蛋白質酶固定附載。然而，前述的化學共價鍵結方法需要複雜的官能基之修飾與改質，方能使蛋白質酶與基材之間能產生充分作用達成固 定附載的效果，更深入之探討可參見M.E.Medina等人(Adv.Mater.,2011,23,5283-5292)所發表的論文。簡言之，如採用物理吸附方法進行固定化時，基材的孔洞性材料之「孔徑尺寸」便是穩定蛋白質酶固定附載效果的關鍵因素之一，孔徑須符合標的生物分子(例如：蛋白質酶)的動態直徑(hydrodynamic diameter)，其範圍通常大於3-8nm。因此，根據一般對於孔洞性材料的孔徑可區分為以下三類：微孔洞(microporous)材料的孔徑通常小於2nm；大孔洞(macroporous)材料孔徑通常大於50nm；中孔洞(mesoporous)材料孔徑則介於微孔洞與大孔洞之間，即約介於2-50nm。
因此，應用於生物分子的固定附載時，孔洞性材料基本條件之一是必須具有中尺寸(meso-size)的孔洞，即為「中孔洞材料」。然而，如採用這些中孔洞材料進行分子的吸附或固定附載，通常必須先行進行繁瑣的改質(例如：繁複的化學鍵結方法)，使材料較易與此生物分子產生化學鍵結，或是利用親疏水性的吸引力，使此生物分子得以牢固地吸附或固定於材料上，方可針對此特定的生物分子，提升吸附效果，並且確保這些生物分子能成功固定於固態載體上。而關於前述的「改質」步驟，不僅需要繁瑣且耗時的程序，化學處理過程中常消耗大量有機溶劑，更導致環境汙染的問題。
另一方面，孔洞性材料是否能廣泛地應用至吸附或固定特定的分子，係取決於使用者所採用的孔洞性材料對於不同尺寸分子的吸附能力。目前，針對尺寸較大的分子(以下稱大分子)，例如蛋白質類的生物分子，多半使用「中孔洞材料」進行吸附。然而，當中孔洞材料的孔洞尺寸過大時，則難以將分子滯留於孔洞中供進一步的應用。
針對上述孔洞性材料的技術需求，近期有少數研究提出將金屬有機骨架材料(MOFs)應用於生物反應系統的概念與技術，係採用金屬有機骨架材料作為生物反應系統中用以固定附載生物分子的固態載體或基材，例如YH.Shih等人(ChemPlusChem.,2012,11,982-986)、V.Lykourinou等人(J.Am.Chem.Soc.,2011,133,10382-10385)、Y.Chen等人(J.Am.Chem.Soc.,2012,134(32), 13188-13191)分別提出將金屬有機骨架材料應用於生物反應系統的技術。然而，YH.Shih等人所提出的方法，仍須倚賴化學鍵結方法，故難以避免前述化學鍵結方法的缺失(繁複、冗長、環境汙染威脅)。
此外，目前這些應用金屬有機骨架材料的方法，仍存有材料形態變異顯著與孔洞尺寸小(通常小於2nm)的問題，使得現有的金屬有機骨架材料技術對於吸附、分離或是固定附載大分子的能力十分受限。另一方面，同樣由於「微孔洞材料」對於大分子的吸附或固定能力有限，因此目前對於採用「微孔洞材料」吸附大分子的技術知之甚少，僅少數研究加以探討，舉例而言，關於V.Lykourinou等人與Y.Chen等人所提出的方法，皆將大分子以物理吸附方式吸附於金屬有機骨架材料的微孔洞中，然而，雖然其採用的材料屬於微孔洞材料，但是以目標分子的尺寸而言，分子無法完整進入微孔洞並且滯留於孔洞中，因此其主要係藉由表面吸附的方式達成吸附的效果；此外，前述技術的吸附過程冗長，需要長達40-60小時才能完成吸附步驟，十分耗時。
針對上述現有技術的缺失，本發明係提出了一種簡易、省時、且應用性廣泛的生物分子吸附固定方法和其用途，以克服現有技術的問題。
本發明係提出一種分子固定方法，係用於進行一生物反應，其特徵在於包含以下步驟：(1)提供一生物分子與一引導分子，以一微波步驟將生物分子聯接至少一引導分子後，形成一吸附體；(2)提供一具有孔洞結構之基材，將吸附體與基材混合，形成一混合物；(3)以一渦流震盪步驟處理混合物，使吸附體以吸附並且固定至基材後，形成一生物反應器。
前述分子固定方法，其中生物分子係蛋白質酶；引導分子係小分子染劑；基材則為金屬有機骨架材料。且其中之蛋白質酶係胰蛋白酶；小分 子染劑係異硫氰酸螢光素。
前述分子固定方法，其中微波步驟之執行時間係介於1至5分鐘；而渦流震盪步驟之執行時間係介於10至60分鐘。
前述分子固定方法，其中金屬有機骨架材料係一鋁基金屬有機骨架材料，且此鋁基金屬有機骨架材料之孔洞結構之孔徑係介於0.8至2.1nm。
本發明同時提出一種生物反應器，係利用根據前述分子固定方法而製得之生物反應器。
此外，本發明進一步提出一種生物反應系統，係包含了根據前述分子固定方法而製得之生物反應器、一緩衝液及一受體，其中生物反應器係用以催化受體進行生物反應。而根據前述之生物反應系統，其中之受體係含有賴胺酸(Lysine)與精胺酸(Arginine)之蛋白質。
基於上述之本發明提供之分子固定方法、生物反應器與生物反應系統之精神，本發明之目的之一在於提供一種簡易省時而有效的分子固定方法，可藉由小分子之引導分子帶領生物分子吸附至一固態載體之具有孔洞結構之基材上，構成一有效之生物反應器，達到將生物分子固定附載於固態載體之效，並進一步與蛋白質受體進行生物反應。
本發明之另一目的在於，根據前述之分子固定方法，進一步提供完整的生物反應環境，以建構一生物反應系統。
本發明之再一目的在於，根據前述之分子固定方法與生物反應系統，以簡易、有效率又安全環保的方式達成高效能的生物反應，且可重複使用，大幅節省了操作時間與成本，同時避免使用有機溶劑免除汙染問題，進而提高操作環境與人員之安全性。
S11‧‧‧步驟11
S12‧‧‧步驟12
S21‧‧‧步驟21
S22‧‧‧步驟22
S31‧‧‧步驟31
S32‧‧‧步驟32
10‧‧‧引導分子
20‧‧‧生物分子
30‧‧‧吸附體
40‧‧‧基材
50‧‧‧受體
101‧‧‧渦流震盪
200‧‧‧生物反應器
300‧‧‧生物反應系統
P‧‧‧孔徑
第1A圖係本發明之生物分子固定方法之原理與步驟示意圖，係呈現本案較佳實施態樣之第1、2步驟。
第1B圖係本發明之生物分子固定方法之原理與步驟示意圖，係呈現本案較佳實施態樣之第3步驟。
第1C圖係本發明之生物分子固定方法之原理與步驟示意圖，係呈現本案較佳實施態樣之第4步驟。
第1D圖係本發明之生物分子固定方法之原理與步驟示意圖，係呈現本案較佳實施態樣之第5步驟。
第1E圖係本發明之生物分子固定方法之原理與步驟示意圖，係呈現本案較佳實施態樣之第6步驟。
第2圖係根據本發明較佳實施例之生物反應效能數據圖，係表示藉由簡易的渦流震盪方法製備而得知生物反應器水解蛋白之效能。
第3圖係根據本發明較佳實施例之固態載體中基材之結構示意圖，係呈現此基材具有立體孔洞結構。
第4圖係掃描式電子顯微鏡影像圖，呈現本發明較佳實施例之基材CYCU-4與MIL-101(Cr)經由本發明之生物分子固定方法製備生物反應器流程中之各階段之外觀結構。a)CYCU-4之合成產物；b)浸泡碳酸鈉溶液後乾燥之CYCU-4；c)FITC@ CYCU-4；d)Trypsin-FITC@ CYCU-4；e)MIL-101(Cr)之合成產物；f)浸泡碳酸鈉溶液後乾燥之MIL-101(Cr)；g)FITC@ MIL-101(Cr)；h)Trypsin-FITC@MIL-101(Cr)。
第5圖係本案較佳實施例之CYCU-4基材之氮氣吸脫附曲線分析圖；呈現氮氣吸脫附能力與孔徑尺寸分布。
第6圖係X光繞射分析(powder X-ray diffraction，PXRD)圖。(A)CYCU-4系統之X光繞射分析圖；(B)MIL-101(Cr)系統之X光繞射分析圖；a)初始狀態CYCU-4；b)浸泡碳酸鈉溶液後之CYCU-4；c)FITC@ CYCU-4；d)Trypsin-FITC@ CYCU-4；e)初始狀態MIL-101(Cr)；f)浸泡碳酸鈉溶液後之MIL-101(Cr)；g)FITC@ MIL-101(Cr)；h)Trypsin-FITC@MIL-101(Cr)。
第7A圖係共軛聚焦雷射掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscopy，CLSM)影像圖。a)初始狀態CYCU-4；b)Trypsin-FITC@ CYCU-4。
第7B圖係共軛聚焦雷射掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscopy，CLSM)影像圖。a)初始狀態MIL-101(Cr)；b)Trypsin-FITC@MIL-101(Cr)。
為使本發明之目的、技術特徵及優點，能更為相關技術領域人員所了解，並得以實施本發明，在此配合所附之圖式，具體闡明本發明之技術特徵與實施方式，並列舉較佳實施例進一步說明。以下文中所對照之圖式，係表達與本發明特徵有關之示意，並未亦不需要依據實際情形完整繪製；而關於本案實施方式之說明中涉及本領域技術人員所熟知之技術內容，亦不再加以贅述，合先敘明。
本發明係利用小分子能有效擴散且牢牢地固定於基材孔洞內的特性，以小分子引導大分子，尤其是生物性大分子(泛指存在於生物體內的各種有機分子，具高分子量通常在一萬以上，例如：蛋白質、酶、核酸、脂類、糖類等)吸附並固定附載至金屬有機骨架材料所構成的微孔洞材料(即載體)，故藉由此方法，可簡易且有效地建構一高效率的生物反應系統，及其它相關的用途。以下針對本發明之詳細技術特徵與實施方式加以說明。
關於吸附、固定及附載生物性分子於微孔洞材料所構成的固態載體之方法，化學鍵結方法之吸附效率易隨改質之內容而變異，且吸附過程冗長而耗時；物理吸附方法主要是藉由分子間的吸引力達成吸附，在吸附過程中不產生實質的電子轉移、化學鍵生成或破壞、原子重組等反應等條件的影響，故吸附速率佳，其吸附表現常取決於生物性分子與固態載體兩者之間的物理特性作用(例如：相對尺寸的配合程度及分子間作用力等微環境因素)。
針對生物反應系統之應用，為獲得較佳的催化及反應效能，生物反應系統中用於附載生物性催化劑(以蛋白酶為主)之載體(carrier)所採用基材(support)應具有以下特性為佳：適當的孔洞尺寸以符合其吸附之分子之 尺寸；高表面積(surface area)用於提高附載量；適當的孔洞微環境以吸附分子並避免流失效應(leaching)；穩定且完整的孔洞架構(framework integrity)以利穩定反應或再生使用。
因此，本發明的微孔洞材料係以具備上述特徵的「金屬有機骨架材料」(以下簡稱MOFs)為主要的實施態樣。MOFs的種類十分多元，且結構易於順應使用需求而彈性調整，孔洞尺寸相當均勻，且MOFs具備的孔洞結構特性則賦予其高表面積的特性，其中又以具微孔洞結構的MOFs為甚。
異硫氰酸螢光素(fluorescein isothiocyanate，下稱FITC)為廣泛使用的一種生物分子螢光染劑，具有優異的螢光標記效能，已普遍地應用於標記與偵測生物分子之技術領域；由於FITC具有優異的螢光轉換效能(將吸光能量轉換成螢光)，故經常用於標記蛋白質酶或其他生物性分子，讓使用者藉由其螢光特性偵測或定位FITC標記的分子。FITC分子量為389 Dalton(Da)，分子相當小，因此，FITC在與蛋白質分子(例如酶、抗體等)接合時，每個蛋白質分子至少能與一個(含以上)FITC分子結合。。FITC對於親核試劑(nucleophiles)具有高反應活性，因此，FITC相當易於與蛋白質中常見的胺基(amine groups)與氫硫基(sulfhydryl groups)等親核性基團產生反應，進行聯接。基於FITC屬「小分子」，且易於精確地與蛋白質聯接之特性，故本發明所述之「小分子」以FITC為較佳之實施態樣。
然而，需說明的是，除了FITC之外，其它具備「小分子尺寸」且「易於與蛋白質聯接」之各類小分子，均適用於本發明，例如：期刊Chem.Eur.J.,2014,20,pp8923-8928(Title：Fast Multipoint Immobilized MOF Bioreactor) 中所述之NBD：「除FITC之外，進一步更以另一種分子尺寸較小的螢光染料4-chloro-7-nitrobenzofurazan(NBD,4-氯基-7-硝基苯並呋喃)取代FITC，製備另一種生物性催化器並探討其分子尺寸與多種有機金屬骨架材料之孔洞大小的影響，而其蛋白質水解效率實可比擬胰蛋白酶結合FITC之有機金屬骨架材料」，亦即本發明不對「小分子」之種類加以限制。
生物性反應系統中，以「蛋白質酶」的應用最多元而廣泛，由於本發明不涉及複雜的化學改質，避免了高度特異性(specificity)的改質步驟，因此本發明之方法十分適用於各類型蛋白質酶類的生物性大分子；換言之，本發明之方法的用途廣泛，不限於特定種類蛋白質酶，凡是具有生物催化功能的「蛋白質酶」均能應用之。
為利於闡明本發明之特徵，本發明係以胰蛋白酶(Trypsin)反應系統為較理想之實施方式。目前，「胰蛋白酶反應系統」已大量使用於蛋白質體學的分析及工業用途，其催化作用原理及用途詳情係為相關領域技術人員所時熟知，故不再加以說明。簡言之，針對「蛋白質體學分析」，由於胰蛋白酶易於純化，及大量取得，其用途最為廣泛，活性穩定且截切精準，可將大分子蛋白質截切為小片段胜肽(peptides)，相當適合用於質譜儀分析。而針對「工業用途」，胰蛋白酶具有對於天然材料進行脫脂、脫膠等功能，廣泛用於制革(軟化皮革並提升皮革品質)、絲綢印染(簡化工序及縮短催化時間)、食品等工業。
因此，本發明係基於前述原理，提出一種新穎的生物反應系統及方法，係針對生物性大分子吸附並固定附載於固態載體之目標，先行利用一小分子與此生物性大分子聯接，並以小分子作為引導，給予適當的能量，使小分子進入MOFs的孔洞同時，帶領大分子吸附至固態載體上，簡易且有效地達成將生物性大分子固定附載於固態載體之效果。
本發明之方法不僅大幅簡化了操作流程，同時免除了化學鍵結的諸多缺失，更結合了MOFs高表面積的優越性能，使生物性大分子得以大量、密集且有效附載於固態載體，提高了生物反應系統的催化效率與整體的反應效能。此外，本發明所提出之生物反應系統更同時具備了「可多次重複使用」之特性。而以下針對本發明較佳之實施方式，係以FITC作為前驅引導的小分子，引導胰蛋白酶吸附至MOFs上，並以「胰蛋白酶反應系統」驗證其生物反應效能，提供一性能良好的胰蛋白生物反應系統。
綜上所述，本發明係提供了一種生物分子固定方法，此方法係 用於進行特定的生物反應，尤其是廣泛應用的「酶催化反應」。以下依據前述本發明較佳實施方式，分就此生物分子固定方法之執行步驟，同時對應之圖式說明本發明之技術特徵。
首先，本發明提供之生物分子固定方法，係用於生物反應(例如，生物分子吸附、蛋白酶催化反應等)，只要生物分子均適用本發明，故不加以特別限制，採以下步驟加以固定此生物分子。步驟S1係將具有生物催化活性的生物分子與引導分子，以微波步驟處理生物分子與引導分子，將此生物分子與至少一引導分子聯接，形成一吸附體。其中，生物分子可以是蛋白質、酶或其他欲用於吸附目標的生物分子，而生物分子中，較佳為蛋白酶；而引導分子較佳為蛋白質染劑或標記物，引導分子須具有分子小(分子體積以小於2 x 2 x 2nm3 或小於10nm3 為佳)，且容易與蛋白質成分或官能基，例如胺基(amine groups)與氫硫基(sulfhydryl groups)產生聯接之特性，即適用於本發明。此外，根據本發明之較佳實施態樣，生物分子較佳為屬蛋白酶之「胰蛋白酶」；引導分子則以「FITC」較佳。
接著，請參照圖1A至1E係以本案較佳之實施方式示意本發明提供之生物分子固定方法。參照圖1A，係根據本案較佳實施例之步驟S11與S12示意說明：於步驟S11中先行提供生物分子(胰蛋白酶)20，以及引導分子(FITC)10充分混合後，以微波步驟(圖未示)將兩者進行聯接，以利進行步驟S12，係使生物分子(胰蛋白酶)20聯接至少一引導分子(FITC)10。其中，胰蛋白酶20可由純化製備而得或採用市售產品，只要其具有胰蛋白酶截切活性即可，不限於使用具有完整全長(full-length)的胰蛋白酶，亦可採用人工選殖、修飾或改良之胰蛋白酶活性片段；而FITC 10則以採用市售產品較為便利。至於微波步驟的較佳執行時間係介於1至5分鐘，其中又以1.5至2.5分鐘為更佳。
因此，根據胰蛋白酶20成分富含胺基(amine groups)與氫硫基(sulfhydryl groups)之特性，又FITC 10與胰蛋白酶20之分子大小差異懸殊， 故單一胰蛋白酶分子20通常能與至少一個FITC 10分子產生聯接，此原則通常適用於其他酶。因此，本發明對於生物分子20與引導分子之間10的分子數量比例不加以限制，而實務上，根據本發明之較佳實施例而言，單一胰蛋白酶分子20通常與1個(含以上)FITC 10聯接，構成吸附體30。
繼續參考圖1B，係根據本案較佳實施例之步驟S21示意說明：提供一種具有孔洞結構之基材(MOFs)40，並且將其與吸附體30混合，形成一混合物，使基材(MOFs)4與吸附體30均勻分散於混合物之中。其中，基材所採用的MOFs 4種類不限，只要MOFs4孔洞之孔徑能符合吸附並固定FITC 10分子之孔徑即適用於本發明，本發明具體採用MOFs 4之孔徑尺寸係介於0.8至2.1nm為較佳，其中又以1.5至2.1nm更佳。
繼續參考圖1C，係根據本案較佳實施例之步驟S22示意說明：以渦流震盪步驟(Vortex)處理前述含有基材(MOFs)4與吸附體30之混合物。渦流震盪101係提供吸附體30吸附至基材(MOFs)4所需的能量；換言之，請同時參見圖1D所示之步驟S31，吸附體30與基材(MOFs)4係藉由簡易的渦流震盪101獲得分子間相吸(host-guest interaction)所需要的能量，藉由小分子FITC 10之引導，帶領生物分子(即胰蛋白酶)20驅向且進入基材(MOFs)4之孔洞結構中，使吸附體30整體能牢固地吸附並固定至基材(MOFs)4之孔洞結構上(主要吸附於孔洞內)，形成一生物反應器200。其中，此渦流震盪步驟之執行時間係介於10至60分鐘，其中以15至40分鐘為較佳。
進一步參照圖1E，步驟S32係示意使用前述由胰蛋白酶、FITC、MOFs三者所構成的生物反應器200進行生物反應。由於胰蛋白酶與其受體之間的生化反應及催化作用，係相關技術領域所熟知之技術，故不再贅述。關於胰蛋白酶之受體50之種類不加以限制，根據習知之胰蛋白酶特性，適用於本發明之受體50涵括但不限於各種含有賴胺酸(Lysine)與精胺酸(Arginie)之蛋白或胜肽，並可隨著使用者選用的胰蛋白酶種類而對應調整選擇，例如經常用於檢測胰蛋白酶活性之牛血清白蛋白(Bovine serum aibumin，簡稱BSA)。而 本發明實施例係以牛血清白蛋白作為實施胰蛋白酶活性檢測之受體50之標準品，以充分說明本發明之特徵及對應效果。
如步驟S32所示，經由本發明提供之生物分子固定方法所製得之生物反應器200可進一步用於建構一生物反應系統300。具體而言，使用者可進採用一適當的緩衝液系統，提供生物反應器200與受體50作為適當的生物反應環境，並將生物反應器200使用於受體50之生化反應或催化反應，便構成了一有效的生物反應系統300，後續可根據胰蛋白酶之用途廣泛運用之。
由此可見，相較於傳統使用化學鍵結進行固態載體或基材之化學鍵結改質方法，本發明提供了一有效、簡易而環保的生物分子固定方法方法，以及藉由此生物分子固定方法所構成的生物反應系統，有效率地達成固定附載生物分子至固態載體，以提升整體生物反應之效能。
關於本發明對於所採用之MOFs不加以限制。然而，基於MOFs的微孔洞特性，具小分子尺寸的FITC(分子尺寸：0.9 x 1.2 x 1.4nm3 )可輕易地進入MOFs的微孔洞結構中。然而，目前關於MOFs吸附小分子或染劑(例如：FITC)仍知之甚少，亦尚未見針對MOFs吸附FITC進行探討的研究。故針對上述問題，本發明以下列舉多種MOFs對於FITC之吸附效果。
具體而言，本發明列舉之MOFs包含：MIL-88B(Cr)、MIL-53(Al)、MIL-53(Cr)、DUT-4(Al)、MIL-101(Cr)、DUT-5(Al)、CYCU-4，其孔洞相關特性列舉如表1所示。同時，對於前述各種MOFs捕捉或吸附FITC的能力進行分析，係將FITC(5mM)、各種MOFs、碳酸鈉緩衝溶液(100mM)混合進行吸附反應，以評估各種MOFs捕捉或吸附FITC的能力。關於各分析結果如表1示。
由表1可知MIL-53(Al)與MIL-53(Cr)兩者之孔道尺寸約0.8-1.1nm，兩者吸附FITC能力皆不佳，吸附效率低於17%；MIL-101(Cr)、DUT-4(Al)兩者開孔(window)與孔道尺寸約1.2nm，其呈現了完全吸附能力(exhaustive absorption)，吸附效率大於99%；而DUT-5(Al)與CYCU-4兩者之孔道尺寸大於1.4nm，吸附效率達92%。此分析結果顯示MOFs吸附FITC的能力與孔道(或開孔)尺寸之間的關聯性。除了MIL-88B(Cr)、MIL-53(Al)、MIL-53(Cr)之外，前述的MOFs之孔道或開孔的尺寸(介於1.2-2.1nm)大於FITC的分子尺寸(0.9 x 1.2 x 1.4nm3 )，能讓大量的FITC進入其孔洞中，藉由有機配位基與FITC之間的強吸引力(π-π interaction)與氫鍵的作用，均可有效地捕捉FITC。後續便根據前述MOFs對FITC的吸附效果，選用表現較佳的MOFs用作固態載體的基材，按照前述本發明之生物分子固定方法，以吸附的方式固定附載胰蛋白酶，並製備得對應的生物反應器，其進行生物反應之效能如表2所示。
此外，關於FITC與胰蛋白酶的聯接，係利用FITC之異硫氰酸基(isothiocyanate)對胰蛋白酶的胺基(amine groups)基團產生親核攻擊(nucleophilic attack)，因此經由約2分鐘的微波加熱後，即可將FITC聯接至胰蛋白酶，形成一種FITC標記的胰蛋白酶，即前述之「吸附體」，以下稱作「Trypsin-FITC」。因此，當Trypsin-FITC經由前述本發明之生物分子固定方法，藉由渦流震盪60分鐘，充分提供能量後，便可將Trypsin-FITC固定附載於特定MOFs，即構成了一「生物反應器」，以下稱作「Trypsin-FITC@MOF」，其中的MOF可以使用者需求置換或調整。此外，吸附體「Trypsin-FITC」與MOF進行渦流震盪時，即為產生「固定附載」(immobilization)的過程，其所需的時間亦視作「固定附載時間」(immobilization time)。
為確認Trypsin-FITC與Trypsin-FITC@MOF生物反應器對於受體蛋白質的活性(即水解或截切胜肽鍵之活性)，亦即本發明提供之「生物反應系統」之效能，現利用牛血清白蛋白(以下簡稱BSA)作為受體標準品，用於檢測自由態(free form)Trypsin-FITC與Trypsin-FITC@MOF的活性：係以 Trypsin-FITC與BSA反應後，採nanoLC-MS方法(常用於蛋白質經酶水解後之鑑定分析)檢測水解後的胜肽片段(proteolytic fragments)，並以Mascot數據庫(質譜圖譜與序列之資料庫，用於比對並鑑定蛋白質)分析之。其中，胰蛋白酶水解能力係基於上述質譜與數據分析方法，以比對後產生之「序列覆蓋率」作為區分的指標，分析結果請參照表1及表2。
參照表1、2，分析結果顯示以Trypsin-FITC水解BSA可獲得43種相符之胜肽，序列覆蓋率為72%；而採用Trypsin-FITC@MOF時，以採用CYCU-4作為MOF時所製備而得知Trypsin-FITC@ CYCU-4，其水解BSA可獲得47種相符之胜肽，序列覆蓋率為72%。此外，進一步分析較短的渦流震盪的「固定附載時間」之效應，結果如第2圖所示：將渦流震盪的「固定附載時間」縮短至15分鐘時，Trypsin-FITC@CYCU-4水解BSA可得27種相符之胜肽；序列覆蓋率為52%；縮短至30分鐘時，Trypsin-FITC@CYCU-4水解BSA可得37種相符之胜肽，序列覆蓋率67%。由於如同其他蛋白質體分析方法，習知使用BSA作為蛋白酶之受體時，其所處的尿素溶液環境可影響其雙硫鍵的穩定性，在進行真正的胰蛋白水解前可能產生微幅的降解，於條件控制良好的情況下不顯著影響數據判讀。
因此，上述數據顯示採用FITC標記於胰蛋白酶並不會干擾胰蛋白酶活性位置(active sites)，不影響其活性；且於吸附體(Trypsin-FITC)經由本發明之方法吸附至MOF之後，其吸附之位向(orientation)亦不會胰蛋白酶之活性，顯見由FITC小分子引導胰蛋白酶與MOF之間的吸附所構成的生物反應器仍具有胰蛋白酶水解BSA之活性(序列覆蓋率22-72%)，且其效能隨著開孔或孔道尺寸增加，故十分有效地提升了生物反應之效能。
關於前述用於附載固定生物分子的固態載體於重複使用時會產生酶流失(enzyme leaching)的效應，使多數的固態載體的再生性十分受限。針對此問題，本發明提供之生物分子固定方法及其對應所構成的生物反應系統，其中的生物反應器具有可重複使用的特性，有效避免了前述缺失。所謂「可重 複使用」之界定，係泛指生物反應器於多次使用後仍能維持其效能表現，因此，關於前述之MOF生物反應器包含DUT-4(Al)與DUT-5(Al)(參照表2)之所以無法取得其第二次水解之序列覆蓋率之理由在於，這兩種生物反應器於第一次水解使用後即形變成泥狀並快速溶解於碳酸鈉溶液中，難以重複使用。
然而，在前述的MOF生物反應器中，以Trypsin-FITC@CYCU-4生物反應器、Trypsin-FITC@MIL-101(Cr)生物反應器兩者不但具有良好的BSA水解能力(序列覆蓋率分別為72%及56%)，亦同時具備了「可重複使用」之特性：Trypsin-FITC@CYCU-4生物反應器可重複使用至少5次；Trypsin-FITC@ MIL-101(Cr)可重複使用至少2次，且重複使用時，兩者都能維持趨於一致的反應效能(參見表3)。是以，基於上述內容，根據生物反應器之效能而言，本發明係以Trypsin-FITC@CYCU-4生物反應器、Trypsin-FITC@ MIL-101(Cr)生物反應器為較佳實施態樣。
因此，接著，針對本發明較佳實施態樣採用之MIL-101(Cr)與CYCU-4材料說明其特徵，並列舉實施例及對應之分析結果加以詳述。
實施例1：CYCU-4之製備與特性
根據本發明實施效果較佳之CYCU-4，其係一種成本低廉且製備程序簡易的複合材料：Al(OH)(SDC)，分子式Al4 O20 C64 H44 。CYCU-4具有鋁基(aluminum based)金屬有機骨架微孔洞特性，且CYCU-4可藉由水溶液浸泡方法(aqueous solution immersion)形成中孔洞(mesopore)，關於CYCU-4的製備， 其原理是建構一種桿狀的羧酸鋁(aluminum carboxylate)次級結構單元(單元數量不限制)，係採用鏈狀的有機配位基(linear organic ligand)：H2 SDC(4,4-stilbendicarboxylic acid)做為鏈結點(linker)，以溶劑熱法(solvothermal)條件，製得產物材料：Al(OH)(SDC)，即CYCU-4。相較於一般鏈狀的供氧有機配位基(O-donor ligands)，前述H2 SDC配位基長度較長(13.7Å)，使其適用於建構中孔洞MOFs。
實際製備CYCU-4時，係使用包含H2 SDC(0.097g；036mmole)、Al(NO3 )3 ˙9H2 O(0.176g；0.47mmol)、N,N-diethylformamide(以下簡稱DEF；10.0ml)之混合溶液，於室溫下攪拌(stir)5分鐘以形成均質溶液。接著將此溶液於180℃加熱3天之後形成暗黃色的粉末後，將粉末濾出並以二甲基甲醯胺(以下簡稱DMF)沖洗，於120℃烘箱中乾燥，可得0.1947g之CYCU-4產物。
CYCU-4之結構示意如第3圖所示，其菱形孔洞(rhomboidal pores)孔徑P約為2.1nm；第4圖(a)，顯示其片狀結晶尺寸(lamellar crystal sizes)範圍介於100-1000nm。且CYCU-4耐熱至300℃左右仍能保持其結構穩定。參見第5圖，根據密度汎函方法(density functional method)所進行的氮氣吸脫附曲線分析(N2 adsorption isotherm)的分析可知，CYCU-4具有低壓氮氣吸附特性，且CYCU-4的孔徑尺寸分布約為：12、16、18及21Å(同時參照第4圖(a))。根據BET(Brunauer-Emmett-Teller)分析CYCU-4之表面積(surface area)與孔洞尺寸(pore volume)，測得其顯示BET表面積為1910m2 g-1 而Langmuir表面積為2671m2 g-1 ，顯示CYCU-4充分具備了微孔材料特性。
實施例2：CYCU-4之溶劑抗性測試
溶劑抗性測試係將去溶劑(desolvated)後的CYCU-4測試樣本置入特定溶劑，於室溫下存放7天。測試結果參照第4圖，顯示CYCU-4充分呈現了其結構對於不同溶劑環境的抵抗性，這些溶劑包含：二甲基甲醯胺(dimethylformamide，DMF)、N,N-二乙基甲酰胺(N,N-diethylformamide，DEF)、 甲苯(toluene)、甲醇等。CYCU-4在前述多種溶劑環境下，仍維持其原有的孔洞結構並保有其部份結晶性，然而其孔隙率(porosity)則降低，使其整體特性趨向於「中孔洞材料」。另一方面，將CYCU-4置入水性溶液中，室溫下存放1小時，此材料便產生了孔徑尺寸介於3-5nm的中孔洞。而上述各檢測方法係為本領域技術人員所熟知之檢測方法，故相關方法的施行細節不在此贅述。
因此，本發明所提供之CYCU-4在去除溶劑後，即具備了微孔洞結構與特性，亦可經由有機溶劑或水溶液浸泡的方式，使其結構轉形產生中孔洞結構。因此可見CYCU-4這種兼具微孔洞與中孔洞的新穎材料的具有廣泛應用的潛力，例如：本發明便以CYCU-4做為固態「載體」(carrier)固定附載FITC標記之生物性催化劑(biocatalyst)胰蛋白酶，以製備生物反應器，並進而構成一效能良好的生物反應系統。
實施例3：MIL-101之製備
關於本發明另一較佳實施態樣Trypsin-FITC@ MIL-101(Cr)生物反應器，其所採用的MIL-101(Cr)即[Cr3 O(BDC)3 (F)(H2 O)2 ]．25H2 O係按照Férey,G.等人所提出之製備方法製得(發表於Science 2005,309,2040.)；因此，簡言之，本發明採用之MIL-101(Cr)係採水熱合成方法，以硝酸鉻(Cr(NO3 )3 ．9H2 O；chromium nitrate nonahydrate；400mg；1.0mmol)、對苯二甲酸(C8 H6 O4 ；terephthalic acid；166mg；1.0mmol)氫氟酸(HF；0.2ml)與水(5ml)混合置入23ml規格鐵氟龍的高壓反應釜(Teflon-autoclave)於220℃加熱8小時， 產生綠色粉末狀的產物，蒐集此產物並過濾，接著於室溫下以純水與乙醇沖洗之；其後，以DMF對產物加熱1天並接著於乙醇中攪拌隔夜，以進一步活化材料；最後將MIL-101(Cr)產物真空抽乾，並以150℃加熱1天，以供後續作為生物反應器之材料使用。至於MIL-101(Cr)製備生物Trypsin-FITC@ MIL-101(Cr)生物反應器之方法，實質上同於前述使用CYCU-4製備生物反應器之方法，亦已詳述於本發明所述之生物分子固定方法，故不再贅述。
實施例4：以胰蛋白酶聯接FITC構成吸附體並固定附載至MOFs
首先混合以下三種溶液：(1)50μL的胰蛋白酶溶液(其中之胰蛋白酶已由TPCK(L-(tosylamido-2-phenyl)ethyl chloromethyl ketone)處理，其濃度為6000μg mL-1 )；(2)50μL FITC(5mM)；與(3)50μL碳酸鈉緩衝液(濃度100mM)。以渦流震盪的方式混合，可得均質化的混合物，將其置入裝有室溫的水的燒杯，以微波方式加熱2分鐘(微波條件與設備：180W；SAMPO微波爐型號：RE-1002SM)，即可將胰蛋白酶聯接FITC成為吸附體：Trypsin-FITC。 其後，依本發明將Trypsin-FITC固定附載至特定MOF上(例如：CYCU-4或MIL-101(Cr))：係將MOF(1mg)加入Trypsin-FITC溶液，使MOF懸浮分散於其中；接著以渦流震盪的方式，於室溫下混合30分鐘，便可將Trypsin-FITC固定附載至MOF，即製得對應之生物反應器Trypsin-FITC@MOF；並且在後續使用於生物反應(例如進行胰蛋白酶水解反應)之前，先行以100μL的磷酸鹽緩衝液清洗三次後方使用之。
實施例5：BSA變性
執行受體蛋白質變性，以供後續水解分析用途，係本領域常用之技術手段。因此，根據本發明較佳之實施態樣，針對BSA之變性的步驟如下述。首先，採用10mg冷凍乾燥之BSA蛋白，使其懸浮回溶至1mL的含有尿素(urea，6M)及Tris緩衝液系統(100mM)的溶液中。將5μL二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)還原劑(200mM)加入分裝於1.5mL離心管，體積為100 μL的BSA溶液(10mg/mL)中，渦流震盪混合後，於室溫靜置1小時。將20μL的碘乙酰胺(iodoacetamide；IAA)烷化試劑(200mM)加入上述溶液並渦流震盪混合，於室溫下避光進行烷化反應(alkylation process)1小時。其後，另加入20μL之二硫蘇糖醇至反應後的溶液中並稍加渦流震盪混合，以耗盡未反應的碘乙酰胺，此步驟室溫下反應共1小時。之後再以775μL的去離子水與上述溶液混合，以減低尿素濃度至約0.6M，使胰蛋白酶得以保有其活性，進行後續生物反應。
實施例6：Trypsin-FITC@MOF水解BSA反應(digestion)
取變性後的BSA 100μL與Trypsin-FITC@MOF生物反應器，稍加渦流震盪混合，並施以超音波方法2分鐘幫助水解反應，取得胜肽溶液。以離心5分鐘的方式將胜肽溶液與固態的Trypsin-FITC@MOF生物反應器分離，其後以1μL醋酸溶液(acetic acid solution；17.4M)加入分離後的胜肽溶液中以中止水解反應。接著將取得的酸化的上清液以ZIP-TIP-C18根據製造商使用指示操作去鹽。並將所得之胜肽溶液以含5%乙腈(acetonitrile，ACN)之醋酸氨溶液(ammonium acetate solution；50mM,pH 8.75)加以稀釋，以進行後續的nano-LC-MS分析。
實施例7：nano-LC-MS分析方法
依照Hsu等人(Journal of Chromatography A 2011,1218,350.)提出的方法調整，採用poly(SMA-DVB-VBTA)(全名：poly(stearyl methacrylate-divinyl benzene-vinylbenzyltrimethylammouium))連續柱狀層析管柱(70cm長度；75μm I.D.)作為分離管柱執行nano-LC-MS分析。首先以100%溶劑A(組成v/v：95%水、5% ACN、0.1% FA)平衡管柱，將BSA胜肽以梯度模式與溶劑B(組成v/v：20%水、80% ACN、0.1% FA)進行分離(gradient mode；條件0-10分鐘：100%溶劑A；10-60分鐘：100%-30%溶劑A；60-65分鐘：30%-0%溶劑A)；流速為250nL/min。由層析儀用自動注射器(Dionex)與1μL樣品管(sample loop)注入0.5μL待測樣品。Nano-LC-ESI-MS分析設 備如下：UltiMate 3000 Nano-LC system(Dionex,Amsterdam；The Netherlands)連結質譜聯用儀(Bruker-Daltonik；Germany)並配有電噴灑(nanoelectrospray ionization source；Bruker)，以HyStar 3.2(BrukerDaltonik)整合操作與控制。其餘操作步驟與流程係屬本領域常用之技術手段，不加以贅述，惟數據分析之依據為Mascot資料庫，係根據分析後之數據比對Mascot資料庫中對應序列，運算後可取得「序列覆蓋率」。
實施例8：Trypsin-FITC@CYCU-4生物反應器胰蛋白酶活性與承載效能(loading capacity)檢測
胰蛋白酶活性係藉由分析N-α-benzoyl-DL-arginine(BAPNA)受到Trypsin-FITC@CYCU-4生物反應器水解生成對-硝苯胺(p-nitroaniline)之量化結果而得，即針對BAPNA水解後的產物進行偵測，係以分光光度計偵測UV-V於波長405nm之吸光值。將500μL 1mM BAPNA溶液(溶於10mM磷酸鈉緩衝液；pH 7.9)加入Trypsin-FITC@CYCU-4生物反應器懸浮液中，反應15分鐘後，以離心方法將Trypsin-FITC@CYCU-4分離並將剩餘上清液以UV-V於波長405nm偵測其吸光值，並加以運算定量，便可得知胰蛋白酶活性。
關於Trypsin-FITC@CYCU-4生物反應器之胰蛋白酶承載效能檢測亦基於類似原理，可採用螢光方法(fluorescence emission method)分別偵測BAPNA之水解現象：首先，針對Trypsin-FITC溶液偵測其於固定附載於CYCU-4之前與之後的螢光發散強度，可推知Trypsin-FITC固定附載於CYCU-4之量，即表承載效能。經由溶液體積(500μL)校正並根據胰蛋白酶初始濃度(2000μg/mL)，可推知Trypsin-FITC@CYCU-4生物反應器之胰蛋白酶承載效能約每單位(mg)MOF可承載55.2μg之胰蛋白酶(即55.2μg trypsin/mg MOF)。
此外，亦可採用活性檢測測定胰蛋白酶承載效能，係比較自由態之胰蛋白酶(溶液內胰蛋白酶：2000ppm)與Trypsin-FITC@CYCU-4生物反應器各別與BAPNA產生水解反應後所反映出之UV吸光值，其間的比例便可運算出之胰蛋白酶承載效能，基於此方法可推算Trypsin-FITC@CYCU-4生物反 應器之胰蛋白酶承載效能約每單位(mg)MOF可承載63.2μg之胰蛋白酶(即63.2μg trypsin/mg MOF)，相當接近於以UV吸光值測定之結果。
實施例9：CYCU-4與MIL-101(Cr)之特性
利用掃描式電子顯微鏡(SEM)分析本發明所採用之較佳MOFs材料：CYCU-4所示與MIL-101之外觀與尺寸，如第4圖所示；並分析其用於本發明提出之生物分子固定方法之所產生的效應。由第4圖可知，CYCU-4所示與MIL-101均成功地經由本案所提出之生物分子固定方法固定附載了Trypsin-FITC。同時請參考第6圖，係CYCU-4與MIL-101(Cr)兩類生物反應器較佳之基材及對應製備之中間物與產物(即Trypsin-FITC@CYCU-4與Trypsin-FITC@ MIL-101(Cr))之X光繞射分析(powder X-ray diffraction，PXRD)結果。根據第4圖e)、f)、g)、h)與第6圖(B)，係呈現了MIL-101(Cr)於固定附載吸附Trypsin-FITC之後型態改變不明顯，但卻產生了顆粒聚集的現象，顯示MIL-101(Cr)之結構穩定性與剛性；然而，根據第4圖a)、b)、c)、d)與第6圖(A)，CYCU-4隨著固定附載胰蛋白酶的過程中，其結構產生了明顯變化，例如其結晶性減低，且孔洞結構逐漸趨變為中孔洞型態(可同時參見第5圖)。
基於觀察FITC具可激發螢光之特性(激發光波長450-488)，故針對CYCU-4與MIL-101(Cr)對於Trypsin-FITC確切地固定附載效果，可藉由觀察螢光而得，例如使用共軛聚焦雷射掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscopy，CLSM)確認FITC分子是否確實進入了MOF之中(實際而言，CYCU-4可觀察到有些微的自體螢光，而MIL-101(Cr)則無此現象)，亦即隨著Trypsin-FITC成功地進入並吸附至MOF後，便增強螢光訊號，而此現象又以CYCU-4系統最為明顯(參照第7A、7B圖)。
另一方面，以氬雷射光束進行CLSM分析可調整z軸向位置而激發不同深度的Trypsin-FITC發出螢光，進而觀察不同深度層的螢光訊號。而分析這些CLSM影像與其對應建構出的3D影像顯示，這些MOF基材中不同深度的螢光分布情形趨向一致，代表Trypsin-FITC不僅是分散吸附於MOF的表 面，而是深入MOF且遍佈於顆粒之中。
此外，根據前述結果可知CYCU-4系統所構成之基材隨著吸附作用而結構產生改變，然而其附載Trypsin-FITC特性卻不受影響。參見表4所記載的MOF之孔洞結構相關參數可知，即使CYCU-4的結構隨環境產生變化，卻不顯著影響其吸附並附載FITC的能力。此外，CYCU-4系統隨著固定吸附過程表面積卻於吸附FITC或Trypsin-FITC之後均產生大幅減低的現象(減低幅度分別為FITC@CYCU-4：97.3%；Trypsin-FITC@CYCU-4：98.2%)，顯示CYCU-4不受胰蛋白酶吸附之影響。因此，初始狀態的CYCU-4具高度微孔洞的特性，賦予其良好的吸附FITC能力，而隨著吸附FITC或TryPsin-FITC過程，CYCU-4孔洞結構產生形變，亦即由微孔洞結構變化產生中孔洞結構，這樣的變化可能導致產生更多的空間(free space)與內部孔道以容納胰蛋白酶大分子，均使其作為生物反應器之效能具有較佳的表現。另一方面，當以同於CYCU-4之原料與組成，以不同的製備方式而製備出不具微孔洞特性或結晶性之材料，則其用於生物反應器之特性如FITC捕捉能力、胰蛋白酶水解能、可重複使用性等，便隨之大幅減低(參見表1與表2)。因此適當的「微孔洞特性」或「結晶性」可能是賦予Trypsin-FITC@CYCU-4良好效能所不可或缺。
至於MIL-101(Cr)系統，其隨著固定吸附過程，孔洞尺寸無明顯變化，且其表面積於吸附FITC或Trypsin-FITC之後產生小幅減低的現象(減低幅度分別為FITC@MIL-101(Cr)：13%；Trypsin-FITC@MIL-101(Cr)：4.7%)。而前述內容顯示，MIL-101(Cr)對於FITC吸附的能力最高，但其可重複使用的特性並不顯著(Trypsin-FITC@ MIL-101(Cr)重複使用第3次即失去水解BSA之效能)，可能的理由是MIL-101(Cr)的孔洞尺寸約同於FITC大小，使其吸附FITC後，表面積明顯減少達13%；然而，當胰蛋白酶存在時，Trypsin-FITC吸附後，由於大分子的胰蛋白酶可能屏蔽FITC的結構，減低其進入MIL-101(Cr)的量，產生了較小幅度的表面積縮減及其對於Trypsin-FITC較弱的吸附能力，進而減弱其生物反應效能與可重複使用之特性。
故經上述對照實驗之分析結果可見，相較於傳統方法動輒十多小時的固定附載時間與繁複的反應條件控制，本發明提供之方法僅需藉由渦流震盪步驟，以15至60分鐘左右的固定附載時間即可有效完成固定附載，關於本發明與現常用之固定附載技術之比較與效果，詳請參見表5。
30‧‧‧吸附體
40‧‧‧基材
50‧‧‧受體
300‧‧‧生物反應系統
【技術領域】
本發明係關於一種分子固定方法，尤其關於一種生物分子固定方法(Immobilization)，及應用此方法的生物反應系統；特別是關於一種以吸附方式固定生物分子之方法，以及採用此方法製備而得之生物反應系統。

Claims (9)

  1. 一種分子固定方法，係用於進行一生物反應，其特徵在於包含以下步驟：提供一生物分子與一引導分子，該生物分子為一具有催化能力且用於吸附目標的蛋白質酶，而該引導分子為一小分子染劑或標記物，其分子體積小於2×2×2nm3 ，且該引導分子與該生物分子之官能基產生聯接；執行一微波步驟，加熱該生物分子及該引導分子，使該生物分子聯接至少一該引導分子，以形成一吸附體；提供一具有孔洞結構之基材，該基材為一金屬有機骨架材料，將該吸附體與該基材混合，形成一混合物，使得該基材與該吸附體均勻分散於該混合物中；以及執行一渦流震盪步驟處理該混合物，其中，該渦流震盪步驟係提供該吸附體吸附至該基材所需的能量，藉由該引導分子帶領該生物分子進入該基材之孔洞結構中，使該吸附體吸附並且固定至該基材之孔洞結構，以形成一生物反應器。
  2. 根據申請專利範圍第1項所述之分子固定方法，其中該微波步驟之執行時間係介於1至5分鐘。
  3. 根據申請專利範圍第1項所述之分子固定方法，其中該渦流震盪步驟之執行時間係介於10至60分鐘。
  4. 根據申請專利範圍第1項所述之分子固定方法，其中該金屬有機骨架材料係一鋁基金屬有機骨架材料，且該鋁基金屬有機骨架材料之孔洞結構之孔徑係介於0.8至2.1nm。
  5. 根據申請專利範圍第1項所述之分子固定方法，其中該小分子染劑或標記物為異硫氰酸螢光素。
  6. 根據申請專利範圍第1項所述之分子固定方法，其中該蛋白質酶為胰蛋白酶。
  7. 一種生物反應器，該生物反應器係依據申請專利範圍第1至6項中任一項所述之該分子固定方法而製得之該生物反應器。
  8. 一種生物反應系統，係包含根據申請專利範圍第1至6項中任一項所述之該分子固定方法而製得之該生物反應器、一緩衝液及一受體，其中該生物反應器係催化該受體以進行一生物反應。
  9. 根據申請專利範圍第8項所述之生物反應系統，其中該受體係含有賴胺酸與精胺酸之蛋白質。
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