KR20160003287A - Ｇｐｃ３ 키메라 항원 수용체 단백질을 코딩하는 핵산 및 ｇｐｃ３ 키메라 항원 수용체 단백질을 발현하는 ｔ임파세포 - Google Patents

Ｇｐｃ３ 키메라 항원 수용체 단백질을 코딩하는 핵산 및 ｇｐｃ３ 키메라 항원 수용체 단백질을 발현하는 ｔ임파세포 Download PDF

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Abstract

휴먼 T임파세포 표면에서 발현되는 키메라 항원 수용체 단백질을 코딩하는 핵산으로써, 상기 키메라 항원 수용체 단백질은 순서적으로 연결된 세포외 결합영역, 막관통영역 및 세포내 신호영역을 포함하며, 그중 상기 세포외 결합영역은 특이적으로 GPC3의 C말단 항원결정부를 식별하는 단사슬항체 scFv(GPC3)를 포함한다. 표면에서 일종의 키메라 항원 수용체를 발현하며, 상기 키메라 항원 수용체가 상기 핵산이 코딩되어 발현되는 형질전환 T임파세포.

Description

ＧＰＣ３ 키메라 항원 수용체 단백질을 코딩하는 핵산 및 ＧＰＣ３ 키메라 항원 수용체 단백질을 발현하는 Ｔ임파세포{NUCLEIC ACID OF CODED GPC3 CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR PROTEIN AND T LYMPHOCYTE EXPRESSING GPC3 CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR PROTEIN}
본 발명은 종양세포 치료 분야에 관한 것이며, 더 구체적으로는, 특이적으로 GPC3를 발현하는 상피유래 종양의 형질전환 T임파세포 치료분야에 관한 것이다.
글리피칸-3(Glypican,GPC3,혹은DGSX, GTR2-2, MXR7, OCI-5, SDYS, SGB, SGBS 또는 SGBS1)은 일종의 세포표면 단백질이며, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(heparin sulfate proteoglycan, HSPG) 패밀리에 속한다. GPC3 유전자는 코딩을 통해 70-kDa정도의 전구체 핵심단백질을 생성하며, 상기 전구체 핵심단백질은 푸린(furin)에 의해 잘려 40-kDa정도의 가용성이며 혈액에 들어갈수 있는 아미노 말단(N-말단) 펩티드와 30-kDa정도의 2개 헤파란황산(HS) 사슬을 포함한 막결합의 카르복시말단(C-말단) 펩티드를 생성한다. GPC3단백질은 글리코실포스파티딜이노시톨(glycosylphosphatidylinositol，GPI) 앵커(anchor)를 통해 세포막에 부착되어 있다.
GPC3은 태아의 간장에서 고도로 발현되나 정상적인 성인의 간조직에서 발현되지 않는다. 그러나 간세포 간암에서 발현되며, 간암의 발생 및 진행과 밀접한 관계를 가지고 있다. 간암 발생의 조기 발견율은 비교적 높으며, 또한 간암의 진행에 따라 발견율도 높아진다. 그러나 GPC3의 발현은 간선종, 담관세포암, 간전이암, 및 12종의 발생율이 높은 고형종양 및 21종의 비간암세포계에서 모두 발견되지 않는다. 또한 GPC3은 예하면 흑색종, 난소 투명세포암, 난황낭종양, 신경모세포종 등 종양에서도 발현된다. GPC3이 간세포간암, 흑색종 등 종양에서 특이적으로 높게 발현되는 것을 고려하여, 종양 면역치료의 하나의 후보 타겟으로 인정되고 있다.
항GPC3항체를 이용하여 간암검사를 진행하는 방안과 항GPC3 항체를 이용하는 항체의존성 세포독성(ADCC) 또는 보체의존성 세포독성(CDC) 연구방안이 이미 보도되어 있다. 일반적으로 치료에 사용되는 항체가 식별하는 것은 GPC3 단백질의 C말단이다. 그러나 항체치료에는 항체가 체내의 혈액순환 중에서 반감기의 제한을 받는 문제가 존재하고 있다. 일반적으로, 반감기는 대부분 23일 이내이다. 따라서, 약물을 지속적으로 투여하거나 및/또는 투여량을 증가하는 것이 종양 항체치료에서 요구하는 바이며, 이는 환자의 치료 코스트의 증가를 초래하며, 또한 일부 상황하에서는 부득불 치료를 중단시키지 않으면 안된다. 또한, 치료성 항체는 외인성 단백질로써, 체내에서 알레르기 반응을 일으키거나 또는 상기 치료성 항체에 대한 중화 항항체의 위험성이 존재한다.
종양면역반응에 있어서 T임파세포의 작용은 날이 갈수록 중요시되고 있다. T임파세포의 입양 면역치료는 일부분 종양에서 일정한 효과를 거두었으며, 이러한 면역치료법은 항체 치료의 상기 결함을 극복할 수 있으나, 대부분 종양 치료에서는 여전히 만족스럽지 못하다(Grupp SA, et al., Adoptive cellular therapy, Curr Top Microbiol Immunol, 2011, 344:149-72). 최근, CTL이 타겟세포에 대한 특이적 식별이 T임파세포 수용체(T Cell Receptor, TCR)에 의존한다는 발견에 따르면, 종양세포의 관련항원에 대한 항체인 scFv와 T임파세포 수용체인 CD3ζ 또는 FcεRIγ 등 세포내 신호활성화 모티프가 융합되어 키메라 항원 수용체(Chimeric antigen receptor，CAR)를 형성하며, 이를 렌티바이러스 감염 등 방법을 통해 T임파세포 표면에 유전자 변형을 시킨다. 이러한 CAR T임파세포는 주조직적합성 복합체(Major histocompatibility complex,MHC)로 비한정적인 방법으로 선택적으로 T임파세포가 종양세포를 목표로 하게 하며 특이적으로 종양세포를 죽이게 된다. CAR T임파세포는 종양면역 치료분야에 있어서 하나의 새로운 면역치료 책략으로 되고 있다(Schmitz M, et al., Chimeric antigen receptor-engineered T cells for immunotherapy of Cancer, J Biomed Biotechnol, 2010, doi: 10.1155/2010/956304).
키메라 항원 수용체는 세포외 결합영역, 막관통영역, 세포내 신호영역을 포함한다. 통상적으로, 세포외 결합영역은 종양 관련 항원을 식별할 수 있는 scFv를 포함하며, 막관통영역은 CD8, CD28등 분자의 막관통영역을 취하며, 세포내 신호영역은 타이로신기반면역수용체활성화모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM) CD3ζ 또는 FcεRIγ 및 보조자극 신호분자(co-stimulatory signaling molecule)인 CD28, CD137, CD134 등 세포내 신호영역을 취한다.
세포내 신호영역에 ITAM만을 포함한 제1세대 CAR T 임파세포에 있어서, 키메라 항원 수용체의 각 부분은 scFv-TM-ITAM의 형식으로 연결된다. 이러한 CAR T는 항종양의 세포독성 효과를 활성화시킬 수 있으나, 시토카인 분비가 비교적 적으며, 또한 체내에서 지속적으로 항종양 효과를 발휘할 수 없다(Zhang T. et al. Chimeric NKG2D-modified T cells inhibit systemic T-cell lymphoma growth in a manner involving multiple cytokines and cytotoxic pathways, Can Res 2007, 67(22):11029-11036.).
뒤따라 발전한 제2세대 CAR T임파세포는 CD28 또는 CD137(4-1BB라고도 함)의 세포내 신호영역을 포함하며, 키메라 항원 수용체의 각 부분은 하기 방식에 따라 연결된다. 즉, scFv-TM-CD28-ITAM 또는 scFv-TM-/CD137-ITAM. 세포내 신호영역에서 발생하는 B7/CD28 또는 4-1BBL/CD137 보조자극 작용에 의해 T임파세포의 지속적인 증식을 일으키며, T임파세포가 IL-2 및 IFN-γ등 시토카인을 분비하는 레벨을 제고시킬 수 있으며, 동시에, 체내에서의 CAR T의 생존주기 및 항종양 효과를 제고시킨다(Dotti G. et al., CD28 costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor modified T cells in lymphoma patients J Clin Invest, 2011, 121 (5):1822-1826).
최근에 발전을 가져온 제3세대 CAR T 임파세포에 있어서, 키메라 항원 수용체의 각 부분은 하기 방식에 따라 연결된다. 즉, scFv-TM-CD28-CD137-ITAM 또는 scFv-TM-CD28-CD134-ITAM. 이는 체내에서의 CAR T의 생존주기 및 항종양 효과를 진일보 제고시켰다(Carpenito C, et al., Control of large established tumor xenografts with genetically retargeted human T cells containing CD28 and CD 137 domains, PNAS, 2009, 106(9): 3360-3365).
CAR T임파세포는 종양면역 치료에서 매력적인 장래성을 가지고 있으나, 일부 잠재적인 위험을 고려해야 한다. 예하면, 일부분 또는 일부 종류의 정상조직에서 적게 발현되는 CAR이 식별할 수 있는 특이성 항원은 CAR T임파세포가 상응한 항원을 발현하는 정상적 조직의 손상을 일으킬 수 있기때문이다. 예하면, 신장세포암 환자의 종양세포에서 발현되는 항원 탄산무수화효소IX(carbonic anhydrase CAIX)는 처음으로 임상에 사용한 CAR T임파세포 입양 치료에 관한 예이며, 또한 처음으로 CAR세포를 포함한 오프 타겟 효과(off-target effect)를 보도한 예가 된다. 환자에게 여러차례 CAR T임파세포를 주입한 후 2~4레벨의 간독성을 나타냈다. 분석해본 결과, 그 원인은 간담관의 상피세포에서 CAIX가 적게 발현되는데 있었으며, 이로써 원래의 임상실험이 부득불 중단된 동시에 환자의 치료효과에 대한 임의의 평가도 배제되었다(Stoter G. et al. Treatment of metastatic renal cell carcinoma with autologous T-lymphocytes genetically retargeted against carbonic anhydrase IX: first clinical experience. J clin oncol, 2006, 24（13）: e20-e22.; Ngo MC., et al. Ex vivo gene transfer for improved adoptive immunotherapy of cancer. Human Molecular Genetics, 2011, R1-R7). 또한, CAR중의 과다한 보조 자극신호는 효과기세포의 활성화에 필요한 역치(threshold)를 감소시켜, 유전자 변형을 거친 T임파세포가 낮은 레벨의 항원 또는 항원에 의한 촉발이 없는 조건하에서도 활성화될수 있어, 이로하여 대량의 시토카인의 방출로 인해 이른바 "시토카인 폭풍(cytokine storm)"을 일으킬 수 있다. 이러한 신호 누설(signal leakage)로 인해 타겟외의 세포 독성을 일으키며, 이로써 비특이성 조직의 손상을 일으키게 된다. 예하면, Her2에 대한 제3대 CAR을 이용하여 간 및 폐에 전이한 말기 결장암 환자에 대하여 임상치료를 하는 과정에서 정상적인 폐조직에서 Her2가 적게 발현되어 일어난 "시토카인 폭풍"으로 인해 환자가 돌연사망하였다(Morgan RA, et al., Report of a serious adverse event following the administration of T cells transduced with a chimeric antigen receptor recognizing Erbb2 Molecular Therapy, 2010, 18 (4): 843-851).
따라서, 본 분야에서는 상기 결함을 극복한 GPC3 키메라 항원 수용체 단백질을 코딩하는 임파세포 종양 치료 방안에 대한 강렬한 수요가 존재하고 있다.
본 발명의 제1방면은, T임파세포 표면에서 발현되는 GPC3 키메라 항원 수용체 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이며, 발현되는 키메라 항원 수용체 단백질은 상기 수용체를 발현시키는 T임파세포가 GPC3를 많이 발현하는 종양세포에 대해 고도의 특이적 세포독성 작용을 갖게 한다. 상기 GPC3 키메라 항원 수용체 단백질은 순서적으로 연결된 세포외 결합영역, 막관통영역 및 세포내 신호영역을 포함하며, 그중 상기 세포외 결합영역은 특이적으로 GPC3의 C말단 항원결정부를 식별할 수 있는 단일사슬항체 scFv(GPC3)를 포함한다. 상기 키메라 항원 수용체 단백질의 세포외 영역은 CD8 경첩영역(hinge region)을 통해 CD8 또는 CD28막관통영역과 연결되며, 막관통 영역 뒤에 바로 세포내신호영역이 연결된다.
본 발명의 핵산 서열은 DNA 또는 RNA 형식일 수 있다. DNA형식은 cDNA, 게놈DNA 또는 인공합성DNA일수도 있다. DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. DNA는 코딩가닥 또는 비코딩 가닥일 수 있다. 본 발명의 키메라 항원 수용체 단백질 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 코돈은 축중(degeneracy) 특성을 가지고 있을 수 있다. 즉, 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 여러가지 축중 아미노산서열은 모두 본 발명의 범위내에 포함된다. 대응한 아미노산을 코딩하는 축중 아미노산 코돈은 본 분야의 숙지의 내용이다. 본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오티드(polynucleotide)의 변이체에 관한 것이며, 이는 본 발명과 동일한 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 단편, 유사체 및 유도체를 코딩한다. 상기 폴리뉴클레오티드 변이체는 천연적으로 생성된 대립유전자 변이체(allelic variants) 또는 비천연적으로 생성된 변이체일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드 변이체는 치환 변이체, 결실 변이체 및 삽입 변이체를 포함한다. 예하면, 본 분야에서 알고 있는 대립유전자 변이체는 하나의 폴리뉴클레오티드의 대체형식이며, 이는 하나 또는 여러개의 뉴클레오티드의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있으나, 실질적으로 코딩하는 폴리펩티드의 기능을 개변시키지는 않는다.
본 발명은 또한 상기 서열과 잡종화(hybridize)되었으며, 또한 두개의 서열사이에 적어도 50%, 비교적 바람직하게 적어도 70%, 더 바람직하게 적어도 80%, 최적화하게 적어도 90% 또는 95% 상동성을 가진 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 특히 엄격한 조건하에 본 발명의 상기 폴리뉴클레오티드와 하이브리다이즈 가능한 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명에 있어서, "엄격한 조건"은, (1)비교적 낮은 이온강도 및 비교적 높은 온도하에 하이브리다이징 및 용리키는 것, 예하면, 0.2 X SSC, 0.1% SDS, 60℃: 또는 (2)하이브리다이징 시에 변성제를 가하는 것, 예하면, 50% (v/v) 포름아미드, 0.1% 송아지 혈청/0.1% Ficoll, 42℃ 등: 또는 (3)2가닥 서열 사이의 상동성이 적어도 90%이상, 바람직하게 95%이상인 경우에만 하이브리다이징이 발생하는 것이다. 또한, 하이브리디제이션이 가능한 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드와 SEQ ID NOs: 22 내지 25 중의 하나가 나타내는 성숙된 폴리펩티드가 동일한 생물학 기능 및 활성을 가지는 것이다.
휴먼 GPC3의 C말단 항원결정부(epitope)를 특이적으로 인식하는 단일 클론 항체는 이미 중국특허문헌 CN101186650A(중외제약 주식회사) 등에 공개 되었으며, 또한 문헌Advances in Liver Cancer Antibody Therapies: A Focus on Glypican-3 and Mesothelin, BioDrugs 2011 October 1; 25 (5):275-284에는 기타 이미 알고 있는 C말단 항원결정부를 특이적으로 인식하는 단일 클론 항체인 GC33 및 hGC33도 각각 보도 되었으며, GPC3에 대한 항원 결정기 (antigenic determinant)는 C 말단 524-563위 아미노산 잔기에 위치하고 있으며, 동시에 보도된 것으로는 GPC3-C02 및 1G12 등 단일 클론 항체가 포함된다. 이러한 공개된 단일 클론 항체는 본 발명의 핵산이 코딩하는 키메라 항원 수용체 단백질 중의 단일사슬 클론 항체 부분의 제조에 사용될 수 있다. GPC3의 C말단 항원결정부를 식별할 수 있는 기타 단일 클론 항체도 적합한 방식으로 본 발명에 사용할 수 있다.
단일사슬 항체 scFv(GPC3)는 상기 공개된 GPC3 단일 클론 항체의 서열에 근거하여, 유전자 공학방법 및 화학합성 방법으로 제조할 수 있다. 본 발명에서 사용한 용어 "단일 사슬 항체(scFv) 단편"은 하기 정의의 항체 단편을 가리키며, 이는 링커(linker)를 통해 중사슬 가변영역(VH) 및 경사슬 가변영역(VL)을 결합한 재조합 단백질을 포함하며, 링커에 의해 상기 두개 구성영역이 상호 연관되며, 최종적으로 항원결합부를 형성하게 된다. scFv의 크기는 일반적으로 하나의 완전한 항체의 1/6이다. 단일 사슬 항체는 바람직하게 한가닥의 뉴클레오티드에 의해 코딩된 한가닥의 아미노산 사슬 서열이다. 본 발명에서 사용한 단일사슬 항체는 본 분야의 기존의 통상적 기술, 예하면 아미노산 결실, 삽입, 치환, 증가 및/또는 재조합 및/혹은 기타 변형방법을 단독 또는 결합하여 진일보 변형시킬수 있다. 일종 항체의 아미노산 서열에 근거하여 DNA서열에 이러한 변형을 인입하는 방법은 본 분야의 기술자들이 숙지하고 있는 것이다. 예하면, Sambrook, 분자 클로닝, 실험 매뉴얼, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y이다. 상기 변형은 바람직하게 핵산 레벨에서 진행한다. 상기 단일사슬 항체에는 그의 유도체도 포함될수 있다. 본 발명 중 "항체의 유도체"는, 예하면 파아지 디스플레이 기술(phage display technology)을 통해 얻은 상기 항체의 유도체일 경우, BIAcore 시스템 등에서 사용한 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance)기술을 통해 GPC3 항원결정부와 결합하는 파아지 항체의 효율을 증가시킨다(Schier, Human Antibody Hybridomas, 7(1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods, 183(1995), 7-13). 또한, 예를 들어 WO89/09622에 기재된 키메라 항체의 제조방법, EP-A10239400 및 WO90/07861에 기재된 휴먼화 항체(humanized antibodies)의 제조방법, WO91/10741, WO94/02602 및 W096/33735에 기재된 마우스 중의 휴먼항체 등 이종항체의 제조에 의해 생성된 항체의 유도체도 포함한다.
본 발명의 기술용어 "특이적 식별"의 의미는 본 발명의 2중 특이성 항체가 타겟항원 외의 임의의 폴리펩티드와 거의 또는 전혀 교차반응을 하지 않음을 나타낸다. 그의 특이성 정도는 면역학 기술을 통해 판단할 수 있으며, 면역블러팅법(immunoblotting), 면역친화성 크로마토그래피(immunoaffinity chromatography), 유세포분석(flow cytometry analysis) 등을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 본 발명에 있어서, 특이적 식별은 바람직하게 유세포분석 기술을 통해 확정할 수 있으나, 구체적 상황하에서 특이성 식별 기준은 본 분야의 일반 기술인들이 장악한 본 분야의 상식에 의해 판단된다.
키메라 항원 수용체의 막관통영역은 CD8 또는 CD28 등 단백질의 막관통 영역에서 선택할 수 있다. CD8 또는 CD28은 T임파세포 표면의 천연 마커(natural marker)이다. 휴먼CD8 단백질은 αβ 또는 γδ의 두개 사슬로 이루어진 이질이합체(heterodimer)이다. 본 발명의 한 실시방안에 있어서, 막관통영역은 CD8α또는 CD28의 막관통영역에서 선택된다. 또한, CD8α경첩영역(hinge region)은 하나의 유연성 영역이며, 이로써, CD8 또는 CD28 막관통 영역은 경첩영역과 함께 키메라 항원 수용체 CAR의 타겟식별 도메인scFV 및 세포내 신호영역을 연결시킨다.
세포내 신호영역은 CD3ζ, FcεRIγ, CD28, CD137, CD134 단백질 세포내 신호영역 및 이들의 조합에서 선택할 수 있다. CD3 분자는 5개의 서브유닛으로 조성되며, 그중, CD3ζ서브유닛(또는 CD3 zeta, 약칭Z)은 3개의 ITAM 모티프를 포함하며, 상기 모티프는 TCR-CD3복합체에 있어서 중요한 신호 전달영역이다. CD3δZ(하기 DZ라고 약칭)는 잘려진 ITAM 모티프를 포함하지 않는 CD3ζ서열이며, 본 발명의 실천 중에서 음성대조군으로 구축된다. FcεRIγ는 주로 비만세포 및 호염기성 세포(mast cells and basophils)표면에 분포되며, 하나의 ITAM 모티프를 포함하며, 구조, 분포 및 기능에 있어서 CD3ζ와 유사하다. 그외, 전술한바와 같이,CD28, CD137, CD134 는 보조자극 신호분자이며, 각자의 리간드와 결합한 후 그의 세포내 신호영역에서 보조자극 작용에 의해 T임파세포의 지속적인 증식을 일으키며, T임파세포가 IL-2 및 IFN- γ 등 시토카인을 분비하는 레벨을 제고시킬 수 있으며, 동시에 CAR T임파세포가 체내에서 생존하는 주기와 항종양 효과를 높일 수 있다.
본 발명의 핵산이 코딩하는 GPC3 키메라 항원 수용체 단백질은 하기 방법 순위로 연결된 키메라 항원 수용체 단백질에서 선택할 수 있다.
scFv(GPC3)-CD8-CD3ζ,
scFv(GPC3)-CD8-CD137-CD3ζ,
scFv(GPC3)-CD28a-CD28b-CD3ζ,
scFv(GPC3)-CD28a-CD28b-CD137-CD3ζ,
및 이들의 조합. 그중, 관련 키메라 항원 수용체 단백질에 있어서, CD28a는 CD28 분자의 막관통영역을 대표하며, CD28b는 CD28 분자의 세포내 신호영역을 대표한다. 상기 각종 타겟 GPC3의 키메라 항원 수용체를 cFv(GPC3)-CAR로 총칭한다.
본 발명의 한 실시방안에 있어서, 본 발명의 핵산은 SEQ ID NOs: 18 내지 21에 표시된 서열을 가지고 있다. 본 발명의 다른 실시방안에 있어서, 본 발명의 핵산은 SEQ ID NOs: 22 내지 25중 하나의 키메라 항원 수용체 단백질을 코딩하는 핵산이다.
본 발명의 두번째 방면에서, T임파세포 표면에서 발현되는 키메라 항원 수용체 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터(vector)를 포괄한다.하나의 구체적인 실시방안에 있어서, 본 발명에서 사용한 벡터는 일종의 렌티바이러스(lentivirus) 벡터 pPWT-eGFP이다. 상기 플라스미드(plasmid)는 제3세대 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터 시스템에 속하며, 상기 시스템은 3개 플라스미드, 즉 단백질Gag/Pol 및 Rev단백질을 코딩하는 패캐징 플라스미드(packaging plasmid) psPAX2; VSV-G단백질을 코딩하는 외피 플라스미드(envelope plasmid) PMD2.G; 및 빈 벡터(empty vector) pPWT-eGFP를 가지고 있으며, 빈 벡터는 타겟 핵산서열을 재조합을 통해 도입할 수 있으며, 즉, CAR 을 코딩하는 핵산서열의 도입에 사용될 수 있다. 빈 벡터 pPWT-eGFP(자체가 후속 실험중의 mock 벡터이다)에 있어서, 연장인자(elongation factor)-1α (EF-1α) 프로모터(promoter)는 강화형 녹색 형광단백질(enhanced green fluorescent protein (eGFP))의 발현을 조절한다. CAR을 코딩하는 타겟 핵산서열을 포함한 재조합 발현 벡터pWPT- -F2A-CAR은 구제역 바이러스(food-and-mouth disease virus,FMDV)유래의 리보솜 스킵서열(ribosomal skipping sequence 2A, 2A라고 약칭)을 통해 eGFP와 CAR의 동시발현(coexpression)을 실현한다. 하나의 구체적인 실시방안에 있어서, 본 발명의 벡터는 SEQ ID NOs: 27 내지 30 중 하나의 핵산서열을 가지고 있다.
본 발명의 세번째 방면에 있어서, 상기 벡터를 포함한 바이러스를 포괄한다. 본 발명의 바이러스는 패키징된 감염능력을 가진 바이러스를 포함하며, 감염성을 가진 바이러스의 패키징에 필요한 성분을 구비한 패키징에 사용될 바이러스도 포함한다. 본 분야에서 이미 알고 있는 기타 T임파세포를 형질주입하는 바이러스 및 그에 대응한 플라스미드도 본 발명에 사용된다.
본 발명의 한 실시방안에 있어서, 상기 바이러스는 상기 pWPT-eGFP-F2A-CAR 재조합 벡터(즉, scFv(GPC3)-CAR을 포함)를 포함하는 렌티바이러스이다.
본 발명의 네번째 방면에 있어서, 형질전환 T임파세포를 포함하며, 이는 본 발명의 핵산 또는 본 발명의 상기 핵산을 포함한 재조합 플라스미드가 형질주입되어 있거나, 또는 상기 플라스미드를 포함하는 바이러스를 포함한다. 본 분야의 통상적인 핵산 형질주입 방법에 있어서, 비 바이러스 및 바이러스를 포함한 형질주입 방법이 모두 본 발명에 사용된다. 비 바이러스 형질주입 방법에는 전기천공법(electroporation) 및 트렌스포손법(transposon)이 포함된다. 최근, Amaxa회사에서 개발한 뉴클레오펙션기인 뉴클레오펙터(Nucleofector)는 직접 외래성 유전자를 세포핵에 도입시켜 타겟 유전자의 고 효율성 형질주입을 실현할 수 있다. 또한, 슬리핑 뷰티 트렌스포손(Sleeping Beauty system) 또는 PiggyBac 프랜스포손 등 트렌스포손 시스템에 의한 형질주입 효과가 일반적인 전기천공법에 비해 훨씬 높으며, 뉴클레오펙션기인 뉴클레오펙터(Nucleofector)와 슬리핑 뷰티 트렌스포손의 결합 사용이 이미 보도되어 있다(Davies JK, et al., Combining CD 19 redirection and alloanergization to generate tumor-specific human T cells for allogeneic cell therapy of B-cell malignancies, Cancer Res, 2010, 70(10). 이 방법은 비교적 높은 형질주입 효율을 가지고 있을 뿐만아니라 타겟 유전자의 부위 특이적 조합도 실현할 수 있다. 본 발명의 한 실시방안에 있어서, 키메라 항원 수용체 유전자 변형의 T임파세포의 형질주입을 실현하는 방법은, 레트로바이러스(retrovirus) 또는 렌티바이러스 등 바이러스에 의한 형질주입 방법이다. 이 방법은 형질주입 효율이 높고 외래성 유전자가 안정적으로 발현될 수 있으며, 또한 T임파세포가 체외배양에서 임상 레벨의 수량에 달하는 시간을 단축시킬 수 있는 등 장점을 갖고 있다. 상기 형질전환 유전자 T임파세포 표면에서, 형질주입된 핵산은 전사, 번역을 통해 표면에서 발현된다. 각종 부동한 배양을 거친 종양세포에 대한 체외 세포 독성실험을 통해, 본 발명의 표면에서 키메라 항원 수용체를 발현하는 형질전환 유전자의 T임파세포가 종양세포에 대해 고도의 특이적 살상 효과(세포 독성이라고 한다)를 가지고 있음을 증명하였다. 따라서, 본 발명의 키메라 항원 수용체 단백질을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 플라스미드, 상기 플라스미드를 포함하는 바이러스 및 상기 핵산, 플라스미드 또는 바이러스가 형질주입 된 형질전환 유전자 T임파세포는 종양의 면역 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 한 실시방안에 있어서, 본 발명의 T임파세포는 그의 세포표면에서 일종의 키메라 항원 수용체를 발현시키며, 상기 키메라 항원 수용체는 SEQ ID NOs: 18 내지 21 중의 하나의 핵산으로부터 코딩되어 발현된다. 다른 한 실시방안에 있어서, 본 발명의 형질전환 유전자 T임파세포 표면에서 일종의 키메라 항원 수용체를 발현시키며, 상기 키메라 항원 수용체의 아미노산 서열은 SEQ ID NOs: 22 내지 25중의 하나이다.
도1은 예시한 본 발명의 CAR를 코딩하는 서열을 포함한 렌티바이러스 벡타 pWPT-eGFP-F2A-CAR의 구조를 나타내는 설명도이다.
도2는 예시한 렌티바이러스 벡타에 포함된 본 발명의 CAR의 부동한 영역사이의 연결관계를 나타내는 설명도이며, 그중, eGFP와 svFv (GPC3) 특이성 키메라 항원 수용체는 리보솜 스킵서열F2A에 의해 연결된다.
도3은 MluI-SalI 이중 효소 분해(double digestion)를 통해 실시예1의 렌티바이러스 플라스미드의 핵산을 동정한 전기영동도를 나타낸다. 그중, M1은 DS2000분자량 마커(광쩌우 동성생물과학기술 유한회사)이며, M2는 Hind III마커(광쩌우 동성생물과학기술 유한회사)이며, 라인1~5는 각각 하기와 같다.
1: pWPT-eGFP-F2A-GPC3-δ Ζ;
2: pWPT-eGFP-F2A-GPC3-Z;
3: pWPT-eGFP-F2A-GPC3-BBZ;
4: pWPT-eGFP-F2A-GPC3-28Z;
5: pWPT-eGFP-F2A-GPC3-28BBZ.
도4는 본 발명의 실시예2의 바이러스 감염CTL(세포독성 T임파세포)후 세포에서 발현되는 eGFP에 대해 유세포분석기(flow cytometry assays)를 통해 측정한 결과를 나타낸다.
도5는 본 발명의 실시예2에서 부동한 키메라 항원 수용체(CAR+)를 발현하는 CTL세포의 체외 생장 상황을 나타낸다. 도에서는 바이러스 감염 14일 후, 부동한 키메라 항원 수용체를 발현하는 CTL 세포가 체외에서 200배 증가함을 나타낸다.
도6A는 유세포분석기를 이용하여 측정한 각 간세포 간암세포계에서 발현되는 GPC3레벨을 나타내며, 세포에서의 GPC3의 발현을 평균 형광강도(Mean Fluorescence Intensity,MFI)로 표시한다. 도6B는 상기 각 세포계에서 발현되는 GPC3 레벨의 웨스턴 블롯(western blot) 결과를 나타내며, 그중, GAPDH는 로딩 대조군이다.
도7A는 GPC3 타겟 CAR T세포를 이용하여 Huh -7이식 종양를 치료한 후 시간의 변화에 따른 각 조내에서 종양이 없는 마우스의 백분비이다. 도7B는 조 당 6마리 마우스를 치사시킨 후, 각자 체내 종양 체적 크기를 나타낸다.
도8A는 실시예5의 각 조의 마우스의 잔여 종양의 체적 대조 결과를 나타낸다. 도8B는 실시예5의 각 조 마우스의 잔여 종양의 중량의 대조 결과를 나타낸다. 도8C는 T임파세포를 입양 주입 일주일 후 측정된 실시예5의 각 조 마우스의 말초혈액의 T세포 생존수량을 나타낸다. 도8D는 실시예5의 각 조 마우스 치사 후의 종양 상황을 나타낸다. 도8E는 실시예5에서 GPC3-28BBZ CAR T임파세포 치료 후 마우스의 종양이 감소(Mock조와 대조)되는 상황을 나타낸다.
도9는 실시예5의 입양 주입한 T세포가 각조의 마우스 이식 종양조직에서 집적된 면역조직 화학염색(immunohistochemical staining) 측정 결과를 나타낸다.
도10A는 실시예6의 각조 마우스의 이식종양 체적을 나타낸다. 도10B는 실시예6의 각조 마우스에서 실험이 끝난 후 종양 조직을 취하여 무게를 단 결과이다. 도10C는 실시예6의 각조 마우스의 종양 조직을 나타낸다. 도10D는 실시예6의 각조 마우스가 제일 마지막으로 T세포를 입양 전달 한 일주일 후 말초혈액의 T세포 수량을 측정한 결과를 나타낸다.
도11A 및 11B는 실시예7의 각조 마우스의 종양의 생물 형광강도 및 종양의 실제 이미지 사진을 나타낸다. 도11C 및 D는 각각 실시예7의 각조 마우스의 복부 종양 상황(체외) 및 해부 후 보이는 종양 상황을 나타낸다. 도11E는 제일 마지막으로 T세포를 입양 전달한 일주일 후, 각조 마우스의 말초혈액의 T세포 수량을 측정한 결과를 나타낸다. 도11F는 제일 마지막으로 T세포를 입양 전달한 일주일 후 각조 마우스의 말초혈액중 CAR 양성의 T세포 수량을 측정한 결과를 나타낸다. 도11G는 실시예7의 각조 마우스가 종양 접종 후 시간에 따른 생존율을 나타낸다.
하기, 구체적인 실시예를 결부시켜 본 발명을 진일보 설명하고자 한다. 이러한 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이지 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아님을 이해해야 한다. 하기 실시예에서 구체적인 조건을 표기하지 않은 실험방법은, 통상의 조건, 예하면 Sambrook등, "분자클로닝: 실험 메뉴얼(New York: Cold Spring Harbor laboratory Press, 1989)"에서 서술한 조건에 따라 진행하며, 실시예에서 시약회사 설명서가 있음을 명확하게 설명하였을 경우, 설명서에서 제안한 조건에 따라 진행한다.
실시예1 . 본 발명의 핵산으로 코딩된 키메라 항원 수용체 단백질을 발현하는 렌티바이러스 플라스미드의 구축 및 바이러스 패키징
하기 표는 본 발명에서 예시한 키메라 항원 수용체 각부분의 연결순서를 해석하였으며, 또한 상기 연결은 도2를 참고할 수 있다.
Figure pct00001
1.핵산 단편의 증폭
(1) scFv ( GPC3 ) 서열의 증폭
scFv (GPC3) 서열의 증폭에 있어서, 본 실험실에서 구축한 더블기능의 단일사슬 항체 뉴클레오티드 GPC3/CD3을 템플레이트(template)로 사용하며, 템플레이트의 서열은 중국 특허출원201210480326.x중의 SEQ ID NO: 9를 참조한다. 증폭에 사용되는 프라이머(primer)는 상류 프라이머 5'-gatgttgtgatgactcagtctc-3', (SEQ ID NO: 1), 및 하류 프라이머 5'-gcgctggcgtcgtggttgaggagacggtgaccag-3' (SEQ ID NO: 2)이며, 이를 이용하여 scFv (GPC3) 를 증폭시켰다. 타겟 증폭 밴드의 사이즈는 746bp이다. PCR증폭 조건은 초기 변성:94℃ , 4분; 변성: 94℃, 40 s; 어닐링(annealing): 58℃, 40 s; 및 연장(extension): 68℃ 40 s; 25 사이클 실행; 마지막 신장(final elongation):68℃, 10분. PCR 증폭 밴드는 아가로스겔 전기영동을 통해 예상한 단편의 사이즈에 부합됨을 확인하였다.
(2) 키메라 항원 수용체 기타 부분의 핵산서열
GPC3 키메라 항원 수용체 단백질의 scFv (GPC3)외 기타 부분의 핵산서열은 각각 특허출원번호201310108532.2에 공개된 서열SEQ ID NO: 1 내지 4를 템플레이트로 사용하여 PCR법을 통해 얻었다. 구체적으로, 그중 하기와 같은 각종GPC3 키메라 항원 수용체 단백질의 scFv (GPC3)외 CAR부분, 그중, CD8-CD3ζ(Ζ) 및 CD28a-CD28b-CD137-CD3ζ(28BBZ)은 각각 scFv(EFGR)-CD8-CD3ζ (특허출원201310108532.2중의 SEQ ID NO: 1) 및 ScFv(EFGR)-CD28a-CD28b-CD137-CD3ζ (특허출원201310108532.2중의 SEQ ID NO: 2) 를 템플레이트로, 상류 프라이머 5'-accacgacgccagcgccgcgaccac-3' (SEQ ID NO: 3) 및 하류 프라이머 5'-gaggtcgacctagcgagggggcagggcctgcatgtgaag-3' (SEQ ID NO: 4)를 이용하여 증폭하였다. PCR 증폭 조건은: 초기 변성: 94℃ , 4 분; 변성: 94℃, 40 s; 어닐링: 60℃,40 s; 및 연장: 68℃, 40 s; 25 사이클 실행; 마지막 신장(final elongation):68℃, 10분이다. 타겟 밴드는 각각 549 bp 및 816 bp,이며, PCR 증폭 밴드는 아가로스겔 전기영동을 통해 예상한 단편 사이즈에 부합됨을 확인하였다.
또한, CD8-CD3 델타 ζ (delta Z, 약칭 δΖ), CD8-CD137-CD3ζ (ΒΒΖ) 및 CD28a-CD28b-CD3ζ (28Z)는 각각 하기 방법을 통해 얻었다.
A)1ml의 트리졸(Invitrogen 회사)을 1×107 건강한 사람의 말초혈액의 단핵세포(상하이시 혈액센터에서 제공)에 가하여 세포를 용해시킨 후, 페놀-클로로포름 추출(phenol-chloroform extraction)법을 통해 토탈 RNA를 추출하였으며, 역전사 킷트 ImProm-IITM (Promega회사)를 이용하여 역전사를 통해 cDNA를 제조하였다. 상기 제조한 cDNA를 템플레이트로 하여 각각 하기 증폭을 진행하였다.
(i)상류 프라이머5'-gtcaccgtctcctcaaccacgacgccagcg-3' (SEQ ID NO: 5) 및 하류 프라이머 5'-ggtgataaccagtgacaggag-3' (SEQ ID NO: 6)를 이용하여 증폭시켜 CD8α 경첩영역-막관통영역을 얻었으며, PCR 증폭조건은, 초기 변성: 94℃ , 4 분; 변성: 94℃, 30 s; 어닐링: 58℃,30 s; 및 연장: 68℃, 30 s; 25 사이클 실행; 마지막 신장(final elongation):68℃, 10분이다. 밴드의 이론적 사이즈는 198bp이며, 증폭산물을 아가로스겔 전기영동을 통해 확인한 결과 이론적 사이즈와 일치하였다.
(ii))상류 프라이머 5'-gtcaccgtctcctcaaccacgacgccagcg-3' (SEQ ID NO: 5) 및 하류 프라이머 5'-gaggtcgacctacgcgggggcgtctgcgctcctgctgaacttcactctggtgataaccagtg-3' (SEQ ID NO: 7)을 이용하여 증폭시켜 CD8α 경첩영역-막관통영역-델타 Z (즉, CD8-CD3 delta ζ)를 얻었으며, PCR 증폭조건은 상기와 같다. 밴드의 이론적 사이즈는 261bp이며, 증폭산물을 아가로스겔 전기영동을 통해 확인한 결과 이론적 사이즈와 일치하였다.
(iii)상류 프라이머 5'-ttttgggtgctggtggtggttgg-3' (SEQ ID NO: 8) 및 하류 프라미어 5'-gctgaacttcactctggagcgataggctgcgaag-3' (SEQ ID NO: 9)를 이용하여 증폭시켜 CD28막관통영역-세포내 신호영역 단편을 얻었으며, PCR 증폭 조건은 상기와 같다. 밴드의 이론적 사이즈는 219bp이며, 증폭산물을 아가로스겔 전기영동을 통해 확인한 결과 이론적 사이즈와 일치하였다.
(iiii)상류 프라이머 5'-aaacggggcagaaagaaactc-3' (SEQ ID NO: 10) 및 하류 프라이머 5'-cagttcacatcctccttc-3' (SEQ ID NO: 11)을 이용하여 증폭시켜 CD137세포내 영역을 얻었으며, PCR 증폭조건은 상기와 같다. 밴드의 이론적 사이즈는 126bp이며, 증폭산물을 아가로스겔 전기영동을 통해 확인한 결과 이론적 사이즈와 일치하였다.
(iiiii)상류 프라이머 5'-cactggttatcaccagagtgaagttcagcaggagc-3' (SEQ ID NO: 12) 및 하류 프라이머 5'-gaggtcgacctagcgagggggcagggcctgcatg-3' (SEQ ID NO: 13)를 이용하여 CD3 zeta 신호영역을 얻었으며, PCR 증폭 조건은 상기와 같다. 밴드의 이론적 사이즈는 339bp이며, 증폭산물을 아가로스겔 전기영동을 통해 확인한 결과 이론적 사이즈와 일치하였다.
B)핵산 단편의 조립
(i)상류 프라이머 5'-accacgacgccagcgccg-3', (SEQ ID NO: 14) 및 하류 프라이머 5'-cacccagaaaataataaag-3' (SEQ ID NO: 15)를 이용하여 조합하여 CD8α 경첩영역-CD28막관통 영역을 얻었으며, 조립조건은, CD8 a 경첩 영역 (50 ng) + CD28 막관통 영역(50 ng) 의 초기 변성: 94℃ , 4 분; 변성: 94℃, 30 s; 어닐링:60℃,30 s; 및 연장: 68℃, 30 s; 5 사이클 실행; 마지막 신장: 68℃, 10분이다. DNA 중합효소 및 상,하류 프라이머를 보충한 후, PCR 증폭을 25사이클 실행하였으며, 증폭조건은, 초기 변성: 94℃ , 4 분; 변성: 94℃, 30 s; 어닐링: 60℃,30 s; 및 연장: 68℃, 30 s; 25 사이클 실행; 마지막 신장: 68℃, 10분이다. 밴드의 이론적 사이즈는 216bp이며, 증폭산물을 아가로스겔 전기영동을 통해 확인한 결과 이론적 사이즈와 일치하였다.
(ii)상류 프라이머 5'-aaacggggcagaaagaaactc-3' (SEQ ID NO: 10) 및 하류 프라이머 5'-gaggtcgacctagcgagggggcagggcctgcatg-3' (SEQ ID NO: 13)를 이용하여 조립 증폭시켜 CD137-CD3ζ, 즉 ΒΒΖ를 얻었다. 조립 및 증폭조건은 상기와 동일하다. 밴드의 이론적 사이즈는 478bp이며, 증폭산물을 아가로스겔 전기영동을 통해 확인한 결과 이론적 사이즈와 일치하였다.
(iii)상류 프라이머 5'-gtcaccgtctcctcaaccacgacgccagcg-3' (SEQ ID NO: 5) 및 하류 프라이머 5'-gaggtcgacctagcgagggggcagggcctgcatg-3' (SEQ ID NO: 13)를 이용하여 CD8α 경첩영역-막관통영역과 BBZ를 조립 및 PCR증폭을 통해 타겟 단편, CD8a 경첩영역-막관통영역-BBZ 세포내 영역, 즉 CD8-CD137-CD3ζ를 얻었으며, 조립 및 PCR증폭 조건은 상기와 동일하다. 밴드의 이론적 사이즈는 691bp이며, 증폭산물을 아가로스겔 전기영동을 통해 확인한 결과 이론적 사이즈와 일치하였다.
(iiii)상류 프라이머 5'-gtcaccgtctcctcaaccacgacgccagcg-3' (SEQ ID NO: 5) 및 하류 프라이머 5'-gaggtcgacctagcgagggggcagggcctgcatg-3' (SEQ ID NO: 13)를 이용하여, CD8α 경첩 영역-CD28막관통 영역-세포내 영역 및 Z는 상기와 동일한 조립 및 PCR증폭을 통해 타겟 단편, CD8α 경첩영역-CD28 막관통 영역-28Z 세포내 영역, 즉 CD28a-CD28b-CD3ζ를 얻었으며, 조립 및 PCR증폭 조건은 상기와 동일하다. 밴드의 이론적 사이즈는 706bp이며, 증폭산물을 아가로스겔 전기영동을 통해 확인한 결과 이론적 사이즈와 일치하였다.
(3)3'말단에 F2A 및 CD8 α 신호 펩티드를 가진 eGFP 핵산 단편의 획득
중국특허출원 201310108532.2에 공개된 pWPT-eGFP-F2A-806-Z를 템플레이트로, 상류 프라이머 5'-cttacgcgtcctagcgctaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggag-3' (SEQ ID NO: 16) 및 하류 프라이머 5'-cggcctggcggcgtggagcag-3'(SEQ ID NO: 17)를 이용하여 렌티바이러스 벡터 중 3'말단에 F2A 및 CD8α 신호 펩티드를 가진 eGFP 핵산 단편을 증폭하였다. PCR 증폭조건은, 초기 변성: 94℃ , 4 분; 변성: 94℃, 40 s; 어닐링: 56℃, 40 s; 및 연장: 68℃, 50s; 25 사이클 실행; 마지막 신장: 68℃, 10분이다. 밴드의 이론적 사이즈는 883bp이며, 증폭산물을 아가로스겔 전기영동을 통해 확인한 결과 이론적 사이즈와 일치하였다.
2. 핵산단편의 조립
각각 상기 단락"(2)키메라 항원 수용체의 기타부분의 핵산서열"에서 증폭시켜 얻은 단편CD8-CD3ζ, CD8-CD137-CD3ζ, CD28a-CD28b-CD3ζ, CD28a-CD28b-CD137-CD3ζ 및 동일한 몰량의 상기 단락"(3)키메라 항원 수용체의 기타 부분의 핵산서열"에서 증폭시켜 얻은 3'말단에 F2A 및 CD8α 신호 펩티드를 가진 eGFP 핵산 단편(질량 약 50ng) 및 동일한 몰량의 scFv (GPC3)(질량이 약 50ng) 3개 단편을 도2에 표시한 바와 같이 조립 및 PCR을 진행하였다. 조립조건은, 초기 변성: 94℃ , 4 분; 변성: 94℃, 40 s; 어닐링: 60℃, 40 s; 및 연장: 68℃, 140s; 5 사이클 실행; 마지막 신장: 68℃, 10분이다. DNA중합효소 및 상류 프라이머 5'-cttacgcgtcctagcgctaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggag-3' (SEQ ID NO:16) 및 하류 프라이머 5'-gaggtcgacctagcgagggggcagggcctgcatg-3' (SEQ ID NO:13) 를 보충한 후, PCR 증폭을 25사이클 진행하였으며, 증폭조건은, 초기 변성: 94℃ , 4 분; 변성: 94℃, 40 s; 어닐링: 60℃, 40 s; 및 연장: 68℃, 140s; 25 사이클 실행; 마지막 신장: 68℃, 10분이다. 증폭시켜 얻은 eGFP-GPC3-Z, eGFP-GPC3-BBZ, eGFP-GPC3-28Z 및 eGFP-GPC3-28BBZ의 이론적 사이즈는 2161 bp, 2278 bp, 2302 bp, 및 2428 bp이다. 증폭산물을 아가로스겔 전기영동을 통해 확인한 결과 이론적 사이즈와 일치하였다.
상기와 동일한 실험조건 하에, 상류 프라이머 5'-gatgttgtgatgactcagtctc-3' (SEQ ID NO: 1) 및 하류 프라이머 5'-gaggtcgacctagcgagggggcagggcctgcatg-3' (SEQ ID NO: 13)을 이용하여, 3'말단에 F2A 및 CD8α 신호 펩티드를 가진 eGFP 핵산 단편(질량 약 50ng)을 가하지 않은 조건하에, GPC3 키메라 항원 수용체 단백질을 코딩하는 핵산 GPC3-Z (SEQ ID NO: 18), GPC3-BBZ (SEQ ID NO: 19), GPC3-28Z (SEQ ID NO: 20) 및 GPC3-28BBZ (SEQ ID NO: 21) 서열을 얻을수 있으며, 상기 각 핵산서열은 각각 하기 아미노산 서열을 가진 GPC3 키메라 항원 수용체 단백질을 코딩한다. GPC3-Z (SEQ ID NO: 22), GPC3-BBZ (SEQ ID NO: 23), GPC3-28Z (SEQ ID NO: 24) 및 GPC3-28BBZ (SEQ ID NO: 25).
또한, 각각 상기 단락"(2)키메라 항원 수용체 기타 부분의 핵산서열"에서 증폭시켜 얻은 CD8-CD3 delta ζ 단편과 동일한 몰량의 상기 단락 ”(3)키메라 항원 수용체의 기타 부분의 핵산서열”에서 증폭시켜 얻은 단편 및 동일한 몰량의 scFv(GPC3)을 이용하여, 상류 프라이머 5'-cttacgcgtcctagcgctaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggag-3' (SEQ ID NO: 16) 및 하류 프라이머 5'-gaggtcgacctacgcgggggcgtctgcgctcctgctgaacttcactctggtgataaccagtg-3' (SEQ ID NO: 7)를 상기와 동일한 조건하에서 조립 및 PCR를 진행하여 eGFP-GPC3- δ Ζ (SEQ ID ΝΟ: 31)을 얻었으며, 이론적 사이즈는 1858 bp이며, 증폭산물을 아가로스겔 전기영동을 통해 확인한 결과 이론적 사이즈와 일치하였다.
2-1. 모의 대조군( sham control ) 2 D3 -28 BBZ CAR 을 코딩하는 렌티바이러스 벡터의 구축(즉, pWPT - eGFP -F2A-2 D3 -28 BBZ )
A.항GFR 신규성 변이체 EGFRvA세포내 영역 폴리펩티드(WET)의 2D3 단일 사슬 항체의 핵산 단편의 획득
항WET 폴리펩티드의 하이브리도마(hybridoma) 2D3세포주(상하이 루이진생물과학기술 유한회사에서 제조)의 mRNA를 템플레이트로, RT-PCR Kit를 이용한 역전사를 통해, cDNA 제1사슬을 합성하였다. cDNA 제1사슬을 템플레이트로 하여, 각각 헤비 프라이머(Heavy Primers) , 라이트 프라이머(Light Primer) Mix(상하이 루이진생물과학기술 유한회사에서 구매)를 프라이머로, VH 및 VL 유전자를 증폭시켰다. PCR조건은, 초기 변성: 94℃, 4 분; 변성: 94℃, 40 s; 어닐링: 55℃, 40 s; 및 연장: 68℃, 40s; 30 사이클 실행; 마지막 신장: 68℃, 7분이다. 아가로스겔 전기영동을 통해 PCR산물을 확인하였으며, 겔회수 킷트(gel extraction kit)로 각각 VH 및 VL 단편을 회수하였다.
다시 VH, VL 단편을 서로 템플레이트로 하여, Linker-Primer Mix를 프라이머(상하이 루이진생물과학기술 유한회사)로, 중복 PCR법으로 VH, VL 단편을 seFv로 조립하였으며, PCR조건은, 변성: 94℃, 1분; 어닐링 및 연장: 63℃, 4분; 7 사이클 실행. 7 사이클 후, 50μl의 반응체계에 Linker-Primer Mix, 중합효소 완충액 및 탈이온수를 보충시켜 PCR을 계속하였다. PCR 증폭조건은, 초기 변성: 94℃ , 4 분; 변성: 94℃, 40 s; 어닐링: 58℃, 40 s; 및 연장: 68℃, 1분; 30 사이클 실행; 마지막 신장: 68℃, 7분이다. 아가로스겔 전기영동으로 PCR산물을 확인하였으며, 겔회수 킷트로 seFv단편을 회수하였다.
B.항 WET 폴리펩티드 2 D3 단일사슬 항체의 발현 및 활성측정
얻은 scFv단편 및 상기 pCANTAB 5E 벡터(Pharmacia회사에서 구매)에 대해 SfiI 및 NotI의 이중효소분해를 진행하였으며, 분해된 단편을 겔에서 회수하였다. 16℃에서 연결시켜 하룻밤을 지낸 후, 형질전환성(competent) E. coli HB2151에 전이시켰다. 다음날, 형질전환 플레이트에서 20개의 싱글 콜로니(colony)을 취하여 30℃에서 배양하였으며, OD600이 되도록 0.4 내지 0.6시간 배양하였을 때, 최종농도가 0.05 mmol/L가 되게 IPTG를 가하여, 발현을 유도하여 하룻밤(18시간)을 지냈다.원심분리시켜 상청액을 취하여, 배양 상청액중의 가용성 scFv의 발현 상황에 대해 ELISA분석을 진행하였다. 구체적으로, 항원WTE-BSA(상하이 루이진과학기술 유한회사에서 제조)을 각각 50 ng/웰 (l ng/μl, 50 μ1/웰)씩 96웰(well) 플레이트에 코팅시킨 후, 37℃에서 2시간 배양하였으며, 5% PBS 탈지 분유(광명유업주식 유한회사)로 37℃에서 2시간 블록시켰으며, 0.1 M 인산완충액(PBS)으로 3번 세척하여, 상기 유도 발현시킨 배양액의 상청액을 50μ1/웰씩 96웰 플레이트에 가하였으며, 37℃에서 1시간 배양하였다. PBST (PBS + 0.05% Tween20)로 3번 세척한 후, HRP로 표기된 anti-E tag 항체(상하이 루이진과학기술 유환회사에서 구매)를 이용하여 1:1000로 희석하였으며, 50μ1/웰씩 가하고, 37℃에서 1시간 배양하였다. PBST로 3번 세척한 후, 1:1000로 희석한 염소-항-마우스IgG-HRP(Santa Cruz 회사에서 구매)를 가하고 37℃에서 1시간 배양하였다. PBST로 5번 세척한 후, ABTS 발색액을 100 μl/웰씩 넣고 37℃에서 10분 동안 빛을 피하여 발색시켰다. Bio-Rad Model 680 플레이트 리더(plate reader)를 사용하여, 파장405mm하에 흡광도를 측정하였으며, 음성대조 흡광도에 비해 2배 이상 높을 경우 양성으로 판단하였다. OD값이 제일 높은 클론2D3-3을 취하여 서열을 측정한 후 플라미스드 pCANTAB 5E 2D3-3 scfv를 분리하여 본 발명의 모의 대조군 CAR에 쓰이는 단일 사슬 항체2D3로 사용하며, 또한 각각 상기 단락"(2)키메라 항원 수용체 기타 부분의 핵산서열"에서 증폭된 단편 CD28a-CD28b-CD137-CD3ζ와 동일한 몰량의 상기 단락"(3)키메라 항원 수용체 기타 부분의 핵산서열"에서 증폭하여 얻은 3'말단에 F2A 및 CD8α 신호 펩티드를 가진 eGFP 핵산 단편(질량 약 50ng)과 같이, 3가지 단편을 도2에 표시한 방법으로 연결하여 PCR을 진행하였다. 연결 조건은, 초기 변성: 94℃, 4 분; 변성: 94℃, 40 s; 어닐링: 60℃, 40 s; 및 연장: 68℃, 140s; 5 사이클 실행; 마지막 신장: 68℃, 10분이다. DNA 중합효소 및 상류 프라이머 5'-cttacgcgtcctagcgctaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggag-3' (SEQ ID NO:16) 및 하류 프라이머 5'-gaggtcgacctagcgagggggcagggcctgcatg-3' (SEQ ID NO:13)를 보충한 후, PCR로 25 사이클을 증폭시켰으며, 증폭조건은, 초기 변성: 94℃, 4 분; 변성: 94℃, 40 s; 어닐링: 60℃, 40 s; 및 연장: 68℃, 140s; 25 사이클 실행; 마지막 신장: 68℃, 10분이다. 증폭시켜 얻은 eGFP-2D3-28BBZ의 이론적 사이즈는 2443 bp이다. 아가로스겔 전기영동에 의해 증폭산물을 확인한 결과 이론치와 일치하였다.
3. 렌티바이러스 플라스미드 벡터의 구축
예시한 본 발명의 렌티바이러스 플라스미드 벡터의 구축에 사용된 벡터시스템은 제3세대 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터 시스템에 속하며, 상기 시스템은 3개 플라스미드, 즉 단백질Gag/Pol 및 Rev단백질을 코딩하는 패캐징 플라스미드(packaging plasmid) psPAX2; VSV-G단백질을 코딩하는 외피 플라스미드(envelope plasmid) PMD2.G; 및 빈 벡터(empty vector) pPWT-eGFP에 근거하여 타겟 유전자CAR를 코딩하는 재조합 발현 벡터를 포함한다.
빈 벡터 pPWT-Egfp에 있어서, 연장인자(elongation factor)-1α (EF-1α)의 프로모터(promoter)는 강화형 녹색 형광단백질(enhanced green fluorescent protein (eGFP))의 발현을 조절하며, 타겟 유전자 CAR을 코딩하는 재조합 발현 벡터에서 구제역 바이러스(food-and-mouth disease virus,FMDV)유래의 리보솜 스킵서열(ribosomal skipping sequence, F2A)을 통해 eGFP와 타겟 유전자CAR의 동시발현(coexpression)을 실현한다. F2A는 구제역 바이러스 유래의 2A(또는 "자기-스플라이싱 폴리펩티디("self-splicing polypeptide)2A")의 한단락의 핵심서열이며, 2A의 "자기-스플라이싱"기능을 가지고 있으며, 상류 및 하류 유전자의 공동발현을 실현할 수 있다. 2A는 스플라이싱율이 높고, 상하류 유전자의 발현 밸런스가 우수하며, 자기서열이 짧은 장점을 갖고 있어 유전자 치료의 다시스트론성 벡터(polycistronic vector)의 구축에 일종의 효과적인 실행가능성 책략을 제공하였다. 특히는 키메라 항원 수용체 유전자변형 T임파세포의 면역치료에 있어서 이러한 서열을 많이 사용하여 타겟 유전자와 GFP 또는 eGFP의 동시발현을 실현하며, GFP 또는 eGFP의 측정을 통해 CAR의 발현을 간접적으로 측정할 수 있다.
본 실시예에서는 F2A에 의해 연결된 eGFP와 특이성 CAR가 동시에 발현 되는 렌티바이러스 벡터를 구축하였으며, pWPT-eGFP-F2A-CAR라고 총칭한다. 상기 단계2에서 얻은 타겟 유전자 eGFP-F2A-CAR은 MluI 및 SalI 엔도뉴클레아제(endonuclease)로 이중효소분해하였으며, 동일하게 이중효소분해한 pWPT 벡터를 도입연결시켜 키메라 항원 수용체를 발현하는 렌티바이러스 벡터를 구축하였다. 구축에 성공한 벡터는 MluI 및 SalI의 효소분해에 인한 동정(도3) 및 정확한 서열측정을 통해 렌티바이러스의 패키징에 사용할 수 있다. 전술한 바와 같이, eGFP-F2A-CAR은 한가닥의 mRNA로 전사되나, 최종적으로 eGFP와 항GPC3키메라 항원 수용체 두가닥 펩티드사슬로 번역되며, 그중 CD8α 신호 펩티드의 작용하에 항GPC3 키메라 항원 수용체는 세포막에 위치를 결정하게 된다. 음성 대조인 eGFP-GPC3- δΖ는 렌티바이러스 플라스미드 벡터에 삽입된 후 세포막 표면에서 잘려진δ Ζ를 포함한 GPC3 키메라 항원 수용체(GPC3-δΖ)를 발현하며, 그의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 32이다.
얻은 각 타겟CAR을 포함한 벡터의 핵산 총 서열은 하기와 같다: pWPT-eGFP-F2A-GPC3-δ Z (SEQ ID NO: 26); pWPT-eGFP-F2A-GPC3-Z (SEQ ID NO: 27); pWPT-eGFP-F2A-GPC3-BBZ (SEQ ID NO: 28); pWPT-eGFP-F2A-GPC3-28Z (SEQ ID NO: 29); pWPT-eGFP-F2A-GPC3-28BBZ (SEQ ID NO: 30)
4.플라스미드 형질주입 293T세포에서 렌티바이러스 패키징
6×106 밀도로 6 내지 10대까지 접종배양한 293T세포(ATCC:CRL-11268)를 10cm 배양접시에서 37℃, 5% CO2조건하에 하룻밤을 배양시켜 형질주입에 사용하였다. 배양액은 10%의 소태아혈청(fetal bovine serum, PAA회사)을 포함한 DMEM(PAA회사)이며, 다음날, 형질주입 약 2시간 전에 배양액을 무혈청DMEM으로 교체하였다.
형질주입 단계는 하기와 같다.
4.1 20μg의 빈 플라스미드pWPT-eGFP (mock 대조) 또는 20μg의 각각의 타겟 유전자 플라스미드 pWPT-eGFP-F2A-CAR을 각각 15μg의 패키징 플라스미드 PAX2와, 6μg의 외피 플라스미드 PMD2.G와 함께 500μL의 MilllQ수에 용해시켜, 균일하게 혼합하였다.
4.2 62 μL 2.5MCaCl2 (Sigma회사)를 한방울한방울 적가하였으며, 1200 rpm/min으로 볼텍스 믹서를 진행하였다.
4.3 마지막으로 500 μL 2×Hepes (280 mM NaCl, l0 mM KCl, 1.5 mM Na2HP04·2H2O, 12 mM 포도당, 50mM Hepes (Sigma회사), pH7.05, 0.22 μM 여과 살균)를 한방울한방울 적가하고, 1200 rpm/min으로 10 초간 볼텍스 믹서를 진행하였다.
4.4 즉시 배양접시에 한방울한방울 적가하고 균일하게 살살 흔들어준 후, 37℃, 5% CO2 하에 4 내지 6시간을 배양한 후, 10% 소태아혈청을 포함한 DMEM로 교체하였다.
형질주입을 진행한 다음날 형집주입 효율(즉, 녹색형광 세포비율)을 관찰하였으며, 형질주입 효율이 ~80%의 양성일 경우, 형질주입 실험이 성공한 것으로 간주한다. 형질주입 후 48시간 또는 72시간 후, 0.45μm 여과기(Millipore회사)로 바이러스를 여과수집하였으며, 이어서 Beckman Optima L-100XP 쾌속 원심분리기로 28000 rpm, 4℃에서 2시간 원심분리시켜 상청액을 제거하였으며, 얻은 침전을 1/10 내지 1/50 원액체적의 Quantum 007 배양액 (PAA 회사)으로 다시 현탁시키고, 100 μL/튜브에 분주하여 -80℃에서 동결 보존시켜, 바이러스 적정 또는 T임파세포의 감염에 사용한다.
5. mock 또는 eGFP -F2A- CAR 를 패키징한 렌티바이러스 적정농도의 측정
첫번째날, l×105/mL로 293T세포를 100μL/웰씩 96웰의 배양 플레이트에 접종시켜, 37°C, 5% CO2에서 배양하며, 배양액은 10%소태아혈청이 포함된 DMEM이다. 두번째날, 50 μL/웰의 배양상청액을 버리고, 50 μL/웰의 신선한 상기 배양액을 보충해주며, 최종농도가 6 μg/mL인 폴리브렌(polybrene)을 포함시키며, 37℃, 5% CO2하에서 30분간 배양하였다. 10 μL/웰의 바이러스 원액 또는 1 μL/웰의 바이러스 농축액을 가하며, 5배로 희석하여 4개 계단농도, 2개 반복을 하여, 37℃, 5% CO2 하에서 배양하였다. 감염 48시간 후, 유세포분석기로 eGFP를 측정하였으며, 양성율이 5 내지 20%인 세포수로, 적정농도를 계산하였다. 적정농도(U/mL) =양성율× 희석배수× 100× 104. 인산칼슘 형질주입법으로 패키징한 상기 mock(즉, 빈 벡터)를 포함한 대조조와 각 eGFP-F2A-CAR의 바이러스 적정농도는 모두 약 0.5 내지 2 × 106 U/mL 레벨이며, 농축시킨 후 측정한 바이러스 적정농도는 2 × 107 U/mL였다.
실시예2 재조합 렌티바이러스에 의해 감염된 CTL 세포
건강한 사람의 말초혈액에서 밀도 구배 원심법(density gradient centrifugation)을 통해 휴먼 말초혈액 단핵세포(상하이시 혈액센터에서 제공)를 얻었으며, 말초혈액 단핵세포에서 CTL세포 마그네틱 비즈(Stem Cell Technologies) 음성선택법(negative selection process)으로 CTL을 얻으며, 선택한 CTL세포는 유세포분석기로 CTL세포의 순도를 측정하였으며, CTL세포의 양성율이 ≥95%일 경우 바람직하며 다음 단계를 진행하였다. 1×106/mL의 밀도로 Quantum 007 임파세포배양액 (PAA 회사)을 가하여 세포를 배양하였다. 세포 대 마그네틱 비즈 비율 1:1로 동시에 항CD3 및 CD28항체를 도포한 마그네틱 비즈(Invitrogen 회사)와 최종농도 100 U/mL인 재조합 휴먼IL-2 (상하이 화신생물고기술 유한회사) 를 가하여 24시간 자극배양하였다. 이어서, MOI
Figure pct00002
5로 상기 재조합 렌티바이러스를 이용하여 CTL세포를 감염시켰다. 감염된 세포를 하루건너 5 × 105/mL의 밀도로 계대배양시키는 동시에 임파세포 배양액에 최종농도가 100 U/mL인 재조합 휴먼 IL-2를 보충하였다.
감염된 CTL세포는 배양한 8일째에 유세포분석기로 각각의 부동한 키메라 항원 수용체 발현을 측정하였으며, eGFP와 CAR은 동시발현하여, eGFP의 양성세포를 측정하면 바로 키메라 항원 수용체를 발현한 양성세포와 상응하다(도4). 감염되지 않은 T임파세포를 음성대조로 하여, 부동한 키메라 항원 수용체를 발현하는 바이러스 감염 CTL세포의 양성율은 하기 표에 표시한바와 같다. 상기 양성율의 결과는 렌티바이러스 감염의 방법을 통해 일정한 양성율의 CAR+ CTL 세포를 얻을수 있음을 표명하였다.
Figure pct00003
CTL세포는 각각 부동한 키메라 항원 수용체를 패키징한 바이러스에 감염된 후, 세포밀도 5 × 105/ml로 하루건너씩 계대배양, 수량 체크를 진행하였으며, 계대배양된 세포 배양액에 IL-2 (최종농도 100 U/ml)를 보충하였으며, 배양 14일째 약 200배로 증폭하였다(도5를 참조). 이는 부동한 키메라 항원 수용체를 발현하는 CTL세포가 체외에서 일정한 수량의 증폭을 가져올 수 있음을 표명하며, 후속적인 체외 독성실험 및 체내 실험에 담보를 제공하였다.
실시예3 . 키메라 항원 수용체 세포를 발현하는 체외독성 효과실험
체외독성실험에서 사용한 타겟세포는 하기 표3에 표시된 간세포 암세포계이며, 효과기세포는 실시예2에서 증명된 12일간 체외 배양한 FACS로 측정한 키메라 항원 수용체가 발현된 양성세포이며, 키메라 항원 수용체 양성(CAR+) CTL로 표시하였다.
Figure pct00004
유세포분석기 및 웨스턴 블롯(western blot)을 통해 간세포 간암세포계 HepG2, Huh-7, Hep3B, PLC/PRF/5 및 SK-HEP-1에서의 GPC3의 발현레벨을 측정하였으며, 유세포분석 결과는 도6A에 표시한바와 같다. 세포에서의 GPC3의 발현은 평균 형광강도(Mean Fluorescence Intensity ,MFI)로 표시한다. 또한, 웨스턴 블롯 방법을 통해 각 세포계GPC3의 발현레벨을 검증하였으며, 결과는 도6B에 표시한바와 같으며, 그중, GAPDH는 로딩 대조군이다. 결과로부터 보아, GPC3가 4가지 간세포 간암세포계 HepG2, Huh-7, Hep3B, 및 PLC/PRF/5에서 부동한 레벨로 발현되나, SK-HEP-1에서는 GPC3의 발현을 측정하지 못했다.
각 실험조와 대조조에는 하기 재료가 포함된다.
각 실험조: 각 타겟세포+부동한 키메라 항원 수용체를 발현하는 CTL,
대조조1: 타겟세포로부터 LDH가 최대로 방출,
대조조2:타겟세포로부터 LDH가 자발적으로 방출,
대조조3:효과기세포로부토 LDH가 자발적으로 방출.
측정방법: CytoTOX 96 비방사성 세포독성측정 킷트 (Promega회사)를 사용하여 진행한다. 상기 방법은 비색법에 기초한 측정방법이며, 51Cr 방출법을 대체할 수 있다. CytoTOX 96® 측정을 통해 젖산탈수소효소(LDH)를 정량적으로 측정하였다. LDH는 일종의 안정적인 세포질효소(cytoplasmic enzyme)이며, 세포 용해시 방출되며, 그 방출방식은 51Cr 이 방사성분석중에서 방출하는 방식과 거의 동일하다. 방출된 LDH 배양액의 상청액에서 30분간의 커플링 효소 반응을 통해 측정할 수 있으며, 효소반응에서 LDH는 일종의 테트라졸륨 염(INT)을 적색의 포르마잔(formazan)으로 전화시킬 수 있다. 생성된 적색 산물의 수량과 용해된 세포 수량은 정비례한다. 구체적으로 CytoTOX 96 비방사성 세포독성측정 킷트의 설명서를 참조로 한다.
상황에 따라 효과기세포/표적세포비(effector:target ratio)를 3:1, 1:1 및 1:3로하고, 타겟세포 수량을 10000/웰(50 μL 2×105/mL)로 하며, 부동한 효과기세포/표적세포비에 근거하여 효과기세포 수량을 결정하였다. 각조는 5개 반복을 취하며, 5개 반복 웰의 평균값을 구한다. 측정시간은 제18시간째이다.
세포독성 계산 공식은 하기와 같다.
Figure pct00005
실험결과는 하기와 같다.
구체적으로 표4에 표시한 바와 같이, 본 발명의 키메라 항원 수용체GPC3-Z CAR+를 발현하는 CTL과 GPC3-28BBZ CAR+를 발현하는 CTL은 GPC3 양성 간세포 암세포계 HepG2, Huh-7, Hep3B 및 PLC/PRF/5세포에 대해 모두 매우 현저한 특이성 세포독성작용을 나타내며, 효과기세포/표적세포비 계단비율 의존성을 나타내고 있다. 즉 효과기세포/표적세포비가 높을 수록 세포독성 작용이 더 강하다. 그러나, GPC3에 대해 음성인 간세포 암세포계SK-HEP-1에 대해서는 특이성 세포독성 작용을 갖고 있지 않았다. 그중, GPC3-28BBZ는 효과기세포/표적세포비가 3:1일 경우 GPC3에 대해 양성인 간암세포 HepG2에 대하여 세포독성은 97%에 달하였으며, GPC3에 대해 양성인 간암세포PLC/PRF/5에 대한 세포독성은 84%에 달하였다.
효과기세포/표적세포비 의존성 데이타는 본 발명에서 타겟GPC3키메라 항원 수용체를 발현하는 CTL이 GPC에 대해 양성인 간암세포에 대해 특이성 세포독성 작용을 갖고 있음을 진일보 나타낸다.
이에 비해, mock플라스미드(GPC3-CAR를 포함하지 않는 빈 플라스미드 벡터 pPWT-eGFP)를 형질도입했거나 또는 모의 대조군 CAR 2D3-28BBZ의 바이러스 감염된 것을 음성 대조군으로 한 CTL은 상기 5종류의 세포에 대한 세포독성 작용이 모두 매우 낮았으며, GPC3의 발현에 민감하지 않음을 나타낸다. 또한, 잘려진 CD3ξ를 포함한 GPC3-δΖ가 형질도입된 CTL은 세포내 신호 영역이 없어, mock와 2D3-28BBZ 를 형질도입한 CTL 세포와 비슷한 독성작용을 갖고 있다. 위에 기재된 바와 같이, 본 발명의 타겟GPC3의 키메라 항원 수용체(GPC3-Z 및 GPC3-28BBZ) 를 발현하는 CTL은 GPC3에 대해 양성인 간암세포에 대해 특이적 독성작용을 갖고 있으며, 보조자극 신호분자인 CD28 및 CD137 신호영역을 가진 GPC3-28BBZ CAR T세포는 상기 두개의 신호영역을 가지고 있지 않는 GPC3-Z CAR T 세포에 비해 더 강한 독성작용을 가지고 있다.
Figure pct00006
실시예4 . 타겟GPC3 의 CAR T세포가 GPC3 고도 발현의 Huh - 7이식종양에 대한 조기치료 실험
동물 그룹: 40마리의 6 내지 8주령 NOD/SCID 마우스를 무작위로 조 당 6 내지 7마리씩 6조로 나누었으며, 실험조는 각각 GPC3-Z CAR T임파세포조, 부동한 효과기세포/표적세포비(1:1 및 1:2)를 가진 GPC3-28BBZ CAR T임파세포조이며, 대조조는 각각 GPC3-δZ CAR T 임파세포, mock CAR T임파세포대조조 및 식염수 대조조이다.
접종: 0일째, 복강내에 200 mg/kg의 시클로포스파미드(cyclophosphamide)를 주사하였으며, 1일째, 마우스 우측 액와부 피하에 Huh7 세포(2×106/마리)를 각각 GPC3-Z, Mock, GPC3-28BBZ (1:1 및 1:2) 조 CAR T임파세포 및 GPC3-δZ CAR T임파세포와 효과기세포1:1의 혼합세포와 함께 접종하였으며, 식염수조는 Huh7 세포 (2×106/마리)만 접종하였다.
실험결과는, GPC3-Z 및 GPC3-28BBZ를 발현하는 CAR T임파세포는 GPC3 양성 Huh-7세포가 종양이 되는것을 특이적으로 억제할 수 있으며, 대조조의 마우스 종양이 2000 mm3 까지 자랄때 실험을 결속하였다(이식 종양 접종 후 28일째). GPC3-Z CAR T임파세포 치료조에서 2/6의 마우스가 종양의 생장이 없었으나, GPC3-28BBZ CAR T임파세포치료조에서는 효과기세포/표적세포비가 1:1 및 1:2인 조의 6마리 마우스가 모두 종양 생장이 없었으며, 대조조인 Mock대조조 및 GPC3-δZ CAR T임파세포조 및 생리식염수조는 마우스의 종양생장에 대해 영향을 미치지 못했다(도7A). 도7B는 조 당 6마리가 치사 후 각자 체내의 종양크기를 나타낸다.
실시예5 . 타겟GPC3 의 CAR T세포가 GPC3 고도 발현의 Huh -7 피하이식종양에 대한 치료실험
종양접종: 대수생장기에 있으며 생장이 양호한 Huh-7세포를 수집하여, 생리식염수로 세포밀도를 l×107/ml로 조절하였으며, 주사체적은 200 μL (2×106/마리)이며, 종양접종일을 0일째로 한다.
T세포 입양 전달: 마우스 종양체적이 200-300 mm3에 달한 후, 즉, 종양 접종 13일째에 복강내에 200 mg/kg의 시클로포스파미드(cyclophosphamide)를 주사하였으며, 실험조와 대조조에서 각각 14일째 꼬리정맥에 8×106/마리 유전자 변형한 T임파세포(양성 형질주입 효율이 50%정도) 또는 생리식염수만 주사하였다.
동물 그룹: 30마리의 6 내지 8주령의 NOD / SCID 마우스를 무작위로 조당 6마리씩 4개조로 나누었다. 실험조: GPC3-28BBZ CAR T임파세포 치료조, 대조조: 2D3-28BBZ CAR T임파세포 대조조, mock 유전자 변형 CAR T임파세포 대조조, 및 식염수 대조조.
T세포 입양 전달 2주후(28일째), 대조조 마우스의 종양 체적이 2000mm3에 달할 때 실험을 마무리하였다. GPC3-28BBZ CAR T임파세포 치료조 3/6 마리 마우스에서 종양이 감소되었으며, 마우스의 잔여 종양의 체적(도8A) 및 중량(도8B)은 3개의 대조조에 비교해, 결과적으로 모두 유의적인 차이(*** P <0.001)를 나타냈다. 도8D는 마우스 치사 후 각조 종양 조직의 상황을 나타낸다. 도8E는 GPC3-28BBZ CAR T임파세포 치료 후 마우스 종양이 감소되는 상황(mock조에 비해)을 나타낸다. 결과는 GPC3-28BBZ CAR T임파세포가 Huh-7이식 종양의 생장을 현저하게 억제함을 나타낸다.
또한, T임파세포 입양주입 1주일 후, 마우스 말초혈액 중 T세포 생존수량을 측정하였으며, 도8C에 표시한 바와 같이, GPC3-28BBZ CAR T 세포 치료조 마우스 체내의 T세포 수량이 mock 대조군 및 2D3-28BBZ CAR T임파세포 치료조(GPC3-28BBZ vs mock, P = 0.0011; GPC3-28BBZ vs 2D3-28BBZ, P = 0.0019; 2D3-28BBZ vs mock, P = 0.359)에 비해 현저히 높았다. 도9C에 표시한 결과에 따르면, GPC3-28BBZ CAR T임파세포가 체내에서 비교적 잘 생존할 수 있음을 나타낸다.
실험이 끝날 때, 각조 Huh-7이식종양 조직에 대해 조직절편을 취하고, 항 휴먼CD3e 항체를 이용하여 면역염색을 진행하였으며, 면역조직 화학염색 결과는 도9에 표시한바와 같다. 결과는, GPC3-28BBZ CAR T세포치료조의 마우스 피하 이식조직 종양 부위의 휴먼 CD3 양성 T세포가 2D3-28BBZ 형질도입 및 mock T세포치료조에 비해 현저히 많았으며, 생리식염수조에서는 휴먼 T세포를 측정하지 못했으며, 이는 GPC3-28BBZ CAR T세포가 종양부위에 모여 종양세포를 살상하는 기능을 수행함을 제시하였다.
상기 결과는 GPC3-28BBZ CAR T세포가 부분적으로 GPC3 과도발현의 Huh-7피하 이식종양을 제거함을 표명한다.
실시예6 . GPC3 -28 BBZ CAR T세포가 GPC3 저 발현 PLC / RPF / 5이식피하 이식종양에 대한 치료실험
종양접종:대수생장기에 있으며 생장이 양호한 PLC/RPF/5세포를 수집하고, 생리식염수로 세포밀도를 2.5×107/ml로 조절하였으며, 주사 체적은 200 μL (5×106/마우스)이며, 종양 접종일을 0일째로 설정한다.
T세포 입양 전달: 마우스 종양 체적이 150 mm3에 달했을 때, 즉 21일째에, 복강내에 200 mg/kg의 시클로포스파미드(cyclophosphamide)를 주사하였으며, 22일째 및 30일째에, 실험조와 대조조에 대해 각각 꼬리정맥에 8×106/마리 유전자 변형한 T세포(양성 형질주입 효율이 50%정도) 또는 생리식염수만 주사하였다.
동물 그룹: 30마리의 6 내지 8주령의 NOD / SCID 마우스를 무작위로 5개조로 나누었으며, 조 당 6마리이다. 실험조: GPC3-28BBZ CAR T임파세포 치료조, 대조조:2D3-28BBZ CAR T임파세포 대조조, mock 유전자 변형 CAR T임파세포 대조조, 및 식염수 대조조.
마우스 종양의 평균 체적이 150mm3에 달했을 때(즉, 21일째), 입양 전달한 T세포에 따라 마우스를 무작위로 4개조로 나누었으며, 복강내에 200 mg/kg의 시클로포스파미드(cyclophosphamide)를 주사하였으며, 22일째와 30일째에, 각각 꼬리정맥에 8×106/마리 GPC3-28BBZ, 2D3-28BBZ 또는 mock 유전자 변형 T임파세포(양성율이 각각 50%) 또는 생리식염수만 주사하여 치료를 진행하였다. 46일째, 대조조 마우스 종양의 평균 체적이 1500mm3에 달했을 때 실험을 마무리하였다.
도10A는 종양 생장 그라프를 나타내며, 46일째, GPC3-28BBZ CAR T임파세포 치료조의 마우스 이식종양의 체적은 각 대조조 (* P<0.05)에 비해 현저히 작았다. 도10B는 실험이 끝난 후 종양조직의 무게를 나타내며, GPC3-28BBZ CAR T임파세포 치료조 이식종양은 대조조 이식종양에 비해, 종양무게가 대조조(GPC3-28BBZ vs 식염수, P = 0.0332; GPC3-28BBZ vs mock, P = 0.0211; GPC3-28BBZ vs 2D3-28BBZ, P = 0.0211)에 비해 훨씬 적었다. 도10C는 실험이 끝난 후 치사한 마우스의 각 조의 종양조직 상황을 나타내며, GPC3-28BBZ CAR T임파세포 치료조는 GPC3 저 발현 PLC/RPF/5 세포에 대해 현저한 억제작용을 가지고 있음을 나타낸다.
T세포가 마우스 체내에서의 생존상황을 측정하기 위해, 제일 마지막으로 T세포 입양 전달 1주일 후 마우스 말초혈액 중 T세포의 수량을 측정하였다. 결과는 도10D에 표시한 바와 같이, GPC3-28BBZ CAR T임파세포 치료조 마우스 체내의 T세포 수량이 대조조(GPC3-28BBZ vs mock, P = 0.004; GPC3-28BBZ vs 2D3-28BBZ, P = 0.0097; 2D3-28BBZ vs mock, P = 0.0804)에 비해 현저히 높으며, GPC3-28BBZ CAR T임파세포가 체내에서 비교적 잘 생존할 수 있음을 제시한다.
상기 결과는 공동으로, GPC3-28BBZ CAR T임파세포가 GPC3 저 발현 PLC/RPF/5 이식 종양의 생장을 현저하게 억제할 수 있음을 나타낸다.
실시예7 . GPC3 -28 BBZ CAR T세포가 간장 부위의 GPC3 -양성 Huh -7 이식종양에 대한 제거효과 실험
종양접종: 대수생장기에 있는 양호한 Huh-7(luc+)을 수집하여, 생리식염수를 이용하여 세포밀도를 l×108/ml로 조절하였으며, 25 μL의 세포 현탁액과 25 μL의 Metrigel 기질젤라틴(얼음위에)을 혼합하여, 클린 벤치에서 개복수술을 진행하였으며, 각각 세포를 40마리 6 내지 8주령의 NOD / SCID마우스 간장 우엽(2.5×106/마우스)에 균일하게 접종하였으며, 종양 접종일을 0일째로 하였다.
동물 그룹:마우스 종양 접종일로부터 매주 사진을 찍으며, 2주 후에 복강에 200 mg/kg의 시클로포스파미드(cyclophosphamide)를 주사하였으며, 무작위로 조당 7말리씩 4개조로 나누었다. 실험조: GPC3-28BBZ CAR T임파세포 치료조, 대조조: 2D3-28BBZ CAR T 임파세포 대조조, mock 유전자 변형 CAR T임파세포 대조조, 및 식염수 대조조이다.
T임파세포 입양 전달: 종양 접종 후 14일 및 21일째, 마우스 꼬리정맥에 5×106/마리 유전자 변형한 T임파세포(양성 형질주입 효율이 50%정도, 주사 체적은200 μL ) 또는 200 μL의 생리식염수만 주사하였다.
첫번째로 형질전환 T임파세포를 주입하여 치료를 진행 한 1주일째, GPC3-28BBZ CAR T임파세포 치료조의 마우스 종양은 대조조에 비해 현저히 작으며, 이어서 2주째 및 3주째 사진을 보면, 모두 GPC3-28BBZ CAR T임파세포 치료조의 마우스 종양이 대조조에 비해 현저히 작았다(도11A 및 도11B). 제일 마지막으로 형질전환 T임파세포를 주입한 1주일 후, 3개 대조조, 즉 2D3-28BBZ CAR T임파세포 치료조, mock T 세포치료조 및 생리식염수 조의 마우스 복부가 현저히 융기되었으나, GPC3-28BBZ CAR T임파세포 치료조의 마우스 복부는 정삼임을 발견하였다(도11C). 마우스를 해부한 후, 대조조 마우스의 간장 부위에 거대한 종양이 차지하고 있음을 발견하였으며, GPC3-28BBZ CAR T임파세포 치료조의 마우스 간장 부위에는 종양 생장이 발견되지 않았다(도11D). 마우스에게 제일 마지막으로 T임파세포를 주입한 1주일 후, 마우스 눈자위에서 채혈하여 형질주입한 T세포가 마우스 체내에서의 생존 상황을 검사하였다. 결과는, GPC3-28BBZ CAR T임파세포 치료조의 마우스 체내의 임파세포가 대조조 mock 및 2D3-28BBZ조((GPC3-28BBZ vs mock, P = 0.0012; GPC3-28BBZ vs 2D3-28BBZ, P = 0.0156; 2D3-28BBZ vs mock, P = 0.355; 도11E))에 비해 많음을 나타내었으며, CAR 양성 T세포를 놓고 말하면, 말초혈액에서 GPC3-28BBZ CAR T 세포 치료조가 제일 높았다(GPC3-28BBZ vs mock, P = 0.0012; GPC3-28BBZ vs 2D3-28BBZ, P = 0.0015; 2D3-28BBZ vs mock, P = 0.22; 도 11F). 실험이 4주간 지속된 후 대조조의 동물은 지속적으로 사망하였다. 대조조의 중위수 생존기는 각각 mock 대조조는 34일이고, 2D3-28BBZ대조조는 39일이며, 생리식염수 조는 33일이였다(도11G). 그러나, 이 시간지점에서 GPC3-28BBZ CAR T세포 치료조의 마우스는 여전히 생존히 양호하며, 복부에 융기가 보이지 않았다.
종합적으로 보면, GPC3-28BBZ CAR T세포는 Huh-7 간 정소성 이식종양(orthotopic xenograft)에 대해 현저한 치료효과를 가지고 있으며, GPC3-28BBZ CAR T세포는 담암체 Huh-7간 정소성 이식종양 마우스 체내에서 효과적으로 생존할 수 있다.
본 발명에서 보호하는 타겟GPC3 키메라 항원 수용체 유전자 변형의 T세포는 GPC3양성 간암세포를 특이적으로 식별 및 살상할 수 있으나, GPC3 음성 간암세포에 대해서는 작용이 없어, 잠재적인 임상응용 가치를 가지고 있다.
Figure pct00007
SEQUENCE LISTING <110> Shanghai Cancer Institute （has been changed to CARSGEN THERAPEUTICS LTD in international phase） <120> NUCLEIC ACID OF CODED GPC3 CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR PROTEIN AND T LYMPHOCYTE EXPRESSING GPC3 CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR PROTEIN <130> GPC3 CART <160> 32 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer 1 <400> 1 gatgttgtga tgactcagtc tc 22 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> aritificial <400> 2 gcgctggcgt cgtggttgag gagacggtga ccag 34 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer 3 <400> 3 accacgacgc cagcgccgcg accac 25 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer 4 <400> 4 gaggtcgacc tagcgagggg gcagggcctg catgtgaag 39 <210> 5 <211> 62 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer 5 <400> 5 gaggtcgacc tacgcggggg cgtctgcgct cctgctgaac ttcactctgg tgataaccag 60 tg 62 <210> 6 <211> 52 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer 6 <400> 6 cttacgcgtc ctagcgctac cggtcgccac catggtgagc aagggcgagg ag 52 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer 7 <400> 7 cggcctggcg gcgtggagca g 21 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer 8 <400> 8 ttttgggtgc tggtggtggt tgg 23 <210> 9 <211> 34 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer 9 <400> 9 gctgaacttc actctggagc gataggctgc gaag 34 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer 10 <400> 10 aaacggggca gaaagaaact c 21 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer 11 <400> 11 cagttcacat cctccttc 18 <210> 12 <211> 35 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer 12 <400> 12 cactggttat caccagagtg aagttcagca ggagc 35 <210> 13 <211> 34 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer 13 <400> 13 gaggtcgacc tagcgagggg gcagggcctg catg 34 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer 14 <400> 14 accacgacgc cagcgccg 18 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer 15 <400> 15 cacccagaaa ataataaag 19 <210> 16 <211> 52 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer 16 <400> 16 cttacgcgtc ctagcgctac cggtcgccac catggtgagc aagggcgagg ag 52 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer 17 <400> 17 cggcctggcg gcgtggagca g 21 <210> 18 <211> 1266 <212> DNA <213> artificial <220> <223> GPC3 CAR (GPC3-Z) <400> 18 gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcctgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg ccaacaccta tttacattgg 120 tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct ataaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgct ctcaaaatac acatgttcct 300 cctacgtttg gccaggggac caagctggag atcaaacgtg gtggaggcgg ttcaggcgga 360 ggtggctctg gcggtggcgg atcgcaggtg cagctggtgc agtctggagc tgaggtgaag 420 aagcctgggg cctcagtgaa ggtctcctgc aaggcttctg gatacacctt caccgactat 480 gaaatgcact gggtgcgaca ggcccctgga caagggcttg agtggatggg agctcttgat 540 cctaaaactg gtgatactgc ctacagtcag aagttcaagg gcagagtcac gctgaccgcg 600 gacgaatcca cgagcacagc ctacatggag ctgagcagcc tgagatctga ggacacggcc 660 gtgtattact gtacaagatt ctactcctat acttactggg gccagggaac cctggtcacc 720 gtctcctcaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 780 cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 840 agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 900 gtccttctcc tgtcactggt tatcaccaga gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc 960 gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat aacgagctca atctaggacg aagagaggag 1020 tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg gaccctgaga tggggggaaa gccgcagaga 1080 aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc 1140 tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc cggaggggca aggggcacga tggcctttac 1200 cagggtctca gtacagccac caaggacacc tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc 1260 cctcgc 1266 <210> 19 <211> 1392 <212> DNA <213> artificial <220> <223> GPC3-BBZ <400> 19 gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcctgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg ccaacaccta tttacattgg 120 tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct ataaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgct ctcaaaatac acatgttcct 300 cctacgtttg gccaggggac caagctggag atcaaacgtg gtggaggcgg ttcaggcgga 360 ggtggctctg gcggtggcgg atcgcaggtg cagctggtgc agtctggagc tgaggtgaag 420 aagcctgggg cctcagtgaa ggtctcctgc aaggcttctg gatacacctt caccgactat 480 gaaatgcact gggtgcgaca ggcccctgga caagggcttg agtggatggg agctcttgat 540 cctaaaactg gtgatactgc ctacagtcag aagttcaagg gcagagtcac gctgaccgcg 600 gacgaatcca cgagcacagc ctacatggag ctgagcagcc tgagatctga ggacacggcc 660 gtgtattact gtacaagatt ctactcctat acttactggg gccagggaac cctggtcacc 720 gtctcctcaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 780 cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 840 agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 900 gtccttctcc tgtcactggt tatcaccaaa cggggcagaa agaaactcct gtatatattc 960 aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact actcaagagg aagatggctg tagctgccga 1020 tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac 1080 gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga 1140 gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg 1200 cagagaagga agaaccctca ggaaggcctg tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg 1260 gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc 1320 ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag gacacctacg acgcccttca catgcaggcc 1380 ctgccccctc gc 1392 <210> 20 <211> 1410 <212> DNA <213> artificial <220> <223> GPC3-28Z <400> 20 gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcctgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg ccaacaccta tttacattgg 120 tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct ataaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgct ctcaaaatac acatgttcct 300 cctacgtttg gccaggggac caagctggag atcaaacgtg gtggaggcgg ttcaggcgga 360 ggtggctctg gcggtggcgg atcgcaggtg cagctggtgc agtctggagc tgaggtgaag 420 aagcctgggg cctcagtgaa ggtctcctgc aaggcttctg gatacacctt caccgactat 480 gaaatgcact gggtgcgaca ggcccctgga caagggcttg agtggatggg agctcttgat 540 cctaaaactg gtgatactgc ctacagtcag aagttcaagg gcagagtcac gctgaccgcg 600 gacgaatcca cgagcacagc ctacatggag ctgagcagcc tgagatctga ggacacggcc 660 gtgtattact gtacaagatt ctactcctat acttactggg gccagggaac cctggtcacc 720 gtctcctcaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 780 cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 840 agggggctgg acttcgcctg tgatttttgg gtgctggtgg tggttggtgg agtcctggct 900 tgctatagct tgctagtaac agtggccttt attattttct gggtgaggag taagaggagc 960 aggctcctgc acagtgacta catgaacatg actccccgcc gccccgggcc aacccgcaag 1020 cattaccagc cctatgcccc accacgcgac ttcgcagcct atcgctccag agtgaagttc 1080 agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag cagggccaga accagctcta taacgagctc 1140 aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag 1200 atggggggaa agccgcagag aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag 1260 aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc 1320 aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc 1380 cttcacatgc aggccctgcc ccctcgctag 1410 <210> 21 <211> 1533 <212> DNA <213> artificial <220> <223> GPC3-CAR (GPC3-28BBZ) <400> 21 gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcctgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg ccaacaccta tttacattgg 120 tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct ataaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgct ctcaaaatac acatgttcct 300 cctacgtttg gccaggggac caagctggag atcaaacgtg gtggaggcgg ttcaggcgga 360 ggtggctctg gcggtggcgg atcgcaggtg cagctggtgc agtctggagc tgaggtgaag 420 aagcctgggg cctcagtgaa ggtctcctgc aaggcttctg gatacacctt caccgactat 480 gaaatgcact gggtgcgaca ggcccctgga caagggcttg agtggatggg agctcttgat 540 cctaaaactg gtgatactgc ctacagtcag aagttcaagg gcagagtcac gctgaccgcg 600 gacgaatcca cgagcacagc ctacatggag ctgagcagcc tgagatctga ggacacggcc 660 gtgtattact gtacaagatt ctactcctat acttactggg gccagggaac cctggtcacc 720 gtctcctcaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 780 cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 840 agggggctgg acttcgcctg tgatttttgg gtgctggtgg tggttggtgg agtcctggct 900 tgctatagct tgctagtaac agtggccttt attattttct gggtgaggag taagaggagc 960 aggctcctgc acagtgacta catgaacatg actccccgcc gccccgggcc aacccgcaag 1020 cattaccagc cctatgcccc accacgcgac ttcgcagcct atcgctccaa acggggcaga 1080 aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca tttatgagac cagtacaaac tactcaagag 1140 gaagatggct gtagctgccg atttccagaa gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg 1200 aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg taccagcagg gccagaacca gctctataac 1260 gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac 1320 cctgagatgg ggggaaagcc gcagagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 1380 ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg 1440 aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac 1500 gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgc 1533 <210> 22 <211> 422 <212> PRT <213> artificial <220> <223> GPC3-CAR(GPC3-Z) <400> 22 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Ala Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 130 135 140 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 145 150 155 160 Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 165 170 175 Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe 180 185 190 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 195 200 205 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 210 215 220 Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro 245 250 255 Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro 260 265 270 Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 275 280 285 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 290 295 300 Ser Leu Val Ile Thr Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro 305 310 315 320 Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly 325 330 335 Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro 340 345 350 Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 355 360 365 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 370 375 380 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 385 390 395 400 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 405 410 415 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 420 <210> 23 <211> 464 <212> PRT <213> artificial <220> <223> GPC3-BBZ amino acid <400> 23 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Ala Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 130 135 140 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 145 150 155 160 Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 165 170 175 Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe 180 185 190 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 195 200 205 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 210 215 220 Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro 245 250 255 Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro 260 265 270 Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 275 280 285 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 290 295 300 Ser Leu Val Ile Thr Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe 305 310 315 320 Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly 325 330 335 Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg 340 345 350 Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln 355 360 365 Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp 370 375 380 Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro 385 390 395 400 Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 405 410 415 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 420 425 430 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 435 440 445 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 450 455 460 <210> 24 <211> 469 <212> PRT <213> artificial <220> <223> GPC3-28Z <400> 24 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Ala Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 130 135 140 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 145 150 155 160 Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 165 170 175 Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe 180 185 190 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 195 200 205 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 210 215 220 Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro 245 250 255 Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro 260 265 270 Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 275 280 285 Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu 290 295 300 Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser 305 310 315 320 Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly 325 330 335 Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala 340 345 350 Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala 355 360 365 Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg 370 375 380 Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu 385 390 395 400 Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr 405 410 415 Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly 420 425 430 Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln 435 440 445 Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln 450 455 460 Ala Leu Pro Pro Arg 465 <210> 25 <211> 511 <212> PRT <213> artificial <220> <223> GPC3-CAR (GPC3-Z8BBZ) <400> 25 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Ala Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 130 135 140 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 145 150 155 160 Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 165 170 175 Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe 180 185 190 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 195 200 205 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 210 215 220 Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr 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ctgctcgcct gtgttgccac ctggattctg cgcgggacgt 5340 ccttctgcta cgtcccttcg gccctcaatc cagcggacct tccttcccgc ggcctgctgc 5400 cggctctgcg gcctcttccg cgtcttcgcc ttcgccctca gacgagtcgg atctcccttt 5460 gggccgcctc cccgcatcgg gaattcgagc tcggtacctt taagaccaat gacttacaag 5520 gcagctgtag atcttagcca ctttttaaaa gaaaaggggg gactggaagg gctaattcac 5580 tcccaacgaa gacaagatgg gatcaattca ccatgggaat aacttcgtat agcatacatt 5640 atacgaagtt atgctgcttt ttgcttgtac tgggtctctc tggttagacc agatctgagc 5700 ctgggagctc tctggctaac tagggaaccc actgcttaag cctcaataaa gcttgccttg 5760 agtgcttcaa gtagtgtgtg cccgtctgtt gtgtgactct ggtaactaga gatccctcag 5820 acccttttag tcagtgtgga aaatctctag cagcatctag aattaattcc gtgtattcta 5880 tagtgtcacc taaatcgtat gtgtatgata cataaggtta tgtattaatt gtagccgcgt 5940 tctaacgaca atatgtacaa gcctaattgt gtagcatctg gcttactgaa gcagacccta 6000 tcatctctct cgtaaactgc cgtcagagtc ggtttggttg gacgaacctt ctgagtttct 6060 ggtaacgccg tcccgcaccc ggaaatggtc agcgaaccaa tcagcagggt catcgctagc 6120 cagatcctct acgccggacg catcgtggcc ggcatcaccg gcgccacagg tgcggttgct 6180 ggcgcctata tcgccgacat caccgatggg gaagatcggg ctcgccactt cgggctcatg 6240 agcgcttgtt tcggcgtggg tatggtggca ggccccgtgg ccgggggact gttgggcgcc 6300 atctccttgc atgcaccatt ccttgcggcg gcggtgctca acggcctcaa cctactactg 6360 ggctgcttcc taatgcagga gtcgcataag ggagagcgtc gaatggtgca ctctcagtac 6420 aatctgctct gatgccgcat agttaagcca gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc 6480 gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg 6540 gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgagac gaaagggcct 6600 cgtgatacgc ctatttttat aggttaatgt catgataata atggtttctt agacgtcagg 6660 tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc 6720 aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag 6780 gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg 6840 ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt 6900 gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt 6960 tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt 7020 attatcccgt attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa 7080 tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag 7140 agaattatgc agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac 7200 aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac 7260 tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac 7320 cacgatgcct gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac 7380 tctagcttcc cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact 7440 tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg 7500 tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt 7560 tatctacacg acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat 7620 aggtgcctca ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta 7680 gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa 7740 tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga 7800 aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac 7860 aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt 7920 tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc 7980 gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat 8040 cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag 8100 acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc 8160 cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc attgagaaag 8220 cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac 8280 aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg 8340 gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct 8400 atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc 8460 tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga 8520 gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga 8580 agcggaagag cgcccaatac gcaaaccgcc tctccccgcg cgttggccga ttcattaatg 8640 cagctgtgga atgtgtgtca gttagggtgt ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga 8700 agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca gcaaccaggt gtggaaagtc cccaggctcc 8760 ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccat agtcccgccc 8820 ctaactccgc ccatcccgcc cctaactccg cccagttccg cccattctcc gccccatggc 8880 tgactaattt tttttattta tgcagaggcc gaggccgcct cggcctctga gctattccag 8940 aagtagtgag gaggcttttt tggaggccta ggcttttgca aaaagcttgg acacaagaca 9000 ggcttgcgag atatgtttga gaataccact ttatcccgcg tcagggagag gcagtgcgta 9060 aaaagacgcg gactcatgtg aaatactggt ttttagtgcg ccagatctct ataatctcgc 9120 gcaacctatt ttcccctcga acacttttta agccgtagat aaacaggctg ggacacttca 9180 catgagcgaa aaatacatcg tcacctggga catgttgcag atccatgcac gtaaactcgc 9240 aagccgactg atgccttctg aacaatggaa aggcattatt gccgtaagcc gtggcggtct 9300 gtaccgggtg cgttactggc gcgtgaactg ggtattcgtc atgtcgatac cgtttgtatt 9360 tccagctacg atcacgacaa ccagcgcgag cttaaagtgc tgaaacgcgc agaaggcgat 9420 ggcgaaggct tcatcgttat tgatgacctg gtggataccg gtggtactgc ggttgcgatt 9480 cgtgaaatgt atccaaaagc gcactttgtc accatcttcg caaaaccggc tggtcgtccg 9540 ctggttgatg actatgttgt tgatatcccg caagatacct ggattgaaca gccgtgggat 9600 atgggcgtcg tattcgtccc gccaatctcc ggtcgctaat cttttcaacg cctggcactg 9660 ccgggcgttg ttctttttaa cttcaggcgg gttacaatag tttccagtaa gtattctgga 9720 ggctgcatcc atgacacagg caaacctgag cgaaaccctg ttcaaacccc gctttaaaca 9780 tcctgaaacc tcgacgctag tccgccgctt taatcacggc gcacaaccgc ctgtgcagtc 9840 ggcccttgat ggtaaaacca tccctcactg gtatcgcatg attaaccgtc tgatgtggat 9900 ctggcgcggc attgacccac gcgaaatcct cgacgtccag gcacgtattg tgatgagcga 9960 tgccgaacgt accgacgatg atttatacga tacggtgatt ggctaccgtg gcggcaactg 10020 gatttatgag tgggccccgg atctttgtga aggaacctta cttctgtggt gtgacataat 10080 tggacaaact acctacagag atttaaagct ctaaggtaaa tataaaattt ttaagtgtat 10140 aatgtgttaa actactgatt ctaattgttt gtgtatttta gattccaacc tatggaactg 10200 atgaatggga gcagtggtgg aatgccttta atgaggaaaa cctgttttgc tcagaagaaa 10260 tgccatctag tgatgatgag gctactgctg actctcaaca ttctactcct ccaaaaaaga 10320 agagaaaggt agaagacccc aaggactttc cttcagaatt gctaagtttt ttgagtcatg 10380 ctgtgtttag taatagaact cttgcttgct ttgctattta caccacaaag gaaaaagctg 10440 cactgctata caagaaaatt atggaaaaat attctgtaac ctttataagt aggcataaca 10500 gttataatca taacatactg ttttttctta ctccacacag gcatagagtg tctgctatta 10560 ataactatgc tcaaaaattg tgtaccttta gctttttaat ttgtaaaggg gttaataagg 10620 aatatttgat gtatagtgcc ttgactagag atcataatca gccataccac atttgtagag 10680 gttttacttg ctttaaaaaa cctcccacac ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat 10740 gcaattgttg ttgttaactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc 10800 atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa 10860 ctcatcaatg tatcttatca tgtctggatc aactggataa ctcaagctaa ccaaaatcat 10920 cccaaacttc ccaccccata ccctattacc actgccaatt acctagtggt ttcatttact 10980 ctaaacctgt gattcctctg aattattttc attttaaaga aattgtattt gttaaatatg 11040 tactacaaac ttagtag 11057 <210> 31 <211> 1815 <212> DNA <213> artificial <220> <223> eGFP-GPC-delta Z <400> 31 atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60 ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120 ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180 ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240 cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300 ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360 gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420 aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480 ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540 gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600 tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660 ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtcc 720 ggagtgaaac agactttgaa ttttgacctt ctgaagttgg caggagacgt tgagtccaac 780 cctgggccca tggccttacc agtgaccgcc ttgctcctgc cgctggcctt gctgctccac 840 gccgccaggc cggatgttgt gatgactcag tctccactct ccctgcccgt cacccctgga 900 gagccggcct ccatctcctg cagatctagt cagagccttg tacacagtaa tgccaacacc 960 tatttacatt ggtacctgca gaagccaggg cagtctccac agctcctgat ctataaagtt 1020 tccaaccgat tttctggggt ccctgacagg ttcagtggca gtggatcagg cacagatttt 1080 acactgaaaa tcagcagagt ggaggctgag gatgttgggg tttattactg ctctcaaaat 1140 acacatgttc ctcctacgtt tggccagggg accaagctgg agatcaaacg tggtggaggc 1200 ggttcaggcg gaggtggctc tggcggtggc ggatcgcagg tgcagctggt gcagtctgga 1260 gctgaggtga agaagcctgg ggcctcagtg aaggtctcct gcaaggcttc tggatacacc 1320 ttcaccgact atgaaatgca ctgggtgcga caggcccctg gacaagggct tgagtggatg 1380 ggagctcttg atcctaaaac tggtgatact gcctacagtc agaagttcaa gggcagagtc 1440 acgctgaccg cggacgaatc cacgagcaca gcctacatgg agctgagcag cctgagatct 1500 gaggacacgg ccgtgtatta ctgtacaaga ttctactcct atacttactg gggccaggga 1560 accctggtca ccgtctcctc aaccacgacg ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc 1620 accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc ccagaggcgt gccggccagc ggcggggggc 1680 gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc tgtgatatct acatctgggc gcccttggcc 1740 gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg gttatcacca gagtgaagtt cagcaggagc 1800 gcagacgccc ccgcg 1815 <210> 32 <211> 321 <212> PRT <213> artificial <220> <223> GPC3-deltaZ protein <400> 32 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Ala Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 130 135 140 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 145 150 155 160 Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 165 170 175 Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe 180 185 190 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 195 200 205 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 210 215 220 Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro 245 250 255 Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro 260 265 270 Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 275 280 285 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 290 295 300 Ser Leu Val Ile Thr Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro 305 310 315 320 Ala

Claims (12)

  1. 휴먼 T임파세포 표면에서 발현되는 항GPC3 키메라 항원 수용체 단백질을 코딩하는 핵산으로서,
    타겟GPC3의 키메라 항원 수용체 단백질은 순서적으로 연결된 세포외 결합영역, 막관통영역 및 세포내 신호영역을 포함하며, 상기 세포외 결합영역은 특이적으로 GPC3의 C말단 항원결정부를 식별하는 단사슬항체 scFv(GPC3)를 포함하는 핵산.
  2. 청구항1에 있어서,
    상기 막관통영역이 CD8 또는 CD28의 막관통영역 및 경첩영역을 포함하는 서열에서 선택되는 핵산.
  3. 청구항1 또는 2에 있어서,
    상기 세포내 신호영역은 CD3ζ, FcεRIγ, CD28, CD137, CD134의 세포내 신호영역 서열 및 이들의 조합에서 선택되는 핵산.
  4. 청구항3에 있어서,
    상기 키메라 항원 수용체 단백질은 순서적으로 연결된 세포외 결합영역, 막관통영역 및 세포내 신호영역을 포함한 하기 순위로 연결된 키메라 항원 수용체 단백질 및 그들의 조합에서 선택되며,
    scFv(GPC3)-CD8-CD3ζ,
    scFv(GPC3)-CD8-CD137-CD3ζ,
    scFv(GPC3)-CD28a-CD28b-CD3ζ,
    scFv(GPC3)-CD28a-CD28b-CD137-CD3ζ,
    그중 관련 키메라 항원 수용체 단백질 중 CD28a는 CD28분자의 막관통영역을 표시하고, CD28b는 CD28분자의 세포내 신호영역을 표시하는 핵산.
  5. 청구항1에 있어서,
    SEQ ID NO: 22 내지 25중의 하나의 서열을 가진 키메라 항원 수용체 단백질을 코딩하는 핵산에서 선택되는 핵산.
  6. 청구항1에 있어서,
    SEQ ID NO: 18 내지 21중의 하나의 서열을 가진 핵산.
  7. 청구항1 내지 6중의 하나의 핵산을 포함하는 벡터.
  8. 청구항7에 있어서,
    렌티바이러스(lentivirus) 플라스미드 pPWT-eGFP에서 유래되며, SEQ ID NO: 27 내지 30중의 하나의 핵산서열을 가진 벡터.
  9. 청구항7 또는 8의 벡터를 포함하는 바이러스.
  10. 청구항1 내지 6중 하나의 핵산 또는 청구항7 또는 8의 벡터 또는 청구항9의 바이러스가 형질도입된 유전자 변형의 T임파세포.
  11. 표면에서 일종의 키메라 항원 수용체를 발현하며, 상기 키메라 항원 수용체가 SEQ ID NO: 18 내지 21 중 하나의 핵산이 코딩되어 발현되는 형질전환 T임파세포.
  12. 표면에서 일종의 키메라 항원 수용체를 발현하며, 상기 키메라 항원 수용체의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 22 내지 25중의 하나인 유전자 변형 T임파세포.
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