KR20230038460A - 동종 종양 세포 백신 - Google Patents

Abstract

기재된 발명은 3개의 면역조절 분자의 핵심 그룹을 발현하도록 유전적으로 조작된 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체, 및 임의로, PBMC의 하나 이상의 하위집합이 발현된 면역조절 분자에 반응하여 증식한 다음, 종양 세포의 사멸을 위한 효과기 단계로 들어가도록 유도하기 위한 추가의 R 면역조절 폴리펩티드를 포함하는 동종 종양 세포 백신을 제공한다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포 백신 후보는 수용자 암 환자에서 환자 자신의 (자가) 종양 세포와 교차 반응하는 면역 반응을 유도할 수 있으며, 그 효과는 매칭된 백신접종되지 않은 환자 코호트와 비교하여 백신접종된 환자 코호트의 증가된 생존에 기여하는 강화된 항종양 면역을 초래하기에 충분하다.

Description

동종이계 종양 세포 백신

관련 출원

본 출원은 미국 가출원 번호 제62/425,424호(2016년 11월 22일 출원)에 대한 우선권을 주장하는 미국 출원 번호 15/821,105호(2017년 11월 22일 출원)의 일부 계속 출원이다.

서열 목록

본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출되었고 그 전체가 본 명세서에 참고로 통합된 서열 목록을 함유한다. 2020년 6월 9일에 생성된 상기 ASCII 사본은 128663-00119_SL.txt로 명명되고 크기는 263,710바이트이다.

기술 분야

기재된 발명은 일반적으로 암의 치료에 대한 면역학적 접근법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 변형된 종양 세포를 포함하는 암 백신에 관한 것이다.

인간 면역계는 일반적으로 "선천적 면역"과 "적응 면역"이라고 하는 2가지 부문으로 나눌 수 있다. 면역계의 선천적 부문은 보체계 및 케모카인/사이토카인 체계를 포함하는 다수의 용해성 인자; 및 비만 세포, 대식세포, 수지상 세포(DC) 및 자연 사멸(natural killer) 세포(NK)를 포함한 다수의 특수화된 세포 유형을 통해 초기 염증 반응을 담당한다. 적응 면역 부문은 항원에 대한 면역학적 기억에서 중요한 역할을 하는 CD8+ 및 CD4+ T 세포 반응과 함께 지연되고 오래 지속되는 항체 반응과 연관되어 있다. 면역계의 제3 부문은 γδ T 세포 및 제한된 T 세포 수용체 레퍼토리를 갖는 T 세포, 예컨대 자연 사멸 T(NKT) 세포 및 점막-연관된 불변 T(MAIT) 세포를 포함하는 것으로 확인될 수 있다.

면역계의 세포

면역계를 구성하는 다수의 세포 상호작용이 있다. 이러한 상호작용은 양방향으로 신호를 보내는 특정 수용체-리간드 쌍을 통해 발생하므로 각 세포는 이들 신호의 시간적 및 공간적 분포에 기초한 지시를 수신한다.

뮤린 모델은 면역조절 경로를 발견하는 데 매우 유용했지만, 이종교배된 인간 모집단은 개별 면역조절 경로에 다양한 정도로 의존하는 개체를 가질 수 있기 때문에, 이러한 경로의 임상적 유용성은 근친교배된 마우스 계통에서 이종교배된 인간 모집단으로 항상 변환되는 것은 아니다.

면역계의 세포는 림프구, 단핵구/대식세포, 수지상 세포, 밀접하게 관련된 랑게르한스 세포, 자연 사멸(NK) 세포, 비만 세포, 호염기구 및 골수 계통의 세포의 기타 구성원을 포함한다. 부가하여, 일련의 특수화된 상피 및 기질 세포는 종종 면역계의 세포에서 성장 및/또는 유전자 활성화를 조절하는 중요한 인자를 분비함에 의해 면역이 발생하는 해부학적 환경을 제공하며, 이는 또한 반응의 유도 및 효과기 단계에서 직접적인 역할을 수행한다. (Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction," Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999), at p. 102).

면역계의 세포는 비장, 림프절, 소장의 파이어 패치 및 편도선과 같은 말초 조직화된 조직에서 발견된다. 림프구는 또한 중추 림프 기관, 흉선 및 골수에서 발견되며, 여기서 림프구는 성숙한 면역계의 무수한 반응을 중재할 수 있게 하는 발달 단계를 거친다. 림프구와 대식세포의 상당 부분은 혈액과 림프에서 발견되는 순환하는 세포의 풀을 포함하여, 면역적격 세포를 이를 필요로 하는 부위에 전달하고 국소적으로 생성된 면역이 일반화되도록 하는 수단을 제공한다. (Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction," Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999), at p. 102).

용어 "림프구"는 전신의 림프 조직에 형성되는 작은 백혈구를 지칭하며, 정상 성인의 경우 순환 혈액 내 총 백혈구 수의 약 22~28%를 차지하며 질환에 대하여 신체를 방어하는데 큰 역할을 한다. 개별 림프구는 그들의 유전 물질의 재조합을 통해 구조적으로 관련된 제한된 세트의 항원에 반응하는 데 (예를 들어, T 세포 수용체와 B 세포 수용체를 생성하는데) 특화되어 있다. 면역계가 주어진 항원과 처음 접촉하기 전에 존재하는 이러한 약속은 림프구 표면 막의 항원에 있는 결정인자(에피토프)에 특이적인 수용체의 존재로 표현된다. 각 림프구는 고유한 수용체 모집단을 가지고 있으며, 모두 동일한 결합 부위를 가지고 있다. 림프구의 한 세트 또는 클론은 그의 수용체의 결합 영역 구조내 또 다른 클론과 다르므로, 인식할 수 있는 에피토프에서 다르다. 림프구는 그의 수용체의 특이성뿐만 아니라 기능도 서로 다르다. (Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction," Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999), at p. 102).

2개의 광범위한 림프구 부류가 인식된다: 항체-분비 세포의 전구체인 B-림프구(B-세포), 및 T-림프구(T-세포).

B-림프구

B-림프구는 골수의 조혈 세포에서 유래한다. 성숙한 B-세포는 그의 세포 표면에서 인식되는 에피토프를 발현하는 항원으로 활성화될 수 있다. 활성화 과정은 항원에 의한 막 Ig 분자의 가교결합(가교결합-의존성 B-세포 활성화)에 따라 직접적일 수도 있거나, 동족이라고 하는 과정에서 헬퍼 T-세포와의 상호작용을 통해 간접적일 수도 있다. 많은 생리학적 상황에서, 수용체 가교 자극과 동족은 시너지 효과를 일으켜 보다 강력한 B-세포 반응을 생성한다.(Paul, W. E., "Chapter 1: The Immune system: an introduction," Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999)).

가교 의존적 B-세포 활성화는 각각의 B-세포가 동일한 가변 영역을 갖는 Ig 분자를 발현하기 때문에 항원이 세포 표면 수용체의 결합 부위에 상보적인 에피토프의 다중 복제본을 발현할 것을 요구한다. 이러한 요구 사항은 미생물의 캡슐 다당류 또는 바이러스 외피 단백질과 같은 반복적 에피토프를 가진 다른 항원에 의해 충족된다. 가교-의존성 B-세포 활성화는 이러한 미생물에 대한 주요 보호 면역 반응이다(Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction", Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999)).

동족이 도움으로써 B-세포가 수용체를 교차연결할 수 없는 항원에 대한 반응을 일으키고 동시에 이들이 약한 교차연결 이벤트에 의해 자극될 때 불활성화로부터 B 세포를 구출하는 보조자극 신호를 제공한다. 동족 도움은 B-세포의 막 면역글로불린(Ig)에 의한 항원의 결합, 항원의 엔도사이토시스, 및 세포의 엔도솜/리소좀 구획 내의 펩티드로의 그의 단편화에 의존한다. 생성된 펩티드 중 일부는 클래스 II 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자로 알려진 특수한 세포 표면 단백질 세트의 홈에 장입된다. 생성된 클래스 II/펩티드 복합체는 세포 표면에서 발현되며, CD4⁺ T-세포로 지정된 T-세포 세트의 항원-특이적 수용체에 대한 리간드 역할을 한다. CD4⁺ T-세포는 B-세포의 클래스 II/펩티드 복합체에 특이적인 수용체를 그들의 표면 상에 가지고 있다. B-세포 활성화는 T 세포 수용체(TCR)를 통한 T 세포의 결합에 의존할 뿐만 아니라, 이 상호작용을 통해 T-세포 상의 활성화 리간드(CD40 리간드)가 B-세포 상의 그의 수용체(CD40)에 결합하여, B-세포 활성화를 시그널링할 수 있다. 또한, T 헬퍼 세포는 B 세포 상의 사이토카인 수용체에 결합하여, 자극된 B-세포의 성장과 분화를 조절하는 여러 사이토카인을 분비한다(Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction, "Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999)).

항체 생산을 위한 동족 도움 동안, CD40 리간드는 활성화된 CD4⁺ T 헬퍼 세포에서 일시적으로 발현되고, 항원-특이적 B 세포 상의 CD40에 결합함으로써 2차 공동자극 신호를 전달한다. 후자의 신호는 항원과 마주한 배 중심 B 세포의 세포자멸사를 방지함으로써 B 세포 성장 및 분화에 필수적이고, 기억 B 세포의 생성에 필수적이다. B 및 T 세포 모두에서 CD40 리간드의 과발현은 인간 SLE 환자의 병원성 자가항체 생산과 관련이 있다.(Desai-Mehta, A. 등, "Hyperexpression of CD40 ligand by B and T cells in human lupus and its role in pathogenic autoantibody production," J. Clin. Invest. Vol. 97(9), 2063-2073, (1996)).

T-림프구

조혈 조직의 전구체로부터 유래된 T-림프구는 흉선에서 분화를 겪은 다음, 말초 림프 조직 및 림프구의 재순환 풀에 시딩된다. T-림프구 또는 T 세포는 광범위한 면역 기능을 매개한다. 여기에는 B 세포가 항체-생성 세포로 발달하도록 돕는 능력, 단핵구/대식세포의 살균 작용을 증가시키는 능력, 특정 유형의 면역 반응 억제, 표적 세포의 직접 살해 및 염증 반응의 동원이 포함된다. 이러한 효과는 특정 세포 표면 분자의 T 세포 발현과 사이토카인의 분비에 따라 달라진다(Paul, W. E., "Chapter 1: The Immune system: an introduction", Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999)).

T 세포는 그 항원 인식의 작용기전에서 B 세포와 상이하다. B 세포의 수용체인 면역글로불린은 가용성 분자 또는 미립자 표면 상의 개별 에피토프에 결합한다. B-세포 수용체는 천연 분자의 표면 상에 발현된 에피토프를 본다. 항체와 B-세포 수용체는 세포외액에서 미생물에 결합하고 이를 보호하기 위해 진화한 반면, T 세포는 다른 세포의 표면 상의 항원을 인식하고 이들 항원-제시 세포(APC)와 상호작용하고 이의 행동을 변경함에 의해 그 기능을 매개한다. T 세포를 활성화할 수 있는 말초 림프 기관에는 3가지 주요 유형의 APC가 있다: 수지상 세포, 대식세포 및 B 세포. 이들 중 가장 강력한 것은 T 세포에 외래 항원을 제시하는 것이 그 유일한 기능인 수지상 세포이다. 미성숙 수지상 세포는 피부, 내장 및 기도를 포함한 신체 전체의 조직에 위치된다. 그것은 이들 부위에서 침입하는 미생물을 조우할 때 병원체와 그 산물을 세포내이입하고 이를 림프를 통해 국소 림프절이나 장 연관된 림프 기관으로 운반한다. 병원체와의 조우는 수지상 세포가 항원-포획 세포에서 T 세포를 활성화할 수 있는 APC로 성숙하도록 유도한다. APC는 T 세포를 활성화하여 효과기 세포가 되는 역할을 하는 3가지 유형의 단백질 분자를 그 표면 상에 표시한다: (1) T 세포 수용체에 외래 항원을 제시하는 MHC 단백질; (2) T 세포 표면 상의 상보적 수용체에 결합하는 공동자극 단백질; 및 (3) T 세포가 활성화될 만큼 충분히 오랫동안 APC에 결합할 수 있게 하는 세포-세포 접착 분자 ("Chapter 24: The adaptive immune system," Molecular Biology of the Cell, Alberts, B. 등, Garland Science, NY, (2002)).

T-세포는 그들이 발현하는 세포 표면 수용체에 기반하여 2개의 별개의 클래스로 세분된다. 대부분의 T 세포는 α 및 β-사슬로 구성된 T 세포 수용체(TCR)를 발현한다. T 세포의 작은 그룹은 γ 및 δ 사슬로 구성된 수용체를 발현한다. α/β T 세포 중에는 2개의 하위-계통이 있다: 공동수용체 분자 CD4를 발현하는 것(CD4⁺ T 세포); 및 CD8을 발현하는 것(CD8⁺ T 세포). 이들 세포는 항원을 인식하는 방법과 그 효과기 및 조절 기능에서 상이하다.

CD4⁺ T 세포는 면역계의 주요 조절 세포이다. 그의 조절 기능은 T 세포가 활성화될 때 발현이 유도되는 CD40 리간드와 같은 그 세포-표면 분자의 발현과 활성화될 때 그것이 분비하는 광범위한 사이토카인 둘 다에 의존한다.

CD4+ 헬퍼 T 세포와 같은 CD8+ (세포독성) T 세포는, 흉선에서 생성되고 T-세포 수용체를 발현한다. 그러나, CD4 분자 대신에 세포독성 T 세포는 일반적으로 하나의 CD8α와 하나의 CD8β 사슬로 구성된 이합체 공동-수용체인 CD8을 발현한다. CD8+ T 세포는 모든 유핵 세포에서 발견되는, MHC 클래스 I 분자에 의해 제시된 펩티드를 인식한다. CD8 이종이량체는 T 세포/항원 제시 세포 상호작용 동안 MHC 클래스 I의 보존된 부분(α3 영역)에 결합한다. CD8+ T 세포(종종 세포독성 T 림프구, 또는 CTL이라고 함)는 바이러스 및 박테리아를 포함한 세포내 병원체에 대한 면역 방어와 종양 감시에 중요하다. CD8+ T 세포가 그의 항원을 인식하고 활성화될 때, 감염된 세포나 악성 세포를 사멸시키는 세 가지 주요 기전이 있다. 첫 번째는 항종양 및 항바이러스 미생물 효과를 갖는 사이토카인, 주로 TNF-α 및 IFNγ의 분비이다. 두 번째 주요 기능은 세포독성 과립의 생성 및 방출이다. NK 세포에서도 발견되는 이러한 과립에는 퍼포린과 그랜자임이라는 두 가지 단백질 계열이 포함되어 있다. 퍼포린은 보체의 막 공격 복합체와 유사하게, 표적 세포의 막에 공극을 형성한다. 이 공극은 세포독성 과립에 포함된 그랜자임이 감염된 세포나 악성 세포에 들어갈 수 있게 한다. 그랜자임은 세포 내부의 단백질을 절단하여 바이러스 단백질의 생산을 차단하고 궁극적으로 표적 세포의 세포자멸사를 초래하는 세린 프로테아제이다. CD8+ T 세포는 과립을 방출하고 감염된 세포를 사멸시킨 다음, 새로운 표적으로 이동하여 다시 사멸시킬 수 있으며, 이를 종종 연쇄 사멸이라고 한다. 감염된 세포의 CD8+ T 세포 파괴의 세 번째 주요 기능은 Fas/FasL 상호작용을 통한 것이다. 활성화된 CD8+ T 세포는 표적 세포의 표면에 있는 그의 수용체인, Fas에 결합하는 세포 표면 상에서 FasL을 발현한다. 이 결합으로 인해 표적 세포 표면의 Fas 분자가 삼량체화되어 시그널링 분자를 함께 끌어당긴다. 이러한 시그널링 분자는 카스파제 캐스케이드의 활성화를 초래하며, 이는 또한 표적 세포의 세포자멸사를 초래한다. CD8+ T 세포는 두 분자를 모두 발현할 수 있기 때문에, Fas/FasL 상호작용은 CD8+ T 세포가 면역 반응이 끝나는 수축 단계 동안 면역 효과기 세포를 제거하기 위해 동족사멸(fratricide)이라고 하는 서로를 사멸시킬 수 있는 기전이다.

T 세포는 또한 중요한 효과기 기능을 매개하는데, 그 중 일부는 그것이 분비하는 사이토카인의 패턴에 의해 결정된다. 사이토카인은 표적 세포에 직접적으로 독성이 있을 수 있고 강력한 염증성 작용기전을 동원할 수 있다.

부가하여, T 세포, 특히 CD8⁺ T 세포는 CTL에 의해 인식되는 항원을 발현하는 표적 세포를 효율적으로 용리할 수 있는 세포독성 T-림프구(CTL)로 발달할 수 있다(Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction," Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999)).

T 세포 수용체(TCR)는 클래스 II 또는 클래스 I MHC 단백질의 분화된 홈에 결합된 항원의 단백질분해에 의해 유도된 펩티드로 구성된 복합체를 인식한다. CD4⁺ T 세포는 펩티드/클래스 II 복합체만 인식하는 반면 CD8⁺ T 세포는 펩티드/클래스 I 복합체를 인식한다(Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction," Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999)).

TCR의 리간드(즉, 펩티드/MHC 단백질 복합체)는 APC 내에서 생성된다. 일반적으로, 클래스 II MHC 분자는 세포내이입 과정을 통해 APC에 의해 흡수된 단백질에서 유래된 펩티드에 결합한다. 그런 다음 이들 펩티드-장입된 클래스 II 분자는 세포의 표면 상에서 발현되며, 여기서 그것은 발현된 세포 표면 복합체를 인식할 수 있는 TCR을 갖는 CD4⁺ T 세포에 의해 결합되는데 이용가능하다. 따라서, CD4⁺ T 세포는 세포외 공급원으로부터 유래된 항원과 반응하도록 분화된다(Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction," Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999)).

대조적으로, 클래스 I MHC 분자는 주로 바이러스 단백질과 같은 내부적으로 합성된 단백질로부터 유래된 펩티드로 장입된다. 이들 펩티드는 프로테오솜에 의한 단백질분해에 의해 세포질 단백질로부터 생성되고 거친 소포체로 전위된다. 일반적으로 길이가 9개의 아미노산으로 구성된 이러한 펩티드는 클래스 I MHC 분자 내에 결합되고 적절한 수용체를 발현하는 CD8⁺ T 세포에 의해 인식될 수 있는 세포 표면으로 이동한다. 이것은 T 세포 시스템, 특히 CD8⁺ T 세포가, 그 온전한 형태에서 이들 단백질이 세포 표면 상에서 발현되거나 분비되지 않더라도, 유기체의 나머지 부분(예를 들어, 바이러스 항원) 또는 돌연변이 항원(예컨대, 활성 종양유전자 생성물)의 세포의 것과 다르거나 이보다 훨씬 더 많은 양으로 생성되는 단백질을 발현하는 세포를 탐지하는 능력을 제공한다(Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction," Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999)).

T 세포는 또한 헬퍼 T 세포로서의 그 기능에 기반하여; 세포 면역을 유도하는데 포함된 T 세포; 억제 T 세포; 및 세포독성 T 세포로 분류될 수 있다.

헬퍼 T 세포

헬퍼 T 세포는 단백질 및 기타 T 세포-의존성 항원에 대한 항체 반응을 일으키도록 B 세포를 자극하는 T 세포이다. T 세포-의존성 항원은 개별 에피토프가 단지 한 번 또는 제한된 횟수로 나타나 그것이 B 세포의 막 면역글로불린(Ig)을 교차-연결할 수 없거나 비효율적으로 교차-연결하는 면역원이다. B 세포는 막 Ig를 통해 항원에 결합하고 복합체는 세포내이입을 겪는다. 엔도솜 및 리소솜 구획 내에서, 항원은 단백질분해 효소에 의해 펩티드로 단편화되고, 생성된 펩티드 중 하나 이상이 이 소포 구획을 통과하는 클래스 II MHC 분자 내에 장입된다. 생성된 펩티드/클래스 II MHC 복합체는 그런 다음 B-세포 표면 막으로 내보내진다. 펩티드/클래스 II 분자 복합체에 특이적인 수용체를 갖는 T 세포는 B-세포 표면 상에서 이 복합체를 인식한다. (Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction," Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia (1999)).

B-세포 활성화는 그의 TCR을 통한 T 세포의 결합 및 B 세포 상의 CD40과 T-세포 CD40 리간드(CD40L)의 상호작용 둘 다에 의존한다. T 세포는 구성적으로 CD40L을 발현하지 않는다. 오히려, CD40L 발현은 T 세포의 TCR에 의해 인식되는 동족체 항원 및 CD80 또는 CD86 둘 다를 발현하는 APC와의 상호작용의 결과로 유도된다. CD80/CD86은 일반적으로, 따라서 활성화된 B 세포와 T 세포를 포함하는 헬퍼 상호작용이 효율적인 항체 생산을 유도할 수 있는, 활성화되지만 휴지기가 아닌 B 세포에 의해 발현된다. 그러나, 많은 경우에 T 세포 상의 CD40L의 초기 유도는 수지상 세포와 같이 구성적으로 CD80/86을 발현하는 APC의 표면 상의 그 항원 인식에 의존적이다. 이러한 활성화된 헬퍼 T 세포는 그 다음 B 세포와 효율적으로 상호작용하고 도움을 줄 수 있다. B 세포에서 막 Ig의 교차-연결은 비효율적일지라도 CD40L/CD40 상호작용과 상승작용하여 활발한 B-세포-활성화를 생성할 수 있다. 증식, Ig 분비, 발현되는 Ig 클래스의 클래스 전환을 포함하는 B-세포 반응에서 후속 이벤트는 T 세포-유래된 사이토카인의 작용에 의존하거나 증진된다(Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction," Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999)).

CD4⁺ T 세포는 주로 사이토카인 IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-10을 분비하는 세포(T_H2 세포) 또는 IL-2, IFNγ, 및 림프독소를 주로 생산하는 세포(T_H1 세포)로 분화되는 경향이 있다. T_H2 세포는 B-세포가 항체-생산 세포로 발달하도록 돕는 데 매우 효과적인 반면, T_H1 세포는 단핵구 및 대식세포의 살균 활성을 향상시켜 결과적으로 세포내 소포체 구획에서 미생물을 용리시키는 효율을 증가시키는 세포 면역 반응의 효과적인 유도제이다. T_H2 세포의 표현형(즉, IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-10)을 갖는 CD4⁺ T 세포가 효율적인 헬퍼 세포이지만, T_H1 세포도 헬퍼로 되는 능력을 갖는다(Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction, "Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999)).

자연 사멸(NK) 세포

자연 사멸(NK) 세포는 T 및 B 세포와 동일한 계열의 림프구로 공통 조상에서 유래한다. 그러나, 선천적 면역계의 세포로서, NK 세포는 그룹 I 선천적 림프구(ILC)로 분류되며, 다양한 병리학적 문제에 빠르게 반응한다. NK 세포는 예를 들어 바이러스에 감염된 세포를 사멸시키고 암의 초기 징후를 감지하고 제어하는 등 질환으로부터 보호한다. NK 세포는 (항원 제시 세포에 의한 프라이밍이 필요한 세포독성 T 세포와 대조적으로) 프라이밍 또는 사전 활성화 없이 종양 세포를 사멸하는 능력으로 처음 주목되었다. 그들은 이 '자연적' 사멸의 이름을 따서 명명되었다. 또한 NK 세포는 IFNγ 및 TNFα와 같은 사이토카인을 분비하여 대식세포 및 수지상 세포와 같은 다른 면역 세포에 작용하여 면역 반응을 향상시킨다.

순찰하는 동안 NK 세포는 지속적으로 다른 세포와 접촉한다. NK 세포가 이들 세포를 사멸시키는지 여부는 NK 세포 표면의 활성화 수용체와 억제 수용체로부터의 신호 균형에 달려 있다. 활성화 수용체는 암세포와 감염된 세포의 표면에 발현되는 분자를 인식하고, NK 세포의 '스위치를 켠다'. 억제 수용체는 NK 세포 사멸을 확인하는 역할을 한다. 대부분의 정상적인 건강한 세포는 이러한 세포를 '자기'로 표시하는 MHC I 수용체를 발현한다. NK 세포 표면의 억제 수용체는 동족체 MHC I을 인식하고, 이것이 NK 세포를 '스위치 꺼서' 사멸시키는 것을 방지한다. 암세포와 감염된 세포는 종종 그들의 MHC I을 잃어, NK 세포 사멸에 취약하다. 사멸시키기로 결정하면, NK 세포는 퍼포린과 그랜자임이 함유된 세포독성 과립을 방출하여, 표적 세포를 용해시킨다.

세포 면역 유도에서 T 세포 관여

T 세포는 또한 세포내 미생물을 파괴하는 단핵구 및 대식세포의 능력을 증진시키는 작용을 할 수 있다. 특히, 헬퍼 T 세포에 의해 생산되는 인터페론-감마(IFNγ)는 단핵 식세포가 산화질소의 생성 및 종양 괴사 인자(TNF) 생성의 유도를 포함한 세포내 박테리아 및 기생을 파괴하는 여러 기전들을 증진시킨다. T_H1 세포는 IFNγ를 생산하기 때문에 살균 작용을 증진시키는 데 효과적이다. 대조적으로, T_H2 세포에 의해 생성된 2가지 주요 사이토카인인 IL-4 및 IL-10은 이들 활성을 차단한다(Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction," Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999)).

조절 T(Treg) 세포

면역 항상성은 면역 반응의 개시와 하향조절 사이의 조절된 균형에 의해 유지된다. 세포자멸사 및 T 세포 아네르기의 작용기전(항원 조우에 이어 T 세포가 본질적으로 기능적으로 비활성화되는 내성 작용기전(Scwartz, R. H., "T cell anergy", Annu. Rev. Immunol., Vol. 21: 305-334 (2003))은 면역 반응의 하향조절에 기여한다. 제3 작용기전은 억제자 또는 조절자 CD4⁺ T(Treg) 세포에 의한 활성화된 T 세포의 활성 억제에 의해 제공된다(Kronenberg, M. 등, "Regulation of immunity by self-reactive T cells", Nature, Vol. 435: 598-604 (2005)에서 검토됨). IL-2 수용체 알파(IL-2Rα) 사슬(CD4⁺ CD25⁺)을 구성적으로 발현하는 CD4⁺ Treg는 아네르기이고 억제적인 자연적으로 발생하는 T 세포 하위집합이다(Taams, L. S. 등, "Human anergic/suppressive CD4⁺CD25⁺ T cells: a highly differentiated and apoptosis-prone population", Eur. J. Immunol. Vol. 31: 1122-1131 (2001)). CD4⁺CD25⁺ Treg의 고갈은 마우스에서 전신 자가면역 질환을 초래한다. 더욱이, 이들 Treg의 전달은 자가면역 질환의 발병을 예방한다. 그 뮤어라인 대응물과 유사한, 인간 CD4⁺CD25⁺ Treg는 흉선에서 생성되고, 세포-세포 접촉-의존성 작용기전을 통해 반응자 T 세포의 증식을 억제하는 능력, IL-2를 생성할 수 없는 능력 및 시험관내에서 아네르기의 표현형에 의해 특징되어 진다. 인간 CD4⁺CD25⁺ T 세포는 CD25 발현 수준에 따라 억제(CD25^high) 및 비억제(CD25^low) 세포로 나눌 수 있다. 전사 인자의 포크헤드 패밀리의 구성원인 FOXP3은 뮤어라인 및 인간 CD4⁺CD25⁺ Treg에서 발현되는 것으로 나타났으며, CD4⁺CD25⁺ Treg 발달을 제어하는 마스터 유전자인 것으로 보인다(Battaglia, M. 등, "Rapamycin promotes expansion of functional CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ regulator T cells of both healthy subjects and type 1 diabetic patients", J. Immunol., Vol. 177: 8338-8347, (2006)).

세포독성 T 림프구

표적 세포 내에서 생성된 단백질로부터 펩티드를 인식하는 CD8⁺ T 세포는 표적 세포의 용리를 유도한다는 점에서 세포독성 특성을 갖는다. CTL-유도된 용리의 작용기전은 표적 세포의 막에 삽입하고 그 세포의 용리를 촉진할 수 있는 분자인 퍼포린의 CTL에 의한 생성을 포함한다. 퍼포린-매개된 용리는 활성화된 CTL에 의해 생성된 일련의 효소인 그랜자임에 의해 증진된다. 많은 활성 CTL은 또한 그 표면 상에 다량의 fas 리간드를 발현한다. 표적 세포의 표면 상의 fas와 CTL의 표면 상의 fas 리간드의 상호작용은 표적 세포에서 세포자멸사를 개시하여 이들 세포의 사멸로 이어진다. CTL-매개된 용리는 바이러스로 감염된 세포를 파괴하는 주요 작용기전인 것으로 나타난다.

T-기억 세포

적응성 면역 반응을 통해 병원체를 인식하고 근절한 후, T 세포의 대다수(90-95%)는 세포자멸사를 겪으며 나머지 세포는 중앙 기억 T 세포(TCM), 효과기 기억 T 세포(TEM) 및 상주 기억 T 세포(TRM)로 지정된 기억 T 세포의 풀을 형성한다(Clark, R.A., "Resident memory T cells in human health and disease", Sci. Transl. Med., 7, 269rv1, (2015)).

표준 T 세포와 비교하여, 이들 기억 T 세포는 특정 표면 마커의 발현, 상이한 사이토카인 프로파일의 신속한 생성, 직접적인 효과기 세포 기능의 능력, 및 독특한 귀소 분포 패턴과 같은 별개의 표현형으로 오래-생존한다. 기억 T 세포는 공격자에 의한 재감염을 제거하고 이에 의해 면역계의 균형을 신속하게 회복시키기 위해 그 각각의 항원에 재-노출되면 빠른 반응을 나타낸다. 증가하는 증거는 자가면역 기억 T 세포가 자가면역 질환을 치료하거나 치유하려는 대부분의 시도를 방해한다는 것을 구체화한다(Clark, R.A., "Resident memory T cells in human health and disease", Sci. Transl. Med., Vol. 7, 269rv1, (2015)).

항원에 대한 효과적인 면역 반응을 위해, 항원 제시 세포(APC)는 T 세포에 대한 적절한 주요 조직적합성 복합체(MHC) 맥락에서 항원을 처리하고 표시해야 하며, 그런 다음, 세포 독성 및 헬퍼 T 세포의 T 세포 자극을 초래할 것이다. 항원 제시 후, APC와 T 세포 모두에서 공동-자극 분자의 성공적인 상호 작용이 일어나야 하며 그렇지 않으면 활성화가 중단될 것이다. GM-CSF 및 IL-12는 많은 종양 모델에서 효과적인 전-염증 분자 역할을 한다. 예를 들어, GM-CSF는 T 세포의 활성화에 필요한 효과적인 항원-제시 세포로의 성숙을 활성화하기 위해 추가적인 신호가 필요하지만, 골수성 전구 세포가 증식하고 수지상 세포(DC)로 분화되도록 유도한다. 효과적인 면역 요법에 대한 장벽에는 적절한 크기와 기능의 세포독성 CD8 T 세포의 유도를 제한할 수 있는 표적 항원에 대한 내성, 생성된 T 세포가 악성 세포 부위로 트래피킹되지 않는 것, 및 유도된 T 세포 반응의 불량한 지속성이 포함된다. 종양-세포 잔해물을 식균하는 DC는 MHC 제시를 위한 물질을 처리하고, 공동자극 분자의 발현을 상향조절하고, 국소 림프절로 이동하여 종양-특이적 림프구를 자극한다. 이 경로는 종양-연관 항원에 반응하는 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 증식 및 활성화를 초래한다. 실제로, 이러한 세포는 환자의 혈액, 림프 조직 및 악성 병변에서 종종 검출될 수 있다.

림프구는 면역계 조절에 관여하는 백혈구의 일종이다. 림프구는 림프계에서 훨씬 더 흔하며, B 세포, T 세포, 사멸 T-세포, 및 자연 사멸(NK) 세포를 포함한다. 림프구에는 두 가지 광범위한 범주, 즉 T 세포와 B 세포가 있다. T-세포는 세포-매개 면역을 담당하는 반면, B-세포는 체액성 면역(항체 관련)을 담당한다. T-세포는 이러한 림프구가 흉선에서 성숙하기 때문에 그렇게 명명되며; B-세포는 골수에서 성숙한다. B 세포는 병원체에 결합하여 파괴할 수 있는 항체를 만든다. CD4+ (헬퍼) T 세포는 면역 반응을 조정한다. CD8+ (세포 독성) T 세포 및 자연 사멸(NK) 세포는 예를 들어 바이러스에 감염되었거나 항원 서열을 나타내는 신체의 세포를 사멸시킬 수 있다.

면역 반응

일반적으로 말해서, 면역 반응은 개체와 외래 물질, 예를 들어 감염성 미생물 사이의 조우에 의해 시작된다. 감염된 개체는 면역원의 항원 결정기/에피토프에 특이적인 항체 분자의 생성을 갖는 체액성 면역 반응과, 감염된 세포를 용리할 수 있는 사이토카인 및 살해 T 세포를 생성하는 세포를 포함하는 항원-특이적 조절 및 효과기 T-림프구의 확장 및 분화에 따른 세포 매개 면역 반응으로 신속하게 반응한다. 주어진 미생물을 사용한 1차 면역은 그 미생물에서 발견되는 항원 결정기/에피토프에 특이적이지만, 통상적으로 관련 없는 미생물에 의해 발현되는 항원 결정기를 인식하지 못하거나 단지 불충분하게 인식하는 항체 및 T 세포를 유발한다(Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction," Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999), at p. 102).

이 초기 반응의 결과로, 면역화된 개체는 면역학적 기억의 상태를 발달시킨다. 동일하거나 밀접하게 관련된 미생물을 다시 조우하면 2차 반응이 이어진다. 이 2차 반응은 일반적으로 더 빠르고 크기가 더 크고 더 큰 친화력으로 항원에 결합하고 체내에서 미생물을 제거하는 데 더 효과적이고, 유사하게 향상되고 종종 더 효과적인 T-세포 반응인 항체로 구성된 항체 반응으로 구성된다. 그러나, 감염원에 대한 면역 반응이 항상 병원체의 제거로 이어지는 것은 아니다(Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction," Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999), at p. 102).

암의 면역 관용

암은 특정 세포의 유전적 불안정성을 특징으로 하지만, 면역계가 발병된 인간 모집단의 적어도 특정 분절에서, 외래로 인식되어야 하는 명백하게 비-자기 표현형을 취한 암성 세포에 대해 최적으로 반응하는 데 실패한다는 사실에 기반하여 면역계의 장애로도 기술되었다. 이 관찰의 근거를 설명하기 위해 몇 가지 이유가 제시되었다. 예를 들어, 첫째, 암 세포는 주로 자가-항원으로 구성되는데, 이는 감염성 유기체와의 상황에 대해 현저히 대조적이다. 암 항원으로 분류되는 일부 항원은 실제로는 과발현된 정상 항원이거나, 폴리펩티드 사슬에서 단지 1 또는 2개 아미노산에 돌연변이가 있는 정상 항원이다. 둘째, 암 세포는 MHC를 하향-조절하고, 따라서 MHC의 방식에 의해 종양 세포-유래된 펩티드를 많이 제시하지 않는다. 셋째, 암 세포, 및 연관된 종양-연관 대식세포는, 면역 반응을 약화시키는 사이토카인을 발현한다(예를 들어, Yu 등 (2007) Nature Rev. Immunol. 7:41-51 참고). 이 약화는 예를 들어 암 세포 또는 연관된 대식세포에 의한 인터루킨-10(IL-10)의 분비로 인해 야기된다. 넷째, 감염이 있는 상황과 달리, 암 세포는 임의의 면역 보조제를 제공하지 않는다. 병원체는 톨-유사 수용체(TLR) 작용제 및 NOD 작용제의 형태를 취하는 다양한 자연적으로-발생하는 면역 보조제를 발현한다(예를 들어, Kleinnijenhuis 등 (2011) Clin. Dev. Immunol. 405310 (12 페이지) 참고). 일반적으로, 수지상 세포의 최적 활성화는 수지상 세포에 의해 발현되는 하나 이상의 톨-유사 수용체(TLR)와 면역 보조제의 접촉을 필요로 한다. 수지상 세포의 활성화 없이, 수지상 세포와 T 세포(면역 시냅스) 사이의 접촉은 T 세포의 최적 활성화를 초래하지 못한다.

면역-회피의 기본 작용기전에 대한 통찰력은, 면역 체크포인트 억제제 또는 다른 요법과의 조합을 통해, 직간접적으로 치료 백신의 효능을 강화하는 병용 요법과 함께 효과적인 항종양 면역을 유도하는 백신 개발의 기초가 되었다.

종양 면역감시 및 면역 편집

종양 면역 편집은 세 단계인: 제거 단계, 평형 단계 및 탈출 단계로 나뉜다. 면역감시로도 알려진 제거 단계는 면역계가 암성 또는 전-암성 세포를 식별하고 그것이 통제를 벗어난 상태로 자라기 전에 이를 제거하는 과정이다. 이 단계는 모든 암성 또는 전암성 세포가 제거될 때 완료될 수 있다. 일부 종양 세포가 제거되지 않으면, 면역계와 종양 세포 성장 사이에 일시적인 평형 상태가 달성될 수 있다. 이 평형 단계에서 종양 세포는 휴면 상태를 유지하거나 존재하는 항원을 조절할 수 있는 게놈 DNA에 대한 추가 변화를 축적하여 진화를 계속할 수 있다. 이 과정 동안 면역계는 진화하는 세포에 선택적인 압력을 가하여, 거의 인식되어 질 수 없는 종양 세포가 생존 이점을 갖는다. 결국 면역 반응은 종양의 세포를 인식할 수 없으며, 그 결과 종양 세포가 통제를 벗어나 점진적으로 성장하는 탈출 단계로 전환된다.

종양 미세환경

종양 미세환경은 종양이 다양한 전략 및 작용기전을 사용하여 항-종양 면역 반응의 모든 단계를 능동적으로 하향조절하기 때문에 면역 세포 기능에 대해 일관되게 효과적인 장벽을 제공한다. 종양 미세환경에서 면역 세포의 기능장애를 유발하는 많은 분자 작용기전이 식별되었으며, 여기에는 종양에 의해 생성된 요인에 의해 직접적으로 매개되는 것과 암의 존재에서 정상 조직 항상성의 변경으로 인한 다른 것들이 포함된다. 대부분의 인간 종양은 면역 세포 발달, 분화, 이동, 세포독성 및 기타 효과기 기능의 하나 이상의 단계를 방해할 수 있는 것으로 보인다(T L　Whiteside, The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth, Oncogene (2008) 27, 5904-5912).

하나의 이러한 작용기전은 인간 종양의 일반적인 특징인 T_reg(CD4⁺CD25^bright Foxp3⁺ T 세포) 및 골수-유래된 세포(CD34⁺CD33⁺CD13⁺CD11b⁺CD15^-)의 종양에서의 축적을 포함하고, 암 환자에서 나쁜 예후와 관련되어 있다(T L　Whiteside, The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth, Oncogene (2008) 27, 5904-5912). 정상 조건 하에서, T_reg 세포는 자가면역을 예방하는 중요한 역할에 관여하지만, 암에서는 이들이 확장되어 종양으로 이동하고 자가 효과기 T-세포 증식을 하향조절하고, 독특한 분자 경로를 사용하여 CD4⁺CD25^- 및 CD8⁺CD25^- T 세포 둘 다의 항-종양 반응을 억제한다. 종양에서 T_reg 세포는 조절 CD3⁺CD4⁺ T 세포의 이종 모집단으로, 천연 T_reg, 항원-특이적 Tr1 세포 및 기타 잘 정의되지 않은 억제 세포의 하위집합을 포함한다. Tr1 세포는 IL-10, TGF-β 및 프로스타글란딘 E₂(PGE₂)가 풍부한 종양 미세환경에서 유도되며, 이들 모두는 Tr1 생성을 촉진하는 것으로 나타났다(T L　Whiteside, The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth, Oncogene (2008) 27, 5904-5912).

골수 억제 세포(MSC)는 또한 TGF-β를 분비하거나 TGF-β 분비를 유도하는 종양 미세환경에서 T-세포 반응을 억제한다. 면역억제 CD34⁺ 세포-유래 골수 세포는 암 환자의 말초 혈액에서 확인되었다. 종양-보유 마우스에서, MSC는 비장과 말초 순환계에 매우 많은 양으로 축적되어, 강력한 면역억제 작용을 하고 종양 성장을 촉진한다. MSC는 또한 L-아르기닌과 같은 필수 아미노산의 가용성을 제어하고 높은 수준의 활성 산소 종을 생성한다. 종양에서 발견되는 MSC는 또한 구성적으로 iNOS와 L-아르기닌의 대사에 관여하는 효소인 아르기나제 1을 발현하며, 이는 또한 iNOS와 상승작용하여 림프구 반응을 방해하는 것으로 밝혀진 슈퍼옥사이드 및 NO 생성을 증가시킨다. 또한 종양 세포에 의해 종종 분비되는 GM-CSF는 MSC를 모집하고 용량 의존적 생체 내 면역 억제 및 종양 촉진을 유도하는 동시에 GM-CSF는 항종양 백신에서 면역 보조제로 사용되었다. GM-CSF는 전이성 흑색종 환자의 순환계에서 TGF-β-생성 MSC의 하위집합을 증가시키는 것으로 관찰되었다. 동시 자극 및 억제 역할은 GM-CSF 및 MSC가 정상 조직에서 면역 항상성을 유지하는 데 관여하지만, 종양 미세 환경에서는 종양 세포 탈출을 촉진한다는 것을 시사한다(T L　Whiteside, The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth, Oncogene (2008) 27, 5904-5912).

종양 면역요법

암 요법은 새로운 분자 표적이 발견됨에 따라 빠르게 발전하고 있다. 특정 경로를 표적으로 하는 생물학적 제제(예를 들어, HERCEPTIN®, ERBITUX®) 및 특정 표적에 대해 설계된 소분자(타목시펜, GLEEVEC™)의 출현에도 불구하고, 화학 요법 및 방사선과 같은 비특이적 양태는 표준 치료로 남아 있다.

항암 면역요법은 다양한 접근법이 시험되고 있는 수년 동안 목표였다. 이 면역 요법을 개발하는 데 있어 한 가지 어려움은 표적 항원이 종종 암 세포와 정상 세포 둘 다에서 발견되는 조직 특이적 분자이고, 면역을 도출하지 않거나 세포 사멸과 관련하여 비-특이성을 나타낸다는 것이다(Kaufman and Wolchok eds., General Principles of Tumor Immunotherapy, Chpt 5, 67-121 (2007)). 더욱이, 종양 세포는 면역 반응을 도출하는 항원의 발현 손실, MHC 클래스 II의 결여 및 MHC 클래스 I 발현의 하향조절과 같은 면역 인식을 어렵게 하는 특징을 가지고 있다. 이들 특징은 CD4+ 및 CD8+ T 세포 둘 다에 의해 종양 세포의 비-인식을 초래할 수 있다(Kaufman and Wolchok eds., General Principles of Tumor Immunotherapy, Chpt 5, 67-121 (2007)). 종양은 또한 면역억제성 사이토카인의 생산과 같은 활성 작용기전을 통해 탐지를 회피할 수 있다(Kaufman and Wolchok eds., General Principles of Tumor Immunotherapy, Chpt 5, 67-121 (2007)).

조혈 전발생 세포 또는 단핵구를 사이토카인 조합으로 배양함에 의해 생체외에서 생성된 DC는 10년 이상 동안 암 환자에서 치료 백신으로 테스트되었다(Ueno H, 등, Immunol. Rev. (2010) 234: 199-212). 예를 들어, 전립선 산 포스파타제(PAP)와 과립구 대식세포 집락-자극 인자(GM-CSF)의 융합 단백질과 간단히 배양되는 농축된 혈액 APC를 기반으로 하는 세포 생성물인 시풀류셀-T(APC 8015로도 알려짐)를 사용한 전이성 전립선암의 치료는 III상 시험에서 대략 4-개월-연장된 중앙값 생존을 초래했다(Higano C S, 등, Cancer (2009) 115: 3670-3679; Kantoff P W, 등, N. Engl. J. Med. (2010) 363: 411-422). 이 연구는 DC-기반 백신이 안전하고, 종양 항원에 특이적인 순환하는 CD4+ T-세포 및 CD8+ T-세포의 확장을 유도할 수 있다고 결론지었다. 이것 및 유사한 연구의 결과로, 시풀류셀-T는 미국 식품의약국(FDA)에서 전이성 전립선암의 치료에 대해 승인되어 차세대의 세포 면역요법 생성물에 대한 임상 개발 및 규제 경로를 마련하게 되었다(Palucka K and Banchereau J, Nature Reviews Cancer (April 2012) 12: 265-276).

종양 덩어리를 특이적으로 감소시킬 수 있고 종양 재발을 제어하기 위해 면역학적 기억을 유도할 수 있는 종양-특이적 효과기 T 세포를 유도하기 위해 DC를 포함하는 백신접종 전략이 개발되었다. 예를 들어, 보조제 및 종양-특이적 항원과 함께 생체외에서 DC를 배양한 다음, 이들 세포를 환자에게 다시 주입함으로써 DC에 종양-특이적 항원을 제공할 수 있다. 절제된 종양, 바늘 생검, 코어 생검, 진공-보조 생검 또는 복막 세척으로부터 얻은 종양 세포는 수지상 세포를 나타내는 종양-특이적-항원을 포함하는 면역원성 조성물을 생성하는 데 사용되었다.

암 치료 전략

HERCEPTIN™ 및 ERBITUX™와 같은 항체 요법은 수동적 면역요법이지만, 예를 들어, 재발률, 무진행 생존 및 전체 생존에 의해 측정된 바와 같이, 임상 결과에서 상당한 개선을 가져왔다. 보다 최근에는, PD-1 및 CTLA4 억제제가 활성 숙주 면역 반응에서 개별 체크포인트를 차단하여 내인성 항암 면역 반응이 지속되도록 하는 것으로 보고되었다. 용어 "면역 체크포인트"는 자가 관용을 유지하고 정상 조직의 손상을 최소화하기 위해 면역 반응의 기간과 정도를 조절하는 데 필요한 일련의 억제 경로를 지칭한다. PD-1, PD-L1, 및 CTLA-4와 같은 면역 체크포인트 분자는 종양 미세환경에서 T-세포 반응을 조절하는 중요한 역할을 수행하는 세포 표면 시그널링 수용체이다. 종양 세포는 그 발현과 활성을 상향-조절하는 그 이점에 위해 이들 체크포인트를 활용하는 것으로 나타났다. 면역 저항의 작용기전으로 일부 면역 체크포인트 경로를 지휘하는 종양 세포의 능력으로, 면역 세포의 분자에 결합하여 이를 활성화 또는 불활성화시키는 체크포인트 억제제가 면역 반응의 억제를 완화할 수 있다는 가설이 세워졌다. 최근 발견으로 PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, LAG3, CCR4, OX40, OX40L, IDO, 및 A2AR 같은 면역 체크포인트 또는 표적이 면역 회피를 담당하는 단백질로 식별되었다. CTLA-4, PD-1 수용체 또는 그의 리간드 PD-L1에 대한 항체를 포함한 특정 면역 체크포인트 억제제는 임상에서 다양한 암에서의 인상적인 결과를 생성하여, 다수의 종양 적응증에서 YERVOY™(이필리무맙, CTLA-4 길항제), OPDIVO™(니볼루맙; PD-1 길항제) 및 KEYTRUDA™(펨브롤리주맙; PD-1 길항제)에 대한 FDA 승인을 이끌어냈고 더 많은 분야에서 등록 시험이 진행 중이다. 은 합성 생물학을 사용하여 (Pardoll, D., The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy, Nature Reviews: Cancer, Vol. 12, April 2012, 253). 키메라 항원 수용체 T-세포 요법(CAR-T)과 같은 최근의 세포 요법은 합성 생물학을 사용하여 T-세포를 특정 세포 표면 종양 항원으로 재지향하도록 시도한다. T-세포의 유전적 변형은 키메라 항원 수용체(CAR)의 트랜스제닉 발현에 의해 종양 항원 인식을 부여하는 데 사용된다. CAR은 T 세포 내에 도입되어 이를 종양 항원에 표적화할 수 있는 조작된 분자이다(Frey, N.V., Porter, D.L., The Promise of Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy, Oncology (2016); 30(1)) pii 219281). CAR T 세포는 혈액 악성종양 및 보다 낮은 정도 고형 종양에 대해 어느 정도 효능이 있는 것으로 나타났다. 그러나, CAR T 요법은 사이토카인 방출 증후군, 신경학적 독성, 비-종양 인식 및 아나필락시스를 포함한 여러 유형의 독성을 유발하는 것으로 나타났다(Bonifant CL, 등, Toxicity and management in CAR T-cell therapy, Molecular Therapy ― Oncolytics (2016) 3, 16011).

암에 대한 치료적 백신접종은 현재의 표준 요법을 보완하는 중요한 방식이며 암의 장기적인 통제로 이어질 수 있다. 전형적인 예인, GVAX^TM은 종양 세포의 자가 또는 동종 모집단 내의 GM-CSF 유전자 형질도입 종양 백신이다. 유전적으로 변형된 종양 세포의 GM-CSF 분비는 백신 부위에서 사이토카인 방출을 자극하여 항원 제시 세포를 활성화시켜 종양 특이적 세포 면역 반응을 유도하는 것으로 여겨졌다(Eager, R. & Nemunaitis, J., GM-CSF Gene-Transduced Tumor Vaccines, Molecular Therapy, Vol. 12, No. 1, 18 (July 2005)). GM-C SF(GVAX)를 분비하도록 조작된 치명적으로 조사된 종양 세포 백신은 흑색종, 신장 세포, 전립선, 및 비소세포 폐, 췌장, 두경부 편평 세포 암종의 다양한 모델에서 유망한 효능을 보여주었지만, 다수의 면역학적 체크포인트 차단으로 인해, 단일 요법으로서의 GVAX는 진행된 질환에서 임상적으로 효과적일 가능성이 낮다. 전통적인 치료 접근법에 난치성일 수 있는 암과 같은 질환을 치료하기 위한 면역학적 전략을 위한 개선된 조성물 및 방법에 대한 요구가 남아있다.

수지상 세포(DC)-종양 세포 융합은 모 종양 세포로부터 유래된 관련 종양 연관된 항원을 발현하고 또한 이러한 항원을 처리하고 면역계의 적절한 세포에 제시하는 능력을 갖는 하이브리드 세포를 생성하기 위해 개발되었다. DC-종양 세포 융합은 더 다양한 종양 항원을 제공하지만, 아마 필요한 자가 구성요소, DC 세포의 성숙으로 인한 생성물의 이질성 및 항원 장입에서의 변화에 기인하여 인간 시험에서 제한적인 성공을 거두었다(Browning, M., Antigen presenting cell/tumor cell fusion vaccines for cancer, Human Vaccines & Immunotherapeutics 9:7, 1545-1548; July 2013; Butterfield, L., Dendritic Cells in Cancer Immunotherapy Clinical Trials: Are We Making Progress?, Frontiers of Immunology, 2013 4: 454).

백신의 면역원성 잠재력

감염원에 대한 백신은 감염 예방 또는 감소라는 치료 목표를 위한 면역 반응을 형성하는 데 사용되는 특정 수용체-리간드 상호작용의 대표적인 예이다(예를 들어, 독감 백신). 일반적으로, 항원은 보조제(예를 들어, 합성 소분자 면역조절제)와 관련하여 면역계에 제시된다.

기술된 발명의 동종 종양 백신은 몇 가지 주요 특징에서 이러한 백신과 구별된다. 첫째, 이론적으로는 종양 형성 예방도 가능하지만 기존 종양을 치료할 수 있도록 설계되었다. 둘째, 그의 효능은 종양이 개인에게 이질적이고 새로운 신항원(즉, 새로운 비자기 요소)을 발현하지만 의심할 여지 없이 인간 종양 세포이기 때문에 개체에 의해 항상 이질적인(즉, 비-자기) 것으로 인식되지 않는다는 사실에 의해 제한되는 경향이 있다.

앞서 언급한 어려움에도 불구하고, 이제 1) 내인성 항종양 반응이 존재하고, 2) 이러한 면역 반응이 조절될 수 있고, 그리고 3) 이러한 조절이 표준 임상 시험에서 전체 생존 측면에서 측정될 수 있다는 증거가 나타났다.

기재된 발명의 일부 양태에 따르면, 암 환자로부터 유래된 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체, 또는 다중 유전적으로 변형된 동종 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체 상에서 공동-발현될 수 있는 일련의 면역조절제는 종양 백신으로 사용될 때, 1) 내인성 항원 제시 세포에 광범위한 종양 항원을 효율적으로 장입하고, 2) 면역 반응 동안 수신되는 정상 신호를 강화하여 여러 세포 유형을 효율적으로 자극하고, 3) T 조절 세포가 면역 반응을 억제하는 작용기전을 방해하고, 4) 면역 반응이 일반적으로 해결되는 신호를 방해하고, 5) 그러한 제형으로 백신접종된 암 환자의 전반적인 생존율을 향상시키는 역할을 할 수 있음이 확인되었다. 특정 실시양태에서, 변형된 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체가 백신을 받은 환자로부터 유래될 수 있지만, 동종 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체 백신 접근법은 맞춤형 요법 접근법과 구별되는데, 변형된 종양 세포가 최종적으로 백신을 접종받는 개체로부터 반드시 유래되는 것은 아니다. 대신, 동종 종양 세포 백신은 동일한 종양 유형의 개별 종양이 공통적으로 가지고 있는 많은 요소에 대한 면역 반응에 초점을 맞추는 것을 목표로 한다.

각각의 개별 유형의 암에 대해 많은 수의 잠재적 종양 항원을 이용하는 한 가지 전략은 잠재적으로 관련된 항원을 우발적으로 배제하는 것을 피하기 위해 전체 종양 세포로 백신접종하는 것이다. 본 명세서에 기재된 본 발명은 무엇보다도 종양 항원 어레이를 보유하고 3개 이상의 면역 조절자를 발현하도록 변형된 전체 종양 세포를 갖는 백신을 제공한다.

일부 양태에 따르면, 기재된 발명은: (1) 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 살아있는 증식-불능 유전적으로 조작된 종양 세포의 모집단으로서, 상기 모집단이: 적어도 3개의 안정적으로 발현된 면역조절 분자로서, 적어도 3개의 면역조절 분자가 발현된 면역조절 분자에 반응하여 증식한 다음, 종양 세포의 사멸을 위한 효과기 단계로 들어가도록 PBMC의 하나 이상의 하위집합을 유도하기 위한, OX40 리간드(OX40L), CD27 리간드(CD70) 및 CD80, CD86, 또는 둘 다를 포함하는 CD28 리간드(CD28L)를 포함하고; PBMC 세포의 하위집합이 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 포함하는, 모집단; 및 (2) 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 동종 종양 세포 백신을 제공한다.

일부 실시형태에 따르면, 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 살아있는 증식-불능 유전적으로 조작된 종양 세포의 모집단은 R1 - R44로부터 선택된 하나 이상의 추가의 안정적으로 발현된 면역조절 분자를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포는 방사선 조사에 의해 증식-불능화된다. 일부 실시형태에 따르면, T-림프구의 유도는 T 림프구의 하위집합의 활성화, T 림프구의 확장, 또는 둘 다를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, NK 세포의 유도는 NK 세포의 하위집합의 활성화, NK 세포의 하위집합의 확장 또는 둘 다를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, DC의 하위집합의 유도는 DC의 하위집합의 활성화, DC의 하위집합의 확장 또는 둘 다를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, B 림프구의 하위집합의 유도는 B 림프구의 하위집합의 활성화, B 림프구의 하위집합의 확장 또는 둘 다를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, NK 세포의 하위집합은 기억-유사 NK 세포의 하위집합을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, T 림프구의 하위집합은 CD8+ 세포독성 T-림프구(CTL)의 하위집합을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, T 림프구의 하위집합은 기억 T 세포의 하위집합을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, T 림프구의 하위집합은 조절 T 세포의 하위집합을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, T 림프구의 하위집합은 헬퍼 T 세포의 하위집합을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, B 림프구의 하위집합은 기억 B 세포의 하위집합을 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 백신은 (1) 전신 염증 없이 생체 내에서 표적 종양 항원을 포함하는 종양 세포를 인식하고 이에 대항하여 작용하기에 효과적인 세포의 면역 활성화를 강화하거나; (2) 표적 종양 항원을 포함하는 종양 세포에 대한 종양 미세환경에서 면역억제를 감소시키거나; (3) 표적 종양 항원을 발현하는 종양 세포의 세포 사멸을 증가시킨다.

일부 실시형태에 따르면, 종양 세포는: 흑색종, 결장직장 암종, 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 전립선암, 두경부암, 편평세포암종, 설암, 후두암, 편도암, 하인두암, 비인두암, 유방암, 결장암, 폐암, 췌장암, 교모세포종 및 뇌암으로 구성된 군으로부터 선택된 암으로부터 유래된다. 일부 실시형태에 따르면, 흑색종 종양 세포는 gp100, 티로시나제, Melan-A, 티로시나제-연관 단백질(TRP-2-INT2), 흑색종 항원-1(MAGE-A1), NY-ESO-1, 우선적으로 발현되는 흑색종 항원(PRAME) CDK4 및 다발성 골수종 암유전자 1(MUM-1) 중 하나 이상의 발현을 특징으로 한다. 일부 실시형태에 따르면, 결장직장암 종양 세포는 암배아 항원(CEA), MAGE, HPV, 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT), EPCAM, PD-1, PD-L1, p53, 및 세포 표면-연관 뮤신 1(MUC1) 중 하나 이상의 발현을 특징으로 한다.

일부 실시형태에 따르면, 살아있는 증식-저항성 종양 세포의 모집단은 대상체로부터 유래된 생물학적 샘플로부터 유래된다. 일부 실시형태에 따르면, 살아있는 증식 저항성 종양 세포의 모집단은 종양 세포주로부터 유래된다. 일부 실시형태에 따르면, 살아있는 증식-저항성 종양 세포의 모집단은 전신 염증 없이 면역 활성화를 유도하는 데 효과적이다. 일부 실시형태에 따르면, 백신은 위약 대조군에 비해 무진행 생존, 전체 생존, 또는 둘 다를 향상시키는 면역 반응을 유도한다. 일부 실시형태에 따르면, R1 - R44로부터 선택되는 하나 이상의 추가의 안정적으로 발현되는 면역조절 분자는 사이토카인, TNF-패밀리 구성원, 분비된 수용체, 샤페론, IgG 슈퍼패밀리 구성원 및/또는 케모카인 수용체이다. 일부 실시형태에 따르면, 면역자극 분자는 유전적으로 조작된 종양 세포의 외부 표면에 제시된다.

또 다른 양태에 따르면, 기재된 발명은 제1항의 동종 종양 세포 백신을 대상체에게 비경구로 또는 국소로 종양 내로 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공하며, 여기서 동종 종양 세포 백신은 대상체의 암에 유형-매칭된다. 일부 실시형태에 따르면, 암은 흑색종 또는 결장직장암으로부터 선택된다. 일부 실시형태에 따르면, 대상체는 암으로 진행되는 감염성 바이러스 질환을 갖는다. 일부 실시형태에 따르면, 방법은 대상체에게 체크포인트 억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.

또 다른 양태에 따르면, 기재된 발명은: (1) 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 살아있는 증식-불능 유전적으로 조작된 종양 세포의 모집단으로서, 상기 모집단이: 적어도 3개의 안정적으로 발현된 면역조절 분자로서, 적어도 3개의 면역조절 분자가 발현된 면역조절 분자에 반응하여 증식한 다음, 종양 세포의 사멸을 위한 효과기 단계로 들어가도록 하나 이상의 PBMC의 하위집합을 유도하기 위한, OX40 리간드(OX40L), CD27 리간드(CD70) 및 CD80, CD86, 또는 둘 다를 포함하는 CD28 리간드(CD28L)이고; PBMC 세포의 하위집합이 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 포함하는, 모집단; 및 (2) 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 동종 종양 세포 백신을 대상체의 종양 부하를 감소시키는 양으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에 따르면, 유효량은 임상 결과를 향상시킨다. 일부 실시형태에 따르면, 유효량은 위약 대조군에 비해 대상체의 무진행 생존, 전체 생존, 또는 둘 다를 향상시킨다. 일부 실시형태에 따르면, 암은 흑색종 또는 결장직장암이다.

또 다른 양태에 따르면, (1) 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 살아있는 증식-불능 유전적으로 조작된 종양 세포의 모집단으로서, 상기 모집단이: 적어도 3개의 안정적으로 발현된 면역조절 분자로서, 적어도 3개의 면역조절 분자가 발현된 면역조절 분자에 반응하여 증식한 다음, 종양 세포의 사멸을 위한 효과기 단계로 들어가도록 PBMC의 하나 이상의 하위집합을 유도하기 위한, OX40 리간드(OX40L), CD27 리간드(CD70) 및 CD80, CD86, 또는 둘 다를 포함하는 CD28 리간드(CD28L)를 포함하고; PBMC 세포의 하위집합이 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 포함하는, 모집단; 및 (2) 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 동종 종양 세포 백신은: 살아있는 종양 세포의 모집단을 포함하는 동종 모 종양 세포주를 제공하는 단계; OX40 리간드(OX40L)인 안정적으로 발현된 면역조절 분자를 인코딩하는 외인성 핵산을 살아있는 종양 세포의 모집단에 도입하는 단계; CD27 리간드(CD70)인 안정적으로 발현된 면역조절 분자를 인코딩하는 외인성 핵산을 살아있는 종양 세포의 모집단에 도입하는 단계; CD80, CD86, 또는 둘 다를 포함하는 CD28 리간드(CD28L)인 안정적으로 발현된 면역조절 분자를 인코딩하는 외인성 핵산을 살아있는 종양 세포의 모집단에 도입하는 단계로서; OX40 리간드(OX40L), CD27 리간드(CD70) 및 CD80, CD86, 또는 둘 다를 포함하는 CD28 리간드(CD28L)의 안정적인 발현이, PBMC의 하나 이상의 하위집합이 발현된 면역조절 분자에 반응하여 증식한 다음, 종양 세포의 사멸을 위한 효과기 단계로 들어가도록 유도하는, 단계; 면역조절 분자의 외인성 하위집합의 면역원성 양을 안정적으로 발현하는 종양 세포 클론을 선택함으로써 종양 세포주 변이체를 생성하는 단계; 및 혼합 림프구 종양 세포 반응에서 세포 증식, 세포 하위집합 분화, 사이토카인 방출 프로파일 및 종양 세포 용해로부터 선택되는 매개변수 중 하나 이상에 의해 클론 유래 세포주 변이체를 선택하는 단계로서; 선택된 클론 유래 세포주 변이체가 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상의 활성화를 자극하는데 효과적인, 단계를 포함하는 방법에 의해 생산된다.

일부 실시형태에 따르면, 동종 종양 세포 백신을 생산하는 방법은 R1 - R44로부터 선택되는 하나 이상의 안정적으로 발현되는 면역조절 분자를 인코딩하는 외인성 핵산을 살아있는 종양 세포의 모집단에 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포는 방사선 조사에 의해 증식 불능화된다. 일부 실시형태에 따르면, 모 종양 세포주는: 흑색종, 및 결장직장 암종으로 이루어진 군으로부터 선택된 종양으로부터 유래한다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 도입 단계는 바이러스 형질도입을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 도입 단계는 전기천공을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 도입 단계는: 리포솜 매개 전달, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스, 레트로바이러스 기반 벡터, 리포펙션 및 렌티바이러스 벡터 중 하나 이상을 이용하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 도입 단계는 렌티바이러스 벡터의 형질감염에 의해 외인성 핵산을 도입하는 것을 포함한다.

발명의 이들 이점 및 기타 이점은 다음의 상세한 설명을 참조하여 당업자에게 명백할 것이다.

도 1은 면역요법을 받는 환자의 종양 세포주에 고유한 펩티드와 종양 세포에 고유한 펩티드 사이의 이종교세포 교차 반응의 한 실시형태를 도시한다.
도 2는 scFv-항-비오틴-G3힌지-mIgG1 벡터 1의 조직의 개략도를 도시한다.
도 3은 완전한 항-비오틴 - G3힌지-mIgG1 벡터 2의 조직의 개략도를 도시한다.
도 4는 sGM-CSF/ires/mFLT3L 벡터 3의 조직의 개략도를 도시한다.
도 5는 sFLT3L/ires/(FLT3 신호-GM-CSF-Tm) 벡터 4의 조직의 개략도를 도시한다.
도 6은 mCD40L 벡터 5의 조직의 개략도를 도시한다.
도 7은 mTNFa 벡터 6의 조직의 개략도를 도시한다.
도 8은 mRANKL/ires/FLT3 신호-V5-scFV 항-비오틴-Tm 벡터 7의 조직의 개략도를 도시한다.
도 9는 벡터 44의 개략도를 도시한다.
도 10은 벡터 97의 개략도를 도시한다.
도 11은 벡터 84의 개략도를 도시한다.
도 12는 벡터 29의 개략도를 도시한다.
도 13은 벡터 107의 개략도를 도시한다.
도 14는 벡터 116의 개략도를 도시한다.
도 15는 벡터 86의 개략도를 도시한다.
도 16은 벡터 18의 개략도를 도시한다.
도 17은 벡터 17의 개략도를 도시한다.
도 18은 벡터 98의 개략도를 도시한다.
도 19는 벡터 30의 개략도를 도시한다.
도 20은 벡터 109의 개략도를 도시한다.
도 21은 벡터 106의 개략도를 도시한다.
도 22는 벡터 16의 개략도를 도시한다.
도 23은 벡터 83의 개략도를 도시한다.
도 24는 벡터 31의 개략도를 도시한다.
도 25는 벡터 12의 개략도를 도시한다.
도 26은 벡터 99의 개략도를 도시한다.
도 27은 벡터 121의 개략도를 도시한다.
도 28은 벡터 105의 개략도를 도시한다.
도 29는 벡터 32의 개략도를 도시한다.
도 30은 벡터 37의 개략도를 도시한다.
도 31은 벡터 22의 개략도를 도시한다.
도 32는 벡터 19의 개략도를 도시한다.
도 33은 벡터 20의 개략도를 도시한다.
도 34는 벡터 89의 개략도를 도시한다.
도 35는 벡터 21의 개략도를 도시한다.
도 36은 벡터 23의 개략도를 도시한다.
도 37은 벡터 108의 개략도를 도시한다.
도 38은 벡터 15의 개략도를 도시한다.
도 39는 벡터 124의 개략도를 도시한다.
도 40은 벡터 65의 개략도를 도시한다.
도 41은 벡터 64의 개략도를 도시한다.
도 42는 벡터 88의 개략도를 도시한다.
도 43은 벡터 96의 개략도를 도시한다.
도 44는 벡터 14의 개략도를 도시한다.
도 45는 벡터 119의 개략도를 도시한다.
도 46은 벡터 120의 개략도를 도시한다.
도 47은 벡터 45의 개략도를 도시한다.
도 48은 벡터 60의 개략도를 도시한다.
도 49는 벡터 59의 개략도를 도시한다.
도 50은 벡터 8의 개략도를 도시한다.
도 51은 벡터 128의 개략도를 도시한다.
도 52는 벡터 35의 개략도를 도시한다.
도 53은 일반적인 실험 형식을 보여주는 개략도이다.
도 54는 유세포분석 실험의 결과를 나타내는 그래프 패널이다. 그립 및 과립도에 대한 정방향(FSC) 및 측면 산란(SSC) 플롯. SK 세포주는 숫자 코드로 나타낸다; SK, 변형되지 않은 모 세포주; 3, 분비된 GM-CSF 및 막 발현된 FLT-3L; 4, 분비된 FLT3L 및 막 발현된 GM-CSF; 5, 절단-불가능 형태의 CD40L; 6, 절단-불가능 형태의 TNF-a를 나타내며; 3-4는 3 및 4의 조합이고; 3-4-5는 3,4 및 5의 조합이고; 그리고 3-4-6은 3,4 및 6의 조합이다. 세포주 6, 3-4-5 및 3-4-6은 상피 기원의 세포 상에서 TNF-a 및 CD40L에 대한 수용체의 존재로 인해, 더 크고 더 세분화된 표현형을 나타낸다.
도 55는 지시된 면역조절제를 갖는 지시된 조작된 세포주에 대한 반응으로 hPBMC에서 CD4 세포에 대한 대표적인 유세포분석 염색을 나타내는 그래프 패널이다. SK 세포주는 숫자 코드로 나타낸다; SK, 변형되지 않은 모 세포주; 2, 막 발현된 IgG1, 3, 분비된 GM-CSF 및 막 발현된 FLT-3L; 4, 분비된 FLT3L 및 막 발현된 GM-CSF; 5, 절단 불가능한 형태의 CD40L; 및 6, 절단 불가능한 형태의 TNF.
도 56은 지시된 조작된 표면 마커에 대한 대표적인 유세포분석 염색을 나타내는 그래프 패널이다; GM-CSF, FLT3L, TNF-a 및 CD40L. SK 세포주는 숫자 코드로 나타낸다; SK, 변형되지 않은 모 세포주; 3, 분비된 GM-CSF 및 막 발현된 FLT-3L; 4, 분비된 FLT3L 및 막 발현된 GM-CSF; 5, 절단 불가능한 형태의 CD40L; 6, 절단 불가능한 형태의 TNF-a; 3-4는 3 및 4의 조합이고; 3-4-5는 3,4 및 5의 조합이고; 그리고 3-4-6은 3,4 및 6의 조합이다.
도 57a 및 도 57b는 면역조절 인자의 발현에 의해 변형된 SK 흑색종 세포에 대한 hPBMC 반응의 CyTOF 질량세포분석 단일 세포 표현형 분석의 결과를 나타낸다. 도 57a는 면역 세포 하위집합 풍부도 및 표현형에서의 상대적인 변화를 나타내는 CyTOF 염색 데이터의 viSNE 밀도 등고선 플롯을 나타낸다. 도 57b는 단일 세포 표현형 분석을 나타낸다. SK 세포주는 숫자 코드로 표시된다; SK, 변형되지 않은 모 세포주; 3, 분비된 GM-CSF 및 막 발현된 FLT-3L; 4, 분비된 FLT3L 및 막 발현된 GM-CSF; 5, 절단 불가능한 형태의 CD40L; 6, 절단 불가능한 형태의 TNF-a; 3-4는 3 및 4의 조합이고; 3-4-5는 3,4 및 5의 조합이고; 그리고 3-4-6은 3,4 및 6의 조합이다.
도 58a 내지 도 58d는 1:5 세포 비율의 지시된, 유전적으로 변형된 SK 세포주로 1일 자극 후 활성화 마커 CD40 (도 58a), CD86 (도 58b), CD69 (도 58c) 및 CD25 (도 58d) 발현의 변화를 나타내는 hPBMC의 CyTOF 단핵구 클러스터 분석을 나타낸다. SK 세포주는 숫자 코드로 표시된다; SK, 변형되지 않은 모 세포주; 3, 분비된 GM-CSF 및 막 발현된 FLT-3L; 4, 분비된 FLT3L 및 막 발현된 GM-CSF; 5, 절단 불가능한 형태의 CD40L; 6, 절단 불가능한 형태의 TNF-a; 3-4는 3 및 4의 조합이고; 3-4-5는 3,4 및 5의 조합이고; 그리고 3-4-6은 3,4 및 6의 조합이다. 도 58e는 단핵구 마커 CD40 및 CD86의 상대 중간 발현 수준을 나타내는 hPBMC의 CyTOF 단핵구 클러스터 분석을 나타낸다. 도 58f는 CD4 T 세포 마커 CD69 및 CD25의 상대 중간 발현 지수(MEI)를 나타내는 hPBMC의 CyTOF 단핵구 클러스터 분석을 나타낸다.
도 59는 SK 모 세포주 및 유전적으로 변형된 SK 세포주에 대한 인간 PBMC 반응의 luminex 다중 사이토카인 프로파일링의 결과를 나타내는 그래프이다. 대조군 배양물은 SK 세포 단독, hPBMC 단독, 및 항-CD3 및 항-CD28 항체의 혼합물(1 μg/ml 최종 농도)로 자극된 hPBMC를 포함하였다. 기호는 재조합 사이토카인을 사용하여 표준 곡선에서 추정된 pg/ml 단위의 사이토카인 수준을 나타낸다. 기호가 없으면 사이토카인이 검출되지 않았음을 나타낸다. SK 세포주는 숫자 코드로 표시된다; SK, 변형되지 않은 모 세포주; 3, 분비된 GM-CSF 및 막 발현된 FLT-3L; 4, 분비된 FLT3L 및 막 발현된 GM-CSF; 5, 절단 불가능한 형태의 CD40L; 6, 절단 불가능한 형태의 TNF-a; 3-4는 3 및 4의 조합이고; 3-4-5는 3,4 및 5의 조합이고; 그리고 3-4-6은 3,4 및 6의 조합이다.
도 60은 면역조절 분자를 발현하는 유전적으로 변형된 SK 세포주에 의해 CD8+ T 세포가 활성화될 수 있음을 입증하는 유세포분석 실험의 결과를 나타낸다. 혼합된 림프구 종양 반응 분석에서 모 세포주 SKMEL2(도 60(i) 및 SK-MEL-2 종양 세포를 발현하는 유전적으로 변형된 14-18-30(도 60(ii)을 PBMC와 인큐베이션한 후 크기 및 과립도에 대한 유세포분석 정방향(FSC) 및 측면 산란(SSC) 플롯이 나타나 있다. 도 60(i) 및 60(ii)의 점선 원은 림프구 게이트를 나타낸다. 도 60(iii) 및 도 60(iv)는 혼합된 림프구 종양 반응 분석에서의 PBMC를 모 세포주(도 60(iii)) 및 SKMEL2 종양 세포를 발현하는 유전적으로 조작된 14-18-30(도 60(iv))과 인큐베이션한 후 CD8 모집단을 나타낸다. 그래프 하단 패널의 점선 원은 CD8 게이트를 나타낸다. 도 61a 및 도 61b는 모 SKMEL2 세포주(도 61a) 및, 표 2에 나타낸 면역조절제의 조합을 발현하여 종양 세포 사멸을 초래하는, 유전적으로 변형된 14-18-30 세포주(도 61b)의 9일 배양을 비교하는 hPBMC로부터의 시험관내 CD8+ T 세포 확장을 나타낸다.
도 62는 유전적으로 변형된 SK 세포주 (i) APX/15; (ii) APX/19; (iii) APX/22; (iv) APX/23; (v) APX/29에서 수지상 세포(DC), 자연 사멸(NK) 세포 및 B 세포 하위집합의 자극을 입증하는 유세포분석의 결과를 나타낸다.
도 63은 면역조절 분자를 발현하는 유전적으로 변형된 SK 세포주 ((i) 모; (ii) APX/3; (iii) APX/3-4; (iv) APX/3-4-5; (v) APX/3-4-6))에 의한 자극 후 PBMC의 여러 하위집합의 분화를 입증하는 CyTOF 데이터를 나타낸다. SK 세포주는 숫자 코드로 나타낸다; 3, 분비된 GM-CSF 및 막 발현된 FLT-3L; 4, 분비된 FLT3L 및 막 발현된 GM-CSF; 5, 절단 불가능한 형태의 CD40L; 6, 절단 불가능한 형태의 TNF-a.
도 64는 면역조절 분자를 발현하는 유전적으로 변형된 SK 세포주 ((i) 모; (ii) APX/3; (iii) APX/3-4; (iv) APX/3-4-5; (v) APX/3-4-6))에 의한 자극 후 DC 활성화를 나타내는 상세한 CyTOF 데이터를 나타낸다. SK 세포주는 숫자 코드로 나타낸다; 3, 분비된 GM-CSF 및 막 발현된 FLT-3L; 4, 분비된 FLT3L 및 막 발현된 GM-CSF; 5, 절단 불가능한 형태의 CD40L; 6, 절단 불가능한 형태의 TNF-a.
도 65는 SK-모 세포주(왼쪽 패널) 대 표 2에 나타낸 면역조절제의 조합을 발현하는 SK-MEL-2 종양 세포주를 발현하는 유전적으로 변형된 14-18-30(오른쪽 패널)을 사용한 CD8 확장 분석에서 6일 및 8일 시점을 비교하는 유세포분석의 결과를 나타낸다.
도 66은 NGS 마우스를 사용한 이종이식 치료 연구의 평균 및 표준 편차를 나타내는 플롯이다. 각 상자의 말단은 상위 및 하위 사분위수이고; 중앙값은 상자 내부의 수직선으로 표시되고, 휘스커는 최고 및 최저 관측치까지 확장되는 상자 외부의 두 선이다. 인간 종양 세포를 NGS(NOD scid 감마) 마우스의 옆구리에 이식했다. 종양이 150 ㎣으로 성장하도록 허용했다. 마우스를 군당 6마리의 마우스로, 대조군과 처리군인 두 군으로 무작위로 나누었다. 30일차(t=0)에 대조군의 마우스에는 비히클만 접종하고 처리군의 마우스에는 ENLIST™ 세포("SUPLEXA™ 세포")를 발현하는 14-18-30에 의해 활성화된 3 x 10⁶ PBMC를 접종했다. 종양 크기는 접종 후 36일에 걸쳐 간격을 두고 측정했다. 두 군 간의 분기는 5일 이내에 나타났다. 22일 후, 분기는 통계적으로 유의하게 되었다(^*P<0.05; ^** P<005).

정의

용어 "활성화" 또는 "림프구 활성화"는 RNA, 단백질 및 DNA의 합성 및 림포카인 생성을 초래하여; 그 다음에 다양한 효과기 및 기억 세포의 증식 및 분화가 뒤따르는, 특정 항원, 비특이적 유사분열원, 또는 동종 세포에 의한 림프구의 자극을 지칭한다. 예를 들어, 성숙한 B 세포는 그 세포 표면 면역글로불린 Ig에 의해 인식되는 에피토프를 발현하는 항원과의 조우에 의해 활성화될 수 있다). 활성화 과정은 항원에 의한 막 Ig 분자의 교차-연결에 의존하는 직접적인 과정(교차-연결-의존성 B 세포 활성화)이거나 헬퍼 T 세포와의 친밀한 상호작용의 맥락에서 가장 효율적으로 일어나는 간접적인 과정("동족 도움 과정")일 수 있다. T-세포 활성화는 클래스 I 또는 클래스 II MHC 분자의 홈에 결합된 펩티드인 그 동족 리간드와 TCR/CD3 복합체의 상호작용에 의존한다. 수용체 계합에 의한 동작으로 설정된 분자적 이벤트는 복잡하다. 초기 단계 중에는 여러 시그널링 경로를 제어하는 기질 세트의 티로신 인산화를 유도하는 티로신 키나제의 활성화가 있는 것으로 보인다. 여기에는 TCR을 ras 경로에 연결하는 어댑터 단백질의 세트, 포스포리파제 Cγ1, 그 촉매 활성을 증가시키고 이노시톨 인지질 대사 경로에 관여하여, 세포내 유리 칼슘 농도의 상승과 단백질 키나제 C의 활성화를 유도하는 티로신 인산화, 및 세포 성장과 분화를 조절하는 일련의 다른 효소가 포함된다. T 세포의 완전한 반응성은 수용체 계합에 부가하여 보조 세포-전달된 공동자극 활성, 예를 들어, 항원 제시 세포(APC) 상의 CD80 및/또는 CD86에 의한 T 세포 상의 CD28의 계합을 필요로 한다. 활성화된 B 림프구의 가용성 생성물은 면역글로불린(항체)이다. 활성화된 T 림프구의 가용성 생성물은 림포카인이다.

B 세포 활성화. 성숙한 B 세포는 그 세포 표면 면역글로불린 Ig)에 의해 인식되는 에피토프를 발현하는 항원과의 조우에 의해 활성화될 수 있다. 활성화 과정은 항원에 의한 막 Ig 분자의 교차-연결에 의존하는 직접적인 과정(교차-연결-의존성 B 세포 활성화)이거나 헬퍼 T 세포와의 친밀한 상호작용의 맥락에서 가장 효율적으로 일어나는 간접적인 과정("동족 도움 과정")일 수 있다. 활성화된 B 림프구의 가용성 생성물은 면역글로불린(항체)이다.

T-세포 활성화는 클래스 I 또는 클래스 II MHC 분자의 홈에 결합된 펩티드인 그 동족 리간드와 TCR/CD3 복합체의 상호작용에 의존한다. 수용체 계합에 의한 동작으로 설정된 분자적 이벤트는 복잡하다. 초기 단계 중에는 여러 시그널링 경로를 제어하는 기질 세트의 티로신 인산화를 유도하는 티로신 키나제의 활성화가 있는 것으로 보인다. 여기에는 TCR을 ras 경로에 연결하는 어댑터 단백질의 세트, 포스포리파제 Cγ1, 그 촉매 활성을 증가시키고 이노시톨 인지질 대사 경로에 관여하여, 세포내 유리 칼슘 농도의 상승과 단백질 키나제 C의 활성화를 유도하는 티로신 인산화, 및 세포 성장과 분화를 조절하는 일련의 다른 효소가 포함된다. T 세포의 완전한 반응성은 수용체 계합에 부가하여 보조 세포-전달된 공동자극 활성, 예를 들어, 항원 제시 세포(APC) 상의 CD80 및/또는 CD86에 의한 T 세포 상의 CD28의 계합을 필요로 한다. 활성화된 T 림프구의 가용성 생성물은 림포카인이다.

수지상 세포 활성화. 병원체 침입은 면역 및 비면역 세포 모두에서 발현되는 패턴 인식 수용체(PRR)에 의한 병원체-유래 분자의 인식을 통해 개시되는 신속한 염증 반응을 유도한다. Joffre, O., 등, Immunol. Rev. (2009) 277(1): 234-47. GET 전염증성 사이토카인 및 케모카인의 초기 파동은 병원체 확산을 제한하고 면역 세포를 모집하고 활성화하여 침입자를 박멸한다. 수지상 세포(DC)는 병원체-특이적 T 및 B 세포의 작용에 의해 지배되는, 면역의 후속 단계를 시작하는 역할을 한다. 초기 전염증성 반응의 경우, DC 활성화는 PRR 시그널에 의해 촉발되며, 이는 휴지 DC를 나이브 병원체-특이적 T 세포의 확장 및 효과기 분화를 촉진할 수 있는 강력한 항원-제시 세포로 전환시킨다. DC는 염증성 사이토카인에 의해 간접적으로 활성화될 수 있지만, 이들 세포는 기능적 T-세포 반응을 유도할 수 없으며, 내성 유도 기능을 할 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "CD8+ T 세포 활성화" 또는 "CD8+ T 세포 활성화"는 증식, 분화, 사이토카인 분비, 세포독성 효과기 분자 방출, 세포독성 활성 및 활성화 마커의 발현으로부터 선택되는, CD8+ T 세포(CTL)의 하나 이상의 세포 반응을 야기하거나 초래하는 과정(예를 들어, 시그널 이벤트)을 지칭한다. 본 명세서에 사용된 "활성화된 CD8+ T 세포"는 활성화 시그널을 수신하여, 증식, 분화, 사이토카인 분비, 세포독성 효과기 분자 방출, 세포독성 활성 및 활성화 마커의 발현으로부터 선택되는 하나 이상의 세포 반응을 나타내는 CD8+ T 세포를 지칭한다. CD8+ T 세포 활성화를 측정하기 위한 적합한 검정법은 당업계에 공지되어 있고, 본원에 기재되어 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "CD8+ T 세포를 확장하는 것" 또는 "CD8+ T 세포 확장"은 CD8+ T 세포의 모집단이 일련의 세포 분열을 겪어 세포 수가 증가하는 과정을 지칭한다. 용어 "확장된 CD8+ T 세포"는 CD8+ T 세포 확장을 통해 얻은 CD8+ T 세포에 관한 것이다. T 세포 확장을 측정하기 위한 적합한 검정법은 당업계에 공지되어 있고, 본원에 기재되어 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "NK 세포를 활성화하는 것" 또는 "NK 세포 활성화"는 MHC 클래스 I 발현이 결핍된 세포를 사멸시킬 수 있는 NK 세포를 야기하거나 초래하는 과정(예를 들어, 시그널링 이벤트)을 지칭한다. 본 명세서에 사용된 "활성화된 NK 세포"는 활성화 시그널을 수신하여, MHC 클래스 I 발현이 결핍된 세포를 사멸시킬 수 있는 NK 세포를 지칭한다. NK 세포 활성화를 측정하기 위한 적합한 검정법은 당업계에 공지되어 있고, 본원에 기재되어 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "NK 세포를 확장하는 것" 또는 "NK 세포 확장"은 NK 세포의 모집단이 일련의 세포 분열을 겪어 세포 수가 증가하는 과정을 지칭한다. 용어 "확장된 NK 세포"는 NK 세포 확장을 통해 얻은 NK 세포에 관한 것이다. NK 세포 확장을 측정하기 위한 적합한 검정법은 당업계에 공지되어 있고, 본원에 기재되어 있다.

포유동물, 세포, 조직, 기관 또는 생물학적 유체에 적용될 때, 본 명세서에 사용된 용어 "투여" 및 그의 다양한 문법적 형태는 제한 없이, 대상체, 세포, 조직, 기관 또는 생물학적 유체 등에 외인성 리간드, 시약, 위약, 소분자, 약제, 치료제, 진단제, 또는 조성물의 접촉을 지칭한다. "투여"는, 예를 들어 치료, 약동학, 진단, 연구, 위약, 및 실험적 방법을 지칭할 수 있다. "투여"는 또한 시약, 진단, 결합 조성물에 의한, 또는 다른 세포에 의한 세포의, 예를 들어 시험관내 및 생체외 처리를 포괄한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "동종"는 공여자와 수용자(숙주)가 유전적 구성은 다르지만 동일한 종임을 의미한다. 본 명세서에 사용된, "동종 세포"는 세포가 투여될 개체를 의미하는 수용자로부터 유래되지 않은 세포, 즉 수용자 개체와 상이한 유전적 구성을 갖는 세포를 지칭한다. 동종 세포는 일반적으로 세포가 투여되는 개체와 동일한 종에서 획득된다. 예를 들어, 동종 세포는 암 환자와 같은 인간 환자에게 투여하기 위한, 본 명세서에 개시된 바와 같은 인간 세포일 수 있다. 본 명세서에 사용된 "동종 종양 세포"는 동종 세포가 투여되는 개체를 의미하는 수용자로부터 유래되지 않는 종양 세포를 지칭한다. 일반적으로, 동종 종양 세포는 세포가 투여될 개체에서 종양에 대한 면역 반응을 자극할 수 있는 하나 이상의 종양 항원을 발현한다. 본 명세서에 사용된 "동종 암 세포", 예를 들어 폐암 세포는 동종 세포가 투여될 수용자 개체로부터 유래되지 않은 암 세포를 지칭한다.

용어 "아미노산 잔기" 또는 "아미노산" 또는 "잔기"는 자연적으로 발생하는 아미노산 및 자연적으로 발생하는 아미노산과 유사한 방식으로 기능할 수 있는 자연 아미노산의 알려진 유사체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드에 혼입되는 아미노산을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 아미노산은 L- 또는 D-아미노산일 수 있다. 아미노산은 펩티드의 반감기를 증가시키거나, 펩티드의 효능을 증가시키거나, 펩티드의 생체이용률을 증가시키도록 변경되는 합성 아미노산에 의해 대체될 수 있다. 아미노산에 대한 단일 문자 기호가 본 명세서에서 주로 사용된다. 이러한 단일 문자 기호는 다음과 같다: A는 알라닌이고; C는 시스테인이고; D는 아스파르트산이고; E는 글루탐산이고; F는 페닐알라닌이고; G는 글리신이고; H는 히스티딘이고; I는 이소류신이고; K는 라이신이고; L은 류신이고; M은 메티오닌이고; N은 아스파라긴이고; P는 프롤린이고; Q는 글루타민이고; R은 아르기닌이고; S는 세린이고; T는 트레오닌이고; V는 발린이고; W는 트립토판이고; 그리고 Y는 티로신이다. 다음은 서로에 대한 보존적 치환인 아미노산의 군을 제시한다: 1) 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T); 2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E); 3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q); 4) 아르기닌(R), 라이신(K); 5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 및 6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W).

용어 "세포자멸사" 또는 "프로그램화된 세포사"는 유기체를 손상시키지 않으면서 기포형성, 세포막의 변화, 예컨대 막 비대칭 및 부착 손실, 세포 수축, 핵 단편화, 염색질 응축 및 염색체 DNA 단편화를 포함하는 다양한 형태학적 변화를 초래하는 일련의 생화학적 이벤트로 구성된 생물학적 항상성에 기여하는 고도로 조절되고 활동적인 과정을 지칭한다.

아폽토시스성 세포 사멸은 많은 상이한 인자에 의해 유도되며, 일부가 카스파제 프로테아제(시스테인 프로테아제의 한 부류)에 의존하고 다른 것이 카스파제 독립적인, 수많은 시그널링 경로를 수반한다. 이는 세포 표면 수용체, 스트레스에 대한 미토콘드리아 반응, 세포독성 T 세포를 포함한 다양한 세포 자극에 의해 촉발될 수 있으며, 그 결과 세포자멸사 시그널링 경로가 활성화된다.

세포자멸사에 관여하는 카스파제는 단백질분해 캐스케이드에서 세포자멸사 시그널을 전달하며, 카스파제는 세포 사멸을 유도하는 다른 세포 표적을 분해하는 다른 카스파제를 절단하고, 활성화한다. 캐스케이드 상단에 있는 카스파제는 카스파제-8 및 카스파제-9를 포함한다. 카스파제-8은 Fas와 같은 사멸 도메인(DD)을 갖는 수용체에 대한 반응에 관여하는 초기 카스파제이다.

TNF 수용체 계열의 수용체는 염증 시그널링 뿐만 아니라 세포자멸사의 유도와 연관되어 있다. Fas 수용체(CD95)는 다른 세포의 표면에서 발현되는 Fas-리간드에 의한 세포자멸사 시그널링을 매개한다. Fas-FasL 상호작용은 면역계에서 중요한 역할을 하며, 이 시스템의 부족은 자가면역으로 이어지며, Fas-매개 세포자멸사가 자기-반응성 림프구를 제거함을 나타낸다. Fas 시그널링은 또한 형질전환된 세포 및 바이러스 감염 세포를 제거하기 위한 면역 감시에 관여한다. Fas가 또 다른 세포 상의 올리고머화 FasL에 결합하면, FAF, FADD 및 DAX를 포함하는 시그널링 어댑터와 상호작용하여 카스파제 단백질분해 캐스케이드를 활성화하는, 사멸 도메인(DD)이라고 하는 세포질 도메인을 통해 세포자멸사 시그널링을 활성화한다. 카스파제-8 및 카스파제-10은 먼저 활성화된 다음, 다운스트림 카스파제 및 다양한 세포 기질을 절단하고 활성화하여 세포 사멸을 유도한다.

미토콘드리아는 미토콘드리아 단백질을 세포질로 방출하여 세포자멸사 시그널링 경로에 참여한다. 전자 수송의 핵심 단백질인 사이토크롬 c는 세포자멸사 시그널에 반응하여 미토콘드리아에서 방출되고, 미토콘드리아에서 방출된 프로테아제인 Apaf-1을 활성화한다. 활성화된 Apaf-1은 카스파제-9 및 카스파제 경로의 나머지를 활성화한다. Smac/DIABLO은 미토콘드리아에서 방출되며 일반적으로 카스파제-9와 상호 작용하여 세포자멸사를 억제하는 IAP 단백질을 억제한다. Bcl-2 계열 단백질에 의한 세포자멸사 조절은 패밀리 구성원이 미토콘드리아 막으로 들어가는 복합체를 형성하여, 사이토크롬 c 및 기타 단백질의 방출을 조절함에 따라 발생한다. 세포자멸사를 유발하는 TNF 계열 수용체는 카스파제 캐스케이드를 직접 활성화하지만, Bcl-2 패밀리 구성원인 Bid를 활성화할 수 있어서 미토콘드리아-매개 세포자멸사를 활성화한다. 또다른 Bcl-2 패밀리 구성원인 Bax는 이 경로에 의해 활성화되어 미토콘드리아 막에 국한되고 투과성을 증가시켜, 사이토크롬 c 및 기타 미토콘드리아 단백질을 방출한다. Bcl-2 및 Bcl-xL은 공극 형성을 방지하여, 세포자멸사를 차단한다. 사이토크롬 c와 마찬가지로, AIF(세포자멸사-포함 인자)는 세포자멸사 자극에 의해 미토콘드리아에서 방출되는, 미토콘드리아에서 발견된 단백질이다. 사이토크롬 C가 카스파제-의존적 세포자멸사 시그널링과 연관되어 있는 반면, AIF 방출은 카스파제-독립적 세포자멸사를 자극하여, DNA와 결합하는 핵으로 이동한다. AIF에 의한 DNA 결합은 아마도 뉴클레아제 동원을 통해 염색질 응축 및 DNA 단편화를 자극한다.

미토콘드리아 스트레스 경로는 미토콘드리아로부터 사이토크롬 c의 방출로 시작되며, 이는 이후 Apaf-1과 상호작용하여, 자가-절단 및 카스파제-9의 활성화를 유발한다. 카스파제-3, -6 및 -7은 업스트림 프로테아제에 의해 활성화되고 스스로 세포 표적을 절단하도록 작용하는 다운스트림 카스파제이다.

세포독성 T 세포에 의해 방출된 그랜자임 B 및 퍼포린 단백질은 표적 세포에서 세포자멸사를 유도하고, 막횡단 공극을 형성하고, 아마도 카스파제의 절단을 통해 세포자멸사를 촉발하지만, 그랜자임 B 매개 세포자멸사의 카스파제-독립적 작용기전이 제안된 바 있다.

뉴클레오솜 래더를 생성하기 위해 세포자멸사 시그널링 경로에 의해 활성화된 다중 뉴클레아제에 의한 핵 게놈의 단편화는 세포자멸사의 세포 반응 특징이다. 세포자멸사에 관여하는 한 가지 뉴클레아제는 카스파제-활성화 DNAse(CAD)인, DNA 단편화 인자(DFF)이다. DFF/CAD는 세포자멸사 동안 카스파제 프로테아제에 의한 그의 관련 억제제 ICAD의 절단을 통해 활성화된다. DFF/CAD는 토포이소머라제 II 및 히스톤 H1과 같은 염색질 구성요소와 상호작용하여 염색질 구조를 응축하고 아마도 CAD를 염색질에 동원한다. 또 다른 세포자멸사 활성화 프로테아제는 엔도뉴클레아제 G(EndoG)이다. EndoG는 핵 게놈에서 인코딩되지만 정상 세포의 미토콘드리아에 국한된다. EndoG는 세포자멸사에 뿐만 아니라 미토콘드리아 게놈의 복제에서도 역할을 할 수 있다. 세포자멸사 시그널링은 미토콘드리아로부터 EndoG의 방출을 유발한다. EndoG 및 DFF/CAD 경로는 EndoG 경로가 DFF가 없는 세포에서 여전히 발생하기 때문에 독립적이다.

저산소증 뿐만 아니라 재산소화에 이은 저산소증은 사이토크롬 c 방출 및 세포자멸사를 유발할 수 있다. 대부분의 세포 유형에서 편재적으로 발현되는 세린-트레오닌 키나제인 글리코겐 합성효소 키나제(GSK-3)는 미토콘드리아 세포 사멸 경로를 활성화시키는 많은 자극으로 인해 세포자멸사를 매개하거나 강화하는 것으로 보인다. Loberg, RD, 등, J. Biol. Chem. 277 (44): 41667-673 (2002). 그것은 카스파제 3 활성화를 유도하고 전-세포자멸사 종양 억제 유전자 p53을 활성화시키는 것으로 입증되었다. 또한 GSK-3은 응집 및 미토콘드리아 국소화 시 사이토크롬 c 방출을 유도하는 전-세포자멸사 Bcl-2 패밀리 구성원인, Bax의 활성화와 전위를 촉진한다고 제안되었다. Akt는 GSK-3의 중요한 조절자이며, GSK-3의 인산화 및 불활성화는 Akt의 일부 항-세포자멸사의 효과를 매개할 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "자가"는 동일한 개체로부터 유래됨을 의미한다.

본 명세서에 사용된 용어 "암"은 비정상 세포가 통제 없이 분열하고 다른 조직을 침범할 수 있는 질환을 의미한다. 암의 종류는 100가지가 넘게 있다. 대부분의 암은 암이 시작되는 기관이나 세포 유형에 따라 이름이 지정된다 - 예를 들어, 결장에서 시작되는 암은 결장암이라고 하고; 피부의 멜라닌 세포에서 시작되는 암을 흑색종이라고 한다. 암 유형은 더 넓은 범주로 그룹화할 수 있다. 암의 주요 범주는: 암종(피부 또는 내부 장기를 감싸거나 덮는 조직에서 시작되는 암, 및 선암종, 기저 세포 암종, 편평 세포 암종 및 이행 세포 암종을 포함하는 그의 하위유형을 의미함); 육종(뼈, 연골, 지방, 근육, 혈관 또는 기타 결합 또는 지지 조직에서 시작되는 암을 의미함); 백혈병(혈액-형성 조직(예를 들어, 골수)에서 시작하여, 많은 수의 비정상 혈액 세포가 생성되어 혈액으로 들어가는 암을 의미); 림프종 및 골수종(면역계의 세포에서 시작되는 암을 의미); 및 중추 신경계 암(뇌 및 척수 조직에서 시작되는 암을 의미)을 포함한다. 용어 "골수이형성 증후군"은 골수가 건강한 혈액 세포(백혈구, 적혈구 및 혈소판)을 충분히 만들지 못하고, 혈액 및/또는 골수에 비정상적인 세포가 존재하는 암의 유형을 지칭한다. 골수이형성 증후군은 급성 골수성 백혈병(AML)이 될 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "세포주"는 단일 세포로부터 발달되고 따라서 무한정으로 증식할 균일한 유전적 구성을 갖는 세포로 구성되는 영구적으로 확립된 세포 배양물을 의미한다.

본 명세서에 사용된 용어 "화학요법"은 암 세포의 성장을 정지시키기 위해 약물을 사용하는 치료를 지칭한다.

본 명세서에 사용된 용어 "접촉" 및 그의 다양한 문법적 형태는 닿거나 즉각적 또는 국소적으로 근접한 상태 또는 조건을 지칭한다. 조성물을 표적 목적지에 접촉시키는 것은 당업자에게 공지된 임의의 투여 수단에 의해 일어날 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "공동자극 분자"는 T 세포를 활성화하여 효과기 세포가 되는 역할을 하는 세포 표면 상에 표시되는 2개 이상의 분자 중 하나를 지칭한다. 예를 들어, T 세포 수용체에 외래 항원을 제시하는 MHC 단백질은 또한, T 세포의 표면 상에 상보적 수용체에 결합하여 T 세포의 활성화를 초래하는 공동자극 단백질을 필요로 한다.

본 명세서에 사용된 용어 "사이토카인"은 다른 세포에 대해 다양한 영향을 미치는, 세포에 의해 분비되는 용해성이 작은 단백질 물질을 지칭한다. 사이토카인은 성장, 발달, 상처 치유 및 면역 반응을 포함한 많은 중요한 생리적 기능을 매개한다. 그것은 세포막에 위치한 그의 세포-특이적 수용체에 결합함에 의해 작용하여, 뚜렷한 신호 변환 캐스케이드가 세포에서 시작되도록 하여 결국 표적 세포에서 생화학적 및 표현형 변화를 초래할 것이다. 사이토카인은 방출 부위로부터 국소적으로 및 이격적으로 양자로 작용할 수 있다. 그것은 많은 인터루킨을 포괄하는 유형 I 사이토카인뿐만 아니라 여러 조혈 성장 인자; 인터페론 및 인터루킨-10을 포함하는 유형 II 사이토카인; TNFα 및 림프독소를 포함하는 종양 괴사 인자("TNF")-관련된 분자; 인터루킨 1("IL-1")을 포함하는 면역글로불린 슈퍼-패밀리 구성원; 및 다양한 면역 및 염증 기능에서 중요한 역할을 하는 분자의 패밀리인 케모카인을 포함한다. 동일한 사이토카인은 세포의 상태에 의존하여 세포에 미치는 영향이 다를 수 있다. 사이토카인은 종종 다른 사이토카인의 발현을 조절하고 케스케이드를 촉발한다. 사이토카인의 비제한적 예는 예를 들어, 과립구-대식세포 집락-자극 인자(GM-CSF), 립구 집락-자극 인자(G-CSF), Fms-관련 티로신 키나제 3 리간드(FLT3LG), 인터루킨-1(IL-1), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12/IL-23 P40, IL13, IL-15, IL-15/IL15-RA, IL-17, IL-18, IL-21, IL-23, TGF-β, MCP-1, TNF-α 및 인터페론 알파(IFNα), IFNγ를 포함한다.

용어 "세포독성 T 림프구"(CTL)는 효과기 CD8+ T 세포를 지칭한다. 세포독성 T 세포는 표적이 세포자멸사를 겪도록 유도하여 사멸시킨다. 그들은 외인성 및 내인성 경로를 통해 표적 세포가 프로그램된 세포 사멸을 겪도록 유도한다.

본 명세서에 사용된 용어 "수지상 세포" 또는 "DC"는 T 세포에 외래 항원을 제시하는 다양한 림프 및 비림프 조직에서 발견되는 형태학적으로 유사한 세포 유형의 다양한 모집단을 기술하며, Steinman, Ann. Rev. Immunol. 9:271-296 (1991)을 참조한다.

본 명세서에 사용된 용어 "로부터 유래된"은 출처로부터 무언가를 수령, 획득 또는 변형하기 위한 임의의 방법을 포괄한다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 펩티드 또는 DNA 서열(예를 들어, 면역 조절제 펩티드 서열)과 관련된 용어 "유도체" 또는 "변이체"는 그의 원래 서열로부터 변형된 비-동일성 펩티드 또는 DNA 서열을 지칭한다. 서열의 차이는 서열 또는 구조의 설계 변경의 결과일 수 있다. 설계된 변경은 특정 목적을 위해 특별히 설계되고 서열에 도입될 수 있다. 이러한 특정 변경은 다양한 돌연변이 유발 기술을 사용하여 시험관 내에서 이루어질 수 있다. 구체적으로 생성된 이러한 서열 변이체는 원래 서열의 "돌연변이체" 또는 "유도체"로 지칭될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 세포와 관련하여 용어 "유도체" 또는 "변이체"는 그 기원 세포주로부터 변형된(예를 들어, 재조합 DNA 서열을 발현하도록 변형된) 세포주를 지칭한다.

용어 "검출가능한 마커"는 선택가능한 마커 및 검정 마커 둘 다를 포괄한다. 용어 "선택가능한 마커"는 약물-내성 마커, 형광-활성화 세포 분류에 유용한 항원 마커, 선택적 부착을 허용하는 부착 리간드에 대한 수용체와 같은 부착 마커 등을 포함하여 발현 구조로 형질전환된 세포가 선택되거나 스크리닝될 수 있는 다양한 유전자 생성물을 지칭한다.

용어 "검출가능한 반응"은 검출 시약을 사용하거나 사용하지 않고 수행할 수 있는 검정에서 검출될 수 있는 임의의 신호 또는 반응을 지칭한다. 검출가능한 반응은 방사성 붕괴 및 에너지(예를 들어, 형광, 자외선, 적외선, 가시광선) 방출, 흡수, 편광, 형광, 인광, 투과, 반사 또는 공명 전달을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 검출가능한 반응은 또한 크로마토그래피 이동성, 탁도, 전기영동 이동성, 질량 스펙트럼, 자외선 스펙트럼, 적외선 스펙트럼, 핵 자기 공명 스펙트럼 및 x-선 회절을 포함한다. 대안적으로, 검출가능한 반응은 융점, 밀도, 전도도, 표면 탄성파, 촉매 활성 또는 원소 조성과 같은 생물학적 물질의 하나 이상의 특성을 측정하기 위한 검정의 결과일 수 있다. "검출 시약"은 관심있는 물질의 존재 또는 부재를 나타내는 검출가능한 반응을 생성하는 임의의 분자이다. 검출 시약은 항체, 핵산 서열 및 효소와 같은 다양한 분자를 포함한다. 검출을 용이하게 하기 위해, 검출 시약은 마커를 포함할 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "분화하다" 및 그의 다양한 문법적 형태는 세포 또는 조직의 구성 수준 또는 복잡성이 증가하여 보다 특화된 기능을 동반하게 되는 발달 과정을 지칭한다.

본 명세서에 사용된 용어 "용량"은 한번에 복용하도록 처방된 치료적 물질의 양을 지칭한다.

본 명세서에 사용된 용어 "효과기 세포"는 최종 반응 또는 기능을 수행하는 세포를 지칭한다. 예를 들어, 면역계의 주요 효과기 세포는 활성화된 림프구 및 식세포이다.

조작된 백혈구 자극기 세포("ENLIST™ 세포)는 암 치료를 위해 단핵 세포를 자극하는 데 사용되는 3개의 면역조절 분자의 핵심 그룹을 발현하도록 유전적으로 조작된 증식 불능 종양 세포의 모집단을 의미한다.

본 명세서에 사용된 용어 "농후화한다"는 원하는 물질의 비율을 증가시키는 것, 예를 들어, 세포 모집단에서 그 천연 빈도와 비교하여 세포의 하위유형의 상대적 빈도를 증가시키는 것을 지칭한다. 양성 선별, 음성 선별 또는 둘 다는 일반적으로 임의의 농후화 계획에 필요한 것으로 간주된다. 선별 방법은 제한 없이 자기 분리 및 FACS를 포함한다. 농후화에 사용된 특정 기술에 관계없이, 발달 단계와 활성화-특이적 반응이 세포의 항원 프로파일을 변경할 수 있기 때문에 선택 과정에 사용된 특정 마커가 중요하다.

본 명세서에 사용된 용어 "외인성 폴리펩티드"는 해당 유형의 야생형 세포에 의해 생성되지 않거나 외인성 폴리펩티드를 함유하는 세포보다 야생형 세포에서 더 낮은 수준으로 존재하는 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 폴리펩티드는 세포 내로 도입된 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드이며, 이 핵산은 선택적으로 세포에 의해 보유되지 않는다.

본 명세서에 사용된 용어 "외인성 면역조절 분자"는 면역 사멸 세포(예를 들어, NK 세포 또는 CD8+ T 세포)와 같은 면역 세포 상에서 동족체 폴리펩티드(예를 들어, 수용체)에 특이적으로 결합하여 면역 세포의 증식, 활성화, 확장 등과 같은 면역 세포의 자극을 매개하는 신호를 제공하는 (예를 들어, 세포내 또는 세포 표면에서) 동종 세포(예를 들어, 동종 세포주)를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 하나 이상의 외인성 면역조절 폴리펩티드는 생체외 또는 생체내에서 면역 사멸 세포를 자극하기에 충분하다. 예시적인 외인성 면역조절 폴리펩티드는 하기에 더 상세히 기재되어 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "발현하다" 또는 "발현"은 mRNA의 생합성, 폴리펩티드 생합성, 예를 들어 번역-후 변형에 의한 폴리펩티드 활성화, 또는 세포하 위치를 변경하거나 염색질로의 동원에 의한 발현의 활성화를 포괄한다. 발현은, 예를 들어: 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자의 수 증가, 유전자의 전사 증가(예컨대 유전자를 구성적 프로모터의 제어하에 두는 것), 유전자의 번역 증가, 경쟁 유전자의 녹아웃, 또는 이들의 조합 및/또는 다른 접근법들을 포함하는 다수의 접근법에 의해 증가될 수 있다.

용어 "발현 벡터"는 숙주 세포에서 발현되는 유전자를 포함하는 DNA 분자를 지칭한다. 전형적으로, 유전자 발현은 프로모터, 조직 특이적 조절 요소 및 인핸서를 포함하지만 이에 제한되지 않는 특정 조절 요소의 제어 하에 놓인다. 이러한 유전자는 조절 요소에 "작동가능하게 연결되어" 있다고 언급된다.

외인성 면역조절 분자와 관련하여 본 명세서에 사용된 용어 "제1" 및 "제2"는 외인성 자극 폴리펩티드의 유형이 하나보다 많은 경우 구별의 편의를 위해 사용된다. 이러한 용어의 사용은 명시적으로 언급되지 않는 한 외인성 자극 폴리펩티드의 특정 순서 또는 배향을 부여하기 위한 것이 아니다.

본 명세서에 사용된 용어 "유세포분석법"은 세포의 표현형과 특성을 조사하기 위한 도구를 지칭한다. 감지 영역을 지나는 레이저(방사선의 유도 방출에 의한 광 증폭)/광빔을 통해 액체 흐름에서 세포 또는 입자가 이동할 때 이를 감지한다. 미세 입자의 상대적인 광-산란 및 색상-식별 형광이 측정된다. 세포의 흐름 분석 및 분화는 크기, 입도 및 세포가 항체 또는 염료의 형태에서 형광 분자를 운반하는지 여부를 기반으로 한다. 세포가 레이저 빔을 통과함에 따라, 광은 모든 방향으로 산란되며 축에서 낮은 각도(0.5-10°)로 전방으로 산란된 광은 구의 반지름의 제곱에 비례하므로 세포 또는 입자의 크기에 비례한다. 광이 세포에 들어갈 수 있고; 따라서, 90° 광(직각, 측면) 산란은 형광색소-연결된 항체로 표지되거나 형광막, 세포질 또는 핵 염료로 염색될 수 있다. 따라서, 세포 유형의 분화, 막 수용체 및 항원의 존재, 막 전위, pH, 효소 활성 및 DNA 함량이 용이하게 될 수 있다. 유세포분석기는 다중매개변수로 각 세포에 대한 여러 측정값을 기록하고; 따라서 이종 모집단 내에서 동종의 하위모집단을 식별하는 것이 가능하다(Marion G. Macey, Flow cytometry: principles and applications, Humana Press, 2007). 물리적 특성이 너무 유사하여 크기나 밀도로 구분할 수 없는 별개의 세포 모집단을 단리할 수 있는, 형광-활성화된 세포 분류(FACS)는 형광 태그를 사용하여 차등적으로 발현되는 표면 단백질을 검출하여, 물리적으로 동종인 세포의 모집단 중에서 미세한 구별이 가능하도록 한다.

용어 "기능적 등가물" 또는 "기능적으로 등가물"은 유사하거나 동일한 효과 또는 용도를 갖는 물질, 분자, 폴리뉴클레오티드, 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드를 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용된다.

본 명세서에 사용된 용어 "유전자"는 주어진 RNA 또는 단백질의 발현과 관련된 핵산의 임의의 분절을 지칭하기 위해 광범위하게 사용된다. 따라서, 유전자는 발현된 RNA(전형적으로 폴리펩티드 코딩 서열을 포함함)를 인코딩하는 영역 및 종종 그들의 발현에 필요한 조절 서열을 포함한다. 유전자는 관심 공급원으로부터의 클로닝 또는 알려진 또는 예측된 서열 정보로부터의 합성을 포함하여 다양한 공급원으로부터 얻을 수 있으며, 구체적으로 원하는 매개변수를 갖도록 설계된 서열을 포함할 수 있다.

용어 "불규칙 변화한"은 원래 펩티드보다 생물학적 효능이 더 높은 펩티드를 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다. "불규칙 변화한 면역원"은 원래의 빈약하게 면역원성인 항원에 교차-반응하는 면역 반응을 유발하는 면역원이다.

용어 "면역 반응" 및 "면역-매개된"은, 이들 반응의 결과가 대상체에게 이롭든지 또는 해롭든지 간에, 외래 또는 자가-항원에 대한 대상체의 면역계의 임의의 기능적 발현을 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.

본 명세서에 사용된 용어 "면역억제" 및 그의 다양한 문법적 형태는 신체의 면역 반응 및 감염과 다른 질환에 대항하는 면역계의 능력의 감소를 지칭한다. 예를 들어, 일부 면역억제는 약물로 유발되거나 질환으로 인해 발생할 수 있다.

용어 "면역조절", "면역 조절제" 및 "면역 조절"은, 예를 들어, 케모카인, 사이토카인 및 면역 반응의 기타 매개체를 발현함에 의해 면역 반응을 직접적으로 또는 간접적으로 증진시키거나 감소시킬 수 있는 물질, 작용제 또는 세포를 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용된다.

본 명세서에 사용된 용어 "면역자극량"은, 예를 들어, 항원-특이적 T 세포를 검출하고 정량화하거나, 항원-특이적 CD4+ T 세포의 혈액 모집단을 정량화하거나, 항원 특이적 CD8+ T 세포의 혈액 모집단을 정량화하기 위한 ELISPOT 검정(세포 면역 반응), ICS(세포내 사이토카인 염색 검정) 및 주요 조직적합성 복합체(MHC) 사량체 검정에 의해 측정된 바와 같이 측정가능한 양만큼 면역 반응을 자극하는데 효과적인 면역원성 조성물의 양을 지칭하고, 또는 여기서 증가는 적절한 대조군과 비교할 때, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 100%이다(예를 들어, 수지상 세포에 종양-특이적 세포가 장입되지 않거나, 종양-특이적 세포로부터 유래된 펩티드가 장입되지 않은 대조군 조성물).

본 명세서에 사용된 용어 "게놈 내로 통합한다"는 숙주 세포의 게놈을 포함하는 게놈 DNA에 부수적으로 연결되는 재조합 DNA 서열을 지칭한다.

본 명세서에 사용된 용어 "카플란 마이어(Kaplan Meier) 플롯" 또는 "카플란 마이어 생존 곡선"은 많은 작은 간격의 시간을 고려하면서 주어진 시간 길이에서 임상 연구 대상체가 생존할 확률의 플롯을 지칭한다. 카플란 마이어 플롯은 다음과 같이 가정한다: (i) 언제든지 센서된(즉, 길을 잃은) 대상체는 계속해서 추적되는 대상체와 동일한 생존 전망을 갖는다; (ii) 생존 확률은 연구 초기 및 후기에 모집된 대상체에 대해 동일하다; 및 (iii) 이벤트(예를 들어, 사망)는 특정한 시간에 발생한다. 이벤트 발생 확률은 최종 추정치를 얻기 위해 이전에 계산된 확률을 곱한 연속 확률로 특정 시점에서 계산된다. 임의의 특정 시간에서의 생존 확률은 살아남은 대상체의 수를 위험에 처한 대상체의 수로 나눈 값으로 계산된다. 사망, 탈락 또는 연구에서 센서된 대상체는 위험에 처한 것으로 간주되지 않는다.

본 명세서에 사용된 용어 "표지화"는 추적가능한 성분을 도입함에 의해 화합물, 구조, 단백질, 펩티드, 항체, 세포 또는 세포 성분을 구별하는 과정을 지칭한다. 일반적인 추적가능한 구성성분은 형광 항체, 형광단, 염료 또는 형광 염료, 염색 또는 형광 염색, 마커, 형광 마커, 화학적 염색, 차등 염색, 차등 표지 및 방사성동위원소를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

용어 "마커" 또는 "세포 표면 마커"는 특정 유형의 세포의 표면에서 발견되는 항원 결정기 또는 에피토프를 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 세포 표면 마커는 세포 유형의 특성화, 그 식별 및 궁극적으로 그 단리를 용이하게 할 수 있다. 세포 분류 기술은 세포 표면 마커(들)가 양성 선별 또는 음성 선별, 즉 세포 모집단으로부터의 포함 또는 배제를 위해 사용될 수 있는 세포 바이오마커를 기반으로 한다.

본 명세서에 사용된 용어 "매개하다" 및 그의 다양한 문법적 형태는 결과를 가져오는 것을 지칭한다.

본 명세서에 사용된 용어 "최소 잔류 질환"은 치료 동안 또는 치료 후에 체내에 남아 있는 매우 적은 수의 암 세포를 지칭한다. 최소 잔류 질환은 백만 개의 정상 세포 중 하나의 암세포를 찾을 수 있는 매우 민감한 실험실 방법에 의해서만 발견될 수 있다.

용어 "혼합된 림프구 종양 반응" 또는 "MLTR"은 반응을 자극하기 위해 동종 림프구를 사용하는 것보다는 동종 종양 세포가 대신 사용되는 혼합된 림프구 반응과 유사한 반응을 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. MLTR 방법은 면역원성 가능성에 대해 테스트되는 종양 세포를 말초 혈액 단핵 세포로부터의 혼합 림프구와 접촉시킨 후, 림프구의 세포 증식, 림프구의 세포 하위집합 분화, 림프구의 사이토카인 방출 프로파일, 및 종양 세포 사멸 중 하나 이상을 측정하는 것을 포함한다.

본 명세서에 사용된 용어 "변형하다" 및 그의 다양한 문법적 형태는 형태 또는 품질의 변경을 지칭한다.

본 명세서에 사용된 용어 "조절하다" 및 그의 다양한 문법적 형태는 특정 척도 또는 비율로 조절, 변경, 적응 또는 조정하는 것을 의미한다. 이러한 조절은 감지할 수 없는 변경을 포함하여 모든 변경이 될 수 있다.

종양 세포에 대한 면역 반응과 관련하여 본 명세서에 사용된 용어 "변형된" 또는 "조절된"은 면역 세포가 종양 세포를 인식하고 사멸시킬 수 있도록 하나 이이상의 재조합 DNA 기술을 통해 종양 세포에 대한 면역 반응의 형태 또는 특성을 변화시키는 것을 의미한다.

본 명세서에 사용된 용어 "골수성 억제 세포" 또는 "골수성-유래된 억제 세포"는 골수 기원, 미성숙 상태, 및 T 세포 반응을 강력하게 억제하는 능력을 특징으로 하는 세포의 이종 모집단을 지칭한다. 이들 세포는 건강한 개체에서 면역 반응과 조직 복구를 조절하고 염증화 동안 모집단이 빠르게 확장한다.

본 명세서에 사용된 용어 "자연 사멸(NK) 세포"는 T 및 B 세포와 동일한 패밀리의 림프구로, 그룹 I 선천적 림프구로 분류된다. 그들은 항원 제시 세포에 의한 프라이밍이 필요한 세포독성 T 세포와 달리, 프라이밍이나 사전 활성화 없이 종양 세포를 사멸시킬 수 있는 능력을 갖는다. NK 세포는 IFNγ 및 TNFα와 같은 사이토카인을 분비하는데, 이들은 대식세포, 수지상 세포 등 다른 면역세포에 작용해 면역반응을 강화한다. NK 세포 표면의 활성화 수용체는 암세포와 감염된 세포의 표면에 발현된 분자를 인식하고 NK 세포의 스위치를 켠다. 억제 수용체는 NK 세포 사멸을 확인하는 역할을 한다. 대부분의 정상적인 건강한 세포는 MHCI 수용체를 발현하여 "자기"로 표시한다. NK 세포 표면의 억제 수용체는 동족 MHCI를 인식하여 NK 세포를 차단하여 사멸하는 것을 막는다. 사멸시키기로 일단 결정되면, NK 세포는 퍼포린과 그랜자임을 함유하는 세포독성 과립을 방출하여, 표적 세포를 용해시킨다. 사이토카인 분비 및 세포독성을 포함한 자연 사멸 반응성은 킬러 면역글로불린-유사 수용체(KIR) 및 자연 세포독성 수용체(NCR)와 같은 여러 생식계열 인코딩된 억제 및 활성화 수용체의 균형에 의해 제어된다. 표적 세포 상의 MHC 클래스 I 분자의 존재는 NK 세포 상의 킬러 세포 면역글로불린-유사 수용체(KIR)인 MHC 클래스 I-특이적 수용체에 대한 그러한 억제 리간드 중 하나로 작용한다. KIR 수용체의 참여는 NK 활성화를 차단하고 역설적으로 비활성화 신호를 트리거하여 연속적인 조우에 반응하는 능력을 보존한다. 따라서, KIR이 MHC 클래스 I에 충분히 결합할 수 있는 경우, 이 참여는 살해 신호를 무효화하고 표적 세포가 살도록 허용할 수 있다. 반대로, NK 세포가 표적 세포의 MHC 클래스 I에 충분히 결합하지 못하면 표적 세포의 사멸이 진행될 수 있다. 결과적으로, 낮은 MHC 클래스 I을 발현하고 T-세포-매개 공격을 회피할 수 있다고 생각되는 종양은 대신 NK 세포-매개 면역 반응에 민감할 수 있다.

용어 "핵산"은 단일- 또는 이중-가닥 형태에서의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중합체를 지칭하기 위해 본 명세서에 사용되고, 달리 제한되지 않는 한, 이들이 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드(예를 들어, 펩티드 핵산)와 유사한 방식으로 단일-가닥 핵산에 혼성화한다는 점에서 천연 뉴클레오티드의 본질적 성질을 갖는 공지된 유사체를 포괄한다. 본 발명의 방법에 유용한 핵산 분자는 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 단편을 인코딩하는 임의의 핵산 분자를 포함한다. 이러한 핵산 분자는 내인성 핵산 서열과 100% 동일할 필요는 없지만 전형적으로 실질적인 동일성을 나타낼 것이다. 내인성 서열에 대해 "실질적인 동일성"을 갖는 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 이중-가닥 핵산 분자의 적어도 하나의 가닥과 혼성화할 수 있다. 본 발명의 방법에 유용한 핵산 분자는 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 단편을 암호화하는 임의의 핵산 분자를 포함한다. 이러한 핵산 분자는 내인성 핵산 서열과 100% 동일할 필요는 없지만 전형적으로 실질적인 동일성을 나타낼 것이다. 내인성 서열에 대해 "실질적인 동일성"을 갖는 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 이중-가닥 핵산 분자의 적어도 하나의 가닥과 혼성화할 수 있다. "혼성화하다"는 쌍을 이루어 다양한 엄격성 조건 하에서 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 본 명세서에 기재된 유전자) 또는 이의 일부 사이에 이중-가닥 분자를 형성하는 것을 의미한다. (예를 들어, Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507 참조). 두 가닥이 어닐링되는 속도를 정량화하여 염기 비호환성의 영향을 측정하면 어닐링되는 두 가닥 사이의 염기 서열 유사성에 대한 정보를 제공할 수 있다. 선택적으로 혼성화하는 핵산은 엄격한 혼성화 조건 하에서 비표적 핵산에 대한 혼성화보다 감지할 수 있을 정도로 더 큰 정도로(예를 들어, 배경에 대해 적어도 2배), 그리고 비표적 핵산을 실질적으로 배제하여, 특정 핵산 표적 서열에 대한 핵산 서열의 혼성화를 겪는다

"실질적으로 동일한"은 참조 아미노산 서열(예를 들어, 본 명세서에 기술된 임의의 아미노산 서열) 또는 핵산 서열(예를 들어, 본 명세서에 기술된 임의의 핵산 서열)에 대해 적어도 50% 동일성을 나타내는 폴리펩티드 또는 핵산 분자를 의미한다. 예를 들어, 이러한 서열은 비교에 사용된 서열과 아미노산 수준 또는 핵산이 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다.

서열 동일성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어(예를 들어, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705, BLAST, BESTFIT, GAP, 또는 PILEUP/PRETTYBOX 프로그램)를 사용하여 측정된다. 이러한 소프트웨어는 다양한 치환, 결실 및/또는 기타 변형에 대한 상동성 정도를 지정하여 동일하거나 유사한 서열을 매칭한다. 보존적 치환은 전형적으로 다음 그룹 내의 치환을 포함한다: 글리신, 알라닌; 발린, 이소류신, 류신; 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 라이신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신. 동일성 정도를 결정하기 위한 예시적인 접근법에서, e-3과 e-100 사이의 확률 점수가 밀접하게 관련된 서열을 나타내는 BLAST 프로그램이 사용될 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "오픈 리딩 프레임"은 펩티드 또는 단백질을 인코딩할 가능성이 있는 DNA 분자에서 뉴클레오티드의 서열을 지칭한다: 그것은 시작 삼중항(ATG)으로 시작하고 각각이 아미노산을 인코딩하는 삼중항의 기호열이 이어지고, 정지 삼중항(TAA, TAG 또는 TGA)으로 종료한다.

어구 "작동가능하게 연결된"은 (1) 제1 서열(들) 또는 도메인이 제2 서열(들) 또는 도메인 또는 그 제2 서열 또는 도메인의 제어 하에 있는 영역에 대해 영향을 미칠 수 있도록 제2 서열(들) 또는 도메인에 충분히 근접하게 위치하는 제1 서열(들) 또는 도메인; 및 (2) 프로모터와 제2 서열 사이의 기능적 연결을 지칭하며, 여기서 프로모터 서열은 제2 서열에 상응하는 DNA 서열의 전사를 개시하고 매개한다. 일반적으로, 작동가능하게 연결된 것은 연결되는 핵산 서열이 인접하고 2개의 단백질 코딩 영역을 연결하는 데 필요한 경우 동일한 판독 프레임에 있다는 것을 의미한다. 일부 실시형태에 따르면, 어구 "작동적으로 연결된"은 생성된 융합 단백질의 각 단백질 도메인 또는 폴리펩티드가 그 원래의 기능을 유지하도록 2개 이상의 단백질 도메인 또는 폴리펩티드가 재조합 DNA 기술 또는 화학 반응을 통해 결찰되거나 조합되는 연결을 지칭한다.

본 명세서에 사용된 용어 "전체 생존"(OS)은 질환으로 진단된 환자가 여전히 살아있는 질환, 예컨대 암의 진단일 또는 치료의 시작으로부터의 시간의 길이를 지칭한다.

본 명세서에 사용된 용어 "비경구" 및 그의 다른 문법적 형태는 입 또는 소화관 이외의 신체에서 발생하는 물질의 투여를 지칭한다. 예를 들어, 본 명세서에 사용된 용어 "비경구"는, 예를 들어, 피하(즉, 피부 아래 주사), 근육내(즉, 근육 내 주사); 정맥내(즉, 정맥 내 주사), 수막강내(즉, 척수 주변 공간 또는 뇌의 거미막 아래 공간 내 주사), 흉골내 주사 또는 주입 기술을 포함한, 주사에 의한 체내 도입(즉, 주사에 의한 투여)을 지칭한다.

용어 "말초 혈액 단핵 세포" 또는 "PBMC"는 예를 들어, 림프구 또는 단핵구와 같은 단일 원형 핵을 갖는 혈액 세포를 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용된다.

본 명세서에 사용된 용어 "약학적 조성물"은 표적 병태, 증후군, 장애 또는 질환을 예방, 강도에서 감소, 치유 또는 그렇지 않으면 치료하기 위해 이용되는 조성물을 지칭한다.

본 명세서에 사용된 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 본 발명의 단리된 폴리펩티드가 안정하고 생체이용가능한 상태로 유지되는 약제의 투여에 통상적으로 사용가능한 임의의 실질적으로 비-독성인 담체를 지칭한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 치료되는 포유동물에게 투여하기에 적합하도록 충분히 고순도 및 충분히 낮은 독성의 것이어야 한다. 더욱이 활성제의 안정성 및 생체이용률을 유지해야 한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 액체 또는 고체일 수 있고, 주어진 조성물의 활성제 및 기타 성분과 조합될 때 원하는 용적, 일관성 등을 제공하기 위해 계획된 방식의 투여를 염두에 두고 선택된다.

본 명세서에 사용된 용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 등이 없이 인간 및 하등 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고 합리적인 이익/위험 비율에 상응한 이들 염을 지칭한다. 의약에 사용되는 경우 염은 약학적으로 허용가능해야 하지만, 비-약학적으로 허용가능한 염을 편리하게 사용하여 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제조할 수 있다. 이러한 염은 다음 산으로부터 제조된 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산, 말레산, 아세트산, 살리실산, p-톨루엔 설폰산, 타르타르산, 시트르산, 메탄 설폰산, 포름산, 말론산, 숙신산, 나프탈렌-2-설폰산 및 벤젠 설폰산. 또한, 이러한 염은 카르복실산 기의 나트륨, 칼륨 또는 칼슘 염과 같은 알칼리 금속 또는 알칼리 토류 염으로서 제조될 수 있다. "약학적으로 허용가능한 염"은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 등 없이 인간 및 하등 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고 합리적인 이익/위험 비율과 상응하는 이들 염을 의미한다. 약학적으로 허용가능한 염은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, P. H. Stahl, 등은 "Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use"(Wiley VCH, Zurich, Switzerland: 2002)에서 약학적으로 허용가능한 염을 자세히 기술한다. 염은 본 발명 내에 기재된 화합물의 최종 단리 및 정제 동안 제자리에서 또는 유리 염기 작용기를 적합한 유기산과 반응시킴에 의해 별도로 제조될 수 있다. 대표적인 산 부가염은 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 시트레이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠술포네이트, 바이술페이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포르술포네이트, 디글루코네이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 푸마레이트, 염산염, 하이드로브로마이드, 하이드로아이오다이드, 2-하이드록시에탄설포네이트(이세티오네이트), 락테이트, 말레에이트, 메탄설포네이트, 니코티네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 옥살레이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 포스페이트, 글루타메이트, 비카르보네이트, p-톨루엔술포네이트 및 운데카노에이트를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 또한, 염기성 질소-함유 기는 저급 알킬 할라이드 예컨대 메틸, 에틸, 프로파일 및 부틸 클로라이드, 브로마이드 및 요오다이드; 디메틸, 디에틸, 디부틸 및 디아밀 술페이트 같은 디알킬 술페이트; 장쇄 할로겐화물 예컨대 데실, 라우릴, 미리스틸 및 스테아릴 클로라이드, 브로마이드 및 요오다이드; 벤질 및 페네틸 브로마이드 등과 같은 아릴알킬 할라이드 같은 제제로 4차화될 수 있다. 이로써 물 또는 오일-가용성 또는 분산성 생성물이 얻어진다. 약학적으로 허용가능한 산부가염을 형성하기 위해 이용될 수 있는 산의 예는 염산, 브롬화수소산, 황산 및 인산 같은 무기산 및 옥살산, 말레산, 숙신산 및 시트르산 같은 유기산을 포함한다. 염기성 부가염은 카르복실산-함유 모이어티를 약학적으로 허용가능한 금속 양이온의 수산화물, 탄산염 또는 중탄산염과 같은 적합한 염기와, 또는 암모니아 또는 유기 1차, 2차 또는 3차 아민과 반응시킴에 의해 발명에 기재된 화합물의 최종 단리 및 정제 동안 제자리에서 제조될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염은 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 및 알루미늄 염 등과 같은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속에 기반한 양이온 및 암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 디에틸아민, 에틸아민 등을 포함하는 비독성 4차 암모니아 및 아민 양이온을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 염기 부가 염의 형성에 유용한 다른 대표적인 유기 아민은 에틸렌디아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 피페리딘, 피페라진 등을 포함한다. 약학적으로 허용가능한 염은 또한, 예를 들어 아민과 같은 충분히 염기성 화합물을 생리학적으로 허용가능한 음이온을 제공하는 적합한 산과 반응시킴에 의해 당업계에 널리 공지된 표준 절차를 사용하여 수득될 수 있다. 카르복실산의 알칼리 금속(예를 들어, 나트륨, 칼륨 또는 리튬) 또는 알칼리 토금속(예를 들어, 칼슘 또는 마그네슘) 염이 또한 제조될 수 있다.

용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연적으로 발생하는 아미노산의 인공 화학적 유사체인 아미노산 중합체뿐만 아니라 자연적으로 발생하는 아미노산 중합체에 적용된다. 이러한 자연적으로 발생하는 아미노산의 유사체의 본질적인 특성은 단백질에 통합될 때 단백질은 동일한 단백질에 대해 유도되지만 완전히 자연적으로 발생하는 아미노산으로 구성된 항체에 특이적으로 반응한다는 것이다.

용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 또한 글리코실화, 지질 부착, 황산화, 글루탐산 잔기의 감마-카르복실화, 하이드록실화, 및 ADP-리보실화를 포함하나 이에 제한되지 않는 변형을 포함한다. 잘 알려져 있고 상기에 언급한 바와 같이, 폴리펩티드는 완전히 선형이 아닐 수 있음이 이해될 것이다. 예로써, 폴리펩티드는 유비퀴틴화의 결과로 분지될 수 있고, 일반적으로 자연적 처리 이벤트 및 자연적으로 발생하지 않는 인간 조작에 의해 야기된 이벤트를 포함하는 번역후 이벤트의 결과로서 분지가 있거나 없이 원형일 수 있다. 원형, 분지형 및 분지형 원형 폴리펩티드는 비-번역 자연적 과정 및 전적으로 합성 방법에 의해서도 합성될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 펩티드는 임의의 길이 또는 크기이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "증식하다" 및 그의 다양한 문법적 형태는 세포 수의 증가를 초래하는 과정을 지칭하고, 세포 사멸 또는 분화를 통한 세포 분열과 세포 손실 사이의 균형에 의해 정의된다.

용어 "단백질 도메인" 및 "도메인"은 그 자체의 3차 구조를 갖는 단백질의 일부를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 큰 단백질은 일반적으로 폴리펩티드 사슬의 유연한 영역을 통해 서로 연결된 여러 도메인으로 구성된다.

다음 용어는 2개 이상의 핵산 또는 폴리뉴클레오티드 사이의 서열 관계를 기술하기 위해 본 명세서에서 사용된다: (a) "참조 서열", (b) "비교 윈도우", (c) "서열 동일성", (d) "서열 동일성의 백분율" 및 (e) "실질적 동일성". (a) 용어 "참조 서열"은 서열 비교의 기초로 사용되는 서열을 지칭한다. 참조 서열은 지정된 서열의 부분집합 또는 전체일 수 있다; 예를 들어, 전장 cDNA 또는 유전자 서열의 세그먼트, 또는 완전한 cDNA 또는 유전자 서열. (b) 용어 "비교 윈도우"는 폴리뉴클레오티드 서열의 인접하고 특정된 세그먼트를 지칭하며, 여기서 폴리뉴클레오티드 서열은 참조 서열과 비교할 수 있고, 비교 윈도우에서 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 정렬을 위해 참조 서열(추가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 추가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 일반적으로, 비교 윈도우는 적어도 20개 연속 뉴클레오티드 길이, 선택적으로 적어도 30개 연속 뉴클레오티드 길이, 적어도 40개 연속 뉴클레오티드 길이, 적어도 50개 연속 뉴클레오티드 길이, 적어도 100개 연속 뉴클레오티드 길이이거나, 또는 더 길다. 당업자는 폴리뉴클레오티드 서열에 갭의 함입으로 인한 참조 서열에 대한 높은 유사성을 피하기 위해 갭 패널티가 전형적으로 도입되고 매치의 수에서 차감된다는 것을 이해한다. 비교를 위한 정렬 방법은 당업계에 잘-알려져 있다. 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은 Smith 및 Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)의 국소 상동성 알고리즘; Needleman 및 Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)의 상동성 정렬 알고리즘; Pearson 및 Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444 (1988)의 유사성에 대한 검사 방법; 캘리포니아주 마운틴뷰 소재의 Intelligenetics에 의한 PC/Gene 프로그램에서 CLUSTAL; 미국 위스콘신주 사이언스 닥터 매디슨 575 소재의 Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG)에서의 GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, 및 TFASTA를 포함하지만 이에 제한되지 않는 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 구현에 의해 수행될 수 있고; CLUSTAL 프로그램은 Higgins 및 Sharp, Gene 73:237-244 (1988); Higgins 및 Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989); Corpet, 등, Nucleic Acids Research 16:10881-90 (1988); Huang, 등, Computer Applications in the Biosciences, 8:155-65 (1992), 및 Pearson, 등, Methods in Molecular Biology, 24:307-331 (1994)에 의해 잘 기술되어 있다. 데이터베이스 유사성 검색에 사용될 수 있는 프로그램의 BLAST 계열은 다음을 포함한다: 뉴클레오티드 데이터베이스 서열에 대한 뉴클레오티드 쿼리 서열용 BLASTN; 단백질 데이터베이스 서열에 대한 뉴클레오티드 쿼리 서열용 BLASTX; 단백질 데이터베이스 서열에 대한 단백질 쿼리 서열용 BLASTP; 뉴클레오티드 데이터베이스 서열에 대한 단백질 쿼리 서열용 TBLASTN; 및 뉴클레오티드 데이터베이스 서열에 대한 뉴클레오티드 쿼리 서열용 TBLASTX. Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 19, Ausubel, 등, Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995)을 참고한다. 달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에 제공된 서열 동일성/유사성 값은 기본 매개변수를 사용하여 BLAST 2.0 프로그램 제품군을 사용하여 수득된 값을 지칭한다. Altschul 등, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997). BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는, 예를 들어 National Center for Biotechnology-Information을 통해 공개적으로 이용가능하다. 이 알고리즘은 먼저 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 단어와 정렬될 때 일부 양수-값의 임계값 스코어 T와 일치하거나 충족하는 쿼리 서열에서 길이 W의 짧은 단어를 식별하여 높은 스코어링 서열 쌍(HSP)을 식별하는 것을 포함한다. T는 이웃 단어 스코어 임계값이라고 한다(Altschul 등, 상기 참고). 이들 초기 이웃 단어 히트는 검색을 시작하여 이를 함유하는 더 긴 HSP를 찾기 위한 시드로 역할을 한다. 그런 다음 누적 정렬 스코어가 증가할 수 있는 한 단어 히트는 각 서열을 따라 양방향으로 확장된다. 누적 스코어는 뉴클레오티드 서열에 대해 매개변수 M(일치하는 잔기의 쌍에 대한 보상 스코어; 항상>0) 및 N(일치하지 않는 잔기에 대한 벌점 스코어, 항상<0)을 사용하여 계산된다. 아미노산 서열의 경우, 스코어링 매트릭스를 사용하여 누적 스코어를 계산한다. 각 방향에서 단어 히트의 확장은 다음과 같은 경우 중단된다: 누적 정렬 스코어가 그 최대 달성 값에서 수량 X만큼 떨어진 경우; 하나 이상의 음수-스코어링 잔기 정렬의 누적으로 인해 누적 점수가 0 또를 그 미만으로 된 경우; 또는 어느 하나의 서열의 말단에 도달한 경우. BLAST 알고리즘 매개변수 W, T 및 X는 정렬의 감도와 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열용)은 기본적으로 단어 길이(W) 11, 기대값(E) 10, 컷오프 100, M=5, N=-4 및 양 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 기본적으로 단어 길이(W) 3, 기대값(E) 10, BLOSUM62 스코어링 매트릭스를 사용한다(Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 참고). 퍼센트 서열 동일성을 계산하는 것 외에, BLAST 알고리즘은 또한 2개 서열 사이의 유사성의 통계적 분석을 수행한다(예를 들어, Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993) 참고). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 척도는 최소 합 확률(P(N))이며, 이는 2개 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 일치가 우연히 발생할 확률의 표시를 제공한다. BLAST 검색은 단백질이 무작위 서열로 모델링될 수 있다고 가정한다. 그러나, 많은 실제 단백질은 단독중합체 트랙, 단-기간 반복부 또는 하나 이상의 아미노산이 풍부한 영역일 수 있는 비무작위 서열의 영역을 포함한다. 이러한 낮은-복잡도 영역은 단백질의 다른 영역이 완전히 유사하지 않더라도 관련되지 않은 단백질 사이에 정렬될 수 있다. 이러한 낮은-복잡도 정렬을 줄이기 위해 다수의 낮은-복잡도 필터 프로그램이 이용될 수 있다. 예를 들어, SEG (Wooten and Federhen, Comput. Chem., 17:149-163 (1993)) 및 XNU (Claverie and States, Comput. Chem., 17:191-201 (1993)) 낮은-복잡도 필터가 단독으로 또는 조합하여 이용될 수 있다. (c) 2개의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서 용어 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 명시된 비교 윈도우에 걸쳐 최대 일치를 위해 정렬될 때 동일한 2개 서열에서 잔기를 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 서열 동일성의 백분율이 단백질과 관련하여 사용될 때 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 종종 다르다는 것이 인식되며 즉, 여기서 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성(예를 들어, 전하 또는 소수성)을 갖는 다른 아미노산 잔기로 치환되고 따라서 분자의 기능적 특성을 변경하지 않는다. 서열이 보존적 치환에서 다른 경우, 퍼센트 서열 동일성은 치환의 보존적 특성을 교정하기 위해 상향으로 조정될 수 있다. 이러한 보존적 치환에 의해 상이한 서열은 "서열 유사성" 또는 "유사성"을 갖는다고 언급된다. 이 조정을 하기 위한 수단은 당업자에게 잘-알려져 있다. 전형적으로 여기에는 완전한 불일치가 아닌 부분적으로 보존적 치환을 스코어링하여 백분율 서열 동일성을 증가시키는 것이 포함된다. 따라서, 예를 들어, 동일한 아미노산에 1의 스코어가 주어지고 비-보존적 치환에 0의 스코어가 주어지는 경우, 보존적 치환에는 0과 1 사이의 스코어가 주어진다. 보존적 치환의 스코어링은, 예를 들어 프로그램 PC/GENE (Intelligenetics, 미국 캘리포니아주 마운틴뷰 소재)에서 구현된 바와 같이, 예를 들어 Meyers and Miller, Computer Applic. Biol. Sci., 4:11-17 (1988)의 알고리즘에 따라 계산된다. (d) 본 명세서에서 사용된 용어 "서열 동일성의 백분율"은 비교 윈도우에 대해 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함에 의해 결정된 값을 의미하며, 여기서 비교 윈도우에서 폴리뉴클레오티드 서열의 부분은 두 서열의 최적 정렬을 위한 참조 서열(추가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 추가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은 일치된 위치의 수를 산출하기 위해 양 서열에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 발생하는 위치의 수를 결정하고, 일치된 위치의 수를 비교의 윈도우에서 총 위치의 수로 나누고, 그리고 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함에 의해 계산된다. (e) 용어 폴리뉴클레오티드 서열의 "실질적 동일성"은 폴리뉴클레오티드가 표준 매개변수를 사용하여 기술된 정렬 프로그램 중 하나를 사용하여 참조 서열과 비교하여, 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성 및 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다는 것을 의미한다. 당업자는 코돈 축퇴, 아미노산 유사성, 판독 프레임 위치화 등을 고려하여 2개의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 단백질의 상응하는 동일성을 결정하기 위해 이들 값을 적절하게 조정할 수 있음을 인지할 것이다. 이들 목적을 위한 아미노산 서열의 실질적인 동일성은 일반적으로 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 서열 동일성을 의미한다. 뉴클레오티드 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 표시는 두 분자가 엄격한 조건 하에서 서로 혼성화하는 경우이다. 그러나, 엄격한 조건 하에서 서로 혼성화하지 않는 핵산은 그것이 인코딩하는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다면 여전히 실질적으로 동일하다. 이것은 예를 들어 유전자 코드에 의해 허용된 최대 코돈 축퇴를 사용하여 핵산의 카피가 생성될 때 발생할 수 있다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 한 가지 표시는 제1 핵산이 인코딩하는 폴리펩티드가 제2 핵산에 의해 인코딩되는 폴리펩티드와 면역학적으로 교차 반응성이다는 것이다. 돌연변이는 또한 코돈 축퇴를 고려하는 것을 포함하여 유전자 코드를 참조하여 본 단백질의 뉴클레오티드 서열에 대해 만들어질 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "프라임"(또는 "프라이밍")은 감도를 증가시키는 과정을 지칭한다. 면역학적 의미로 사용될 때 그것은 특정 항원이 나이브 림프구에 제시되어 분화를 일으키는 과정을 지칭한다. 프라이밍은 다음의 여러 단계를 포함한다: 항원 제시 세포에 의해 클래스 MHC 분자에 결합된 항원 흡수, 처리 및 세포 표면 발현, 림프 조직에서 헬퍼 T 세포 전구체의 재순환 및 항원-특이적 포획, 및 T 세포 증식 및 분화. Janeway, CA, Jr., "The priming of helper T cells, Semin. Immunol. 1(1): 13-20 (1989).

본 명세서에 사용된 용어 "무진행 생존" 또는 "PFS"는 암과 같은 질환의 치료 동안 및 후 환자가 질환과 함께 생활하지만 더 악화되지 않는 기간을 지칭한다. 임상 시험에서 무진행 생존을 측정하는 것은 새로운 치료가 얼마나 잘 작동하는지 결정하는 한 가지 방법이다.

암과 관련하여 본 명세서에 사용된 용어 "재발"은 일반적으로 암이 감지될 수 없는 일정 기간 후에 재발(복귀)한 암을 의미한다. 암은 원래의(원발성) 종양과 같은 위치 또는 신체의 다른 위치로 돌아올 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "무재발 생존(RFS)"은 암에 대한 1차 치료 후 암의 어떠한 징후 또는 증상 없이 환자가 생존하는 기간을 지칭한다. 무질환 생존(DFS) 및 무진행 생존(PFS)이라고도 한다.

용어 "방출" 또는 "사이토카인 효과기 분자의 방출"은 수용체 자극에 반응하는 시그널링 캐스케이드의 활성화 후 주어진 면역 세포 유형으로부터 외부 환경으로 면역 반응의 용해성 매개체가 전달되는 복잡하고 엄격하게 제어되는 과정을 의미한다. 고전적인 분비 경로에서, 신호 펩티드를 갖는 사이토카인은 용해성 또는 막횡단 전구체로서 합성을 위해 소포체(ER)에 동시번역적으로 삽입된다. 그런 다음 추가 처리를 위해 소포에서 골지 복합체로 이동하고, 트랜스-골지 네트워크(TGN)에서 세포 표면 또는 다른 소기관으로의 구성적 전달을 위해 소포 또는 담체로 장입된다. 특화된 세포 유형에서, 사이토카인 및 기타 카고를 저장 및 이후 방출을 위해 과립에 장입함으로써 추가 분비 방식이 제공된다. Lacy, P. and Stow, JL, "Cytokine release from innate immune cells: association with diverse membrane trafficking pathways," Blood (2011) 118: 9-18을 참고한다. 사이토카인 방출은 면역글로불린- 또는 보체 수용체-매개된 시그널링 또는 TLR과 같은 패턴 인식 수용체를 포함한 다양한 세포 수용체 배열을 통한 병원체에 의해 직접 유발될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "반응률"은 치료 후 암이 줄어들거나 사라진 환자의 백분율을 지칭한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "내성 암"은 이러한 치료의 시작 시 또는 이러한 치료 동안 때때로 치료에 반응하지 않는 암을 지칭한다.

용어 "리포터 유전자"("리포터") 또는 "검정 마커"는 검출될 수 있거나 쉽게 식별 및 측정될 수 있는 유전자 및/또는 펩티드를 지칭한다. 리포터의 발현은 RNA 수준 또는 단백질 수준에서 측정될 수 있다. 실험적 검정 프로토콜에서 검출될 수 있는 유전자 생성물은 마커 효소, 항원, 아미노산 서열 마커, 세포 표현형 마커, 핵산 서열 마커 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 연구원은 세포 배양, 박테리아, 동물 또는 식물에서 관심있는 다른 유전자에 리포터 유전자를 부착할 수 있다. 예를 들어, 일부 리포터는 선택가능한 마커이거나 이를 발현하는 유기체에 특성을 부여하여 유기체를 쉽게 식별하고 검정할 수 있게 한다. 리포터 유전자를 유기체 내에 도입하기 위해 연구자는 리포터 유전자와 관심있는 유전자를 동일한 DNA 작제물에 배치하여 세포 또는 유기체 내에 삽입되도록 할 수 있다. 배양 중인 박테리아 또는 진핵 세포의 경우, 이것은 플라스미드 형태일 수 있다. 일반적으로 사용되는 리포터 유전자는 형광 단백질, 루시퍼라제, 베타-갈락토시다제 및 클로람페니콜과 카노마이신과 같은 선택가능한 마커를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.

세포를 언급할 때 본 명세서에서 사용된 용어 "분비하다"는 세포 내에서 제조된 분자가 세포 외부 공간으로 이동하는 과정을 의미한다.

본 명세서에 사용된 용어 "일련의 사멸 세포"는 다중 종양 또는 병원체-감염된 세포를 사멸시키는 능력을 나타내면서 그러한 사멸 작용에 대한 내성을 나타내는 세포의 모집단을 지칭한다. 이 효과기 기능을 나타내는 여러 종류의 세포, 예를 들어, NK 세포, NKT 세포, LAK 세포, CIK 세포, MAIT 세포, CD8+ CTLs, CD4+ CTL이 있다. 일련의 사멸 효과기 기능은 세포용리 또는 세포독성 활성을 통해 직접적이거나 병원성 및 암성 세포를 표적화하는 다른 세포 및 단백질의 면역조절을 통해 간접적일 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자"는 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 자극하기에 충분한 기간 동안, T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구를 자극하기에 충분히 발현되는 외인성 면역조절 분자를 지칭한다. 일부 실시형태에 따르면, 그 기간은 1시간 내지 72시간, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45 50, 55, 60, 65, 70, 71 또는 72시간이다. 일부 실시형태에 따르면, 기간은 72시간 초과이다.

본 명세서에 사용된 용어 "자극하다" 및 임의의 다양한 문법적 형태는 활성화를 유도하거나 활성을 증가시키는 것을 지칭한다.

본 명세서에 사용된 용어 "면역 세포를 자극하다" 또는 "면역 세포 자극"은 면역 세포, 예를 들어 NK 세포 및/또는 CD8+ T 세포의 활성화 및/또는 확장과 같은 세포 반응을 유발하거나 초래하는 과정(예를 들어, 시그널링 이벤트 또는 자극을 수반함)을 지칭한다. 일부 실시형태에 따르면, 면역 세포(예를 들어, NK 세포 및/또는 CD8+ T 세포)를 자극하는 것은 면역 세포의 활성화 및/또는 확장을 초래하는 자극 또는 신호(예를 들어, 자극 폴리펩티드)를 제공하는 것을 지칭한다.

본 명세서에 사용된 용어 "면역 세포를 자극하기에 충분한"은 예를 들어 면역 세포의 세포 반응을 촉진하는 외인성 면역조절 폴리펩티드의 시그널링 이벤트 또는 자극의 양 또는 수준을 지칭한다.

본 명세서에 사용된 용어 "대상체" 또는 "개체" 또는 "환자"는 인간을 포함하는 포유동물 기원의 동물 종의 구성원을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다.

본 명세서에 사용된 용어 "이를 필요로 하는 대상체"는, 문구의 문맥 및 용법이 달리 나타내지 않는 한, (i) 기재된 발명에 따른 면역원성 조성물이 투여될 것이거나, (ii) 기재된 발명에 따른 면역원성 조성물을 받고 있거나; 또는 (iii) 기재된 발명에 따른 면역원성 조성물을 받았던 환자를 지칭한다.

용어 "SUPLEXA™ 세포"는 조작된 백혈구 자극기(ENLIST™) 세포에 의해 시험관 내에서 자극된 자가 혈액 세포를 의미한다.

본 명세서에 사용된 용어 "치료제"는 치료적 효과를 제공하는 약물, 분자, 핵산, 단백질, 대사산물, 조성물 또는 기타 물질을 지칭한다. 본 명세서에 사용된 용어 "활성"은 의도된 치료적 효과를 담당하는 기재된 발명의 조성물의 요소, 성분 또는 구성분을 지칭한다. 용어 "치료제" 및 "활성제"는 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용된다. 본 명세서에 사용된 용어 "치료 성분"은 모집단의 백분율에서 특정 질환 징후의 진행을 제거, 감소 또는 예방하는 치료적으로 유효한 투여량(즉, 용량 및 투여 빈도)을 지칭한다. 일반적으로 사용된 치료 성분의 예는 모집단의 50%에서 특정 질환 징후에 대해 치료적으로 효과적인 특정 투여량에서의 용량을 기술하는 ED50이다.

용어 활성제의 "치료량", "치료적으로 유효한 양", "유효한 양" 또는 "약학적 유효량"은 치료의 의도된 이점을 제공하기에 충분한 양을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 그러나, 투여량 수준은 부상 유형, 연령, 체중, 성별, 환자의 의학적 상태, 상태의 중증도, 투여 경로 및 이용된 특정 활성제를 포함한 다양한 인자를 기반으로 한다. 따라서 투여량 요법은 매우 다양할 수 있지만 표준 방법을 사용하여 의사가 일상적으로 결정할 수 있다. 부가적으로, 용어 "치료량", "치료적으로 유효한 양" 및 "약학적 유효량"은 기재된 발명의 조성물의 예방적 또는 방지적 양을 포함한다. 기술된 발명의 예방적 또는 방지적 적용에서, 약학적 조성물 또는 약제는 질환, 장애 또는 병태에 걸리기 쉽거나 그렇지 않으면 그 위험이 있는 환자에게, 위험을 제거하거나 감소시키거나, 중증도를 감소시키거나, 또는 질환, 장애 또는 병태, 이의 합병증의 생화학적, 조직학적 및/또는 행동적 증상, 및 질환, 장애 또는 병태의 발달 동안 나타나는 중간 병리학적 표현형을 포함하여, 질환, 장애 또는 병태의 발현을 지연하기에 충분한 양으로 투여된다. 일반적으로 일부 의학적 판단에 따른 최대 용량, 즉 가장 안전한 최고 용량을 사용하는 것이 바람직하다. 용어 "용량" 및 "투여량"은 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용된다.

본 명세서에 사용된 용어 "치료적 효과"는 치료의 결과를 지칭하며, 그 결과는 바람직하고 유익한 것으로 판단된다. 치료적 효과는 질환 징후의 정지, 감소 또는 제거를 직접적 또는 간접적으로 포함할 수 있다. 치료적 효과는 또한 질환 징후의 진행의 정지 감소 또는 제거를 직접적 또는 간접적으로 포함할 수 있다.

본 명세서에 기재된 임의의 치료제에 대해 치료 유효량은 초기에 예비 시험관내 연구 및/또는 동물 모델로부터 결정될 수 있다. 치료 유효 용량은 또한 인간 데이터로부터 결정될 수 있다. 적용되는 용량은 투여된 화합물의 상대적인 생체이용률 및 효능에 기반하여 조정될 수 있다. 상기에서 기술된 방법 및 기타 잘-알려진 방법을 기반으로 최대 효능을 달성하기 위해 용량을 조정하는 것은 통상적으로 숙련된 기술자의 능력 범위 내에 있다.

본 명세서에 참조로 포함된 Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th Edition, McGraw-Hill (New York) (2001)의 1장에서 찾을 수 있는 치료적 효과를 결정하기 위한 일반 원칙은 아래에 요약되어 있다.

약동학적 원리는 허용할 수 없는 부작용을 최소화하면서 원하는 정도의 치료적 효능을 얻기 위해 투여량 요법을 변형하기 위한 기초를 제공한다. 약물의 혈장 농도를 측정할 수 있고 치료적 윈도우와 관련할 수 있는 상황에서, 투여량 조절에 대한 추가 지침을 얻을 수 있다.

약물 생성물이 동일한 활성 성분을 함유하고 강도 또는 농도, 투여량 형태 및 투여의 경로가 동일한 경우 약학적 등가물로 간주된다. 두 생성물에서 활성 성분의 생체이용률의 비율과 정도가 적절한 시험 조건 하에서 유의하게 다르지 않은 경우 두 약학적으로 동등한 약물 생성물은 생물학적 등가물인 것으로 간주된다.

용어 "치료적 윈도우"는 허용할 수 없는 독성 없이 치료적 효능을 제공하는 농도 범위를 지칭한다. 일정 용량의 약물의 투여에 이어, 그 효과는 일반적으로 특징적인 일시적 패턴을 나타낸다. 약물 농도가 원하는 효과에 대한 최소 유효 농도("MEC")를 초과하기 전에 지연 기간이 존재한다. 반응의 발현에 이어, 약물이 계속 흡수되고 분포됨에 따라 효과의 강도가 증가한다. 이것은 피크에 도달한 후 약물 제거로 인해 약물 농도가 다시 MEC 아래로 떨어질 때 사라지는 효과의 강도에서 감소를 초래한다. 따라서, 약물의 작용의 지속시간은 농도가 MEC를 초과하는 기간에 의해 결정된다. 치료적 목표는 최소한의 독성으로 원하는 반응에 대한 치료적 윈도우 내에서 농도를 얻고 유지하는 것이다. 원하는 효과에 대한 MEC 미만의 약물 반응은 치료 미만일 것이고, 반면 부작용의 경우 독성의 가능성은 MEC 이상으로 증가할 것이다. 약물 투여량을 늘리거나 줄이면 반응 곡선이 강도 척도를 위아래로 이동하고 약물의 효과를 조절하는 데 사용된다. 용량을 늘리면 또한 약물의 작용 기간이 연장되지만 부작용의 가능성이 증가할 위험이 있다. 따라서, 약물이 비독성이지 않는 한, 용량을 늘리는 것은 약물의 작용 기간을 연장하는 데 유용한 전략이 아니다.

대신, 치료적 윈도우 내에서 농도를 유지하기 위해 다른 용량의 약물이 제공되어야 한다. 일반적으로, 약물의 치료적 범위의 하한은 최대의 가능한 치료적 효과의 약 절반을 생성하는 약물 농도와 대략적으로 동일한 것으로 나타나고, 치료적 범위의 상한은 약 5% 내지 약 10% 이하의 환자가 독성 효과를 경험할 것이도록 된다. 이들 수치는 매우 가변적일 수 있고, 일부 환자는 치료적 범위를 초과하는 약물 농도로부터 큰 이점을 얻을 수 있는 반면 다른 환자는 훨씬 더 낮은 값에서 상당한 독성을 겪을 수 있다. 치료적 목표는 치료적 윈도우 내에서 정상-상태 약물 수준을 유지하는 것이다. 대부분의 약물에 대해 이 원하는 범위와 연관된 실제 농도는 알 수 없고 알 필요도 없으며, 효능과 독성은 일반적으로 농도-의존적이다는 것과 약물 투여량과 투여의 빈도가 약물 수준에 어떻게 영향을 미치는지를 이해하는 것으로 충분하다. 효능과 독성을 초래하는 농도 사이에 작은(2- 내지 3-배수) 차이가 있는 소수의 약물에 대해 효과적인 치료와 연관된 혈장-농도 범위가 정의되었다.

이 경우, 표적 수준 전략이 합리적이며, 여기서 효능 및 최소 독성과 연관된 약물(일반적으로 혈장 내)의 원하는 표적 정상-상태 농도가 선택되고, 이 값을 달성할 것으로 예상되는 투여량이 계산된다. 약물 농도가 후속적으로 측정되고 필요한 경우 표적에 더 가깝게 근접하도록 투여량이 조정된다.

대부분의 임상 상황에서, 약물은 치료적 윈도우와 연관된 약물의 정상-상태 농도를 유지하기 위해 일련의 반복적인 용량으로 또는 연속 주입으로 투여된다. 선택된 정상-상태 또는 표적 농도("유지 용량")를 유지하기 위해, 약물 투여의 속도는 투입 속도가 손실 속도와 같도록 조정된다. 임상의가 원하는 혈장에서의 약물 농도를 선택하고 특정 환자에서 그 약물의 클리어런스와 생체이용률을 알고 있다면, 적절한 용량과 투여 간격을 계산할 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "치료하는"은 병태의 진행을 폐지, 실질적으로 억제, 감속 또는 역전시키거나, 병태의 임상 증상을 실질적으로 개선하거나, 또는 병태의 임상 증상의 출현을 실질적으로 예방하는 것을 포함한다. 치료하는 것은 추가로 다음 중 하나 이상을 달성하는 것을 지칭한다: (a) 장애의 중증도를 감소시키는 것; (b) 치료되는 장애(들)의 특징적인 증상의 발달을 제한하는 것; (c) 치료되는 장애(들)의 특징적인 증상의 악화를 제한하는 것; (d) 이전에 장애(들)가 있었던 환자에서 장애(들)의 재발을 제한하는 것; 및 (e) 이전에 장애(들)에 대해 무증상이었던 환자에서 증상의 재발을 제한하는 것.

본 명세서에 사용된 "종양"은 악성이든 양성이든지 모든 신생물 세포 성장 및 증식, 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 의미한다.

본 명세서에 사용된 용어 "종양 부하" 및 "종양 하중"은 암 세포의 수, 종양의 크기, 또는 체내 암의 양을 지칭한다.

본 명세서에 사용된 용어 "백신접종된"은 백신으로 치료받는 것을 지칭한다.

본 명세서에 사용된 용어 "백신접종"은 백신으로 치료하는 것을 지칭한다.

본 명세서에 사용된 용어 "백신"은 면역계가 종양 또는 미생물에 반응하게 하거나, 신체가 암 세포 또는 미생물을 인식하고 파괴하도록 돕는 것을 의미하는 물질 또는 물질 그룹을 지칭한다. 백신이라는 용어는 또한 그러한 노출(예를 들어, 감염원, 암세포)에 대한 강력한 면역 반응을 자극하는 데 사용되는 인위적인 자극을 지칭한다.

본 명세서에 사용된 용어 "백신 요법"은 종양 또는 감염성 미생물을 파괴하도록 면역계를 자극하는 물질 또는 물질 그룹을 사용하는 치료 유형을 지칭한다.

본 명세서에 사용된 용어 "변이체"는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 삽입 또는 다른 변형에 의해 원래 단백질과 다른 폴리펩티드를 지칭한다. 이러한 변형은 원래 단백질의 생물학적 활성을 크게 변화시키지 않는다. 많은 경우에, 변이체는 원래 단백질의 생물학적 활성의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100%를 보유한다. 변이체의 생물학적 활성도 원래 단백질의 활성보다 높을 수 있다. 변이체는 대립형질 변이 또는 다형성과 같이 자연적으로 발생하거나 의도적으로 조작될 수 있다.

변이체의 아미노산 서열은 원래 단백질의 아미노산 서열과 실질적으로 동일하다. 많은 실시형태에서, 변이체는 원래 단백질과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 그 이상의 전체적인 서열 동일성 또는 유사성을 공유한다. 서열 동일성 또는 유사성은 염기 국소 정렬 도구(BLAST), 도트 매트릭스 분석 또는 동적 프로그래밍 방법과 같은 당업계에 공지된 다양한 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 한 예에서, 서열 동일성 또는 유사성은 유전학 컴퓨터 그룹(GCG) 프로그램 GAP(Needleman-Wunsch 알고리즘)를 사용하여 결정된다. 변이체와 원래 단백질의 아미노산 서열은 하나 이상의 영역에서 실질적으로 동일할 수 있지만, 다른 지역에서 다양할 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "야생형"은 유기체, 균주, 유전자, 단백질, 핵산 또는 자연에서 발생하는 특성의 전형적인 형태를 지칭한다. 야생형은 자연 개체군에서 가장 흔한 표현형을 지칭한다. 용어들 "야생형" 및 "자연 발생"은 상호교환적으로 사용된다.

II. 동종 백신

본 개시내용은 외인성 면역조절 분자를 발현하는 종양 세포를 포함하는 동종 종양 세포 백신, 및 면역 반응을 자극하기 위해 동종 종양 세포 백신을 사용하는 방법을 특징으로 한다. 백신 단백질은 기재된 발명에서, 예를 들어 암이나 전염병의 치료에서 사용되는 면역 반응을 유도할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 본 명세서에 기재된 동종 종양 세포 백신은 전신 염증 없이 생체내에서 표적 종양 항원을 포함하는 종양 세포를 인식하고 그에 대해 작용하기에 효과적인 세포의 면역 활성화를 향상시키고; 표적 종양 항원을 포함하는 종양 세포에 대한 종양 미세환경에서 면역억제를 감소시키고; 또는 표적 종양 항원을 발현하는 종양 세포의 세포 사멸을 증가시키는데 효과적이다. 일부 실시양형에 따르면, 본 명세서에 기재된 동종 종양 세포 백신은 전신 염증 없이 면역 활성화가 가능하다.

일부 양태에 따르면, 본 개시내용은 (1) 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식-불능 종양 세포의 모집단으로서, 상기 종양 세포가 T 림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 자극하도록 유전적으로 조작되는, 모집단으로서, (a) T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구를 자극하기에 충분한 다수의 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자를 포함하는 모집단; 및 (2) 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 동종 종양 세포 백신을 특징으로 한다.

종양 특이적 항원

일부 실시형태에 따르면, 본 개시내용은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식-불능 종양 세포의 모집단을 제공한다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 특이적 항원은 정상 조직이 아닌 종양에 의해 차등적으로 발현되는 유전자 산물의 일차 오픈 리딩 프레임에 의해 인코딩될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 특이적 항원은 돌연변이된 유전자, 인트론 서열, 또는 번역된 대안적 오픈 리딩 프레임, 유사유전자, 안티센스 가닥에 의해 인코딩될 수 있거나, 또는 유전자 전위 이벤트의 생성물을 나타낼 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포는 넓은 범위의 종양 특이적 항원을 제공하며, 이들 중 다수는 특성이 알려져 있지 않다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 항원은 신생항원이다.

일부 실시형태에 따르면, 종양 특이적 항원은 하기 그룹들: (a) 비돌연변이된 공유 항원(예를 들어, 흑색종-연관된 항원(MAGE), B-흑색종 항원(BAGE), 신장 종양 항원(RAGE), 및 암 고환 항원(예를 들어, NY-ESO); (b) 분화 항원(예를 들어, 전립선 암종에서 전립선-특이적 막 항원[PSMA] 및 전립선-특이적 항원(PSA), 많은 흑색종에 존재하는 Mart1/MelanA 및 티로시나제, 및 결장암의 큰 백분율로 존재하는 암 배아 항원(CEA))으로, 이는 조직이 제한적이고 계통-특이적 종양 세포에 존재하는, 항원; (c) 면역 인식을 위한 새로운 에피토프를 제공하는, 돌연변이된 종양유전자 및 종양 억제 유전자(예를 들어, 돌연변이된 ras, 재배열된 bcr/abl, 돌연변이된 p53); (d) 고유한 이디오타입(예를 들어, 골수종 및 B-세포 골수종에서 면역글로불린 항원, CTCL에서 발현되는 T-세포 수용체(TCR)), (e) 종양바이러스-유래된 에피토프(예를 들어, 인유두종바이러스-인코딩된 E6 및 E7 단백질, 일차 뇌 림프종에 존재하는 엡스타인-바 바이러스-연관된 항원); 및 (f) CEA, α-태아단백질 및 서바이빈과 같은 돌연변이되지 않은 종양태아 단백질 중 하나로부터 선택된다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 특이적 항원은 공개적으로 이용가능한 암 항원 펩티드 데이터베이스(그 전체가 참고로 본 명세서에 포함된, caped.icp.ucl.ac.be/Peptide/list에서의 전세계 웹)에 열거된 항원으로부터 선택된다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 특이적 항원은 하기에 나타낸 표 1에 제시된 항원으로부터 선택된다.

일부 실시형태에 따르면, 종양 세포는 흑색종, 결장직장 암종, 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 전립선암, 두경부암, 편평세포암종, 설암, 후두암, 편도암, 하인두암, 비인두암, 유방암, 결장암, 폐암, 췌장암, 교모세포종 및 뇌암으로 구성된 군으로부터 선택된 암에서 유래된다.

일부 실시형태에 따르면, 흑색종 종양 세포는 gp100, 티로시나제, Melan-A, 티로시나제-연관 단백질(TRP-2-INT2), 흑색종 항원-1(MAGE-A1), NY-ESO-1, 흑색종 항원(PRAME) CDK4 및 다발성 골수종 암유전자 1(MUM-1)의 우선적으로 발현된 항원 중 하나 이상의 발현을 특징으로 한다.

일부 실시형태에 따르면, 결장직장암 종양 세포는 암배아 항원(CEA), MAGE, HPV, 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT), EPCAM, PD-1, PD-L1, p53, 세포 표면-연관된 뮤신 1(MUC1) 중 하나 이상의 발현을 특징으로 한다.

면역학적 항원 특이성은 항원의 아미노산 서열 중 하나 이상, 종양 세포에 의한 해당 항원의 발현의 정도, 항원의 번역-후 변형 등으로부터 발생할 수 있다.

특정 유형의 암 세포에 대한 면역학적 항원 특이성은 또한 복수의 종양 항원의 특정 지문 중 하나 이상, 다양한 종양 세포에 의해 발현되지만 특정 항원이 더 적은 수의 종양 유형에 대한 면역요법에서 특정 용도를 갖는다는 사실, MHC 클래스 I 제시가능 및 MHC 클래스 II 제시가능 에피토프의 특정 집합이 특정 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 단편 상에 존재한다는 사실로부터, 그리고 면역관용을 유발할 수 있는 하나 이상의 펩티드를 생략함에 의해 발생할 수 있다. 숙련된 기술자는, 예를 들어 미국 정부 웹사이트, ncbi.nlm.nih에서 관련 핵산 및 폴리펩티드 서열을 찾을 수 있다.

일부 실시형태에 따르면, 종양 세포는 대상체로부터의 샘플로부터 유래된다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포는 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체로부터 유래된다.

일부 실시형태에 따르면, 본 발명의 종양 항원 특이성은 면역조절제로 변형을 위해 선택된 모 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체에 의해 결정될 수 있다.

모 세포주

일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 공개적 공급원(예를 들어, NIH, Charles River Laboratories Inc.에 의해 운영되는 DCTD Tumor Repository) 또는 상업적 공급원(예를 들어, ATCC, Sigma Alrich, Thermo Fischer Scientific, Genescript, DSM2) 중 어느 하나에서 확립된 세포주로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 암 환자의 종양으로부터 유래된 종양 세포로부터 새로운 세포주가 새로이 확립될 수 있다.

일부 실시형태에 따르면, 암 조직, 암 세포, 암-유발제로 감염된 세포, 기타 종양전 세포, 및 인간 기원의 세포주가 공급원으로서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 암 세포는 확립된 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체, 예컨대, 제한 없이, 확립된 비-소세포 폐 암종(NSCLC), 방광암, 흑색종, 난소암, 신세포 암종, 전립선 암종, 육종, 유방 암종, 편평 세포 암종, 두경부 암종, 간세포 암종, 췌장 암종, 또는 결장 암종 세포주로부터의 것일 수 있다.

일부 실시형태에 따르면, 확립된 세포주는 LNCaP 클론 FGC(ATCC CRL-1740)를 포함하며, 이는 그 자체가 림프절로 이동한 전이성 전립선암으로부터 유래된다. 일부 실시형태에 따르면, 확립된 세포주는 PC-3(ATCC CRL-1435) 세포주를 포함하며, 이는 그 자체가 뼈로 이동한 전이성 전립선암으로부터 유래된다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 다음의 ATCC 세포주 중 하나 이상으로부터 유래된다: VCaP(ATCC CRL-2876); MDA PCa 2b(ATCC CRL-2422); 또는 DU 145(ATCC HTB-81).

일부 실시형태에 따르면, 확립된 세포주는 SK-MEL-2 클론(ATCC HTB-68)을 포함하며, 이는 그 자체가 허벅지의 피부에 대한 전이로부터 유래된다.

일부 실시형태에 따르면, 확립된 세포주는 COO-G, DU4475, ELL-G, HIG-G, MCF/7, MDA-MB-436, MX-1, SW-613 및 VAN-G로 지정된 유방 암종 세포주 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 확립된 세포주는 ASPS 및 ASPS-1로 지정된 폐포 연부 육종 세포주 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 확립된 세포주는 LX-1, COS-G, H-MESO-1, H-MESO-1A, NCI-H23, 및 NCI-H460으로 지정된 하나 이상의 폐 세포주를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 확립된 세포주는 CX-5, GOB-G, HCC-2998, HCT-15, KLO-G, KM20L2, MRI-H-194, LOVO I, LOVO II, 및 MRI-H-250으로 지정된 하나 이상의 결장암 세포주를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 확립된 세포주는 NIS-G, TRI-G, WIL-G, MRI-H-121B, MRI-H-187, MRI-H-221, 및 MRI-H-255로 지정된 하나 이상의 흑색종 세포주를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 확립된 세포주는 MRI-H-177, MRI-H-186, MRI-H-196, 및 MRI-H-215로 지정된 하나 이상의 자궁경부암 세포주를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 확립된 세포주는 MRI-H-121 및 MRI-H-166으로 지정된 하나 이상의 신장암 세포주를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 확립된 세포주는 MRI-H-147 및 MRI-H-220으로 지정된 하나 이상의 자궁내막암 세포주를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 확립된 세포주는 MRI-H-258, MRI-H-273, MRI-H-1834, 및 SWA-G로 지정된 하나 이상의 난소암 세포주를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 확립된 세포주는 HS-1, OGL-G, 및 DEL-G로 지정된 하나 이상의 육종 세포주를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 확립된 세포주는 DEAC-1로 지정된 표피 세포주를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 확립된 세포주는 SF 295로 지정된 교모세포종 세포주를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 확립된 세포주는 CWR-22로 지정된 전립선암 세포주를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 확립된 세포주는 DAU로 지정된 버킷 림프종 세포주를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 본 명세서에 기재된 상기한 확립된 세포주는, 예를 들어, 미국 타입 배양 컬렉션(ATCC), 세포 배양의 유럽 컬렉션(ECACC) 또는 부다페스트 조약 제7조에 따라 국제 기탁 기관(IDA)으로 등재된 임의의 기탁소로부터 상업적으로 입수가능하다.

일부 실시형태에 따르면, 예시적인 확립된 세포주는 하기 나타낸 하기 세포주 중 하나 이상을 포함한다:

일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체가 유래될 수 있는 모 세포주의 선택은 동종 백신의 특이성에 영향을 미친다. 예를 들어, 환자의 뼈로 이동한 전이성 전립선암에서 유래한 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체의 사용은 환자의 뼈에서 전이성 전립선암에 특이적인 면역 반응을 유도하는 동종 백신을 초래할 수 있다.

일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 보편적인 암 특이적 항원을 포함하는 모 세포로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 환자의 뼈로 이동한 전이성 전립선암에서 유래한 모 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체의 사용은 모든 전립선암 세포에 대한 면역 반응을 유도하는 동종 백신을 초래할 수 있다.

일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 다양한 암으로부터 유래된 환자 유래 세포로부터 유래된다. 일부 실시형태에 따르면, 종양으로부터 외과적으로 제거된 신선한 조직은 유형 IV 콜라게나제에 의해 효소적으로 소화된 후 분해된 세포의 수집이 이어진다. 일부 실시형태에 따르면, 분해된 세포는 그 다음 부착을 촉진하기 위해 세포외 기질 물질, 예컨대 콜라겐 또는 피브로넥틴 상의 10% 소 태아 혈청을 갖는 성장 배지에서 시험관내 성장될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 부착성 세포는 그 다음 불멸의 암 세포가 비-암성 섬유아세포 세포를 능가할 때까지 계대될 수 있다.

예를 들어, 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 암 줄기 세포를 포함하는 종양 세포를 포함하는 고형 종양, 암 줄기 세포를 포함하는 전이성 종양 세포를 포함하는 전이성 암, 또는 비-전이성 암으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 암은 방광, 혈액, 뼈, 골수, 뇌, 유방, 결장, 식도, 십이지장, 소장, 대장, 결장, 직장, 항문, 잇몸, 머리, 신장, 간, 폐, 비인두, 목, 난소, 전립선, 피부, 위, 고환, 혀 또는 자궁에서 기원할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 암은 조직학적 유형, 예를 들어 피부 또는 내부 장기를 라이닝하거나 덮는 조직에서 시작하는 암(암종); 연골, 지방, 근육, 혈관 및 섬유 조직을 포함한 신체의 뼈 또는 연조직에서 시작하는 암(육종); 혈액-형성 조직에서 시작하는 암(백혈병); 면역계의 세포에서 시작하는 암(림프종); 형질 세포에서 발생하는 암(골수종) 또는 뇌/척수암의 것일 수 있다.

암종의 예는, 제한 없이 거대 세포 및 방추 세포 암종; 소세포 암종; 유두 암종; 편평 세포 암종; 림프상피 암종; 기저 세포 암종; 모기질 암종; 이행 세포 암종; 유두 이행 세포 암종; 선암종; 가스트린종, 담관암종; 간세포 암종; 결합된 간세포 암종 및 담관암종; 섬유주 선암종; 선양 낭성 암종; 샘종성 폴립의 선암종; 선암종, 가족성 용종증 대장균; 고형 암종; 카르시노이드 종양; 분지-폐포 선암종; 유두 선암종; 발색단 암종; 호산구 암종; 호산성 선암종; 호염기구 암종; 투명 세포 선암종; 과립 세포 암종; 여포 선암종; 비-피막 경화성 암종; 부신 피질 암종; 자궁내막 암종; 피부 부속기 암종; 아포크린 선암종; 피지성 선암종; 귀지 선암종; 점막표피양 암종; 낭선암종; 유두낭선암종; 유두상 장액성 낭선암종; 점액성 낭선암종; 점액성 선암종; 인장 고리 세포 암종; 침윤성 도관 암종; 수질 암종; 소엽 암종; 염증성 암종; 유선 포상 세포 암종인 파제트병; 선편평 암종; 선암종 w/편평상피화생; 세르톨리 세포 암종; 배아 암종; 융모막암종을 포함한다.

육종의 예는, 제한 없이 사구체육종; 육종; 섬유육종; 점액육종; 지방육종; 평활근육종; 횡문근육종; 배아 횡문근육종; 폐포 횡문근육종; 기질 육종; 암육종; 활액 육종; 혈관육종; 카포시 육종; 림프관육종; 골육종; 피질옆 골육종; 연골육종; 중간엽 연골육종; 뼈의 거대 세포 종양; 유윙 육종; 치성 종양, 악성; 변색성 상아육종; 흑색모세포종, 악성; 변색성 섬유육종; 골수 육종; 비만 세포 육종을 포함한다.

백혈병의 예는, 제한 없이 백혈병; 림프성 백혈병; 형질 세포 백혈병; 적혈구백혈병; 림프육종 세포 백혈병; 골수성 백혈병; 호염기성 백혈병; 호산구성 백혈병; 단핵구 백혈병; 비만 세포 백혈병; 거핵모구성 백혈병; 및 모세포 백혈병을 포함한다.

림프종 및 골수종의 예는, 제한 없이 악성 림프종; 호지킨병; 호지킨스; 부육아종; 악성 림프종, 소림프구성; 악성 림프종, 대세포, 미만성; 악성 림프종, 여포; 균상 식육종; 기타 특정 비-호지킨 림프종; 악성 흑색종; 무색소성 흑색종; 표재성 확산 흑색종; 거대 색소 모반의 악성 흑색종; 상피세포 흑색종; 다발성 골수종을 포함한다.

뇌/척수암의 예는, 제한 없이 송과종, 악성; 척색종; 신경교종, 악성; 뇌실막종; 성상세포종; 원형질 성상세포종; 원섬유성 성상세포종; 성상모세포종; 교모세포종; 희소돌기아교종; 희소돌기모세포종; 원시 신경외배엽; 소뇌 육종; 신경절신경모세포종; 신경모세포종; 망막모세포종; 후각 신경성 종양; 수막종, 악성; 신경섬유육종; 신경염, 악성을 포함한다.

다른 암의 예는, 제한 없이 흉선종; 난소 기질 종양; 코마; 과립막 세포 종양; 남성모세포종; 라이딕 세포 종양; 지질 세포 종양; 부신경절종; 유방-외 부신경절종; 갈색세포종; 청색 모반, 악성; 섬유성 조직구종, 악성; 혼합된 종양, 악성; 뮬러 혼합된 종양; 신모세포종; 간모세포종; 간엽종, 악성; 브레너 종양, 악성; 엽상 종양, 악성; 중피종, 악성; 이상생식세포종; 기형종, 악성; 난소 기질, 악성; 중신종, 악성; 혈관내피종, 악성; 혈관주위세포종, 악성; 연골모세포종, 악성; 과립 세포 종양, 악성; 악성 조직구증; 면역증식성 소장 질환을 포함한다.

임의의 주어진 종양 유형에 대해, 여러 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체가 상업적으로 이용가능할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 전체 세포의 혼합물로서 또는 전체 세포의 혼합물 이외 막 제제를 제조함에 의해 몇 가지의 이들 세포주의 풀링은 그 종양 유형에 대한 세포 표면 종양 항원의 배열을 제공할 수 있다.

일부 실시형태에 따르면, 종양 세포 또는 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 방사선 조사에 의해 증식 불능화된다.

외인성 면역조절 분자

일부 실시형태에 따르면, 개시된 발명의 외인성 면역조절 분자는 단독으로 또는 다른 외인성 면역조절 분자와 조합하여 면역 세포의 자극을 매개하는 폴리펩티드이다. 일부 실시형태에 따르면, 개시된 발명의 외인성 면역조절 분자는 단독으로 또는 다른 외인성 면역조절 분자와 조합하여 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구의 자극을 매개하는 폴리펩티드이다. 일부 실시형태에 따르면, NK 세포는 기억-유사 NK 세포이다. 일부 실시형태에 따르면, T 림프구는 세포독성 T-림프구(CTL)(CD8+ T 세포)이다. 일부 실시형태에 따르면, T 림프구는 기억 T 세포이다. 일부 실시형태에 따르면, T 림프구는 조절 T 세포이다. 일부 실시형태에 따르면, T 림프구는 헬퍼 T 세포이다. 일부 실시형태에 따르면, B 림프구는 기억 B 세포이다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포의 모집단을 포함하는 외인성 면역조절 분자가 하나 초과의 유형의 면역 세포를 자극하는 데 효과적이다는 것, 예를 들어, 본 개시내용의 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하는 동종 종양 백신이 T-림프구(예를 들어, CD8+ T 세포), 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 자극하는 데 효과적이다는 것이 본 발명의 특징이다.

일부 실시형태에 따르면, 면역 세포를 자극하는 것은 면역 세포의 확장을 지칭한다. 일부 실시형태에 따르면, 면역 세포를 자극하는 것은 면역 세포의 활성화를 지칭한다. 일부 실시형태에 따르면, 면역 세포를 자극하는 것은 면역 세포의 세포독성에서 증가를 지칭한다. 일부 실시형태에 따르면, 면역 세포를 자극하는 것은 면역 세포의 확장, 활성화 및/또는 증가된 세포독성 중 하나 이상의 조합을 지칭한다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포의 모집단에 의해 발현되는 하나 이상의 외인성 면역조절 분자는 면역 세포(예를 들어, T-림프구(예를 들어, CD8+T 세포), 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구)를 생체외에서 활성화 및/또는 확장하는 데 효과적이다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포의 모집단에 의해 발현되는 하나 이상의 외인성 면역조절 분자는 면역 사멸 세포(예를 들어, T-림프구(예를 들어, CD8+T 세포), 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구)를 생체내에서 활성화 및/또는 확장하는 데 효과적이다. 외인성 면역자극 분자가 면역 사멸 세포를 자극하는 데 효과적인지를 검출하기 위한 검정이 본 명세서에 기재되어 있다. 일 양태에 따르면, 따라서 본 개시내용은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하는 동종 종양 세포 백신을 제공하며, 여기서 종양 세포는 T 림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 자극하도록 유전적으로 조작되며, 복수의 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자를 포함하는 모집단이 T-림프구(예를 들어, CD8+ T 세포), 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구를 자극하는 데 충분하다.

일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하고, 여기서 종양 세포는 T 림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 자극하도록 유전적으로 조작되며, 모집단은 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구를 자극하는데 효과적인 적어도 3개의 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하고, 여기서 종양 세포는 T 림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 자극하도록 유전적으로 조작되며, 모집단은 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구를 자극하는데 효과적인 적어도 4개의 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하고, 여기서 종양 세포는 T 림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 자극하도록 유전적으로 조작되며, 모집단은 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구를 자극하는데 효과적인 적어도 5개의 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하고, 여기서 종양 세포는 T 림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 자극하도록 유전적으로 조작되며, 모집단은 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구를 자극하는데 효과적인 적어도 5개의 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하고, 여기서 종양 세포는 T 림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 자극하도록 유전적으로 조작되며, 모집단은 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구를 자극하는데 효과적인 적어도 6개의 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하고, 여기서 종양 세포는 T 림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 자극하도록 유전적으로 조작되며, 모집단은 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구를 자극하는데 효과적인 적어도 7개의 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하고, 여기서 종양 세포는 T 림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 자극하도록 유전적으로 조작되며, 모집단은 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구를 자극하는데 효과적인 적어도 8개의 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하고, 여기서 종양 세포는 T 림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 자극하도록 유전적으로 조작되며, 모집단은 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구를 자극하는데 효과적인 적어도 9개의 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하고, 여기서 종양 세포는 T 림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 자극하도록 유전적으로 조작되며, 모집단은 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구를 자극하는데 효과적인 적어도 10개의 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하고, 여기서 종양 세포는 T 림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 자극하도록 유전적으로 조작되며, 모집단은 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구를 자극하는데 효과적인 적어도 11개의 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하고, 여기서 종양 세포는 T 림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 자극하도록 유전적으로 조작되며, 모집단은 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구를 자극하는데 효과적인 적어도 12개의 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하고, 여기서 종양 세포는 T 림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 자극하도록 유전적으로 조작되며, 모집단은 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구를 자극하는데 효과적인 적어도 13개의 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하고, 여기서 종양 세포는 T 림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 자극하도록 유전적으로 조작되며, 모집단은 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구를 자극하는데 효과적인 적어도 14개의 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하고, 여기서 종양 세포는 T 림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 자극하도록 유전적으로 조작되며, 모집단은 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구를 자극하는데 효과적인 적어도 15개의 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하고, 여기서 종양 세포는 T 림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 자극하도록 유전적으로 조작되며, 모집단은 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구를 자극하는데 효과적인 적어도 16개의 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하고, 여기서 종양 세포는 T 림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 자극하도록 유전적으로 조작되며, 모집단은 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구를 자극하는데 효과적인 적어도 17개의 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하고, 여기서 종양 세포는 T 림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 자극하도록 유전적으로 조작되며, 모집단은 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구를 자극하는데 효과적인 적어도 18개의 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하고, 여기서 종양 세포는 T 림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 자극하도록 유전적으로 조작되며, 모집단은 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구를 자극하는데 효과적인 적어도 19개의 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하고, 여기서 종양 세포는 T 림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 자극하도록 유전적으로 조작되며, 모집단은 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구를 자극하는데 효과적인 적어도 20개의 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하고, 여기서 종양 세포는 T 림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 자극하도록 유전적으로 조작되며, 모집단은 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구를 자극하는데 효과적인 적어도 21개의 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하고, 여기서 종양 세포는 T 림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 자극하도록 유전적으로 조작되며, 모집단은 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구를 자극하는데 효과적인 적어도 22개의 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하고, 여기서 종양 세포는 T 림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 자극하도록 유전적으로 조작되며, 모집단은 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구를 자극하는데 효과적인 적어도 23개의 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하고, 여기서 종양 세포는 T 림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 자극하도록 유전적으로 조작되며, 모집단은 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구를 자극하는데 효과적인 적어도 24개의 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하고, 여기서 종양 세포는 T 림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 자극하도록 유전적으로 조작되며, 모집단은 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구를 자극하는데 효과적인 적어도 25개의 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하고, 여기서 종양 세포는 T 림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 자극하도록 유전적으로 조작되며, 모집단은 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구를 자극하는데 효과적인 적어도 26개의 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하고, 여기서 종양 세포는 T 림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 자극하도록 유전적으로 조작되며, 모집단은 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구를 자극하는데 효과적인 적어도 27개의 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하고, 여기서 종양 세포는 T 림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 자극하도록 유전적으로 조작되며, 모집단은 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구를 자극하는데 효과적인 적어도 28개의 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하고, 여기서 종양 세포는 T 림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 자극하도록 유전적으로 조작되며, 모집단은 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구를 자극하는데 효과적인 적어도 29개의 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하고, 여기서 종양 세포는 T 림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 자극하도록 유전적으로 조작되며, 모집단은 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구를 자극하는데 효과적인 적어도 30개의 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자를 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하고, 여기서 종양 세포는 T 림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 자극하도록 유전적으로 조작되며, 모집단은 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구를 자극하는데 효과적인 3개의 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자의 발현을 특징으로 한다.

일부 실시형태에 따르면, 종양 세포의 모집단은 제1 외인성 면역조절 분자 및 제2 외인성 면역조절 분자를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포의 모집단은 제1 외인성 면역조절 분자, 제2 외인성 면역조절 분자 및 제3 외인성 면역조절 분자를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 제1 외인성 면역조절 분자 및 제2 외인성 면역조절 분자는 키메라 또는 융합 분자, 예를 들어 2개 이상의 개별 유전자의 결합을 통해 생성된 분자를 포함하고, 이들 각각은 유전자가 단일 단위로 전사되고 번역되어 단일 폴리펩티드를 생성하도록 단백질의 적어도 하나의 도메인을 인코딩한다. 일부 실시형태에 따르면, 본 명세서에 기재된 동종 백신은 하나 이상의 외인성 면역조절 분자를 포함하는 종양 세포를 포함하며, 여기서 제1 종양 세포 또는 종양 세포의 모집단은 제1 면역조절 분자를 포함하고, 제2 종양 세포 또는 종양 세포의 모집단은 제2 면역조절 분자를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 본 명세서에 기재된 동종 백신은 하나 이상의 외인성 면역조절 분자를 포함하는 종양 세포를 포함하며, 여기서 제1 종양 세포 또는 종양 세포의 모집단은 제1 및 제2 면역조절 분자를 포함하고, 제2 종양 세포 또는 종양 세포의 모집단은 제3 면역조절 분자를 포함한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 외인성 면역조절 분자는 시스(모두 동일한 세포 상에) 또는 트랜스(각각, 또는 각각의 조합으로, 상이한 세포 상에)로 종양 세포 모집단에 존재할 수 있는 것으로 이해된다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역자극 분자는 유전적으로 조작된 종양 세포의 표면에 제시된다.

일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자는 특히 항종양 면역 반응을 개시하고/하거나 항종양 면역 반응을 지속하는 능력 및/또는 암 환자에게 특징적으로 존재하는 기존 면역 억제하는 능력, 또는 세 가지 모두의 조합으로부터 선택된다. 일부 실시형태에 따르면, 면역조절 분자의 조합은 인간 혼합된 림프구 종양 세포 반응에 의해 평가되고 선택된다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자는 사이토카인, TNF-패밀리 구성원, 분비된 수용체, 샤페론, IgG 슈퍼패밀리 구성원 및 케모카인 수용체로부터 선택된다.

일부 실시형태에 따르면, 본 개시내용의 동종 종양 세포 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하며, 여기서 종양 세포는 T 림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 자극하도록 유전적으로 조작되며, 상기 모집단은 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구를 자극하기에 효과적인 다수의 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자를 포함하고, 여기서 상기 외인성 면역조절 분자는 하나 이상의 사이토카인 단백질을 포함하고; 여기서 상기 외인성 면역조절 분자는 하나 이상의 TNF 패밀리 구성원 단백질을 포함하고; 여기서 상기 외인성 면역조절 분자는 하나 이상의 분비된 수용체 단백질을 포함하고; 여기서 상기 외인성 면역조절 분자는 하나 이상의 샤페론 단백질을 포함하고; 여기서 상기 외인성 면역조절 분자는 하나 이상의 IgG 슈퍼패밀리 구성원 단백질을 포함하고; 및/또는 여기서 상기 외인성 면역조절 분자는 하나 이상의 케모카인 수용체 단백질을 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 본 개시내용의 동종 종양 세포 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하며, 여기서 종양 세포는 T 림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 자극하도록 유전적으로 조작되며, 모집단은 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구를 자극하는데 효과적인 복수의 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자를 포함하며, 여기서 외인성 면역조절 분자는 하나 이상의 사이토카인 패밀리 구성원 단백질 및 하나 이상의 TNF 패밀리 구성원 단백질을 포함하며; 여기서 외인성 면역조절 분자는 하나 이상의 사이토카인 패밀리 구성원 단백질 및 하나 이상의 분비된 수용체 단백질을 포함하며; 여기서 외인성 면역조절 분자는 하나 이상의 사이토카인 패밀리 구성원 단백질 및 하나 이상의 샤페론 단백질을 포함하며; 여기서 외인성 면역조절 분자는 하나 이상의 사이토카인 패밀리 구성원 단백질 및 하나 이상의 IgG 슈퍼패밀리 구성원 단백질을 포함하며; 여기서 외인성 면역조절 분자는 하나 이상의 사이토카인 패밀리 구성원 단백질 및 하나 이상의 케모카인 수용체 단백질을 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 본 개시내용의 동종 종양 세포 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하고, 여기서 종양 세포는 T 림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 자극하도록 유전적으로 조작되며, 모집단은 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구를 자극하는데 효과적인 복수의 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자를 포함하며, 여기서 외인성 면역조절 분자는 하나 이상의 TNF 패밀리 구성원 단백질 및 하나 이상의 분비된 수용체 단백질을 포함하며; 여기서 외인성 면역조절 분자는 하나 이상의 TNF 패밀리 구성원 단백질 및 하나 이상의 샤페론 단백질을 포함하며; 여기서 외인성 면역조절 분자는 하나 이상의 TNF 패밀리 구성원 단백질 및 하나 이상의 IgG 슈퍼패밀리 구성원 단백질을 포함하며; 여기서 외인성 면역조절 분자는 하나 이상의 TNF 패밀리 구성원 단백질 및 하나 이상의 케모카인 수용체 단백질을 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 본 개시내용의 동종 종양 세포 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하고, 여기서 종양 세포는 T 림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 자극하도록 유전적으로 조작되며, 모집단은 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구를 자극하는데 효과적인 복수의 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자를 포함하며, 여기서 외인성 면역조절 분자는 하나 이상의 분비된 수용체 단백질 및 하나 이상의 샤페론 단백질을 포함하며; 여기서 외인성 면역조절 분자는 하나 이상의 분비된 수용체 단백질 및 하나 이상의 IgG 슈퍼패밀리 구성원 단백질을 포함하며; 여기서 외인성 면역조절 분자는 하나 이상의 분비된 수용체 단백질 및 하나 이상의 케모카인 수용체 단백질을 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 본 개시내용의 동종 종양 세포 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하며, 여기서 종양 세포는 T 림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 자극하도록 유전적으로 조작되며, 모집단은 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구를 자극하는데 효과적인 복수의 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자를 포함하며, 여기서 외인성 면역조절 분자는 하나 이상의 샤페론 단백질 및 하나 이상의 IgG 슈퍼패밀리 구성원 단백질을 포함하며; 여기서 외인성 면역조절 분자는 하나 이상의 샤페론 단백질 및 하나 이상의 케모카인 수용체 단백질을 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 본 개시내용의 동종 종양 세포 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하며, 여기서 종양 세포는 T 림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 자극하도록 유전적으로 조작되며, 모집단은 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구를 자극하는데 효과적인 복수의 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자를 포함하며, 여기서 외인성 면역조절 분자는 하나 이상의 IgG 슈퍼패밀리 구성원 단백질 및 하나 이상의 케모카인 수용체 단백질을 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자는 면역 자극 분자이다.

일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자는 표 2에 나타낸 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자는 마우스로부터 유래된다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자는 인간으로부터 유래된다.

일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자는 TNF-패밀리 구성원, 분비된 수용체, 샤페론 단백질, IgG 슈퍼패밀리 구성원, 케모카인 수용체 중 하나 이상으로부터 선택된다. 일부 실시형태에 따르면, TNF-패밀리 구성원은 표 2에 열거된 TNF-패밀리 구성원으로부터 선택된다. 일부 실시형태에 따르면, 분비된 수용체는 표 2에 열거된 분비된 수용체로부터 선택된다. 일부 실시형태에 따르면, 샤페론 단백질은 표 2에 열거된 샤페론 단백질로부터 선택된다. 일부 실시형태에 따르면, IgG 슈퍼패밀리 구성원은 표 2에 열거된 IgG 슈퍼패밀리 구성원으로부터 선택된다. 일부 실시형태에 따르면, 케모카인 수용체는 표 2에 열거된 케모카인 수용체로부터 선택된다.

일부 실시형태에 따르면, 표 2의 외인성 면역조절 분자는 막 결합된 형태이다(즉, 막 앵커를 포함함). 다른 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자는 분비된 형태이다. 일부 실시형태에 따르면, 면역조절제의 막 결합된 형태는 4-1BB 리간드, BAFF, April, CD40 리간드, CD80, CD86, Flt3 리간드, GM-CSF, HSP90, ICOS 리간드, IL-12, IL-15, IL-18, IL-2, IL-21, IL-23, IL7, LIGHT, OX40 리간드, RANK 리간드 및 TNF로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상이다. 일부 실시형태에 따르면, 면역조절제의 분비된 형태는 Flt3 리간드, GM-CSF, IL10R, IL7 및 TGF베타 수용체로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상이다.

일부 실시형태에 따르면, 표 2의 외인성 면역조절 분자는 야생형 아미노산 서열을 갖는 분자이다. 일부 실시형태에 따르면, 표 2의 외인성 면역조절 분자는 변이체 아미노산 서열을 갖는 분자이다.

일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자는 4-1BB 리간드, APRIL, BAFF, CD27 리간드, CD30L, CD40 리간드, CD80, CD86, FLT-3 리간드, 막횡단 영역을 제거하도록 조작된 FLT-3 리간드, GM-CSF, CD8 막 앵커 및 IRES 호환 신호 서열로 조작된 GMCSF, HSP-70, HSP-90, ICOS 리간드, IL-10R, IL-12, IL-15, IL-18, IL-2, IL-21, IL-23, IL-7, CD8 막 앵커로 조작된 IL-7, LIGHT, OX-40 리간드, RANK 리간드, TGF-b 수용체, 및 TNF로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상이다.

일부 실시형태에 따르면, 하나 이상의 외인성 면역조절 분자는 적어도 3개의 필수 면역조절 분자를 포함하며, 여기서 적어도 3개의 필수 면역조절 분자는 OX40 리간드(OX40L), CD27 리간드(CD70), 및 CD80, CD86 또는 둘 다를 포함하는 CD28 리간드(CD28L)이다. 일부 실시형태에 따르면, R로 식별된 추가의 면역조절 성분이 또한 존재할 수 있다.

일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 MNC 모집단을 자극하는데 효과적인 하나 이상의 종양 특이적 항원 및 3개의 안정적으로 발현된 필수 외인성 면역조절 분자, OX40L, CD70, 및 CD28L을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 하나 이상의 종양 특이적 항원 및 3개의 안정적으로 발현된 필수 외인성 면역조절 분자, OX40L, CD70, 및 CD80, CD86 또는 둘 다를 포함하는 CD28L을 발현하는 종양 세포의 모집단을 포함하는 ENLIST™ 세포 모집단은 CTL의 상승적 확장을 자극하는 데 효과적이다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 면역조절제를 포함하는 R 면역조절제의 하나 이상의 하위집합을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 종양 세포의 모집단을 포함하며, 여기서 종양 세포는 적어도 3개의 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자 OX40L, CD70, 및 CD80, CD86 또는 둘 다를 포함하는 CD28L 플러스 3-25, 포괄적 면역조절제를 포함하는 하나의 R 하위집합을 안정적으로 발현하도록 유전적으로 조작된다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 종양 세포의 모집단을 포함하며, 여기서 종양 세포는 적어도 3개의 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자 OX40L, CD70, 및 CD80, CD86 또는 둘 다를 포함하는 CD28L 플러스 3-25, 포괄적 면역조절제를 포함하는 2개의 R 하위집합을 안정적으로 발현하도록 유전적으로 조작된다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 종양 세포의 모집단을 포함하며, 여기서 종양 세포는 적어도 3개의 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자 OX40L, CD70, 및 CD80, CD86 또는 둘 다를 포함하는 CD28L 플러스 3-25, 포괄적 면역조절제를 포함하는 3개의 R 하위집합을 안정적으로 발현하도록 유전적으로 조작된다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 종양 세포의 모집단을 포함하며, 여기서 종양 세포는 적어도 3개의 필수 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자 OX40L, CD70, 및 CD80, CD86 또는 둘 다를 포함하는 CD28L 플러스 3-25, 포괄적 면역조절제를 포함하는 4개의 R 하위집합을 안정적으로 발현하도록 유전적으로 조작된다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 종양 세포의 모집단을 포함하며, 여기서 종양 세포는 적어도 3개의 필수 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자 OX40L, CD70, 및 CD80, CD86 또는 둘 다를 포함하는 CD28L 플러스 3-25, 포괄적 면역조절제를 포함하는 5개의 R 하위집합을 안정적으로 발현하도록 유전적으로 조작된다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 종양 세포의 모집단을 포함하며, 여기서 종양 세포는 적어도 3개의 필수 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자 OX40L, CD70, 및 CD80, CD86 또는 둘 다를 포함하는 CD28L 플러스 3-25, 포괄적 면역조절제를 포함하는 6개의 R 하위집합을 안정적으로 발현하도록 유전적으로 조작된다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 종양 세포의 모집단을 포함하며, 여기서 종양 세포는 적어도 3개의 필수 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자 OX40L, CD70, 및 CD80, CD86 또는 둘 다를 포함하는 CD28L 플러스 3-25, 포괄적 면역조절제를 포함하는 7개의 R 하위집합을 안정적으로 발현하도록 유전적으로 조작된다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 종양 세포의 모집단을 포함하며, 여기서 종양 세포는 적어도 3개의 필수 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자 OX40L, CD70, 및 CD80, CD86 또는 둘 다를 포함하는 CD28L 플러스 3-25, 포괄적 면역조절제를 포함하는 8개의 R 하위집합을 안정적으로 발현하도록 유전적으로 조작된다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 종양 세포의 모집단을 포함하며, 여기서 종양 세포는 적어도 3개의 필수 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자 OX40L, CD70, 및 CD80, CD86 또는 둘 다를 포함하는 CD28L 플러스 3-25, 포괄적 면역조절제를 포함하는 9개의 R 하위집합을 안정적으로 발현하도록 유전적으로 조작된다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 종양 세포의 모집단을 포함하며, 여기서 종양 세포는 적어도 3개의 필수 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자 OX40L, CD70, 및 CD80, CD86 또는 둘 다를 포함하는 CD28L 플러스 3-25, 포괄적 면역조절제를 포함하는 10개의 R 하위집합을 안정적으로 발현하도록 유전적으로 조작된다.

일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R¹은 APRIL이다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R²는 BAFF이다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R³은 4-IBB 리간드이다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R⁴는 CD30L이다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R⁵는 CD40 리간드이다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R⁶은 CD80. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R⁷은 CD86. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R⁸은 FLT-3 리간드이다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R⁹는 HSP-70이다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R¹⁰은 HSP-90이다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R¹¹은 ICOS 리간드이다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R¹²는 IL-10R이다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R¹³은 IL-12이다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R¹⁴는 IL-15이다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R¹⁵는 IL-18이다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R¹⁶은 IL-2이다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R¹⁷은 IL-21이다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R¹⁸은 IL-23이다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R¹⁹는 IL-7이다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R²⁰은 LIGHT이다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R²¹은 RANK 리간드이다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R²²는 TGF-b 수용체이다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R²³은 TNF이다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R²⁴는 GM-CSF이다.

일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R은 APRIL, BAFF, 4-IBB 리간드, CD30 리간드, CD40 리간드, CD80, CD86, FLT-3 리간드, 막횡단 영역을 제거하도록 조작된 FLT-3 리간드, GM-CSF, CD8 막 앵커 및 IRES 호환 신호 서열로 조작된 GMCSF, HSP-70, HSP-90, ICOS 리간드, IL-10R, IL-12, IL-15, IL-18, IL-2, IL-21, IL-23, IL-7, CD8 막 앵커로 조작된 IL-7, LIGHT, OX-40 리간드, RANK 리간드, TGF-b 수용체, 및 TNF로 구성된 군으로부터 선택된, 즉 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30, 외인성 면역조절 분자를 포괄하는, 1 내지 30 면역조절제를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자는 1 내지 30, 즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30, 외인성 면역조절 분자를 포함하며, 적어도 3개의 면역조절 분자는 OX40 리간드(OX40L), CD27 리간드, 및 CD80, CD86 또는 둘 다를 포함하는 CD28 리간드이며, 여기서 R¹ - R²⁴로 식별된 추가 면역조절 성분은 APRIL, BAFF, 4-IBBL 리간드(4-IBBL), CD30L, CD40 리간드, CD80, CD86, FLT-3 리간드, 막횡단 영역을 제거하도록 조작된 FLT-3 리간드, CD8 막 앵커 및 IRES 호환 신호 서열로 조작된 GMCSF, HSP-70, HSP-90, ICOS 리간드, IL-10R, IL-12, IL-15, IL-18, IL-2, IL-21, IL-23, IL-7, CD8 막 앵커로 조작된 IL-7, LIGHT, RANK 리간드, TGF-b 수용체, 및 TNF로 구성된 군으로부터 선택된다.

일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R은 APRIL, BAFF,4-IBB 리간드, CD30L, CD40 리간드, CD80, CD86, FLT-3 리간드, 막횡단 영역을 제거하도록 조작된 FLT-3 리간드, GM-CSF, CD8 막 앵커 및 IRES 호환 신호 서열로 조작된 GMCSF, HSP-70, HSP-90, ICOS 리간드, IL-10R, IL-12, IL-15, IL-18, IL-2, IL-21, IL-23, IL-7, CD8 막 앵커로 조작된 IL-7, LIGHT, OX-40 리간드, RANK 리간드, TGF-b 수용체, 및 TNF로 구성된 군으로부터 선택된, 즉 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20을 포괄하는, 1 내지 20 외인성 면역조절 분자를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자는 1 내지 20, 즉 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20을 포괄하는 외인성 면역조절 분자를 포함하며, 여기서 적어도 3개의 면역조절 분자는 OX40 리간드(OX40L), CD27 리간드, 및 CD28 리간드이며, 여기서 R¹ - R²⁴로 식별된 추가 면역조절 성분은 APRIL, BAFF, 4-IBB 리간드, CD30L, CD40 리간드, CD80, CD86, FLT-3 리간드, 막횡단 영역을 제거하도록 조작된 FLT-3 리간드, CD8 막 앵커 및 IRES 호환 신호 서열로 조작된 GMCSF, HSP-70, HSP-90, ICOS 리간드, IL-10R, IL-12, IL-15, IL-18, IL-2, IL-21, IL-23, IL-7, CD8 막 앵커로 조작된 IL-7, LIGHT, RANK 리간드, TGF-b 수용체, 및 TNF로 구성된 군으로부터 선택된다.

일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R은 APRIL, BAFF, 4-IBB 리간드, CD30L, CD40 리간드, CD80, CD86, FLT-3 리간드, 막횡단 영역을 제거하도록 조작된 FLT-3 리간드, GM-CSF, CD8 막 앵커 및 IRES 호환 신호 서열로 조작된 GMCSF, HSP-70, HSP-90, ICOS 리간드, IL-10R, IL-12, IL-15, IL-18, IL-2, IL-21, IL-23, IL-7, CD8 막 앵커로 조작된 IL-7, LIGHT, OX-40 리간드, RANK 리간드, TGF-b 수용체, 및 TNF로 구성된 군으로부터 선택된, 즉 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10을 포괄하는, 1 내지 10 외인성 면역조절 분자를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자는 즉 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10을 포괄하는, 1 내지 10 외인성 면역조절 분자를 포함하며, 여기서 적어도 3개의 면역조절 분자는 OX40 리간드(OX40L), CD27 리간드, 및 CD28 리간드이며, 여기서 R¹ - R²⁴로 식별된 추가 면역조절 성분은 APRIL, BAFF, 4-IBB 리간드, CD30L, CD40 리간드, CD80, CD86, FLT-3 리간드, 막횡단 영역을 제거하도록 조작된 FLT-3 리간드, CD8 막 앵커 및 IRES 호환 신호 서열로 조작된 GMCSF, HSP-70, HSP-90, ICOS 리간드, IL-10R, IL-12, IL-15, IL-18, IL-2, IL-21, IL-23, IL-7, CD8 막 앵커로 조작된 IL-7, LIGHT, RANK 리간드, TGF-b 수용체, 및 TNF로 구성된 군으로부터 선택된다.

일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R은 APRIL, BAFF, 4-IBB 리간드, CD30L, CD40 리간드, CD80, CD86, FLT-3 리간드, 막횡단 영역을 제거하도록 조작된 FLT-3 리간드, GM-CSF, CD8 막 앵커 및 IRES 호환 신호 서열로 조작된 GMCSF, HSP-70, HSP-90, ICOS 리간드, IL-10R, IL-12, IL-15, IL-18, IL-2, IL-21, IL-23, IL-7, CD8 막 앵커로 조작된 IL-7, LIGHT, OX-40 리간드, RANK 리간드, TGF-b 수용체, 및 TNF로 구성된 군으로부터 선택된 즉 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20을 포괄하는 5 내지 20 외인성 면역조절 분자를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자는 즉, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20을 포괄하는 5 내지 20 외인성 면역조절 분자를 포함하며, 여기서 적어도 3개의 면역조절 분자는 OX40 리간드(OX40L), CD27 리간드, 및 CD28 리간드이고, 여기서 R¹ - R²⁴로 식별된 추가 면역조절 성분은 APRIL, BAFF, CD27 리간드, CD30L, CD40 리간드, CD80, CD86, FLT-3 리간드, 막횡단 영역을 제거하도록 조작된 FLT-3 리간드, CD8 막 앵커 및 IRES 호환 신호 서열로 조작된 GMCSF, HSP-70, HSP-90, ICOS 리간드, IL-10R, IL-12, IL-15, IL-18, IL-2, IL-21, IL-23, IL-7, CD8 막 앵커로 조작된 IL-7, LIGHT, RANK 리간드, TGF-b 수용체, 및 TNF로 구성된 군으로부터 선택된다.

일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R은 APRIL, BAFF, 4IBB 리간드, CD30L, CD40 리간드, CD80, CD86, FLT-3 리간드, 막횡단 영역을 제거하도록 조작된 FLT-3 리간드, GM-CSF, CD8 막 앵커 및 IRES 호환 신호 서열로 조작된 GMCSF, HSP-70, HSP-90, ICOS 리간드, IL-10R, IL-12, IL-15, IL-18, IL-2, IL-21, IL-23, IL-7, CD8 막 앵커로 조작된 IL-7, LIGHT, OX-40 리간드, RANK 리간드, TGF-b 수용체, 및 TNF로 구성된 군으로부터 선택된, 즉 10, 11, 12, 13, 14 또는 15를 포괄하는 10 내지 15 외인성 면역조절 분자를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자는 즉 10, 11, 12, 13, 14 또는 15를 포괄하는 10 내지 15 외인성 면역조절 분자를 포함하며, 여기서 적어도 3개의 면역조절 분자는 OX40 리간드(OX40L), CD27 리간드, 및 CD28 리간드이고, 여기서 R¹ - R²⁴로 식별된 추가 면역조절 성분은 APRIL, BAFF, 4-IBB 리간드, CD30L, CD40 리간드, CD80, CD86, FLT-3 리간드, 막횡단 영역을 제거하도록 조작된 FLT-3 리간드, CD8 막 앵커 및 IRES 호환 신호 서열로 조작된 GMCSF, HSP-70, HSP-90, ICOS 리간드, IL-10R, IL-12, IL-15, IL-18, IL-2, IL-21, IL-23, IL-7, CD8 막 앵커로 조작된 IL-7, LIGHT, RANK 리간드, TGF-b 수용체, 및 TNF로 구성된 군으로부터 선택된다.

일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R은 APRIL, BAFF, 4-IBB 리간드, CD30L, CD40 리간드, CD80, CD86, FLT-3 리간드, 막횡단 영역을 제거하도록 조작된 FLT-3 리간드, GM-CSF, CD8 막 앵커 및 IRES 호환 신호 서열로 조작된 GMCSF, HSP-70, HSP-90, ICOS 리간드, IL-10R, IL-12, IL-15, IL-18, IL-2, IL-21, IL-23, IL-7, CD8 막 앵커로 조작된 IL-7, LIGHT, OX-40 리간드, RANK 리간드, TGF-b 수용체, 및 TNF로 구성된 군으로부터 선택된 14 외인성 면역조절 분자를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자는 14 외인성 면역조절 분자를 포함하며, 여기서 적어도 3개의 면역조절 분자는 are OX40 리간드(OX40L), CD27 리간드, 및 CD28 리간드이고, 여기서 R¹ - R²⁴로 식별된 추가 면역조절 성분은 APRIL, BAFF, 4-IBB 리간드, CD30L, CD40 리간드, CD80, CD86, FLT-3 리간드, 막횡단 영역을 제거하도록 조작된 FLT-3 리간드, GM-CSF, CD8 막 앵커 및 IRES 호환 신호 서열로 조작된 GMCSF, HSP-70, HSP-90, ICOS 리간드, IL-10R, IL-12, IL-15, IL-18, IL-2, IL-21, IL-23, IL-7, CD8 막 앵커로 조작된 IL-7, LIGHT, OX-40 리간드, RANK 리간드, TGF-b 수용체, 및 TNF로 구성된 군으로부터 선택된다.

일부 실시형태에 따르면, 각각의 외인성 면역조절 분자 4-1BB 리간드, APRIL, BAFF, CD27 리간드, CD30L, CD40 리간드, CD80, CD86, FLT-3 리간드, GM-CSF, HSP-70, HSP-90, ICOS 리간드, IL-10R, IL-12, IL-15, IL-18, IL-2, IL-21, IL-23, IL-7, LIGHT, OX-40 리간드, RANK 리간드, TGF-b 수용체, 및 TNF는 야생형 분자이다. 일부 실시형태에 따르면, 각각의 외인성 면역조절 분자 4-1BB 리간드, APRIL, BAFF, CD27 리간드, CD30L, CD40 리간드, CD80, CD86, FLT-3 리간드, GM-CSF, HSP-70, HSP-90, ICOS 리간드, IL-10R, IL-12, IL-15, IL-18, IL-2, IL-21, IL-23, IL-7, LIGHT, OX-40 리간드, RANK 리간드, TGF-b 수용체, 및 TNF는 돌연변이체 또는 변이체 서열이다.

일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R²⁴는 IRES 호환 신호 서열로 조작된 CD86 변이체이다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R²⁵는 막횡단 영역을 제거하도록 조작된 FLT3L 변이체이다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R²⁶은 CD8 막 앵커 및 IRES 호환 신호 서열로 조작된 GM-CSF 변이체이다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R²⁷은 CD8 막 앵커로 조작된 HSP70 변이체이다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R²⁸은 CD8 막 앵커로 조작된 HSP-90B1(GRP94/96) 변이체이다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R²⁹는 CD8 막 앵커로 조작된 HSP90 변이체이다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R³⁰은 IRES 호환 신호 서열로 조작된 ICOSL 변이체이다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R³¹은 막횡단 영역을 제거하도록 조작된 IL10R 변이체이다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R³²는 막횡단 영역(VSV-GM-CSF 태그)을 제거하도록 조작된 IL-Rα 변이체이다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R³³은 CD8 막 앵커를 갖는 단일 사슬이 되도록 조작된 IL12 변이체이다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R³⁴는 CD8 막 앵커로 조작된 IL15 변이체이다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R³⁵는 CD8 막 앵커로 조작된 IL18 변이체이다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R³⁶은 CD8 막 앵커 및 IRES 호환 서열로 조작된 IL2 변이체이다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R³⁷은 CD8 막 앵커로 조작된 IL21 변이체이다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R³⁸은 CD8 막 앵커를 갖는 단일 사슬이 되도록 조작된 IL23 변이체이다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R³⁹는 CD8 막 앵커로 조작된 IL7 변이체이다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R⁴⁰은 막횡단 영역을 제거하도록 조작된 TGFb-R 변이체이다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R⁴¹은 막횡단 영역을 제거하도록 조작된 TGFb 수용체 III 변이체이다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R⁴²는 막 결합되도록 변형된 mIFNα 변이체이다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R⁴³은 막 결합되도록 변형된 mIFNαγ 변이체이다. 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자 R⁴⁴는 절단 저항성인 CD40L 변이체이다.

표 3은 R 기 R¹-R⁴⁴를 제시한다.

일부 실시형태에 따르면, 적어도 12개 벡터는 14개 면역조절제를 포함하며, 여기서 적어도 3개의 면역조절 분자는 OX40 리간드(OX40L), CD27 리간드(CD70), 및 CD80, CD86 또는 둘 다를 포함하는 CD28 리간드(CD28L)이고, 여기서 나머지 11개 면역조절제는 표 3에서 R¹ - R⁴⁴로부터 선택된다. 일부 실시형태에 따르면, 적어도 11개 벡터는 14개 면역조절제를 포함하며, 여기서 적어도 3개의 면역조절 분자는 OX40 리간드(OX40L), CD27 리간드(CD70), 및 CD80, CD86 또는 둘 다를 포함하는 CD28 리간드(CD28L)이고, 나머지 11개 면역조절제는 표 3에서 R¹ - R⁴⁴로부터 선택된다. 일부 실시형태에 따르면, 적어도 10개 벡터는 14개 면역조절제를 포함하며, 여기서 적어도 3개의 면역조절 분자는 OX40 리간드(OX40L), CD27 리간드(CD70), 및 CD80, CD86 또는 둘 다를 포함하는 CD28 리간드(CD28L)이고, 여기서 나머지 11개 면역조절제는 표 3에서 R¹ - R⁴⁴로부터 선택된다. 일부 실시형태에 따르면, 14개 면역조절제는 표 2로부터 선택되며, 여기서 적어도 3개의 면역조절 분자는 OX40 리간드(OX40L), CD27 리간드(CD70), 및 CD80, CD86 또는 둘 다를 포함하는 CD28 리간드(CD28L)이고, 나머지 11개 면역조절제는 표 3에서 R¹ - R⁴⁴로부터 선택되고 14개 면역조절제는 12개 벡터에 있다. 일부 실시형태에 따르면, 14개 면역조절제는 표 2로부터 선택되고, 여기서 적어도 3개의 면역조절 분자는 OX40 리간드(OX40L), CD27 리간드(CD70), 및 CD80, CD86 또는 둘 다를 포함하는 CD28 리간드(CD28L)이고, 여기서 나머지 11개 면역조절제는 표 3에서 R¹ - R⁴⁴로부터 선택되고, 여기서 14개 면역조절제는 11개 벡터에 있다. 일부 실시형태에 따르면, 14개 면역조절제는 표 2로부터 선택되고, 여기서 적어도 3개의 면역조절 분자는 OX40 리간드(OX40L), CD27 리간드(CD70), 및 CD80, CD86 또는 둘 다를 포함하는 CD28 리간드(CD28L)이고, 여기서 나머지 11개 면역조절제는 표 3에서 R¹ - R⁴⁴로부터 선택되고, 여기서 14개 면역조절제는 10개 벡터에 있다. 벡터는 태그를 더 포함할 수 있다.

일부 실시형태에 따르면, 면역조절제는 코돈 최적화된다. "코돈 최적화"는 코딩된 단백질이 그 안에서 보다 효율적으로 발현될 수 있도록 특정 유기체에서 다른 것 이전에 먼저 사용되는 코돈으로 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 코돈의 변형을 의미한다. 대부분의 아미노산은 "동의어" 또는 "동의어 코돈"으로 지칭되는 여러 코돈에 의해 기술되기 때문에 유전 코드는 축퇴성을 갖는다. 그러나, 특정 유기체에 의한 코돈 사용은 무작위가 아니고 특정 코돈 삼중항에 더 편향되어 있다. 이러한 코돈 사용 편향은 특정 유전자, 공통 기능 또는 조상 기원을 갖는 유전자, 높은 수준으로 발현되는 단백질 대 낮은 카피 수를 갖는 단백질, 또는 유기체의 게놈의 그룹 단백질 코딩 영역과 관련하여 훨씬 더 높을 수 있다.

사이토카인

일 실시형태에 따르면, 개시내용은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하는 동종 종양 세포 백신을 포괄하며, 여기서 종양 세포는 T 림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 자극하도록 유전적으로 조작되며, 상기 모집단은 하나 이상의 사이토카인을 포함한다. 따라서, 개시내용은 사이토카인의 전장, 단편, 상동체, 변이체 또는 돌연변이를 포함하는 사이토카인을 포괄한다. 사이토카인은 다른 세포의 생물학적 기능에 영향을 미칠 수 있는 단백질을 포함한다. 사이토카인에 의해 영향을 받는 생물학적 기능은 세포 성장, 세포 분화 또는 세포 사멸을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에 따르면, 본 개시내용의 사이토카인은 세포 표면 상의 특정 수용체에 결합할 수 있어 면역 세포(예를 들어, T 림프구(예를 들어, CD8+ T 세포), 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구)를 자극할 수 있다.

일부 실시형태에 따르면, 사이토카인은 과립구-대식세포 집락-자극 인자(GM-CSF), 과립구 집락-자극 인자(G-CSF), Fms-관련된 티로신 키나제 3 리간드(FLT3LG), 인터루킨-1 (IL-1), IL-1a, IL-1b, Il-1ra, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12p40, IL-12p70, IL-12/IL-23 P40, IL13, IL-15, IL-15/IL15-RA, IL-17, IL-17A, IL-18, IL-21, IL-23, TGF-β, MCP-1, TNF-α 및 인터페론 알파(IFNα), IFNγ, MIP1b, Rantes, Tweak, 및 TREM-1로부터 선택된다. 일부 실시형태에 따르면, 사이토카인은 과립구-대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF)이다. 일부 실시형태에 따르면, 사이토카인은 Fms-관련 티로신 키나제 3 리간드(FLT3LG)이다.

일부 실시형태에 따르면, 사이토카인이 분비된다. 일부 실시형태에 따르면, 사이토카인은 막 결합되어 있다.

과립구-대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF)

과립구-대식세포 집락-자극 인자(GM-CSF; 집락 자극 인자 2; CSF2)는 단핵구/대식세포 및 활성화된 T 세포에서 발견되고, 성장 인자로 작용하여 수지상 세포를 자극하고 모집할 수 있다. GM-CSF는 면역계의 세포뿐만 아니라 내피 세포 및 섬유아세포에 의해 분비된 단량체성 당단백질이다. 인간 GM-CSF는 절단되어 성숙한 127개 아미노산 단백질을 생성할 수 있는 17개 아미노산 신호 펩티드를 포함하는 144개 아미노산 단백질이다. GM-CSF의 생물학적 활성은 단핵구, 대식세포, 과립구, 림프구, 내피 세포 및 폐포 상피 세포 상에서 발현되는 이종 세포 표면 수용체에 대한 결합을 통해 발생한다. GM-CSF 수용체(GM-CSFR)는 전형적으로 낮은 발현(예를 들어, 20-200/세포)을 갖지만 높은 친화도를 갖는다(Shi Y 등., Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and T-cell responses: what we do and don't know, Cell Research (2006) 16: 126-133).

일부 마우스 모델에서, GM-CSF를 분비하는 동계 마우스 흑색종 세포로 백신접종하면 다른 사이토카인에 의해 생성된 백신보다 더 강력하고 오래 지속되는 항종양 면역을 자극한다. 보조 요법으로서 가용성 GM-CSF로 치료된 흑색종 환자는 대조군과 비교하여 무 질환 생존에서의 증가를 나타냈다. GM-CSF는 제한 없이, 가용성 GM-CSF, GM-CSF 융합 단백질, GM-CSF로 종양 세포의 형질감염 및 GM-CSF DNA의 주입의 전신 및 국소 적용을 포함하는 다양한 방식으로 면역 보조제로 사용되었다. 재조합 GM-CSF는 다양한 펩티드, 단백질 및 바이러스 백신에 대한 보조제로서 사용되어 왔고, 흑색종, 유방암 및 난소암 환자에서 효과적인 보조제인 것으로 밝혀졌다. GM-CSF를 포함하는 융합 단백질은 또한 항원의 면역원성을 증진시키는 것으로 나타났다. GM-CSF는 동종 또는 자가 GM-CSF 발현 세포가 백신으로 사용되는 유전자 요법 접근법에서 사용하기 위해 테스트되었다(Kaufman and Wolchok eds., General Principles of Tumor Immunotherapy, Chpt 5, 67-121 (2007)). 이러한 백신은 여러 다른 암 유형 중에서 다양한 정도의 효과를 갖는다.

일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 13의 GM-CSF 펩티드를 발현할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 13의 단백질에 대해 적어도 60%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 13의 단백질에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 13의 단백질에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 13의 단백질에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주는 변이체는 서열번호: 13의 단백질에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 13의 단백질에 대해 적어도 96%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 13의 단백질에 대해 적어도 97%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 13의 단백질에 대해 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 13의 단백질에 대해 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다.

일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 막 발현을 가능하게 하는 GM-CSF와 HLA-I 사이의 융합을 포함하는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 42 또는 서열번호: 5의 단백질에 대해 적어도 60%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 42 또는 서열번호: 5의 단백질에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 42 또는 서열번호: 5의 단백질에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 42 또는 서열번호: 5의 단백질에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 42 또는 서열번호: 5의 단백질에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 42 또는 서열번호: 5의 단백질에 대해 적어도 96%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 42 또는 서열번호: 5의 단백질에 대해 적어도 97%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 42 또는 서열번호: 5의 단백질에 대해 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 42 또는 서열번호: 5의 단백질에 대해 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다.

Fms-유사 티로신 키나제-3 리간드(Flt-3L)

인간 Flt3L 단백질은 FLT3LG 유전자에 의해 인코딩되는 막 결합된 조혈 4개 나선 번들 사이토카인이다. Flt3L은 다양한 혈구 전구체의 증식 및 분화를 자극하는 성장 인자로 작용하고, 수지상 세포의 생산 및 발달에 중요하다. Flt3L을 결하는 마우스는 낮은 수준의 수지상 세포를 갖는 반면, 마우스 또는 인간에게 투여된 Flt3L은 매우 높은 수준의 수지상 세포를 초래한다(Shortman 등, Steady-state and inflammatory dendritic-cell development, Nature Reviews Immunology, Vol. 7. 19-30 (2007)).

일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 14의 Flt3L 펩티드를 발현한다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 14의 단백질에 대해 적어도 60%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 14의 단백질에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 14의 단백질에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 14의 단백질에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 14의 단백질에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 14의 단백질에 대해 적어도 96%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 14의 단백질에 대해 적어도 97%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 14의 단백질에 대해 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 14의 단백질에 대해 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다.

일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 Flt3L의 가용성 형태를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 44의 단백질에 대해 적어도 60%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 44의 단백질에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 44의 단백질에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 44의 단백질에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 44의 단백질에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 44의 단백질에 대해 적어도 96%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 44의 단백질에 대해 적어도 97%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 44의 단백질에 대해 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 44의 단백질에 대해 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다.

당업자는 일단 본 명세서에 제공된 교시로 무장하면, 발명이 현재 당업계에 잘-알려져 있든, 미래에 발견되든 임의의 사이토카인을 포괄한다는 것을 이해할 것이다.

일부 실시형태에 따르면, 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하는 동종 종양 세포 백신은 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5 또는 그 초과) 사이토카인, 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함한다.

TNF-패밀리 구성원

일 실시형태에 따르면, 개시내용은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하는 동종 종양 세포 백신을 포괄하며, 여기서 종양 세포는 T 림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 자극하도록 유전적으로 조작되며, 상기 모집단은 하나 이상의 TNF-패밀리 구성원을 포함한다. 따라서, 개시내용은 TNF-패밀리 단백질의 전장, 단편, 상동체, 변이체 또는 돌연변이를 포함하는 TNF-패밀리 구성원 단백질을 포괄한다. 일부 실시형태에 따르면, TNF 수퍼패밀리 구성원은 종양 괴사 인자 알파(TNFα), CD40 리간드(CD40L), OX40 리간드(OX40L), FAS 리간드(FASL), CD27 리간드(CD27L), CD30 리간드(CD30L), CD137 리간드(CD137L), TNFSF8, TNFSF9, TNFSF10, TNFSF11, TNFS12, TNFSF13, TNFSF13B, TNFSF14, TNFSF15, TNFSF18, TNFβ, TNFSF1B, TNFγ, 엑토디스플라신 A(EDA) 중 하나 이상으로부터 선택된다. 일부 실시형태에 따르면, TNF 수퍼패밀리 구성원은 TNFα이다. 일부 실시형태에 따르면, TNF 수퍼패밀리 구성원은 CD40L이다.

일부 실시형태에 따르면, TNF 패밀리 구성원은 막 결합되어 있다.

종양 괴사 인자(TNF) 슈퍼패밀리는 TNF 상동성 도메인을 함유하고 삼량체를 형성하는 유형 II 막횡단 단백질의 단백질 슈퍼패밀리이다. 이 슈퍼패밀리의 구성원은 세포외 단백질분해 절단에 의해 세포막에서 방출되고 사이토카인으로 기능할 수 있다. 이들 단백질은 주로 면역 세포에 의해 발현되고 면역 반응 및 염증의 조절뿐만 아니라 증식, 분화, 세포자멸사 및 배발생을 포함한 다양한 세포 기능을 조절한다. 수퍼패밀리는 TNF 수용체 수퍼패밀리의 29개 구성원에 결합하는 19개 구성원을 함유한다.

OX40L(TNFSF4, bTNF 슈퍼패밀리 구성원 4)

원래 당단백질 34 kDa(GP34)로 명명되었던 OX40 리간드(OX40L)(CD252, TNFSF4)는 TNF 슈퍼패밀리에 속하며; 그것은 활성화된 수지상 세포(DC), B 세포, 대식세포, T 세포뿐만 아니라 내피 세포를 포함하는 항원-제시 세포(APC)의 표면 상에서 주로 발현된다[DeSmedt, T 등, J. Immunol (2002) 168: 661-670. doi: 10.4049/jimmunol.168.2.661을 인용하는, Huang, L. 등, J. Trans. Med. (2018) 16: 74; doi: 10.1186/s12967-018-1436-4; Ohshima, Y. 등, Blood (1998) 92: 3338-3345].

OX40(ACT35, CD134, TNFRSF4)은 활성화된 CD4+ T 세포의 세포 표면 상에서 구성적으로 발현된다[Id., Ogawa R, 등, Cytokine Growth Factor Rev. (2008) 19:253-262. doi: 10.1016/j.cytogfr.2008.04.003, Paterson DJ, 등 Mol Immunol. (1987) 24:1281-1290. doi: 10.1016/0161-5890(87)90122-2 인용]. 그것은 OX40L에 특별히 결합할 수 있고 CD4+ T 세포의 증식 및 생존과 사이토카인 분비를 촉진하는 데 기여하는 일련의 반응을 개시할 수 있다[Id., Kaur D, Brightling C. Chest. (2012) 141:494-499. doi: 10.1378/chest.11-1730 인용]. OX-40 수용체(OX-40R)는 활성화된 CD4(+) T 세포의 표면 상에서 발견되는 막횡단 단백질이다. Weinberg, AD, 등, "OX-40: life beyond the effector T cell stage," Semin. Immunol. (1998) 10(6): 471-80). T 세포주에 대한 항원 제시 동안 항-OX-40 항체 또는 OX-40 리간드(OX-40L)와 같은 작용제에 의해 계합될 때, OX-40R은 CD28 공동자극만큼 강력한 공동자극 신호를 생성한다. Id. OX-40R의 계합은 IL-2 생산을 상향조절하고 효과기 T 세포의 수명을 증가시켜 효과기 및 기억-효과기 T 세포 기능을 증진시킨다. Id.

CD25-Foxp3-나이브 CD4 T 세포는 유도성 Treg(iTreg)로의 분화를 유도하는 TGF-βR 및 IL-2R 신호에 의해 구동되는 Foxp3을 획득할 수 있다. 그래서, T 등, Cytokine Growth Factor Rev. (2008) 19(3-4): 253-62. OX40으로부터 공동자극 신호는 항원-반응 나이브 CD4 T 세포에서 Foxp3 유도에 길항하고 많은 수의 CD25+Foxp3+iTreg의 발달을 억제하는 것으로 밝혀졌다(Id, Vu MD, 등 Blood. (2007) 110:2501-10; So T, Croft M. J Immunol. (2007) 179:1427-30 인용).

개시된 발명의 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 108의 종양 세포의 막 상에서 OX40L의 막 결합된 형태를 발현하도록 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 108의 단백질에 대해 적어도 60%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 108의 단백질에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 108의 단백질에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 108의 단백질에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 108의 단백질에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 108의 단백질에 대해 적어도 96%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 108의 단백질에 대해 적어도 97%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 108의 단백질에 대해 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 108의 단백질에 대해 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다.

CD27 리간드(CD70)

유형 II 막횡단 단백질인, CD27 리간드(CD70)는 TNF 슈퍼패밀리의 구성원이다. 그것은 활성화된 T 및 B 림프구뿐만 아니라 NK 세포 상에서 발현된다. CD27 리간드 및 이의 수용체 CD27은 T 세포 확장 및 분화, 뿐만 아니라 NK 증진을 촉진함에 의해 면역 반응을 조절한다. 일차 CD8+ T 세포 반응의 후기 단계 동안, CD27 신호는 항원-특이적 CD8+ T 세포의 세포자멸사를 방지한다. CD27 신호의 결여는 기억 CD8+ T 세포 반응의 품질을 저하시킨다. 그러나, 나이브 세포와 유사한 표면 CD27을 발현하는 기억 CD8+ T 세포는 2차 반응 동안 CD27 공동자극을 필요로 하지 않는다. 따라서, 생체 내에서 CD27은 일차 반응의 후기 단계 동안 CD8+ T 세포의 세포자멸사를 방지함에 의해 일차 항원-특이적 CD8+ T 세포 반응을 간접적으로 조절하는 역할을 하고, 기억 세포의 최적 품질에 필요하지만 정상적으로 프라이밍된 2차 CD8+ T 세포 반응 동안에는 필요하지 않는다. Dolfi, DV, et a., J. Immunol. (2008) 180(5): 2912-2921). 전장 CD27 리간드(CD70)는 17개 아미노산 세포질 도메인, 21개 아미노산 막횡단 도메인 및 155개 아미노산 세포외 도메인으로 구성된 193개 아미노산 단백질이다. 인간 가용성 CD70은 전장 CD70 단백질의 155개 아미노산 세포외 도메인에 상응한다.

개시된 발명의 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 종양 세포의 막 상에서 CD70의 막 결합된 형태를 발현하도록 조작될 수 있다.

개시된 발명의 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 CD70의 가용성 형태를 발현하도록 조작될 수 있다.

개시된 발명의 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 109의 종양 세포의 막 상에서 CD70의 막 결합된 형태를 발현하도록 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 109의 단백질에 대해 적어도 60%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 109의 단백질에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 109의 단백질에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 109의 단백질에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 109의 단백질에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 109의 단백질에 대해 적어도 96%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 109의 단백질에 대해 적어도 97%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 109의 단백질에 대해 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 109의 단백질에 대해 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다.

4-IBBL

나이브 CD8 T 세포는 나이브 CD4 T 세포보다 활성화된 효과기 세포가 되도록 유도하기 위해 더 많은 공동-자극 활성을 필요로 한다. 이 요구사항은 2가지 방식으로 충족될 수 있다. 가장 간단한 방식은 높은 고유 공동-자극 활성을 갖는 활성화된 DC에 의한 프라이밍이다. 일부 바이러스 감염에서, 수지상 세포는 CD4 T 세포의 도움 없이 세포독성 효과기 세포로의 그 분화에 필요한 IL-2를 생성하도록 CD8 T 세포를 직접적으로 유도하기 위해 충분히 활성화된다. DC의 이 특성은 종양에 대한 세포독성 T 세포 반응을 생성하기 위해 이용되었다. 그러나, 대부분의 바이러스 감염에서, CD8 T-세포 활성화는 CD4 효과기 T 세포에 의해 제공되는 추가 도움이 필요하다. APC에 의해 제시되는 관련된 항원을 인식하는 CD4 T 세포는 APC를 추가로 활성화함에 의해 나이브 CD T 세포의 활성화를 증폭할 수 있다. DC에 의해 발현된 B7은 먼저 CD4 T 세포를 활성화시켜 IL-2 및 CD40L을 발현한다. CD40L은 DC 상의 CD40에 결합하여, 수지상 세포에 의한 B7 및 4-IBBL의 발현을 증가시키는 추가 신호를 전달하고, 이는 차례로 나이브 CD8 T 세포에 추가 공동-자극을 제공한다. 활성화된 CD4 T 세포에 의해 생성된 IL-2는 또한 효과기 CD8 T-세포 분화를 촉진하는 작용을 한다. Murphy, Kenneth. Janeway's Immunobiology: 8th ed. Chapter 15: Garland Science. (2012), at 372.

4-IBB는 T 세포의 일차 활성화를 따르고 활성화된 CD4+ 및 CD8+ T 세포로 제한된 발현의 패턴을 갖는다. Guinn, B, 등, J. Immuno. (1999) 162: 5003-5010. 4-IBB 수용체의 계합은 활성화된 T 세포 내에서 강력한 공동자극 신호를 중계하는 것으로 나타났으며, 이는 그의 증진된 증식 및 사이토카인 분비를 야기한다. Id. 이러한 시그널링은 다른 보조 신호의 부재에서 TCR 교차-연결에 이어서 활성화-유도된 세포 사멸을 방지한다. Id. 활성화된 APC의 표면 상에 발현되는 4-IBB에 대한 고친화성 리간드인 4-IBBL은 TNF 수용체 패밀리의 구성원과 상동성을 나타내는 유형 II 막 단백질이다. CD28 -/- 마우스에서 정제된 T 세포는 사이토카인을 분비하고 4-IBBL을 발현하는 림프종에 반응하여 증식하는 것으로 나타났다; 이 반응은 가용성 4-IBB 수용체 융합 단백질에 의해 억제될 수 있다. Id. CD28 신호의 부재에서, 4-IBBL:4-IBB 상호작용은 혼합된 림프구 반응에서 Th2 반응의 생성에 역할을 수행하는 것으로 나타났다. Id.

개시된 발명의 일부 실시형태에 따르면, 면역조절제의 R 하위집합은 4-IBBL의 막 결합된 형태를 포함할 수 있다. 개시된 발명의 일부 실시형태에 따르면, 면역조절제의 R 하위집합은 4-IBBL의 가용성 형태를 포함할 수 있다.

CD40L

CD154 또는 CD40L로 알려진 CD40의 리간드는 번역-후 변형으로 인해 32 내지 39kDa 사이의 가변성 분자량을 갖는, 유형 II 막횡단 단백질이다(Elgueta R 등, Molecular mechanism and function of CD40/CD40L engagement in the immune system. Immunological reviews. 2009; 229(1):10.1111/j.1600-065X.2009.00782.x. doi:10.1111/j.1600-065X.2009.00782.x, citing van Kooten C 등, J. Leukoc Biol. 2000 Jan; 67(1):2-17.). 막횡단 형태와 유사한 활성을 갖는 가용성 형태의 CD40L이 보고되었다(Id. Graf D 등, Eur J Immunol. 1995 Jun; 25(6):1749-54; Mazzei GJ 등, J Biol Chem. 1995 Mar 31; 270(13):7025-8 인용.).

자연에서, CD40L은 TNF 슈퍼패밀리의 구성원이고 β-시트, α-나선 루프, 및 CD40L의 삼량체화를 가능하게 하는 β-시트로 구성된 샌드위치 세포외 구조를 특징으로 한다(Id. Karpusas M 등, Structure. 1995 Oct 15; 3(10):1031-9 인용). CD40L은 주로 활성화된 T 세포뿐만 아니라 활성화된 B 세포 및 혈소판에 의해 발현되며; 염증 조건 하에서 그것은 또한 단핵구 세포, 자연 사멸 세포, 비만 세포 및 호염기구에서 유도된다(Id. Carbone E 등, J Exp Med. 1997 Jun 16; 185(12):2053-60 인용). CD40L 및 CD40의 공동자극 쌍의 광범위한 발현은 이들이 다양한 세포 면역 과정에서 수행하는 중추적 역할을 나타낸다.

CD40L은 3개의 결합 파트너인: CD40, α5β1 인테그린 및 αIIbβ3 인테그린을 갖는다. CD40L은 공동자극 분자로 작용하고 T 여포 헬퍼 세포(TFH 세포)라고 하는 T 세포의 하위집합에서 특히 중요하며, 여기서 그것은 B 세포 표면 상에서 CD40을 계합하여 세포-세포 통신을 촉진함에 의해 B 세포 성숙 및 기능을 촉진한다. CD40L 유전자에서 결함은 면역글로불린 클래스 전환을 겪는데 있어 불능을 초래하고 고-IgM 증후군과 연관되어 있다. CD40L의 부재는 또한 배 중심의 형성을 중단하여 적응성 면역계에서 중요한 과정인, 항체 친화도 성숙을 억제한다.

CD40은 APC 상에서 발현되는 것으로 밝혀진 반면, 그의 리간드인 CD40L은 활성화된 T 세포 상에서 발견되었다. CD40은 체액성 면역 반응에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 밝혀졌고 APC가 T 세포를 활성화할 수 있게 하는 것으로 식별되었다. 루푸스 및 죽상동맥경화증을 포함한 여러 병리가 CD40/CD40L 경로와 연관되어 있지만, 항-CD40L 항체는 활성화된 혈소판 상의 CD40 발현으로 인한 혈전 합병증의 임상 적용으로 제한되었다(Kaufman 및 Wolchok eds., General Principles of Tumor Immunotherapy, Chpt 5, 67-121(2007)).

CD40은 또한 고형 종양 및 혈액 악성종양을 포함한 여러 유형의 암에서 발견되었다. 혈액암에서 CD40을 통한 시그널링은 성장 또는 퇴행을 중재할 수 있는 반면, 고형 종양에서 CD40 시그널링은 단지 종양파괴적이다. 이들 특성은 SCID 마우스 모델에서도 발견되고 따라서 TNF 사멸 도메인 시그널링으로 인한 것일 수 있다. 면역 조절의 증거도 있으며, 예를 들어 CD40/CD40L 경로의 차단은 GM-CSF 분비 흑색종 백신의 보호 효과를 완화한다(Kaufman 및 Wolchok eds., General Principles of Tumor Immunotherapy, Chpt 5, 67-121 (2007)).

CD40L을 발현하는 종양 세포 백신은 암 모델에서 유용한 것으로 입증되었다. 예를 들어, CD40과 CD40L 또는 항-CD40 항체와의 결찰은 GM-CSF, IFN-감마, IL-2 및 CTLA-4 차단과 시너지 효과를 나타냈다. 더욱이, 항-CD40 항체는 전-임상 마우스 모델에서 항-종양 활성을 갖는 것으로 보고되었다(Kaufman 및 Wolchok eds., General Principles of Tumor Immunotherapy, Chpt 5, 67-121 (2007)).

일부 실시형태에 따르면, 면역조절제의 R 하위집합은 CD40 리간드(CD40L)를 포함할 수 있다. 개시된 발명의 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 6의 비절단성 CD40L 펩티드를 발현하도록 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 6의 단백질에 대해 적어도 60%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 6의 단백질에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 6의 단백질에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 6의 단백질에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 6의 단백질에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 6의 단백질에 대해 적어도 96%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 6의 단백질에 대해 적어도 97%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 6의 단백질에 대해 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 6의 단백질에 대해 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다.

일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 종양 세포의 막 표면 상에 서열번호: 7의 비-절단성 막 결합된 CD40L 펩티드를 발현하도록 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 7의 단백질에 대해 적어도 60%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 7의 단백질에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 7의 단백질에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 7의 단백질에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 7의 단백질에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 7의 단백질에 대해 적어도 96%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 7의 단백질에 대해 적어도 97%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 7의 단백질에 대해 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 7의 단백질에 대해 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다.

종양 괴사 인자 알파(TNFα)

종양 괴사 인자(TNF; 종양 괴사 인자 알파(TNFα); 카케신, 카켁틴)는 전신 염증에 관여하는 활성화된 대식세포 및 림프구에 의해 주로 생성되는 사이토카인이다. 그것은 또한 면역원성 반응의 급성기에 관여하는 사이토카인 중 하나이다. TNF는, 예를 들어 CD4+ 림프구, NK 세포, 호중구, 비만 세포, 호산구 및 뉴런과 같은 다른 세포 유형에 의해 생성될 수 있다.

면역 세포의 조절자로서 그 주요 역할에서, TNF는 발열, 세포자멸사 세포사, 악액질, 염증 및 종양형성의 억제를 유도할 수 있으며; 바이러스 복제를 억제할 수 있고; 그리고 패혈증 바이알 IL-1 및 IL-6 생산 세포에 대한 반응을 개시할 수 있다. 조절되지 않은 TNF 생산은 알츠하이머병, 주요 우울증, 건선 및 염증성 장 질환(IBD)을 포함한 인간 질환의 광범위한 배열과 연관된다. TNF는 악성종양의 환경에서 이소성으로 생성될 수 있고 2차 고칼슘혈증을 유발하고 과도한 생성과 연관된 암 둘 다에서 부갑상선 호르몬과 유사하다.

TNF는 26kDa 막 결합된 형태 및 17kDa 가용성 사이토카인 형태를 포함한다. 가용성 형태의 TNF는 TNF-알파 전환 효소(TACE)에 의한 막 결합된 형태의 단백질분해 절단으로부터 유래된다(Grell M. 등, The 막횡단 Form of Tumor Necrosis Factor Is the Prime Activating Ligand of the 80 kDa Tumor Necrosis Factor Receptor, Cell, Vol. 83, 793-802). TACE는 전장 TNF의 세포외 도메인에서 절단 부위를 인식하는 매트릭스 메탈로프로테아제이다(Rieger, R., Chimeric form of tumor necrosis factor-alpha has enhanced surface expression and antitumor activity, Cancer Gene Therapy, 2009, 16, 53-64). TNF 상의 절단 부위의 결실은 TNF의 증진된 막 안정성을 초래한다(Id.).

TNF는 세포에 대한 항증식 및 세포독성 효과를 갖고, 종양 혈류 및 종양 혈관 손상을 감소시키는 것으로 알려져 있고, 대식세포 및 NK 세포 활성을 자극함에 의해 면역 반응을 조절할 수 있다. 그러나, TNF의 치료제로서의 사용 자체는 패혈증-유사 증후군을 유발할 수 있는 용량-의존성 저혈압 및 모세혈관 누출에 의해 제한되어 왔다. 그 이유로 그것은 전신 효과를 제한하는 방식으로 전달되어야 한다. TNF는 반응 속도를 개선하기 위해 표준 화학요법제에 추가되었다. TNF를 투여하는 다른 접근법은 위장 악성종양에서 TNF를 발현하도록 변경된 아데노바이러스의 주입을 포함한다. 종양 혈관-표적화된 TNF 화합물이 또한 개발되었다(Kaufman 및 Wolchok eds., General Principles of Tumor Immunotherapy, Chpt 5, 67-121 (2007)). 재조합 TNF는 tasonermin이라는 이름으로 면역자극제로 사용되어 왔으며, 반면에 HUMIRA®는 염증성 질환(예를 들어, 건선 및 류마티스 관절염)의 치료에 유용한 TNF에 대한 항체이다. 이 역할을 인식하여 항체와 같은 분자는 TNF 활성을 방해하도록 설계되었다. 그러나, 이러한 요법은, 잠재적으로 치명적일 수 있는 백혈구 활성화/사이토카인 방출의 양성 피드백 루프를 초래하는, 사이토카인의 부적절한 전신 방출로 인한 사이토카인 폭풍을 개시할 위험을 제기한다.

일부 실시형태에 따르면, R 면역조절제의 하위집합은 TNF를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 종양 세포의 막 상에 막 결합된 형태의 TNF를 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에 따르면, 세포주 변이체는 서열번호: 8의 펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 8의 단백질에 대해 적어도 60%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 8의 단백질에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 8의 단백질에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 8의 단백질에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 8의 단백질에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 8의 단백질에 대해 적어도 96%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 8의 단백질에 대해 적어도 97%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 8의 단백질에 대해 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 8의 단백질에 대해 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다.

일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 TNF의 비-절단성 막 결합된 형태를 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 아미노산 VRSSSRTPSDKP(서열번호: 104) 중 하나 이상이 결실된 서열번호: 8의 TNF 단백질을 포함할 수 있다(예를 들어, 서열번호: 26 참고).

일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 TNF의 가용성 형태를 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 막횡단 영역의 일부 또는 전체가 제거된 서열번호: 8의 TNF 단백질을 발현할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 아미노산 F, S, F, L, I, V, A, G, A, T, T, L, F, C, L, L, H, F, G, V, I 중 하나 이상이 결실된 서열번호: 8의 유도체 TNF 단백질을 포함할 수 있다(예를 들어, 서열번호: 27 참고).

일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 CD40L 및 TNF의 비-절단성 막 결합된 키메라 형태를 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에 따르면, TNF 분자의 리간드 결합 부분은 CD40L의 막횡단 및 근위 세포외 도메인과 융합되어, TNF는 정의된 TNF 알파 절단 효소(TACE) 부위를 결할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 세포내, 막횡단 및 부분적 세포외 부분 CD40L은 TACE 절단 부위에서 원위인 TNF의 세포외 영역과 융합될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, CD40L/TNF의 키메라 형태는 서열번호: 9의 CD40L 서열 및 서열번호: 10의 TNF 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, CD40L/TNF 서열은 연결 펩티드를 통해 길이 1 내지 30개 아미노산에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 9 및 서열번호: 10의 단백질에 대해 적어도 60%의 서열 동일성을 갖는 융합 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 9 및 서열번호: 10의 단백질에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 융합 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 9 및 서열번호: 10의 단백질에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 융합 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 9 및 서열번호: 10의 단백질에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 융합 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 9 및 서열번호: 10의 단백질에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 융합 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 9 및 서열번호: 10의 단백질에 대해 적어도 96%의 서열 동일성을 갖는 융합 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 9 및 서열번호: 10의 단백질에 대해 적어도 97%의 서열 동일성을 갖는 융합 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 9 및 서열번호: 10의 단백질에 대해 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 융합 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 9 및 서열번호: 10의 단백질에 대해 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 융합 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다.

일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 11의 단백질에 대해 적어도 60%의 서열 동일성을 갖는 TNF의 비-절단성 막 결합된 형태를 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 11의 단백질에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 TNF의 비-절단성 막 결합된 형태를 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 11의 단백질에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 TNF의 비-절단성 막 결합된 형태를 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 11의 단백질에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 TNF의 비-절단성 막 결합된 형태를 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 11의 단백질에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 TNF의 비-절단성 막 결합된 형태를 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 11의 단백질에 대해 적어도 96%의 서열 동일성을 갖는 TNF의 비-절단성 막 결합된 형태를 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 11의 단백질에 대해 적어도 97%의 서열 동일성을 갖는 TNF의 비-절단성 막 결합된 형태를 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 11의 단백질에 대해 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 TNF의 비-절단성 막 결합된 형태를 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 11의 단백질에 대해 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 TNF의 비-절단성 막 결합된 형태를 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다.

일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 CD40L 및 TNF의 비-절단성 막 결합된 키메라 형태를 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에 따르면, TNF 분자의 리간드 부분은 CD40L의 세포외 부분과 융합될 수 있으며, 여기서 CD40L은 비-절단성인 세포외 부분을 포함하고 TNF는 정의된 TACE 부위(예를 들어, 아미노산 76과 77 사이의 절단 부위)를 결한다. 일부 실시형태에 따르면, CD40L 펩티드 서열의 일부 또는 전부는 TACE 절단 부위에서 원위인 TNF 펩티드 서열의 세포외 영역과 융합된다. 일부 실시형태에 따르면, CD40L/TNF의 키메라 형태는 서열번호: 31의 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 31의 단백질에 대해 적어도 60%의 서열 동일성을 갖는 융합 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 31의 단백질에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 융합 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 31의 단백질에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 융합 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 31의 단백질에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 융합 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 31의 단백질에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 융합 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 31의 단백질에 대해 적어도 96%의 서열 동일성을 갖는 융합 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 31의 단백질에 대해 적어도 97%의 서열 동일성을 갖는 융합 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 31의 단백질에 대해 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 융합 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 31의 단백질에 대해 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 융합 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다.

일부 실시형태에 따르면, 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하는 동종 종양 세포 백신은 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 또는 그 초과)의 TNF-패밀리 구성원 단백질, 또는 그의 변이체 또는 단편을 포함한다.

분비된 수용체

일 실시형태에 따르면, 개시내용은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하는 동종 종양 세포 백신을 포괄하며, 여기서 종양 세포는 T 림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 자극하도록 유전적으로 조작되며, 모집단은 하나 이상의 분비된 수용체를 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, R 면역조절제는 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5 또는 그 초과)의 분비된 수용체 단백질, 또는 그의 변이체 또는 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 분비된 수용체는 IL10R, TGFβR3, 또는 둘 다이다.

인터루킨-10(IL-10)은 광범위한 백혈구뿐만 아니라 비조혈 세포에 의해 생성되는 주요 면역억제성 사이토카인이다. Shouval, DS., 등, Immunity (2014) 40: 706-719. IL-10은 세포 표면에서 나오는 IL-10 수용체(IL-10R)-의존성 신호를 통해 항-염증성 효과를 매개한다. IL-10R은 IL-10Rα의 2개 하위단위와 IL-10Rβ의 2개 하위단위로 구성된 이종사량체이다. Id., Moore, KW, 등, Annu. Rev. Immunol. (2001) 19: 683-765 인용). IL-10Rα 하위단위는 IL-10 시그널링에 고유한 반면, IL-10Rβ 하위단위는 IL-22, IL-26 및 인터페론 λ를 포함한 다른 사이토카인 수용체와 공유된다, Id. IL-10R을 통한 IL-10 다운스트림 시그널링은 NF-κB-의존성 신호를 차단함에 의해 전염증성 사이토카인의 유도를 억제한다. (Id., Saraiva, M., and O'Garra, A. Nat. Rev. Immunol. (2010) 10: 180-181 인용).

형질전환 성장 인자-베타 수용체 3(TbetaRIII 또는 TbetaR3)은 짧은 41개 아미노산 세포질 도메인을 함유하는 853개 아미노산 막횡단 프로테오글리칸이다. 그것은 거의 모든 세포 유형에서 편재적으로 발현된다. TbetaRIII 발현의 수준은 세포 유형에 특이적이다. 그것은 대부분의 인간 조직에서 세포 증식, 세포자멸사, 분화 및 이동을 매개하는 데 필수적인 역할을 하는 TGF-베타 슈퍼패밀리 시그널링 경로의 구성원이다. TbetaRIII는 가장 풍부하게 발현되는 TGF-베타 수퍼패밀리 수용체이고 TGF-베타 수퍼패밀리 구성원인, TGF-베타1, TGF-베타2 또는 TGF-베타3, 인히빈, BMP-2, BMP-4, BMP-7 및 GDF-5에 결합하여 TGF-베타 수퍼패밀리 공동-수용체로 기능하고 이들 리간드를 그 각각의 시그널링 수용체에 제시하여 Smad 전사 인자에 대한 TGF-베타1, BMP 또는 액티빈 시그널링을 활성화하거나 억제한다(인히빈의 경우). 예를 들어, TGF-베타 1, 2 또는 3의 경우, TbetaRIII는 TGF-베타 유형 II 수용체(TbetaRII)에 리간드를 제시한다. 일단 리간드에 결합되면 TbetaRII는 그 다음 TGF-베타 유형 I 수용체(TbetaRI)를 모집하고 트랜스포스포릴화하여 그 키나제 기능을 활성화하고 Smad2/3의 인산화를 야기한다. Smad2 및 Smad3의 인산화는 Smad4와 복합체의 형성과, 핵에 이 복합체를 축적을 야기하며, 여기서 공동-활성화제 및 공동-억제인자와 함께 그것은 증식, 혈관신생, 세포자멸사 및 분화와 관련된 유전자의 전사를 조절한다. 수용체 매개된 Smad 시그널링을 조절하는 것 외에도 TbetaRIII는 리간드 의존적이고 독립적인 p38 경로 시그널링을 또한 매개한다. TbetaRIII는 또한 TGF-베타 슈퍼패밀리 구성원을 결합하고 격리하여 그의 시그널링을 억제하는 가용성 TbetaRIII(sTbetaRIII)를 생성하기 위해 엑토도메인 누출을 겪을 수 있다. sTbetaRIII 발현이 TbetaRIII의 세포 표면 발현과 상관관계가 있는 것으로 입증되었지만, sTbetaRIII 생산의 조절에 대해서는 알려진 바가 거의 없다. TbetaRIII 누출은 막 유형 기질 메탈로프로테아제(MT-MMP) MT1-MMP 및/또는 MT3-MMP, 및 TbetaRIII의 세포외 도메인을 절단하는 것으로 밝혀진 세린 프로테이나제인, 플라스민에 의해 부분적으로 매개될 수 있다. 부가하여, TbetaRIII 누출은 티로신 포스파타제 억제제인, 퍼바나데이트에 의해 조절된다. 이를 뒷받침하여, MT-MMP 및 ADAM 프로테아제 억제제인, TAPI-2는 TbetaRIII 누출을 억제하는 것으로 나타났다. TbetaRIII 발현의 조절은 TGF-베타 시그널링을 변경하기에 충분하다. TbetaRIII의 세포질 도메인은 TbetaRIII 세포 표면 발현을 안정화시키고 TGF-베타 시그널링을 증가시키는, PDZ-도메인 함유 단백질인 GAIP 상호작용 단백질, C 말단(GIPC)과 상호작용한다. TbetaRIII와 GIPC 사이의 상호작용은 또한 유방암 진행 동안 TGF-베타 시그널링, 세포 이동 및 침윤의 TbetaRIII 매개된 억제에서 중요한 역할을 수행한다. TbetaRIII의 세포질 도메인은 TbetaRII에 의해 인산화되어, 스캐폴딩 단백질 베타-아레스틴2에 대한 TbetaRIII 결합을 초래한다. TbetaRIII/베타-아레스틴2 상호작용은 베타-아레스틴2/TbetaRIII/TbetaRII의 공동-내재화 및 TGF-베타 시그널링의 하향-조절을 초래한다. TbetaRIII와 베타-아레스틴2 사이의 상호작용은 BMP 시그널링뿐만 아니라 TGF-베타 시그널링을 조절한다. TbetaRIII는 ALK6의 내재화 및 ALK6 특이적 BMP 시그널링 이벤트의 자극을 매개하기 위해 베타-아레스틴2 의존적 방식으로 BMP 유형 I 수용체인, ALK6과 복합체를 형성한다. 베타-아레스틴2와의 그 상호작용을 통해 TbetaRIII는 유방암과 관련하여 NFκ-B 시그널링을 부정적으로 조절하고, alpha5beta1 내재화 및 초기 국소 부착으로의 트래피킹의 조절을 통해 피브로넥틴에 대한 상피 세포 부착, 섬유소형성 및 국소 부착 형성을 조절하고, Cdc42를 활성화하여, 액틴 세포골격을 변경하고 정상 및 암성 난소 상피 세포의 이동을 억제한다. 발달 동안 TbetaRIII는 심장에서 방실 쿠션의 형성에 중요한 역할을 한다. 발달 동안 TbetaRIII의 중요한 역할과 일치하여, TGFbetaR3 널 마우스는 심장 및 간 결함으로 인해 치명적인 배아이다. TGFbetaR3은 최근 유방암, 폐암, 난소암, 췌장암 및 전립선암을 포함한 다중 유형의 인간 암에서 종양 억제인자로 식별되었다. 이들 암 유형에서 TGFbetaR3의 손실은 질환 진행과 상관관계가 있고, 시험관내에서 증가된 운동성 및 침윤과 생체내에서 증가된 침습 및 전이를 초래한다. (http://atlasgeneticsoncology.org/Genes/TGFBR3ID42541ch1p33.html, 2019년 8월 26일 방문).

샤페론

일부 실시형태에 따르면, R 면역조절제의 하위집합은 하나 이상의 샤페론 단백질을 포함할 수 있다. 일 실시형태에 따르면, 개시내용은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하는 동종 종양 세포 백신을 포괄하며, 여기서 종양 세포는 T 림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 자극하도록 유전적으로 조작되며, 모집단은 하나 이상의 샤페론 단백질을 포함한다. 따라서, 개시내용은 샤페론 단백질의 전장, 단편, 상동체, 변이체 또는 돌연변이를 포함하는 샤페론 단백질을 포괄한다. 샤페론은 생리학적 및 스트레스 조건 하에서 세포에서 단백질 접힘을 보조하는 단백질의 기능적으로 관련된 그룹이다. 일부 실시형태에 따르면, 샤페론 단백질은 GRP78/BiP, GRP94, GRP170, 칼넥신, 칼레티쿨린, HSP47, ERp29, 단백질 이황화 이성화효소(PDI), 펩티딜 프롤릴 시스-트랜스-이성화효소(PPI), Erp57, Hsp60, Hsp70, Hsp90, Hsp100 중 하나 이상으로부터 선택된다.

일부 실시형태에 따르면, 샤페론 단백질은 막 결합되어 있다.

일부 실시형태에 따르면, 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하는 동종 종양 세포 백신은 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5 또는 그 초과)의 샤페론 단백질, 또는 그 변이체 또는 단편을 포함한다.

면역글로불린 S슈퍼패밀리(IgSF)

일부 실시형태에 따르면, R 면역조절제의 하위집합은 하나 이상의 IgSF 단백질을 포함할 수 있다. 일 실시형태에 따르면, 개시내용은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하는 동종 종양 세포 백신을 포괄하며, 여기서 종양 세포는 T 림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 자극하도록 유전적으로 조작되며, 모집단은 하나 이상의 IgS 패밀리 단백질을 포함한다. 따라서, 개시내용은 IgSF 슈퍼패밀리 구성원의 전장, 단편, 상동체, 변이체 또는 돌연변이를 포함하는 IgSF 슈퍼패밀리의 구성원을 포괄한다. 면역글로불린 슈퍼패밀리(IgSF)는 세포의 접합, 결합 및 인식 과정과 연관된 단백질의 부류이다. 분자는 면역글로불린과 공유된 구조적 특성에 기반한 이 슈퍼패밀리의 구성원으로 분류된다; 그것은 모두 면역글로불린 도메인 또는 접힘으로 알려진 도메인을 보유한다. IgSF의 구성원은 면역계의 세포 표면 항원 수용체, 공동-수용체 및 공동-자극 분자, 림프구에 대한 항원 제시에 관여하는 분자, 세포 부착 분자, 특정 사이토카인 수용체 및 세포내 근육 단백질을 포함한다. IgSF의 구성원은 다음과 같이 분류될 수 있다: 항원 수용체(예를 들어, 항체 또는 면역글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM); 항원 제시 분자(예를 들어, MHC 클래스 I, MHC 클래스 II); 공동-수용체(예를 들어, CD4, CD8); 공동-자극 또는 억제 분자(예를 들어, CD28, Cd80, CD86); 자연 사멸 세포 상의 수용체(예를 들어, 사멸-세포 면역글로불린 유사-수용체(KIR)); 백혈구 상의 수용체(예를 들어, 백혈구 면역글로불린 유사-수용체(LILR)); IGSF CAM(예를 들어, NCAM, ICAM-1); 사이토카인 수용체; 성장 인자 수용체; 수용체 티로신 키나제/포스파타제; IgG 결합 수용체.

일부 실시형태에 따르면, IgSF 구성원은 막 결합되어 있다.

폴리오바이러스 수용체(PVR/CD155)는 면역글로불린 슈퍼패밀리에 속하는 막횡단 당단백질이다. PVR/CD155는 NK 세포 부착을 매개하고 NK 세포 효과기 기능을 촉발한다. PVR/CD155는 2개의 다른 NK 세포 수용체인: CD96과 CD226에 결합한다. 이들 상호작용은 세포-세포 접촉 부위에 축적되어, NK 세포와 표적 세포 사이에 성숙한 면역학적 시냅스의 형성을 야기한다. 이것은 용리성 과립 및 IFN-감마(IFNγ)의 부착 및 분비를 촉발하고 활성화된 NK 세포의 세포독성을 활성화할 수 있으며, 또한 NK 세포-표적 세포 모듈 교환 및 NK 세포로의 PVR 전달을 촉진할 수 있다.

넥틴-2로도 알려진 폴리오바이러스 수용체-관련 2(PVRL2)는 2개의 Ig-유사 C2-유형 도메인 및 Ig-유사 V-유형 도메인을 갖는 단일-통과 유형 I 막 당단백질이다. 이 단백질은 부착 접합부의 원형질막 구성요소 중 하나이다.

B-림프구 활성화 마커(BLAST-1) 또는 시그널링 림프구 활성화 분자 2(SLAMF2)로도 알려진 CD48 항원(분화 클러스터 48)은 인간에서 CD48 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이다. CD48은 CD84, CD150, CD229 및 CD244와 같은 SLAM(시그널링 림프구 활성화 분자) 단백질을 포함하는 IgSF의 CD2 서브패밀리의 구성원이다. CD48은 림프구 및 기타 면역 세포, 수지상 세포 및 내피 세포의 표면 상에서 발견되고 이들 세포의 활성화 및 분화 경로에 참여한다.

NK-T-B 항원(NTBA)은 NK, T 및 B 세포 상에 발현된 표면 분자이다. 인간 NK 세포에서, NTBA는 자연 세포독성 수용체(NCR)의 높은 표면 밀도를 발현하는 세포에서만 세포용리 활성을 촉발할 수 있기 때문에 주로 공동수용체로 작용하는 것으로 나타났다. 분자 클로닝은 NTBA가 CD2 패밀리에 그 할당을 허용하는 구조적 특성을 특징으로 하는 Ig 슈퍼패밀리의 구성원임을 밝혔다.

일 실시형태에 따르면, IgSF 단백질은 IgG이다. 일 실시형태에 따르면, IgSF 단백질은 PVR/CD155이다. 일 실시형태에 따르면, IgSF 단백질은 CD48이다. 일 실시형태에 따르면, IgSF 단백질은 넥틴2이다. 일 실시형태에 따르면, IgSF 단백질은 NK-T-B 항원이다.

면역글로불린(Ig)은 면역 세포에 의해 생성되는 당단백질이다. 항체는 혈청 단백질이며, 그 분자는 그 표적 상의 작은 화학적 그룹화에 상보적인 그 표면의 작은 영역을 가지고 있다. 이들 상보적 영역(상보적 결정 영역(CDR), 또는 항체 조합 부위 또는 항원 결합 부위로 지칭됨)에는 항체 분자당 적어도 2개가 있고 일부 유형의 항체 분자에서는 10, 8 또는 일부 종에서는 최대 12개가 항원 상의 상응하는 상보적 영역(항원 결정기 또는 에피토프)과 반응하여 여러 분자의 다가 항원을 함께 연결하여 격자를 형성할 수 있다. 면역글로불린은 박테리아 또는 바이러스가 나타내는 항원과 같은 특정 항원에 결합함에 의해 면역 반응에서 중요한 역할을 수행한다. 일부 실시형태에 따르면, 항원에 대한 면역글로불린의 결합은 대상체의 면역 세포에 의한 파괴를 위해 항원을 표적화할 수 있다.

전체 항체 분자의 기본 구조 단위는 4개 폴리펩티드 사슬, 2개 동일한 경쇄(L)(각각 약 220개 아미노산 함유) 및 2개 동일한 중쇄(H)(각각 일반적으로 약 440개 아미노산 함유)로 구성된다. 2개 중쇄와 2개 경쇄는 비공유 및 공유(이황화) 결합의 조합에 의해 함께 유지된다. 분자는 경쇄의 N-말단 영역과 중쇄의 N-말단 영역으로 구성된 동일한 항원-결합 부위를 각각 가진 2개의 동일한 반쪽으로 구성된다. 경쇄와 중쇄 둘 다는 일반적으로 협력하여 항원 결합 표면을 형성한다.

포유동물에는 5가지 부류의 항체인, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 있으며, 각각 그 자체 부류의 중쇄-α(IgA의 경우), δ(IgD의 경우), ε(IgE의 경우), γ(IgG의 경우) 및 μ(IgM의 경우)를 갖는다. 부가하여, 각각 γ1, γ2, γ3 및 γ4 중쇄를 갖는 4개 하위부류의 IgG 면역글로불린(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)이 있다. 그 분비된 형태에서 IgM은 총 10개 항원 결합 부위를 제공하는, 5개의 4-사슬 단위로 구성된 5량체이다. 각 5량체는 2개의 인접한 꼬리 영역 사이에 공유적으로 삽입된 J 사슬의 한 카피를 함유한다.

말초 혈액 림프구로부터의 면역글로불린 중쇄(VH) 및 경쇄(Vκ 및 Vλ) 가변 유전자의 다양한 라이브러리는 또한 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭에 의해 증폭될 수 있다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인이 폴리펩티드 스페이서에 의해 연결된 단일 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 유전자는 PCR을 사용하여 중쇄 및 경쇄 V-유전자를 무작위로 조합함에 의해 제작될 수 있다.

일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 IgG1 중쇄 불변 영역을 발현하도록 조작될 수 있다. 자연에서 Ig 감마-1(IgG-1) 사슬 C 영역은 인간에서의 IGHG1 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 1의 막 결합된 형태 IgG-1 사슬 C 단백질을 발현할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 2의 IgG-1 사슬 C의 분비된 형태를 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 3의 IgG-1 사슬 C의 분비된 형태를 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 아미노산 서열 서열번호: 1, 서열번호: 2, 및 서열번호: 3을 갖는 하나 이상의 단백질에 대해 적어도 60%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 아미노산 서열 서열번호: 1, 서열번호: 2, 및 서열번호: 3을 갖는 하나 이상의 단백질에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 아미노산 서열 서열번호: 1, 서열번호: 2, 및 서열번호: 3을 갖는 하나 이상의 단백질에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 아미노산 서열 서열번호: 1, 서열번호: 2, 및 서열번호: 3을 갖는 하나 이상의 단백질에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 아미노산 서열 서열번호: 1, 서열번호: 2, 및 서열번호: 3을 갖는 하나 이상의 단백질에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 아미노산 서열 서열번호: 1, 서열번호: 2, 및 서열번호: 3을 갖는 하나 이상의 단백질에 대해 적어도 96%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 아미노산 서열 서열번호: 1, 서열번호: 2, 및 서열번호: 3을 갖는 하나 이상의 단백질에 대해 적어도 97%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 아미노산 서열 서열번호: 1, 서열번호: 2, 및 서열번호: 3을 갖는 하나 이상의 단백질에 대해 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 아미노산 서열 서열번호: 1, 서열번호: 2, 및 서열번호: 3을 갖는 하나 이상의 단백질에 대해 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다.

일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 아미노산 서열 서열번호: 12, 서열번호: 32, 서열번호: 33, 서열번호: 34, 서열번호: 35, 서열번호: 36, 서열번호: 37, 서열번호: 38, 서열번호: 39, 서열번호: 40, 서열번호: 45, 및 서열번호: 46을 갖는 하나 이상의 단백질에 대해 적어도 60%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 아미노산 서열 서열번호: 12, 서열번호: 32, 서열번호: 33, 서열번호: 34, 서열번호: 35, 서열번호: 36, 서열번호: 37, 서열번호: 38, 서열번호: 39, 서열번호: 40, 서열번호: 45, 및 서열번호: 46을 갖는 하나 이상의 단백질에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 아미노산 서열 서열번호: 12, 서열번호: 32, 서열번호: 33, 서열번호: 34, 서열번호: 35, 서열번호: 36, 서열번호: 37, 서열번호: 38, 서열번호: 39, 서열번호: 40, 서열번호: 45, 및 서열번호: 46을 갖는 하나 이상의 단백질에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 아미노산 서열 서열번호: 12, 서열번호: 32, 서열번호: 33, 서열번호: 34, 서열번호: 35, 서열번호: 36, 서열번호: 37, 서열번호: 38, 서열번호: 39, 서열번호: 40, 서열번호: 45, 및 서열번호: 46을 갖는 하나 이상의 단백질에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 아미노산 서열 서열번호: 12, 서열번호: 32, 서열번호: 33, 서열번호: 34, 서열번호: 35, 서열번호: 36, 서열번호: 37, 서열번호: 38, 서열번호: 39, 서열번호: 40, 서열번호: 45, 및 서열번호: 46을 갖는 하나 이상의 단백질에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 아미노산 서열 서열번호: 12, 서열번호: 32, 서열번호: 33, 서열번호: 34, 서열번호: 35, 서열번호: 36, 서열번호: 37, 서열번호: 38, 서열번호: 39, 서열번호: 40, 서열번호: 45, 및 서열번호: 46을 갖는 하나 이상의 단백질에 대해 적어도 96%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 아미노산 서열 서열번호: 12, 서열번호: 32, 서열번호: 33, 서열번호: 34, 서열번호: 35, 서열번호: 36, 서열번호: 37, 서열번호: 38, 서열번호: 39, 서열번호: 40, 서열번호: 45, 및 서열번호: 46을 갖는 하나 이상의 단백질에 대해 적어도 97%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 아미노산 서열 서열번호: 12, 서열번호: 32, 서열번호: 33, 서열번호: 34, 서열번호: 35, 서열번호: 36, 서열번호: 37, 서열번호: 38, 서열번호: 39, 서열번호: 40, 서열번호: 45, 및 서열번호: 46을 갖는 하나 이상의 단백질에 대해 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 아미노산 서열 서열번호: 12, 서열번호: 32, 서열번호: 33, 서열번호: 34, 서열번호: 35, 서열번호: 36, 서열번호: 37, 서열번호: 38, 서열번호: 39, 서열번호: 40, 서열번호: 45, 및 서열번호: 46을 갖는 하나 이상의 단백질에 대해 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다.

일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 종양 세포 특이적 항원에 결합할 수 있는 IgG 단백질을 발현하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 전립선암 특이적 항원; 예를 들어, 전립선-특이적 막 항원(PSMA)의 세포외 영역에 결합할 수 있는 IgG 단백질을 발현하도록 조작될 수 있다(Chang, S., Overview of Prostate-Specific Membrane Antigen, Reviews in Urology, Vol.6 Suppl. 10, S13 (2004) 참고). 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 면역 세포 특이적 항원에 결합할 수 있는 IgG 단백질을 발현하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 T 세포 마커, 예를 들어 CD3, CD4 또는 CD8에 결합할 수 있는 IgG 단백질을 발현하도록 조작될 수 있다. 또 다른 예에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 수지상 세포 마커, 예를 들어 CD11c 또는 CD123에 결합할 수 있는 IgG 단백질을 발현하도록 조작될 수 있다.

일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 IgG3 중쇄 불변 영역을 발현하도록 조작될 수 있다. 자연에서, IgG3 중쇄 불변 영역은 CH1-힌지-CH2-CH3 도메인을 포함하고, 인간에서 IGHG3 유전자에 의해 인코딩되고; IGHG3 유전자는 상이한 힌지 길이를 포함하는 구조적 다형성을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 4의 IgG-3 중쇄 불변 영역을 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 아미노산 1-76이 누락된 서열번호: 4의 유도체를 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 아미노산 1-76이 누락된 서열번호: 4의 유도체를 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 아미노산 77-98이 아미노산 QMQGVNCTVSS(서열번호: 101)로 대체된 서열번호: 4의 유도체를 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 E213Q 변이체(서열번호: 16)를 포함하는 서열번호: 4의 유도체를 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 P221L 변이체(서열번호: 17)를 포함하는 서열번호: 4의 유도체를 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 E224Q 변이체(서열번호: 18)를 포함하는 서열번호: 4의 유도체를 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 Y226F 변이체(서열번호: 19)를 포함하는 서열번호: 4의 유도체를 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 D242N 변이체(서열번호: 20)를 포함하는 서열번호: 4의 유도체를 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 N245D 변이체(서열번호: 21)를 포함하는 서열번호: 4의 유도체를 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 T269A 변이체(서열번호: 22)를 포함하는 서열번호: 4의 유도체를 발현하도록 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 S314N 변이체(서열번호: 23)를 포함하는 서열번호: 4의 유도체를 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 결실된 S314(서열번호: 24)를 포함하는 서열번호: 4의 유도체를 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 F366Y 변이체(서열번호: 25)를 포함하는 서열번호: 4의 유도체를 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다.

일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 4의 단백질에 대해 적어도 60%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 4의 단백질에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 4의 단백질에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 4의 단백질에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 4의 단백질에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 4의 단백질에 대해 적어도 96%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 4의 단백질에 대해 적어도 97%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 4의 단백질에 대해 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 4의 단백질에 대해 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다.

일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 하나 이상의 IgG 중쇄 가변 영역을 발현하도록 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 람다/카파 경쇄 불변 및/또는 경쇄 가변 영역을 발현하도록 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, IgG의 힌지 영역은 면역 세포 상의 FcyR 수용체에 결합한다. 일부 실시형태에 따르면, IgG는 FcyR을 활성화하고 항원(예를 들어, 전립선암 세포와 연관된 PSA)의 제시를 증진시키는 데 효과적이다.

일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 종양 세포의 세포 표면 상에서 온전한 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 발현하도록 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 온전한 모노클로날 또는 폴리클로날 항체는 면역원성 반응을 유도하는 분자를 전달하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에 따르면, 온전한 모노클로날 항체는 DNA에 결합하여 면역 세포에 CpG 모티프를 전달하도록 설계될 수 있다.

일부 실시형태에 따르면, 박테리아 DNA의 면역자극 활성은 비메틸화된 CpG 모티프를 면역 세포에 전달하도록 면역조절제를 조작함에 의해 모방될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에 따르면, IgG는 비오틴에 결합하도록 조작될 수 있고, 이는 그 다음 비오틴화된 CpG를 면역계의 세포에 전달할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, CpG 모티프는 전신 효과를 방지하기 위해 종양 세포 백신의 종양 세포의 표면에 직접적으로 또는 간접적으로 결합될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, CpG 모티프는 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체로부터의 종양 세포의 표면 상에 제시된 하나 이상의 항원에 접합될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, CpG는 클래스 A CpG이다. 일부 실시형태에 따르면, CpG는 클래스 B CpG이다. 일부 실시형태에 따르면, CpG는 클래스 C CpG이다. 일부 실시형태에 따르면, CpG는 서열 5' EEAACCGTATCGGCGATATCGGTTEEEEEG 3'(서열번호: 102)의 CpG 30-mer이다. CpG 모티프와 관련하여 본 명세서에 사용된 "E"는 G-포스포로티오에이트이고 이 연결은 뉴클레오티드의 3' 말단을 지칭한다(즉, 포스포로티오에이트 결합은 뉴클레오티드 골격에서 비-가교 산소에 대한 황 원자를 대체함). 일부 실시형태에 따르면, CpG는 서열 5'-비오틴-EEAACCGTATCGGCGATATCGGTTEEEEEG-3'(서열번호: 102)의 비오틴화된 30-mer이다. 일부 실시형태에 따르면, CpG는 서열 5' EEAACCGTATGCGGCATATCGGTTEEEEEG 3'(서열번호: 103)의 CpG 30-mer이다. 일부 실시형태에 따르면, CpG는 서열 5'-비오틴-EEAACCGTATGCGGCATATCGGTTEEEEEG-3'(서열번호: 103)의 비오틴화된 CpG 30-mer이다.

일부 실시형태에 따르면, IgG는 하나 이상의 IgG 서브클래스의 하이브리드로 조작될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에 따르면, IgG는 IgG1 및 IgG3로부터의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, IgG는 비오틴에 대한 친화성을 갖도록 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 45의 단백질에 대해 적어도 60%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 45의 단백질에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 45의 단백질에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 45의 단백질에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 45의 단백질에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 45의 단백질에 대해 적어도 96%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 45의 단백질에 대해 적어도 97%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 45의 단백질에 대해 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 45의 단백질에 대해 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다.

일부 실시형태에 따르면, IgG는 IgG에 대한 Fc 수용체(FcyR)에 대한 친화도를 증진시키는 야생형 IgG에 비해 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 돌연변이 T323A 및 E325A 중 하나 이상을 갖는 서열번호: 45의 하나 이상의 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 41, 서열번호: 30 및 서열번호: 43 중 하나 이상의 단백질에 대해 적어도 60%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 41, 서열번호: 30 및 서열번호: 43 중 하나 이상의 단백질에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 41, 서열번호: 30 및 서열번호: 43 중 하나 이상의 단백질에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 41, 서열번호: 30 및 서열번호: 43 중 하나 이상의 단백질에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 41, 서열번호: 30 및 서열번호: 43 중 하나 이상의 단백질에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 41, 서열번호: 30 및 서열번호: 43 중 하나 이상의 단백질에 대해 적어도 96%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 41, 서열번호: 30 및 서열번호: 43 중 하나 이상의 단백질에 대해 적어도 97%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 41, 서열번호: 30 및 서열번호: 43 중 하나 이상의 단백질에 대해 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서열번호: 41, 서열번호: 30 및 서열번호: 43 중 하나 이상의 단백질에 대해 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다.

일부 실시형태에 따르면, 동종 종양 세포 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하며, 종양 세포는 하나 이상의(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 또는 초과) IgSF 단백질, 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함한다.

케모카인 수용체

일부 실시형태에 따르면, R 면역조절제의 하위집합은 하나 이상의 케모카인 수용체를 포함할 수 있다. 케모카인 수용체는 케모카인의 결합 시 세포 반응을 활성화하는 매개체로 정의된다. 인간 케모카인 수용체의 23개의 하위유형이 식별되었으며, 이들 모두는 수용체의 7개-막횡단(7TM) 도메인 수퍼패밀리의 구성원이다. 그것은 2가지 주요 그룹으로 나눌 수 있다: G 단백질-커플링된 화학주성 케모카인 수용체(n = 19) 및 비정형 케모카인 수용체(n = 4). 양 그룹으로부터의 수용체에 대한 케모카인 결합, 막 고착 및 시그널링 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬에서 유래한다. 이들 수용체가 동종- 및 이종이량체를 형성한다는 구조적 및 생화학적 증거가 존재한다.

일부 실시형태에 따르면, 케모카인 수용체는 막 결합되어 있다.

일 실시형태에 따르면, 본 개시내용은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하는 동종 종양 세포 백신을 포괄하며, 여기서 종양 세포는 T 림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 자극하도록 유전적으로 조작되며, 상기 모집단은 하나 이상의 케모카인 수용체를 포함한다. 따라서, 개시내용은 케모카인 수용체의 전장, 단편, 상동체, 변이체 또는 돌연변이체를 포함하는 케모카인 수용체를 포괄한다. 사이토카인은 다른 세포의 생물학적 기능에 영향을 미치는데 효과적인 단백질을 포함한다. 사이토카인에 의해 영향을 받는 생물학적 기능은 세포 성장, 세포 분화 또는 세포 사멸을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 개시내용의 케모카인 수용체는 면역 세포(예를 들어, T 림프구(예를 들어, CD8+ T 세포), 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구)를 자극할 수 있다.

일부 실시형태에 따르면, 케모카인 수용체는 CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR5, CXCR6, CXCR8, CCR8, CCR1, CCR2, CCR3, CCR5, CCR4, CCR6, CCR7, CCR9, CCR10, CXCR1, 및 CXCR3 중 하나 이상으로부터 선택된다.

CD28 리간드(CD28L)

T 세포 상의 CD28 수용체의 결찰은 나이브 T 세포 활성화를 위한 T 세포 수용체(TCR) 결찰과 함께 중요한 제2 신호를 제공한다. Esenstein, JH 등, Immunity (2016) 44(5): 973-988). CD28은 T 세포의 장기 확장 및 분화에 필수적인 고유한 인산화 및 전사 시그널링, 대사, 및 주요 사이토카인, 케모카인 및 생존 신호의 생성을 포함한 주요한 세포내 생화학적 이벤트를 유도한다(Id., Bluestone, JA 등, Immunity. (2006)24: 233-238; Bour-Jordan, H. 등, Immunol Rev. (2011) 241:180-205; Martin, PJ 등, J Immunol. (1986) 136: 3282-3287; Weiss, A. 등, J Immunol. (1986) 137:819-825 인용).

CD28은 세포외 가변 면역글로불린-유사 도메인을 특징으로 하는 공동자극 분자의 서브패밀리의 기초 구성원이다. 서브패밀리의 다른 구성원은 ICOS, CTLA4, PD1, PD1H 및 BTLA를 포함한다(Id., Chen, L. and Flies, D.B., Nat Rev Immunol. 2013;13:227-242 인용). CD28은 마우스 T 세포 상에서 구성적으로 발현되는 반면, 다른 패밀리 구성원 ICOS 및 CTLA4의 발현은 T 세포 수용체 자극에 의해 그리고 인터루킨 2(IL-2)와 같은 사이토카인에 대한 반응으로 유도된다. CD28은 대략 80%의 인간 CD4+ T 세포와 50% CD8+ T 세포 상에서 발현된다. 인간에서 CD28 양성 T 세포의 비율은 나이가 들면서 감소한다. CD28 발현이 골수 기질 세포, 형질 세포, 호중구 및 호산구를 포함한 다른 세포 계통에서 식별되었지만, 이들 세포에 대한 CD28의 기능적 중요성은 완전히 이해되지 않았다(Id., Gray Parkin, K., 등, J Immunol. (2002) 169:2292-2302; Rozanski, CH 등, J Exp Med. (2011) 208:1435-1446; Venuprasad, K., 등, Eur J Immunol. (2001) 31:1536-1543; Woerly, G. 등, Clin Exp Allergy. (2004) 34:1379-1387 인용).

CD28 리간드 CD80 및 CD86은 그의 발현 패턴, 다량체 상태 및 기능성이 다양하여 CD28 시그널링의 조절에 또 다른 층의 복잡성을 부가한다. CD80은 세포 표면 상에 주로 이량체 형태로 존재하는 반면 CD86은 단량체성이다(Id., Bhatia, S. 등, Proc Natl Acad Sci U S A. (2005) 102:15569-155742005 인용). CD86은 항원 제시 세포(APC) 상에서 구성적으로 발현되고 APC의 타고난 자극에 의해 빠르게 상향 조절되는 반면(Id., Lenschow, DJ 등, J Immunol. (1994) 153:1990-1997 인용), 다른 CD28 리간드인, CD80은 나중 시점에서 상향조절된다(Id., Sharpe, AJ and Freeman, GJ, Nat Rev Immunol. (2002) 2:116-126 인용). 따라서 CD86은 면역 반응의 개시에 더 중요할 수 있다. CD80과 CD86은 서로 다른 세포 유형에서 서로 다른 자극에 의해 유도되고 기능상 상호교환가능하지 않다.

CD28 및 CTLA4는 T 세포 자극에 대해 반대 효과를 갖는다. CD28은 활성화 신호를 제공하고 CTLA4는 억제 신호를 제공하며, 이는 현재 원형 면역 체크포인트로 간주된다(Id., Krummel, MF and Allison, JP, J Exp Med. 1995;182:459-465; Walunas, TL 등, Immunity. (1994) 1:405-413 인용). 활성화에도 기여하는 ICOS는 그 리간드 B7H2(ICOSL)에 결합하며, 이는 또한 인간 CD28 및 CTLA4에 대한 리간드로 작용한다(Id., Chen, L. and Flies, DB, Nat Rev Immunol. (2013) 13:227-242; Yao, S. 등, Immunity (2011) 34:729-740 인용). 따라서 이 수용체 및 리간드의 패밀리는 결합 패턴과 생물학적 효과 둘 다에서 상당한 복잡성을 가지고 있다. 전반적으로, CTLA4와 비교하여 CD28 및 ICOS의 상반된 역할은 이 수용체 및 리간드의 패밀리가 경쟁적인 향- 및 항-염증 효과를 통해 면역 반응에 대한 가감저항기 역할을 할 수 있도록 한다. Id.

CTLA4Ig와의 결찰이 APC에서 트립토판 대사를 조절하는 것으로 나타났기 때문에, CD80 및 CD86은 또한 신호 변환 수용체 자체로 작용할 수 있다고 제안되었다(Id., Grohmann, U 등, Nat Immunol. (2002) 3:1097-1101 인용). T 세포 외에 형질 세포도 CD28을 발현한다. CD28 신호는 형질 세포 생물학에서 CD28이 수행하는 정확한 역할이 아직 불분명하지만 형질 세포 또는 형질 세포 생존에 의한 항체 생산을 조절할 수 있다(Id., Njau, NM and Jacob, J., Adv Exp Med Biol. (2013) 785:67-75 인용).

CD28 유전자는 44kDa의 글리코실화된, 이황화-연결된 동종이량체로서 세포 표면 상에 발현되는 220개 아미노산의 단백질을 인코딩하는 4개 엑손으로 구성되어 진다. CD28 패밀리의 구성원은 다수의 공통 특성을 공유한다. 이들 수용체는 단일 막횡단 도메인에 부착된 쌍을 이루는 V-세트 면역글로불린 슈퍼패밀리(IgSF) 도메인 및 주요한 시그널링 모티프를 함유하는 세포질 도메인으로 구성된다(Id., Carreno, BM and Collins, M, Annu Rev Immunol. (2002) 20: 29-53 인용). CD28 및 CTLA4 리간드인, CD80 및 CD86은 단일 V-세트 및 C1-세트 IgSF 도메인으로 구성된다. 이들 공동자극 수용체와 리간드의 상호작용은 수용체 V-세트 도메인 내에서 MYPPPY 모티프(서열번호: 105)를 통해 매개된다(Id., Evans, EJ 등, Nat Immunol. (2005) 6:271-279; Metzler, WJ 등, Nat Struct Biol. (1997) 4: 527-531 인용).

그의 리간드에 의한 CD28 계합은 CD28의 세포질 꼬리와 단백질의 특이적 연계에 의존하는 신호 변환 이벤트를 개시한다. 고유한 효소 활성이 없음에도 불구하고, 인간 CD28의 41개 아미노산 세포질 꼬리는 TCR 또는 CD28 자극에 반응하여 인산화되고 포스포티로신-의존적 방식으로 SH2 도메인과 표적을 결합하는 고도로 보존된 티로신-기반 시그널링 모티프를 함유한다. 세포질 꼬리 내의 프롤린 풍부 서열은 또한 단백질을 함유하는 SH3-도메인에 결합한다. 특히, 막 근위 YMNM 모티프(서열번호: 106) 및 원위 PYAP 모티프(서열번호: 107)는 여러 키나제 및 어댑터 단백질과 복합체를 이루는 것으로 나타났으며, 일부 단백질은 SH2 및/또는 SH3 도메인 상호작용을 통해 어느 하나 또는 양 모티프에 결합할 수 있다(Id., Boomer, JS and Green, JM, Cold Spring Harb Perspect Biol. (2010) 2: a002436 인용). 이들 모티프는 IL-2 유전자 발현에 중요하며, 이는 NFAT, AP-1 및 NF-κB 패밀리 전사 인자의 CD28-의존적 활성화에 의해 매개된다(Id., Fraser, JD 등, Science. (1991) 251:313-316; June, CH 등, Mol Cell Biol. (1987) 7: 4472-4481; Thompson, CB 등, Proc Natl Acad Sci U S A. (1989) 86:1333-1337 인용).

막-근위 YXXM 모티프는 CD28, CTLA4 및 ICOS 간에 공유되고 지질 키나제 포스파티딜이노시톨 3-키나제(PI3K)의 p85 하위단위에 대한 공통 부위이다(Id., August, A. and Dupont, B. Int Immunol. (1994) 6:769-774; Pages, F., 등, Nature. (1994) 369: 327-329; Prasad, KV 등, Proc Natl Acad Sci U S A. (1994) 91: 2834-2838; Rudd, CE and Schneider, H., Nat Rev Immunol. (2003) 3: 544-556 인용). PI3K 특이성을 부여하는 CD28 서열의 +3 메티오닌, YMNM(서열번호: 106)에 부가하여, +2 아스파라긴은 CD28 상의 어댑터 단백질 GRB2 및 GADS에 대한 특이성을 부여한다(Id., Cai, YC 등, Immunity. (1995) 3: 417-426; Kim, HH 등, J Biol Chem. (1998) 273: 296-301; Okkenhaug, K. and Rottapel, R., 1998; Okkenhaug 등, J Biol Chem. (1998) 273: 21194-21202; Raab, M 등, Proc Natl Acad Sci U S A. (1995) 92: 8891-8895; Stein, PH 등, Mol Cell Biol. (1994) 14: 3392-3402 인용). ICOS와 CTLA4 둘 다는 PI3K에 결합할 수 있지만 GRB2에 결합하는 능력이 부족하여, 이들 공동자극 수용체 사이의 기능적 및 시그널링 차이의 일부를 설명할 수 있다(Id., Rudd, CE and Schneider,H Nat Rev Immunol. (2003) 3: 544-556 인용). 증식 및 IL-2 분비를 매개하는 YMNM 모티프(서열번호: 106)의 중요성은 논란의 여지가 있다, C-말단 PYAP 모티프(서열번호: 107)의 시그널링 이벤트 다운스트림은 키나아제 PDK1 및 PKCθ의 인산화 및 활성화, 및 후속적인 GSK3β의 불활성화를 포함하는 것으로 생각되어, 궁극적으로 IL-2를 포함한, NFAT-의존성 유전자의 증진된 전사를 야기한다. SH3-매개된 결합 및 Src 키나제 Lck의 활성화(Id., Holdorf, AD 등, J Exp Med. (1999) 190: 375-384; King, PD 등, J Immunol. (1997) 158: 580-590 인용)는 이 경로의 잠재적 조절자로 제안된다. 어댑터 단백질, GRB2 및 GADS는 원위 PYAP 모티프(서열번호: 107)에서 그 SH3 도메인을 통하거나 또는 막 근위 YMNM 모티프(서열번호: 106)에 대한 그 SH2 도메인을 통해 CD28에 결합할 수 있다. 그러나, NF-κB 활성화에서 더 큰 역할을 하는 것으로 생각되는 것은 C-말단 PYAP 모티프(서열번호: 107)이며, 이는 NF-κB 활성화에 중요한 다른 시그널링 분자가, 상기에서 논의된 바와 같이, Lck와 같은 C-말단 PYAP 모티프(서열번호: 107)에 결합함을 시사한다((Id., Holdorf, AD 등, J Exp Med. (1999) 190: 375-384; Watanabe, R. 등, J Immunol. (2006) 177:1085-1091 인용).

CD28 결찰이 통상적인 T 세포의 증식 및 효과기 기능을 촉진하는 데 중요하지만, 그것은 또한 조절 T(Treg) 세포의 항-염증 기능을 촉진한다. 따라서, CD28은 세포 유형 및 그것이 발현되는 상황에 따라 향- 및 항-염증 역할 둘 다로 작용한다. CD28 신호는 효과기 T 세포가 면역화에 대한 Treg 세포-매개된 억제를 극복할 수 있도록 하는 데 중요하지만(Id., Lyddane, C 등, J Immunol. (2006) 176: 3306-3310 인용), 다른 맥락에서 CD28은 Treg 기능을 촉진함에 의해 자발적인 자가면역을 방지한다(Id., Salomon B. 등, Immunity. 2000;12:431-440 인용).

CD28은 다양한 방식으로 T 세포 항상성과 기능을 지원한다. CD28 신호는 Treg 세포에 의한 최대 IL-10 생산에 중요한 miR17-92 패밀리 구성원의 발현을 지원한다(de Kouchkovsky, D 등, J Immunol. (2013) 191: 1594-1605). 흉선세포는 Foxp3를 상향조절하고 Treg 세포로 분화하기 위해 동시적인 TCR 및 CD28 신호가 필요하다. CD28은 또한 말초 유도된 Treg 세포의 생산에 필요하다. CD4+CD25- T 세포는 TGF-β로 활성화되었을 때 기능적인 Foxp3+ Treg 세포로 분화하기 위해 CD28 결찰을 필요로 했다.

개시된 발명의 일부 실시형태에 따르면, 증식 불능 종양 세포의 모집단은 서열번호: 110의 ENLST™의 막 상에 CD80의 막 결합된 형태를 발현하도록 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 증식 불능 종양 세포의 모집단은 서열번호: 110의 단백질에 대해 적어도 60%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 증식 불능 종양 세포의 모집단은 서열번호: 110의 단백질에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 증식 불능 종양 세포의 모집단은 서열번호: 110의 단백질에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 증식 불능 종양 세포의 모집단은 서열번호: 110의 단백질에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 증식 불능 종양 세포의 모집단은 서열번호: 110의 단백질에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 증식 불능 종양 세포의 모집단은 서열번호: 110의 단백질에 대해 적어도 96%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 증식 불능 종양 세포의 모집단은 서열번호: 110의 단백질에 대해 적어도 97%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 증식 불능 종양 세포의 모집단은 서열번호: 110의 단백질에 대해 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 증식 불능 종양 세포의 모집단은 서열번호: 110의 단백질에 대해 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 조작될 수 있다.

개시된 발명의 일부 실시형태에 따르면, 증식 불능 종양 세포의 모집단은 서열번호: 111의 증식 불능 종양 세포의 모집단의 막 상에 CD86의 막 결합된 형태를 발현하도록 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 증식 불능 종양 세포의 모집단은 서열번호: 111의 단백질에 대해 적어도 60%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 증식 불능 종양 세포의 모집단은 서열번호: 111의 단백질에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 증식 불능 종양 세포의 모집단은 서열번호: 111의 단백질에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 증식 불능 종양 세포의 모집단은 서열번호: 111의 단백질에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 증식 불능 종양 세포의 모집단은 서열번호: 111의 단백질에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 증식 불능 종양 세포의 모집단은 서열번호: 111의 단백질에 대해 적어도 96%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 증식 불능 종양 세포의 모집단은 서열번호: 111의 단백질에 대해 적어도 97%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 증식 불능 종양 세포의 모집단은 서열번호: 111의 단백질에 대해 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 조작될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 증식 불능 종양 세포의 모집단은 서열번호: 111의 단백질에 대해 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하도록 조작될 수 있다.

일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 건강한 대상체와 암 환자의 인간 말초 혈액 단핵 세포를 사용하여 빠른 시험관 내 평가에 적합하여 개체 간 변동성과 정상 환자 간 차이를 검사하여 동물 실험을 피한다.

일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 강력한 항-동종 백신 반응의 유도에 의해 단기적으로 임상적 이점을 제공하고, 장기적으로 내인성 비변형 숙주 종양에 대해 장기간 지속되고 교차 반응성 반응을 제공하도록 개조된다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 종양 세포 백신에 대한 면역 반응은 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체에 고유한 펩티드와 백신을 투여받은 환자의 종양 세포에 고유한 펩티드 사이의 불규칙 교차 반응을 포함한다(예를 들어, 도 1 참조). 일부 실시형태에 따르면, 불규칙 교차 반응은 일반적으로 비면역원성 표면을 제공하는 종양 세포 펩티드-MHC 복합체와 T 세포 수용체의 향상된 결합을 통해 면역원성을 향상시킨다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 종양 세포 백신은 암을 앓는 대상체의 종양 세포에 비해 변경된 펩티드를 포함하며, 여기서 변경된 펩티드는 암을 앓는 대상체의 종양 세포의 비면역원성 펩티드에 대한 불규칙 교차 반응을 일으키는 면역원성 표면을 제공한다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포 백신의 불규칙 인식 및 동종반응성 항원 인식은 백신을 받는 환자의 종양 세포에 대한 면역 반응을 유도하는 데 유용한 광범위한 항원 어레이를 제공한다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 예를 들어 무진행 생존, 무재발 생존 또는 전체 생존의 형태로 임상적 이점을 제공하도록 개조된다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 불규칙 면역화 유도 종양 면역을 제공하는 데 효과적이다(Dyall R., 등, Heteroclitic Immunization Induces Tumor Immunity, J. Exp. Med., Vol. 188, No. 9, November 2, 1998, 본 명세서에 그 전문이 참조로 포함됨).

일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 치료량으로 발현되는 재조합 면역조절 신호를 포함하도록 유전적으로 변형된 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체로부터 유래된다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체와 같은 균일한 출발 물질로부터 유래되며, 여기서 다수의 개별 생물학적 제제는 용해성 또는 막 결합 형태로 출발 물질에서 발현된다. 일부 실시형태에 따르면, 용해성 또는 막 결합 형태의 발현 및 활성이 각각, 말초 혈액 단핵 세포를 사용하는 유세포 분석 및 혼합된 림프구 종양 검정에 의해 시험관 내에서 확인된다. 일부 실시형태에 따르면, 용해성 또는 막 결합 형태의 발현 및 활성은 면역화에 사용된 동종 종양 세포에 대한 백신접종된 암 환자의 말초 혈액 단핵 세포를 사용하는 유세포분석 및 혼합된 림프구 종양 검정에 의해 시험관내에서 확인된다.

일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 외인성 면역조절 분자를 포함하며, 각각은 막 결합 또는 분비된 시그널링 분자를 인코딩한다. 일부 실시형태에 따르면, 각각의 막 결합된 면역조절 분자는 항원 제시의 시간 및 장소에서 우세하게 시그널링을 제공하기 위해 공간적 및 시간적으로 제한된 방식으로 활성인 준약학적 용량으로 치료량을 전달하도록 적응된다. 일부 실시형태에 따르면, 막 결합된 면역조절 분자는 전신 부작용의 가능성을 감소시키도록 적응된다. 일부 실시형태에 따르면, 분비된 면역조절 분자는 전신이 아닌 국소 신호를 전달하도록 적응된다.

일부 양태에 따르면, 동종 백신은 하나 이상의 면역조절 분자를 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체에 유전적으로 도입하는데 효과적인 유전 물질을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 유전 물질은 바이러스 형질도입 기술에 의해 도입되고 유전적으로 도입된 면역 조절제에 대한 양성 선별에 의해 단리될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에 따르면, 유전적으로 도입된 면역 조절제 분자의 양성 선별은 항체를 사용한 선별을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 면역조절 분자는 수지상 세포 및 림프구 하위-모집단(예를 들어, T 세포, 자연 사멸 세포 및 T-조절 세포)과 같은 주요 면역 세포 하위집합에 대한 영향과 관련하여 다양하고 보완적이다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 다양한 면역 세포 하위집합 상의 다양한 면역조절 경로와 관련된 다양한 면역조절 분자를 포함하며, 여기서 모든 경로가 개별 암 환자에서의 면역원성 반응에 동등하게 기여하지는 않을 것이다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체에 유전적으로 도입된 면역조절 분자는 안정적으로 발현된다.

일부 실시형태에 따르면, 본 개시내용의 동종 종양 세포 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하며, 동종 종양 세포는 3개의 안정적으로 발현되는 필수 외인성 면역조절 분자의 핵심인, OX40 리간드(OX40L), CD27 리간드(CD70), 및 CD80, CD86 또는 둘 다를 포함하는 CD28 리간드(CD28L)를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 종양 세포 백신은 (코어 화학 구조의 것들과 유사하게) R 그룹으로 지정된, 안정적으로 발현된 외인성 면역조절제 분자의 하나 이상의 추가의 하위집합을 추가로 포함하며, 각 하위집합은 3~25개 면역조절제를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 하위집합 R은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 면역조절제를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 본 개시내용의 동종 종양 세포 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하며, 여기서 종양 세포는 적어도 3개의 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자 OX40 리간드(OX40L), CD27 리간드(CD70), 및 CD80, CD86 또는 둘 다를 포함하는 CD28 리간드(CD28L)를 안정적으로 발현하도록 유전적으로 조작되며, 또한, 1개의 R 하위집합은 3~25개 면역조절제를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 본 개시내용의 동종 종양 세포 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하며, 여기서 종양 세포는 적어도 3개의 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자 4-IBBL, GM-CSF, OX40L을 안정적으로 발현하도록 유전적으로 조작되며, 또한 2개의 R 하위집합은 3~25개 면역조절제를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 본 개시내용의 동종 종양 세포 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하며, 여기서 종양 세포는 적어도 3개의 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자 OX40 리간드(OX40L), CD27 리간드(CD70), 및 CD80, CD86 또는 둘 다를 포함하는 CD28 리간드(CD28L)를 안정적으로 발현하도록 유전적으로 조작되며, 또한 3개의 R 하위집합은 3~25개 면역조절제를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 본 개시내용의 동종 종양 세포 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하며, 여기서 종양 세포는 적어도 3개의 필수 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자 OX40 리간드(OX40L), CD27 리간드(CD70), 및 CD80, CD86 또는 둘 다를 포함하는 CD28 리간드(CD28L)를 안정적으로 발현하도록 유전적으로 조작되며, 또한 4개의 R 하위집합은 3~25개 면역조절제를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 본 개시내용의 동종 종양 세포 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하며, 여기서 종양 세포는 적어도 3개의 필수 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자 OX40 리간드(OX40L), CD27 리간드(CD70), 및 CD80, CD86 또는 둘 다를 포함하는 CD28 리간드(CD28L)를 안정적으로 발현하도록 유전적으로 조작되며, 또한 5개의 R 하위집합은 3~25개 면역조절제를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 본 개시내용의 동종 종양 세포 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하며, 여기서 종양 세포는 적어도 3개의 필수 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자 OX40 리간드(OX40L), CD27 리간드(CD70), 및 CD80, CD86 또는 둘 다를 포함하는 CD28 리간드(CD28L)를 안정적으로 발현하도록 유전적으로 조작되며, 또한 6개의 R 하위집합은 3~25개 면역조절제를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 본 개시내용의 동종 종양 세포 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하며, 여기서 종양 세포는 적어도 3개의 필수 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자 OX40 리간드(OX40L), CD27 리간드(CD70), 및 CD80, CD86 또는 둘 다를 포함하는 CD28 리간드(CD28L)를 안정적으로 발현하도록 유전적으로 조작되며, 또한 7개의 R 하위집합은 3~25개 면역조절제를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 본 개시내용의 동종 종양 세포 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하며, 여기서 종양 세포는 적어도 3개의 필수 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자 OX40 리간드(OX40L), CD27 리간드(CD70), 및 CD80, CD86 또는 둘 다를 포함하는 CD28 리간드(CD28L)를 안정적으로 발현하도록 유전적으로 조작되며, 또한 8개의 R 하위집합은 3~25개 면역조절제를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 본 개시내용의 동종 종양 세포 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하며, 여기서 종양 세포는 적어도 3개의 필수 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자 OX40 리간드(OX40L), CD27 리간드(CD70), 및 CD80, CD86 또는 둘 다를 포함하는 CD28 리간드(CD28L)를 안정적으로 발현하도록 유전적으로 조작되며, 또한 9개의 R 하위집합은 3~25개 면역조절제를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 본 개시내용의 동종 종양 세포 백신은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하며, 여기서 종양 세포는 적어도 3개의 필수 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자 OX40 리간드(OX40L), CD27 리간드(CD70), 및 CD80, CD86 또는 둘 다를 포함하는 CD28 리간드(CD28L)를 안정적으로 발현하도록 유전적으로 조작되며, 또한 10개의 R 하위집합은 3~25개 면역조절제를 포함한다.

면역원성 가능성 평가

혼합 림프구 종양 세포 반응성

일부 실시형태에 따르면, 유전적으로 도입된 면역조절제는 혼합된 림프구 종양 세포 반응(MLTR)에 의해 그 면역원성 잠재력에 대해 평가될 수 있다. MLTR 검정은 혼합된 림프구를 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체(또는 대조군)와 함께 며칠 동안 인큐베이션하여 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체의 종양 세포가 혼합된 림프구로부터 시험관내에서 면역 반응을 이끌어낼 수 있도록 하는 것을 포함한다. 이 방법은 종양 세포 또는 용리물에 대한 혼합된 림프구 반응(예컨대 림프구의 세포 증식, 림프구의 세포 하위집합 분화, 림프구의 사이토카인 방출 프로파일, 종양 세포 사멸)을 평가하는 신속한 시험관내 방법을 제공할 수 있다. 이 접근법은 인간 말초 혈액 단핵 세포를 사용하여 표현형으로 변형된 형질감염된 종양 세포에 대한 세포, 체액 또는 둘 다의 면역 반응의 포괄적 모니터링을 할 수 있다. MLTR은 또한 뮤어라인 종양 생존 연구에 대한 대안을 제공할 수 있고 항-종양 반응을 위한 최적의 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체의 선별을 초래할 수 있다. 유사한 검정이 Hunter TB 등, (2007) Scandanavian J. Immunology 65, 479-486에 의해 기술되었으며, 이는 그 전체가 참고로 본 명세서에 포함된다.

MLTR은 Stjernsward J, 등 in 1970 (Clin Exp Immunol 6: 963-668, 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 처음으로 기술되었으며, 혼합된 림프구 반응(MLR) 방법에 기반하였다. Uchida A, 등은 MLTR을 사용한 특이적 및 비특이적 킬러 T 세포의 생성을 기술한다(Int J. Canc (1988) 41: 651-656, 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). MLTR은 예를 들어 Eini 등 (Biochemical Pharmacology Volume 98, Issue 1, 1 November 2015, Pages 110-118, 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 나타낸 바와 같은 면역 반응의 수용된 모델이며, 이는 면역 반응 조절(예를 들어, 전염증성 사이토카인 방출의 상승)을 평가하기 위해 MLTR 검정을 사용하고; Wang 등, (Eur J Immunol. 1995 May;25(5):1163-7, 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)은 MLTR 검정을 사용하여 T-세포 증식에 대한 열 안정성 항원의 효과를 평가하고; 그리고 Xiu 등 (J Mol Med (Berl). 2007 May;85(5):511-21. Epub 2007 Jan 12, 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)은 MLTR 검정을 사용하여 종양-특이적 T 세포 반응에 대한 초항원 스타필로코커스 엔테로톡신 A(SEA)-코팅된 종양 세포의 효과를 측정하였다.

일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 형질감염된 종양 세포를 말초 혈액 단핵 세포로부터의 혼합된 림프구와 접촉시키고 이어서 세포 증식, 세포 하위집합 분화, 사이토카인 방출 프로파일 및 종양 세포 용리물 중 적어도 하나를 측정함에 의해 면역원성 잠재력에 대해 시험될 수 있다.

일부 실시형태에 따르면, 혼합된 림프구는 Ficoll-Paque 기울기에 의해 단리된 말초 혈액 단핵 세포에서 얻어질 수 있다. 간단하게 말하면, 항응고제-처리된 혈액을 PBS/EDTA로 1:2 내지 1:4 범위로 희석하여 적혈구의 응집을 감소시킬 수 있다. 그런 다음 희석된 혈액은 혼합 없이 원심분리 튜브에서 Ficoll-Paque 용액 위에 층상화될 수 있다. 층상화된 혈액/Ficoll-Paque는 원심분리기 브레이크를 사용하지 않고 18 내지 20℃ 사이에서 400 x g에서 40분 동안 원심분리되어, 위에서 아래로 혈장을 포함하는 제1 분획; 단핵 세포를 포함하는 제2 분획; Ficoll-Paque 배지를 포함하는 제3 분획; 및 과립구와 적혈구를 포함하는 제4 분획을 포함하는 혈액 분획의 형성을 초래한다.

분획은 특정 분획 성분을 단리하기 위해 추가로 처리될 수 있다. 예를 들어, 단핵 세포를 추가로 처리하기 위해, 단핵 세포를 포함하는 두 번째 분획을 파스퇴르 피펫을 사용하여 Ficoll-Paque 구배에서 조심스럽게 제거할 수 있다. 대안적으로, 두 번째 분획을 바늘로 튜브를 천공하고 두 번째 분획을 직접 빼냄으로써 직접 제거할 수 있다. 그런 다음 두 번째 분획을 세척하고, 300 x g, 18° 및 20℃에서 PBS/EDTA로 3회 원심분리하고, 각 라운드 후 상청액을 버린다.

일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체로부터의 면역조절제의 존재 하에 항종양 면역의 활성화를 직접 평가할 수 있도록 7일 동안 림프구를 포함하는 PBMC와 공동-배양될 수 있다.

일부 실시형태에 따르면, 림프구의 활성화를 측정하기 위해 사용되는 하나의 매개변수는 세포 증식일 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 증식은 ³H-티미딘 혼입에 의해 검출될 수 있다. 간단하게 말하면, 대략 5 x 10³개 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체 세포는 둥근 바닥 96-웰 플레이트에서 대략 1 x 10⁶개 혼합된 림프구와 공동-배양될 수 있다. 배양 3일 후, 세포를 1 μCi의 ³H-티미딘으로 18시간 동안 펄싱할 수 있다. 그런 다음 세포는 필터 매트 상에 수확될 수 있고, ³H-티미딘 혼입은 섬광 계수기를 사용하여 측정될 수 있다. 비-형질감염된 종양 세포 대조군과 비교하여 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체의 증식이 측정될 수 있다. 대조군에 비해 증식에서 증가, 감소 또는 무 변화가 가능한 결과이다.

일부 실시형태에 따르면, 림프구의 활성화를 측정하기 위한 또 다른 매개변수는 사이토카인 방출 프로파일일 수 있다. 예를 들어, 혼합된 림프구 모집단 내 반응성 T 세포의 수는 PBMC에 의한 IFN-감마 및/또는 IL-2 생성의 효소 결합 면역스폿(ELISpot) 분석에 의해 정량화될 수 있다. 간단하게 말하면, 혼합된 림프구 및 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체를 포함하는 PBMC는 3일 내지 7일 배양될 수 있다. 그런 다음, 공동-배양된 세포를 수확하고 항-IFN-감마 및/또는 항-IL-2 항체로 사전 코팅된 ELISpot 플레이트에서 인큐베이션할 수 있다. 20시간 후, 증류수로 2회, 세척 완충액으로 2회 세척하여 세포를 제거할 수 있다. 그런 다음 ELISpot 플레이트를 차단 완충액에서 비오티닐화된 항-IFN-감마 및/또는 항-IL-2 항체 및 스트렙타비딘 알칼리 포스파타제와 1~2시간 동안 접촉시킬 수 있다. 세척 후, 플레이트는 흑점이 나타날 때까지 알칼리 포스파타제 기질과 접촉할 수 있다. 그런 다음 플레이트를 수돗물로 세척하고, 공기 중에서 건조시킬 수 있다. 그런 다음 반점을 수동으로 또는 플레이트 판독기로 정량화하고 형질감염되지 않은 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체 대조군과 비교하였다.

일부 실시형태에 따르면, 림프구의 활성화를 측정하기 위한 또 다른 매개변수는 세포 하위집합 분화를 정량화하는 것일 수 있다. 예를 들어, CD45+/CD3+ T-림프구에서 CD45+/CD3+/CD4+ 헬퍼 T-림프구, CD45+/CD3+/CD8+ 세포독성 T-림프구, 및 CD45+/CD3+/CD25+ 활성화 T-림프구로의 분화는 유세포분석에 의해 정량화될 수 있다.

일부 실시형태에 따르면, 림프구의 활성화를 측정하기 위한 또 다른 매개변수는 종양 세포 세포독성을 정량화하는 것일 수 있다. 종양 세포의 세포독성은 임의의 수의 확립된 방법들에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에 따르면, LDH-세포독성 비색 검정 키트(BioVision Cat. # K311-400)를 사용하여 손상된 세포에서 성장 배지로 방출된 젖산 탈수소효소(LDH)를 테스트하여 종양 세포의 세포독성을 측정할 수 있다. 간단히 말해서, 대조군(비형질감염된 종양 세포 포함), 실험군(면역 조절제 형질감염된 종양 세포 포함) 및 배지 단독의 각각으로부터 배지 100 μl를 96웰 플레이트의 웰 안으로 피펫팅할 수 있다. 염료 용액 및 촉매 용액을 포함하는 100μl의 LDH 반응 혼합물을 96웰 플레이트의 웰에 첨가하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션할 수 있다. 그런 다음 샘플은 마이크로타이터 플레이트 판독기를 사용하여 490~500 nm에서의 흡광도를 측정할 수 있다.

면역 세포의 자극

본 명세서에 사용된 바와 같이, 본 개시내용은 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하는 동종 종양 세포 백신을 제공하며, 여기서 종양 세포는 하나 이상의 면역 세포(예를 들어, T 림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상)를 자극하도록 유전적으로 조작된다. 면역 세포의 자극은 정상 세포 기능을 향상시키거나, 비정상 세포에서 정상적인 세포 기능을 시작할 수 있다.

일부 실시형태에 따르면, T-림프구를 자극하는 것은 T 림프구를 활성화 및/또는 확장시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, NK 세포를 자극하는 것은 NK 세포를 활성화 및/또는 확장시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, DC를 자극하는 것은 DC를 활성화 및/또는 확장시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, B 림프구를 자극하는 것은 B 림프구를 활성화 및/또는 확장시키는 것을 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 본 개시내용은 면역 킬러 세포를 자극하는데 효과적인 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하는 동종 종양 세포 백신을 제공한다. 자극될 수 있는 면역 킬러 세포는 예를 들어, 세포용해성 T 세포(CD8+ 세포), 기억 CD8+ T 세포, 및 NK 세포를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 킬러 면역 세포는 자연 사멸(NK) 세포이다. 일 실시형태에 따르면, NK 세포는 기억-유사 NK 세포이다. 일 실시형태에 따르면, 킬러 면역 세포는 CD8+ T-세포이다. 일 실시형태에 따르면, CD8+ T-세포는 기억 T 세포이다. 따라서, 본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 동종 종양 세포 백신에 의한 자극으로부터 생성된 세포의 모집단을 제공한다

본 발명의 특징은, 일부 실시형태에 따르면, 동종 종양 세포 백신이 동시에 1종 초과의 면역 사멸 세포, 예를 들어, 1종 초과의 세포용해성 T 세포(CD8+ 세포), 기억 CD8+ T 세포 및 NK 세포를 자극하는데 효과적이라는 것이다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 종양 세포 백신은 CD8+ T 세포 및 NK 세포를 모두 자극하기에 효과적이다.

일부 실시형태에 따르면, 동종 종양 세포 백신은 CD8+ T 세포를 자극하며, 여기서 특정 외인성 면역조절 분자의 발현은 다른 외인성 자극 분자와 비교하여, 다른 것보다 더 효과적으로 사멸시키는 CD8+ T 세포를 자극한다.

일부 실시형태에 따르면, 동종 종양 세포 백신은 NK 세포를 자극하며, 여기서 특정 외인성 면역조절 분자의 발현은 다른 외인성 자극 분자와 비교하여, 다른 것보다 더 효과적으로 사멸시키는 NK 세포를 자극한다.

일부 실시형태에 따르면, "면역 킬러 세포를 자극하는 것"은 면역 킬러 세포의 확장을 지칭한다. 일부 실시형태에 따르면, "면역 킬러 세포를 자극하는 것"은 면역 킬러 세포의 활성화를 지칭한다. 일부 실시형태에 따르면, "면역 킬러 세포를 자극하는 것"은 면역 킬러 세포의 세포독성 증가를 지칭한다.

일부 실시형태에 따르면, 본 명세서에 기재된 동종 종양 세포 백신은 생체외에서 면역 킬러 세포의 모집단을 자극하기에 충분하다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 동종 종양 세포 백신은 생체내에서 면역 킬러 세포의 모집단을 자극하기에 충분하다.

NK 세포 활성화 및 확장

일 실시형태에 따르면, 본 명세서에 기재된 동종 종양 세포 백신은 NK 세포를 활성화하는데 효과적이다.

일 실시형태에 따르면, 본 명세서에 기재된 동종 종양 세포 백신은 NK 세포를 확장하는데 효과적이다.

탈과립화/ 세포독성

NK 세포의 기능적 특징을 정의하는 것은 사전 감작화 없이 세포 표적의 "자연 사멸"을 수행하는 그 고유한 능력으로 남아 있다.

일 실시형태에 따르면, 본 명세서에 기재된 동종 종양 세포 백신은 본 명세서에 기재된 동종 종양 세포 백신에 의해 활성화되고 확장된 NK 세포가 대조군 NK 세포와 비교하여 더 높은 탈과립 활성을 나타내도록 NK 세포를 활성화 및 확장하는데 효과적이다. 예를 들어, 탈과립 활성은 예를 들어, 유세포분석에 의해 CD107a 발현의 측정을 통해 추정될 수 있다. CD107a 표면 발현은 탈과립화 및 세포독성 과립의 방출과 밀접하게 상관관계가 있다. CD107a 발현에 의해 측정된 탈과립화는 NK 세포와 같은 효과기 세포의 세포독성 활성과 상관관계가 있다. CD107a 발현의 측정을 통해 탈과립 활성을 측정하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, Alter G, Malenfant J M, Altfeld M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. 2004; 294: 15-22를 참고하며, 그 전체 내용은 참고로 본 명세서에 포함된다.

일 실시형태에 따르면, 본 발명의 동종 종양 세포 백신에 의한 생체외 또는 생체내 자극후 수득된 확장되고 활성화된 NK 세포는 예를 들어, 비확장된 NK 세포와 비교하여 탈과립 활성에 의해 측정될 때 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80% 또는 약 90% 증가된 세포독성을 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 확장되고 활성화된 NK 세포는 비확장된 NK 세포와 비교하여 적어도 약 100% 증가된 세포독성을 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 확장되고 활성화된 NK 세포는 비확장된 NK 세포와 비교하여 적어도 약 200% 증가된 세포독성을 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 확장되고 활성화된 NK 세포는 비-생체외 확장된 NK 세포와 비교하여 적어도 약 300% 증가된 세포독성을 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 확장되고 활성화된 NK 세포는 비-생체외 확장된 NK 세포와 비교하여 적어도 약 400% 증가된 세포독성을 포함한다.

일 실시형태에 따르면, 본 발명의 동종 종양 세포 백신에 의한 생체외 또는 생체내 자극후 수득된 확장되고 활성화된 NK 세포는 예를 들어, 비확장된 NK 세포와 비교하여 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80% 또는 약 90% 증가된 탈과립 활성을 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 확장되고 활성화된 NK 세포는 비확장된 NK 세포와 비교하여 적어도 약 100% 증가된 탈과립 활성을 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 확장되고 활성화된 NK 세포는 비확장된 NK 세포와 비교하여 적어도 약 200% 증가된 탈과립 활성을 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 확장되고 활성화된 NK 세포는 비-생체외 확장된 NK 세포와 비교하여 적어도 약 300% 증가된 탈과립 활성을 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 확장되고 활성화된 NK 세포는 비-생체외 확장된 NK 세포와 비교하여 적어도 약 400% 증가된 탈과립 활성을 포함한다.

NK 세포 성숙 및 활성화의 마커

인간 NK 세포는 표현형으로 CD56의 발현 및 CD3의 부재를 특징으로 하고 CD56^bright 모집단 및 CD56^dim 모집단으로 추가로 세분될 수 있다. CD56^bright 모집단은 인터페론-γ(IFNγ), 종양 괴사 인자-베타(TNF-B), 종양 괴사 인자-α(TNF-α), 과립구 대식세포-집락 자극 인자(GMCSF), IL-10, 및 IL-13(4)을 포함한 면역조절 사이토카인을 생성한다. CD56^dim 하위집합은 CD56^bright 모집단의 최종적으로 분화된 후속이고 주로 세포용리 기능을 발휘하는 역할을 한다. 그러나, CD56^dim NK 세포는 NKp30 활성화 수용체의 NKp46을 통한 세포 촉발 후 또는 IL-2, IL-12 및 IL-15의 조합으로 자극한 후 사이토카인, 특히 IFNγ를 생성할 수 있다.

일 실시형태에 따르면, NK 세포 성숙 및/또는 활성화의 다양한 마커는, 예를 들어, 유세포분석 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, NK 세포의 고전적인 마커는 CD16이라고도 불리는 활성화 수용체 FcγRIII이다.

NK 세포의 활성화는 퍼포린 및 다양한 그랜자임을 함유하는 세포독성 과립의 방출 및 사이토카인 생산, 가장 두드러지게는 인터페론-γ(IFNγ)를 유도한다. 부가하여, Fas 리간드(FasL) 및 TNF-관련된 세포자멸사-유도 리간드(TRAIL)와 같은 종양 괴사 인자(TNF) 패밀리에 속하는 사멸-유도 리간드의 세포 표면에서의 발현은 또한 표적 세포 상에서, 사멸 수용체(DR), 즉 Fas, DR4(TRAIL-RI) 및 DR5(TRAIL-RII)에 대한 결합을 통해 카스파제 효소 캐스케이드의 활성화를 유도한다.

일 실시형태에 따르면, 본 명세서에 기재된 동종 종양 세포 백신은 적어도 하나의 NK 세포 활성화 수용체(예를 들어, 표 3에 열거된 활성화 수용체)를 적어도 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 100%, 약 150%, 약 200%, 약 300% 또는 그 초과로 상향조절한다. 일 실시형태에 따르면, 본 명세서에 기재된 동종 종양 세포 백신은 적어도 하나의 NK 세포 활성화 수용체를 적어도 약 75%, 즉 적어도 약 76%, 적어도 약 77%, 적어도 약 78%, 적어도 약 79%, 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 적어도 약 100%, 적어도 약 110%, 적어도 약 120%, 적어도 약 130%, 적어도 약 140%, 적어도 약 150%, 적어도 약 160%, 적어도 약 170%, 적어도 약 180%, 적어도 약 190%, 적어도 약 200% 상향조절한다. 일 실시형태에 따르면, 본 명세서에 기재된 동종 종양 세포 백신은 적어도 하나의 NK 세포 활성화 수용체를 적어도 약 100% 상향조절한다. 일 실시형태에 따르면, 본 명세서에 기재된 동종 종양 세포 백신은 적어도 하나의 NK 세포 활성화 수용체를 적어도 약 200% 상향조절한다.

또 다른 실시형태에 따르면, 본 명세서에 기재된 동종 종양 세포 백신은 억제성 수용체 또는 케모카인 수용체(예를 들어, CCR7)와 같은 적어도 하나의 NK 세포 수용체의 발현을 하향조절한다. 예를 들어, 특정 NK 세포 억제성 수용체는 KIR(사멸 억제성 수용체 또는 CD158)로 지칭된다. 억제성 수용체의 비-제한적인 예는 억제성 사멸 면역글로불린-유사 수용체(KIR), GL183, KIR2DL 1, Lir-1, NKB1, 및 NKG2A이다.

일 실시형태에 따르면, 본 명세서에 기재된 동종 종양 세포 백신은 적어도 하나의 NK 세포 억제성 수용체(예를 들어, 표 4에 열거된 억제성 수용체)를 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 110%, 120%, 적어도 약 130%, 약 140%, 적어도 약 150%, 적어도 약 160%, 적어도 약 170%, 적어도 약 180%, 적어도 약 190%, 적어도 약 200%, 적어도 약 220%, 적어도 약 230%, 적어도 약 240%, 적어도 약 250%, 적어도 약 260%, 적어도 약 270%, 적어도 약 280%, 적어도 약 290%, 적어도 약 300% 또는 그 초과로 하향조절한다. 일 실시형태에 따르면, 본 명세서에 기재된 동종 종양 세포 백신은 적어도 하나의 NK 세포 억제성 수용체를 적어도 약 75% 하향조절한다. 일 실시형태에 따르면, 본 명세서에 기재된 동종 종양 세포 백신은 적어도 하나의 NK 세포 억제성 수용체를 적어도 약 100% 하향조절한다. 일 실시형태에 따르면, 본 명세서에 기재된 동종 종양 세포 백신은 적어도 하나의 NK 세포 억제성 수용체를 적어도 약 200% 하향조절한다.

수용체 발현에서 변화는 평균 형광 강도(MFI) 비율에 의해 계산될 수 있다:

MFI_dayX/MFI_day0

여기서 x는 NK 세포의 확장의 일수이다.

X일차 샘플에 대한 MFI가 0일차에 대한 것보다 높을 때, MFI 비율은 1보다 높을 것이며, 이는 그 수용체에서 상향조절의 상대적 정도를 나타낸다. 따라서, 예를 들어 1.5의 MFI 비율은 특정 수용체의 50% 상향조절을 의미한다. MFI 비율의 계산은 당업자에게 잘 알려져 있다.

다양한 NK 세포 활성화 또는 억제성 수용체는 하기 표 4에 나타나 있다. 볼드체는 패밀리를 나타낸다.

[표 4]

표 4에서 약어: ACT, 활성화; BAT-3, HLA-B-연관된 전사체 3; H, 인간; HA, 헤마글루티닌; HLA, 인간 백혈구 항원; INHIB, 억제성; KIR, 사멸 면역글로불린-유사 수용체; KLRG1, 사멸 세포 렉틴-유사 수용체 G1; LILR, 백혈구 면역글로불린-유사 수용체; M, 마우스; MHC, 주요 조직적합성 복합체; MULT-1, 마우스 UL16-결합-유사 전사체-1; NCR, 천연 세포독성 수용체; NK, 자연 사멸; PVR, 소아마비 바이러스 수용체; RAE-1, 레티노산 초기 전사체-1.

CD8+ T 세포 활성화 및 확장

일 실시형태에 따르면, 본 명세서에 기재된 동종 종양 세포 백신은 CD8+ T-세포를 활성화시키는데 효과적이다. 일 실시형태에 따르면, 본 명세서에 기재된 동종 종양 세포 백신은 CD8+ T-세포를 확장시키는데 효과적이다. 일 실시형태에 따르면, 본 명세서에 기재된 동종 종양 세포 백신은 CD8+ T-세포를 활성화시키고 확장하는데 효과적이다.

T 세포 활성화 및 확장은 본 명세서에 기재된 바와 같은 다양한 검정에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 측정될 수 있는 T 세포 활성은 T 세포의 증식의 유도, T 세포에서 시그널링의 유도, T 세포에서 활성화 마커의 발현의 유도, T 세포에 의한 사이토카인 분비의 유도 및 T 세포의 세포독성 활성을 포함한다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, CD8+ T 세포 활성화는 증식 검정에 의해 측정된다.

사이토카인 분비

발명의 동종 종양 세포 백신에 의한 CD8+ T-세포의 활성화는 감마 인터페론(IFNγ), 종양 괴사 인자 알파(TNFa), 인터루킨-12 (IL-12) 또는 인터루킨 2(IL-2)와 같은 사이토카인의 분비를 결정함에 의해 평가 또는 측정될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, ELISA는 사이토카인 분비, 예를 들어 감마 인터페론(IFNγ), 종양 괴사 인자 알파(TNFa), 인터루킨-12(IL-12) 또는 인터루킨 2(IL-2)의 분비를 결정하는 데 사용된다. ELISPOT(효소-연결된 면역반점) 기술은 본 명세서에 기술된 조작된 종양 세포로 자극에 반응하여 주어진 사이토카인(예를 들어, 감마 인터페론(IFNγ))을 분비하는 T 세포를 검출하는 데 사용될 수 있다. T 세포는 항-IFNγ 항체로 코팅된 웰에서 조작된 종양 세포와 함께 배양된다. 분비된 IFNγ는 코팅된 항체에 의해 포획된 다음 발색 기질에 커플링된 제2 항체와 함께 나타내어 진다. 따라서, 국소적으로 분비되는 사이토카인 분자는 반점을 형성하며, 각 반점은 하나의 IFNγ-분비 세포에 상응한다. 반점의 수를 통해 분석된 샘플에서 IFNγ-분비 세포의 빈도를 결정할 수 있다. ELISPOT 검정이 또한 종양 괴사 인자 알파, 인터루킨-4 (IL-4), IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, 과립구-대식세포 집락-자극 인자 및 그랜자임 B-분비 림프구의 검출에 대해 기술되었다(Klinman D, Nutman T. Current protocols in immunology. New York, N.Y: John Wiley & Sons, Inc.; 1994. pp. 6.19.1-6.19.8, 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함됨).

세포내 사이토카인의 유세포분석은 배양 상등액에서 사이토카인 함량을 측정하는 데 사용될 수 있지만, 실제로 사이토카인을 분비하는 T 세포의 수에 대한 정보는 제공하지 않는다. T 세포가 모넨신 또는 브레펠딘 A와 같은 분비의 억제제로 처리될 때, 이들은 (예를 들어, 본 발명의 조작된 적혈구로) 활성화시 그 세포질 내에 사이토카인을 축적한다. 림프구의 고정화 및 투과화 후, 세포내 사이토카인은 세포분석법에 의해 정량화될 수 있다. 이 기술을 통해 생성된 사이토카인, 이들 사이토카인을 생성하는 세포의 유형 및 세포당 생성된 사이토카인의 양을 결정할 수 있다.

세포독성

발명의 동종 종양 세포 백신에 의한 CD8+ T-세포의 활성화는 CD8+ T-세포의 세포독성 활성을 검정함에 의해 평가될 수 있다.

T 세포의 세포독성 활성은 당업자에게 공지된 임의의 적합한 기술에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 조작된 적혈구에 노출된 T 세포를 포함하는 샘플은 표준 세포독성 검정에서 적절한 기간 후 세포독성 활성에 대해 검정될 수 있다. 이러한 검정은 당 분야에 알려진 크롬 방출 CTL 검정 및 Alamar Blue™ 형광 검정을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.

증식/ 확장

T 세포를 확장시키는 본 발명의 동종 종양 세포 백신의 능력은 CFSE 염색을 사용하여 평가할 수 있다. 초기 세포 확장 속도를 비교하기 위해, 세포를 CFSE 염색하여 동종 종양 세포 백신이 T 세포의 증식을 얼마나 잘 유도했는지 결정한다. CFSE 염색은 훨씬 더 정량적 평가변수를 제공하고 확장된 세포의 동시적 표현형검사를 허용한다. 자극 후 매일 세포의 분취량을 각 배양물에서 제거하고 유세포분석으로 분석한다. CFSE 염색은 세포를 고도로 형광성으로 만든다. 세포 분열시 형광은 반으로 줄어들므로 세포가 더 많은 횟수로 분열할수록 형광성은 더 줄어든다. 동종 종양 세포 백신이 T 세포 증식을 유도하는 능력은 1회, 2회, 3회 등으로 분열된 세포의 수를 측정함에 의해 정량화된다. 특정 시점에서 가장 많은 수의 세포 분열을 유도하는 동종 종양 세포 백신은 가장 강력한 확장자로 간주된다.

이들 동종 종양 세포 백신이 T 세포의 장기 성장을 얼마나 잘 촉진하는지를 결정하기 위해, 세포 성장 곡선이 생성될 수 있다. 이들 실험은 전술한 CFSE 실험으로 설정되지만 CFSE는 사용되지 않는다. 배양 2-3일마다 T 세포를 각 배양물로부터 제거하고 얼마나 많은 세포가 존재하는지와 세포의 평균 부피를 측정하는 Coulter 계수기를 사용하여 계수한다. 평균 세포 부피는 세포를 재자극할 시기를 가장 잘 예측한다. 일반적으로, T 세포가 적절하게 자극되면 그 세포 부피는 3배가 된다. 이 부피가 초기 폭발의 약 절반 초과로 감소되면 로그 선형 확장을 유지하기 위해 T 세포를 재자극할 필요가 있을 수 있다(Levine 등, 1996, Science 272:1939-1943; Levine 등, 1997, J. Immunol. 159:5921-5930). 각 조작된 적혈구가 20 모집단 배가를 유도하는 데 걸리는 시간이 계산된다. 이 수준의 T 세포 확장을 유도하기 위한 각 동종 종양 세포 백신의 상대적인 차이는 특정 동종 종양 세포 백신을 평가하기 위한 한 가지 기준이다.

부가하여, 각 동종 종양 세포 백신에 의해 확장된 세포의 표현형은 특정 하위집합이 우선적으로 확장되는지 여부를 결정하기 위해 특성화될 수 있다. 각 재자극 이전에, Appay 등 (2002, Nature Med. 8, 379-385, 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함됨)에 의해 제안된 CD27 및 CD28 정의 및 Sallusto 등 (1999, Nature 401:708-712, 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함됨)에 의해 제안된 CCR7 정의를 사용하여 확장된 T 세포의 분화 상태를 정의하기 위해 확장 T 세포 모집단의 표현형 분석이 수행된다. 퍼포린 및 그랜자임 B 세포내 염색을 사용하여 세포용리 가능성을 추정하는 총체적 측정을 수행할 수 있다.

세포자멸사 마커

본 발명의 특정 실시형태에 따르면, 본 명세서에 기재된 바와 같은 동종 종양 세포 백신을 사용한 T 세포의 자극, 활성화 및 확장은 세포자멸사에 대해 보호하거나 또는 그렇지 않으면 생체내 또는 시험관내 생존을 연장하는 T 세포에서 특정 핵심 분자의 발현을 증진시킨다. 세포자멸사는 일반적으로 T 세포에서 특정 신호의 유도로 인해 발생한다. 따라서, 발명의 조작된 종양 세포는 T 세포의 자극으로 인한 세포 사멸로부터 T 세포를 보호하는 것을 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명에는 또한 조기 사멸로부터 또는 T 세포 생존에 일반적으로 필요한 Bcl-xL, 성장 인자, 사이토카인 또는 림포카인과 같은 인식된 T 세포 성장 마커의 부재 또는 결실뿐만 아니라 Fas 또는 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 교차-연결 또는 특정 호르몬 또는 스트레스에 대한 노출에 의한 것으로부터 보호함에 의해 증진된 T 세포 성장이 포함된다.

III. 제조 방법

동종 종양 세포 백신을 제조하는 다양한 방법이 본 개시내용에 의해 고려된다.

일부 실시형태에 따르면, 본 개시내용은 동종 모 종양 세포주를 제공하는 단계; 적어도 하나의 외인성 면역조절 분자를 인코딩하는 외인성 핵산을 종양 세포에 도입하는 단계; 면역원성 양의 외인성 면역조절 분자를 안정적으로 발현하는 종양 세포 클론을 선택하여 종양 세포주 변이체를 생성하는 단계; 및 혼합 림프구 종양 세포 반응에서 세포 증식, 세포 하위집합 분화, 사이토카인 방출 프로파일, 및 종양 세포 용해로부터 선택되는 하기 매개변수 중 하나 이상에 의해 클론 유래 세포주 변이체를 선택하는 단계로서; 여기서 선택된 클론 유래 세포주 변이체가 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상의 활성화를 자극하는데 효과적인, 단계를 포함하는 방법에 의해 생산된, 적어도 3개의 안정적으로 발현된 외인성 면역조절 분자를 포함하는 증식 불능 종양 세포의 모집단을 포함하는 동종 종양 세포 백신을 특징으로 한다. 일 실시형태에 따르면, 종양 세포는 방사선 조사에 의해 증식 불능화된다. 일 실시형태에 따르면, 외인성 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 도입 단계는 바이러스 형질도입을 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 도입 단계는 전기천공법을 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 도입 단계는 리포솜 매개 전달, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스, 레트로바이러스 기반 벡터, 리포펙션 및 렌티바이러스 벡터 중 하나 이상을 이용하는 것을 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 도입 단계는 렌티바이러스 벡터의 형질감염에 의해 외인성 핵산을 도입하는 것을 포함한다.

렌티바이러스 벡터

기재된 발명은 원핵 및 진핵 세포에서 발현될 수 있는 2개 이상의 면역조절제를 인코딩하는 핵산 작제물을 제공한다. 예를 들어, 기재된 발명은 2개 이상의 면역조절제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 벡터(예를 들어, DNA- 또는 RNA-기반 벡터)를 제공한다. 부가하여, 기재된 발명은 본 명세서에 기재된 벡터를 제조하는 방법, 뿐만 아니라 인코딩된 폴리펩티드의 발현을 위해 적절한 숙주 세포 내로 벡터를 도입하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 본 명세서에서 제공되는 방법은 2개 이상의 면역조절제를 인코딩하는 핵산 서열을 구성하는 것, 및 서열을 발현 벡터 내에 클로닝하는 것을 포함한다. 발현 벡터는 숙주 세포 내로 도입되거나 바이러스 입자 내로 합체될 수 있으며, 이들 중 어느 하나는 예를 들어 암을 치료하기 위해 대상체에게 투여될 수 있다.

둘 이상의 면역조절제를 인코딩하는 cDNA 또는 DNA 서열은 통상적인 DNA 클로닝 및 돌연변이유발 방법, DNA 증폭 방법 및/또는 합성 방법을 사용하여 수득 (및 원하는 경우 변형)될 수 있다. 일반적으로, 2개 이상의 면역조절제를 인코딩하는 서열은 발현 이전에 유전적 변형 및 복제 목적을 위해 클로닝 벡터 내에 삽입될 수 있다. 각각의 코딩 서열은 시험관내 및 생체내 적합한 숙주 세포에서 인코딩된 단백질을 발현시키기 위한 목적으로 프로모터와 같은 조절 요소에 작동가능하게 연결될 수 있다.

발현 벡터는 분비된 면역조절제를 생산하기 위해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 핵산을 생존가능한 세포 내에 도입하는데 이용가능한 다양한 기술이 있다. 시험관내에서 포유동물 세포 내로 핵산의 전달에 적합한 기술은 리포솜의 사용, 전기천공, 미세주입, 세포 융합, 고분자-기반 시스템, DEAE-덱스트란, 바이러스 형질도입, 인산칼슘 침전 방법 등을 포함한다. 생체내 유전자 전달을 위해, 리포솜; 및 천연 고분자-기반 전달 비히클 예컨대 키토산 및 젤라틴을 포함한 다수의 기술 및 시약이 또한 사용될 수 있고; 바이러스 벡터는 또한 생체내 형질도입에 적합하다. 일부 상황에서는 세포 표면 막 단백질에 특이적인 항체 또는 리간드와 같은 표적화제를 제공하는 것이 바람직하다. 리포솜이 이용되는 경우, 세포내이입과 연관된 세포 표면 막 단백질에 결합하는 단백질은 표적화 및/또는 흡수 촉진, 예를 들어 특정 세포 유형에 대한 캡시드 단백질 또는 그의 단편, 순환에서 내재화를 겪는 단백질에 대한 항체, 세포내 국소화를 표적화하고 세포내 반감기를 증진시키는 단백질의 흡수를 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 수용체-매개된 세포내이입의 기술은, 예를 들어 Wu 등, J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); 및 Wagner 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)에 기술되어 있다.

적절한 경우, 예를 들어 통합 서열과 같은 유전자 전달 작용제가 이용될 수도 있다. 다수의 통합 서열이 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Nunes-Duby 등, Nucleic Acids Res. 26:391-406, 1998; Sadwoski, J. Bacteriol., 165:341-357, 1986; Bestor, Cell, 122(3):322-325, 2005; Plasterk 등, TIG 15:326-332, 1999; Kootstra 등, Ann. Rev. Pharm. Toxicol., 43:413-439, 2003 참고). 이들은 재조합효소와 유전자전위효소를 포함한다. 예는 Cre(Sternberg and Hamilton, J. Mol. Biol., 150:467-486, 1981), 람다(Nash, Nature, 247, 543-545, 1974), FIp (Broach, 등, Cell, 29:227-234, 1982), R (Matsuzaki, 등, J. Bacteriology, 172:610-618, 1990), cpC31 (예를 들어, Groth 등, J. Mol. Biol. 335:667-678, 2004 참고), 슬리핑 뷰티, 마리너 패밀리의 유전자전위효소(Plasterk 등, 상동), 및 AAV, 레트로바이러스, 및 레트로바이러스 또는 렌티바이러스의 LTR 서열 및 AAV의 ITR 서열과 같은 바이러스 통합을 제공하는 성분을 갖는 안티바이러스와 같은 바이러스를 통합하기 위한 구성요소(Kootstra 등, Ann. Rev. Pharm. Toxicol., 43:413-439, 2003)를 포함한다.

세포는 예를 들어 시험관내에서 배양되거나 유전적으로 조작될 수 있다. 숙주 세포는 건강한 인간, 암 환자, 개인 실험실 기탁물, 미국 타입 배양 컬렉션과 같은 공공 배양 수집물을 포함하는 정상 또는 영향을 받은 대상체로부터 또는 상업적 공급업체로부터 얻을 수 있다.

생체내에서 둘 이상의 면역조절제의 생성 및 분비에 사용될 수 있는 세포는, 제한 없이, 상피 세포, 내피 세포, 각질세포, 섬유아세포, 근육 세포, 간세포; T 림프구, B 림프구, 단핵구, 대식세포, 호중구, 호산구, 거핵구 또는 과립구와 같은 혈액 세포, 조혈 줄기 또는 전발생 세포(예를 들어, 골수로부터 획득됨)와 같은 다양한 줄기 또는 전발생 세포, 제대혈, 말초 혈액, 태아 간 등 및 종양 세포(예를 들어, 인간 종양 세포)를 포함한다. 세포 유형의 선택은 치료 또는 예방되는 종양 또는 감염성 질환의 유형에 의존하고, 당업자에 의해 결정될 수 있다.

상이한 숙주 세포는 번역-후 프로세싱 및 단백질의 변형을 위한 특징적이고 특정한 작용기전을 갖는다. 수령체가 그 열 충격 단백질(hsps)을 처리하는 방식과 유사한 특정 양식으로 발현된 유전자 생성물을 변형 및 처리하는 숙주 세포를 선택할 수 있다.

일부 실시형태에 따르면, 본 명세서에 제공된 바와 같은 발현 작제물은 항원 세포 내로 도입될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 항원 세포는 바이러스와 같은 암-유발 감염성 제제로 감염되었지만 아직 신생물이 아닌 종양전 세포, 또는 돌연변이원 또는 암-유발 제제, 예컨대, 예를 들어, DNA-손상 제제 또는 방사선에 노출된 항원 세포를 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 다른 세포는 형태 또는 생리학적 또는 생화학적 기능을 특징으로 하는 정상에서 신생물 형태로 전이 중인 종양전 세포이다.

전형적으로, 본 명세서에 제공된 방법에 사용된 암 세포 및 종양전 세포는 포유동물 기원의 것이다. 일부 실시형태에 따르면, 암 세포(예를 들어, 인간 종양 세포)가 본 명세서에 기재된 방법에 사용될 수 있다. 종양전 병변, 암 조직 또는 암세포에서 유래한 세포주가 또한 사용될 수 있다. 암 조직, 암 세포, 암-유발 제제로 감염된 세포, 기타 종양전 세포, 및 인간 유래의 세포주가 사용될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 암 세포는 확립된 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체, 예컨대, 제한 없이, 확립된 비-소세포 폐 암종(NSCLC), 방광암, 흑색종, 난소암, 신세포 암종, 전립선 암종, 육종, 유방 암종, 편평 세포 암종, 두경부 암종, 간세포 암종, 췌장 암종 또는 결장 암종 세포주로부터 유래할 수 있다.

모 세포주는 상기에 기재되어 있다.

더욱이, 일부 실시형태에 따르면, 동종 종양 세포 백신은 본 명세서에 기재된 다양한 방법에서 사용될 때 환자의 면역계가 관심있는 질환에 대해 활성화되도록 추가로 허용하는 어쥬번트 효과를 제공한다.

원핵생물 및 진핵생물 벡터 둘 다는 본 명세서에 제공된 방법에서 둘 이상의 면역조절제의 발현에 사용될 수 있다. 원핵생물 벡터는 대장균 서열에 기초한 작제물을 포함한다(예를 들어, Makrides, Microbiol Rev 1996, 60:512-538 참고). 대장균에서 발현을 위해 사용될 수 있는 조절 영역의 비-제한적인 예는 lac, trp, 1pp, phoA, recA, tac, T3, T7 및 람다 P_L을 포함한다. 원핵생물 발현 벡터의 비-제한적인 예는 .lamda.gt11과 같은 Agt 벡터 시리즈(Huynh 등, in "DNA Cloning Techniques, Vol. I: A Practical Approach," 1984, (D. Glover, ed.), pp. 49-78, IRL Press, Oxford) 및 pET 벡터 시리즈(Studier 등, Methods Enzymol 1990, 185:60-89)를 포함할 수 있다.

포유동물 숙주 세포에서 동종 종양 백신의 발현을 위해 다양한 조절 영역이 사용될 수 있다. 예를 들어, SV40 초기 및 후기 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시 초기 프로모터, 및 라우스 육종 바이러스 장말단 반복(RSV-LTR) 프로모터가 사용될 수 있다. 포유동물 세포에서 유용할 수 있는 유도성 프로모터는 제한 없이 메탈로티오네인 II 유전자, 마우스 유방 종양 바이러스 글루코코르티코이드 반응성 장말단 반복부(MMTV-LTR), n-인터페론 유전자 및 hsp70 유전자와 연관된 프로모터를 포함한다(Williams 등, Cancer Res 1989, 49:2735-42; 및 Taylor 등, Mol Cell Biol 1990, 10:165-75 참고). 열 충격 프로모터 또는 스트레스 프로모터는 또한 재조합 숙주 세포에서 융합 단백질의 발현을 유도하는데 유리할 수 있다.

조직 특이성을 나타내고 트랜스제닉 동물에서 이용된 동물 조절 영역은 또한 다음의 특정 조직 유형의 종양 세포에서 사용될 수 있다: 췌장 포상 세포에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 조절 영역(Swift 등, Cell 1984, 38:639-646; Ornitz 등, Cold Spring Harbor Symp Quant Biol 1986, 50:399-409; 및 MacDonald, Hepatology 1987, 7:425-515); 췌장 베타 세포에서 활성인 인슐린 유전자 조절 영역(Hanahan, Nature 1985, 315:115-122), 림프 세포에서 활성인 면역글로불린 유전자 조절 영역(Grosschedl 등, Cell 1984, 38:647-658; Adames 등, Nature 1985, 318:533-538; 및 Alexander 등, Mol Cell Biol 1987, 7:1436-1444), 고환, 유방, 림프 및 비만 세포에서 활성인 마우스 유방 종양 바이러스 조절 영역(Leder 등, Cell 1986, 45:485-495), 간에서 활성인 알부민 유전자 조절 영역(Pinkert 등, Genes Devel, 1987, 1:268-276), 간에서 활성인 알파-태아단백질 유전자 조절 영역(Krumlauf 등, Mol Cell Biol 1985, 5:1639-1648; 및 Hammer 등, Science 1987, 235:53-58); 간에서 활성인 알파 1-항트립신 유전자 조절 영역(Kelsey 등, Genes Devel 1987, 1:161-171), 골수 세포에서 활성인 베타-글로빈 유전자 조절 영역(Mogram 등, Nature 1985, 315:338-340; 및 Kollias 등, Cell 1986, 46:89-94); 뇌에서 희소돌기아교세포에서 활성인 수초 염기성 단백질 유전자 조절 영역(Readhead 등, Cell 1987, 48:703-712); 골격근에서 활성인 미오신 경쇄-2 유전자 조절 영역(Sani, Nature 1985, 314:283-286), 및 시상하부에서 활성인 성선자극성 방출 호르몬 유전자 조절 영역(Mason 등, Science 1986, 234:1372-1378).

발현 벡터는 또한 SV40 바이러스, B형 간염 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 면역글로불린 유전자, 메탈로티오네인 및 .베타.-액틴에서 발견되는 것과 같은 전사 인핸서 요소를 포함할 수 있다(Bittner 등, Meth Enzymol 1987, 153:516-544; 및 Gorman, Curr Op Biotechnol 1990, 1:36-47). 부가하여, 발현 벡터는 하나 이상의 유형의 숙주 세포에서 벡터의 유지 및 복제, 또는 숙주 염색체 내로 벡터의 통합을 허용하는 서열을 함유할 수 있다. 이러한 서열은, 제한 없이, 복제 기점, 자율 복제 서열(ARS), 중심체 DNA 및 텔로미어 DNA을 포함한다.

부가하여, 발현 벡터는 본 명세서에 기재된 바와 같은 면역원성 단백질을 인코딩하는 DNA를 함유하는 숙주 세포를 초기에 단리, 식별 또는 추적하기 위한 하나 이상의 선택가능하거나 선별가능한 마커 유전자를 함유할 수 있다. gp96-Ig 및 T 세포 공동자극 융합 단백질의 장기간 고수율 생산을 위해, 포유동물 세포에서의 안정적인 발현이 유용할 수 있다. 다수의 선택 시스템이 포유동물 세포에 사용될 수 있다. 예를 들어, 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제(Wigler 등, Cell 1977, 11:223), 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Szybalski and Szybalski, Proc Natl Acad Sci USA 1962, 48:2026), 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Lowy 등, Cell 1980, 22:817) 유전자는 각각 tk^-, hgprf^- 또는 arf^-세포에서 이용될 수 있다. 부가하여, 항대사물질 내성은 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 디하이드로폴레이트 환원효소(dhfr)(Wigler 등, Proc Natl Acad Sci USA 1980, 77:3567; O'Hare 등, Proc Natl Acad Sci USA 1981, 78:1527); 마이코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt(Mulligan and Berg, Proc Natl Acad Sci USA 1981, 78:2072); 아미노글리코시드 G-418에 대한 내성을 부여하는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(neo)(Colberre-Garapin 등, J Mol Biol 1981, 150:1); 및 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제(hyg)(Santerre 등, Gene 1984, 30:147)에 대한 선택의 기초로 사용될 수 있다. 다른 선택가능한 마커 예컨대 히스티디놀 및 Zeocin™이 또한 사용될 수 있다.

다수의 바이러스-기반 발현 시스템이 또한 포유동물 세포와 함께 사용되어 동종 종양 세포 백신을 생산할 수 있다. DNA 바이러스 골격을 사용하는 벡터는 유인원 바이러스 40(SV40)(Hamer 등, Cell 1979, 17:725), 아데노바이러스(Van Doren 등, Mol Cell Biol 1984, 4:1653), 아데노-연관된 바이러스(McLaughlin 등, J Virol 1988, 62:1963) 및 소 유두종 바이러스(Zinn 등, Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79:4897)로부터 유래되었다. 아데노바이러스가 발현 벡터로 사용되는 경우, 공여자 DNA 서열은 아데노바이러스 전사/번역 제어 복합체, 예를 들어 후기 프로모터 및 삼중 리더 서열에 결찰될 수 있다. 이 융합 유전자는 그 다음 시험관내 또는 생체내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈에 삽입될 수 있다. 바이러스 게놈의 비-필수 영역(예를 들어, 영역 E1 또는 E3)에 삽입은 감염된 숙주에서 생존가능하고 이종 생성물을 발현할 수 있는 재조합 바이러스를 초래할 수 있다. (예를 들어, Logan and Shenk, Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81:3655-3659 참고).

소 유두종바이러스(BPV)는 사람을 비롯한 많은 고등 척추동물을 감염시킬 수 있고, 이의 DNA는 에피솜으로 복제된다. 포유동물 세포에서 안정적인 다중복제(20-300 복제/세포) 염색체외 요소로 존재하는 재조합 유전자 발현을 위해 다수의 셔틀 벡터가 개발되었다. 전형적으로 이들 벡터는 BPV DNA의 세그먼트(전체 게놈 또는 69% 형질전환 단편), 광범위한 숙주 범위를 갖는 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 스플라이스 신호, 선택가능한 마커 및 벡터가 대장균에 번식되도록 허용하는 "무독성" 플라스미드 서열을 함유한다. 박테리아에서의 구성 및 증폭에 이어서, 발현 유전자 작제물은, 예를 들어 인산칼슘 공침에 의해 배양된 포유동물 세포 내로 형질감염된다. 형질전환된 표현형을 나타내지 않는 이들 숙주 세포의 경우, 형질전환체의 선택은 히스티디놀 및 G418 내성과 같은 우성 선택가능한 마커의 사용에 의해 달성된다.

대안적으로, 백시니아 7.5K 프로모터가 사용될 수 있다. (예를 들어, Mackett 등, Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79:7415-7419; Mackett 등, J Virol 1984, 49:857-864; 및 Panicali 등, Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79:4927-4931 참고.) 인간 숙주 세포를 사용하는 경우에, 앱스타인-바 바이러스(EBV) 기원(OriP) 및 EBV 핵 항원 1(EBNA-1; 트랜스-작용 복제 인자)을 기반으로 하는 벡터가 사용될 수 있다. 이러한 벡터는 광범위한 인간 숙주 세포, 예를 들어 EBO-pCD(Spickofsky 등, DNA Prot Eng Tech 1990, 2:14-18); pDR2 및 .lamda.DR2(Clontech Laboratories로부터 이용가능)와 함께 사용될 수 있다.

동종 종양 세포 백신은 또한 레트로바이러스-기반 발현 시스템으로 만들 수 있다. Moloney 뮤어라인 백혈병 바이러스와 같은 레트로바이러스는 바이러스 유전자 서열의 대부분이 제거되고 외인성 코딩 서열로 대체될 수 있기 때문에 사용할 수 있는 반면 누락된 바이러스 기능은 트랜스로 공급될 수 있다. 형질감염과 대조적으로, 레트로바이러스는 예를 들어 일차 조혈 세포를 포함한 광범위한 세포 유형에 유전자를 효율적으로 감염시키고 전달할 수 있다. 더욱이, 레트로바이러스 벡터에 의한 감염을 위한 숙주 범위는 벡터 패키징에 사용된 엔벨롭의 선택에 의해 조작될 수 있다.

예를 들어, 레트로바이러스 벡터는 5' 긴 말단 반복부(LTR), 3' LTR, 패키징 신호, 박테리아 복제의 기점 및 선택가능한 마커를 포함할 수 있다. 예를 들어, gp96-Ig 융합 단백질 코딩 서열은 5' LTR과 3' LTR 사이의 위치 내에 삽입되어 5' LTR 프로모터로부터의 전사가 클로닝된 DNA를 전사하도록 할 수 있다. 5' LTR은 프로모터(예를 들어, LTR 프로모터), R 영역, U5 영역 및 프라이머 결합 부위를 그 순서로 함유한다. 이들 LTR 요소의 뉴클레오티드 서열은 당업계에 잘 알려져 있다. 감염된 세포의 선택을 용이하게 하기 위해 이종 프로모터 뿐만 아니라 다중 약물 선택 마커가 또한 발현 벡터에 포함될 수 있다. McLauchlin 등, Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 1990, 38:91-135; Morgenstern 등, Nucleic Acid Res 1990, 18:3587-3596; Choulika 등, J Virol 1996, 70:1792-1798; Boesen 등, Biotherapy 1994, 6:291-302; Salmons and Gunzberg, Human Gene Ther 1993, 4:129-141; 및 Grossman and Wilson, Curr Opin Genet Devel 1993, 3:110-114 참고.

본 명세서에 기재된 임의의 클로닝 및 발현 벡터는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 공지된 DNA 서열로부터 합성되고 조립될 수 있다. 조절 영역 및 인핸서 요소는 천연 및 합성 둘 다에서 다양한 기원의 것일 수 있다. 일부 벡터 및 숙주 세포는 상업적으로 획득될 수 있다. 유용한 벡터의 비-제한적인 예는 본 명세서에 참고로 포함된, Current Protocols in Molecular Biology, 1988, ed. Ausubel 등, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience의 부록 5; 및 Clontech Laboratories, Stratagene Inc. 및 Invitrogen, Inc.와 같은 상업적 공급업체의 카탈로그에 기술되어 있다.

재조합 면역조절제

일부 실시형태에 따르면, 2개 이상의 면역조절제는 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체의 세포 내로 형질감염(예를 들어, 지질, 인산칼슘, 양이온성 중합체, DEAE-덱스트란, 활성화된 덴드리머, 자기 비드, 전기천공, 생물학적 기술, 미세주사, 레이저감염/광주사를 통함) 또는 형질도입(예를 들어, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스를 통함)을 위한 2개 이상의 플라스미드 작제물 내로 클로닝될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 각각의 면역 조절제 단백질을 인코딩하는 재조합 DNA는 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체의 세포의 게놈 내로 통합을 위해 렌티바이러스 벡터 플라스미드 내로 클로닝될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 면역 조절제 단백질을 인코딩하는 재조합 DNA는 항생제 내성 유전자와 같은 선택가능한 형질을 인코딩하는 플라스미드 DNA 작제물 내로 클로닝될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 면역 조절제 단백질을 인코딩하는 재조합 DNA는 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체의 세포에서 각각의 재조합 단백질을 안정적으로 발현하도록 적응된 플라스미드 작제물 내로 클로닝될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 형질감염되거나 형질도입된 종양 세포는 각각의 면역 조절제 단백질을 인코딩하는 재조합 DNA의 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체의 세포의 게놈 내로의 통합의 균질한 부위를 갖는 세포주 변이체를 달성하기 위해 클론적으로 확장될 수 있다.

렌티바이러스 작제물

일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자를 코딩하는 DNA 서열은 포유동물 세포 내로의 형질도입을 위해 렌티바이러스 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 렌티바이러스 시스템은 2개 이상의 면역 조절제 서열을 인코딩하는 렌티바이러스 전달 플라스미드, GAG, POL, TAT 및 REV 서열을 인코딩하는 패키징 플라스미드, 및 ENV 서열을 인코딩하는 엔벨롭 플라스미드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 렌티바이러스 전달 플라스미드는 유전자 발현을 위해 바이러스 LTR 프로모터를 사용한다. 일부 실시형태에 따르면, 렌티바이러스 전달 플라스미드는 하이브리드 프로모터, 또는 다른 특수화된 프로모터를 사용한다. 일부 실시형태에 따르면, 렌티바이러스 전달 플라스미드의 프로모터는 다른 면역조절 서열에 비해 원하는 수준에서 2개 이상의 면역 조절제 서열을 발현하도록 선택된다. 일부 실시형태에 따르면, 상대적 수준은 mRNA 전사체로서 전사의 수준에서 측정된다. 일부 실시형태에 따르면, 상대적 수준은 단백질 발현으로서 번역의 수준에서 측정된다.

멀티시스트론 플라스미드 작제물

일부 실시형태에 따르면, 하나 이상의 면역 조절제 서열은 하나의 면역 조절제와 제2 면역 조절제 또는 다른 재조합 서열과의 공동-발현을 위해 멀티시스트론 벡터에서 클로닝될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 면역 조절제 서열은 단일 전사체로부터 2개 이상의 단백질의 번역을 촉진하기 위해 IRES 요소를 포함하는 플라스미드 내로 클로닝될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 하나 이상의 면역 조절제 서열은 자가 절단 2A 펩티드에 대한 서열을 포함하는 멀티시스트론 벡터 내로 클로닝되어 단일 전사체로부터 2개 이상의 외인성 면역조절 분자를 생성한다.

외인성 면역조절 분자의 유전적 도입

일부 실시형태에 따르면, 재조합 면역 조절제 서열을 포함하는 플라스미드 작제물은 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체로 형질감염되거나 형질도입될 수 있다.

일부 실시형태에 따르면, 최대 25개의 면역조절제(즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 2, 22, 23, 24 또는 25)가 포유동물 세포 내로 형질도입을 위해 10개의 별도 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 최대 25개의 면역조절제(즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25)가 포유동물 세포 내로 형질도입을 위해 11개의 별도 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 최대 25개의 면역조절제(즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25)가 포유동물 세포 내로 형질도입을 위해 12개의 별도 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 14개 이상의 면역조절제(즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14개 이상)가 포유동물 세포 내로 형질도입을 위해 10개의 별도 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 14개 이상의 면역조절제(즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14개 이상)가 포유동물 세포 내로 형질도입을 위해 11개의 별도 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 14개 이상의 면역조절제(즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14개 이상)가 포유동물 세포 내로 형질도입을 위해 12개의 별도 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 14개 이상의 면역조절제(즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14개 이상)가 포유동물 세포 내로 형질도입을 위해 13개의 별도 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 14개 이상의 면역조절제(즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14개 이상)가 포유동물 세포 내로 형질도입을 위해 14개의 별도 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 14개 이상의 면역조절제(즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14개 이상)가 포유동물 세포 내로 형질도입을 위해 14개 이상의 별도 벡터 내로 클로닝될 수 있다.

일부 실시형태에 따르면, 벡터 작제물은 본 명세서에 기재된 바와 같이 하나 이상의 태그를 추가로 포함한다.

렌티바이러스 시스템

일부 실시형태에 따르면, 렌티바이러스 시스템은 면역 조절제 서열을 갖는 전달 벡터, 엔벨롭 벡터 및 패키징 벡터가 각각 바이러스 생산을 위해 숙주 세포 내로 형질감염되는 경우에 이용될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 렌티바이러스 벡터는 인산칼슘 침전 형질감염, 지질 기반 형질감염, 또는 전기천공 중 임의의 것에 의해 293T 세포 내로 형질감염되고 밤새 인큐베이션될 수 있다. 면역 조절제 서열이 형광 리포터를 동반할 수 있는 실시형태의 경우, 형광에 대한 293T 세포의 검사는 밤새 인큐베이션 후에 점검될 수 있다. 바이러스 입자를 포함하는 293T 세포의 배양 배지는 8-12시간마다 2 또는 3회 수확하고 원심분리하여 분리된 세포 및 파편을 침전시킬 수 있다. 그런 다음 배양 배지를 직접적으로 사용하거나 필요에 따라 동결하거나 농축할 수 있다.

종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 표준 조직 배양 조건 하에 약 70%의 컨플루언시로 성장할 수 있다. 그런 다음 세포를 헥사다이메트린 브로마이드(세포의 형질도입을 증진시키기 위함) 및 신선한 배지에서 재조합 작제물을 포함하는 렌티바이러스 입자로 처리하고 배지를 교체한 후 18-20시간 동안 인큐베이션할 수 있다

지질 기반 형질감염

일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체의 세포는 지질 기반 형질감염 방법을 사용하여 면역 조절제 서열로 형질감염될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 리포펙타민과 같은 확립된 지질 기반 형질감염 시약이 사용될 수 있다. 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 조직 배양 용기에서 약 70-90% 컨플루언스로 성장할 수 있다. 적절한 양의 Lipofectamine® 및 면역 조절제 서열을 포함하는 플라스미드 작제물을 조직 배양 배지에서 별도로 희석하고 실온에서 잠시 인큐베이션할 수 있다. 배지에서 희석된 Lipofectamine® 및 플라스미드 작제물을 함께 혼합하고 실온에서 잠시 인큐베이션할 수 있다. 그런 다음 플라스미드 리포펙타민 혼합물을 조직 배양 용기에서 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체의 세포에 첨가하고 표준 조직 배양 조건 하에서 1-3일 동안 인큐베이션할 수 있다.

발현 클론의 선택

일부 실시형태에 따르면, 면역조절제 서열로 형질감염된 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체의 종양 세포는 다양한 발현 수준에 대해 선택될 수 있다.

일부 실시형태에 따르면, 면역조절제 서열은 항생제 내성 유전자를 동반할 수 있으며, 이는 면역조절제 서열을 인코딩하는 재조합 DNA의 안정한 통합을 갖는 클론에 대해 선택하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 면역조절제 서열은 네오마이신/카나마이신 내성 유전자와 같은 항생제 내성을 포함하는 플라스미드 작제물 내로 클로닝될 수 있다. 형질감염된 세포는 매일 배지를 교체하면서 1-2주 이상 동안 제조업체의 프로토콜에 따라 항생제로 처리된다. 항생제 치료 중 어느 시점에서, 항생제 내성 유전자가 안정적으로 통합되지 않은 모든 세포의 대규모 종양 세포 사멸이 발생하여, 안정적으로 발현하는 클론의 작은 콜로니를 남긴다. 각각의 안정적으로 발현하는 클론을 선정하고, 별도의 조직 배양 용기에서 배양하고, 웨스턴 블롯, 유세포분석 및 형광 현미경과 같은 임의의 확립된 방법으로 면역조절제 발현의 수준을 테스트할 수 있다.

일부 실시형태에 따르면, 형질감염된 종양 세포는 형광 활성화된 세포 분류(FACS)에 의해 면역조절제의 높은 발현에 대해 선택될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 면역조절제 서열은 면역조절제의 발현을 정량화하는 데 사용될 수 있는 하나 이상의 형광 단백질(예를 들어, GFP)을 동반할 수 있다. 예를 들어, IRES 서열을 통해 GFP 서열에 연결된 면역조절제 서열을 포함하는 바이시스트론 플라스미드는 면역조절제 및 동일한 전사체로부터 번역된 GFP 단백질 둘 다를 초래할 것이다. 따라서, GFP 발현 수준은 면역조절제의 발현 수준에 대한 대리자 역할을 할 것이다. 면역조절제/GFP 형질감염된 종양 세포의 단일 세포 현탁액은 형광 강도에 기반하여 FACS에 의해 원하는 발현 수준에 대해 선택될 수 있다. 이와 관련하여 임의의 형광성 단백질이 사용될 수 있다. 예를 들어, 다음 재조합 형광 단백질(rXFP) 중 임의의 것이 사용될 수 있다: EBFP, ECFP, EGFP, YFP, mHoneydew, mBanana, mOrange, tdTomato, mTangerine, mStrawberry, mCherry, mGrape, mRasberry, mGrape2, mPlum.

대안적으로, 재조합 면역조절제의 발현은 각 면역조절제에 특이적인 또는 각 면역조절제 상에 조작된 태그에 특이적인 형광 항체에 의해 직접적으로 관찰될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에 따르면 면역조절제 서열의 세포외 영역은 FLAG 태그 또는 HA 태그와 융합될 수 있다. 항-FLAG 또는 항-HA 항체를 일차 항체 또는 이차 항체에 부착된 형광단과 함께 사용되어) 형질감염된 종양 세포의 표면 상의 면역조절제의 발현을 검출할 수 있다. 원하는 수준의 면역조절제를 발현하는 종양 세포는 FACS 분류에 의해 선택되고 별도로 배양될 수 있다.

클론에 새로운 플라스미드 작제물을 순차적으로 추가

일부 실시형태에 따르면, 하나 이상의 면역조절제 서열(들)을 발현하는 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 순차적인 방식으로 안정한 발현을 위해 추가의 면역조절제로 형질감염된다. 연속적인 방식으로 재조합 면역조절제를 순차적으로 추가함에 의해, 여러 면역조절제를 동시적으로 발현하는 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체의 세포가 생성될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 2개의 면역조절제를 동시적으로 발현하는 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체가 생성될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 3개의 면역조절제를 동시적으로 발현하는 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체가 생성될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 4개의 면역조절제를 동시적으로 발현하는 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체가 생성될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 5개의 면역조절제를 동시적으로 발현하는 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체가 생성될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 6개의 면역조절제를 동시적으로 발현하는 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체가 생성될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 7개의 면역조절제를 동시적으로 발현하는 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체가 생성될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 8개의 면역조절제를 동시적으로 발현하는 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체가 생성될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 9개의 면역조절제를 동시적으로 발현하는 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체가 생성될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 10개의 면역조절제를 동시적으로 발현하는 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체가 생성될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 11개의 면역조절제를 동시적으로 발현하는 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체가 생성될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 12개의 면역조절제를 동시적으로 발현하는 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체가 생성될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 13개의 면역조절제를 동시적으로 발현하는 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체가 생성될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 14개의 면역조절제를 동시적으로 발현하는 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체가 생성될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 15개의 면역조절제를 동시적으로 발현하는 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체가 생성될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 16개의 면역조절제를 동시적으로 발현하는 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체가 생성될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 17개의 면역조절제를 동시적으로 발현하는 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체가 생성될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 18개의 면역조절제를 동시적으로 발현하는 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체가 생성될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 19개의 면역조절제를 동시적으로 발현하는 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체가 생성될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 20개의 면역조절제를 동시적으로 발현하는 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체가 생성될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 21개의 면역조절제를 동시적으로 발현하는 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체가 생성될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 22개의 면역조절제를 동시적으로 발현하는 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체가 생성될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 23개의 면역조절제를 동시적으로 발현하는 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체가 생성될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 24개의 면역조절제를 동시적으로 발현하는 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체가 생성될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 25개의 면역조절제를 동시적으로 발현하는 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체가 생성될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 26개의 면역조절제를 동시적으로 발현하는 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체가 생성될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 27개의 면역조절제를 동시적으로 발현하는 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체가 생성될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 28개의 면역조절제를 동시적으로 발현하는 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체가 생성될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 29개의 면역조절제를 동시적으로 발현하는 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체가 생성될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 30개의 면역조절제를 동시적으로 발현하는 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체가 생성될 수 있다.

다양하게 발현하는 클론

개시된 발명의 일 양태에 따르면, 다중 재조합 면역조절제 펩티드는 단일 클론으로 유래된 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체에서 발현될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 각 세포에서 발현된 각각의 개별 면역조절제의 양 (또는 수준)은 모든 다른 면역조절제 펩티드의 발현 수준과 동일하다. 그러나, 일부 실시형태에 따르면, 각 세포에서 발현된 각각의 개별 면역조절제의 수준은 세포에서 발현된 다른 면역조절제의 발현 수준과 상이하다. 일부 실시형태에 따르면, 면역조절제의 동일한 보체를 발현하는 클론으로 유래된 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 서로에 대해 다양한 양으로 이들 면역조절제를 안정적으로 발현한다.

각각 클론으로 유래된 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체 내에서, 그리고 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체 사이에서 발현된 재조합 면역 조절제의 상대적인 양은 전사 또는 번역 수준에서 측정될 수 있다. 예를 들어, 재조합 면역조절제의 상대적인 양은 무엇보다도 웨스턴 블롯, RT-PCR, 유세포분석, 면역형광 및 노던 블롯에 의해 정량화될 수 있다.

일부 실시형태에 따르면, 서로에 대해 발현된 면역조절제의 양에서 차이는 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체의 게놈의 다소간 전사적으로 활성인 영역 내로 무작위 통합의 결과일 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 발현된 면역조절제의 양에서 상대적인 차이는 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체를 생성하기 위해 사용된 형질감염되거나 형질도입된 DNA 내로 조작된 요소에 의해 달성될 수 있다.

예를 들어, 일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자의 발현 수준은 면역 조절제 유전자의 발현을 조절하기 위해 더 강하거나 더 약한 유전자 프로모터 서열을 조작함에 의해 전사 수준에서 달성될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 다음 프로모터 중 하나 이상이 면역조절제의 발현을 조절하는데 사용될 수 있다: 유인원 바이러스 40 초기 프로모터(SV40), 사이토메갈로바이러스 즉시-초기 프로모터(CMV), 인간 유비퀴틴 C 프로모터(UBC), 인간 신장 인자 1α 프로모터(EF1A), 마우스 포스포글리세레이트 키나제 1 프로모터(PGK), 및 CMV 초기 인핸서와 커플링된 치킨 β-액틴 프로모터(CAGG).

일부 실시형태에 따르면, 외인성 면역조절 분자의 발현 수준은 면역조절 전사체의 시작 코돈 주위에 더 강하거나 더 약한 코작 공통 서열을 조작함에 의해 번역 수준에서 달성될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 면역 조절제 번역을 조절하기 위해 다음 뉴클레오티드 서열이 제공될 수 있다: GCCGCC(A/G)CCAUGG(서열번호: 15). 일부 실시형태에 따르면, 서열번호: 15와 적어도 60% 동일한 서열이 면역조절제 번역을 조절하기 위해 제공될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 서열번호: 15와 적어도 70% 동일한 서열이 면역조절제 번역을 조절하기 위해 제공될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 서열번호: 15와 적어도 80% 동일한 서열이 면역조절제 번역을 조절하기 위해 제공될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 서열번호: 15와 적어도 90% 동일한 서열이 면역조절제 번역을 조절하기 위해 제공될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 서열번호: 15와 적어도 95% 동일한 서열이 면역조절제 번역을 조절하기 위해 제공될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 서열번호: 15와 적어도 96% 동일한 서열이 면역조절제 번역을 조절하기 위해 제공될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 서열번호: 15와 적어도 97% 동일한 서열이 면역조절제 번역을 조절하기 위해 제공될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 서열번호: 15와 적어도 98% 동일한 서열이 면역조절제 번역을 조절하기 위해 제공될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 서열번호: 15와 적어도 99% 동일한 서열이 면역조절제 번역을 조절하기 위해 제공될 수 있다.

비-바이러스 접근법은 또한 종양 또는 종양 세포주 또는 변이체를 갖는 환자로부터 유래된 세포에 하나 이상의 면역조절 분자를 인코딩하는 벡터의 도입을 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 면역조절 분자를 인코딩하는 핵산 분자는 리포펙션(Feigner 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:7413, 1987; Ono 등, Neuroscience Letters 17:259, 1990; Brigham 등, Am. J. Med. Sci. 298:278, 1989; Staubinger 등, Methods in Enzymology 101:512, 1983), 아시아루로소뮤코이드-폴리라이신 접합(Wu 등, Journal of Biological Chemistry 263:14621, 1988; Wu 등, Journal of Biological Chemistry 264:16985, 1989)의 존재에서, 또는 외과적 조건하에서 미세-주입(Wolff 등, Science 247:1465, 1990)에 의해 핵산 분자를 투여함에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 바람직하게는 핵산은 리포솜 및 프로타민과 조합하여 투여된다.

시험관내 형질감염을 달성하는 방법은 인산칼슘, DEAE 덱스트란, 전기천공 및 원형질체 융합의 사용을 포함한다. 리포솜은 또한 세포 내로 DNA의 전달에 잠재적으로 유리할 수 있다.

IV. 치료 조성물

동종 종양 세포 백신을 포함하는 본 발명의 면역원성 조성물은 특정 유형의 암 치료를 위한 치료제 및 예방제로서 유용하다. 유리하게는, 이들 백신은 대상체의 종양에서 발현되는 특정 종양 항원을 표적으로 하는 백신을 생성함으로써 특정 개체의 암을 치료하도록 맞춤될 수 있다. 본 발명의 동종 백신은 전형적으로 불활성화된 종양 세포 또는 본원에 기재된 바와 같이 외인성 면역조절 분자를 발현하도록 유전적으로 변형된 종양 항원을 발현하는 세포를 함유한다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 종양 세포 백신은 면역조절 분자를 코딩하는 2개 이상의 유전자를 포함하는 일정량의 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 면역조절 분자를 최대로 발현하는 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체의 클론이 확인되고 선택된다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체의 모집단에 의한 면역조절 분자의 발현은 유세포분석에 의해 결정된다. 일부 실시형태에 따르면, 유세포분석은 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체의 최대 발현 모집단(들)을 게이팅하는데 사용된다.

일부 실시형태에 따르면, 면역원성 양은 하나 이상의 종양 특이적 항원에 대한 항종양 면역 반응을 자극하는데 효과적이다. 일부 실시형태에 따르면, 면역원성 양은 안전성 및 효능 모두를 제공하도록 적정될 수 있다.

일부 실시형태에 따르면, 면역원성 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 면역원성 조성물은 보조제를 추가로 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 확립된 세포주로부터 유래된 종양 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 암 환자로부터 유래된 종양 세포를 포함하며, 여기서 종양 세포는 고형 종양으로부터 유래된다.

일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 면역원성 양의 파괴된 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체를 포함한다. 물리적 파괴 방법의 예에는 초음파 처리, 캐비테이션, 탈수, 이온 고갈 또는 하나 이상의 염에 대한 노출로 인한 독성이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

일부 실시형태에 따르면, 면역원성 조성물의 면역원성 양은 적어도 1 x 10³개의 전체 또는 파괴된 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 면역원성 조성물의 면역원성 양은 적어도 1 x 10⁴개의 전체 또는 파괴된 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 면역원성 조성물의 면역원성 양은 적어도 1 x 10⁵개의 전체 또는 파괴된 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 면역원성 조성물의 면역원성 양은 적어도 1 x 10⁶개의 전체 또는 파괴된 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 면역원성 조성물의 면역원성 양은 적어도 1 x 10⁷개의 전체 또는 파괴된 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 면역원성 조성물의 면역원성 양은 적어도 1 x 10⁸개의 전체 또는 파괴된 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 면역원성 조성물의 면역원성 양은 적어도 1 x 10⁹개의 전체 또는 파괴된 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 면역원성 양은 치료량일 수 있다.

일부 실시형태에 따르면, 면역원성 양은 (1) 세포독성 T 세포 모집단, 자연 사멸 세포 집단, 항체, APC, T 세포 모집단, B 세포 모집단, 및 수지상 세포 모집단 중 하나 이상을 포함하는 종양 부하를 감소시키는 면역 반응을 자극시키고; 및 (2) 적합한 대조군과 비교할 때, 무진행 생존, 무질환 생존, 진행까지의 시간, 원격 전이까지의 시간, 및 대상체의 전체 생존 중 하나 이상으로부터 선택된 임상 결과 매개변수를 개선하기에 효과적이다.

일부 실시형태에 따르면, 면역원성 조성물은 주당 1회, 주당 2회, 2주에 1회, 3주에 1회, 4주에 1회, 1개월에 1회, 2개월에 1회, 3개월에 1회, 4개월에 1회, 5개월에 1회, 6개월에 1회, 7개월에 1회, 8개월에 1회, 9개월에 1회, 10개월에 1회, 11개월에 1회 또는 1년에 1회 투여될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 투여는 1일 또는 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일 또는 그 이상에 일어난다. 일부 실시형태에 따르면, 투여는 같은 날에 2회 이상의 투여를 수반할 수 있다.

조합 요법

일부 실시형태에 따르면, 본 개시내용은 대상체에게 추가 제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에 따르면, 본 발명은 병용투여 및/또는 복합제형화에 관한 것이다.

일부 실시형태에 따르면, 면역원성 조성물의 투여는 또 다른 작용제와 공동 투여될 때 상승적으로 작용하고 이러한 작용제가 단일요법으로 사용될 때 일반적으로 사용되는 용량보다 낮은 용량으로 투여된다.

암 적용을 포함하지만 이에 제한되지 않는 일부 실시형태에 따르면, 본 발명은 추가 제제로서의 화학요법제에 관한 것이다. 화학요법제의 예는 티오테파 및 사이톡산 사이클로포스파미드와 같은 알킬화제; 부설판, 임프로설판 및 피포설판과 같은 알킬 설포네이트; 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파 및 우레도파와 같은 아지리딘; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 아세토게닌(예를 들어, 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신(합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 콜리스타틴; CC-1065(그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 크립토피신(예를 들어, 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신(합성 유사체, KW-2189 및 CB 1-TM1 포함); 엘류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕틴; 스폰기스타틴; 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드와 같은 질소 머스타드; 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라니무스틴과 같은 니트로우레아; 에네다인 항생제(예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감말 및 칼리케아미신 오메갈; 다이네미신 A를 포함하는 다이네미신; 클로드로네이트와 같은 비스포스포네이트; 에스페라마이신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 발색단백 에네다인 항생제 발색단)와 같은 항생제, 아클라시노미신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 아드리아마이신 독소루비신(모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시 독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 예컨대 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 켈라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU)과 같은 항대사물질; 데놉테린, 메토트렉세이트, 프테롭테린, 트리메트렉세이트와 같은 엽산 유사체; 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌과 같은 퓨린 유사체; 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘과 같은 피리미딘 유사체; 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤과 같은 안드로겐; 미노글루테티미드, 미토탄, 트리로스탄과 같은 항부신제; 프롤린산 등의 엽산 보충제; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐루라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK 다당류 복합체; 라족산; 리족신; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2''-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(예를 들어, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안귀딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노사이드("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 TAXOL 파클리탁셀(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), 아브락산 크레모포어-프리, 파클리탁셀의 알부민-조작된 나노입자 제형, 및 TAXOTERE 도세탁셀; 클로란부실; GEMZAR 젬시타빈; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카보플라틴과 같은 백금 유사체; 빈블라스틴; 백금; 에토포사이드(VP-16); 이포스파마이드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 네이블빈. 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; 이리노테칸(Camptosar, CPT-11)(이리노테칸과 5-FU 및 류코보린의 치료 요법 포함); 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노산과 같은 레티노이드; 카페시타빈; 콤브레타스타틴; 류코보린(LV); 옥살리플라틴 치료 요법(FOLFOX)을 포함한 옥살리플라틴; 라파티닙(TYKERB); 세포 증식을 감소시키는 PKC-.알파., Raf, H-Ras, EGFR (예를 들어, 에를로티닙(Tarceva)) 및 VEGF-A의 억제제 및 임의의 사기의 약학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 또한, 치료 방법은 방사선의 사용을 추가로 포함할 수 있다.

종양 면역억제의 체크포인트 차단/차단

일부 인간 종양은 환자의 면역계에 의해 제거될 수 있다. 예를 들어, 면역 "체크포인트" 분자를 표적으로 하는 단클론 항체의 투여는 완전한 반응과 종양 완화로 이어질 수 있다. 이러한 항체의 작용 방식은 종양이 항종양 면역 반응으로부터 보호하기 위해 선택한 면역 조절 분자의 억제를 통한 것이다. 이러한 "체크포인트" 분자를 (예를 들어, 길항 항체로) 억제함으로써, 환자의 CD8+ T 세포가 증식하여 종양 세포를 파괴할 수 있다.

일부 실시형태에 따르면, 동종 백신 조성물은 일단 그러한 면역 반응이 개시되면 효과적인 면역 반응의 조기 종결을 방지하는데 효과적일 수 있는 하나 이상의 체크포인트 억제제를 추가로 포함한다.

예를 들어, 제한 없이 예를 들어 CTLA-4 또는 PD-1을 표적으로 하는 단클론 항체의 투여는 완전한 반응 및 종양 완화로 이어질 수 있다. 이러한 항체의 작용 방식은 종양이 항종양 면역 반응으로부터 보호하기 위해 채택한 CTLA-4 또는 PD-1의 억제를 통한 것이다. (예를 들어, 길항 항체로) 이러한 "체크포인트" 분자를 억제함으로써 환자의 CD8+ T 세포가 증식하여 종양 세포를 파괴할 수 있다.

따라서, 본 명세서에 제공된 동종 백신 조성물은 면역 "체크포인트" 분자를 표적으로 하는 하나 이상의 차단 항체와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에 따르면, 본 명세서에 제공된 동종 백신 조성물은 CTLA-4 또는 PD-1과 같은 분자를 표적으로 하는 하나 이상의 차단 항체와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 제공된 동종 백신 조성물은 PD-1 및 PD-L1 또는 PD-L2 및/또는 PD-1과 PD-L1 또는 PD-L2의 결합을 차단, 감소 및/또는 억제하는 제제(비제한적인 예로, 니볼루맙(ONO-4538/BMS-936558, MDX1106, OPDIVO, BRISTOL MYERS SQUIBB), 펨브롤리주맙(KEYTRUDA, Merck), 피딜리주맙(CT-011, CURE TECH), MK-3475(MERCK), BMS 936559 (BRISTOL MYERS SQUIBB), MPDL328OA (ROCHE)) 중 하나 이상)와 함께 사용될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 본 명세서에 제공된 동종 백신 조성물은 CTLA-4의 활성 및/또는 CTLA-4와 하나 이상의 수용체(예를 들어, CD80, CD86, AP2M1, SHP-2, 및 PPP2R5A)의 결합을 차단, 감소 및/또는 억제하는 제제와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에 따르면, 면역-조절제는 비제한적으로 이필리무맙(MDX-010, MDX-101, Yervoy, BMS) 및/또는 트레멜리무맙(Pfizer)과 같은 항체이다. 이들 분자에 대한 차단 항체는 예를 들어, Bristol Myers Squibb (New York, N.Y.), Merck (Kenilworth, N.J.), Medlmmune (Gaithersburg, Md.), 및 Pfizer (New York, N.Y.)로부터 입수할 수 있다.

또한, 본 명세서에서 제공되는 동종 면역 조성물은 예를 들어 BTLA, HVEM, TIM3, GALS, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160(BY55라고도 함), CGEN-15049, CHK 1 및 CHK2 키나제, A2aR, CEACAM(예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), GITR, GITRL, 갈렉틴-9, CD244, CD160, TIGIT, SIRPα, ICOS, CD172a, 및 TMIGD2 및 여러 B-7 패밀리 리간드(B7-1, B7-2, B7-DC, B7-H1, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H5, B7-H6 및 B7-H7을 포함하지만 이에 제한되지 않음)와 같은 면역 "체크포인트" 분자를 표적으로 하는 하나 이상의 차단 항체와 함께 사용될 수 있다.

보조제

일부 실시형태에 따르면, 본 발명의 조성물은 그의 보조제 특성으로 인해 불활성화된 종양 세포(들) 상에 존재하는 암 항원에 반응하도록 면역계를 자극하도록 작용할 수 있는 하나 이상의 추가 물질을 추가로 포함할 수 있다. 그러한 보조제는 지질, 리포솜, 선천 면역을 유도하는 불활성화된 박테리아(예를 들어, 불활성화된 또는 약화된 리스테리아 모노사이토게네스), 톨-유사 수용체(TLRs), (NOD)-유사 수용체(NLR), 레티노산 유도 유전자-기반(RIG)-I-유사 수용체(RLR), 및/또는 C형 렉틴 수용체(CLR)를 통해 선천 면역 활성화를 매개하는 조성물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. PAMP의 예는 지단백질, 지질폴리펩티드, 펩티도글리칸, 자이모산, 지질다당류, 나이세리알 포린, 플라젤린, 프로필린, 갈락토세라미드, 무라밀 디펩티드를 포함한다. 펩티도글리칸, 지단백질 및 리포테이코산은 그람 양성의 세포벽 성분이다. 지질다당류는 MPL이 한 예인 대부분의 박테리아에서 발현된다. 플라겔린은 병원성 및 공생 세균에 의해 분비되는 세균성 편모의 구조적 성분을 지칭한다. a-갈락토실세라미드(a-GalCer)는 자연 사멸 T(NKT) 세포의 활성화제이다. 무라밀 디펩티드는 모든 박테리아에 공통적인 생활성 펩티도글리칸 모티프이다. 이 목록은 제한하기 위한 것이 아니다.

일부 실시형태에 따르면, 치료 요법은 표준 항종양 요법(예컨대 수술, 방사선 요법, 암 세포를 정확하게 식별하고 공격하는 표적 요법, 호르몬 요법 또는 이들의 조합)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 표준 항종양 요법은 임의의 기존 항종양 면역 반응을 보존하면서 종양을 치료하는 데 효과적이다. 일부 실시형태에 따르면, 면역원성 조성물은 화학요법 후에 적용되지 않는다. 일부 실시형태에 따르면, 면역원성 조성물은 저용량 화학요법 후에 적용된다.

일부 실시형태에 따르면, 면역원성 조성물은 2개 이상의 클론 유래 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 2개 이상의 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 재조합 면역조절제의 동일한 보체를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 2개 이상의 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 재조합 면역조절제의 상이한 패널을 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 대상체에게 투여하기 전에 세포 분열을 방지하는 제제로 처리된다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 방사선 조사된다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 증식을 방지하는 화학 제제로 처리된다.

일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 비경구적으로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 외과적 절제 공동으로 국소적으로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포 변이체는 피내 주사에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 피하 주사에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다.

V. 치료 방법

일부 실시형태에 따르면, 본 명세서에 기재된 동종 종양 세포 백신은 세포의 면역 활성화를 강화하고, 전신 염증 없이 생체내에서 표적 종양 항원을 포함하는 종양 세포를 인식하고 그에 대해 작용하고; 표적 종양 항원을 포함하는 종양 세포에 대한 종양 미세환경에서 면역억제를 감소시키고; 종양 부하를 감소시키거나, 또는 표적 종양 항원을 발현하는 종양 세포의 세포 사멸을 증가시키는데 효과적이다. 일부 실시형태에 따르면, 본 명세서에 기재된 동종 종양 세포 백신은 전신 염증 없이 면역 활성화를 유도하는 데 효과적이다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 종양 세포 백신은 위약 대조군과 비교하여 무진행 생존, 전체 생존, 또는 둘 다를 향상시키는 면역 반응을 유도하는 데 효과적이다.

일부 실시형태에 따르면, 동종 백신 조성물은 종양 세포에 의해 생성된 면역억제 분자를 억제하는 제제와 조합하여 암으로 진단된 대상체에게 투여된다.

일부 실시형태에 따르면, 기재된 발명은 특정 유형의 암을 가진 모든 환자에게 보편적으로 투여될 수 있는 활성 면역요법을 위한 동종 종양 세포 백신을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 유전적으로 변형된 동종 종양-유형 특이적 세포, 또는 약학적으로 허용가능한 담체에 제형화된 변형된 동종 종양-유형 특이적 세포로부터 유래된 막 용해물을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 변형된 동종 종양-유형 특이적 세포는 이전에 확립된 세포주로부터 유래된다.

일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 체액성 면역과 세포성 면역을 포함하는 선천성 면역(저항성) 및 적응성(특이적) 면역에 의해 자기 인식 및 비자기에 대한 반응을 포함하는 기능적 면역계 및 최소한의 잔여 질환을 가진 환자를 치료하도록 개조된다. 예를 들어, 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 원발성 병변이 외과적으로 제거된 직후에 얻어진 최소 잔류 질환을 가진 환자를 치료하도록 개조된다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신은 백신의 피하 투여를 위해 개조된다. 일부 실시형태에 따르면, 동종 백신을 투여하기 위한 용량 및 일정은 전체 생존의 궁극적인 향상을 위한 가이드로서 백신에 대한 면역학적 반응을 사용하여 결정된다.

일부 실시형태에 따르면, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 동종 종양 세포 백신을 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 암에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 특징으로 하며, 여기서 동종 종양 세포 백신은 대상체의 암에 유형-매칭된다.

본 명세서에 제공된 바와 같은 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체는 대상체(예를 들어, 암 또는 감염과 같은 임상적 병태를 앓는 연구 동물 또는 인간과 같은 포유동물)에게 투여하기 위한 조성물에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 3개의 면역조절 분자의 코어 그룹을 안정적으로 발현하도록 유전적으로 조작된 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체; 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 동종 종양 세포 백신은 암 치료를 위해 대상체에게 투여될 수 있으며, 여기서 면역조절제 분자의 코어 그룹이 OX40 리간드(OX40L), CD27 리간드(CD70) 및 CD28 리간드(CD28L)이다. 또 다른 예에서, 종양-유형 특이적 세포주 변이체를 포함하는 동종 종양 세포 백신은 위약 대조군과 비교하여 개선된 무진행 생존, 전체 생존, 또는 둘 다에 반영되는 효과적인 항종양 반응을 이끌어내기에 충분한 면역조절 신호와 관련하여 광범위한 종양 항원을 전달하는데 사용되며, 여기서 면역조절 신호는 적어도, 3개의 면역조절 분자의 코어 그룹을 포함하고, 여기서 면역조절 분자의 코어 그룹은 OX40 리간드(OX40L), CD27 리간드(CD70) 및 CD28 리간드(CD28L)이고; 선택적으로 표 2에 제시된 것들로부터 선택된 3~25개의 면역조절제("R 그룹")를 포함하는 추가적인 수의 면역조절 분자를 포함한다.

따라서, 기재된 발명은 본 명세서에 제공된 동종 종양 백신으로 암과 같은 임상 병태를 치료하는 방법을 제공한다.

여러 실시형태에 따르면, 기재된 발명은 암 및/또는 종양; 예를 들어, 암 및/또는 종양의 치료 또는 예방에 관한 것이다. "암 또는 종양"이라는 어구는 세포의 통제되지 않는 성장 및/또는 비정상적으로 증가된 세포 생존 및/또는 신체 기관 및 시스템의 정상적인 기능을 방해하는 세포사멸의 억제를 지칭한다. 양성 및 악성 암, 폴립, 과형성뿐만 아니라 휴면 종양 또는 미세전이가 포함된다. 또한, 면역계에 의해 방해받지 않는 비정상적인 증식을 갖는 세포(예를 들어, 바이러스 감염 세포)도 포함된다. 암은 원발성 암 또는 전이성 암일 수 있다. 원발성 암은 임상적으로 검출될 수 있는 기원 부위의 암 세포 영역일 수 있고, 원발성 종양일 수 있다. 대조적으로, 전이성 암은 한 기관 또는 부분에서 인접하지 않은 다른 기관 또는 부분으로 질병이 퍼질 수 있다. 상기 전이성 암은 암세포가 국소 영역내 주변 정상 조직에 침투 및 침윤하여 새로운 종양을 형성하는 능력을 획득하여 발생하며, 이는 국소 전이일 수 있다. 암은 또한 림프관 및/또는 혈관의 벽을 관통하는 능력을 획득한 암세포에 의해 유발될 수 있으며, 그 후에 암세포는 혈류를 통해 체내 다른 부위 및 조직으로 순환할 수 있다(따라서 순환하는 종양 세포가 됨). 암은 림프계 또는 혈행성 전이와 같은 과정으로 인한 것일 수 있다. 암은 또한 종양 세포가 다른 부위에 머무르다가 혈관이나 벽을 통해 다시 침투하고 계속 증식하여 결국에는 임상적으로 감지할 수 있는 또 다른 종양을 형성함으로써 발생할 수 있다. 암은 전이성(또는 이차) 종양일 수 있는 이 새로운 종양일 수 있다.

암은 전이된 종양 세포에 의해 유발될 수 있으며, 이는 2차 또는 전이성 종양일 수 있다. 종양의 세포는 원래 종양의 세포와 같을 수 있다. 예를 들어, 유방암이나 대장암이 간으로 전이되면 이차 종양은 간에 존재하지만 비정상적인 간세포가 아닌 비정상적인 유방이나 대장 세포로 구성된다. 따라서, 간의 종양은 간암이 아니라 전이성 유방암 또는 전이성 결장암일 수 있다.

치료될 수 있는 예시적인 암은 암종, 예를 들어, 암종, 예를 들어 선암종, 기저 세포 암종, 편평 세포 암종 및 전이 세포 암종을 포함하는 다양한 아형), 육종(예를 들어, 뼈 및 연조직 포함), 백혈병(예를 들어, 급성 골수성, 급성 림프구성, 만성 골수성, 만성 림프구 및 털 세포), 림프종 및 골수종(예를 들어, 호지킨 및 비호지킨 림프종, 경쇄, 비분비성, MGUS 및 형질세포종 포함) 및 중추 신경계 암(예를 들어, 뇌(예를 들어, 신경아교종(예를 들어, 성상세포종, 핍지교종 및 상의세포종), 수막종, 뇌하수체 선종 및 신경종, 및 척수 종양(예를 들어, 수막종 및 신경섬유종) 포함)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

특정 실시형태에 따르면, 치료될 수 있는 암/종양은 치료의 표준이 더 이상 화학요법이 아닌 암/종양인데, 이는 화학요법이 성공적인 백신접종 프로토콜 동안 발생할 것으로 예상되는 면역 반응을 방해하는 것으로 알려져 있기 때문이다. 예시적인 종양 유형에는 전립선암 및 유방암(예를 들어, 전립선암에 대한 Abiraterone® 및 유방암에 대한 Tamoxifen®)과 같은 호르몬 요법으로 치료되는 종양 유형, 항체와 같은 표적 요법(예를 들어, B 세포 악성종양에 대한 Rituxan®, 유방암에 대한 Herceptin®)으로 치료되는 종양 유형, 만성 골수성 백혈병에 대한 GLEEVEC™과 같은 키나제 억제제로 치료되는 종양 유형 및 체크포인트 억제제, 종양용해성 바이러스 및 CAR-T 세포와 같은 다른 면역계 보존 또는 강화 방식으로 치료되는 종양 유형이 포함된다.

본 발명의 대표적인 암 및/또는 종양이 본원에 기술되어 있다.

본 개시내용은 또한 사이토카인, TNF-패밀리 구성원, 분비된 수용체, 샤페론, IgG 슈퍼패밀리 구성원 및 케모카인 수용체로부터 선택되는 2개 이상의 안정적으로 발현된 재조합 외인성 면역조절 분자를 포함하는 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체를 포함하는 동종 종양 백신을 함유하는 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 또한 2, 3, 4개 또는 그 이상의 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체를 포함하는 동종 종양 세포 백신을 함유하는 조성물을 제공하며, 각각은 사이토카인, TNF-패밀리 구성원, 분비된 수용체, 샤페론, IgG 슈퍼패밀리 구성원 및 케모카인 수용체로부터 선택되는 2개 이상의 안정적으로 발현된 재조합 외인성 면역조절 분자를 포함한다.

본 개시내용은 또한 본원에서 생리학적 및 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께, 표 2에 제시된 것들로부터 선택된 2개 이상의 안정적으로 발현된 재조합 막 결합된 면역조절 분자를 포함하는 종양 세포주 또는 종양 세포주 변이체, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 동종 종양 세포 백신을 함유하는 조성물을 제공한다. 생리학적 및 약학적으로 허용가능한 담체는 면역화에 유용한 잘 알려진 임의의 성분을 포함할 수 있다. 담체는 백신에 투여된 항원에 대한 면역 반응을 촉진하거나 향상시킬 수 있다. 세포 제형은 바람직한 pH 범위를 유지하기 위한 완충액, 염 또는 항원에 대한 면역 반응을 자극하는 조성물에서 개체에게 항원을 제시하는 다른 성분을 함유할 수 있다. 생리학적으로 허용가능한 담체는 또한 항원에 대한 면역 반응을 향상시키는 하나 이상의 보조제를 함유할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는, 예를 들어 약학적으로 허용가능한 용매, 현탁화제, 또는 화합물을 대상체에게 전달하기 위한 임의의 다른 약리학적 비활성 비히클을 포함한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 액체 또는 고체일 수 있으며, 하나 이상의 치료 화합물 및 주어진 약학적 조성물의 임의의 다른 성분들과 조합될 때 원하는 벌크, 농도 및 기타 적절한 수송 및 화학적 특성을 제공하도록 염두에 두고 계획된 투여 방식으로 선택될 수 있다. 예시적인 약학적으로 허용가능한 담체는 물, 식염수, 결합제(예를 들어, 폴리비닐피롤리돈 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스); 충전제(예를 들어, 락토스 또는 덱스트로스 및 기타 당류, 젤라틴 또는 황산칼슘), 윤활제(예를 들어, 전분, 폴리에틸렌 글리콜 또는 아세트산나트륨), 붕해제(예를 들어, 전분 또는 나트륨 전분 글리콜레이트) 및 습윤제(예를 들어, 나트륨 라우릴 황산염)을 포함한다. 조성물은 피하, 근육내 또는 피내 투여를 위해 또는 면역화에 허용가능한 임의의 방식으로 제형화될 수 있다.

"보조제"는 분비된 백신 단백질을 발현하는 종양 세포와 같은 면역원성 제제에 첨가될 때 혼합물에 노출시 수혜 숙주에서 제제에 대한 면역 반응을 비특이적으로 향상시키거나 강력하게 하는 물질을 지칭한다. 보조제는 예를 들어 수중유 에멀젼, 유중수 에멀젼, 명반(알루미늄 염), 리포솜 및 미립자, 예컨대 폴리시트렌, 전분, 폴리포스파젠 및 폴리락타이드/폴리글리코사이드를 포함할 수 있다.

보조제는 또한 예를 들어 스쿠알렌 혼합물(SAF-I), 무라밀 펩티드, 사포닌 유도체, 미코박테리움 세포벽 제제, 모노포스포릴 지질 A, 미콜산 유도체, 비이온성 블록 공중합체 계면활성제, Quil A, 콜레라 독소 B 서브유닛, 폴리포스파젠 및 유도체, 및 Takahashi 등., Nature 1990, 344:873-875에 기술된 것과 같은 면역자극 복합체(ISCOM)를 포함할 수 있다. 수의학적 용도 및 동물에서의 항체 생산을 위해, 프로인트 보조제의 분열촉진 성분(완전 및 불완전 모두)을 사용할 수 있다. 인간에서 불완전 프로인트 보조제(IFA)는 유용한 보조제이다. 다양한 적절한 보조제는 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, Warren and Chedid, CRC Critical Reviews in Immunology 1988, 8:83; 및 Allison and Byars, in Vaccines: New Approaches to Immunological Problems, 1992, Ellis, ed., Butterworth-Heinemann, Boston 참조). 추가의 보조제는 예를 들어, bacille Calmett-Guerin (BCG), DETOX(Mycobacterium phlei(CWS)의 세포벽 골격 및 Salmonella minnesota(MPL)의 모노포스포릴 지질 A 함유), 등을 포함한다(예를 들어, Hoover 등, J Clin Oncol 1993, 11:390; 및 Woodlock 등, J Immunother 1999, 22:251-259 참조).

일부 실시형태에 따르면, 동종 종양 세포 백신은 대상체에게 1회 이상(예를 들어, 1회, 2회, 2 내지 4회, 3 내지 5회, 5 내지 8회, 6 내지 10회, 8 내지 12회 또는 12회 초과) 투여될 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 동종 종양 세포 백신은 1일 1회 이상, 1주 1회 이상, 격주로, 1개월 1회 이상, 2개월 내지 3개월마다 1회, 3개월 내지 6개월마다 1회 또는 6 내지 12개월마다 1회 투여될 수 있다. 동종 종양 세포 백신은 약 1일 내지 약 12개월의 기간과 같은 임의의 적합한 기간에 걸쳐 투여될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 예를 들어, 투여 기간은 약 1일 내지 90일; 약 1일 내지 60일; 약 1일 내지 30일; 약 1일 내지 20일; 약 1일 내지 10일; 약 1일에서 7일일 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 투여 기간은 약 1주 내지 50주; 약 1주 내지 50주; 약 1주 내지 40주; 약 1주 내지 30주; 약 1주 내지 24주; 약 1주 내지 20주; 약 1주 내지 16주; 약 1주 내지 12주; 약 1주 내지 8주; 약 1주 내지 4주; 약 1주 내지 3주; 약 1주 내지 2주; 약 2주 내지 3주; 약 2주 내지 4주; 약 2주 내지 6주; 약 2주 내지 8주; 약 3주 내지 8주; 약 3주 내지 12주; 또는 약 4주 내지 20주일 수 있다.

일부 실시형태에 따르면, 동종 종양 세포 백신의 초기 용량(때때로 "프라이밍" 용량으로 지칭됨)이 투여되고 최대 항원-특이적 면역 반응이 달성된 후, 하나 이상의 부스팅 용량이 투여될 수 있다. 예를 들어, 부스팅 용량은 프라이밍 용량 후 약 10 내지 30일, 약 15 내지 35일, 약 20 내지 40일, 약 25 내지 45일, 또는 약 30 내지 50일에 투여될 수 있다.

일부 실시형태에 따르면, 본 명세서에 제공된 방법은 고형 종양 성장 및/또는 전이를 제어하기 위해 사용될 수 있다. 상기 방법은 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 동종 종양 세포 백신을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수 있다.

본 명세서에 제공된 벡터 및 방법은 종양에 대한 면역 반응을 자극하는 데 유용할 수 있다. 그러한 면역 반응은 종양과 관련된 징후 또는 증상을 치료하거나 완화시키는데 유용하다. 실무자는 본 명세서에 기재된 방법이 후속 요법을 결정하기 위해 숙련된 시술자(의사 또는 수의사)에 의한 지속적인 임상 평가와 함께 사용되어야 함을 인식할 것이다. 이러한 평가는 특정 치료 용량, 투여 방식 등을 증가, 감소 또는 지속할지 여부를 평가하는 데 도움이 되고 정보가 될 것이다.

따라서 본원에 제공된 방법은 예를 들어 암을 비롯한 종양을 치료하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 추가 종양 성장을 방지하거나, 종양 성장을 늦추거나, 종양 퇴행을 유발함으로써 종양의 성장을 억제하기 위한 방법들이 사용될 수 있다. 따라서, 방법은 예를 들어 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 화합물이 투여되는 대상체는 특정 외상 상태를 겪을 필요가 없다는 것을 이해할 것이다. 실제로, 본 명세서에 기술된 동종 종양 세포 백신은 증상(예를 들어, 암이 완화된 환자)이 발생하기 전에 예방적으로 투여될 수 있다.

항종양 및 항암 효과는 제한없이, 종양 성장(예를 들어, 종양 성장 지연), 종양 크기 또는 전이의 조절, 특정 항암제와 연관된 독성 및 부작용의 감소, 암의 임상적 장애 또는 증상의 개선 또는 최소화, 그러한 치료가 없을 때 예상되는 것 이상으로 대상체의 생존 연장, 및 투여 전에 종양 형성이 결여된 동물에서 종양 성장의 예방, 즉, 예방 투여를 포함한다.

치료적 유효량은 예를 들어 상대적으로 적은 양에서 시작하여 유익한 효과의 동시 평가와 함께 단계별 증분을 사용하여 결정될 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 제공되는 방법은 종양이 있는 환자를 치료하기 위해 단독으로 또는 다른 잘 알려진 종양 치료법과 함께 사용될 수 있다. 당업자는 예를 들어 암 환자의 기대 수명을 연장하고/하거나 암 환자(예를 들어, 폐 암환자)의 삶의 질을 개선함에 있어서 본 명세서에 제공된 동종 종양 세포 백신 및 방법의 유리한 용도를 쉽게 이해할 것이다.

일부 실시형태에 따르면, 대상체(즉, 암으로 진단된 대상체)는 동종 백신 조성물의 투여 전 또는 투여와 동시에 체크포인트 억제제 요법으로 치료된다. 특정 실시형태에서, 암은 흑색종이다.

대상체

본 명세서에 기술된 방법은 이러한 방법의 이점을 경험할 수 있는 모든 대상체와 함께 사용하기 위한 것이다. 따라서 "대상체", "환자" 및 "개체"(상호호환적으로 사용됨)에는 인간뿐만 아니라 비인간 대상체, 특히 가축이 포함된다.

일부 실시형태에 따르면, 대상체 및/또는 동물은 포유동물, 예를 들어 인간, 마우스, 래트, 기니피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 토끼, 양, 또는 비인간 영장류, 예컨대 원숭이, 침팬지 또는 비비이다. 다른 실시형태에서, 대상체 및/또는 동물은 비-포유동물, 예컨대, 예를 들어, 제브라피시이다. 일부 실시형태에 따르면, 대상체 및/또는 동물은 형광 태그가 붙은 세포(예를 들어, GFP 포함)를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 대상체 및/또는 동물은 형광 세포를 포함하는 트랜스제닉 동물이다.

일부 실시형태에 따르면, 대상체 및/또는 동물은 인간이다. 일부 실시형태에 따르면, 인간은 소아 인간이다. 다른 실시형태에서, 인간은 성인 인간이다. 다른 실시형태에서, 인간은 고령자이다. 다른 실시형태에서, 인간은 환자로 지칭될 수 있다.

특정 실시형태에 따르면, 인간은 약 0개월 내지 약 6개월, 약 6 내지 약 12개월, 약 6 내지 약 18개월, 약 18 내지 약 36개월, 약 1 내지 약 5세, 약 5 내지 약 10세, 약 10 내지 약 15세, 약 15 내지 약 20세, 약 20 내지 약 25세, 약 25 내지 약 30세, 약 30 내지 약 35세, 약 35 내지 약 40세, 약 40 내지 약 45세, 약 45 내지 약 50세, 약 50 내지 약 55세, 약 55 내지 약 60세, 약 60 내지 약 65세, 약 65 내지 약 70세, 약 70 내지 약 75세, 약 75 내지 약 80세, 약 80 내지 약 85세, 약 85 내지 약 90세, 약 90 내지 약 95세 또는 약 95 내지 약 100세 범위의 연령을 갖는다.

다른 실시형태에 따르면, 대상체는 비인간 동물이고, 따라서 본 발명은 수의학적 용도에 관한 것이다. 구체적인 실시형태에 따르면, 비인간 동물은 가정용 애완동물이다. 또 다른 특정 실시형태에 따르면, 비인간 동물은 가축이다. 특정 실시형태에 따르면, 대상체는 화학 요법을 받을 수 없는, 예를 들어 환자가 화학요법에 반응하지 않거나 너무 아파서 화학요법에 적합한 치료 창을 가질 수 없는 인간 암 환자이다(예를 들어, 너무 많은 용량 또는 요법 제한 부작용 경험). 특정 실시형태에서, 대상체는 진행성 및/또는 전이성 질환을 앓는 인간 암 환자이다.

값의 범위가 제공되는 경우, 문맥이 달리 명확하게 지시하지 않는 한 그 범위의 상한과 하한 사이에서 하한의 10분의 1 단위까지 각 개재하는 값 및 그 명시된 범위에서 임의의 기타 명시되거나 개재하는 값은 발명 내에 포괄된다는 것이 이해된다. 더 작은 범위에 독립적으로 포함될 수 있는 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한도 발명 내에 포괄되며, 명시된 범위에서 구체적으로 제외된 제한이 적용된다. 명시된 범위가 제한 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 이들 포함된 제한의 둘 중 어느 하나를 제외한 범위도 발명에 포함된다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상인에 의해 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 또한 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 이제 기재되어 있다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물은 그 간행물이 인용된 것과 관련하여 방법 및/또는 재료를 개시하고 기술하기 위해 참고로 본 명세서에 포함된다.

본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "and" 및 "the"는 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수 참조를 포함한다는 점에 유의해야 한다. 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 동일한 의미를 갖는다.

본 명세서에서 논의된 간행물은 본 출원의 출원일 이전의 그 공개를 위해서만 제공되고 각각은 그 전체가 참고로 포함된다. 본 명세서에서 어떠한 내용도 본 발명이 선행 발명으로 인해 그러한 공개보다 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 더욱이, 제공된 공개일은 실제 공개일과 다를 수 있어 독립적으로 확인되어야할 필요가 있을 수 있다.

실시예

하기 실시예는 본 발명을 제조하고 사용하는 방법에 대한 완전한 개시 및 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제시되고, 발명자들이 그의 발명으로 간주하는 것의 범위를 제한하기 위한 것으로 의도되지 않거나 아래의 실험이 수행된 모든 또는 유일한 실험임을 나타내는 것으로 의도되지 않는다. 사용된 숫자(예를 들어, 양, 온도, 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력했지만 일부 실험 오류 및 편차를 고려해야 한다. 달리 표시되지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압 또는 그 부근이다.

실시예 1.

실시예는 아래 본 명세서에 기술된 방법을 사용하지만 이에 제한되지 않는다.

웨스턴 블로팅

간단히 말해서, 세포를 저온 용리 완충액으로 용리하고 원심분리하여 세포 파편을 펠렛화한다. 상등액의 단백질 농도는 단백질 정량 검정(예를 들어, 브래드퍼드 단백질 검정, Bio-Rad Laboratories)에 의해 결정된다. 그런 다음 용리액 상등액을 동일한 부피의 2X SDS 샘플 완충액과 조합하고 100℃에서 5분 동안 끓인다. 샘플 완충액에서 동일한 양의 단백질을 분자량 마커와 함께 SDS-PAGE 겔의 웰 안으로 장입하고 100V에서 1-2시간 동안 전기영동한다. 그런 다음 단백질을 니트로셀룰로오스 또는 PVDF 막으로 옮긴다. 그 다음 막은 TBST 차단 완충액 중 5% 무-지방 분유를 사용하여 실온에서 1시간 동안 차단한다. 그런 다음 막을 TBST 차단 완충액 중 5% 무-지방 분유에서 1:500 희석한 일차 항체와 함께 인큐베이션한 다음, 20 Mn Tris, Ph 7.5; 150 mM NaCl, 0.1% 트윈 20(TBST)에서 5분 동안 3회 세정한다. 그 다음 막을 실온에서 1시간 동안 TBST 차단 완충액에서 5% 무-지방 분유 내 1:2000 희석에서 접합된 이차 항체와 함께 인큐베이션한 다음, 각각 5분 동안 TBST에서 3회 세정한다. 블롯의 이미지는 화학발광 검출을 위한 암실 현상 기술을 사용하거나 비색 또는 형광 검출을 위한 이미지 스캐닝 기술을 사용하여 얻는다.

실시간 PCR

실시간 PCR 기술은 mRNA의 발현 수준을 분석하기 위해 기술된 바와 같이 수행될 수 있다(Zhao Y. 등, Biochemical and Biophysical Research Communications 360 (2007) 205-211). 간단히 말해서, Quiagen 키트(Valencia CA)를 사용하여 세포에서 전체 RNA를 추출하고 이어서, 무작위 6량체 프라이머(Fermentas, Hanover MD)를 사용하여 첫 번째 가닥 cDNA 합성을 행한다. 각 관심있는 유전자에 대해 검증된 유전자 특이적 RT-PCR 프라이머 세트를 사용하여 40주기 동안 Mx3000p 정량 PCR 시스템(Stratagene, 캘리포니아주 라호야 소재)을 사용하여 각 샘플에 대해 실시간 PCR을 수행한다. 각 전사체의 상대적 발현 수준을 내부 대조군으로 하우스 키핑 유전자 베타-액틴의 것에 대해 보정한다.

면역형광

간단히 말해서, 부착성 종양 세포주 변이체 세포는 실온에서 15분 동안 따뜻한 PBS에 희석된 4% 포름알데히드로 고정한다. 고정액을 흡인하고 세포를 PBS로 각각 5분 동안 3회 세정한다. 세포는 실온에서 60분 동안 5% BSA 차단 완충액에서 차단한다. 그런 다음 차단 완충액을 흡인하고 일차 항체 용액(예를 들어, 1:100 희석)을 4℃에서 밤새 세포와 함께 인큐베이션한다. 그런 다음 세포를 PBS로 각각 5분 동안 3회 헹구고 이어서 실온에서 1-2시간 동안 형광색소 접합된 이차 항체(예를 들어, 1:1000 희석)의 용액과 함께 인큐베이션한다. 그런 다음 세포를 PBS로 각각 5분 동안 3회 세정하고 형광 현미경으로 시각화한다.

유세포분석

유세포분석은 기술된 바와 같이 수행할 수 있다(Zhao Y. 등, Exp. Cell Res., 312, 2454 (2006)). 간단히 말해서, 트립신/EDTA로 처리되거나 처리되지 않은 채로 남아 있는 종양 세포주 변이체 세포는 원심분리에 의해 수집되고 PBS에 재-현탁된다. 세포는 37℃에서 10분 동안 4% 포름알데히드에 고정된다. 항체를 사용한 세포외 염색의 경우 세포는 투과가능하지 않다. 세포내 염색의 경우 세포는 미리-냉각된 세포에 얼음처럼 차가운 100% 메탄올을 90% 메탄올의 최종 농도로 첨가함에 의해 투과가능하게 되고 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션한다. 세포는 먼저 인큐베이션 완충액에 세포를 재현탁하고 일차 항체의 희석액을 추가함에 의해 면역염색된다. 세포를 실온에서 1시간 동안 1차 항체와 함께 인큐베이션한 다음, 인큐베이션 완충액으로 3회 세정한다. 그런 다음 세포를 실온에서 30분 동안 접합된 이차 항체의 희석액과 함께 인큐베이션 완충액에 재현탁한 다음, 인큐베이션 완충액에서 3회 세정한다. 그런 다음 염색된 세포를 유세포분석에 의해 분석한다.

효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)

간단히 말해서, 관심있는 단백질에 특이적인 포획 항체를 마이크로플레이트의 웰 상에 도포한다. 관심있는 단백질을 함유하는 표준, 대조군 표본 및 미지물질을 포함하는 샘플을 단백질 항원이 포획 항체에 결합하는 마이크로플레이트의 웰 내로 피펫팅한다. 4회 세정 후 1시간 동안 검출 항체를 웰에 첨가하여, 1차 인큐베이션 동안 포획된 고정화된 단백질에 결합시킨다. 과잉의 검출 항체를 제거하고 4회 세정한 후, 홀스 래디시 퍼옥시다제(HRP) 접합체(이차 항체 또는 스트렙타비딘)를 30분간 첨가하여 검출 항체에 결합시킨다. 과잉의 HRP 접합체를 제거하기 위해 4회 더 세정한 후, 기질 용액을 암실에서 30분 동안 첨가하여 효소에 의해 검출가능한 형태(색상 신호)로 전환시킨다. 마이크로플레이트의 각 웰에 정지 용액을 첨가하고 반응을 정지한 30분 이내에 평가한다. 착색된 생성물의 강도는 원래 표본에 존재하는 항원의 농도에 직접적으로 비례할 수 있다.

인간 혼합된 림프구 종양 반응(MLTR) 검사

혼합된 림프구 종양 반응(MLTR)은 리드 후보를 최적화하도록 설계된 모든 인간, 시험관내 검정이다. MLTR에서 최적화는 조작된 동종 종양 세포에 대한 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 반응의 정성적 및 정량적 평가를 통해 달성된다. MLTR은 유세포분석 및 질량 세포분석(CyTOF)에 의해, 세포독성에 의해, 젖산 탈수소효소(LDH) 방출 검정 및 사이토카인 프로파일에 의해 측정된 증식 및 분화를 측정한다. 일부 실시형태에 따르면, 단일 면역조절 단백질을 발현하는 동종 세포 풀이 MLTR에서 사용된다. 일부 실시형태에 따르면, 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 면역조절 단백질을 발현하는 동종 세포 풀이 MLTR에서 사용된다.

기본 MLTR 1일 절차는 다음과 같이 수행된다:

PBMC(20 MN 세포)의 바이알을 해동한다. 그런 다음 세포를 dPBS에서 세정한다. PMBC 세포를 X-VIVO(~8 ml)에서 ml당 2.5 x 10⁶ 세포로 재현탁한다. 세포는 세포 모집단의 특성을 문서화하기 위해 유세포분석에 의해 특징지어진다.

MLTR에서의 사용은 다음과 같이 수행된다:

2.5 x 10⁵ 세포 PBMC(스톡 100μl)

0.5 x 10⁵ 동종 세포(스톡 100μl), 사용 시

0.5 x 10⁵ 동종 세포(스톡 100μl). 이들 세포는 미토마이신 C로 비활성화될 것이다.

6x 스톡의 양성 대조군 50μl(항-CD28/CD3)

96-웰 평평 바닥에서 총 부피 300μl - 96-웰의 총 부피는 360μl이다.

4일 동안 인큐베이션한다

루미넥스로 사이토카인 분석을 위해 100μl를 제거한다

CyTOF는 나머지 200μl 상에서 수행된다.

사이토카인 프로파일링을 위한 상등액은 1일 후에 제거된다.

CyTOF는, 예를 들어 Bendall 등 (Science, Vol. 332, 6 May 2011) 및 Bendall and Nolan (Nature Biotechnology, Vol. 30 No. 7, July 2012)에 이미 기술되어 있으며, 이 둘 다는 본 명세서에 그 전체가 참고로 포함된다. CyTOF 염색에 이용된 인간 마커는 아래 표 6에 나타나 있다.

[표 6]

루미넥스 다중 검정

루미넥스 xMAP 기술(이전 LabMAP, FlowMetrix)은 적색 및 근적외선 형광단의 뚜렷한 비율로 염색된 폴리스티렌 비드(미세구)를 분류할 수 있는 디지털 신호 처리를 사용한다. 이들 비율은 각 비드 모집단에 대한 '스펙트럼 주소'를 정의한다. 결과적으로, 매우 작은 샘플 부피에서 다양한 비드 모집단에 대해 최대 100가지 다른 검출 반응을 동시적으로 수행할 수 있다(Earley 등 Report from a Workshop on Multianalyte Microsphere Arrays. Cytometry 2002;50:239-242; Oliver 등 Clin Chem 1998;44(9):2057-2060; Eishal and McCoy, Methods 38(4): 317-323, April 2006, 이들 모두는 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함됨).

루미넥스 다중 검정은 상업적으로 이용 가능하고, 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함된, 월드 와이드 웹 thermofisher.com/us/en/home/life-science/protein-biology/protein-assays-analysis/luminex-multiplex-assays.html 상에 기술되어 있다. 세포의 미토마이신 C 준비

미토마이신 C는 400μl의 DMSO(500x 스톡 = 5mg/ml)를 사용하여 건조 분말(바이알당 2mg)로부터 제조되고, 완전히 용해되고 25ul 부피로 분취되고, -80C에서 저장된다. 1 분취량 20μl를 10ml 가온된 C5에 사용하여 10μg/ml 최종 작업 용액을 생성한다. 용액은 필터 멸균된다.

용액은 재현탁된 세포 또는 플라스크에서 부착 세포에 대해 사용할 수 있다.

세포를 암실에서 37C에서 30분 동안 인큐베이션한 다음 따뜻한 C5에서 3회 세정한다. 세포를 1ml X-VIVO에 재현탁한다. 40ul는 접시 상에서 200ul로 계수된다. 세포를 X-VIVO(무혈청 배지, Lonza)에서 1x10⁶/ml의 최종 농도로 재현탁한다.

실시예 2.

기재된 발명은 단일 세포 플랫폼으로 다중 면역조절제를 표적화함으로써, 예를 들어 암 치료에서 면역학적 균형을 회복하기 위한 접근법을 제공한다. 이 접근 방식은 여러 시그널의 동시 조절을 가능하게 하고, 면역학적 균형을 복원하기 위한 전통적인 접근 방식이 제한되어 있는 중요한 특징인, 공간적으로 제한된 작용 부위를 제공한다.

개시된 발명의 일 양태에 따르면, 암을 치료하기 위한 종양 세포 백신으로서 사용하기 위해 5개 이상의 재조합 펩티드를 발현하는 종양 세포주 변이체가 생성될 수 있다. 예를 들어, 종양 세포주는 변형을 위해 선택될 수 있고, 재조합 면역 조절제 서열의 렌티바이러스 형질감염은 면역조절제를 세포 게놈 내에 안정적으로 통합하기 위해 사용될 수 있다. 아래 실시예 3은 면역조절제를 세포 게놈 내에 안정적으로 통합하는 데 사용될 수 있는 7개 렌티바이러스 벡터(벡터 1, 벡터 2, 벡터 3, 벡터 4, 벡터 5, 벡터 6 및 벡터 7)를 기술한다.

일부 실시형태에 따르면, 2개의 재조합 면역조절제 단백질을 동시적으로 형질감염시키고, 이어서 2개 이상의 재조합 면역조절제 단백질을 동시적으로 형질감염시키고, 이어서 단일 재조합 면역조절제 단백질을 형질감염시켜 종양 세포 백신으로 사용하기 위한 총 5개의 재조합 펩티드를 달성할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 2개의 재조합 펩티드를 동시적으로 형질감염시키고, 이어서 단일 재조합 펩티드를 형질감염시키고, 이어서 단일 재조합 펩티드를 형질감염시키고, 이어서 단일 재조합 펩티드를 형질감염시켜 종양 세포 백신으로 사용하기 위한 총 5개의 재조합 펩티드를 달성할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 단일 재조합 펩티드를 형질감염시키고, 이어서 2개의 재조합 펩티드를 동시적으로 형질감염시키고, 이어서 2개의 재조합 펩티드를 동시적으로 형질감염시켜 종양 세포 백신으로 사용하기 위한 총 5개의 재조합 펩티드를 달성한다.

하기 실시예 3은 면역조절제를 세포 게놈 내에 안정적으로 통합하는데 사용될 수 있는 렌티바이러스 벡터(벡터 44, 벡터 97, 벡터 84, 벡터 29, 벡터 107, 벡터 116, 벡터 86, 벡터 18, 벡터 17, 벡터 98, 벡터 5, 벡터 30, 벡터 109, 벡터 3, 벡터 4, 벡터 106, 벡터 16, 벡터 83, 벡터 31, 벡터 12, 벡터 99, 벡터 121, 벡터 105, 벡터 32, 벡터 37, 벡터 22, 벡터 19, 벡터 20, 벡터 89, 벡터 21, 벡터 23, 벡터 108, 벡터 15, 벡터 124, 벡터 65, 벡터 64, 벡터 88, 벡터 96, 벡터 14, 벡터 119, 벡터 120, 벡터 45, 벡터 60, 벡터 59, 벡터 8, 벡터 128, 벡터 35, 및 벡터 6)를 기술한다.

일 실시형태에 따르면, 벡터 44는 하나 이상의 TNF 패밀리 구성원 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 29는 하나 이상의 TNF 패밀리 구성원 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 18은 하나 이상의 TNF 패밀리 구성원 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 17은 하나 이상의 TNF 패밀리 구성원 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 5는 하나 이상의 TNF 패밀리 구성원 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 16은 하나 이상의 TNF 패밀리 구성원 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 99는 하나 이상의 TNF 패밀리 구성원 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 15는 하나 이상의 TNF 패밀리 구성원 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 14는 하나 이상의 TNF 패밀리 구성원 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 45는 하나 이상의 TNF 패밀리 구성원 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 6은 하나 이상의 TNF 패밀리 구성원 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 하나 이상의 TNF 패밀리 면역조절제는 표 2 또는 표 3에 열거된 것들로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 벡터 44는 3-14개 TNF 패밀리 구성원 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 29는 3-14개 TNF 패밀리 구성원 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 18은 3-14개 TNF 패밀리 구성원 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 17은 3-14개 TNF 패밀리 구성원 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 5는 3-14개 TNF 패밀리 구성원 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 16은 3-14개 TNF 패밀리 구성원 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 99는 3-14개 TNF 패밀리 구성원 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 15는 3-14개 TNF 패밀리 구성원 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 14는 3-14개 TNF 패밀리 구성원 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 45는 3-14개 TNF 패밀리 구성원 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 6은 3-14개 TNF 패밀리 구성원 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 3-14개 TNF 패밀리 면역조절제는 표 2 또는 표 3에 열거된 것들로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 벡터 97은 하나 이상의 Ig 패밀리 구성원 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 84는 하나 이상의 Ig 패밀리 구성원 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 107은 하나 이상의 Ig 패밀리 구성원 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 98은 하나 이상의 Ig 패밀리 구성원 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 30은 하나 이상의 Ig 패밀리 구성원 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 83은 하나 이상의 Ig 패밀리 구성원 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 121은 하나 이상의 Ig 패밀리 구성원 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 119는 하나 이상의 Ig 패밀리 구성원 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 하나 이상의 Ig 패밀리 구성원 면역조절제는 표 2 또는 표 3에 열거된 것들로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 벡터 97은 3-14개 Ig 패밀리 구성원 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 84는 3-14개 Ig 패밀리 구성원 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 107은 3-14개 Ig 패밀리 구성원 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 98은 3-14개 Ig 패밀리 구성원 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 30은 3-14개 Ig 패밀리 구성원 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 83은 3-14개 Ig 패밀리 구성원 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 121은 3-14개 Ig 패밀리 구성원 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 119는 3-14개 Ig 패밀리 구성원 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 3-14개 Ig 패밀리 구성원 면역조절제는 표 2 또는 표 3에 열거된 것들로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 벡터 116은 하나 이상의 케모카인 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 하나 이상의 케모카인 면역조절제는 표 2 또는 표 3에 열거된 것들로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 벡터 116은 3-14개 케모카인 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 3-14개 케모카인 면역조절제는 표 2 또는 표 3에 열거된 것들로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 벡터 109는 하나 이상의 성장 인자 면역조절제를 포함한다.

일 실시형태에 따르면, 벡터 109는 3-14개 성장 인자 면역조절제를 포함한다.

일 실시형태에 따르면, 벡터 3은 하나 이상의 사이토카인 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 4는 하나 이상의 사이토카인 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 32는 하나 이상의 사이토카인 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 22는 하나 이상의 사이토카인 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 19는 하나 이상의 사이토카인 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 20은 하나 이상의 사이토카인 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 89는 하나 이상의 사이토카인 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 21은 하나 이상의 사이토카인 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 23은 하나 이상의 사이토카인 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 121은 하나 이상의 사이토카인 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 65는 하나 이상의 사이토카인 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 64는 하나 이상의 사이토카인 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 88은 하나 이상의 사이토카인 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 96은 하나 이상의 사이토카인 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 60은 하나 이상의 사이토카인 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 59는 하나 이상의 사이토카인 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 128은 하나 이상의 사이토카인 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 하나 이상의 사이토카인 면역조절제는 표 2 또는 표 3에 열거된 것들로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 벡터 3은 3-14개 사이토카인 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 4는 3-14개 사이토카인 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 32는 3-14개 사이토카인 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 22는 3-14개 사이토카인 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 19는 3-14개 사이토카인 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 20은 3-14개 사이토카인 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 89는 3-14개 사이토카인 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 21은 3-14개 사이토카인 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 23은 3-14개 사이토카인 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 121은 3-14개 사이토카인 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 65는 3-14개 사이토카인 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 64는 3-14개 사이토카인 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 88은 3-14개 사이토카인 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 96은 3-14개 사이토카인 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 60은 3-14개 사이토카인 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 59는 3-14개 사이토카인 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 128은 3-14개 사이토카인 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 3-14개 사이토카인 면역조절제는 표 2 또는 표 3에 열거된 것들로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 벡터 37은 하나 이상의 수용체 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 124는 하나 이상의 수용체 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 88은 하나 이상의 수용체 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 8은 하나 이상의 수용체 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 하나 이상의 수용체 면역조절제는 표 2 또는 표 3에 열거된 것들로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 벡터 37은 3-14개 수용체 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 124는 3-14개 수용체 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 88은 3-14개 수용체 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 8은 3-14개 수용체 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 3-14개 수용체 면역조절제는 표 2 또는 표 3에 열거된 것들로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 벡터 86은 하나 이상의 다른 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 106은 하나 이상의 다른 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 107은 하나 이상의 다른 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 31은 하나 이상의 다른 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 12는 하나 이상의 다른 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 105는 하나 이상의 다른 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 108은 하나 이상의 다른 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 120은 하나 이상의 다른 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 35는 하나 이상의 다른 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 하나 이상의 다른 면역조절제는 표 2 또는 표 3에 열거된 것들로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 벡터 86은 3-25개 다른 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 106은 3-25개 다른 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 107은 3-25개 다른 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 31은 3-25개 다른 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 12는 3-25개 다른 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 105는 3-25개 다른 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 108은 3-25개 다른 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 120은 3-25개 다른 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 벡터 35는 3-25개 다른 면역조절제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 3-25개 다른 면역조절제는 표 2 또는 표 3에 열거된 것들로부터 선택된다.

개시된 발명의 일 실시형태에 따르면, 각각이 단일 면역조절 단백질을 발현하는 동종 세포 풀의 조합을 사용하여 다중 면역조절 단백질을 발현하는 단일 세포가 할 수 있는 것(예를 들어, 부가성, 상승작용, 간섭)을 모델링한다.

개시된 발명의 일 양태에 따르면, 1, 2, 3, 4 또는 5개 초과의 재조합 펩티드를 발현하는 종양 세포주 변이체는 피부암을 치료하기 위한 종양 세포 백신으로서 사용하기 위해 생성될 수 있다. 예를 들어, SK-MEL2 인간 흑색종 세포주(ATCC HTB-68)가 변형을 위해 선택될 수 있고, 재조합 면역 조절제 서열의 렌티바이러스 형질감염이 면역조절제를 세포 게놈으로 안정적으로 통합하기 위해 사용될 수 있다.

개시된 발명의 일 양태에 따르면, 1, 2, 3, 4 또는 5개 초과의 재조합 펩티드를 발현하는 종양 세포주 변이체는 전립선암을 치료하기 위한 종양 세포 백신으로서 사용하기 위해 생성될 수 있다. 예를 들어, DU-145 인간 전립선 암종 세포주는 변형을 위해 선택될 수 있고, 재조합 면역 조절제 서열의 렌티바이러스 형질감염은 면역조절제를 세포 게놈으로 안정적으로 통합하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 2개의 재조합 면역조절 단백질을 동시에 형질감염시킨 후, 동시에 2개 이상의 재조합 면역조절 단백질을 형질감염시킨 후, 단일 재조합 면역조절 단백질을 형질감염시켜 종양 세포 백신으로 사용하기 위한 총 5개의 재조합 펩티드를 달성할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 2개의 재조합 펩티드를 동시에 형질감염시킨 후, 단일 재조합 펩티드를 형질감염시킨 후, 단일 재조합 펩티드를 형질감염시키고, 이어서 단일 재조합 펩티드를 형질감염시켜 종양 세포 백신으로 사용하기 위한 총 5개의 재조합 펩티드를 달성할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 단일 재조합 펩티드를 형질감염시킨 후, 동시에 2개의 재조합 펩티드를 형질감염시킨 후, 동시에 2개의 재조합 펩티드를 형질감염시켜 종양 세포 백신으로 사용하기 위한 총 5개의 재조합 펩티드를 달성한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 전립선암을 치료하기 위한 종양 세포 백신으로서 사용하기 위해 하나 이상의 재조합 펩티드를 발현하는 2개 이상의 종양 세포주 변이체가 생성될 수 있다. 예를 들어, DU-145 및 PC-3 인간 전립선 암종 세포주는 변형을 위해 선택될 수 있고, 재조합 면역 조절제 서열의 렌티바이러스 형질감염은 면역조절제를 세포 게놈에 안정적으로 통합하는 데 사용될 수 있다.

CD40L 면역조절제

CD40L 면역 조절제 cDNA 서열은 퓨로마이신 선별 마커를 갖는 CMV 프로모터에 의해 구동되는 렌티바이러스 전달 플라스미드 작제물 pLenti-puro(Addgene 카탈로그 번호 39481) 내로 클로닝될 수 있다. CD40L 면역 조절제 cDNA 서열은 절단 불가능하도록 조작될 수 있으며, 이는 궁극적으로 번역된 CD40L 단백질을 막 결합 상태(예를 들어, 서열번호: 7)로 유지한다. 인간 인플루엔자 헤마글루티닌 태그(HA 태그)는 또한 CD40L 서열의 세포외 부분에 클로닝될 수 있다. 번역된 HA 태그는 펩티드 서열 YPYDVPDYA(서열번호: 28)를 갖는다. 패키징 플라스미드 psPAX2(AddGene 카탈로그 번호 12260) 및 엔벨로프 플라스미드 pLTR-RD114A(AddGene 카탈로그 번호 17576)도 렌티바이러스 시스템용으로 선택할 수 있다.

각각의 렌티바이러스 전달 플라스미드, 패키징 플라스미드 및 엔벨로프 플라스미드는 Lipofectamine 2000(ThermoFisher 카탈로그 번호 11668027)을 사용하여 대수기 성장 293T 세포로 형질감염될 수 있다. 간략하게, 세포는 70% 내지 90% 합류점에서 시드된다. 형질감염 당일에 Lipofectamine 시약 12μl를 무혈청 세포 배지 150 μl에 희석한다. 형질감염을 위한 5 μg의 DNA도 150 μl의 무혈청 배지에 희석한다. 그런 다음 희석된 DNA를 희석된 Lipofectamine에 첨가하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션한다. 혼합물의 전체 부피는 소용돌이치면서 시드된 293T 세포의 배지에 적가한다. 그런 다음 세포를 37도에서 1~3일 동안 인큐베이션한다.

바이러스 입자를 포함하는 293T 세포 배양 배지를 매 8~12시간마다 3회 수거하고 원심분리하여 분리된 세포 및 잔해를 펠릿화한다. 바이러스 입자를 함유하는 배양 배지는 DU-145 세포주를 감염시키기 위해 직접 사용한다.

DU-145 세포주는 10% 소태아 혈청을 포함하는 이글 최소필수배지(EMEM)에서 약 70% 컨플루언시까지 배양한다. 그런 다음 헥사디메트린 브로마이드(Sigma-Aldrich 카탈로그 번호 H9268)를 바이러스 입자가 함유된 배지와 결합하여 8 μg/mL 헥사디메트린 브로마이드의 최종 농도를 만든다. DU-145 세포의 배양 배지를 흡인하고 바이러스 입자 및 8 μg/mL 헥사디메트린 브로마이드를 함유하는 배지로 교체한다. DU-145 세포는 배지 교체 후 18~20시간 동안 배양한다.

감염된 DU-145 세포는 약 1주일 후에 세포 사멸이 시작될 때까지 1 μg/mL 퓨로마이신(ThermoFisher 카탈로그 번호 A1113802)을 함유하는 배지에서 성장한다. 형질감염된 세포의 다수의 생존 콜로니를 확장을 위해 선택하고 웨스턴 블롯에 의해 CD40L 발현에 대해 테스트하였다. 웨스턴 블롯은 마우스 단일클론 항-HA 일차 항체(Abcam 카탈로그 번호 ab18181) 및 염소 항-마우스 HRP(Abcam 카탈로그 번호 ab205719) 이차 항체로 프로브되어 각 클론주에서 발현된 재조합 CD40L의 상대적인 양을 정량화한다. 가장 안정적으로 발현되는 DU-145 세포주는 DU145-Gen1로 표시되고 추가 조작을 위해 선택된다.

TNF-알파/GM-CSF

CD40L을 발현하도록 형질감염된 DU145-Gen1 세포는 TNF-알파 및 GM-CSF 서열을 포함하는 바이-시스트론 렌티바이러스 벡터로 추가로 형질감염된다. 각각의 TNF-알파 cDNA 및 GM-CSF cDNA는 먼저 인간 신장 인자 1 알파(EF1α) 프로모터의 제어 하에 pEF1α-IRES 바이시스트론 포유류 발현 벡터(Clontech 카탈로그 번호 631970)에 클로닝된다. 번역된 단백질이 막 결합 형태로 남아 있도록 TACE에 의해 절단될 수 없는 TNF-알파의 변이체가 사용된다. TNF-알파 서열은 번역된 단백질의 용이한 검출을 위해 TNF-알파의 세포외 영역에 FLAG 태그 서열과 함께 제공된다. FLAG 태그 펩티드 서열은 DYKDDDDK(서열번호: 29)이다. 가용성 GM-CSF를 형성할 수 있는 GM-CSF 서열이 사용된다. 그런 다음 pEF1 프로모터, TNF-알파 서열, IRES 서열 및 GM-CSF 서열 전체를 pLenti-puro(Addgene 카탈로그 번호 39481) 렌티바이러스 벡터에 클로닝한다(벡터의 원래 CMV 프로모터는 이 과정에서 제거됨). 패키징 플라스미드 psPAX2(AddGene 카탈로그 번호 12260) 및 엔벨로프 플라스미드 pLTR-RD114A(AddGene 카탈로그 번호 17576)도 선택한다.

각각의 렌티바이러스 전달 플라스미드, 패키징 플라스미드 및 엔벨로프 플라스미드는 Lipofectamine 2000(ThermoFisher 카탈로그 번호 11668027)을 사용하여 대수기 성장 293T 세포로 형질감염된다. 간략하게, 세포는 70% 내지 90% 컨플루언시에서 시드된다. 형질감염 당일에 Lipofectamine 시약 12 μl를 무혈청 세포 배지 150μl에 희석한다. 형질감염을 위한 5 μg의 DNA도 150 μl의 무혈청 배지에 희석한다. 그런 다음 희석된 DNA를 희석된 Lipofectamine에 첨가하고 실온에서 5분 동안 배양한다. 혼합물의 전체 부피는 소용돌이치면서 시드된 293T 세포의 배지에 적가한다. 그런 다음 세포를 37도에서 1~3일 동안 인큐베이션한다.

바이러스 입자를 포함하는 293T 세포 배양 배지를 매 8~12시간마다 3회 수거하고 원심분리하여 분리된 세포 및 잔해를 펠릿화한다. 바이러스 입자를 함유하는 배양 배지는 DU145-Gen1 세포주를 감염시키기 위해 직접 사용한다.

DU145-Gen1 세포주는 약 70%의 컨플루언시까지 배양한다. 그런 다음 헥사디메트린 브로마이드(Sigma-Aldrich 카탈로그 번호 H9268)를 바이러스 입자가 함유된 배지와 결합하여 8 μg/mL 헥사디메트린 브로마이드의 최종 농도를 만든다. DU145-Gen1 세포의 배양 배지를 흡인하고 바이러스 입자 및 8 μg/mL 헥사디메트린 브로마이드를 함유하는 배지로 교체한다. DU145-Gen1 세포는 배지 교체 후 18~20시간 동안 배양한다.

형질도입된 DU145-Gen1 세포는 재조합 면역조절제를 안정적으로 발현하는 클론에 대해 선택된다. 선별 과정은 TNF-알파의 FLAG 태그를 사용하여 형광 활성화 세포 분류에 의해 수행되어 면역 조절제를 통합한 세포를 식별한다. 살아있는 세포는 차단 완충액이 있는 PBS에서 마우스 단일클론 항-FLAG 항체(Sigma Aldrich F3040) 및 토끼 항-마우스 FITC 접합된 이차 항체(Sigma Aldrich ASB3701170)로 프로브한다. 가장 많이 발현되는 세포는 추가 처리를 위해 분류, 분리 및 배양된다. FLAG 태그의 존재를 기준으로 분류한 후, 가용성 GM-CSF의 발현을 웨스턴 블롯으로 확인한다. 분류된 배양 세포의 농축 배지는 SDS-PAGE에 의해 분해되고 마우스 항-GM-CSF 항체(ThermoFisher 카탈로그 번호 3092) 및 염소 항-마우스 HRP 접합된 이차 항체로 웨스턴 블롯에 의해 프로브한다. 세포 용해물은 또한 SDS-PAGE에 의해 분해될 수 있고 TNF의 존재를 확인하기 위해 FLAG 태그에 대해 프로브될 수 있다. 높은 수준의 재조합 GM-CSF 및 TNF-알파를 발현하는 세포 배양물은 DU145-Gen2로 지정하고 추가 처리를 위해 선택한다.

Flt-3L

CD40L, GM-CSF, 및 TNF를 발현하도록 형질감염된 DU145-Gen2 세포는 Flt-3L 면역 조절제 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터로 추가로 형질감염된다. Flt-3L cDNA는 통합 및 발현을 위한 마커로 사용되는 GFP 단백질 서열과 함께 pEF1α-IRES 바이시스트론 포유류 발현 벡터(Clontech 카탈로그 번호 631970)에 클로닝한다. Flt-3L의 서열은 막 결합 펩티드로 번역되는 반면, GFP는 세포질에 남아 있다. 그런 다음 pEF1 프로모터, Flt-3L 서열, IRES 서열 및 GFP 서열 전체를 pLenti-puro(Addgene 카탈로그 번호 39481) 렌티바이러스 벡터에 클로닝한다(벡터의 원래 CMV 프로모터는 이 과정에서 제거됨). 패키징 플라스미드 psPAX2(AddGene 카탈로그 번호 12260) 및 엔벨로프 플라스미드 pLTR-RD114A(AddGene 카탈로그 번호 17576)도 선택한다.

각각의 렌티바이러스 전달 플라스미드, 패키징 플라스미드 및 엔벨로프 플라스미드는 Lipofectamine 2000(ThermoFisher 카탈로그 번호 11668027)을 사용하여 대수기 성장 293T 세포로 형질감염된다. 간략하게, 세포는 70% 내지 90% 컨플루언시에서 시드한다. 형질감염 당일에 Lipofectamine 시약 12 μl를 무혈청 세포 배지 150 μl에 희석한다. 형질감염을 위한 5 μg의 DNA도 150 μl의 무혈청 배지에 희석한다. 그런 다음 희석된 DNA를 희석된 Lipofectamine에 첨가하고 실온에서 5분 동안 인큐베이션한다. 혼합물의 전체 부피는 소용돌이치면서 시드된 293T 세포의 배지에 적가한다. 그런 다음 세포를 37도에서 1~3일 동안 인큐베이션한다.

바이러스 입자를 포함하는 293T 세포 배양 배지를 매 8~12시간마다 3회 수거하고 원심분리하여 탈착된 세포 및 잔해를 펠릿화한다. 바이러스 입자를 함유하는 배양 배지는 DU145-Gen2 세포주를 감염시키기 위해 직접 사용한다.

DU145-Gen2 세포주는 약 70%의 컨플루언시로 배양된다. 그런 다음 헥사디메트린 브로마이드(Sigma-Aldrich 카탈로그 번호 H9268)를 바이러스 입자가 함유된 배지와 결합하여 8 μg/mL 헥사디메트린 브로마이드의 최종 농도를 만든다. DU145-Gen2 세포의 배양 배지를 흡인하고 바이러스 입자 및 8 μg/mL 헥사디메트린 브로마이드를 함유하는 배지로 교체한다. DU145-Gen2 세포는 배지 교체 후 18~20시간 동안 배양한다.

이어서 GFP 마커를 사용하여 Flt-3L 서열을 안정적으로 발현하는 세포에 대해 DU145-Gen2 세포를 선택한다. 선택 과정은 면역 조절제를 통합한 세포를 식별하기 위해 GFP 마커를 사용하는 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의해 수행한다. 가장 많이 발현되는 세포는 추가 처리를 위해 분류, 분리 및 배양한다. GFP 마커의 존재를 기준으로 분류한 후, Flt-3L의 발현을 웨스턴 블롯으로 확인한다. 배양된 세포 용해물은 SDS-PAGE에 의해 분해되고 토끼 다클론 항-Flt-3L 항체(AbCam Cat. No. ab9688) 및 염소 항-토끼 HRP 접합된 이차 항체(AbCam 카탈로그 번호 ab205718)로 웨스턴 블롯에 의해 프로브한다. 높은 수준의 재조합 Flt-3L을 발현하는 세포 배양물은 DU145-Gen3으로 지정되며 추가 처리를 위해 선택한다.

IgG 중쇄

CD40L, GM-CSF, TNF-알파 및 Flt-3L을 발현하도록 형질감염된 DU145-Gen3 세포는 막 결합된 IgG1 중쇄 단편인 IgG 1(서열번호: 1)을 포함하는 렌티바이러스 벡터로 추가로 형질감염된다. IgG1 중쇄 cDNA는 통합 및 발현용 마커로 사용되는 RFP 단백질 서열과 함께 pEF1α-IRES 바이시스트론 포유류 발현 벡터(Clontech 카탈로그 번호 631970)에 클로닝된다. IgG1 중쇄의 서열은 막 결합 펩티드로 번역되는 반면 RFP는 세포질에 남아 있다. 그런 다음 pEF1 프로모터, IgG1 중쇄 서열, IRES 서열 및 RFP 서열 전체를 pLenti-puro(Addgene 카탈로그 번호 39481) 렌티바이러스 벡터에 클로닝한다(벡터의 원래 CMV 프로모터는 이 과정에서 제거됨). 패키징 플라스미드 psPAX2(AddGene 카탈로그 번호 12260) 및 엔벨로프 플라스미드 pLTR-RD114A(AddGene 카탈로그 번호 17576)도 선택한다.

각각의 렌티바이러스 전달 플라스미드, 패키징 플라스미드 및 엔벨로프 플라스미드는 Lipofectamine 2000(ThermoFisher 카탈로그 번호 11668027)을 사용하여 대수기 성장 293T 세포로 형질감염된다. 간략하게, 세포는 70% 내지 90% 컨플루언시에서 시드된다. 형질감염 당일에 Lipofectamine 시약 12 μl를 무혈청 세포 배지 150 μl에 희석한다. 형질감염을 위한 5 μg의 DNA도 150 μl의 무혈청 배지에 희석한다. 그런 다음 희석된 DNA를 희석된 Lipofectamine에 첨가하고 실온에서 5분 동안 인큐베이션한다. 혼합물의 전체 부피는 소용돌이치면서 시드된 293T 세포의 배지에 적가한다. 그런 다음 세포를 37도에서 1~3일 동안 인큐베이션한다.

바이러스 입자를 포함하는 293T 세포 배양 배지를 매 8~12시간마다 3회 수거하고 원심분리하여 탈착된 세포 및 파편을 펠릿화한다. 바이러스 입자를 함유하는 배양 배지는 DU145-Gen3 세포주를 감염시키기 위해 직접 사용한다.

DU145-Gen3 세포주는 약 70%의 컨플루언시로 배양한다. 그런 다음 헥사디메트린 브로마이드(Sigma-Aldrich 카탈로그 번호 H9268)를 바이러스 입자가 포함된 배지와 결합하여 8 μg/mL 헥사디메트린 브로마이드의 최종 농도를 만든다. DU145-Gen2 세포의 배양 배지를 흡인하고 바이러스 입자 및 8 μg/mL 헥사디메트린 브로마이드를 포함하는 배지로 교체한다. DU145-Gen3 세포는 배지 교체 후 18~20시간 동안 배양한다.

이어서 RFP 마커를 사용하여 IgG1 중쇄 서열을 안정적으로 발현하는 세포에 대해 DU145-Gen3 세포를 선택한다. 선택 과정은 RFP 마커를 사용하여 면역 조절제를 통합한 세포를 식별하는 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의해 수행한다. 가장 많이 발현되는 세포는 추가 처리를 위해 분류, 분리 및 배양한다. RFP 마커의 존재를 기준으로 분류한 후, 웨스턴 블롯으로 IgG1 중쇄의 발현을 확인한다. 높은 수준의 재조합 IgG1 중쇄를 발현하는 세포 배양물은 DU145-Gen4로 지정되며 추가 처리를 위해 선택한다.

CD40L, GM-CSF, TNF, Flt-3L 및 IgG1 중쇄를 발현하도록 형질감염된 DU145-Gen4 종양 세포주는 RT-PCR, 면역형광 및 웨스턴 블롯팅으로 특성화되어, 모든 재조합 면역조절제가 세포에 의해 발현되고, 올바른 위치(예를 들어, 세포막 상)에 있음을 확인한다.

인간 혼합된 림프구 종양 반응(MLTR) 시험

DU145-Gen4 세포는 변형된 세포 및 변형되지 않은 DU145 세포의 각각의 다른 세대(즉, DU145-Gen2 및 DU145-Gen3)에 대한 일차 및 이차 MLTR 검정에 의해 그 면역조절 가능성에 대해 시험된다.

말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 건강한 사람과 전립선암 환자의 말초혈액에서 얻어지며, 혈액세포는 Ficoll-Paque 기울기를 사용하여 분리된다. 항응고제-처리된 혈액을 PBS/EDTA로 1:2 내지 1:4 범위로 희석하여 적혈구의 응집을 감소시킨다. 그런 다음 희석된 혈액은 혼합 없이 원심분리 튜브에서 Ficoll-Paque 용액 위에 층상화된다. 층상화된 혈액/Ficoll-Paque는 원심분리기 브레이크를 사용하지 않고 18 내지 20℃ 사이에서 400 x g에서 40분 동안 원심분리되어, 혈액 분획의 형성을 초래한다. 단핵 세포를 포함하는 분획은 추가 처리를 위해 선택된다.

형질감염된 종양 세포주 변이체 및 모 종양 세포주 DU-145(대조군)로부터의 각각의 세포는 표준 조직 배양 조건 하에서 최대 7일 동안 PBMC와 공동-배양된 다음, 면역 세포 증식, 유세포분석 및 CyTOF에 의해 측정된 면역 세포 분화, 사이토카인 방출 프로파일 및 LDH 방출 검정에 의해 측정된 세포독성에 대한 평가가 따랐다.

실시예 3.

본 명세서에 사용된 벡터는 아래에 자세히 기술되어 있다:

벡터 1. 면역조절제: scFv-항-비오틴-G3힌지-mIgG1(표면 IgG 생성용)

면역조절제 scFv-항-비오틴-G3힌지-mIgG1에 대해 사용된 벡터 1의 조직화의 개략도는 도 2에 도시되어 있다. 아래의 표 7은 벡터 성분 명칭, 서열번호: 47에서의 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 7]

벡터 1이 이용되는 경우, 항-IgG가 유동 검출에 사용된다. 비오틴 + 형광 표지된 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)는 2차 검출 방법으로 사용된다.

다음은 면역조절제 scFv-항-비오틴-G3힌지-IgG1-Tm의 설명이다.

유형: 면역글로불린

주석:

· H7 중쇄 리더

· 항-비오틴 가변 중쇄(VH)는 비오틴 표지된 CpG를 장입하는 것을 허용함

· 도메인-간 이황화 연결 VH44 (G->C) 및 VL100 (G->C)

· FcyR 상호작용을 증진시키는 IgG3 힌지

· 연결은 표준임

· FcyR/FcRn과의 상호작용 및 막 고착에 사용된 IgG1 (CH2-CH3-Tm-Cyt)

· FcRn 및 FcyR 상호작용을 증진시키는 T233A 돌연변이

서열은 아래와 같이 나타낸다:

H7 중쇄 리더(서열번호: 54)

MEFGLSWVFLVALFRGVQC

도메인-간 연결을 위해 삽입된 Cys를 갖는 항-비오틴 뮤라인 vH(서열번호: 55)

QVKLQESGPG LVAPSQSLSI TCTVSGFSLT AYGVDWVRQP PGK C LEWLGV

IWGGGRTNYN SGLMSRLSIR KDNSKSQVFL TMNSLQTDDT AKYYCVKHTN

WDGGFAYWGQ GTTVTVSS

링커(서열번호: 56)

GGGGSGGGGS GGGGS

경쇄 가변(인간 람다 가변) (서열번호: 57)

GSPGQSVSIS CSGSSSNIGN NYVYWYQHLP GTAPKLLIYS DTKRPSGVPD

RISGSKSGTS ASLAISGLQS EDEADYYCAS WDDSLDGPVF G C GTKLTVL

FcyR에 대한 접근성 향상을 위한 IgG3 힌지(서열번호: 58)

LKTPLGDTTHTCPR CPEPKSCDTP PPCPRCPEPK SCDTPPPCPR

CPEPKSCDTP PPCPRCP

IgG1 CH2, CH3 Tm 및 세포질 꼬리(T256A)(서열번호: 59)

LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SR A PEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE

VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE

KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES

NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH

NHYTQKSLSL SPELQLEESC AEAQDGELDG LWTTITIFIT LFLLSVCYSA

TVTFFKVKWI FSSVVDLKQT IIPDYRNMIG QGA*

scFv-항-비오틴-G3힌지-IgG1-Tm(598 ORF1)(서열번호: 60)

MEFGLSWVFLVALFRGVQCQVKLQESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTA

YGVDWVRQPPGKCLEWLGVIWGGGRTNYNSGLMSRLSIRKDNSKSQVFLT

MNSLQTDDTAKYYCVKHTNWDGGFAYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGG

GSGSPGQSVSISCSGSSSNIGNNYVYWYQHLPGTAPKLLIYSDTKRPSGV

PDRISGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCASWDDSLDGPVFGCGTKLTV

LLKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPK

SCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRAPEVTCVVVDVSH

EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKE

YKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCL

VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ

QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPELQLEESCAEAQDGELDGLWTTI

TIFITLFLLSVCYSATVTFFKVKWIFSSVVDLKQTIIPDYRNMIGQGA*

벡터 2. 면역조절제: 전체 항-비오틴-G3힌지-mIgG1(중쇄/ires/경쇄 사용)

면역조절제 전체 항-비오틴 - G3힌지-mIgG1에 대해 사용된 벡터 2의 조직화의 개략도가 도 3에 도시되어 있다. 벡터 2는 비시스트론이다. 하기 표 8은 벡터 성분 명칭, 서열번호 48에서 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 8]

벡터 2가 이용되는 경우, 항-IgG가 유동 검출에 사용된다. 비오틴 + 형광 표지된 ODN는 2차 검출 방법으로 사용된다.

다음은 면역조절제 전체 항-비오틴 ― G3힌지-mIgG1(중쇄/ires/경쇄 사용)의 설명이다.

유형:

막 고착된 면역글로불린

주석:

· H7 중쇄 리더

· FcyR 상호작용을 증진시키는 IgG3 힌지

· FcRn 및 FcyR 상호작용을 증진시키는 T233A 돌연변이

· 항-비오틴 가변 H는 비오틴 표지된 CpG를 장입하는 것을 허용함

· CH1 (일반적)

· LC 가변(인간 람다 가변)

· 람다로부터 LC 불변 영역 1(http://www.uniprot.org/uniprot/P0CG04)

· 도메인간 이황화 연결 VH44 (G->C) 및 VL100 (G->C)(ref)

· 연결은 표준임

· FcyR/FcRn과의 상호작용 및 막 고착에 대한 IgG1(CH2-CH3-Tm-Cyt)

· L1 경쇄 리더(IRES에 대해 변형됨) MATDMRVPAQLLGLLLLWLSGARC(서열번호: 61)

서열은 아래와 같이 나타낸다:

H7 중쇄 리더(서열번호: 54)

MEFGLSWVFLVALFRGVQC

항-비오틴 vH(Murine)(서열번호: 62)

QVKLQESGPG LVAPSQSLSI TCTVSGFSLT AYGVDWVRQP PGKGLEWLGV

IWGGGRTNYN SGLMSRLSIR KDNSKSQVFL TMNSLQTDDT AKYYCVKHTN

WDGGFAYWGQ GTTVTVSS

CH1(일반적)(서열번호: 63)

PSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV

HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVE

FcyR에 대한 접근성 향상을 위한 IgG3 힌지(서열번호: 64)

LKTP LGDTTHTCPR CPEPKSCDTP PPCPRCPEPK SCDTPPPCPR

CPEPKSCDTP PPCPRCP

IgG1 CH2, CH3 Tm 및 세포질 꼬리(T256A)(서열번호: 65)

APELLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRAPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE

VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE

KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES

NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH

NHYTQKSLSL SPELQLEESC AEAQDGELDG LWTTITIFIT LFLLSVCYSA

TVTFFKVKWI FSSVVDLKQT IIPDYRNMIG QGA*

요약(578 ORF2a)(서열번호: 66)

MEFGLSWVFLVALFRGVQCQVKLQESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTA

YGVDWVRQPPGKGLEWLGVIWGGGRTNYNSGLMSRLSIRKDNSKSQVFLT

MNSLQTDDTAKYYCVKHTNWDGGFAYWGQGTTVTVSSPSVFPLAPSSKST

SGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV

VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVELKTPLGDTTHTCPRCPEPK

SCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGP

SVFLFPPKPKDTLMISRAPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK

TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK

AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE

NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ

KSLSLSPELQLEESCAEAQDGELDGLWTTITIFITLFLLSVCYSATVTFF

KVKWIFSSVVDLKQTIIPDYRNMIGQGA*

IRES(서열번호: 67)

L1 시그널(IRES와 호환성이 되도록 변형됨)(서열번호: 61)

MATDMRVPAQLLGLLLLWLSGARC

LC 가변(인간 람다 가변)(서열번호: 69)

GSPGQSVSIS CSGSSSNIGN NYVYWYQHLP GTAPKLLIYS DTKRPSGVPD

RISGSKSGTS ASLAISGLQS EDEADYYCAS WDDSLDGPVF GGGTKLTVL

람다로부터의 LC 불변 영역 1(http://www.uniprot.org/uniprot/P0CG04)(관련없음)(서열번호: 70)

GQPKANPTVT LFPPSSEELQ ANKATLVCLI SDFYPGAVTV AWKADGSPVK

AGVETTKPSK QSNNKYAASS YLSLTPEQWK SHRSYSCQVT HEGSTVEKTV

APTECS*

요약(229 ORF2b)(서열번호: 71)

MATDMRVPAQLLGLLLLWLSGARCGSPGQSVSISCSGSSSNIGNNYVYWY

QHLPGTAPKLLIYSDTKRPSGVPDRISGSKSGTSASLAISGLQSEDEADY

YCASWDDSLDGPVFGGGTKLTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLV

CLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPE

QWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS*

벡터 3. 면역조절제: sGM-CSF/ires/mFLT3L

면역조절제 sGM-CSF/ires/mFLT3L에 대해 사용된 벡터 3의 조직화의 개략도가 도 4에 도시되어 있다. 벡터 3은 비시스트론이다. 하기 표 9는 벡터 성분 명칭, 서열번호 49에서 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 9]

벡터 3이 이용되는 경우, 항-FLT3L이 유동 검출에 사용된다. 가장 높은 표면 FLT3L 발현자는 가장 높은 분비된 GM-CSF 발현을 가질 것이다.

다음은 면역조절제 sGM-CSF/ires/mFLT3L의 설명이다.

유형:

사이토카인, 성장 및 분화 인자

주석:

야생형 서열

서열은 아래와 같이 나타낸다:

GM-CSF 시그널 서열(서열번호: 72)

MWLQSLLLLG TVACSIS

야생형 GM-CSF 서열(서열번호: 73)

APA RSPSPSTQPW EHVNAIQEAR RLLNLSRDTA

AEMNETVEVI SEMFDLQEPT CLQTRLELYK QGLRGSLTKL KGPLTMMASH

YKQHCPPTPE TSCATQIITF ESFKENLKDF LLVIPFDCWE PVQE*

IRES(서열번호: 74)

FLT3L 신호(IRES 친화적으로 변형됨) (서열번호: 75)

M A TVLAPAWSP TTYLLLLLLL SSGLS

FLT3L(서열번호: 76)

GTQDC SFQHSPISSD FAVKIRELSD

YLLQDYPVTV ASNLQDEELC GGLWRLVLAQ RWMERLKTVA GSKMQGLLER

VNTEIHFVTK CAFQPPPSCL RFVQTNISRL LQETSEQLVA LKPWITRQNF

SRCLELQCQP DSSTLPPPWS PRPLEATAPT APQPPLLLLL LLPVGLLLLA

AAWCLHWQRT RRRTPRPGEQ VPPVPSPQDL LLVEH*

요약(144 ORF3a)(서열번호: 77)

MWLQSLLLLGTVACSISAPARSPSPSTQPWEHVNAIQEARRLLNLSRDTA

AEMNETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQE*

요약(236 ORF3b)(서열번호: 78)

MATVLAPAWSPTTYLLLLLLLSSGLSGTQDCSFQHSPISSDFAVKIRELS

DYLLQDYPVTVASNLQDEELCGGLWRLVLAQRWMERLKTVAGSKMQGLLERVNTEIHFVTKCAFQPPPSCLRFVQTNISRLLQETSEQLVALKPWITRQN

FSRCLELQCQPDSSTLPPPWSPRPLEATAPTAPQPPLLLLLLLPVGLLLL

AAAWCLHWQRTRRRTPRPGEQVPPVPSPQDLLLVEH*

벡터 4. 면역조절제: sFLT3L/ires/(FLT3 신호-GM-CSF-Tm)

면역조절제 sFLT3L/ires/(FLT3 신호-GM-CSF-Tm)에 대해 사용된 벡터 4의 조직화의 개략도가 도 5에 도시되어 있다. 벡터 4는 비시스트론이다. 하기 표 10은 벡터 성분 명칭, 서열번호 50에서 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 10]

벡터 4가 이용되는 경우, 항-GM-CSF가 유동 검출에 사용된다. 가장 높은 표면 GMCSF 발현자는 가장 높은 분비된 FLT3L 발현을 가질 것이다.

다음은 면역조절제 sFLT3L/ires/(FLT3 신호-GM-CSF-Tm)의 설명이다.

유형:

사이토카인, 성장 및 분화 인자

주석:

야생형 서열

서열은 아래와 같이 나타낸다:

막횡단이 결실된 야생형 FLT3L 서열(서열번호: 79)

MTVLAPAWSP TTYLLLLLLL SSGLSGTQDC SFQHSPISSD FAVKIRELSD YLLQDYPVTV ASNLQDEELC GGLWRLVLAQ RWMERLKTVA GSKMQGLLERVNTEIHFVTK CAFQPPPSCL RFVQTNISRL LQETSEQLVA LKPWITRQNFSRCLELQCQP DSSTLPPPWS PRPLEATAPT APQ*

IRES(서열번호: 80)

FLT3L 신호(IRES 친화적으로 변형됨)(서열번호: 81)

M A TVLAPAWSP TTYLLLLLLL SSGLS

야생형 GM-CSF 서열(마이너스 천연 신호)(서열번호: 82)

APA RSPSPSTQPW EHVNAIQEAR RLLNLSRDTA

AEMNETVEVI SEMFDLQEPT CLQTRLELYK QGLRGSLTKL KGPLTMMASHYKQHCPPTPE TSCATQIITF ESFKENLKDF LLVIPFDCWE PVQE

CD8알파 막횡단 및 세포질 도메인(서열번호: 83)

PTTTP APRPPTPAPTIASQPLSLRP EACRPAAGGA VHTRGLDFAC DIYIWAPLAG TCGVLLLSLVITLYCNHRNR RRVCKCPRPV VKSGDKPSLS ARYV*

요약(183 ORF4a)(서열번호: 84)

MTVLAPAWSPTTYLLLLLLLSSGLSGTQDCSFQHSPISSDFAVKIRELSD

YLLQDYPVTVASNLQDEELCGGLWRLVLAQRWMERLKTVAGSKMQGLLERVNTEIHFVTKCAFQPPPSCLRFVQTNISRLLQETSEQLVALKPWITRQNF

SRCLELQCQPDSSTLPPPWSPRPLEATAPTAPQ*

CYAGEN에 대한 요약(253 ORF4b)(서열번호: 85)

MATVLAPAWSPTTYLLLLLLLSSGLS APARSPSPSTQPWEHVNAIQEAR

RLLNLSRDTAAEMNETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPFDCWE

PVQEPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD

IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVVKSGDKPSLSARYV*

벡터 5. 면역조절제: mCD40L

면역조절제 mCD40L에 대해 사용된 벡터 5의 조직화의 개략도가 도 6에 도시되어 있다. 벡터 5는 비시스트론이다. 하기 표 11은 벡터 성분 명칭, 서열번호: 51에서 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 11]

벡터 5가 이용되는 경우, 항-CD40L은 유동 검출에 사용된다.

다음은 면역조절제 mCD40L의 설명이다.

유형:

TNF 유형 II 막횡단 단백질

주석:

비-절단성 버전을 만들기 위해 도입된 돌연변이(밑줄침)

서열은 아래와 같이 나타낸다:

절단을 정지시키기 위한 변형된 서열(서열번호: 86)

MIETYNQTSP RSAATGLPIS MKIFMYLLTV FLITQMIGSA LFAVYLHRRL

DKIEDERNLH EDFVFMKTIQ RCNTGERSLS LLNCEEIKSQ FEGFVKDIMLNKEETKKENS FEM PR G EEDS QIAAHVISEA SSKTTSVLQW AEKGYYTMSN

NLVTLENGKQ LTVKRQGLYY IYAQVTFCSN REASSQAPFI ASLCLKSPGR

FERILLRAAN THSSAKPCGQ QSIHLGGVFE LQPGASVFVN VTDPSQVSHG

TGFTSFGLLK L*

요약(261 ORF5)(서열번호: 87)

MIETYNQTSPRSAATGLPISMKIFMYLLTVFLITQMIGSALFAVYLHRRL

DKIEDERNLHEDFVFMKTIQRCNTGERSLSLLNCEEIKSQFEGFVKDIML

NKEETKKENSFEMPRGEEDSQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSN

NLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGR

FERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHG

TGFTSFGLLKL*

벡터 6. 면역조절제: mTNFalpha (TNFα)

면역조절제 mTNFα에 대해 사용된 벡터 6의 조직화의 개략도가 도 7에 도시되어 있다. 벡터 6은 모노시스트론이다. 하기 표 12는 벡터 성분 명칭, 서열번호: 52에서 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 12]

벡터 6이 이용되는 경우, 항-TNFα는 유동 검출에 사용된다.

다음은 면역조절제 mTNFα의 설명이다.

유형: TNF 유형 II 막횡단 단백질

주석: 비-절단성 버전을 만들기 위해 돌연변이가 도입되었다.

벡터 7. 면역조절제: mRANKL /ires/FLT3 신호-V5- scFV 항-비오틴-Tm

면역조절제 mRANKL/ires/FLT3 신호-V5-scFV 항-비오틴-Tm에 대해 사용된 벡터 7의 조직화의 개략도가 도 8에 도시되어 있다. 하기 표 13은 벡터 성분 명칭, 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 13]

벡터 7이 이용되는 경우, 항-RANKL이 유동 검출에 사용된다. 항-V5 mAb는 2차 검출 방법으로 사용된다.

다음은 면역조절제 mRANKL /ires/FLT3 신호-V5-scFV 항-비오틴-Tm의 설명이다.

유형: TNF 유형 II 막횡단 단백질

주석: 야생형 서열

벡터 44

도 9는 벡터 44의 개략도를 도시한다.

아래 표 14는 벡터 성분 명칭, 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 14]

벡터 97

도 10은 벡터 97의 개략도를 도시한다.

아래 표 15는 벡터 성분 명칭, 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 15]

벡터 84.

도 11은 벡터 84의 개략도를 도시한다.

아래 표 16은 벡터 성분 명칭, 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 16]

벡터 29.

도 12는 벡터 29의 개략도를 도시한다.

아래 표 17은 벡터 성분 명칭, 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 17]

벡터 107

도 13은 벡터 107의 개략도를 도시한다.

아래 표 18은 벡터 성분 명칭, 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 18]

벡터 116

도 14는 벡터 116의 개략도를 도시한다.

아래 표 19는 벡터 성분 명칭, 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 19]

벡터 86

도 15는 벡터 86의 개략도를 도시한다.

아래 표 20은 벡터 성분 명칭, 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 20]

벡터 18

도 16은 벡터 18의 개략도를 도시한다.

아래 표 21은 벡터 성분 명칭, 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 21]

벡터 17

도 17은 벡터 17의 개략도를 도시한다.

아래 표 22는 벡터 성분 명칭, 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 22]

벡터 98

도 18은 벡터 98의 개략도를 도시한다.

아래 표 23은 벡터 성분 명칭, 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 23]

벡터 30

도 19는 벡터 30의 개략도를 도시한다.

아래 표 24는 벡터 성분 명칭, 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 24]

벡터 109

도 20은 벡터 109의 개략도를 도시한다.

아래 표 25는 벡터 성분 명칭, 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 25]

벡터 106

도 21은 벡터 106의 개략도를 도시한다.

아래 표 26은 벡터 성분 명칭, 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 26]

벡터 16

도 22는 벡터 16의 개략도를 도시한다.

아래 표 27은 벡터 성분 명칭, 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 27]

벡터 83

도 23은 벡터 83의 개략도를 도시한다.

아래 표 28은 벡터 성분 명칭, 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 28]

벡터 31

도 24는 벡터 31의 개략도를 도시한다.

아래 표 29는 벡터 성분 명칭, 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 29]

벡터 12

도 25는 벡터 12의 개략도를 도시한다.

아래 표 30은 벡터 성분 명칭, 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 30]

벡터 99

도 26은 벡터 99의 개략도를 도시한다.

아래 표 31은 벡터 성분 명칭, 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 31]

벡터 121

도 27은 벡터 121의 개략도를 도시한다.

아래 표 32는 벡터 성분 명칭, 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 32]

벡터 105

도 28은 벡터 105의 개략도를 도시한다.

아래 표 33은 벡터 성분 명칭, 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 33]

벡터 32

도 29는 벡터 32의 개략도를 도시한다.

아래 표 34는 벡터 성분 명칭, 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 34]

벡터 37

도 30은 벡터 37의 개략도를 도시한다.

아래 표 35는 벡터 성분 명칭, 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 35]

벡터 22

도 31은 벡터 22의 개략도를 도시한다.

아래 표 36은 벡터 성분 명칭, 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 36]

벡터 19

도 32는 벡터 19의 개략도를 도시한다.

아래 표 37은 벡터 성분 명칭, 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 37]

벡터 20

도 33은 벡터 20의 개략도를 도시한다.

아래 표 38은 벡터 성분 명칭, 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 38]

벡터 89

도 34는 벡터 89의 개략도를 도시한다.

아래 표 39는 벡터 성분 명칭, 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 39]

벡터 21

도 35는 벡터 21의 개략도를 도시한다.

아래 표 40은 벡터 성분 명칭, 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 40]

벡터 23

도 36은 벡터 23의 개략도를 도시한다.

아래 표 41은 벡터 성분 명칭, 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 41]

벡터 108

도 37은 벡터 108의 개략도를 도시한다.

아래 표 42는 벡터 성분 명칭, 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 42]

벡터 15

도 38은 벡터 15의 개략도를 도시한다.

아래 표 43은 벡터 성분 명칭, 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 43]

벡터 124

도 39는 벡터 124의 개략도를 도시한다.

아래 표 44는 벡터 성분 명칭, 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 44]

벡터 65

도 40은 벡터 65의 개략도를 도시한다.

아래 표 45는 벡터 성분 명칭, 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 45]

벡터 64

도 41은 벡터 64의 개략도를 도시한다.

아래 표 46은 벡터 성분 명칭, 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 46]

벡터 88

도 42는 벡터 88의 개략도를 도시한다.

아래 표 47은 벡터 성분 명칭, 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 47]

벡터 96

도 43은 벡터 96의 개략도를 도시한다.

아래 표 48은 벡터 성분 명칭, 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 48]

벡터 14

도 44는 벡터 14의 개략도를 도시한다.

아래 표 49는 벡터 성분 명칭, 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 49]

벡터 119

도 45는 벡터 119의 개략도를 도시한다.

아래 표 50은 벡터 성분 명칭, 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 50]

벡터 120

도 46은 벡터 120의 개략도를 도시한다.

아래 표 51은 벡터 성분 명칭, 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 51]

벡터 45

도 47은 벡터 45의 개략도를 도시한다.

아래 표 52는 벡터 성분 명칭, 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 52]

벡터 60

도 48은 벡터 60의 개략도를 도시한다.

아래 표 53은 벡터 성분 명칭, 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 53]

벡터 59

도 49는 벡터 59의 개략도를 도시한다.

아래 표 54는 벡터 성분 명칭, 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 54]

벡터 8

도 50은 벡터 8의 개략도를 도시한다.

아래 표 55는 벡터 성분 명칭, 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 55]

벡터 128

도 51은 벡터 128의 개략도를 도시한다.

아래 표 56은 벡터 성분 명칭, 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 56]

벡터 35

도 52는 벡터 35의 개략도를 도시한다.

아래 표 57은 벡터 성분 명칭, 상응하는 뉴클레오티드 위치, 성분의 전체 명칭 및 설명을 나타낸다.

[표 57]

일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 2는 세포 게놈으로 3~30개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용되고, 여기서 적어도 3개의 면역조절제는 OX40L, CD27L 및 CD28L이고, 선택적으로 추가 면역조절제는 표 3의 R¹ - R⁴⁴로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 3은 세포 게놈으로 3~30개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용되고, 여기서 적어도 3개의 면역조절제는 OX40L, CD27L 및 CD28L이고, 선택적으로 추가 면역조절제는 표 3의 R¹ - R⁴⁴로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 4는 세포 게놈으로 3~30개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용되고, 여기서 적어도 3개의 면역조절제는 OX40L, CD27L 및 CD28L이고, 선택적으로 추가 면역조절제는 표 3의 R¹ - R⁴⁴로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 5는 세포 게놈으로 3~30개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용되고, 여기서 적어도 3개의 면역조절제는 OX40L, CD27L 및 CD28L이고, 선택적으로 추가 면역조절제는 표 3의 R¹ - R⁴⁴로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 6은 세포 게놈으로 3~30개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용되고, 여기서 적어도 3개의 면역조절제는 OX40L, CD27L 및 CD28L이고, 선택적으로 추가 면역조절제는 표 3의 R¹ - R⁴⁴로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 14는 세포 게놈으로 3~30개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용되고, 여기서 적어도 3개의 면역조절제는 OX40L, CD27L 및 CD28L이고, 선택적으로 추가 면역조절제는 표 3의 R¹ - R⁴⁴로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 18은 세포 게놈으로 3~30개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용되고, 여기서 적어도 3개의 면역조절제는 OX40L, CD27L 및 CD28L이고, 선택적으로 추가 면역조절제는 표 3의 R¹ - R⁴⁴로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 30은 세포 게놈으로 3~30개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용되고, 여기서 적어도 3개의 면역조절제는 OX40L, CD27L 및 CD28L이고, 선택적으로 추가 면역조절제는 표 3의 R¹ - R⁴⁴로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 15는 세포 게놈으로 3~30개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용되고, 여기서 적어도 3개의 면역조절제는 OX40L, CD27L 및 CD28L이고, 선택적으로 추가 면역조절제는 표 3의 R¹ - R⁴⁴로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 19는 세포 게놈으로 3~30개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용되고, 여기서 적어도 3개의 면역조절제는 OX40L, CD27L 및 CD28L이고, 선택적으로 추가 면역조절제는 표 3의 R¹ - R⁴⁴로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 22는 세포 게놈으로 3~30개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용되고, 여기서 적어도 3개의 면역조절제는 OX40L, CD27L 및 CD28L이고, 선택적으로 추가 면역조절제는 표 3의 R¹ - R⁴⁴로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 23은 세포 게놈으로 3~30개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용되고, 여기서 적어도 3개의 면역조절제는 OX40L, CD27L 및 CD28L이고, 선택적으로 추가 면역조절제는 표 3의 R¹ - R⁴⁴로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 29는 세포 게놈으로 3~30개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용되고, 여기서 적어도 3개의 면역조절제는 OX40L, CD27L 및 CD28L이고, 선택적으로 추가 면역조절제는 표 3의 R¹ - R⁴⁴로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 2 및 벡터 3은 세포 게놈으로 3~30개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용되고, 여기서 적어도 3개의 면역조절제는 OX40L, CD27L 및 CD28L이고, 선택적으로 추가 면역조절제는 표 3의 R¹ - R⁴⁴로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 2 및 벡터 4는 세포 게놈으로 3~30개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용되고, 여기서 적어도 3개의 면역조절제는 OX40L, CD27L 및 CD28L이고, 선택적으로 추가 면역조절제는 표 3의 R¹ - R⁴⁴로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 2 및 벡터 5는 세포 게놈으로 3~30개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용되고, 여기서 적어도 3개의 면역조절제는 OX40L, CD27L 및 CD28L이고, 선택적으로 추가 면역조절제는 표 3의 R¹ - R⁴⁴로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 2 및 벡터 6은 세포 게놈으로 3~30개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용되고, 여기서 적어도 3개의 면역조절제는 OX40L, CD27L 및 CD28L이고, 선택적으로 추가 면역조절제는 표 3의 R¹ - R⁴⁴로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 3 및 벡터 4는 세포 게놈으로 3~30개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용되고, 여기서 적어도 3개의 면역조절제는 OX40L, CD27L 및 CD28L이고, 선택적으로 추가 면역조절제는 표 3의 R¹ - R⁴⁴로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 3 및 벡터 5는 세포 게놈으로 3~30개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용되고, 여기서 적어도 3개의 면역조절제는 OX40L, CD27L 및 CD28L이고, 선택적으로 추가 면역조절제는 표 3의 R¹ - R⁴⁴로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 3 및 벡터 6은 세포 게놈으로 3~30개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용되고, 여기서 적어도 3개의 면역조절제는 OX40L, CD27L 및 CD28L이고, 선택적으로 추가 면역조절제는 표 3의 R¹ - R⁴⁴로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 2, 벡터 3 및 벡터 4는 세포 게놈으로 3~14개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용되고, 여기서 적어도 3개의 면역조절제는 OX40L, CD27L 및 CD28L이고, 선택적으로 추가 면역조절제는 표 3의 R¹ - R⁴⁴로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 2, 벡터 3 및 벡터 5는 세포 게놈으로 3~30개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용되고, 여기서 적어도 3개의 면역조절제는 OX40L, CD27L 및 CD28L이고, 선택적으로 추가 면역조절제는 표 3의 R¹ - R⁴⁴로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 2, 벡터 3 및 벡터 6은 세포 게놈으로 3~30개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용되고, 여기서 적어도 3개의 면역조절제는 OX40L, CD27L 및 CD28L이고, 선택적으로 추가 면역조절제는 표 3의 R¹ - R⁴⁴로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 2, 벡터 3 및 벡터 6은 세포 게놈으로 3~30개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용되고, 여기서 적어도 3개의 면역조절제는 OX40L, CD27L 및 CD28L이고, 선택적으로 추가 면역조절제는 표 3의 R¹ - R⁴⁴로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 3, 벡터 4 및 벡터 5는 세포 게놈으로 3~30개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용되고, 여기서 적어도 3개의 면역조절제는 OX40L, CD27L 및 CD28L이고, 선택적으로 추가 면역조절제는 표 3의 R¹ - R⁴⁴로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 3, 벡터 4 및 벡터 6은 세포 게놈으로 3~30개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용되고, 여기서 적어도 3개의 면역조절제는 OX40L, CD27L 및 CD28L이고, 선택적으로 추가 면역조절제는 표 3의 R¹ - R⁴⁴로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 2, 벡터 3, 벡터 4 및 벡터 5는 세포 게놈으로 3~30개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용되고, 여기서 적어도 3개의 면역조절제는 OX40L, CD27L 및 CD28L이고, 선택적으로 추가 면역조절제는 표 3의 R¹ - R⁴⁴로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 2, 벡터 3, 벡터 4 및 벡터 6은 세포 게놈으로 3~30개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용되고, 여기서 적어도 3개의 면역조절제는 OX40L, CD27L 및 CD28L이고, 선택적으로 추가 면역조절제는 표 3의 R¹ - R⁴⁴로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 2, 벡터 3, 벡터 5 및 벡터 6은 세포 게놈으로 3~30개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용되고, 여기서 적어도 3개의 면역조절제는 OX40L, CD27L 및 CD28L이고, 선택적으로 추가 면역조절제는 표 3의 R¹ - R⁴⁴로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 3, 벡터 4, 벡터 5 및 벡터 6은 세포 게놈으로 3~30개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용되고, 여기서 적어도 3개의 면역조절제는 OX40L, CD27L 및 CD28L이고, 선택적으로 추가 면역조절제는 표 3의 R¹ - R⁴⁴로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 2, 벡터 3, 벡터 4, 벡터 5 및 벡터 6은 세포 게놈으로 3~30개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용되고, 여기서 적어도 3개의 면역조절제는 OX40L, CD27L 및 CD28L이고, 선택적으로 추가 면역조절제는 표 3의 R¹ - R⁴⁴로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 14 및 벡터 18은 세포 게놈으로 3~30개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용되고, 여기서 적어도 3개의 면역조절제는 OX40L, CD27L 및 CD28L이고, 선택적으로 추가 면역조절제는 표 3의 R¹ - R⁴⁴로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 14 및 벡터 30은 세포 게놈으로 3~30개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용되고, 여기서 적어도 3개의 면역조절제는 OX40L, CD27L 및 CD28L이고, 선택적으로 추가 면역조절제는 표 3의 R¹ - R⁴⁴로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 18 및 벡터 30은 세포 게놈으로 3~30개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용되고, 여기서 적어도 3개의 면역조절제는 OX40L, CD27L 및 CD28L이고, 선택적으로 추가 면역조절제는 표 3의 R¹ - R⁴⁴로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 14, 벡터 18 및 벡터 30은 세포 게놈으로 3~30개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용되고, 여기서 적어도 3개의 면역조절제는 OX40L, CD27L 및 CD28L이고, 선택적으로 추가 면역조절제는 표 3의 R¹ - R⁴⁴로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 15, 벡터 19, 벡터 22, 벡터 23 및 벡터 29 중 하나 이상은 세포 게놈으로 3~30개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용되고, 여기서 적어도 3개의 면역조절제는 OX40L, CD27L 및 CD28L이고, 선택적으로 추가 면역조절제는 표 3의 R¹ - R⁴⁴로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 44는 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 97은 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 84는 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 29는 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 107은 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 116은 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 86은 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 18은 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 17은 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 98은 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 5는 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 30은 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 109는 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 3은 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 4는 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 106은 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 16은 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 83은 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 31은 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 12는 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 99는 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 121은 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 105는 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 32는 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 37은 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 22는 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 19는 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 20은 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 89는 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 21은 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 23은 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 108은 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 15는 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 124는 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 65는 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 64는 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 88은 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 96은 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 14는 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 119는 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 120은 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 45는 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 60은 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 59는 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 8은 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 128은 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 35는 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 6은 세포 게놈으로 3~25개의 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다.

일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 44, 벡터 29, 벡터 18, 벡터 17, 벡터 5, 벡터 16, 벡터 99, 벡터 15, 벡터 14, 벡터 45, 및 벡터 6 중 하나 이상은 세포 게놈으로 3~14개 TNF 패밀리 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 3~14개 TNF 패밀리 구성원 면역조절제는 표 2에 열거된 것들로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 97, 벡터 84, 벡터 107, 벡터 98, 벡터 30, 벡터 83, 벡터 121, 및 벡터 119 중 하나 이상은 세포 게놈으로 3~25개 Ig 패밀리 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 3~25개 Ig 패밀리 구성원 면역조절제는 표 2에 열거된 것들로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 109는 세포 게놈으로 3~25개 성장 인자 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다.

일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 3, 벡터 4, 벡터 32, 벡터 22, 벡터 19, 벡터 20, 벡터 89, 벡터 21, 벡터 23, 벡터 121, 벡터 65, 벡터 64, 벡터 88, 벡터 96, 벡터 60, 벡터 59, 및 벡터 128 중 하나 이상은 세포 게놈으로 3~25개 사이토카인 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 3~25개 사이토카인 면역조절제는 표 2에 열거된 것들로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 37, 벡터 124, 벡터 88, 및 벡터 8 중 하나 이상은 세포 게놈으로 3~25개 수용체 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 3~25개 수용체 면역조절제는 표 2에 열거된 것들로부터 선택된다.

일 실시형태에 따르면, 변형을 위해 종양 세포주가 선택되고, 벡터 86, 벡터 106, 벡터 107, 벡터 31, 벡터 12, 벡터 105, 벡터 108, 벡터 120, 및 벡터 35 중 하나 이상은 세포 게놈으로 3~25개 다른 면역조절제를 안정적으로 통합하는데 사용된다. 일 실시형태에 따르면, 3~25개 다른 면역조절제는 표 2에 열거된 것들로부터 선택된다.

실시예 4.

흑색종 종양 세포주 SK-MEL2 상에서 발현되는, 본 명세서에 기재된 면역조절제가 인간 PBMC의 증식 및 분화에 차별적으로 영향을 미친다는 것을 입증하기 위해 실험을 수행하였다. 도 53은 일반적인 실험 설계를 보여주는 개략도이다. 아래의 동종 세포주를 시험하였다:

· SK-MEL (모 세포주) ("SK")

· 벡터 2로만 변형된 SK ("2"))

· 벡터 3으로만 변형된 SK ("3")

· 벡터 4로만 변형된 SK (4")

· 벡터 5로만 변형된 SK (5")

· 벡터 6으로만 변형된 SK (6"

· 벡터 2 및 벡터 3으로 변형된 SK ("2-3")

· 벡터 3, 벡터 4 및 벡터 5로 변형된 SK ("3-4-5")

· 벡터 3, 벡터 5 및 벡터 6으로 변형된 SK ("3-5-6")

· 벡터 3, 벡터 4, 벡터 5 및 벡터 6으로 변형된 SK ("3-4-5-6")

· 벡터 2, 벡터 3, 벡터 4, 벡터 5 및 벡터 6으로 변형된 SK

동종 세포주의 기능적 특성화는 본 명세서에 기재된 바와 같이 일차 MLTR 검정을 사용하여 수행하였다. MLTR 검정은 250,000개의 새로 해동된 PBMC 및 50,000개의 선별 조작된 동종 세포주로 설정하였다. 다음 산출물을 측정하였다: 1) CFSE 표지된 PMBC 상에서 흐름으로 증식을 측정한다. 2) 비표지 PMBC 상에서 CyTOF로 분화를 측정하고; 3) 사이토카인 프로파일링을 Luminex에 의해 수행한다.

유세포분석 데이터

"동종인식(Allorecognition)"은 동일한 종 내에서 유전적으로 이질적인 개체들 사이의 조직부적합 항원의 면역학적 인식을 정의하는 데 사용되는 용어이다. "직접 동종인식"은 수용자 T 세포가 수용자 APC에 의한 항원 처리에 대한 필요 없이 이식된 세포의 표면에 표시된 MHC-분자-펩티드 복합체 상의 결정인자를 인식하는 기전이다. 직접 반응은 직접 동종제시만이 발생할 수 있는 혼합된 림프구 반응에 의해 시험관 내에서 가장 쉽게 입증될 수 있다.

"간접 동종인식"은 자기-제한적 방식으로 자기-MHC에 의해 제시된 동종 조직적합성 항원의 처리된 펩티드의 인식을 지칭한다. 간접 동종인식 제시는 변함없이 CD4+ T 세포에 의해 지배되는 동종반응을 초래한다.

말초 혈액 T 세포의 약 10%는 백신접종에 사용되는 동종 종양 유형 특이적 세포의 동종인지가 가능한 TCR을 보유한다. 이것은 "직접 동종인식"이라고 불리며, 백신 접종 후 이벤트 과정 초기에 발생한다. 직접 동종인식은 동종 세포에 대한 T 세포 매개된 면역 반응을 표적으로 하여 이들의 사멸 및 종양 유형 특이적 신생항원 및 공유된 정상 항원의 방출을 초래한다. 이들 종양 신생항원 (및 정상 항원)은 숙주 항원 제시 세포에 의해 흡수되고 처리되어 숙주 HLA와 관련하여 제시된다. 이 "간접 동종인식"은 백신접종 후 이벤트 과정에서 늦게 발생한다. 간접 동종인식 동안 활성화된 TCR은 직접 동종인식 중 이전에 관련된 것과 상이하지만, 두 과정 모두 고밀도 면역조절제(예를 들어, 매월 백신접종)를 보유하는 동종 세포에 반복적으로 노출된 국소 환경에서 발생한다.

에피토프 확산은 별개이지만 밀접하게 관련된 T 세포 에피토프를 포함하도록 면역 반응을 확장시키는 과정이다. 이것은 일반적으로 면역 반응의 성숙으로 설명된다. 종양 신생항원 대 자가-항원에 대한 면역 반응의 차등적 성숙은 자가-항원에 대한 면역 반응에 대해 차등적으로 보호하기 위한 내성 기전이 존재한다는 사실에 의해 유도된다. 자기-관용이 깨질 수 있지만 종양 신생항원에 대한 반응보다는 어렵다.

이론에 구애됨 없이, 주어진 유형의 모든 종양은 많은 항원을 공유하기 때문에, 면역 반응의 간접 동종인식에 의해 초기에 유도된 T-세포 매개된 반응은 동일한 유형의 숙주 종용에 대해 교차 반응할 것이다. 일부 실시형태에 따르면, 종양 미세환경이 극복할 수 없는 부정적인 면역조절 장애물을 제공할 수 있기 때문에, 이 접근법은 용적축소 요법(예를 들어, 수술, 방사선 또는 종양용해성 바이러스) 후 최소 잔여 질환의 설정에서 체크포인트 억제제와 함께 사용될 수 있다.

본 명세서에 기재된 실험은 직접 동종인식을 통한 hPBMC 활성화 대 범-자극을 사용한다. 일차 인간 pan-T 세포는 CD4 및 CD8 T 세포 뿐만 아니라 일부 감마/델타 T 세포 하위집합을 포함한다. 범-자극에서, 비표적 세포, 즉, 단핵구, 호중구, 호산구, B 세포, 줄기 세포, 수지상 세포, NK 세포, 과립구 또는 적혈구 세포는 비오틴-접합된 항체의 칵테일을 사용하여 표지된다. T 세포는 컬럼을 사용하지 않으면서 음성 면역자기 분리 기술을 사용하여 말초 혈액(PB) 단핵 세포(MNC)로부터 단리된다. 세포는 분리 공정의 영향을 받지 않으며 후속 사용을 위해 준비된다. 직접 동종인식을 통한 hPBMC 활성화는 종양 세포에 대해 근본적으로 다른 반응을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 이 방법에 의한 hPBMC 활성화와 관련하여 세 가지 중요한 관찰이 이루어졌다: 1) hPBMC의 ~10%가 항-CD3/CD28 치료의 ~50%에 비해 증식한다는 것; 2) 항-CD3/CD28 치료보다 더 많은 세포 분열을 유도하고; 3) 보다 다양한 형태를 유도한다는 것.

도 54는 유세포분석 실험의 결과를 나타내는 그래프 패널이다. 크기 및 세분성에 대한 정방향(FSC) 및 측면 산란(SSC) 플롯이 표시된다. SK 종양 세포주는 숫자 코드로 표시된다; SK, 비변형 모 세포주; 벡터 3, 분비된 GM-CSF 및 막 발현된 FLT-3L; 벡터 4, 분비된 FLT3L 및 막 발현된 GM-CSF; 벡터 5, 절단 불가능한 형태의 CD40L; 벡터 6, 절단 불가능한 형태의 TNF-a; 3-4는 벡터 3과 4의 조합이고; 3-4-5는 벡터 3,4 및 5의 조합이고; 3-4-6은 벡터 3,4 및 6의 조합이다. 세포주 6, 3-4-5 및 3-4-6은 상피 기원의 세포 상의 TNF-a 및 CD40L에 대한 수용체의 존재로 인해 더 크고 더 세분화된 표현형을 나타낸다.

도 55는 지시된 조작된 표면 마커에 대한 대표적인 유세포분석 염색을 나타내는 그래프 패널이다; GM-CSF, FLT3L, TNF-a 및 CD40L. SK 종양 세포주는 숫자 코드로 표시된다; SK, 비변형 모 세포주; 벡터 3, 분비된 GM-CSF 및 막 발현된 FLT-3L; 벡터 4, 분비된 FLT3L 및 막 발현된 GM-CSF; 5, 절단 불가능한 형태의 CD40L; 벡터 6, 절단 불가능한 형태의 TNF-a; 3-4는 벡터 3과 4의 조합이고; 3-4-5는 벡터 3,4 및 5의 조합이고; 3-4-6은 벡터 3,4 및 6의 조합이다.

도 56은 지시된 조작된 표면 마커에 대한 대표적인 유세포분석 염색을 나타내는 그래프 패널이다; GM-CSF, FLT3L, TNF-a 및 CD40L. SK 종양 세포주는 숫자 코드로 표시된다; SK, 비변형 모 세포주; 벡터 3, 분비된 GM-CSF 및 막 발현된 FLT-3L; 벡터 4, 분비된 FLT3L 및 막 발현된 GM-CSF; 벡터 5, 절단 불가능한 형태의 CD40L; 벡터 6, 절단 불가능한 형태의 TNF-a; 3-4는 벡터 3과 4의 조합이고; 3-4-5는 벡터 3,4 및 5의 조합이고; 3-4-6은 벡터 3,4 및 6의 조합이다.

CyTOF 데이터

면역조절 인자의 발현에 의해 변형된 SK 흑색종 세포에 대한 hPBMC 반응의 CyTOF 질량 세포측정법 단일-세포 표현형 분석이 도 14a 및 도 14b에 도시되어 있다. SK 흑색종 세포주 및 hPBMC는 24시간 동안 배양하였다. 세포를 배양물로부터 수확하고 32-마커 CyTOF 항체 패널로 염색하여 다중 면역 세포 하위집합뿐만 아니라 세포 표면 및 세포내 표현형 마커를 검출했다. CyTOF 질량 세포측정법 데이터는 Helios 기기에서 생성되었다. 데이터는 평형 비드를 사용하여 신호에 대해 정규화되었다. 세포 염색 데이터는 세포 게이팅 기능과 일련의 데이터 시각화 방법을 포함하는 CyTOF 데이터 분석을 위한 클라우드 컴퓨팅 제품군인 Cytobank를 사용하여 분석하였다.

도 57a 및 도 57b에 도시된 데이터는 시각화를 위해 단일 세포로부터의 다차원 염색 신호를 플롯으로 변환하는 차원 축소 방법인 viSNE를 사용하여 플롯되었다. 도 57a는 면역 세포 하위집합 풍부도 및 표현형에서의 상대적인 변화를 나타내는 CyTOF 염색 데이터의 viSNE 밀도 등고선 플롯을 나타낸다. 도 57b는 단일 세포 표현형 분석을 나타낸다. viSNE 밀도 등고선 플롯은 SK 흑색종 세포 또는 변형된 SK 흑색종 세포와 함께 배양된 게이팅되지않은 총 PBMC로부터 viSNE에 의해 생성되었다. 플롯은 hPBMC 면역 세포 하위집합에 대한 세포 밀도의 상대적인 변화를 나타낸다. 삽입된 viSNE 플롯은 viSNE 밀도 플롯의 클러스터 내에서 발견되는 면역 세포 하위집합을 식별한다. 밀도 등고선 플롯의 화살표는 hPBMC, SK 세포, 및 변형된 SK 세포들 사이의 면역 세포 하위집합의 눈에 보이는 변화를 가리킨다. SK 종양 세포주는 숫자 코드로 표시된다; SK, 비변형 모 세포주; 벡터 3, 분비된 GM-CSF 및 막 발현된 FLT-3L; 벡터 4, 분비된 FLT3L 및 막 발현된 GM-CSF; 벡터 5, 절단 불가능한 형태의 CD40L; 벡터 6, 절단 불가능한 형태의 TNF-a; 3-4는 벡터 3과 4의 조합이고; 3-4-5는 벡터 3,4 및 5의 조합이고; 3-4-6은 벡터 3,4 및 6의 조합이다.

도 58a~도 58d는 1:5 세포 비율의 지시된, 유전적으로 변형된 SK 세포주로 1일 자극 후 활성화 마커 CD40 (도 58a), CD86 (도 58b), CD69 (도 58c) 및 CD25 (도 58d) 발현의 변화를 나타내는 hPBMC의 CyTOF 단핵구 클러스터 분석을 나타낸다. 도 58e는 단핵구 마커 CD40 및 CD86의 상대 중간 발현 수준(MEI)을 나타내는 hPBMC의 CyTOF 단핵구 클러스터 분석을 나타낸다. 도 58f는 CD4 T 세포 마커 CD69 및 CD25의 상대 중간 발현 지수(MEI)를 나타내는 hPBMC의 CyTOF 단핵구 클러스터 분석을 나타낸다. SK 종양 세포주는 숫자 코드로 표시된다; SK, 비변형 모 세포주; 벡터 3, 분비된 GM-CSF 및 막 발현된 FLT-3L; 벡터 4, 분비된 FLT3L 및 막 발현된 GM-CSF; 벡터 5, 절단 불가능한 형태의 CD40L; 벡터 6, 절단 불가능한 형태의 TNF-a; 3-4는 벡터 3과 4의 조합이고; 3-4-5는 벡터 3,4 및 5의 조합이고; 3-4-6은 벡터 3,4 및 6의 조합이다.

사이토카인 데이터

SK 모 세포주 및 유전적으로 변형된 SK 세포주에 대한 인간 PBMC 반응의 Luminex 다중 사이토카인 프로파일링이 도 59에 도시되어 있다. SK 세포 또는 지정된 변형 세포주는 1:5 세포 비율로 인간 PBMC와 함께 24시간 동안 배양하였다. 대조군 배양물은 SK 세포 단독, hPBMC 단독, 및 항-CD3 및 항-CD28 항체의 혼합물(1 μg/ml 최종 농도)로 자극된 hPBMC를 포함하였다. 다중 Luminex 비드 어레이 검정을 사용하여 상청액을 사이토카인 수준에 대해 스크리닝하여, IL-1a, IL-1b, IL-1ra, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p40, IL-12p70, IL-13, IL-17A, IL-23, TNFa, IFNg, G-CSF, GM-CSF, MIP1b, MCP-1, Rantes, Tweak, 및 TREM-1을 검출하였다. SK 모 세포주 및 변형된 SK 세포주에 의해 특이적으로 유도되는 것으로 밝혀진 이들 사이토카인은 플롯으로 나타낸다. 기호는 재조합 사이토카인을 사용하여 표준 곡선에서 추정된 pg/ml 단위의 사이토카인 수준을 나타낸다. 기호가 없으면 사이토카인이 검출되지 않았음을 나타낸다. SK 세포주는 숫자 코드로 나타낸다; SK, 비변형 모 세포주; 3, 분비된 GM-CSF 및 막 발현된 FLT-3L; 3, 분비된 FLT3L 및 막 발현된 GM-CSF; 5, 절단 불가능한 형태의 CD40L; 6, 절단 불가능한 형태의 TNF-a; 3-4는 3과 4의 조합이고; 3-4-5는 3,4 및 5의 조합이고; 3-4-6은 3,4 및 6의 조합이다.

기술된 연구는 면역조절제의 복합 조합 공간이 모든 인간 시험관내 MLTR 검정을 사용하여 신속하고 효율적으로 평가될 수 있다는 개념 증명을 제공한다.

실시예 5.

CD8+ T 세포 및 NK 세포 활성화 및 확장에 대하여, 종양 세포주 SK-MEL2 상에서 발현된, 본 명세서에 기재된 면역조절제의 효과를 결정하기 위한 실험을 수행하였다.

아래 동종 세포주를 시험하였다:

· SK-MEL (모 세포주, 대조군으로 사용함)

· 벡터 14, 벡터 18 및 벡터 30으로 변형된 SK ("14-18-30")

· 벡터 15로만 변형된 SK ("15")

· 벡터 19로만 변형된 SK ("19")

· 벡터 22로만 변형된 SK ("22")

· 벡터 23으로만 변형된 SK ("23")

· 벡터 29로만 변형된 SK ("29")

실시예 1에 기재된 바와 같이 일차 MLTR 검정을 사용하여 동종 세포주의 기능적 특성화를 수행하였다. 아래 산출물을 측정하였다: 1) CD8+ T-세포 증식은 유세포분석으로 측정하고(도 60); 2) 9일차 생/사 염색을 사용한 종양 세포 사멸(도 61); 3) 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 및 B 세포 확장은 유세포분석에 의해 측정된다(도 62).

실험의 제1 세트에서, CD8+ T 세포 자극이 "14-18-30"에 의해 구체적으로 증진될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 도 60은 벡터 14, 벡터 18 및 벡터 30("14-18-30")으로 변형된 종양 세포와 모 세포주의 효과를 비교한다. 그래프 상단 패널의 점선 타원은 림프구 게이트를 나타낸다. 모 세포주(i)에서, 림프구가 활동하지 않는 반면, "14-18-30" 세포주(ii)에서는 상당한 림프구 확장이 있다. 그래프 하단 패널의 점선 원은 CD8 게이트를 나타낸다. 모 세포주(iii)에서, 적은 수의 CD8+ T 세포가 있는 반면, "14-18-30" 세포주(iv)에는 CD8+ T 세포 수가 크게 증가했다. CD8+ T 세포 수 증가는 기준선보다 ~300배 증가했으며, 면역 활성화를 나타내는 CD8/CD4 비율은 기준선보다 ~15배 증가한 것으로 밝혀졌다. 또한, CCR7+/CCR7- 비율(CTL 기억 표현형의 대용)은 기준선보다 ~15배 증가했다.

또한, 배양 9일째에 벡터 14, 벡터 18 및 벡터 30("14-18-30")으로 변형된 모 세포주와 종양 세포를 비교할 때, 모 세포주("변형되지 않은 모 종양 세포주 + hPBMC)에서 건강한 종양 세포 및 휴지 림프구를 시각화할 수 있는 반면, 벡터 14, 벡터 18 및 벡터 30으로 변형된 종양 세포("APX-14-18-30 백신 후보 + hPBMC")에서, 활성화된 CTL이 관찰되는 동안 살아있는 종양 세포가 시각화되지 않았다.

추가 실험 세트에서, 벡터 15, 벡터 19, 벡터 22, 벡터 23 및 벡터 29로 변형된 종양 세포가 면역 세포 자극에 미치는 효과를 측정하였다. 특히, 도 62에 도시된 바와 같이, 각각의 특정 면역조절제가 자극하는 면역 세포의 하위집합을 유세포분석을 사용하여 측정할 수 있었다. 사멸 능력은 시각적으로 결정하였다. 도 62에 도시된 바와 같이, 벡터 15("APX/15")는 DC를 자극하고, 벡터 19("APX/19")는 NK 세포를 자극하고, 벡터 22("APX/22")는 DC를 자극하고, 벡터 23("APX/23")은 DC 세포를 자극하고 벡터 29("APX/29")는 B 세포를 자극하였다.

도 65는 CD8+ T 세포 확장 및 세포 사멸을 평가하기 위해 유세포분석을 사용한, 또 다른 일련의 실험으로부터의 결과를 나타낸다. 6일 및 8일 시점을 SK-모 세포주 대 면역조절 분자 14, 18 및 30("14-18-30")을 발현하는 변형된 SK 세포주를 사용하는 CD8 확장 검정에서 비교하였다. 왼쪽 하단 패널(iii)은 CD8+ T 세포를 나타낸다. 패널(iii)을 패널(iv)와 비교하면, CD8+T 세포의 수가 증가하고 유세포 분석 판독값이 오른쪽으로 확장되어 활성화 형태를 나타내는 것을 볼 수 있다. 오른쪽 상단 패널(ii)은 동종 세포를 나타낸다. 동종 세포(패널(i) 및 (ii))를 비교하면, 면역조절 분자 14, 18 및 30을 발현하는 변형된 SK 세포주와 함께 유세포분석 결과가 패널(ii)에서 왼쪽으로 이동하는 것이 관찰되었다. 이러한 결과는 사멸된 세포와 사멸되어가는 세포로의 전환을 나타낸다. 따라서, CD8+ T 세포는 확장되었을 뿐만 아니라 그 중간에 있는 동종 세포도 사멸시켰다. 이러한 결과는 동종 종양 세포가 혈액 세포와 상호작용하여 주입된 세포를 사멸시킨다는 것을 입증했다. 따라서, 임상 시나리오에서, 동종 종양 세포 백신이 환자의 림프구, 특히 면역 킬러 세포(CD8+ T 세포 및 NK 세포)의 하위 집합을 활성화하고 확장하는 데 사용될 수 있으며, 이는 차례로 환자의 종양 세포를 사멸시킨다. 종양 세포 백신은 대상체에게 동종이지만, 혈액 세포와 종양 세포는 동일한 HLA를 가지고 있다.

수지상 세포(DC) 확장

실시예 1에 기술된 바와 같이 CyTOF를 수행하였다. 면역조절 분자 (벡터 3("APX/3"), 벡터 3 및 벡터 4("APX/3-4); 벡터 3, 벡터 4, 벡터 5("APX/3-4-5") 및 벡터 3, 벡터 4, 벡터 6("APX/3-4-6")의 발현에 의한 변형을 갖는 SK 흑색종 세포에 대한 hPBMC 반응의 CyTOF 질량측정 단일-세포 표현형 분석이 도 20 및 도 21에 도시되어 있다. CyTOF는 유세포분석과 비교하여, 원자 질량 스펙트럼 분해능으로 극도의 다중화를 제공하고, 따라서 본 명세서에서 다양한 면역조절 분자로 자극 후 다양한 PBMC 하위집합을 정의하는데 사용하였다. SK 흑색종 세포주 및 hPBMC를 24시간 동안 배양하였다. 세포를 배양물에서 수확하고, 32-마커 CyTOF 항체 패널로 염색하여 다중 면역 세포 하위집합 뿐만 아니라 세포-표면 및 세포내 표현형 마커를 검출하였다. CyTOF 질량 세포분석 데이터는 Helios 기기에서 생성되었다. 데이터는 평형 비드를 사용하여 신호에 대해 정규화하였다. 세포 염색 데이터는 세포 게이팅 기능과 일련의 데이터 시각화 방법을 포함하는 CyTOF 데이터 분석을 위한 클라우드 컴퓨팅 제품군인 Cytobank를 사용하여 분석하였다.

도 63 및 도 64에 도시된 데이터는 단일 세포로부터의 다차원 염색 신호를 시각화를 위한 플롯으로 변환하는 차원 축소 방법인 viSNE를 사용하여 플롯하였다. 도 63은 면역 세포 하위집합 풍부도 및 표현형의 상대적인 변화를 나타내는 CyTOF 염색 데이터의 viSNE 밀도 등고선 플롯을 나타낸다. 도 63에서, 점선 원은 모 세포주("부모")에 존재하지 않았던 세포의 하위 모집단(들)을 따른다. 도 63에서 알 수 있는 바와 같이, 모 세포주에 존재하지 않았던 NK 세포 및 골수 세포의 모집단이 도 64에 존재하며, 이는 면역조절 분자로 변형된 표시된 SK 세포주로 9회 자극후 마커들 PD-L1, CD86, CD25, CD16, CD14, CD141, CD64, CD123 및 T-bet 발현의 변화를 나타내는 hPBMC의 CyTOF 단핵구 클러스터 분석을 나타낸다. 도 64에 도시된 바와 같이, DC 마커로 알려진, CD123 및 CD141의 발현이 면역조절 분자로 변형된 세포주에서 증가하였다. 또한, 면역조절 분자로 변형된 세포주에서 골수 마커인 CD14의 발현이 증가하였다.

실시예 6. 생체내 이종이식 마우스 실험

6주령 암컷 근친교배 SCID 마우스를 Charles River Laboratories(미국 코네티컷주 하트퍼드 소재)로부터 수득하였다. 동물은 시설의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인한 프로토콜에 따라 처리된다. 마우스는 동물 사육장에 적응하도록 허용된다.

인간 종양 이종이식은 NSG(NOD scid 감마 마우스(Jackson Laboratory)에서 확립되었다. 인간 종양을 NSG 마우스의 옆구리에 이식하였다. 인간 종양 세포를 NGS(NOD scid 감마) 마우스의 옆구리에 이식하고 150 ㎣으로 성장하도록 허용했다. 마우스를 군당 6마리의 마우스로, 대조군과 처리군인 두 군으로 무작위로 나누었다. 처리군은 ENLIST™ 세포를 발현하는 14-18-30에 의해 활성화된 확장된 활성화된 일련의 사멸 세포를 포함하는 확장된 활성화된 PBMC로 처리되었다. 30일차(t=0)에 대조군의 마우스에는 비히클만 접종하고 처리군의 마우스에는 확장된 활성화된 일련의 사멸 세포를 포함하는 3 x 10⁶ 확장된 활성화된 PBMC를 접종했다. 종양 크기를 두 군 모두에서 접종 후 시간 경과에 따라 캘리퍼스에 의해 측정했다. 도 66은 NGS 마우스를 사용한 이종이식 치료 연구의 평균 및 표준 편차를 나타내는 플롯이다. 각 상자의 말단은 상위 및 하위 사분위수이고; 중앙값은 상자 내부의 수직선으로 표시되고, 휘스커는 최고 및 최저 관측치까지 확장되는 상자 외부의 두 선이다. 인간 종양 세포를 NGS(NOD scid 감마) 마우스의 옆구리에 이식했다. 종양이 150 ㎣으로 성장하도록 허용했다. 마우스를 군당 6마리의 마우스로, 대조군과 처리군인 두 군으로 무작위로 나누었다. 30일차(t=0)에 대조군의 마우스에는 비히클만 접종하고 처리군의 마우스에는 ENLIST™ 세포("SUPLEXA™ 세포")를 발현하는 14-18-30에 의해 활성화된 3 x 10⁶ PBMC를 접종했다. 종양 크기는 접종 후 36일에 걸쳐 간격을 두고 측정했다. 두 군 간의 분기는 5일 이내에 나타났다. 22일차 후, 분기는 통계적으로 유의하게 되었다(*P<0.05; ** P<005).

본 발명이 이의 특정 실시형태를 참조하여 기술되었지만, 발명의 진정한 사상 및 범주를 벗어남이 없이 다양한 변경이 이루어질 수 있고 균등물이 대체될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해되어야 한다. 부가하여, 특정 상황, 재료, 물질의 조성, 공정, 공정 단계 또는 단계들을 본 발명의 객관적인 사상 및 범주에 채택하기 위해 많은 변형이 이루어질 수 있다. 이러한 모든 변형은 본 명세서에 첨부된 청구항의 범주 내에 있는 것으로 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> ALLOPLEX BIOTHERAPEUTICS, INC. <120> ALLOGENEIC TUMOR CELL VACCINE <130> 128663-00119 <140> <141> <150> 15/821,105 <151> 2017-11-22 <150> 62/425,424 <151> 2016-11-22 <160> 109 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 399 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> membrane IgG-1 heavy chain <400> 1 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Glu Leu Gln Leu Glu Glu Ser Cys 325 330 335 Ala Glu Ala Gln Asp Gly Glu Leu Asp Gly Leu Trp Thr Thr Ile Thr 340 345 350 Ile Phe Ile Thr Leu Phe Leu Leu Ser Val Cys Tyr Ser Ala Thr Val 355 360 365 Thr Phe Phe Lys Val Lys Trp Ile Phe Ser Ser Val Val Asp Leu Lys 370 375 380 Gln Thr Ile Ile Pro Asp Tyr Arg Asn Met Ile Gly Gln Gly Ala 385 390 395 <210> 2 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> secreted IgG-1 heavy chain <400> 2 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 3 <211> 295 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> fragment secreted IgG-1 heavy chain <400> 3 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Tyr Lys Cys Lys 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> Flt3L <400> 14 Met Thr Val Leu Ala Pro Ala Trp Ser Pro Thr Thr Tyr Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Ser Ser Gly Leu Ser Gly Thr Gln Asp Cys Ser Phe 20 25 30 Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala Val Lys Ile Arg Glu Leu 35 40 45 Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val Thr Val Ala Ser Asn Leu 50 55 60 Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp Arg Leu Val Leu Ala Gln 65 70 75 80 Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala Gly Ser Lys Met Gln Gly 85 90 95 Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His Phe Val Thr Lys Cys Ala 100 105 110 Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe Val Gln Thr Asn Ile Ser 115 120 125 Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu Val Ala Leu Lys Pro Trp 130 135 140 Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu Glu Leu Gln Cys Gln Pro 145 150 155 160 Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Pro Trp Ser Pro Arg Pro Leu Glu Ala 165 170 175 Thr Ala Pro Thr Ala Pro Gln Pro Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 180 185 190 Pro Val Gly Leu Leu Leu Leu 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region from IgG1 <400> 37 Ala Glu Ala Gln Asp Gly Glu Leu Asp Gly Leu Trp Thr Thr Ile Thr 1 5 10 15 Ile Phe Ile Thr Leu Phe Leu Leu Ser Val Cys Tyr Ser Ala Thr Val 20 25 30 Thr Phe Phe Lys Val Lys Trp Ile Phe Ser Ser Val Val Asp Leu Lys 35 40 45 Gln Thr Ile Ile Pro Asp Tyr Arg Asn Met Ile Gly Gln Gly Ala 50 55 60 <210> 38 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> LC Signal <400> 38 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gln Pro Ala Met Ala 20 <210> 39 <211> 99 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> LC Variable <400> 39 Gly Ser Pro Gly Gln Ser Val Ser Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser 1 5 10 15 Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln His Leu Pro Gly Thr 20 25 30 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Asp Thr Lys Arg Pro Ser Gly Val 35 40 45 Pro Asp Arg Ile Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser 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hybrid anti-biotin heavy chain - T323A mutant <400> 41 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Phe Arg Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala 20 25 30 Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu 35 40 45 Thr Ala Tyr Gly Val Asp Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Gly Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Ser 65 70 75 80 Gly Leu Met Ser Arg Leu Ser Ile Arg Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln 85 90 95 Val Phe Leu Thr Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Lys Tyr 100 105 110 Tyr Cys Val Lys His Thr Asn Trp Asp Gly Gly Phe Ala Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 130 135 140 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 145 150 155 160 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 165 170 175 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 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<400> 42 Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile 1 5 10 15 Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His 20 25 30 Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp 35 40 45 Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Met Phe 50 55 60 Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys 65 70 75 80 Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met 85 90 95 Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser 100 105 110 Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys 115 120 125 Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu 130 135 140 Glu Leu Ser Ser Gln Pro Thr Ile Pro Ile Val Gly Ile Ile Ala Gly 145 150 155 160 Leu Val Leu Leu Gly Ala Val Ile Thr Gly Ala Val Val Ala Ala Val 165 170 175 Met Trp Arg Arg Lys Ser Ser Asp Arg Lys Gly Gly Ser Tyr Thr Gln 180 185 190 Ala Ala Ser Ser Asp Ser Ala Gln Gly Ser Asp Val Ser Leu Thr Ala 195 200 205 Cys Lys Val 210 <210> 43 <211> 583 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> mIgG Heavy Chain IgG 1/3 hybrid anti-biotin heavy chain - E325A, T323A mutant <400> 43 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Phe Arg Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala 20 25 30 Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu 35 40 45 Thr Ala Tyr Gly Val Asp Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Gly Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Ser 65 70 75 80 Gly Leu Met Ser Arg Leu Ser Ile Arg Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln 85 90 95 Val Phe Leu Thr Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Lys Tyr 100 105 110 Tyr Cys Val Lys His Thr Asn Trp Asp Gly Gly Phe Ala Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 130 135 140 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 145 150 155 160 Ala Leu Gly Cys Leu 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cggcgactgg tgagtacgcc aaaaattttg 540 actagcggag gctagaagga gagagatggg tgcgagagcg tcagtattaa gcgggggaga 600 attagatcgc gatgggaaaa aattcggtta aggccagggg gaaagaaaaa atataaatta 660 aaacatatag tatgggcaag cagggagcta gaacgattcg cagttaatcc tggcctgtta 720 gaaacatcag aaggctgtag acaaatactg ggacagctac aaccatccct tcagacagga 780 tcagaagaac ttagatcatt atataataca gtagcaaccc tctattgtgt gcatcaaagg 840 atagagataa aagacaccaa ggaagcttta gacaagatag aggaagagca aaacaaaagt 900 aagaccaccg cacagcaagc ggccgctgat cttcagacct ggaggaggag atatgaggga 960 caattggaga agtgaattat ataaatataa agtagtaaaa attgaaccat taggagtagc 1020 acccaccaag gcaaagagaa gagtggtgca gagagaaaaa agagcagtgg gaataggagc 1080 tttgttcctt gggttcttgg gagcagcagg aagcactatg ggcgcagcgt caatgacgct 1140 gacggtacag gccagacaat tattgtctgg tatagtgcag cagcagaaca atttgctgag 1200 ggctattgag gcgcaacagc atctgttgca actcacagtc tggggcatca agcagctcca 1260 ggcaagaatc ctggctgtgg aaagatacct aaaggatcaa cagctcctgg ggatttgggg 1320 ttgctctgga aaactcattt gcaccactgc tgtgccttgg 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<211> 9746 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> Vector 4 <400> 50 aatgtagtct tatgcaatac tcttgtagtc ttgcaacatg gtaacgatga gttagcaaca 60 tgccttacaa ggagagaaaa agcaccgtgc atgccgattg gtggaagtaa ggtggtacga 120 tcgtgcctta ttaggaaggc aacagacggg tctgacatgg attggacgaa ccactgaatt 180 gccgcattgc agagatattg tatttaagtg cctagctcga tacataaacg ggtctctctg 240 gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc 300 tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg 360 taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca gtggcgcccg 420 aacagggact tgaaagcgaa agggaaacca gaggagctct ctcgacgcag gactcggctt 480 gctgaagcgc gcacggcaag aggcgagggg cggcgactgg tgagtacgcc aaaaattttg 540 actagcggag gctagaagga gagagatggg tgcgagagcg tcagtattaa gcgggggaga 600 attagatcgc gatgggaaaa aattcggtta aggccagggg gaaagaaaaa atataaatta 660 aaacatatag tatgggcaag cagggagcta gaacgattcg cagttaatcc tggcctgtta 720 gaaacatcag 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agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc caatacgcaa 7800 accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca ggtttcccga 7860 ctggaaagcg ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt tagctcactc attaggcacc 7920 ccaggcttta cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca 7980 atttcacaca ggaaacagct atgaccatga ttacgccaag cgcgcaatta accctcacta 8040 aagggaacaa aagctggagc tgcaagctt 8069 <210> 53 <211> 10067 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> Vector 7 <400> 53 aatgtagtct tatgcaatac tcttgtagtc ttgcaacatg gtaacgatga gttagcaaca 60 tgccttacaa ggagagaaaa agcaccgtgc atgccgattg gtggaagtaa ggtggtacga 120 tcgtgcctta ttaggaaggc aacagacggg tctgacatgg attggacgaa ccactgaatt 180 gccgcattgc agagatattg tatttaagtg cctagctcga tacataaacg ggtctctctg 240 gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc 300 tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg 360 taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca gtggcgcccg 420 aacagggact tgaaagcgaa agggaaacca gaggagctct ctcgacgcag gactcggctt 480 gctgaagcgc gcacggcaag aggcgagggg cggcgactgg tgagtacgcc aaaaattttg 540 actagcggag gctagaagga gagagatggg tgcgagagcg tcagtattaa gcgggggaga 600 attagatcgc gatgggaaaa aattcggtta aggccagggg gaaagaaaaa atataaatta 660 aaacatatag tatgggcaag cagggagcta gaacgattcg cagttaatcc tggcctgtta 720 gaaacatcag aaggctgtag acaaatactg ggacagctac aaccatccct tcagacagga 780 tcagaagaac ttagatcatt atataataca gtagcaaccc tctattgtgt gcatcaaagg 840 atagagataa aagacaccaa ggaagcttta gacaagatag aggaagagca aaacaaaagt 900 aagaccaccg cacagcaagc ggccgctgat cttcagacct ggaggaggag atatgaggga 960 caattggaga agtgaattat ataaatataa agtagtaaaa attgaaccat taggagtagc 1020 acccaccaag gcaaagagaa gagtggtgca gagagaaaaa agagcagtgg gaataggagc 1080 tttgttcctt gggttcttgg gagcagcagg aagcactatg ggcgcagcgt caatgacgct 1140 gacggtacag gccagacaat tattgtctgg tatagtgcag cagcagaaca atttgctgag 1200 ggctattgag gcgcaacagc atctgttgca actcacagtc tggggcatca 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ctttttcccg 2100 agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag tagtcgccgt gaacgttctt tttcgcaacg 2160 ggtttgccgc cagaacacag gtaagtgccg tgtgtggttc ccgcgggcct ggcctcttta 2220 cgggttatgg cccttgcgtg ccttgaatta cttccacctg gctgcagtac gtgattcttg 2280 atcccgagct tcgggttgga agtgggtggg agagttcgag gccttgcgct taaggagccc 2340 cttcgcctcg tgcttgagtt gaggcctggc ctgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct 2400 ggtggcacct tcgcgcctgt ctcgctgctt tcgataagtc tctagccatt taaaattttt 2460 gatgacctgc tgcgacgctt tttttctggc aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc 2520 tgcacactgg tatttcggtt tttggggccg cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc 2580 gcacatgttc ggcgaggcgg ggcctgcgag cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt 2640 ctcaagctgg ccggcctgct ctggtgcctg gtctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct 2700 gggcggcaag gctggcccgg tcggcaccag ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg 2760 gccctgctgc agggagctca aaatggagga cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt 2820 cacccacaca aaggaaaagg gcctttccgt cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg 2880 agtaccgggc gccgtccagg cacctcgatt agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt 2940 taggttgggg ggaggggttt tatgcgatgg agtttcccca cactgagtgg gtggagactg 3000 aagttaggcc agcttggcac ttgatgtaat tctccttgga atttgccctt tttgagtttg 3060 gatcttggtt cattctcaag cctcagacag tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg 3120 tgtcgtgaca agtttgtaca aaaaagcagg ctgccaccat gagcaccgag agcatgatca 3180 gagacgtgga gctggccgag gaggccctgc ccaagaagac cggcggcccc cagggcagca 3240 gaagatgcct gttcctgagc ctgttcagct tcctgatcgt ggccggcgcc accaccctgt 3300 tctgcctgct gcacttcggc gtgatcggcc cccagagaga ggagttcccc agagacctga 3360 gcctgatcag ccccctggcc caggccgtgg cccacgtggt ggccaacccc caggccgagg 3420 gccagctgca gtggctgaac agaagagcca acgccctgct ggccaacggc gtggagctga 3480 gagacaacca gctggtggtg cccagcgagg gcctgtacct gatctacagc caggtgctgt 3540 tcaagggcca gggctgcccc agcacccacg tgctgctgac ccacaccatc agcagaatcg 3600 ccgtgagcta ccagaccaag gtgaacctgc tgagcgccat caagagcccc tgccagagag 3660 agacccccga gggcgccgag gccaagccct ggtacgagcc catctacctg ggcggcgtgt 3720 tccagctgga gaagggcgac agactgagcg ccgagatcaa cagacccgac tacctggact 3780 tcgccgagag cggccaggtg tacttcggca tcatcgccct gtaaacccag ctttcttgta 3840 caaagtggtg ataatcgaat tctaaataga tagaacaaca acaattgcat tcatttttga 3900 tttcaggttc agggggaggt gtgggaggtt ttttaaagca agtaaaacct ctacactgac 3960 ggtacgcgtt aacaacaaca attgcattca tttgtagttt caggttcagg gggaggtgtg 4020 ggaggttttt taaagcaagt taaacctcta aaatagtggt acgcgttacc cagctttctt 4080 gtacaaagtg gacccagctt tcttgtacaa agtgggcccc tctccctccc ccccccctaa 4140 cgttactggc cgaagccgct tggaataagg ccggtgtgcg tttgtctata tgttattttc 4200 caccatattg ccgtcttttg gcaatgtgag ggcccggaaa cctggccctg tcttcttgac 4260 gagcattcct aggggtcttt cccctctcgc caaaggaatg caaggtctgt tgaatgtcgt 4320 gaaggaagca gttcctctgg aagcttcttg aagacaaaca acgtctgtag cgaccctttg 4380 caggcagcgg aaccccccac ctggcgacag gtgcctctgc ggccaaaagc cacgtgtata 4440 agatacacct gcaaaggcgg cacaacccca gtgccacgtt gtgagttgga tagttgtgga 4500 aagagtcaaa tggctctcct caagcgtatt caacaagggg ctgaaggatg cccagaaggt 4560 accccattgt atgggatctg atctggggcc tcggtgcaca tgctttacat gtgtttagtc 4620 gaggttaaaa aaacgtctag gccccccgaa ccacggggac gtggttttcc tttgaaaaac 4680 acgatgataa tatggccaca accatggcca ccgtgctggc ccccgcctgg agccccacca 4740 cctacctgct gctgctgctg ctgctgagca gcggcctgag cggcggcggc ggcagcggca 4800 agcccatccc caaccccctg ctgggcctgg acagcaccgg cggcggcggc agccaggtga 4860 agctgcagga gagcggcccc ggcctggtgg cccccagcca gagcctgagc atcacctgca 4920 ccgtgagcgg cttcagcctg accgcctacg gcgtggactg ggtgagacag ccccccggca 4980 agtgcctgga gtggctgggc gtgatctggg gcggcggcag aaccaactac aacagcggcc 5040 tgatgagcag actgagcatc agaaaggaca acagcaagag ccaggtgttc ctgaccatga 5100 acagcctgca gaccgacgac accgccaagt actactgcgt gaagcacacc aactgggacg 5160 gcggcttcgc ctactggggc cagggcacca ccgtgaccgt gagcagcggc ggcggcggca 5220 gcggcggcgg cggcagcggc ggcggcggca gcggcagccc cggccagagc gtgagcatca 5280 gctgcagcgg cagcagcagc aacatcggca acaactacgt gtactggtac cagcacctgc 5340 ccggcaccgc ccccaagctg ctgatctaca gcgacaccaa gagacccagc ggcgtgcccg 5400 acagaatcag cggcagcaag agcggcacca gcgccagcct ggccatcagc ggcctgcaga 5460 gcgaggacga ggccgactac tactgcgcca gctgggacga cagcctggac ggccccgtgt 5520 tcggctgcgg caccaagctg accgtgctgc ccaccaccac ccccgccccc agacccccca 5580 cccccgcccc caccatcgcc agccagcccc tgagcctgag acccgaggcc tgcagacccg 5640 ccgccggcgg cgccgtgcac accagaggcc tggacttcgc ctgcgacatc tacatctggg 5700 cccccctggc cggcacctgc ggcgtgctgc tgctgagcct ggtgatcacc ctgtactgca 5760 accacagaaa cagaagaaga gtgtgcaagt gccccagacc cgtggtgaag agcggcgaca 5820 agcccagcct gagcgccaga tacgtgtaac aactttatta tacatagttg atcaattcca 5880 actttattat acatagttga tcaattccga taatcaacct ctggattaca aaatttgtga 5940 aagattgact ggtattctta actatgttgc tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt 6000 aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg tatggctttc attttctcct ccttgtataa 6060 atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt gtggcccgtt gtcaggcaac gtggcgtggt 6120 gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac tggttggggc attgccacca cctgtcagct 6180 cctttccggg actttcgctt tccccctccc tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg 6240 ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc 6300 ggggaagctg acgtcctttc catggctgct cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg 6360 gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct 6420 gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc 6480 cctttgggcc gcctccccgc atcgggaatt cccgcggttc gctttaagac caatgactta 6540 caaggcagct gtagatctta gccacttttt aaaagaaaag gggggactgg aagggctaat 6600 tcactcccaa cgaagacaag atctgctttt tgcttgtact gggtctctct ggttagacca 6660 gatctgagcc tgggagctct ctggctaact agggaaccca ctgcttaagc ctcaataaag 6720 cttgccttga gtgcttcaag tagtgtgtgc ccgtctgttg tgtgactctg gtaactagag 6780 atccctcaga cccttttagt cagtgtggaa aatctctagc agtagtagtt catgtcatct 6840 tattattcag tatttataac ttgcaaagaa atgaatatca gagagtgaga ggaacttgtt 6900 tattgcagct tataatggtt acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc 6960 atttttttca ctgcattcta gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat cttatcatgt 7020 ctggctctag ctatcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc 7080 gcccattctc cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc 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ttgctcacat 9660 gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc 9720 tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga 9780 agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg 9840 gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta 9900 gctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg 9960 aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt acgccaagcg 10020 cgcaattaac cctcactaaa gggaacaaaa gctggagctg caagctt 10067 <210> 54 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> H7 heavy chain leader <400> 54 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Phe Arg Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys <210> 55 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> anti-biotin murine vH with inserted Cys for inter-domain linkage <400> 55 Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly 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cytoplasmic tail (T256A) <400> 59 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 1 5 10 15 Thr Leu Met Ile Ser Arg Ala Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 20 25 30 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 35 40 45 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 50 55 60 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 65 70 75 80 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 85 90 95 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 100 105 110 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 115 120 125 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 130 135 140 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 145 150 155 160 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 165 170 175 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 180 185 190 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> Summary (578 ORF2a) <400> 66 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Phe Arg Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala 20 25 30 Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu 35 40 45 Thr Ala Tyr Gly Val Asp Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Gly Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Ser 65 70 75 80 Gly Leu Met Ser Arg Leu Ser Ile Arg Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln 85 90 95 Val Phe Leu Thr Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Lys Tyr 100 105 110 Tyr Cys Val Lys His Thr Asn Trp Asp Gly Gly Phe Ala Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 130 135 140 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 145 150 155 160 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 165 170 175 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> LC Variable <400> 69 Gly Ser Pro Gly Gln Ser Val Ser Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser 1 5 10 15 Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln His Leu Pro Gly Thr 20 25 30 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Asp Thr Lys Arg Pro Ser Gly Val 35 40 45 Pro Asp Arg Ile Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala 50 55 60 Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser 65 70 75 80 Trp Asp Asp Ser Leu Asp Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 85 90 95 Thr Val Leu <210> 70 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> LC Constant Region 1 <400> 70 Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 1 5 10 15 Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp 20 25 30 Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro 35 40 45 Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn 50 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Synthetic polypeptide <220> <223> Summary (144 ORF3a) <400> 77 Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile 1 5 10 15 Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His 20 25 30 Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp 35 40 45 Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Met Phe 50 55 60 Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys 65 70 75 80 Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met 85 90 95 Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser 100 105 110 Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys 115 120 125 Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu 130 135 140 <210> 78 <211> 236 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> Summary (236 ORF3b) <400> 78 Met Ala Thr Val Leu Ala Pro Ala Trp Ser Pro Thr Thr Tyr Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Leu Ser Ser 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> Synthetic peptide <400> 101 Gln Met Gln Gly Val Asn Cys Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 102 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> CpG <220> <221> modified_base <222> (1)..(2) <223> g-phosphorothioate <220> <221> modified_base <222> (25)..(29) <223> g-phosphorothioate <400> 102 ggaaccgtat cggcgatatc ggttgggggg 30 <210> 103 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> CpG <220> <221> modified_base <222> (1)..(2) <223> g-phosphorothioate <220> <221> modified_base <222> (25)..(29) <223> g-phosphorothioate <400> 103 ggaaccgtat gcggcatatc ggttgggggg 30 <210> 104 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> Synthetic peptide <400> 104 Val Arg Ser Ser Ser Arg 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Claims (22)

1. 동종 종양 세포 백신으로서,
   (1) 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 살아있는 증식-불능 유전적으로 조작된 종양 세포의 모집단으로서, 상기 모집단이 적어도 3개의 안정적으로 발현된 면역조절 분자로서, 상기 적어도 3개의 면역조절 분자가 발현된 면역조절 분자에 반응하여 증식한 다음, 종양 세포의 사멸을 위한 효과기 단계로 들어가도록 PBMC의 하나 이상의 하위집합을 유도하기 위한, OX40 리간드(OX40L), CD27 리간드(CD70) 및 CD80, CD86, 또는 둘 다를 포함하는 CD28 리간드(CD28L)를 포함하고;
   상기 PBMC 세포의 하위집합이 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 포함하는, 모집단; 및
   (2) 약학적으로 허용가능한 담체
   를 포함하는, 동종 종양 세포 백신.
2. 제1항에 있어서,
   (a) 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 살아있는 증식-불능 유전적으로 조작된 종양 세포의 모집단이 R¹ - R⁴⁴로부터 선택된 하나 이상의 추가의 안정적으로 발현된 면역조절 분자를 추가로 포함하거나; 또는
   (b) 방사선 조사에 의해 종양 세포가 증식 불능화되거나; 또는
   (c) 종양 세포가 흑색종, 결장직장 암종, 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 전립선암, 두경부암, 편평세포암종, 설암, 후두암, 편도암, 하인두암, 비인두암, 유방암, 결장암, 폐암, 췌장암, 교모세포종 및 뇌암으로 구성된 군으로부터 선택된 암으로부터 유래되거나; 또는
   (d) 살아있는 증식-저항성 종양 세포의 모집단이 대상체로부터 유래된 생물학적 샘플로부터 유래되거나; 또는
   (e) 살아있는 증식 저항성 종양 세포의 모집단이 종양 세포주로부터 유래되거나; 또는
   (f) 면역자극 분자가 유전적으로 조작된 종양 세포의 외부 표면에 존재하거나; 또는
   (g) T-림프구의 유도가 T 림프구의 하위집합의 활성화, T 림프구의 확장, 또는 둘 다를 포함하거나; 또는
   (h) NK 세포의 유도가 NK 세포의 하위집합의 활성화, NK 세포의 하위집합의 확장, 또는 둘 다를 포함하거나; 또는
   (i) DC의 하위집합의 유도가 DC의 하위집합의 활성화, DC의 하위집합의 확장, 또는 둘 다를 포함하거나; 또는
   (j) B 림프구의 하위집합의 유도가 B 림프구의 하위집합의 활성화, B 림프구의 하위집합의 확장, 또는 둘 다를 포함하는, 동종 종양 세포 백신.
3. 제1항에 있어서,
   (a) T 림프구의 하위집합이 CD8+ 세포독성 T-림프구(CTL)의 하위집합을 포함하거나; 또는
   (b) T 림프구의 하위집합이 기억 T 세포의 하위집합을 포함하거나; 또는
   (c) T 림프구의 하위집합이 조절 T 세포의 하위집합을 포함하거나; 또는
   (d) T 림프구의 하위집합이 헬퍼 T 세포의 하위집합을 포함하거나; 또는
   (e) B 림프구의 하위집합이 기억 B 세포의 하위집합을 포함하는, 동종 종양 세포 백신.
4. 제1항에 있어서,
   (1) 백신은 전신 염증 없이 생체 내에서 표적 종양 항원을 포함하는 종양 세포를 인식하고 이에 대해 작용하는 데 효과적인 세포의 면역 활성화를 증진시키거나; 또는
   (2) 백신은 표적 종양 항원을 포함하는 종양 세포에 대한 종양 미세환경에서 면역억제를 감소시키거나; 또는
   (3) 백신은 표적 종양 항원을 발현하는 종양 세포의 세포 사멸을 증가시키거나; 또는
   (4) 살아있는 증식-저항성 종양 세포의 모집단이 전신 염증 없이 면역 활성화를 이끌어내거나; 또는
   (5) 백신이 위약 대조군에 비해 무진행 생존, 전체 생존, 또는 둘 다를 개선시키는 면역 반응을 유도하는, 동종 종양 세포 백신.
5. 제2항에 있어서, 상기 흑색종 종양 세포는 gp100, 티로시나제, Melan-A, 티로시나제-연관 단백질(TRP-2-INT2), 흑색종 항원-1(MAGE-A1), NY-ESO-1, 우선적으로 발현되는 흑색종 항원(PRAME) CDK4 및 다발성 골수종 암유전자 1(MUM-1) 중 하나 이상의 발현에 의해 특성화되는, 동종 종양 세포 백신.
6. 제2항에 있어서, 상기 결장직장암 종양 세포는 암배아 항원(CEA), MAGE, HPV, 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT), EPCAM, PD-1, PD-L1, p53, 및 세포 표면-연관 뮤신 1(MUC1) 중 하나 이상의 발현에 의해 특성화되는, 동종 종양 세포 백신.
7. 제2항에 있어서, 상기 R¹ - R⁴⁴로부터 선택된 하나 이상의 추가의 안정적으로 발현된 면역조절 분자는 사이토카인, TNF-패밀리 구성원, 분비된 수용체, 샤페론, IgG 슈퍼패밀리 구성원 및/또는 케모카인 수용체인, 동종 종양 세포 백신.
8. 제1항에 있어서,
   살아있는 종양 세포의 모집단을 포함하는 동종 모 종양 세포주를 제공하는 단계;
   OX40 리간드(OX40L)인 안정적으로 발현된 면역조절 분자를 인코딩하는 외인성 핵산을 살아있는 종양 세포의 모집단에 도입하는 단계;
   CD27 리간드(CD70)인 안정적으로 발현된 면역조절 분자를 인코딩하는 외인성 핵산을 살아있는 종양 세포의 모집단에 도입하는 단계;
   CD80, CD86, 또는 둘 다를 포함하는 CD28 리간드(CD28L)인 안정적으로 발현된 면역조절 분자를 인코딩하는 외인성 핵산을 살아있는 종양 세포의 모집단에 도입하는 단계로서; OX40 리간드(OX40L), CD27 리간드(CD70) 및 CD80, CD86, 또는 둘 다를 포함하는 CD28 리간드(CD28L)의 안정적인 발현이, PBMC의 하나 이상의 하위집합이 발현된 면역조절 분자에 반응하여 증식한 다음, 종양 세포의 사멸을 위한 효과기 단계로 들어가도록 유도하는, 단계;
   면역조절 분자의 외인성 하위집합의 면역원성 양을 안정적으로 발현하는 종양 세포 클론을 선택함으로써 종양 세포주 변이체를 생성하는 단계; 및
   혼합 림프구 종양 세포 반응에서 세포 증식, 세포 하위집합 분화, 사이토카인 방출 프로파일 및 종양 세포 용해로부터 선택되는 매개변수 중 하나 이상에 의해 클론 유래 세포주 변이체를 선택하는 단계로서; 선택된 클론 유래 세포주 변이체가 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상의 활성화를 자극하는데 효과적인, 단계
   를 포함하는 방법에 의해 생산되는, 동종 종양 세포 백신.
9. 제8항에 있어서, R¹ - R⁴⁴로부터 선택되는 하나 이상의 안정적으로 발현되는 면역조절 분자를 인코딩하는 외인성 핵산을 살아있는 종양 세포의 모집단에 도입하는 단계를 추가로 포함하는 방법에 의해 생산되는, 동종 종양 세포 백신.
10. 제8항에 있어서,
    (a) 종양 세포는 방사선 조사에 의해 증식 불능화되거나; 또는
    (b) 모 종양 세포주는 흑색종 또는 결장직장 암종으로부터 유래되거나; 또는
    (c) 외인성 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함하거나; 또는
    (d) 도입 단계는 바이러스 형질도입을 포함하거나; 또는
    (e) 도입 단계는 전기천공을 포함하거나; 또는
    (f) 도입 단계는 리포솜 매개 전달, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스, 레트로바이러스 기반 벡터, 리포펙션 및 렌티바이러스 벡터 중 하나 이상을 이용하는 것을 포함하거나; 또는
    (g) 도입 단계는 렌티바이러스 벡터의 형질감염에 의해 외인성 핵산을 도입하는 것을 포함하는 방법에 의해 생산되는, 동종 종양 세포 백신.
11. 대상체에서 암에 대한 면역 반응을 유도하는 방법으로서,
    (a) (1) 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 살아있는 증식-불능 유전적으로 조작된 종양 세포의 모집단으로서, 상기 모집단이 적어도 3개의 안정적으로 발현된 면역조절 분자를 포함하며, 적어도 3개의 면역조절 분자가 OX40 리간드(OX40L), CD27 리간드(CD70) 및 CD80, CD86, 또는 둘 다를 포함하는 CD28 리간드(CD28L)인, 모집단, 및 (2) 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 동종 종양 세포 백신을 종양에 비경구로 또는 국소로 대상체에게 투여하는 단계;
    (b) 발현된 면역조절 분자에 반응하여 증식한 다음, 종양 세포의 사멸을 위한 효과기 단계로 들어가도록 하나 이상의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 하위집합을 유도하는 단계로서;
    상기 PBMC 세포의 하위집합이 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 포함하고; 그리고
    상기 동종 종양 세포 백신이 대상체의 암에 대해 유형-매칭된, 단계
    를 포함하는, 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 암이 흑색종 또는 결장직장암으로부터 선택되는, 방법.
13. 제11항에 있어서, 상기 대상체가 암으로 진행되는 감염성 바이러스 질환을 앓는, 방법.
14. 제11항에 있어서, 상기 대상체에게 체크포인트 억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
15. 제11항에 있어서, 상기 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 살아있는 증식-불능 유전적으로 조작된 종양 세포의 모집단이 R¹ - R⁴⁴로부터 선택되는 하나 이상의 추가의 안정적으로 발현된 면역조절 분자를 추가로 포함하는, 방법.
16. 제11항에 있어서,
    (a) 살아있는 증식-저항성 종양 세포의 모집단이 대상체로부터 유래된 생물학적 샘플에서 유래되거나; 또는
    (b) 살아있는 증식 저항성 종양 세포의 모집단이 종양 세포주로부터 유래되는, 방법.
17. 대상체의 암을 치료하는 방법으로서, 상기 암이 흑색종 또는 결장직장암이고,
    (a) (1) 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 살아있는 증식-불능 유전적으로 조작된 종양 세포의 모집단; 및 (2) 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 동종 종양 세포 백신을 대상체에게 투여하는 단계로서, 상기 모집단이 적어도 3개의 안정적으로 발현된 면역조절 분자이며, 상기 적어도 3개의 면역조절 분자가 OX40 리간드(OX40L), CD27 리간드(CD70) 및 CD80, CD86, 또는 둘 다를 포함하는 CD28 리간드(CD28L)를 포함하는, 단계, 및
    (b) 발현된 면역조절 분자에 반응하여 증식한 다음, 종양 세포의 사멸을 위한 효과기 단계로 들어가도록 하나 이상의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 하위집합을 유도하는 단계로서;
    상기 PBMC 세포의 하위집합이 위약 대조군에 비해 대상체의 무진행 생존, 전체 생존, 또는 둘 다를 개선하고 대상체의 종양 부하를 감소시키는데 효과적인 양으로 T-림프구, 자연 사멸(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 B 림프구 중 하나 이상을 포함하는, 단계
    를 포함하는, 방법.
18. 제17항에 있어서, 상기 하나 이상의 종양 특이적 항원을 발현하는 살아있는 증식-불능 유전적으로 조작된 종양 세포의 모집단이 R¹ - R⁴⁴로부터 선택되는 하나 이상의 추가의 안정적으로 발현되는 면역조절 분자를 추가로 포함하는, 방법.
19. 제17항에 있어서, 살아있는 증식-불능 유전적으로 조작된 종양 세포의 모집단이 방사선조사에 의해 증식-불능화되는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
20. 제17항에 있어서,
    (a) 살아있는 증식-저항성 종양 세포의 모집단이 대상체로부터 유래된 생물학적 샘플로부터 유래되거나; 또는
    (b) 살아있는 증식 저항성 종양 세포의 모집단이 종양 세포주로부터 유래되는, 방법.
21. 제17항에 있어서, 상기 면역자극 분자가 유전적으로 조작된 종양 세포의 외부 표면에 존재하는, 방법.
22. 제17항에 있어서,
    (a) T-림프구의 유도가 T 림프구의 하위집합의 활성화, T 림프구의 확장, 또는 둘 다를 포함하거나; 또는
    (b) NK 세포의 유도가 NK 세포의 하위집합의 활성화, NK 세포의 하위집합의 확장, 또는 둘 다를 포함하거나; 또는
    (c) DC의 하위집합의 유도가 DC의 하위집합의 활성화, DC의 하위집합의 확장 또는 둘 다를 포함하거나; 또는
    (d) B 림프구의 하위집합의 유도가 B 림프구의 하위집합의 활성화, B 림프구의 하위집합의 확장, 또는 둘 다를 포함하는, 방법.

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