KR20100108524A

KR20100108524A - 변형된 인슐린 폴리펩티드 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20100108524A
Application number: KR1020107013379A
Authority: KR
Inventors: 젠웨이 미아오; 데니스 크라위츠; 바딤 크라이노브; 펭 티안; 비-쳉 심; 릴리안 스키드모어; 푸트남 안나-마리아 에이 헤이스; 닉 크누드센; 마이클 데구즈만
Original assignee: 암브룩스, 인코포레이티드
Priority date: 2007-11-20
Filing date: 2008-11-20
Publication date: 2010-10-07
Also published as: US20100298212A1; WO2009067636A3; CN101918026B; DK2217265T3; MX338336B; KR101656107B1; WO2009067636A2; CA2703830A1; EP2217265B1; AU2008326324B9; IL205579A0; EP2217265A4; US20150299288A1; US8946148B2; IL237314A0; IL205579A; JP2014169313A; AU2008326324B2; JP2011504187A; IL237314A

Abstract

본 발명은 변형된 인슐린 폴리펩티드 및 이의 용도를 제공한다.

Description

변형된 인슐린 폴리펩티드 및 이의 용도{MODIFIED INSULIN POLYPEPTIDES AND THEIR USES}

본 발명은 비천연적으로 코딩된 하나 이상의 아미노산을 이용하여 변형될 수 있는 인슐린 폴리펩티드에 관한 것이다.

현재 당뇨병 환자 수는 전세계적으로 2억 4천 6백만 명이며, 2025년까지 3억 8천만 명이 될 것으로 추산된다(2007년 11월 15일 세계당뇨병연맹(International Diabetes Federation)의 통계). 2형 당뇨병은 선진국의 모든 당뇨병 환자의 약 85% 내지 95%를 차지하며 개발도상국에서는 이보다 훨씬 높은 퍼센트를 나타낸다. 급속히 확산되고 있는 당뇨병의 이러한 특성으로 인해 전세계적으로 환자 수가 계속 증가되고 있는 반면, 이에 대한 일반 공중의 인식은 낮은 편이다.

당뇨병은 오줌 배출량의 초과를 특징으로 하는 질환이다. 가장 흔한 형태의 당뇨병은 진성 당뇨병으로, 이는 인슐린 기능의 장애로 인해 탄수화물을 산화시킬 수 없는 대사 질환이다. 진성 당뇨병은 상승된 혈당과 일시적 케톤산증(episodic ketoacidosis)을 특징으로 한다. 진성 당뇨병의 추가적인 증상으로는 갈증, 당뇨증, 다뇨증, 고지방혈증 및 허기짐 등이 있다. 이를 치료하지 않으면 질병은 치명적인 케톤산증으로 이어질 수 있다. 다른 형태의 당뇨병으로는 요붕증과 불안정형 당뇨병을 포함한다. 요붕증은 항이뇨 호르몬 결핍의 결과이다. 요붕증의 주요 증상(과도한 오줌 배출량)은 물을 재흡수하는 신장의 능력이 쇠퇴함에 따라서 발생한다. 불안정형 당뇨병은 조절하기가 매우 힘이 드는 유형이다. 이것은 저혈당증과 산성증 사이를 오락가락하는 아직 이유가 밝혀지지 않은 증상을 특징으로 한다.

진성 당뇨병을 앓고 있다는 것을 임상적으로 확인하는 기준으로는, (1) 126 mg/dL (7 mmol/L)를 초과하는 공복 혈당 수준(정상 수준은 100 mg/dL (5.6 mmol/L) 이하이어야 함) 또는 (2) 경구 당부하 검사(oral glucose tolerance test, OGTT) 시 두 시점(한번은 당 섭취 후 2시간 이내이어야 함)에서 200 mg/dL (11 mmol/L)를 초과하는 혈당 수준을 나타내는 상태를 포함한다.

당뇨병이 있다는 것을 조기에 진단을 받는다면 혈류 순환 장애로 인한 신부전증, 실명 및 사지 절단과 같은 초기의 좋지 않은 결과를 피할 수 있는 가능성은 더 높아진다. 미국 당뇨병 협회(American Diabetes Association)는 의사에게 경구 당부하 검사(OGTT) 후 환자의 공복 혈당 수준이 100mg/dL를 초과하나 125mg/dL 이하일 경우와 환자의 혈당 수준이 140mg/dL 이상이나 200mg/dL 이하일 경우에 당뇨병 전단계로 고려하여 처방할 것을 권고하는 내용을 논의한 바 있다.

진성 당뇨병은 여러 원인을 가지는 이종성 임상 질환이다. 진성 당뇨병은 주로 특발성과 2차 진성 당뇨병의 두 가지 분류가 존재한다. 특발성 당뇨병은 인슐린 의존성과 인슐린 비의존성의 두 가지 주요 유형으로 나뉜다. 인슐린 의존성 진성 당뇨병(IDDM, 1형 당뇨병으로 지칭하는 경우가 더 흔함)은 인슐린 요법의 부재 하에 케톤산증이 발달된 상태로 정의된다. 1형 당뇨병은 대개 유년기에 발병하는 경우가 많으며(따라서 연소성 발병 당뇨병으로도 불림), 췌장의 β-세포의 자가면역 파괴의 결과이다. 인슐린 비의존성 진성 당뇨병(NIDDM, 2형 당뇨병으로 지칭하는 경우가 더 흔함)은 고혈당증이 지속되나 케톤산증으로 이어지는 경우가 드문 것을 특징으로 한다. 2형 당뇨병은 일반적으로 40세 이후에 나타나기 때문에 더 이상 사용하지는 않지만 성인성 발병 당뇨병이라고 불린다. 2형 당뇨병은 인슐린 작용에 대한 저항성과 인슐린 결핍을 야기하는 유전적 결함에 의해 발병할 수 있다. 2형 당뇨병에는 두 가지 주요 유형이 존재한다: (1) 비만과 관련이 있는 후발성 2형 당뇨병; 및 (2) 비만과 관련이 없는 후발성 2형 당뇨병. 모든 경우는 아니지만 2형 당뇨병이 있는 생명체에 있어서 장기간의 좋지 않은 영향의 대부분은 계속되는 고혈당증에 기인한 것이다. 이러한 이유 때문에, 2형 당뇨병 치료의 주된 목적도 혈당 수준을 감소시키는데 있는 것이다.

인슐린의 주된 기능은 다수의 고혈당증 발생 호르몬들이 연합하여 작용하는 것에 대응하고, 낮은 혈당 수준을 유지하는 것이다. 수많은 고혈당증 호르몬이 존재하기 때문에, 인슐린과 관련된 질환을 치료하지 않고 놔두게 되면 대개는 심각한 고혈당증과 수명 단축으로 이어지게 된다.

인슐린은 글루코스 대사를 조절하는 역할 이외에도, 지질 생성을 촉진하고, 지질 분해를 감쇠시키며 세포 내로 아미노산 수송을 증대시킨다. 또한, 인슐린은 전사를 조절하여, 수많은 mRNA들의 세포 내용물을 변화시킨다. 인슐린은 성장, DNA 합성 및 세포 복제를 촉진시켜 인슐린 유사 성장 인자(IGF)와 릴랙신과 공통으로 지니는 효과를 나타낸다.

발명의 개요

본 발명은 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 경우에 따라 변형되는 인슐린 폴리펩티드를 제공한다. 본 명세서는 일부 실시 양태들을 제공하지만, 이러한 실시 양태들은 본 발명을 예시하기 위한 목적이지 청구범위에 나타난 바와 같이 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석해서는 안 된다.

당뇨병에 걸리지 않은 사람은 췌장에서 낮은(또는 기본) 수준으로 인슐린이 공급된다. 간은 신체가 공복 상태인 경우 신체의 각 부분에 당을 공급한다. 이를 통상 간내 당 생성이라고 일컫는다. 식사를 하게 되면, 높은 수준의 인슐린이 췌장에서 방출된다. 인슐린은 먼저 간에 작용하여 간에서 간내 당 생성을 멈출 것과 식사로 일부 섭취된 당을 흡수할 것을 지시하는 신호를 전달한다. 췌장에서 한 차례 방출된 인슐린의 일부는 간을 통과하여 다른 체내 세포들, 특히 근육과 작용하여 이들에게 당을 흡수하여 사용할 것을 지시하는 신호를 전달하게 된다. 그러나, 당뇨병 환자의 경우에는 췌장과 간에 의해 수행되는 이러한 탠덤 작업이 방해받을 수 있기 때문에, 고혈당증 또는 저혈당증과 이러한 변동과 관련된 단기간 및 장기간의 영향을 받지 않으면서 건강상 허용되는 한계치 내로 당 수준을 유지하도록 도와줄 수 있는 당뇨병 환자를 위한 요법을 제공하는 것이 바람직하다. 따라서, 정상적인 사람의 내인성 인슐린 분비 패턴을 모방하는 것이 인슐린 요법의 오랜 숙원 사업이었다. 인슐린의 일일 생리학적 요구량은 변화하는데, 이는 두 가지 국면으로 나누어볼 수 있다: (a) 식사로 급증한 혈당을 처리하기 위해 한 차례의 인슐린 흐름을 필요로 하는 흡수기 및 (b) 최적의 공복 혈당 유지를 위해서 간내 당 방출을 조절하는데 필요한 후-흡수기. 따라서, 효과적인 요법은 일반적으로 볼루스 주사로 식사 시간 전에 제공되는 속효성 인슐린과 하루에 1회 또는 2회 투여되는 지효성 기본 인슐린의 두 가지 외인성 인슐린을 병용하게 된다.

엘리 릴리(Eli Lilly)에게 권리가 양도된 특허출원(미국 특허공보 20040242460, 참조로서 본원에 포함됨)에서, 지효성인 기본 인슐린 요법으로 사용하기 위한 한 부류의 아실화 인슐린이 개시되었다. 상기 아실화 인슐린은 활성화 지방산 유도체, 정상 인슐린과 특정 인슐린 유도체를 비롯한 단량체성 인슐린의 자유 아미노기(들)을 이용해 선택적으로 아실화하여 제조된다. 유용한 지방산 유도체로는 6개 이상의 탄소 원자 사슬 길이를 갖는 반응성 지방산 유형의 화합물을 포함하며, 특히 사슬 내에 8개 내지 21개의 탄소 원자를 가지는 지방산 유도체를 포함한다. 팔미트산 유도체로 아실화된 모노-아실화된 정상 인간의 인슐린이 특히 유망한 후보 물질이다. 이러한 카테고리 내에 포함되는 인슐린들은 일본특허공보 1-254,699에 기술되어 있다. 본 발명의 실시 양태는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 아실화 인슐린을 제공한다. 본 발명의 추가의 실시 양태는 PEG와 같은 수용성 중합체에 결합된 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 아실화된 인슐린을 포함한다.

본 발명의 실시 양태들에 따른 방법들은 건강한 간(즉, 조절 호르몬인 인슐린의 부재만 아니라면 정상적인 당 수취 및 생성이 가능한 간)을 가진 당뇨병 환자의 혈당 항상성을 회복시켜 줄 수 있다. 본 발명의 방법은 혈당 수준을 조절하기 위해 간을 활성화시킴으로써 진성 당뇨병의 통상적인 치료 방법과 연관된 고혈당증 및/또는 저혈당증을 감소시키거나 제거할 수 있다. 또한, 본 발명의 실시 양태들에 따른 방법들은 통상 진성 당뇨병과 관련이 있는 미세혈관 합병증(예를 들어, 신장해, 망막증 및/또는 신경 장애) 및/또는 대혈관 합병증(예를 들어, 심근 경색 및/또는 뇌졸중)을 전부는 아니더라도 일부 감소시키거나 제거할 수 있다. 게다가, 본 발명의 실시 양태들에 따른 방법들은 인슐린의 말초 정맥 투여(예를 들어, 피하, 폐내, 비강내, 구강, 점액)와 관련이 있는 과인슐린혈증을 감소시키거나 제거할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 실시 양태들에 따른 방법은 간을 활성화하여 그 지방산의 대사를 개선시킴으로써 당뇨병과 관련이 있는 과지질혈증을 감소시키거나 제거할 수 있다. 또한, 간의 적절한 활성화는 다른 간세포, 진성 당뇨병 관련 합병증에 관계된 유전자 조절 대사 경로를 회복시킬 수도 있다.

일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 하나 이상의 번역 후 변형물을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 링커, 중합체 또는 생물학적 활성 분자에 결합된다. 일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 이작용성 중합체, 이작용성 링커 또는 하나 이상의 추가 인슐린 폴리펩티드에 결합되어 있다.

일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다. 일부 실시 양태에서, 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 링커를 갖는 수용성 중합체에 연결되거나 혹은 수용성 중합체에 결합된다. 일부 실시 양태에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 이작용성 중합체이다. 일부 실시 양태에서, 이작용성 중합체는 제2 폴리펩티드에 결합된다. 일부 실시 양태에서, 제2 폴리펩티드는 인슐린 폴리펩티드이다.

일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함하는 수용성 중합체에 결합된 2개 이상의 아미노산을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 아미노산은 비천연적으로 코딩된 아미노산이다.

일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 인슐린, 인슐린 유사체, 인슐린 리스프로, 인슐린 글루리신, 인슐린 디터머 또는 인슐린 글라진 폴리펩티드 중 임의의 한 폴리펩티드에 있어서 다음 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: A 사슬 내에서 1번 위치 앞 (즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 (즉, 단백질의 카르복실 말단) 및 이들의 임의의 조합(서열번호 1, 또는 이에 대응하는 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9 또는 서열번호 11의 아미노산) 및/또는 B 사슬 내에서 1번 위치 앞 (즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 (서열번호 2, 또는 이에 대응하는 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12의 아미노산). 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 인슐린의 다음 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: 1번 위치 앞 (즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111 (즉, 서열번호 13의 단백질의 카르복실 말단 또는 이에 대응하는 서열번호 14의 아미노산). 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 인슐린, 인슐린 유사체, 인슐린 리스프로, 인슐린 글루리신, 인슐린 디터머 또는 인슐린 글라진 폴리펩티드 중 임의의 한 폴리펩티드에 있어서 다음 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: A 사슬 내에서 1, 9, 14, 15 (서열번호 1 또는 이에 대응하는 서열번호 3, 5, 7, 9, 11의 아미노산 위치). 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 인슐린, 인슐린 유사체, 인슐린 리스프로, 인슐린 글루리신, 인슐린 디터머 또는 인슐린 글라진 폴리펩티드 중 임의의 한 폴리펩티드에 있어서 다음 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: B 사슬 내에서 1, 22, 28 (서열번호 2 또는 이에 대응하는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12의 아미노산 위치). 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 인슐린, 인슐린 유사체, 인슐린 리스프로, 인슐린 글루리신, 인슐린 디터머 또는 인슐린 글라진 폴리펩티드 중 임의의 한 폴리펩티드에 있어서 다음 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: A 사슬 내에서 1, 4, 5, 8, 9, 12, 14, 15, 18 (서열번호 1 또는 이에 대응하는 서열번호 3, 5, 7, 9, 11의 아미노산 위치). 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 인슐린, 인슐린 유사체, 인슐린 리스프로, 인슐린 글루리신, 인슐린 디터머 또는 인슐린 글라진 폴리펩티드 중 임의의 한 폴리펩티드에 있어서 다음 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: B 사슬 내에서 1, 3, 4, 21, 22, 28, 29 (서열번호 2 또는 이에 대응하는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12의 아미노산 위치).

일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 인슐린 또는 인슐린 유사체의 다음 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: A 사슬 위치 8, 9, 10, 14 (서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11); 사슬 위치 1, 17, 21, 25, 28 (서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12). 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 인슐린의 다음 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: A 사슬 위치 8, 9, 10, 14 (서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11); 사슬 위치 1, 17, 21, 25, 28 (서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12). 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 인슐린 유사체의 다음 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: A 사슬 위치 8, 9, 10, 14 (서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11); 사슬 위치 1, 17, 21, 25, 28 (서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12).

일부 실시 양태에서, 다음의 위치들(이에 제한되지는 않음) 중 하나 이상의 위치의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다: A 사슬 내에서 1번 위치 앞 (즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 (즉, 단백질의 카르복실 말단) 및 이들의 임의의 조합 (서열번호 1 또는 이에 대응하는 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9 또는 서열번호 11의 아미노산) 및/또는 B 사슬 내에서 1번 위치 앞 (즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 (서열번호 2 또는 이에 대응하는 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12의 아미노산). 일부 실시 양태에서, 다음의 위치들(이에 제한되지는 않음) 중 하나 이상의 위치의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다: 1번 위치 앞 (즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111 (즉, 서열번호 13의 단백질의 카르복실 말단 또는 이에 대응하는 서열번호 14의 아미노산). 일부 실시 양태에서, 다음의 위치들(이에 제한되지는 않음) 중 하나 이상의 위치의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다: A 사슬 내에서 1, 4, 5, 8, 9, 12, 14, 15, 18 (서열번호 1 또는 이에 대응하는 서열번호 3, 5, 7, 9, 11의 아미노산). 일부 실시 양태에서, 다음의 위치들(이에 제한되지는 않음) 중 하나 이상의 위치의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다: 사슬 내에서 1, 3, 4, 21, 22, 28, 29 (서열번호 2 또는 이에 대응하는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12의 아미노산).

일부 실시 양태에서, 다음의 위치들(이에 제한되지는 않음) 중 하나 이상의 위치의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다: A 사슬 위치 8, 9, 10, 14 (서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11); 사슬 위치 1, 17, 21, 25, 28 (서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12). 일부 실시 양태에서, 다음의 위치들(이에 제한되지는 않음) 중 하나 이상의 위치의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다: A 사슬 위치 8, 9, 10, 14 (서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11); 사슬 위치 1, 17, 21, 25, 28 (서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12). 일부 실시 양태에서, 다음의 위치들(이에 제한되지는 않음) 중 하나 이상의 위치의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다: A 사슬 위치 8, 9, 10, 14 (서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11); B 사슬 위치 1, 17, 21, 25, 28 (서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12).

일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 인슐린, 인슐린 유사체, 인슐린 리스프로, 인슐린 글루리신, 인슐린 디터머, 또는 인슐린 글라진 폴리펩티드 중 임의의 한 폴리펩티드에 있어서 다음 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: B 사슬 위치 1, 2, 9, 10, 28, 29, 30 (서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12). 일부 실시 양태에서, 다음의 위치들(이에 제한되지는 않음) 중 하나 이상의 위치의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다: B 사슬 위치 1, 2, 9, 10, 28, 29, 30 (서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12).

일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비자연 발생 아미노산은 인슐린, 인슐린 유사체, 인슐린 리스프로, 인슐린 글루리신, 인슐린 디터머, 또는 인슐린 글라진 폴리펩티드 중 임의의 한 폴리펩티드에 있어서 다음 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: A 사슬 21, 또는 B 사슬 위치 1, 10, 13, 16, 28, 29, 31, 또는 32 (즉, 단백질의 카르복실 말단) (서열번호 1 내지 서열번호 12). 일부 실시 양태에서, 다음의 위치들(이에 제한되지는 않음) 중 하나 이상의 위치의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다: A 사슬 21, 또는 B 사슬 위치 1, 10, 13, 16, 28, 29, 31, 또는 32 (즉, 단백질의 카르복실 말단) (서열번호 1 내지 서열번호 12).

일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 인슐린, 인슐린 유사체, 인슐린 리스프로, 인슐린 글루리신, 인슐린 디터머, 또는 인슐린 글라진 폴리펩티드 중 임의의 한 폴리펩티드에 있어서 다음 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: A 사슬 위치 8, 9, 10, 14 (서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11). 일부 실시 양태에서, 다음의 위치들(이에 제한되지는 않음) 중 하나 이상의 위치의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다: A 사슬 위치 8, 9, 10, 14 (서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11).

일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 인슐린, 인슐린 유사체, 인슐린 리스프로, 인슐린 글루리신, 인슐린 디터머, 또는 인슐린 글라진 폴리펩티드 중 임의의 한 폴리펩티드에 있어서 다음 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: B 사슬 위치 17, 21, 25, 28 (서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12). 일부 실시 양태에서, 다음의 위치들(이에 제한되지는 않음) 중 하나 이상의 위치의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다: B 사슬 위치 17, 21, 25, 28 (서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12).

일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 인슐린, 인슐린 유사체, 인슐린 리스프로, 인슐린 글루리신, 인슐린 디터머, 또는 인슐린 글라진 폴리펩티드 중 임의의 한 폴리펩티드에 있어서 다음 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: A 사슬 위치 4, 8, 9, 10, 14, 18, 21 (서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11). 일부 실시 양태에서, 다음의 위치들(이에 제한되지는 않음) 중 하나 이상의 위치의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다: A 사슬 위치 4, 8, 9, 10, 14, 18, 21 (서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11).

일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 인슐린, 인슐린 유사체, 인슐린 리스프로, 인슐린 글루리신, 인슐린 디터머, 또는 인슐린 글라진 폴리펩티드 중 임의의 한 폴리펩티드에 있어서 다음 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: B 사슬 위치 1, 5, 17, 21, 25, 29, 30 (서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12). 일부 실시 양태에서, 다음의 위치들(이에 제한되지는 않음) 중 하나 이상의 위치의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다: B 사슬 위치 1, 5, 17, 21, 25, 29, 30 (서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12).

일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 인슐린의 다음 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: A 사슬 내에서 1번 위치 앞 (즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 (즉, 단백질의 카르복실 말단) 및 이들의 임의의 조합 (서열번호 1) 또는 B 사슬 내에서 1번 위치 앞 (즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 (서열번호 2). 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 인슐린 리스프로의 다음 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: A 사슬 내에서 1번 위치 앞 (즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 (즉, 단백질의 카르복실 말단) 및 이들의 임의의 조합 (서열번호 3) 또는 B 사슬 내에서 1번 위치 앞 (즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 (서열번호 4). 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 인슐린 아스파트의 다음 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: A 사슬 내에서 1번 위치 앞 (즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 (즉, 단백질의 카르복실 말단) 및 이들의 임의의 조합 (서열번호 5) 또는 B 사슬 내에서 1번 위치 앞 (즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 (서열번호 6). 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 인슐린 글루리신의 다음 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: A 사슬 내에서 1번 위치 앞 (즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 (즉, 단백질의 카르복실 말단) 및 이들의 임의의 조합 (서열번호 7) 또는 B 사슬 내에서 1번 위치 앞 (즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 (서열번호 8). 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 인슐린 디터머의 다음 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: A 사슬 내에서 1번 위치 앞 (즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 1O, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 (즉, 단백질의 카르복실 말단) 및 이들의 임의의 조합 (서열번호 9) 또는 B 사슬 내에서 1번 위치 앞 (즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 (서열번호 10). 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 인슐린 글라진의 다음 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: A 사슬 내에서 1번 위치 앞 (즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 (즉, 단백질의 카르복실 말단) 및 이들의 임의의 조합 (서열번호 11) 또는 B 사슬 내에서 1번 위치 앞 (즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 (서열번호 12).

일부 실시 양태에서, 인슐린, 인슐린 리스프로, 인슐린 글루리신, 인슐린 디터머, 또는 인슐린 글라진 폴리펩티드 중 임의의 한 폴리펩티드에 있어서 다음 위치들(이에 제한되지는 않음) 중 하나 이상의 위치의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다: 1번 위치 앞 (즉, N-말단), A 사슬 내에서 1번 위치 앞 (즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 (즉, 단백질의 카르복실 말단) 및 이들의 임의의 조합 (서열번호 1 또는 이에 대응하는 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 또는 서열번호 11의 아미노산) 또는 B 사슬 내에서 1번 위치 앞 (즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 (서열번호 2 또는 이에 대응하는 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12의 아미노산).

일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드의 다음 위치들(이에 제한되지는 않음) 중 하나 이상의 위치의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다: 1번 위치 앞 (즉, N-말단), A 사슬 내에서 1번 위치 앞 (즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 (즉, 단백질의 카르복실 말단) 및 이들의 임의의 조합 (서열번호 1) 또는 B 사슬 내에서 1번 위치 앞 (즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 (서열번호 2). 일부 실시 양태에서, 인슐린 리스프로 폴리펩티드의 다음 위치들(이에 제한되지는 않음) 중 하나 이상의 위치의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다: A 사슬 내에서 1번 위치 앞 (즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 (즉, 단백질의 카르복실 말단) 및 이들의 임의의 조합 (서열번호 3) 또는 B 사슬 내에서 1번 위치 앞 (즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 (서열번호 4). 일부 실시 양태에서, 인슐린 아스파트 폴리펩티드의 다음 위치들(이에 제한되지는 않음) 중 하나 이상의 위치의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다: A 사슬 내에서 1번 위치 앞 (즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 (즉, 단백질의 카르복실 말단) 및 이들의 임의의 조합 (서열번호 5) 또는 B 사슬 내에서 1번 위치 앞 (즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 (서열번호 6). 일부 실시 양태에서, 인슐린 글루리신 폴리펩티드의 다음 위치들(이에 제한되지는 않음) 중 하나 이상의 위치의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다: A 사슬 내에서 1번 위치 앞 (즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 (즉, 단백질의 카르복실 말단) 및 이들의 임의의 조합 (서열번호 7) 또는 B 사슬 내에서 1번 위치 앞 (즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 (서열번호 8). 일부 실시 양태에서, 인슐린 디터머 폴리펩티드의 다음 위치들(이에 제한되지는 않음) 중 하나 이상의 위치의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다: A 사슬 내에서 1번 위치 앞 (즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 (즉, 단백질의 카르복실 말단) 및 이들의 임의의 조합 (서열번호 9) 또는 B 사슬 내에서 1번 위치 앞 (즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 (서열번호 10). 일부 실시 양태에서, 인슐린 글라진 폴리펩티드의 다음 위치들(이에 제한되지는 않음) 중 하나 이상의 위치의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다: A 사슬 내에서 1번 위치 앞 (즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 (즉, 단백질의 카르복실 말단) 및 이들의 임의의 조합 (서열번호 11) 또는 B 사슬 내에서 1번 위치 앞 (즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 (서열번호 12).

일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 인슐린, 인슐린 리스프로, 인슐린 글루리신, 인슐린 디터머, 또는 인슐린 글라진 폴리펩티드 중 임의의 한 폴리펩티드의 다음 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: 28, 36, 76, 80, 107, 108, 111, 8, 15, 19, 36, 42, 46, 48, 49, 80, 108, 111, 113, 155 및 이들의 임의의 조합 (서열번호 1과 서열번호 2; 서열번호 3과 서열번호 4; 서열번호 5와 서열번호 6; 서열번호 7과 서열번호 8; 서열번호 9와 서열번호 10; 또는 서열번호 11과 서열번호 12).

본 발명의 방법은 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 인슐린 유사체의 결정체를 제조하는데 사용될 수 있다. 사노피-아벤티스 도이칠란드 게엠베하(Sanofi-Aventis Deutschland GmbH)에게 권리가 양도된 미국 특허 제7,193,035호(본원에 참조로 포함됨)는 인슐린 유사체의 결정체를 제조하는 방법과 그의 용도를 개시하고 있다.

제형

본 발명을 광범위하게 실시하는 경우를 생각하면, 인슐린, 인슐린 유사체, 아실화 인슐린, 또는 아실화 인슐린 유사체 중 2개 이상의 물질과, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 혼합물의 하나 이상의 성분과의 혼합물을 포함할 수 있는 제형도 고려될 수 있다. 본 발명의 다른 실시 양태에서, 인슐린, 인슐린 유사체, 아실화 인슐린, 또는 아실화 인슐린 유사체 중 2개 이상의 물질과, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 혼합물의 하나 이상의 성분과의 혼합물을 포함할 수 있는 제형은 또한 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산에 결합된 하나 이상의 수용성 중합체를 포함한다.

또한, 본 발명은 제형이 그를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있도록 인슐린 폴리펩티드와 인슐린 유사체가 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 후 혼합되는 이종성 혼합물을 포함할 수 있는데, 여기서 이 제형은 예를 들어, peg화된 B 사슬의 28번 위치에 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 25% 인슐린 폴리펩티드, B 사슬의 10번 위치에, 수용성 중합체에 커플링된 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 25% 인슐린 폴리펩티드 및 비천연적으로 코딩된 아미노산이 인슐린의 B 사슬 (서열번호 2; 다르게는 서열번호 4, 6, 8, 10, 또는 12) 31번 위치에 나타나는 50% 인슐린 폴리펩티드를 포함한다. 인슐린 폴리펩티드가 (1) 서로 다른 크기의 PEG를 가지거나, 혹은 (2) PEG가 서열 상에서 서로 다른 위치에 포함되는 것 등의 다양성을 포함하여, 인슐린 폴리펩티드 변이체의 서로 다른 퍼센트 양의 서로 다른 혼합물이 존재한다. 이러한 사실은 예시를 든 것일 뿐이고, 본 발명에 의해 제조될 수 있는 제형의 종류를 제한하는 것이라 이해해서는 안 될 것이며, 당업자라면 이러한 사실들을 명백히 알 수 있을 것이다. 추가의 실시 양태에서, 제형 혼합물 내에 포함시킬 인슐린 폴리펩티드 변이체는 다양한 해리 시간을 갖는 것들 중에서 적절히 선택될 것이어서, 본 제형을 필요로 하는 환자에게 인슐린이 서서히 방출될 수 있게끔 해 줄 것이다.

본 발명의 제형은 글루카곤을 포함할 수 있다.

흡입용 제형을 포함하는 본 발명의 다른 실시 양태

본 발명의 추가의 실시 양태에서, 폐로 투여한 후 6시간 이상 동안, 보다 구체적으로는 8, 10, 12, 14, 18, 24시간 이상 또는 이를 초과하는 시간 동안 지속되어 혈액 내 상승된 인슐린 수준을 유도하는 것으로서, 환자에게 사용하기 위해 강화된 약물 동태학적 특성 및 약력학적 특성을 보유하도록 본원에 개시된 인슐린 유사체 제조 기술을 이용하는 것이 가능하다. 본 발명의 다른 실시 양태에서, 흡입제로서 환자에게 투여하도록 고안된 치료 제형에 적합하여 유리한 인슐린 유사체의 혼합물도 가능하다.

본 발명의 일부 실시 양태에서, 본래의 인슐린 분자 내의 다음의 부위는 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환될 수 있으며, 선택적으로는 PEG와 같은 수용성 중합체와의 공유 결합에 의해 추가로 변형시킬 수도 있다: A와 B 사슬의 2개의 C-말단, Arg22B, His1OB, His5A, Glu4A, Glu17A, Glu13B 및 Glu21B.

원래의 인슐린 이외에도, 본 발명은 PEG와 같은 하나 이상의 수용성 중합체 내에 치환 또는 삽입된 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 갖는 비천연 인슐린 폴리펩티드 및 인슐린 유사체를 제공한다. 본 발명의 이러한 실시 양태는 예를 들어, 효소적 분해에 대한 향상된 저항성을 지니는 PEG-인슐린을 형성하기 위해 인슐린 분자 내에 추가적인 사용자 위주로 설정된 peg화 부위를 도입하는데 특히 유용하다. 이러한 접근법은 활성, 안정성, 가용성 및 약리학적 특성이 바람직하게 균형잡힌 최적화된 인슐린 콘쥬케이트를 고안하는데 있어 보다 더 융통성을 발휘할 수 있게 해준다. 인슐린 분자 내에서는 임의의 번호 위치에서 돌연변이 변형, 즉 부위 특이적 돌연변이 생성법을 수행할 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 PEG는 선형, Y형(포크형), 분지형, 아령형 등의 다양한 구조를 가질 수 있다. 보통, PEG는 인슐린 분자 상의 목적하는 부위(들)을 커플링하기에 적절한 활성화기를 이용하여 활성화된다. 활성화된 PEG는 그 말단에 인슐린과 반응하기 위한 반응성기를 보유하게 될 것이다. 대표적인 활성화 PEG 유도체 및 인슐린과 같은 약물에 이러한 제제를 접합시키기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 문헌 [Zalipsky, S., et al., Use of Functionalized Poly(Ethylene Glycols) for Modification of Polypeptides", Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris, Plenus Press, New York (1992)] 및 [Advanced Drug Reviews, 16:157-182 (1995)]에도 기술되어 있다.

본 발명의 한 실시 양태에서, 접합체(콘쥬게이트)의 PEG 부분은 중합체 혹은 중합체-인슐린 접합체의 수용성의 특성을 현저히 변화시키기에 효과적인 하나 이상의 친유성기가 존재하지 않는다. 다시 말해, 본 발명의 접합체에 있어서 중합체 또는 인슐린이 아닌 부분은 친수성이기보다는 친유성인 원자의 군(예를 들어, 약 2개 내지 8-12개의 탄소 원자를 갖는 탄소 사슬)을 포함할 수 있지만, 이러한 군(들)의 존재가 중합체 또는 접합체의 친수성 특성을 현저히 변화시키기에 효과적이지 않은 경우, 이러한 부분이 본 발명의 접합체 내에 포함될 수 있다. 즉, 인슐린, 인슐린 폴리펩티드 및 인슐린 유사체의 부위 특이적 돌연변이를 통해서, 본 발명의 인슐린 접합체는 그 자체가 친유성 혹은 양친매성 이기보다는 친수성을 나타낼 수 있다. 친유성 부분이 존재할 수 있는 본 발명의 특정 실시 양태에서, 이러한 친유성 부분은 PEG 사슬의 말단에 위치하지 않는 것이 좋다.

본 발명의 접합체에서 사용하기 위한 분지형 PEG는 국제특허공보 WO 96/21469(이 문헌의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨)에 기술된 것들을 포함한다. 일반적으로, 분지형 PEG는 화학식 R(PEG--OH)_n으로 나타낼 수 있으며, 여기서 R은 중심 "코어" 분자를 나타내고, n은 암(arm)의 수를 나타낸다. 분지형 PEG는 중심 코어를 가지며 여기로부터 2개 이상의 "PEG" 암이 신장되는 형태다. 분지형 형태에서는, 분지형 중합체 코어는 인슐린에 부착하기 위한 단일 반응성 부위를 가지고 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 분지형 PEG는 보통 4개 보다 적게 PEG 암을 포함하게 될 것이고, 보다 바람직하게는 3개 보다 적게 PEG 암을 포함할 것이다. 분지형 PEG는 그에 대응하는 선형 PEG보다 더 크고 보다 밀도 있는 중합체 구름으로 커플링된 단일 반응성 부위를 가지는 장점을 제공한다. 분지형 PEG의 한 구체적인 유형은 (MeO-PEG-)_pR-X로 나타낼 수 있는데, 여기서 p는 2 또는 3이고, R은 2개 또는 3개의 PEG 암이 부착된 리신 또는 글리세롤과 같은 중심 코어 구조이며, X는 인슐린에 커플링되기 위해 활성화되거나 활성화될 수 있는 임의의 적절한 작용기를 나타낸다. 특히 바람직한 분지형 PEG는 mPEG2-리신-숙신이미드 구조를 가지는 mPEG2-NHS (미국 알라바마주 소재의 쉐어워터 코포레이션(Shearwater Corporation) 제조)이다.

또 다른 분지형 구조물로서, "펜던트 PEG"는 PEG 사슬의 말단보다 PEG 백본을 따라 위치하는 단백질 커플링을 위한 반응성 기를 가진다. 인슐린에 커플링하기 위해 PEG 백본으로부터 신장된 반응성 기들은 동일하거나 서로 다를 수 있다. 펜던트 PEG 구조는 유용할 수는 있으나, 일반적으로는 그다지 바람직하지 못한데, 특히 흡입용 조성물에 있어서 그렇다.

다르게는, PEG-인슐린 접합체의 PEG 부분은 중합체 사슬의 한 말단에 분지형 부분과 이러한 분지형 부분에 인슐린과의 부착을 위해 연결된 2개의 자유 반응성 기(또는 임의의 2의 배수)를 가지는 포크형 구조를 보유할 수 있다. 대표적인 포크형 PEG에 대해서는 국제특허공보 WO 99/45964(이 문헌의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 기술되어 있다. 포크형 폴리에틸렌 글리콜은 임의로 중합체 사슬의 맞은편 말단에 알킬기 즉 "R"기를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명에 따른 포크형 PEG-인슐린 접합체는 화학식 R-PEG-L(Y-인슐린)_n의 구조를 가지며, 여기서 R은 알킬이고, L은 수분에 대해 안정한 분지점이며, Y는 인슐린에 대한 포크형 중합체의 화학 결합을 제공하는 연결기이고, n은 2의 배수이다. L은 "-CH-"와 같은 단일 "코어"기를 나타낼 수 있거나, 또는 원자들의 긴 사슬을 포함할 수 있다. 대표적인 L기로서는 리신, 글리세롤, 펜타에리트리톨 또는 소르비톨을 포함한다. 통상, 분지형 기 내의 특정 분지 원자는 탄소이다.

본 발명의 한 특정 실시 양태에서, 인슐린 분자에 대한 포크형 PEG의 결합 (Y)는 수분에 대해 안정하다. 바람직한 실시 양태에서, n은 2이다. 인슐린 상의 반응성 부위와의 콘쥬게이션(접합) 이전에 적절한 Y 부분으로서는 이에 제한되지는 않지만, 활성 에스테르, 활성 카르보네이트, 알데하이드, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 에폭시드, 알콜, 말레이미드, 비닐술폰, 히드라지드, 디티오피리딘 및 요오도아세트아미드를 포함한다. 활성화 기는 인슐린 분자 상에 부착하려는 부위에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 당업자라면 쉽게 결정할 수 있다. 생성된 PEG-인슐린 접합체 내에 해당 Y기는 활성화된 포크형 중합체와 인슐린 상의 적절한 반응성 부위와의 반응한 결과로 형성된 것이다. 이러한 최종 결합의 개별적 확인은 당업자에게는 명백할 것이다. 예를 들어, 반응성인 포크형 PEG가 숙신이미드 또는 말레이미드 에스테르와 같은 활성 에스테르를 포함하는 경우, 인슐린 상의 아민 부위를 통한 접합은 이에 상응하는 아미드 결합의 형성을 유도할 것이다. 이러한 특정 포크형 중합체는 인슐린:PEG 몰비가 2:1 이상인 접합체를 제공하기 때문에 특히나 매력이 있다. 이러한 접합체는 예컨대 인슐린 분해 효소에 의한 효소적 분해에 대하여 인슐린을 보호할 목적으로 고안되어 취급이 용이한 유연성을 제공하면서도, 인슐린 수용체 부위를 차단하는 성질도 덜할 것이다.

관련 실시 양태에서, 화학식 R-[PEG-L(Y-인슐린)₂]_n으로 표현되는 포크형 PEG-인슐린 접합체가 사용될 수 있다. 이 경우, R은 하나 이상의 PEG-디-인슐린 접합체가 부착된 비천연적으로 코딩된 아미노산을 나타낸다. 구체적으로, 이러한 본 발명의 측면에 따른 바람직한 포크형 중합체는 n이 1, 2, 3, 4, 5 및 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것들이다. 다른 실시 양태에서, 인슐린, 인슐린 폴리펩티드, 또는 인슐린 유사체 내의 비천연 아미노산과 중합체 분지점과의 화학 결합은 분해될 수 있다(즉, 수분에 대해 불안정함). 다르게는, 하나 이상의 분해가능한 결합은 중합체 백본 내에 포함되어 처음에 투여된 접합체에서 보다 더 작은 PEG 사슬을 갖는 PEG-인슐린 접합체의 생체 내 생성을 가능하게 한다. 예를 들어, 크고 상대적으로 불활성인 접합체(즉, 여기에는 하나 이상의 고분자량의 PEG 사슬, 예를 들어, 약 10,000 초과의 분자량을 갖는 하나 이상의 PEG 사슬이 부착되는데, 이 접합체는 본래 생물활성을 보유하고 있지 않다)가 투여될 수 있는데, 이것은 폐 또는 혈류 내에서 가수분해되어 원래 존재하는 PEG 사슬의 한 부분을 보유하는 생물 활성 접합체를 생성하게 된다. 가수분해 가능한 결합이 생체 내에서 분해될 때, 자유 인슐린 (분해가능한 결합의 위치에 따라 다름) 또는 작은 폴리에틸렌 태그가 부착된 인슐린이 방출되어 폐를 통해 보다 쉽게 흡수되고/되거나 혈액 내에서 순환하게 된다.

본 발명의 이러한 실시 양태의 한 특징에서, 가수분해 이전의 온전한 중합체-접합체는 투여시 최소한으로 분해되기 때문에, 온몸으로 순환하기 이전에 인슐린의 효소적 분해와는 대조적으로 이러한 절단가능한 결합의 가수분해는 혈류 내로 활성 인슐린의 느린 방출 속도를 제어하는데 효과적이다.

생리학적으로 절단가능한 적절한 결합으로서는, 이에 제한되지는 않지만, 에스테르, 카르보네이트 에스테르, 카르바메이트, 설페이트, 포스페이트, 아실옥시알킬 에테르, 아세탈 및 케탈을 포함한다. 이러한 접합체는 저장 및 투여시 안정한 생리학적으로 절단가능한 결합을 보유하여야 한다. 예를 들어, PEG-절단가능 결합-인슐린 접합체는 최종 약학 조성물의 제조시, 적절한 전달 비히클이 사용되는 경우 그 비히클 내에 해리시, 그리고 투여시(어떤 경로든 간에) 그 온전함을 유지해야만 한다.

단일 사슬 인슐린

말초 인슐린 저항성에 초점을 맞추는 경우에는, 인슐린 민감성 제제의 한 유형인 티아졸리딘디온 약물을 선택한다. 예를 들어, 트로글리타존(TRG)은 티아졸리딘디온 화학 계열의 경구 활성 항당뇨제이다. 이 약물은 NIDDM과 내당능장애에 걸린 환자에 있어서 인슐린 저항성을 역전시켜서, 다양한 유전적 및 후천적 인슐린 저항성을 갖는 설치류 모델에 있어서 인슐린 작용을 향상시킬 수 있음이 밝혀졌다. TRG의 항고혈당 효과는 인슐린 의존성 당 처리를 증가시키고 간내 당 생성을 감소시키는 TRG의 능력으로부터 발생한다. TRG 치료는 인슐린 작용을 향상시킴으로써 인슐린 수준이 낮게 순환하는 곳에서 정상 혈당 수준을 유도하는 것으로 보인다. 이와 관련하여, 정상인 설치류와 인간 그리고 당뇨병이 있는 설치류와 인간에 대한 연구에서, 임상 실험을 통해서는 티아졸리딘디온 요법의 합병증으로서 저혈당증은 나타나지 않았다. 반면, 정상 동물 또는 인슐린이 부족한 동물에 이러한 약물을 투여했을 때에는 비록 인슐린 민감도가 증가했다 하더라도 혈당 또는 인슐린 또는 당 부하를 변화시키지는 못했다.

인슐린의 두 사슬 구조로 인해 인슐린은 여러 가지 형태를 취할 수 있으며, 여러 연구 결과들에서 보면, 인슐린은 상당한 형태적 변화를 나타내는 경향이 있고, 이러한 변화에 대한 가능성을 제한하면 리간드에 대한 인슐린 수용체의 친화도를 현저히 감소시킨다는 사실을 알 수 있다. 프로인슐린은 본래의 인슐린보다 인슐린 수용체에 대해 100배 더 낮은 친화도를 나타낸다. 또한, 인슐린에서 아미노산 잔기 A1을 차단하게 되면, 수용체 결합이 불량하게 되는 결과를 초래하는데 이것은 인슐린의 A 사슬의 자유 N-말단과 B 사슬의 자유 C-말단이 인슐린 수용체에 대한 결합에 있어서 중요하다는 원리와 일치한다.

인슐린 분자 고유의 물리적 및 화학적 안정성은 진성 당뇨병의 인슐린 요법을 위한 기본적인 조건이다. 이러한 기본적 특성들은 인슐린 제형을 위해서 그리고 적절한 인슐린 투여 방법을 위해서뿐만 아니라, 약학 제제의 유통 기한 및 저장 조건을 위해서는 핵심적인 사항이다. 인슐린 투여를 위해 용액을 사용하게 되면, 인슐린 분자를 복합적 인자들, 예를 들어 고온, 변동성의 기체-액체-고체 인터페이스 및 전단력에 노출시키기 때문에, 이로써 피브릴화와 같은 비가역적인 형태 변화를 야기할 수 있다. 이것은 자동약물주입기(외부에 걸치고 있거나 내부에 이식된)에 있어서 인슐린 용액에 특히 관계된 사항으로, 인슐린 분자는 이러한 인자들뿐만 아니라 장시간 동안 주입기 펌프의 움직임으로 인해 전단력에도 노출된다. 결과적으로, 피브릴화는 인슐린 전달 시스템으로서 자동약물주입기를 사용할 때 특히 우려되는 사항이다. 게다가, 인슐린의 가용성은 다수의 요인들에 의해 영향을 받는 것으로, pH 4.2 내지 6.6 범위에서 깨끗하게 감소됨을 보여준다. pH 침전 영역은 일반적으로 제형 제조에 있어서 제한을 가하게 되지만, 특정 유사체의 개발과 제조에 있어서 의도적으로 사용되기도 하였다.

따라서, 본 발명의 다른 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 단일 사슬 인슐린 또는 단일 사슬 인슐린 유사체 내로 도입된다. 인슐린 활성을 가지는 단일 사슬 인슐린은 EP 1,193,272에 개시되어 있다. 이러한 단일 사슬 인슐린은 5-18번 아미노산에서 변형된 C-펩티드를 가지며, 인슐린 활성을 42%까지 나타내는 것으로 보고되었다. EP 1,193,272는 B30과 A21을 연결하는 하기와 같은 변형된 C-펩티드를 개시하고 있다: Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Lys-Arg, Arg-Arg-Gly-Pro-Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys-Arg, Arg-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg, Arg-Arg-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly, Gly-Gly-Tyr-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg, Arg-Arg-Tyr-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly, Gly-Gly-His-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg 및 Arg-Arg-His-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly. EP 741,188은 10-14개의 아미노산 잔기와 14% 내지 34%의 인슐린 활성 및 연결 펩티드 Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg 및 Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Ala-Pro-Gln-Thr를 가지는 단일 사슬 인슐린을 개시하고 있다. WO 95/16708은 1-15번 아미노산 잔기의 연결 펩티드를 가지며, 이 연결 펩티드 내에 C-말단 아미노산 잔기로서 Lys 또는 Arg가 없는 단일 사슬 인슐린을 개시하고 있다.. WO 95/16708은 C-펩티드 서열 Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Ala-Pro-Gln-Thr 및 Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Ala-Ala-Ala-Pro-Gln-Thr을 개시하고 있다. 이러한 단일 사슬 인슐린은 인슐린 활성을 보유하고 있지만 IGF-1 수용체에 대해서도 꽤 높은 친화도를 가지는 것으로 보고되고 있다.

미국 특허공보 제20070129284호(노보 노르디스크 인코포레이티드(Novo Nordisk, Inc.))는 B 사슬과 A 사슬 사이에 C-펩티드를 도입함으로써 분자적 유연성을 감소시키면서 동시에 피브릴화 경향을 줄이고 pH 침전 영역을 제한하거나 변화시키는 단일 사슬 인슐린 유사체를 개시하고 있다. 노보 노르디스크 인코포레이티드에 의해 개시된 단일 사슬 인슐린의 한 예로서는 연결 펩티드에 의해 연결된 인간 인슐린 또는 유사체 또는 유도체의 B 사슬 및 A 사슬을 포함하는데, 여기서 상기 연결 펩티드는 5-11개의 아미노산 잔기를 가지지만, 단, 상기 연결 펩티드가 2개의 인접하는 기본 아미노산 잔기들을 포함하는 경우에는, B 및/또는 A 사슬 내에 하나 이상의 천연 아미노산 잔기가 또다른 코딩가능한 아미노산 잔기로 치환되거나, A 사슬, B 사슬 또는 연결 펩티드 내의 하나 이상의 리신 잔기가 아실화에 의해 화학적으로 변형되었거나, 혹은 연결 펩티드가 하기의 서열 Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Lys-Arg, Arg-Arg-Gly-Pro-Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys-Arg, Arg-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg, Arg-Arg-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly, Gly-Gly-Tyr-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg, Arg-Arg-Tyr-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly, Gly-Gly-His-Pro-Gly-Λsp-Val-Lys-Arg 또는 Arg-Arg-His-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly 중의 하나가 아니게 된다.

일부 실시 양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 신호 서열에 있어서 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산의 치환, 첨가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 본 명세서 내에 개시된 인슐린 또는 인슐린 유사체 또는 폴리펩티드 중 임의의 하나에 대한 신호 서열에 있어서 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산의 치환, 첨가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 신호 서열에 있어서 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산의 치환, 첨가 또는 결실뿐만 아니라, 본 명세서 내에 개시된 인슐린 또는 인슐린 유사체 또는 폴리펩티드 중 임의의 하나에 대한 신호 서열에 있어서 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산의 치환, 첨가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연 아미노산은 본 명세서 내에 개시된 인슐린 또는 인슐린 유사체 또는 폴리펩티드 중 임의의 하나에 대한 리더 서열 또는 신호 서열에 도입된다.

일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 인슐린 폴리펩티드 수용체 또는 결합 동반체, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 단백질, 폴리펩티드, 소분자 또는 핵산에 대한 인슐린 폴리펩티드의 친화도를 조절하는 치환, 첨가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 치환, 첨가 또는 결실이 없는 해당 인슐린 폴리펩티드의 안정성과 비교했을 때, 인슐린 폴리펩티드의 안정성을 증가시키는 치환, 첨가 또는 결실을 포함한다. 안정성 및/또는 용해도는 당업자에게 공지된 여러 가지 다른 분석법을 사용하여 측정될 수 있다. 이러한 분석법으로서는 이에 제한되지는 않지만 HPLC와 RP-HPLC를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 치환, 첨가 또는 결실이 없는 해당 인슐린 폴리펩티드의 면역원성과 비교했을 때, 인슐린 폴리펩티드의 면역원성을 조절하는 치환, 첨가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 치환, 첨가 또는 결실이 없는 해당 인슐린 폴리펩티드의 혈청 반감기 또는 순환 시간과 비교했을 때, 인슐린 폴리펩티드의 혈청 반감기 또는 순환 시간을 조절하는 치환, 첨가 또는 결실을 포함한다.

일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 치환, 첨가 또는 결실이 없는 해당 인슐린 폴리펩티드의 수용해도와 비교했을 때, 인슐린 폴리펩티드의 수용해도를 증가시키는 치환, 첨가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 치환, 첨가 또는 결실이 없는 해당 인슐린 폴리펩티드의 용해도와 비교했을 때, 숙주 세포 내에서 생성된 인슐린 폴리펩티드의 용해도를 증가시키는 치환, 첨가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 치환, 첨가 또는 결실이 없는 해당 인슐린 폴리펩티드의 발현 또는 합성과 비교했을 때, 숙주 세포 내에서의 인슐린 폴리펩티드의 발현을 증가시키거나 시험관 내에서 인슐린 폴리펩티드의 합성을 증가시키는 치환, 첨가 또는 결실을 포함한다. 이러한 치환을 포함하는 인슐린 폴리펩티드는 작용제 활성을 보유하고 숙주 세포 내에서 발현 수준을 유지하거나 향상시킨다. 일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 치환, 첨가 또는 결실이 없는 해당 인슐린 폴리펩티드의 프로테아제 저항성과 비교했을 때, 인슐린 폴리펩티드의 프로테아제 저항성을 증가시키는 치환, 첨가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 치환, 첨가 또는 결실이 없는 해당 인슐린 폴리펩티드와의 상호작용시 수용체의 활성과 비교했을 때, 인슐린 수용체의 신호 전달 활성을 조절하는 치환, 첨가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 치환, 첨가 또는 결실이 없는 해당 인슐린 폴리펩티드의 결합과 비교했을 때, 수용체와 같은 또다른 분자에 대한 그 결합을 조절하는 치환, 첨가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 치환, 첨가 또는 결실이 없는 해당 인슐린 폴리펩티드의 항바이러스 활성과 비교했을 때, 그의 항바이러스 활성을 조절하는 치환, 첨가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 치환, 첨가 또는 결실이 없는 해당 인슐린 폴리펩티드의 당 대사 활성과 비교했을 때, 그의 당 대사 활성을 향상시키는 치환, 첨가 또는 결실을 포함한다.

일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 치환, 첨가 또는 결실이 없는 해당 인슐린 폴리펩티드의 혼화성과 비교했을 때, 인슐린 폴리펩티드의 약학 보존제(예를 들어, m-크레졸, 페놀, 벤질 알콜)와의 혼화성을 증가시키는 치환, 첨가 또는 결실을 포함한다. 상기 증가된 혼화성은 보존제가 첨가된 약학 제형의 제제가 저장시 단백질의 물리화학적 특성 및 생물학적 활성을 유지하도록 한다.

일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연 아미노산을 갖도록 하나 이상의 조작된 결합을 생성시킬 수 있다. 분자 간 결합은, 이에 제한되지는 않지만, 적절한 조건 하에서 단백질 내에 두 아미노산 간의 반응(하나 또는 두 개의 아미노산 모두는 비천연 아미노산일 수 있음); 적절한 조건 하에 링커, 중합체 또는 다른 분자를 이용한 두 아미노산(각각은 자연적으로 코딩되거나 비천연적으로 코딩될 수 있음)의 반응 등을 비롯하여 여러 가지 방법으로 생성될 수 있다.

일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드 중의 하나 이상의 아미노산 치환은 하나 이상의 자연 발생 또는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 사용하여 이루어질 수 있다. 일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드 중의 아미노산 치환은 자연 발생 또는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 사용하여 이루어질 수 있으나, 단, 하나 이상의 치환은 비천연적으로 코딩된 아미노산을 사용하여 이루어진다. 일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드 중의 하나 이상의 아미노산 치환은 하나 이상의 자연 발생 아미노산을 이용하여 이루어지며, 추가적인 하나 이상의 치환은 비천연적으로 코딩된 아미노산을 이용하여 이루어진다.

일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 카르보닐 기, 아세틸 기, 아미노옥시 기, 히드라진 기, 히드라지드 기, 세미카르바지드 기, 아지드 기 또는 알킨 기를 포함한다.

일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 카르보닐 기를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 다음의 구조를 갖는다.

상기 식 중,

n은 0-10이고, R₁은 알킬, 아릴, 치환된 알킬 또는 치환된 아릴이고, R₂는 H, 알킬, 아릴, 치환된 알킬 및 치환된 아릴이며, R₃은 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 아미노 말단 변형 기이고, R₄는 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 카르복시 말단 변형 기이다.

일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 아미노옥시 기를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 히드라지드 기를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 히드라진 기를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산 잔기는 세미카르바지드 기를 포함한다.

일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산 잔기는 아지드 기를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 다음의 구조를 갖는다.

상기 식 중,

n은 0-10이고, R₁은 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 치환된 아릴이거나 존재하지 않으며, X는 O, N, S이거나 존재하지 않고, m은 0-10이며, R₂는 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 아미노 말단 변형 기이고, R₃은 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 카르복시 말단 변형 기이다.

일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 알킨 기를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 다음의 구조를 갖는다.

상기 식 중,

n은 0-10이고, R₁은 알킬, 아릴, 치환된 알킬 또는 치환된 아릴이며, X는 O, N, S이거나 존재하지 않고, m은 0-10이며, R₂는 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 아미노 말단 변형 기이고, R₃은 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 카르복시 말단 변형 기이다.

일부 실시 양태에서, 폴리펩티드는 인슐린 폴리펩티드 작용제, 부분 작용제, 길항제, 부분 길항제 또는 역작용제이다. 일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드 작용제, 부분 작용제, 길항제, 부분 길항제 또는 역작용제는 수용성 중합체에 결합된 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드 작용제, 부분 작용제, 길항제, 부분 길항제 또는 역작용제는 비천연적으로 코딩된 아미노산 및 번역 후 변형, 링커, 중합체 또는 생물학적 활성 분자를 하나 이상으로 포함한다.

또한, 본 발명은 엄격한 조건 하에서 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12의 인슐린 폴리펩티드를 코딩하는 핵산과 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 또한, 본 발명은 엄격한 조건 하에서 서열번호 1과 2의 인슐린 폴리펩티드를 코딩하는 핵산과 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 또한, 본 발명은 엄격한 조건 하에서 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12에 나타난 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드(들)을 포함하는 단리된 핵산을 제공하는데, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 셀렉터 (selector) 코돈을 포함한다. 또한, 본 발명은 엄격한 조건 하에서 서열번호 1과 2에 나타난 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드(들)을 포함하는 단리된 핵산을 제공하는데, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함한다. 본 발명은 서열번호 1과 2에 나타난 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 또한, 본 발명은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12에 나타난 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 본 발명은 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 갖는 서열번호 1과 2에 나타난 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 또한, 본 발명은 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 갖는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12에 나타난 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 서로 다른 여러 가지 폴리뉴클레오티드들이 본 발명의 임의의 폴리펩티드를 코딩할 수 있다는 사실은 당업자라면 쉽게 알 수 있다.

일부 실시 양태에서, 셀렉터 코돈은 앰버 코돈, 오커 (ochre) 코돈, 오팔 (opal) 코돈, 유니크 코돈, 희귀 코돈, 5-염기 코돈 및 4-염기 코돈으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또한, 본 발명은 수용성 중합체에 결합된 인슐린 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공한다. 일부 실시 양태에서, 이 방법은 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 단리된 인슐린 폴리펩티드를 비천연적으로 코딩된 아미노산과 반응하는 부분을 포함하는 수용성 중합체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드에 혼입되는 비천연적으로 코딩된 아미노산은 20개의 통상적인 아미노산 중 어느 것에도 반응하지 않는 수용성 중합체에 대해 반응성을 나타낸다. 일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드에 혼입되는 비천연적으로 코딩된 아미노산은 20개의 통상적인 아미노산 중 어느 것에도 반응하지 않는 링커, 중합체 또는 생물학적 활성 분자에 대해 반응성을 나타낸다.

일부 실시 양태에서, 수용성 중합체에 결합된 인슐린 폴리펩티드는 카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 인슐린 폴리펩티드를 아미노옥시, 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드 기를 포함하는 폴리(에틸렌 글리콜) 분자와 반응시킴으로써 제조된다. 일부 실시 양태에서, 아미노옥시, 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드 기는 아미드 결합을 통해 폴리(에틸렌 글리콜) 분자에 결합된다. 일부 실시 양태에서, 아미노옥시, 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드 기는 카르바메이트 결합을 통해 폴리(에틸렌 글리콜) 분자에 결합된다.

일부 실시 양태에서, 수용성 중합체에 결합된 인슐린 폴리펩티드는 카르보닐기를 포함하는 폴리(에틸렌 글리콜) 분자를 아미노옥시, 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드 기를 포함하는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드와 반응시킴으로써 제조된다.

일부 실시 양태에서, 수용성 중합체에 결합된 인슐린 폴리펩티드는 알킨 함유 아미노산을 포함하는 인슐린 폴리펩티드를 아지드 부분을 포함하는 폴리(에틸렌 글리콜) 분자와 반응시킴으로써 제조된다. 일부 실시 양태에서, 아지드 또는 알킨 기는 아미드 결합을 통해 폴리(에틸렌 글리콜) 분자에 결합된다.

일부 실시 양태에서, 수용성 중합체에 결합된 인슐린 폴리펩티드는 아지드 함유 아미노산을 포함하는 인슐린 폴리펩티드를 알킨 부분을 포함하는 폴리(에틸렌 글리콜) 분자와 반응시킴으로써 제조된다. 일부 실시 양태에서, 아지드 또는 알킨 기는 아미드 결합을 통해 폴리(에틸렌 글리콜) 분자에 결합된다.

일부 실시 양태에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 약 0.1 kDa 내지 약 100 kDa의 분자량을 갖는다. 일부 실시 양태에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 0.1 kDa 내지 50 kDa의 분자량을 갖는다.

일부 실시 양태에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 분지형 중합체이다. 일부 실시 양태에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분지형 중합체의 각각의 분지는 1 kDa 내지 100 kDa, 또는 1 kDa 내지 50 kDa의 분자량을 갖는다.

일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드에 결합된 수용성 중합체는 폴리알킬렌 글리콜 부분을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드에 혼입되는 비천연적으로 코딩된 아미노산 잔기는 카르보닐 기, 아미노옥시 기, 히드라지드 기, 히드라진, 세미카르바지드 기, 아지드 기 또는 알킨 기를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드에 혼입되는 비천연적으로 코딩된 아미노산 잔기는 카르보닐 부분을 포함하고, 수용성 중합체는 아미노옥시, 히드라지드, 히드라진 또는 세미카르바지드 부분을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드에 혼입되는 비천연적으로 코딩된 아미노산 잔기는 알킨 부분을 포함하고, 수용성 중합체는 아지드 부분을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드에 혼입되는 비천연적으로 코딩된 아미노산 잔기는 아지드 부분을 포함하고, 수용성 중합체는 알킨 부분을 포함한다.

또한, 본 발명은 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 인슐린 폴리펩티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다.

또한, 본 발명은 셀렉터 코돈을 포함하는 인슐린 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 제공한다. 일부 실시 양태에서, 이 세포는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 인슐린 폴리펩티드에 치환시키기 위한 오르소고날 (orthogonal) RNA 합성효소 및/또는 오르소고날 tRNA를 포함한다.

또한, 본 발명은 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 인슐린 폴리펩티드의 제조 방법을 제공한다. 일부 실시 양태에서, 이 방법은 인슐린 폴리펩티드의 발현을 가능하게 하는 조건 하에서 인슐린 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들), 오르소고날 RNA 합성효소 및/또는 오르소고날 tRNA를 포함하는 세포를 배양하는 단계 및 상기 세포 및/또는 배양 배지로부터 인슐린 폴리펩티드를 정제하는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명은 인슐린 폴리펩티드의 치료적 반감기, 혈청 반감기 또는 순환 시간을 증가시키는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 인슐린 폴리펩티드의 면역원성을 조절하는 방법을 제공한다. 일부 실시 양태에서, 이 방법은 자연 발생 인슐린 폴리펩티드에서 임의의 하나 이상의 아미노산을 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환하고(치환하거나), 상기 인슐린 폴리펩티드를 링커, 중합체, 수용성 중합체 또는 생물학적 활성 분자에 결합시키는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명은 유효량의 본 발명의 인슐린 분자를 사용하여 치료를 필요로 하는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시 양태에서, 이 방법은 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 인슐린 폴리펩티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 치료적 유효량의 약학 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다. 일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 글리코실화된다. 일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 글리코실화되지 않는다.

또한, 본 발명은 하나 이상의 아미노산이 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환되는 것을 제외하고, 서열번호 1과 2 또는 임의의 다른 인슐린 폴리펩티드 서열(이러한 비제한적인 예로서는 서열번호 3 내지 12일 수 있음)에 나타난 서열을 포함하는 인슐린 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다. 일부 실시 양태에서, 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 카르보닐 기, 아미노옥시 기, 히드라지드 기, 히드라진 기, 세미카르바지드 기, 아지드 기 또는 알킨 기를 포함한다.

또한, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체 및 서열번호 1 내지 12 또는 임의의 다른 인슐린 폴리펩티드 서열에 나타난 서열을 포함하는 인슐린 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물을 제공하며, 여기서 하나 이상의 아미노산은 비천연적으로 코딩된 아미노산에 의해 치환된다. 또한, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체 및 A와 B 사슬(예를 들어, 서열번호 1과 2는 인슐린을 만들 수 있으며, 서열번호 3과 4는 인슐린 리스프로를 만들 수 있음)의 서열번호 1 내지 12 또는 임의의 다른 인슐린 폴리펩티드 서열에 나타난 서열을 포함하는 인슐린 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물을 제공하며, 여기서 하나 이상의 아미노산은 비천연적으로 코딩된 아미노산에 의해 치환된다. 또한, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체 및 서열번호 1과 2에 나타난 서열을 포함하는 인슐린 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체 및 서열번호 1 내지 12에 나타난 서열을 포함하는 인슐린 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 사카라이드 부분을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 수용성 중합체는 사카라이드 부분을 통해 폴리펩티드에 결합된다. 일부 실시 양태에서, 링커, 중합체 또는 생물학적 활성 분자는 사카라이드 부분을 통해 인슐린 폴리펩티드에 결합된다.

또한, 본 발명은 인슐린 폴리펩티드의 단일 아미노산의 공유 결합에 의해 결합된 수용성 중합체를 포함하는 인슐린 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시 양태에서, 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 수용성 중합체에 공유 결합된 아미노산은 폴리펩티드 중에 존재하는 비천연적으로 코딩된 아미노산이다.

본 발명은 하나 이상의 링커, 중합체 또는 생물학적 활성 분자를 포함하는 인슐린 폴리펩티드를 제공하는데, 여기서 상기 링커, 중합체 또는 생물학적 활성 분자는 폴리펩티드 내에 리보좀으로 통합된 비천연적으로 코딩된 아미노산의 작용기를 통해 폴리펩티드에 부착된다. 일부 실시 양태에서, 폴리펩티드는 모노PEG화 (monoPEGylation)된다. 또한, 본 발명은 폴리펩티드의 기선택된 부위에서 리보좀으로 통합되는 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산에 부착되는 링커, 중합체 또는 생물학적 활성 분자를 포함하는 인슐린 폴리펩티드를 제공한다.

프로인슐린으로 볼 수 있는 예로서 인슐린 리더 또는 신호 서열도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 선택된 이종성 리더 또는 신호 서열은, 예를 들어 숙주 세포 분비 시스템에 의해 인지 및 처리되어서 분비가 되어, 숙주 세포의 신호 펩티다아제에 의해 절단될 수 있는 것이어야 한다. 본 발명의 인슐린 또는 인슐린 폴리펩티드 또는 유사체를 이용하여 질병 또는 장애를 치료하는 방법은 신호 또는 리더 펩티드가 존재하거나 존재하지 않는 인슐린을 이용한 치료를 의미하는 것이다.

또한, 본 발명은 당 대사도의 증가를 유도하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 당 대사 활성의 증가를 유도하기에 효과적인 양의 인슐린을 상기 세포에 투여하는 단계를 포함한다.

또 다른 실시 양태에서, 이에 제한되지는 않지만 PEG를 비롯한 다른 분자에 대한 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 인슐린 폴리펩티드의 접합은 실직적으로 정제된 인슐린을 제공하는데, 이는 비천연 아미노산에 대한 접합을 위해 이용되는 독특한 화학 반응 때문이다. 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 인슐린의 PEG와 같은 다른 분자에 대한 접합은 실질적으로 순수한 인슐린을 제공하기 위해 접합 이전 또는 이후에 수행되는 다른 정제 기법을 사용하여 수행될 수 있다.

도 1은 인슐린의 아미노산 서열을 따라서 나타나는 인슐린의 두 가지 결정 구조 모델을 나타낸 것이다.
도 2는 인슐린의 결정 구조 모델을 나타낸 것이다. 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환하기 위해 선택된 부위들이 나타나 있다.
도 3은 1차적인 프로인슐린을 나타낸 것이다.
도 4는 인슐린, 휴마로그, 노보로그, 글라진 및 디터머를 나타낸 것이다.
도 5는 프로인슐린 발현 플라스미드인 pVK6-LisPro 인슐린과 LisPro 인슐린 삽입체의 서열을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 인슐린 폴리펩티드의 SDS-PAGE 겔 분석을 나타낸 것으로서, 본 발명의 폴리펩티드는 Q15 A 사슬 (서열번호 3), Y14 A 사슬 (서열번호 3), R22 B 사슬 (서열번호 4), F1 B 사슬 (서열번호 4), G1 A 사슬 (서열번호 3), S9 A 사슬 (서열번호 3) 및 K28 B 사슬 (서열번호 4)에서 치환된 것을 포함하며, 이들 각각의 치환은 비천연 아미노산(pAF)으로 이루어진다.
도 7은 PEG화 및 비PEG화된 인슐린 폴리펩티드의 SEC-HPLC를 나타낸 것이다.
도 8은 피치아(Pichia) 내로 클로닝을 위해 사용되는 플라스미드를 그림으로 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 두 인슐린 폴리펩티드인 A14pAF-PEG-A21N과 A14pAF-PEG-A21G에 대한 곡선 아래 면적(Area Under the Curve)의 막대 그래프를 나타낸 것이다.
도 10은 실시예 36에 추가로 논의된 바와 같이, A21G 인슐린 폴리펩티드에 대한 리폴딩(refolding) 반응의 결과의 겔을 나타낸 것이다.
도 11은 QHP 정제되고 리폴딩된 실시예 36의 프로인슐린의 HPLC를 나타낸 것이다.
도 12는 실시예 36에 기술된 PEG화 반응의 HPLC를 나타낸 것이다.

정의

본 발명은 본 명세서에 기재된 특정한 방법론, 프로토콜, 세포주, 구조물 및 시약에 한정되지 않으며, 이러한 것들은 여러 가지로 다양하게 변화될 수 있다는 점을 인식해야 할 것이다. 또한, 본 명세서에 사용된 용어는 오직 특정 실시 양태를 설명하기 위한 목적이지, 본 발명의 범위를 첨부되는 청구 범위에 의해서만 한정하려는 의도가 아님도 이해하여야 할 것이다.

본 명세서와 청구범위에서 사용된 단수 형태의 표현은 달리 명시하지 않는다면 복수의 표현을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "인슐린" 또는 "인슐린 폴리펩티드" 그리고 하이픈이 있거나 없는 다른 여러 언급은 하나 이상의 이러한 단백질들을 지칭하며, 당업자에게 공지된 이의 등가물 등을 포함하는 것이다.

달리 정의되지 않으면, 본 명세서에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당업계의 숙련자에게 공통으로 이해되는 것과 동일한 의미를 지닌다. 비록 본 명세서에 기재된 것들과 유사하거나 또는 동등한 방법, 장치 및 물질들이라면 그 어느 것이라도 본 발명의 실시 또는 시험에 사용할 수 있으나, 바람직한 방법, 장치 및 물질들에 대해서 하기에 기재한다.

본 명세서에 언급된 모든 공보 및 특허는 예를 들어, 여기에 개시된 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 공보에 기술된 구조물과 방법론을 기술하여 개시할 목적으로 본 명세서에 참고 문헌으로 인용된다. 본 명세서에서 논의되는 공보는 오직 본 출원의 출원일 전에 개시된 것들만이 제공된다. 본원에 개시된 것들 중 그 어떤 것이라도, 본 발명자들이 선행 발명에 의해서 또는 어떤 다른 이유 때문에 그 개시 내용을 선행할 자격이 되지 않는다고 인정하는 것으로 이해되어서는 안 될 것이다.

"실질적으로 정제된"이라는 용어는 자연 발생 환경, 즉 본래의 세포에서, 또는 재조합으로 생산된 인슐린 폴리펩티드의 경우는 숙주 세포에서 발견되는 단백질을 정상적으로 동반하거나 또는 그 단백질과 상호작용하는 성분을 실질적으로 또는 기본적으로 함유하지 않을 수 있는 인슐린 폴리펩티드를 지칭한다. 실질적으로 세포성 물질을 함유하지 않을 수 있는 인슐린 폴리펩티드는 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만 또는 약 1% 미만 (건조 중량 기준)의 오염원 단백질을 갖는 단백질 제제를 포함한다. 인슐린 폴리펩티드 또는 그의 변이체가 숙주 세포에 의한 재조합으로 생산되는 경우, 단백질은 세포의 건조 중량의 약 30%, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1% 이하로 존재할 수 있다. 인슐린 폴리펩티드 또는 그의 변이체가 숙주 세포에 의한 재조합으로 생산되는 경우, 단백질은 세포의 건조 중량의 약 5 g/L, 약 4 g/L, 약 3 g/L, 약 2 g/L, 약 1 g/L, 약 750 mg/L, 약 500 mg/L, 약 250 mg/L, 약 100 mg/L, 약 50 mg/L, 약 10 mg/L 또는 약 1 mg/L 이하로 배양 배지 중에 존재할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 생산된 "실질적으로 정제된" 인슐린 폴리펩티드는 SDS/PAGE 분석, RP-HPLC, SEC 및 모세관 전기영동과 같은 적절한 방법에 의해 측정시 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상의 순도, 구체적으로 약 75%, 80%, 85% 이상의 순도, 보다 구체적으로는 약 90% 이상의 순도, 약 95% 이상의 순도, 약 99% 이상의 순도 또는 그 이상의 순도를 가질 수 있다.

"재조합 숙주 세포" 또는 "숙주 세포"라는 용어는 삽입을 위해 사용되는 방법, 예컨대 직접적 섭취, 형질 도입, f-교배, 또는 재조합 숙주 세포를 생성하는 당업계에 공지된 기타 방법들이 무엇이든지 그에 상관없이 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 지칭하는 말이다. 외인성 폴리뉴클레오티드는 통합되지 않은(nonintegrated) 벡터, 예를 들어 플라스미드로서 유지되거나, 또는 다르게는, 숙주 유전체 내로 통합될 수 있다.

본 명세서에 사용된 "배지(들)"이라는 용어는 세균 숙주 세포, 효모 숙주 세포, 곤충 숙주 세포, 식물 숙주 세포, 진핵생물 숙주 세포, 포유류 숙주 세포, CHO 세포, 원핵생물 숙주 세포, 대장균 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 숙주 세포를 비롯한 임의의 숙주 세포 및 세포 함유물을 지지하거나 또는 포함할 수 있는 임의의 배양 배지, 용액, 고체, 반고체 또는 강성 지지체를 포함한다. 따라서, 이 용어는 숙주 세포가 성장하는 배지, 예를 들어 증식 단계 이전 또는 증식 단계 이후 배지를 비롯하여 인슐린 폴리펩티드가 분비되는 배지를 포함할 수 있다. 또한, 이 용어는 예를 들어, 인슐린 폴리펩티드가 세포 내에서 생산되어 숙주 세포가 용해되거나 또는 붕괴되어 인슐린 폴리펩티드를 방출하는 경우와 같이, 숙주 세포 용해물을 함유하는 완충제 또는 시약을 포함할 수 있다.

단백질 리폴딩(refolding)과 관련하여 본 명세서에 사용된 "환원제"라는 용어는 환원 상태의 설프히드릴 기를 유지시키고, 분자 내 또는 분자 간 이황화 결합을 감소시키는 임의의 화합물 또는 물질로 정의된다. 적합한 환원제로서는, 이에 제한되지는 않지만, 디티오트레이톨 (DTT), 2-머캅토에탄올, 디티오에리트리톨, 시스테인, 시스테아민 (2-아미노에탄티올) 및 환원된 글루타티온을 포함한다. 광범위하게 다양한 환원제를 본 발명의 방법 및 조성물에 적합하게 사용할 수 있다는 점은 당업자라면 쉽게 이해할 수 있을 것이다.

단백질 리폴딩과 관련하여 본 명세서에 사용된 "산화제"라는 용어는 산화되는 화합물로부터 전자를 제거할 수 있는 임의의 화합물 또는 물질로 정의된다. 적합한 산화제로서는, 이에 제한되지는 않지만, 산화 글루타티온, 시스틴, 시스타민, 산화 디티오트레이톨, 산화 에리트레이톨 및 산소를 포함한다. 광범위하게 다양한 산화제를 본 발명의 방법 및 조성물에 적합하게 사용할 수 있다는 점은 당업자라면 쉽게 이해할 수 있을 것이다.

본 명세서에 사용된 "변성화제 (denaturing agent)" 또는 "변성제 (denaturant)"라는 용어는 단백질의 가역적인 풀림(언폴딩, unfolding)을 야기하는 임의의 화합물 또는 물질로 정의된다. 변성화제 또는 변성제의 세기는 특정 변성화제 또는 변성제의 특성과 농도 양자 모두에 의해 결정되게 된다. 적절한 변성화제 또는 변성제로서는 케이오트로프 (chaotrope), 계면활성제, 유기 용매, 수혼화성 용매, 인지질, 또는 이러한 제제를 2개 이상으로 조합한 혼합물일 수 있다. 적합한 케이오트로프로서는, 이에 제한되지는 않지만, 우레아, 구아니딘 및 소듐 티오시아네이트를 포함한다. 유용한 계면활성제로서는, 이에 제한되지는 않지만, 강성 계면활성제, 예컨대 소듐 도데실 설페이트, 또는 폴리옥시에틸렌 에테르 (예를 들어, Tween 또는 Triton 계면활성제), 사르코실 (Sarkosyl), 연성인 비이온성 계면활성제 (예를 들어, 디지토닌 (digitonin)), 연성인 양이온성 계면활성제, 예컨대 N->2,3-(디올레이옥시)-프로필-N,N,N-트리메틸암모늄, 연성인 이온성 계면활성제 (예를 들어, 소듐 콜레이트 또는 소듐 데옥시콜레이트) 또는 양성이온성(zwitterionic) 계면활성제, 예컨대 이에 제한하지는 않지만, 설포베타인 (쯔비터젠트 (Zwittergent)), 3-(3-클로라미도프로필)디메틸암모니오-1-프로판 설페이트 (CHAPS) 및 3-(3-클로라미도프로필)디메틸암모니오-2-히드록시-1-프로판 설포네이트 (CHAPSO)를 포함할 수 있다. 유기 수혼화성 용매, 예컨대 아세토니트릴, 저급 알칸올 (특히 C₂-C₄ 알칸올, 예컨대 에탄올 또는 이소프로판올), 또는 저급 알칸디올 (특히, C₂-C₄ 알칸디올, 예컨대 에틸렌-글리콜)이 변성제로서 사용될 수 있다. 본 발명에서 유용한 인지질은 자연 발생 인지질, 예컨대 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린 및 포스파티딜이노시톨 또는 합성 인지질 유도체 또는 이의 변이체, 예를 들어 디헥사노일포스파티딜콜린 또는 디헵타노일포스파티딜콜린일 수 있다.

본 명세서에 사용된 "리폴딩"이라는 용어는 이황화 결합을 함유하는 폴리펩티드가 이황화 결합과 관련해서 부적절하게 접혀(폴딩) 있거나 또는 풀려(언폴딩)있는 상태로부터 본래대로 또는 적절하게 접힌 구조로 변형하게 되는 임의의 과정, 반응 또는 방법을 기술하는 말이다.

본 명세서에 사용된 "코폴딩 (cofolding)"이라는 용어는 서로 상호작용하는 2 개 이상의 폴리펩티드를 사용하여 풀려있거나 또는 부적절하게 접혀있는 폴리펩티드를 본래 적절하게 접힌 폴리펩티드로 변형시키는 리폴딩 과정, 반응 또는 방법을 특별히 지칭한다.

본 명세서에서 사용된 "프로인슐린"이라는 용어는 구조식 B-C-A로 적절히 잡교계된 단백질을 말하며, 상기 구조식 중

A는 인슐린의 A 사슬 또는 이의 기능적 유도체이고;

B는 인슐린의 B 사슬 또는 ε-아미노기를 보유하는 이의 기능적 유도체이며;

C는 프로인슐린의 연결 펩티드이다. 바람직하게는, 프로인슐린은 인간 인슐린의 A 사슬, 인간 인슐린의 B 사슬이며, C는 천연 연결 펩티드이다. 프로인슐린이 천연 서열인 경우, 프로인슐린은 페닐알라닌(1)(α-아미노기), 리신(29)(ε-아미노기) 및 리신(64)(ε-아미노기)의 3개의 자유 아미노기를 보유한다.

본 명세서에 사용된 "인슐린 유사체"라는 용어는 A-B 구조식으로 인슐린 활성을 나타내는 적절히 잡교계된 단백질을 말하며, 상기 구조식 중,

A는 인슐린의 A 사슬 또는 인슐린 A 사슬의 기능적 유도체이고,

B는 인슐린의 B 사슬 또는 ε-아미노기를 보유하는 인슐린 B 사슬의 기능적 유도체이며, A 또는 B 중 적어도 하나는 천연 서열로부터 변형된 아미노산을 포함한다.

본 명세서에서, 인슐린이라는 용어가 복수형 또는 일반적인 의미로서 사용될 때는 언제나 자연 발생 인슐린과 인슐린 유사체 그리고 이의 유도체를 모두 포함하는 것으로 봐야 한다. 본 명세서에서 사용되는 "인슐린 폴리펩티드"라는 용어는 Cys.sup.A7과 Cys.sup.B7, Cys.sup.A20과 Cys.sup.B19 간의 이황화 결합 및 Cys.sup.A6과 Cys.sup.A11 간의 내부 이황화 가교를 포함하여, 인슐린 활성을 보유하는 인간 인슐린의 것과 유사한 분자 구조를 가지는 화합물을 의미한다.

본 명세서에서 "인슐린"이라는 용어는 아미노산 서열과 공간 구조가 잘 알려져 있는 인간 인슐린을 지칭한다. 인간 인슐린은 이황화 결합으로 가교된 21개의 아미노산 A 사슬과 30개의 아미노산 B 사슬로 이루어진다. 적절하게 가교된 인슐린은 A사슬의 7번 위치와 B 사슬의 7번 위치 간의 제1 이황화 결합, A 사슬의 20번 위치와 B 사슬의 19번 위치 간의 제2 이황화 결합 및 A 사슬의 6번과 11번 위치 간의 제3 이황화 결합의 3개의 이황화 결합을 포함한다[Nicol, D.S.H.W. and Smith, L.F., Nature, 187, 483-485 (1960)].

인슐린 펩티드는 이에 제한되지는 않지만, 인슐린, 인간; 인슐린, 돼지; IGF-I, 인간; 인슐린 유사 성장 인자 II (69-84); 프로인슐린 유사 성장 인자 II (68- 102), 인간; 프로인슐린 유사 성장 인자 II (105-128), 인간; [AspB28]-인슐린, 인간; [LysB28]-인슐린, 인간; [LeuB28]-인슐린, 인간; [ValB28]-인슐린, 인간; [AlaB28]-인슐린, 인간; [AspB28, ProB29]-인슐린, 인간; [LysB28, ProB29]-인슐린, 인간; [LeuB28, ProB29]-인슐린, 인간; [ValB28, ProB29]-인슐린, 인간; [AlaB28, ProB29]-인슐린, 인간; [GlyA21]-인슐린, 인간; [GlyA21, GlnB3]-인슐린, 인간; [AlaA21]-인슐린, 인간; [AlaA21, Gln.sup.B3]-인슐린, 인간; [GlnB3]-인슐린, 인간; [GlnB30]-인슐린, 인간; [GlyA21, GluB30]-인슐린, 인간; [GlyA21, GlnB3, GluB30]-인슐린, 인간; [GlnB3, GluB30]-인슐린, 인간; B22-B30 인슐린, 인간; B23-B30 인슐린, 인간; B25-B30 인슐린, 인간; B26-B30 인슐린, 인간; B27-B30 인슐린, 인간; B29-B30 인슐린, 인간; 인간 인슐린의 A 사슬과 인간 인슐린의 B 사슬을 포함한다.

"인슐린 유사체"라는 용어는 인간 인슐린의 A 사슬 및/또는 B 사슬과 각각 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지지만, 인슐린 유사체의 인슐린 활성을 변화시키지 않는 하나 이상의 아미노산 결실, 하나 이상의 아미노산 치환 및/또는 하나 이상의 아미노산 첨가에 의해 인간 인슐린의 A 사슬과 B 사슬과는 다른 A 사슬과 B 사슬을 보유하는 단백질을 의미한다. 인슐린의 등전점보다 "높은" 등전점을 갖는 인슐린 유사체가 인슐린 유사체의 한 종류이다. 다른 유형의 인슐린 유사체는 "단량체성 인슐린 유사체"이다.

"단량체성 인슐린 유사체"는 예를 들어, B28 위치의 Pro이 Asp, Lys, Leu, Val 또는 Ala으로 치환된 인간 인슐린 및 B29 위치의 Lys이 Pro으로 치환된 인간 인슐린을 비롯한 인간 인슐린의 속효성 유사체이다. des(B27) 인간 인슐린으로도 알려진 또다른 단량체성 인슐린 유사체는 B 사슬의 27번 위치의 Thr이 결실된 인간 인슐린이다. 단량체성 인슐린 유사체는 미국 특허 제5,514,646호(Chance, R.E., et al., 1996.5.7); 문헌 [Brems, D.N., et al., Protein Engineering, 5, 527-533 (1992)]; EPO 공보 제214,826호(Brange, J.J.V., et al., 1987.3.18 간행); 및 문헌 [Brange, J.J.V., et al., Current Opinion in Structural Biology, 1, 934-940 (1991)]에 기술되어 있다. 본 발명의 제형에 사용되는 단량체성 인슐린 유사체는 인간 인슐린에서와 동일한 위치에서 적절히 가교된다.

추가의 실시 양태에서, 본 발명은 변이체 단백질을 코딩하는 재조합 핵산, 변이체 핵산을 포함하는 발현 벡터, 상기 변이체 핵산 및/또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포 및 상기 변이체 단백질의 제조 방법을 제공한다. 추가적인 측면으로, 본 발명은 변이체 단백질을 통상 약학적 담체를 이용하여 치료적 유효량으로 환자에게 투여함으로써 인슐린 반응성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 추가적인 측면으로, 본 발명은 MHC 클래스 II 에피토프를 변형시킴으로써 인슐린 폴리펩티드의 면역원성을 조절하는 방법(특히 면역원성을 감소시키는 방법)을 제공한다.

또한, "인슐린 폴리펩티드"라는 용어는 약학적으로 허용가능한 염 및 전구약물 및 이러한 염의 전구약물, 자연 발생 인슐린의 다형체, 수화물, 용매화물, 생물학적 활성 단편, 생물학적 활성 변이체 및 입체이성체, 그리고 자연 발생 인슐린의 작용제, 모방체 및 길항제 변이체와 이들의 폴리펩티드 융합체를 포함한다. 아미노 말단, 카르복실 말단 또는 양쪽 말단 모두에서 추가의 아미노산을 포함하는 융합체도 "인슐린 폴리펩티드"라는 용어에 포함된다. 대표적인 융합체로서는, 이에 제한되지는 않지만, 예를 들어, 리더 또는 신호 펩티드 또는 이의 부분이 부족한 인슐린의 성숙된 형태를 재조합 발현시켜 메티오닌이 인슐린의 N-말단에 결합되도록 유도한 것인 메티오닐 인슐린 (재조합 발현의 결과로 메티오닌이 인슐린의 N-말단에 결합함), 정제용 융합체 (이에 제한되지는 않지만, 폴리-히스티딘 또는 친화성 에피토프를 포함함), 혈청 알부민 결합 펩티드를 갖는 융합체 및 혈청 알부민과 같은 혈청 단백질을 갖는 융합체를 포함한다. 미국 특허 제5,750,373호(본원에 참조로 포함됨)는 성장 호르몬과 같은 신규한 단백질 및 각 수용체 분자에 대해 변화된 결합 특성을 보유하는 항체 단편 변이체를 선별하는 방법을 기술하고 있다. 상기 방법은 섬유상 파지 M13의 유전자 III 피막 단백질의 카르복시 말단 도메인에 해당 단백질을 코딩하는 유전자를 융합시키는 단계를 포함한다. 키메라 분자는 인슐린과 하나 이상의 다른 분자를 포함한다. 상기 키메라 분자는 인슐린과 다른 분자(들) 중 하나 또는 양자 모두의 특정 영역 또는 단편을 포함할 수 있다. 이러한 임의의 단편은 표준 생화학적 방법에 의해 또는 이러한 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현시킴으로써 단백질로부터 제조할 수 있다. 인슐린 또는 이의 단편은 인간 혈청 알부민(HSA), Fc 또는 이의 일부분을 포함하는 융합 단백질로서 생성될 수 있다. 이러한 융합 구조물은 진핵생물 숙주 세포 내에서 인슐린 또는 이의 단편의 발현 향상을 위해 적절하다. 대표적인 HSA 부분으로서는 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 제5,766,883호와 공보 WO 97/24445에 개시된 바와 같은 N-말단 폴리펩티드 (아미노산 1-369, 1-419 및 1번 아미노산으로 시작되는 중간 길이의 아미노산)를 포함한다. 다른 키메라 폴리펩티드로서는 HSA의 C-말단과 N-말단 각각에 인슐린 또는 이의 단편이 부착된 HSA 단백질을 포함할 수 있다. 이러한 HSA 구조물은 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 제5,876,969호에 개시되어 있다. 인슐린과 a) 면역글로불린의 Fc 부분; b) 면역글로불린 Fc 부분의 유사체 및 c) 면역글로불린 Fc 부분의 단편을 융합시킴으로써 다른 기타 융합체도 제조할 수 있다.

다양한 참조 문헌들이 중합체 접합 또는 글리코실화에 의한 폴리펩티드의 변형을 개시하고 있다. "인슐린 폴리펩티드"라는 용어는 PEG와 같은 중합체에 접합되는 폴리펩티드를 포함하며, 시스테인, 리신 또는 다른 잔기의 하나 이상의 추가적인 유도체화를 포함할 수 있다. 또한, 인슐린 폴리펩티드는 링커 또는 중합체를 포함할 수 있는데, 여기서 상기 링커 또는 중합체가 접합되는 아미노산은, 본 발명에 따른 비천연 아미노산일 수 있고, 또는 상기 링커 또는 중합체는 예를 들어 리신 또는 시스테인에 대한 커플링과 같이 당업계에 공지된 기법을 사용하여 천연적으로 코딩된 아미노산에 접합시킬 수 있다.

또한, "인슐린 폴리펩티드"는 글리코실화된 인슐린, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 임의의 아미노산 위치에서 글리코실화된 폴리펩티드, N-결합 또는 O-결합 글리코실화 형태의 폴리펩티드를 포함한다. 단일 뉴클레오티드 변화를 포함하는 변이체가 인슐린 폴리펩티드의 생물학적 활성 변이체로서 고려되기도 한다. 추가로, 스플라이스 변이체도 포함된다. 또한, "인슐린 폴리펩티드"라는 용어는 임의의 하나 이상의 인슐린 폴리펩티드들 또는 임의의 다른 폴리펩티드의 인슐린 폴리펩티드 이종이량체, 동종이량체, 이종다량체 또는 동종다량체, 단백질, 탄수화물, 중합체, 소분자, 링커, 리간드, 또는 화학적 방법에 의해 결합되거나 또는 융합 단백질로서 발현되는 임의 유형의 기타 생물학적 활성 분자뿐만 아니라, 예컨대, 특정 결실 또는 다른 변형을 포함하면서도 생물학적 활성을 유지하는 폴리펩티드 유사체를 포함한다.

"인슐린 폴리펩티드" 또는 "인슐린"이라는 용어는 하나 이상의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 포함하는 인슐린 폴리펩티드를 망라한다. 본 발명의 인슐린 폴리펩티드는 하나 이상의 비천연 아미노산 변형물과 하나 이상의 자연 아미노산을 병용한 변형물을 포함할 수 있다. 자연 발생 인슐린 폴리펩티드 내의 광범위하게 다양한 아미노산 위치에서 치환을 대표적으로 예시하면, 이에 제한하지는 않지만, 약학적 안정성을 조절하는 치환, 인슐린 폴리펩티드의 하나 이상의 생물학적 활성을 조절하는 치환, 예컨대 작용제의 활성을 증가시키거나, 폴리펩티드의 가용성을 증가시키거나, 프로테아제 민감도를 감소시키거나, 폴리펩티드를 길항제로 전환시키는 것 등의 치환을 포함하며, 이들은 "인슐린 폴리펩티드"라는 용어에 포함된다. 일부 실시 양태에서, 인슐린 길항제는 인슐린 분자의 수용체 결합 부위에 존재하는 수용성 중합체에 결합된 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다.

일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 인슐린 폴리펩티드의 생물학적 활성을 조절하는 첨가, 치환 또는 결실을 추가로 포함한다. 일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 인슐린 폴리펩티드의 항바이러스 활성을 조절하는 첨가, 치환 또는 결실을 추가로 포함한다. 일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 인슐린 폴리펩티드의 항바이러스 활성을 강화시키는 첨가, 치환 또는 결실을 추가로 포함한다. 예를 들어, 첨가, 치환 또는 결실은 인슐린의 하나 이상의 특성 또는 활성을 조절할 수 있다. 예를 들어, 첨가, 치환 또는 결실은 인슐린 수용체에 대한 친화도를 조절하거나, 순환 반감기를 조절하거나, 치료적 반감기를 조절하거나, 폴리펩티드의 안정성을 조절하거나, 투약량을 조절하거나, 방출 또는 생체 내 이용효율을 조절하거나, 정제를 용이하게 하거나 또는 특정 투여 경로를 개선하거나 변화시킬 수 있다. 이와 유사하게, 인슐린 폴리펩티드는 프로테아제 절단 서열, 반응성 기, 항체 결합 도메인 (FLAG 또는 폴리-His를 포함하며 이에 한정되지 않음) 또는 다른 친화성 기반의 서열 (FLAG, 폴리-His, GST 등을 포함하며 이에 한정되지 않음) 또는 폴리펩티드의 검출 (GFP를 포함하며 이에 한정되지 않음), 정제 또는 다른 형질을 개선시키는 결합 분자 (비오틴을 포함하며 이에 한정되지 않음)를 포함할 수 있다.

또한, "인슐린 폴리펩티드"라는 용어는, 예컨대 이에 제한되지는 않으나, 비천연적으로 코딩된 아미노산 측쇄를 통해서 동일하거나 또는 서로 다른 비천연적으로 코딩된 아미노산 측쇄, 또는 천연적으로 코딩된 아미노산 측쇄에 직접 결합되거나, 또는 링커를 통해 간접적으로 결합된 동종이량체, 이종이량체, 동종다량체 및 이종다량체를 망라한다. 대표적인 링커로서는 소분자 유기 화합물, 수용성 중합체, 예컨대 다양한 길이의 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 폴리덱스트란 또는 다양한 길이의 폴리펩티드를 포함하며 이에 한정되지 않는다.

"비천연적으로 코딩된 아미노산"은 20개의 통상적인 아미노산 중 하나의 아미노산 또는 피롤리신 혹은 셀레노시스테인이 아닌 아미노산을 지칭한다. "비천연적으로 코딩된 아미노산"이라는 용어와 동의어로 사용될 수 있는 다른 용어들로는 "비천연 아미노산," "비천연 아미노산," "비자연 발생 아미노산" 및 이들 용어를 하이픈으로 여러가지 형태로 결합시키거나 그렇지 않은 용어가 있다. 또한, "비천연적으로 코딩된 아미노산"이라는 용어는 천연적으로 코딩된 아미노산 (20개의 일반 아미노산 또는 피로리신 및 셀레노시스테인을 포함하며 이에 한정되지 않음)의 변형 (예를 들어, 번역 후 변형)에 의해 발생하나, 그 자체로는 번역 복합체에 의해 성장 폴리펩티드 사슬에 자연적으로 통합되지 않는 아미노산을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 이러한 비자연 발생 아미노산의 예로서는, 이에 제한되지는 않지만, N-아세틸글루코사미닐-L-세린, N-아세틸글루코사미닐-L-트레오닌 및 O-포스포티로신을 포함한다.

"아미노 말단 변형기"는 폴리펩티드의 아미노 말단에 부착될 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 이와 유사하게, "카르복시 말단 변형기"는 폴리펩티드의 카르복시 말단에 부착될 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 말단 변형 기는 펩티드의 혈청 반감기를 증가시키는 다양한 수용성 중합체, 펩티드 또는 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 혹은 다른 부분들을 포함하며 이에 한정되지 않는다.

"작용기", "활성 부분", "활성화 기", "이탈기", "반응성 부위", "화학적 반응성 기" 및 "화학적 반응성 부분"이라는 용어는 분자에 있어서 서로 뚜렷이 다른 것으로 정의할 수 있는 부분 또는 단위를 지칭하는 것으로 당업계 및 본 명세서에서 사용된다. 이 용어들은 화학 분야에서도 다소 동일한 의미이며, 본 명세서에서는 일부 기능 또는 활동을 수행하고, 다른 분자와 반응성을 갖는 분자의 부분을 가리키는 것으로 사용된다.

본 명세서에 사용된 "결합" 또는 "링커"라는 용어는 보통 화학적 반응의 결과로 형성되며, 통상 공유 결합인 기 또는 결합을 지칭한다. 수분에 대해 안정한 결합이라는 말은 결합이 수중에서 실질적으로 안정하여, 예컨대 이에 제한하지는 않지만, 장시간 동안, 심지어 무기한의 시간 동안 생리학적 조건 하를 비롯하여 유용한 pH 값에서 물과 반응하지 않는 것을 의미한다. 수분에 대해 불안정하거나 또는 분해가능한 결합은 이러한 결합이 예컨대, 혈액을 비롯한 물 또는 수용액에서 분해가능하다는 것을 의미한다. 효소적으로 불안정하거나 또는 분해가능한 결합은 이러한 결합이 하나 이상의 효소에 의해 분해될 수 있다는 것을 의미한다. 당업계에서 주지되고 있는 바와 같이, PEG 및 관련 중합체는 중합체 백본 내에, 또는 중합체 백본과 중합체 분자의 하나 이상의 말단 작용기 사이의 링커기 내에 분해가능한 결합을 포함할 수 있다. 예를 들어, PEG 카르복실산 또는 활성화된 PEG 카르복실산을 생물학적 활성제 상에서 알콜 기와 반응시킴으로써 형성된 에스테르 결합은 일반적으로 이러한 상기 제제를 방출시키는 생리학적 조건 하에서 가수분해된다. 다른 가수분해가능한 결합으로서는 이에 제한되지는 않지만, 카르보네이트 결합, 아민과 알데하이드의 반응으로 생성된 이민 결합, 알콜을 포스페이트기에 반응시켜 형성되는 포스페이트 에스테르 결합, 히드라지드와 알데하이드의 반응 생성물인 히드라존 결합, 알데하이드와 알콜의 반응 생성물인 아세탈 결합, 포르메이트와 알콜의 반응 생성물인 오르쏘에스테르 결합, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, PEG와 같은 중합체 말단의 아민기와 펩티드의 카르복실기에 의해 형성된 펩티드 결합, 그리고 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 중합체의 말단의 포스포라미다이트 기와 올리고뉴클레오티드의 5' 히드록실 기에 의해 형성된 올리고뉴클레오티드 결합을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 "생물학적 활성 분자", "생물학적 활성 부분" 또는 "생물학적 활성제"라는 용어는, 이에 제한하지는 않지만, 바이러스, 세균, 박테리오파지, 트랜스포슨, 프리온, 곤충, 진균류, 식물, 동물 및 인간을 비롯한 유기체와 관련된 생물학적 시스템, 경로, 분자 또는 상호작용에 있어서 임의의 물리적 또는 생화학적 특성에 영향을 미칠 수 있는 임의의 물질을 의미한다. 특히, 본 명세서에 사용된 생물학적 활성 분자라는 말은, 이에 제한하지는 않지만, 인간 또는 다른 동물의 질병을 진단, 치유, 완화, 치료 또는 예방하기 위한 임의의 물질 또는 인간 또는 동물의 신체적 또는 정신적 행복감을 향상시키기 위한 임의의 물질을 포함한다. 생물학적 활성 분자의 예로서는, 이에 한정되지는 않지만, 펩티드, 단백질, 효소, 소분자 약물, 백신, 면역원, 중독성이 강한 마약, 중독성이 약한 마약, 탄수화물, 무기 원자 또는 무기 분자, 염료, 지질, 뉴클레오사이드, 방사성 핵종, 올리고뉴클레오티드, 변성 독소, 독소, 원핵생물 및 진핵생물 세포, 바이러스, 폴리사카라이드, 핵산, 그리고 바이러스, 박테리아, 곤충, 동물 또는 임의의 다른 세포 혹은 세포형으로부터 수득되거나 유래한 이들의 부분, 리포좀, 미세입자 및 미셀을 포함한다. 인슐린 폴리펩티드는 미셀계 제형 내에 첨가될 수 있다(미국 특허 제5,833,948호 참조, 본원에 참조로 그 내용 전체가 포함됨). 본 발명에서 사용하기에 적절한 부류의 생물학적 활성제로서는, 이에 제한되지는 않지만, 약물, 전구 약물, 방사성 핵종, 조영제, 중합체, 항생제, 살진균제, 항바이러스제, 항염증제, 항종양제, 심혈관 약제, 항불안제, 호르몬, 성장 인자, 스테로이드성 약제, 미생물 유래 독소 등을 포함한다.

"이작용성 중합체"는 다른 부분 (아미노산 측기를 포함하며 이에 한정되지 않음)과 특이적으로 반응하여 공유 또는 비공유 결합을 형성할 수 있는 2개의 별도의 작용기를 포함하는 중합체를 지칭한다. 특정 생물학적 활성 성분의 기와 반응성인 하나의 작용기, 그리고 제2 생물학적 성분의 기와 반응성인 또 다른 기를 보유하는 이작용성 링커를 사용하여 제1 생물학적 활성 성분, 이작용성 링커 및 제2 생물학적 활성 성분을 포함하는 접합체를 형성할 수 있다. 펩티드에 다양한 화합물을 부착시키기 위한 여러 가지 방법과 링커 분자들이 공지되어 있다. 예를 들어, 본 명세서에 참고 문헌으로 포함되는 유럽 특허 출원 제188,256호, 미국 특허 제4,671,958호, 제4,659,839호, 제4,414,148호, 제4,699,784호, 제4,680,338호 및 제4,569,789호를 참조할 수 있다. "다작용성 중합체"는 다른 부분 (아미노산 측기를 포함하며 이에 한정되지 않음)과 특이적으로 반응하여 공유 또는 비공유 결합을 형성할 수 있는 2개 이상의 별도의 작용기를 포함하는 중합체를 지칭한다. 이작용성 중합체 또는 다작용성 중합체는 임의의 원하는 길이 또는 분자량을 가질 수 있으며, 인슐린에 결합된 하나 이상의 분자와 그의 수용체 또는 인슐린 간에 원하는 특정 이격 거리 또는 배위를 제공하도록 선택될 수 있다.

치환기가 통상적인 화학식에 의해서 좌측으로부터 우측으로 기록한 내용으로 특정되는 경우에, 이러한 치환기는 오른쪽으로부터 왼쪽으로 그 구조를 기록하여 만들어지는 화학적으로 동일한 치환기도 동일하게 망라하는 것인데, 예를 들자면, 구조 -CH₂O-는 구조 -OCH₂-와 동일한 것을 들 수 있다.

"치환기"라는 용어는 이에 제한되지는 않지만, "비간섭 치환기"를 포함한다. "비간섭 치환기"는 안정한 화합물을 생성하는 기이다. 적절한 비간섭 치환기 또는 라디칼로서는, 이에 제한되지는 않지만, 할로, C₁-C₁₀ 알킬, C₂-C₁₀ 알케닐, C₂-C₁₀ 알키닐, C₁-C₁₀ 알콕시, C₁-C₁₂ 아랄킬, C₁-C₁₂ 알카릴, C₃-C₁₂ 시클로알킬, C₃-C₁₂ 시클로알케닐, 페닐, 치환된 페닐, 톨루오일, 크실레닐, 비페닐, C₂-C₁₂ 알콕시알킬, C₂-C₁₂ 알콕시아릴, C₇-C₁₂ 아릴옥시알킬, C₇-C₁₂ 옥시아릴, C₁-C₆ 알킬설피닐, C₁-C₁₀ 알킬설포닐, --(CH₂)_m--O--(C₁-C₁₀ 알킬) (여기서, m은 1 내지 8임), 아릴, 치환된 아릴, 치환된 알콕시, 플루오로알킬, 헤테로시클릭 라디칼, 치환된 헤테로시클릭 라디칼, 니트로알킬, --NO₂, --CN, --NRC(O)--(C₁-C₁₀ 알킬), --C(O)--(C₁-C₁₀ 알킬), C₂-C₁₀ 알킬 티오알킬, --C(O)O--(C₁-C₁₀ 알킬), --OH, --SO₂, =S, --COOH, --NR₂, 카르보닐, --C(O)--(C₁-C₁₀ 알킬)-CF₃, --C(O)-CF₃, --C(O)NR₂, --(C₁-C₁₀ 아릴)-S--(C₆-C₁₀ 아릴), --C(O)--(C₁-C₁₀ 아릴), --(CH₂)_m--O--(--(CH₂)_m--0--(C₁-C₁₀ 알킬) (여기서, 각각의 m은 1 내지 8임), --C(O)NR₂, --C(S)NR₂, --SO₂NR₂, --NRC(O)NR₂, --NRC(S)NR₂, 이의 염 등을 포함한다. 본 명세서에 사용된 각각의 R은 H, 알킬 또는 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴, 아랄킬 또는 알카릴이다.

"할로겐"이라는 용어는 불소, 염소, 요오드 및 브롬을 포함한다.

"알킬"이라는 용어는 달리 언급이 없으면, 그 자체로서나 또는 다른 치환기의 일부로서, 완전히 포화되거나, 단일 불포화되거나 또는 다중 불포화될 수 있고, 지정된 탄소 원자의 수를 갖는 2가 및 다가의 라디칼 (즉, C₁-C₁₀은 1 내지 10 개의 탄소를 의미함)을 포함할 수 있는 직쇄형 또는 분지형 사슬, 또는 시클릭 탄화수소 라디칼, 또는 이들의 조합체를 의미한다. 포화 탄화수소 라디칼의 예로서는, 이에 제한되지는 않지만, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, sec-부틸, 시클로헥실, (시클로헥실)메틸, 시클로프로필메틸과 같은 기들과, 예컨대 n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸 등과 같은 기의 동족체 및 이성체를 포함한다. 불포화된 알킬 기는 하나 이상의 이중 결합 또는 삼중 결합을 갖는 기이다. 불포화된 알킬 기의 예로서는, 이에 제한되지는 않지만, 비닐, 2-프로페닐, 크로틸, 2-이소펜테닐, 2-(부타디에닐), 2,4-펜타디에닐, 3-(1,4-펜타디에닐), 에티닐, 1-프로피닐 및 3-프로피닐, 3-부티닐 및 이들의 고급 동족체 및 이성체를 포함한다. "알킬"이라는 용어는 달리 언급이 없으면, "헤테로알킬"과 같이 하기에서 더욱 상세히 정의되는 알킬의 유도체를 포함하는 것을 의미하기도 한다. 탄화수소 기로 제한된 알킬기는 "호모알킬"이라는 용어로 부른다.

"알킬렌"이라는 용어는 그 자체로 또는 다른 치환기로 일부로서, 이에 한정하지는 않지만 구조 -CH₂CH₂- 및 -CH₂CH₂CH₂CH₂-에 의해 예시된 것과 같이 알칸으로부터 유래된 2가의 라디칼을 의미하며, 하기에서 "헤테로알킬렌"으로 기술되는 기들을 추가로 포함한다. 보통, 알킬 (또는 알킬렌) 기는 1개 내지 24개의 탄소 원자를 가지게 되며, 본원에 기술된 방법과 조성물의 특정 실시 양태에 있어서는 10개 이하의 탄소 원자를 가진다. "저급 알킬" 또는 "저급 알킬렌"은 일반적으로 8개 이하의 탄소 원자를 갖는 더 짧은 사슬 알킬 또는 알킬렌 기이다.

"알콕시," "알킬아미노" 및 "알킬티오" (또는 티오알콕시)라는 용어는 통상적인 의미로 사용되며, 각각 산소 원자, 아미노 기 또는 황 원자를 통해 분자의 잔여부에 부착된 알킬 기를 지칭한다.

"헤테로알킬"이라는 용어는 달리 언급이 없으면, 그 자체로 또는 다른 용어와 함께, 언급된 수의 탄소 원자 및 0, N, Si 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 헤테로원자로 이루어진 안정한 직쇄형 또는 분지형 사슬, 또는 시클릭 탄화수소 라디칼 또는 그들의 조합체를 의미하며, 여기서 상기 질소 및 황 원자는 산화될 수 있고, 질소 헤테로원자는 임의적으로 4급화될 수 있다. 헤테로원자(들) O, N과 S 및 Si는 헤테로알킬 기의 임의의 내부 위치 또는 알킬 기가 분자의 잔여부에 부착되는 위치에 위치할 수 있다. 이러한 예로서는, 이에 제한되지는 않지만, -CH₂-CH₂-O-CH₃, -CH₂-CH₂-NH-CH₃, -CH₂-CH₂-N(CH₃)-CH₃, -CH₂-S-CH₂-CH₃, -CH₂-CH₂, -S(O)-CH₃, -CH₂-CH₂-S(O)₂-CH₃, CH=CH-O-CH₃, -Si(CH₃)₃, -CH₂-CH=N-OCH₃ 및 -CH=CH-N(CH₃)-CH₃를 포함한다. 2개 이하의 헤테로원자는 -CH₂-NH-OCH₃ 및 -CH₂-0-Si(CH₃)₃과 같이 연속적으로 배치될 수 있다. 이와 유사하게, "헤테로알킬렌"이라는 용어는 그 자체로 또는 다른 치환기의 일부로서, 이에 한정하는 것은 아니지만, -CH₂-CH₂-S-CH₂-CH₂- 및 -CH₂-S-CH₂-CH₂-NH-CH₂-로 예시되는 바와 같이, 헤테로알킬로부터 유도된 2가의 라디칼을 의미한다. 헤테로알킬렌 기의 경우, 동일하거나 또는 서로 다른 헤테로원자들은 사슬 말단(알킬렌옥시, 알킬렌디옥시, 알킬렌아미노, 알킬렌디아미노, 아미노옥시알킬렌 등을 포함하며 이에 한정되지 않음)의 어느 한쪽 또는 양쪽 모두를 차지할 수도 있다. 또한, 알킬렌 및 헤테로알킬렌 결합 기의 경우, 결합 기의 화학식이 기록되는 방향이 결합 기의 방향을 의미하지는 않는다. 예를 들어, 화학식 -C(O)₂R'-는 -C(O)₂R'- 및 -R'C(O)₂- 양자 모두를 나타낸다.

"시클로알킬" 및 "헤테로시클로알킬"이라는 용어는 달리 언급이 없으면, 그 자체로서 또는 다른 용어와 함께, 각각 "알킬" 및 "헤테로알킬"의 시클릭 형태를 나타낸다. 따라서, 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬은 포화된 고리 결합, 부분 불포화된 고리 결합 및 완전 불포화된 고리 결합을 포함한다. 또한, 헤테로시클로알킬의 경우, 헤테로원자는 헤테로사이클이 분자의 잔여부에 부착되는 위치를 점유할 수 있다. 시클로알킬의 예로서는, 시클로펜틸, 시클로헥실, 1-시클로헥세닐, 3-시클로헥세닐, 시클로헵틸 등을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 헤테로시클로알킬의 예로서는, 1-(1,2,5,6-테트라히드로피리딜), 1-피페리디닐, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐, 4-모르폴리닐, 3-모르폴리닐, 테트라히드로퓨란-2-일, 테트라히드로퓨란-3-일, 테트라히드로티엔-2-일, 테트라히드로티엔-3-일, 1-피페라지닐, 2-피페라지닐 등을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 또한, 이 용어는 바이시클릭 및 트리시클릭 고리 구조를 포함한다. 이와 유사하게, "헤테로시클로알킬렌"이라는 용어는 그 자체로서 또는 다른 치환기의 일부로서, 헤테로시클로알킬로부터 유도된 2가의 라디칼을 의미하고, "시클로알킬렌"이라는 용어는 그 자체로서 또는 다른 치환기의 일부로서, 시클로알킬로부터 유도된 2가의 라디칼을 의미한다.

본 명세서에 사용된 "수용성 중합체"라는 용어는 수성 용매 중에서 가용성인 임의의 중합체를 지칭한다. 인슐린 폴리펩티드에 수용성 중합체를 결합시킴으로써, 변형되지 않은 형태에 비해 증가되거나 또는 조절된 혈청 반감기 또는 증가되거나 또는 조절된 치료적 반감기, 조절된 면역원성, 응집 및 다량체 형성과 같은 조절된 물리적 회합 특성, 변화된 수용체 결합, 하나 이상의 결합 동반체에 대한 변화된 결합 및 변화된 수용체 이량체화 또는 다량체화를 비롯한 변화들(여기에 한정되지 않음)을 일으킬 수 있다. 수용성 중합체는 그 자체에 생물학적 활성을 가질 수도 있고, 가지지 못할 수도 있으며, 인슐린을 다른 분자, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 하나 이상의 인슐린 폴리펩티드, 또는 하나 이상의 생물학적 활성 분자에 부착시키기 위한 링커로서 이용될 수 있다. 적합한 중합체로서는, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드, 이의 모노 C₁-C₁₀ 알콕시 또는 아릴옥시 유도체 (본 명세서에 참고 문헌으로 포함되는 미국 특허 제 5,252,714호에 기재됨), 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알콜, 폴리아미노산, 디비닐에테르 말레산 무수물, N-(2-히드록시프로필)-메타크릴아미드, 덱스트란, 덱스트란 설페이트를 비롯한 덱스트란 유도체, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올, 헤파린, 헤파린 단편, 폴리사카라이드, 올리고사카라이드, 글리칸, 메틸셀룰로스 및 카르복시메틸 셀룰로스를 포함하며 이에 한정되지 않는 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체, 전분 및 전분 유도체, 폴리펩티드, 폴리알킬렌 글리콜 및 이의 유도체, 폴리알킬렌 글리콜의 공중합체 및 이의 유도체, 폴리비닐 에틸 에테르 및 α-β-폴리[(2-히드록시에틸)-DL-아스파르트아미드 등, 또는 이들의 혼합물을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 이러한 수용성 중합체의 예로서는, 폴리에틸렌 글리콜 및 혈청 알부민을 포함하며 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에 사용된 "폴리알킬렌 글리콜" 또는 "폴리(알켄 글리콜)"이라는 용어는 폴리에틸렌 글리콜 (폴리(에틸렌 글리콜)), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리부틸렌 글리콜 및 이의 유도체를 지칭한다. "폴리알킬렌 글리콜"이라는 용어는 선형 및 분지형 중합체 양자 모두를 포함하며, 0.1 kDa 내지 100 kDa의 평균 분자량을 가진다. 다른 예시적인 실시 양태들은 예를 들어, 쉐어워터 코퍼레이션 (Shearwater Corporation)의 카탈로그 ["Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications" (2001)]와 같은 제품 공급업체 카탈로그에 나열되어 있다.

"아릴"이라는 용어는 달리 언급이 없으면, 함께 융합되거나 또는 공유 결합되는 단일 고리 또는 다중 고리 (예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 1개 내지 3개의 고리)일 수 있는 다중 불포화, 방향족, 탄화수소 치환기를 의미한다. "헤테로아릴"이라는 용어는 N, O 및 S로부터 선택된 1개 내지 4개의 헤테로원자를 함유하는 아릴기(또는 고리)를 일컬으며, 여기서 상기 질소 및 황 원자는 산화될 수 있고, 질소 원자(들)는 4급화될 수 있다. 헤테로아릴 기는 헤테로원자를 통해 분자의 잔여부에 부착될 수 있다. 아릴 및 헤테로아릴 기의 비제한적인 예로서는, 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 4-비페닐, 1-피롤릴, 2-피롤릴, 3-피롤릴, 3-피라졸릴, 2-이미다졸릴, 4-이미다졸릴, 피라지닐, 2-옥사졸릴, 4-옥사졸릴, 2-페닐-4-옥사졸릴, 5-옥사졸릴, 3-이속사졸릴, 4-이속사졸릴, 5-이속사졸릴, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 5-티아졸릴, 2-퓨릴, 3-퓨릴, 2-티에닐, 3-티에닐, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-피리미딜, 4-피리미딜, 5-벤조티아졸릴, 퓨리닐, 2-벤즈이미다졸릴, 5-인돌릴, 1-이소퀴놀릴, 5-이소퀴놀릴, 2-퀴녹살리닐, 5-퀴녹살리닐, 3-퀴놀릴 및 6-퀴놀릴을 포함한다. 상기 언급된 각각의 아릴 및 헤테로아릴 고리계에 대한 치환기는 하기 기술되는 허용가능한 치환기의 군으로부터 선택된다.

간추려 말하면, "아릴"이라는 용어는 다른 용어들 (아릴옥시, 아릴티옥시, 아릴알킬을 포함하며 이에 한정되지 않음)과 함께 사용되는 경우 상기 정의한 아릴 및 헤테로아릴 고리 양자 모두를 포함한다. 따라서, "아릴알킬"이라는 용어는 아릴 기가 알킬기에 부착된 라디칼을 포함하는 것인데, 예를 들어 탄소 원자 (메틸렌기를 포함하며 이에 한정되지 않음)가 예컨대, 산소 원자 (페녹시메틸, 2-피리딜옥시메틸, 3-(1-나프틸옥시)프로필 등을 포함하며 이에 한정되지 않음)에 의해 치환된 알킬기를 비롯한 알킬기 (벤질, 펜에틸, 피리딜메틸 등을 포함하며 이에 한정되지 않음)등을 포함한다.

상기 용어들 ("알킬," "헤테로알킬," "아릴" 및 "헤테로아릴"을 포함하며 이에 한정되지 않음) 각각은 지정된 라디칼의 치환된 형태 및 치환되지 않은 형태 양자 모두를 포함하는 것이다. 각 유형의 라디칼에 대한 대표적인 치환기를 하기에 제공한다.

알킬 및 헤테로알킬 라디칼 (흔히 알킬렌, 알케닐, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 시클로알케닐 및 헤테로시클로알케닐로 지칭되는 기들을 포함함)에 대한 치환기는 0 내지 (2m' + 1) (여기서, m'는 이러한 라디칼 중의 총 탄소 원자의 수임) 범위의 수의 -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R"R"', -OC(O)R', -C(O)R', -CO₂R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'C(O)NR"R"', -NR"C(O)₂R', -NR-C(NR'R"R"')=NR"", -NR-C(NR'R")=NR"', -S(O)R', -S(O)₂R', -S(O)₂NR'R", -NRSO₂R', -CN 및 -NO₂(이에 한정되지 않음)로부터 선택되는 하나 이상의 다양한 기들일 수 있다. R', R", R"' 및 R""는 각각 독립적으로 수소, 치환되거나 또는 치환되지 않은 헤테로알킬, 치환되거나 치환되지 않은 아릴, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 1-3 개의 할로겐으로 치환된 아릴, 치환되거나 또는 치환되지 않은 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시 기 또는 아릴알킬 기를 지칭한다. 본 발명의 화합물이 하나 이상의 R 기를 포함하는 경우, 예를 들어, 각각의 R기는 R', R", R"' 및 R"" 중 하나 이상의 기가 존재하는 경우의 R', R", R"' 및 R"" 기와 마찬가지로 독립적으로 선택된다. R' 및 R"가 동일한 질소 원자에 부착되는 경우, 이들은 질소 원자와 결합하여 5원, 6원 또는 7원 고리를 형성할 수 있다. 예를 들어, -NR'R"는 이에 제한되지는 않지만, 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함하는 것을 의미한다. 상기 논의한 치환기의 내용으로부터, 당업자라면 "알킬"이라는 용어가 수소 기 이외의 기에 결합된 탄소 원자를 포함하는 기, 예컨대 할로알킬 (-CF₃ 및 -CH₂CF₃를 포함하며 이에 한정되지 않음) 및 아실 (-C(O)CH₃, -C(O)CF₃, -C(O)CH₂OCH₃ 등을 포함하며 이에 한정되지 않음)을 포함한다는 의미를 알 수 있을 것이다.

알킬 라디칼에 대해 기재된 치환기와 유사하게, 아릴 및 헤테로아릴 기에 대한 치환기는 다양하며, 이에 제한되지는 않지만, 0 내지 방향족 고리계 상의 총 개방 원자가 범위의 수로, 할로겐, -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R"R"', -OC(O)R', -C(O)R', -CO₂R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R"', -NR"'C(O)₂R', -NRC(NR'R"R"')=NR"", -NR-C(NR'R")=NR"', -S(O)R', -S(O)₂R', -S(O)₂NR'R", -NRSO₂R', -CN 및 -NO₂, -R', -N₃, -CH(Ph)₂, 플루오로(C₁-C₄)알콕시 및 플루오로(C₁-C₄)알킬 (여기서, R', R", R"' 및 R""는 수소, 알킬, 헤테로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택됨)로부터 선택된다. 본 발명의 화합물이 하나 이상의 R 기를 포함하는 경우, 예를 들어, 각각의 R기는 R', R", R"' 및 R"" 중 하나 이상의 기가 존재하는 경우의 R', R", R"' 및 R"" 기와 마찬가지로 독립적으로 선택된다.

본 명세서에 사용된 "조절된 혈청 반감기"라는 용어는 변화되지 않은 인슐린의 형태에 비해 변형된 인슐린의 순환 반감기에서의 양성적 변화 또는 음성적 변화를 의미한다. 혈청 반감기는 인슐린의 투여 후 다양한 시점에서 혈액 샘플을 채취하고, 각각의 샘플 내의 분자의 농도를 측정함으로써 결정된다. 혈청 농도와 시간의 상관 관계로부터 혈청 반감기를 계산할 수 있다. 증가된 혈청 반감기는 바람직하게는 약 2배 이상이지만, 예컨대, 만족스러운 투여 요법을 이끌어내거나 또는 독성 효과를 피하는 경우에는 이보다 적은 증가량도 유용할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 그 증가 정도는 약 3배 이상, 약 5배 이상 또는 약 10배 이상이다.

본 명세서에 사용된 "조절된 치료적 반감기"라는 용어는 변화되지 않은 인슐린의 형태에 비하여 치료적 유효량의 인슐린 반감기에 있어서 양성적 변화 또는 음성적 변화를 의미한다. 치료적 반감기는 투여 후 다양한 시점에서 분자의 약동학적 특성 및/또는 약력학적 특성을 측정함으로써 결정된다. 증가된 치료적 반감기는 바람직하게는 유익한 특정 투여 요법, 유익한 특정 총 투약량을 가능하게 하거나 또는 원치 않는 효과를 피할 수 있게 해준다. 일부 실시 양태에서, 치료적 반감기의 증가는 효능의 증대, 표적에 대한 변형된 분자의 결합 증가 또는 감소, 프로테아제와 같은 효소에 의한 분자 붕괴의 증가 또는 감소, 또는 변형되지 않은 분자의 다른 매개변수 혹은 작용 기전의 증가 또는 감소, 또는 분자의 수용체 매개성 클리어랜스(clearance)의 증가 또는 감소로부터 비롯된다.

"단리된"이라는 용어는 핵산 또는 단백질과 관련하여 사용되는 경우, 핵산 또는 단백질이 자연 상태에서 회합되는 다른 세포 성분들을 적어도 일부 함유하지 않거나, 또는 핵산 또는 단백질이 생체 내 또는 시험관 내에서 생성되는 농도보다 높은 수준으로 농축되는 것을 의미한다. 이는 균질한 상태에서 이루어질 수 있다. 단리된 물질은 건조 또는 반건조 상태이거나, 또는 용액, 예컨대 이에 한정하는 것은 아니지만, 수용액 중에 존재할 수 있다. 단리된 물질은 추가의 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학 조성물의 성분일 수 있다. 보통, 순도 및 균질도는 분석 화학 기법, 예를 들어 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 결정된다. 제제 중에 존재하는 우세한 종인 단백질은 실질적으로 정제된다. 특히, 단리된 유전자는 그 유전자에 측접하여 해당 유전자 이외의 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임으로부터 분리된다. "정제된"이라는 용어는 핵산 또는 단백질이 전기영동 겔에서 실질적으로 하나의 밴드를 생성하는 것을 의미한다. 특히, 이는 핵산 또는 단백질의 순도가 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상인 것을 의미한다.

"핵산"이라는 용어는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오사이드, 리보뉴클레오사이드, 또는 리보뉴클레오티드 및 이들의 중합체를 지칭한다. 특별히 달리 한정하지 않는다면, 이 용어는 기준 핵산과 유사한 결합 특성을 가지며, 자연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사 작용을 하는 공지된 천연 뉴클레오티드의 유사체를 함유하는 핵산을 망라한다. 특별히 달리 한정하지 않는다면, 이 용어는 PNA (펩티도핵산)를 비롯한 올리고뉴클레오티드 유사체, 안티센스 기법에 사용되는 DNA의 유사체 (포스포로티오에이트, 포스포로아미데이트 등)도 지칭한다. 달리 언급이 없으면, 특정 핵산 서열은 보존적으로 변형된 그의 변이체 (축퇴성 코돈 치환을 포함하며 이에 한정되지 않음) 및 상보적 서열뿐만 아니라 명시적으로 지정된 서열도 내포하여 망라한다. 구체적으로, 축퇴성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 3번째 위치가 혼합된 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환되는 서열을 생성시킴으로써 달성될 수 있다 (문헌 [Batzer et al., Nucleic Acids Res. 19: 5081 (1991)]; [Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985)]; 및 [Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)] 참조).

"폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"이라는 용어는 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하는 것으로 본 명세서에서는 호환되어 사용된다. 즉, 폴리펩티드에 대한 설명은 펩티드에 관한 설명 및 단백질에 관한 설명에 대해서도 동일하게 적용되고, 이와 반대의 경우도 성립한다. 이 용어들은 자연 발생 아미노산 중합체뿐만 아니라 하나 이상의 아미노산 잔기가 비천연적으로 코딩된 아미노산인 아미노산 중합체에 적용된다. 본 명세서에 사용된 용어들은 아미노산 잔기들이 공유 펩티드 결합에 의해 결합되어 있는 전장 단백질을 비롯하여 임의의 길이로 된 아미노산 사슬을 망라한다.

"아미노산"이라는 용어는 자연 발생 및 비자연 발생 아미노산뿐만 아니라 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 천연적으로 코딩된 아미노산은 20개의 통상적인 아미노산 (알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린) 그리고 피롤리신과 셀레노시스테인이다. 아미노산 유사체는 자연 발생 아미노산과 동일한 기본적인 화학 구조, 즉 수소에 결합된 α 탄소, 카르복실 기, 아미노 기와 R기, 예컨대 호모세린, 노르루신, 메티오닌 설폭시드, 메티오닌 메틸 설포늄을 가지는 화합물을 지칭한다. 이러한 유사체는 변형된 R 기 (예를 들어, 노르루신) 또는 변형된 펩티드 백본을 가지지만, 자연 발생 아미노산과 동일한 기본적인 화학 구조를 보유한다. 아미노산이라고 언급하는 경우로는, 예를 들어 자연 발생 단백질 생성과 관련된 L-아미노산, D-아미노산, 화학적으로 변형된 아미노산, 예컨대 아미노산 변이체와 그 유도체, 자연 발생 단백질 생성과 관련이 없는 아미노산, 예컨대 β-알라닌, 오르니틴 등과, 아미노산의 특정으로 당업계에게 알려진 성질을 보유하는 화학적으로 합성된 화합물을 포함한다. 비자연 발생 아미노산의 예로서는, 이에 한정하는 것은 아니지만, α-메틸 아미노산(예컨대, α-메틸 알라닌), D-아미노산, 히스티딘 유사 아미노산(예컨대, 2-아미노-히스티딘, β-히드록시-히스티딘, α-플루오로메틸-히스티딘 및 α-메틸-히스티딘), 측쇄에 추가의 메틸렌을 가지는 아미노산("호모" 아미노산) 및 측쇄의 카복실산 작용기가 설폰산기로 치환된 아미노산(시스테산)을 포함한다. 합성 비천연 아미노산, 치환된 아미노산, 또는 하나 이상의 D-아미노산을 비롯한 비천연 아미노산을 본 발명의 단백질 내로 도입하는 것은 여러 가지로 유리할 수 있다. D-아미노산을 함유하는 펩티드 등은 L-아미노산을 함유하는 그의 대응물에 비하여 증가된 안정성을 나타낸다. 따라서, D-아미노산을 도입하는 펩티드의 구축 작업 등은 세포 내에서 더 큰 안정성이 바람직하거나 요구되는 경우에 특히 유용할 수 있다. 보다 구체적으로, D-펩티드 등은 내인성 펩티다아제 및 프로테아제에 대해 저항성이 있어, 이러한 특성이 바람직한 경우에 있어서 분자의 향상된 생체 내 이용률과 생체 내 연장된 수명을 제공한다. 추가로, D-펩티드 등은 T 헬퍼 세포에 대한 주조직 적합성 복합체 클래스 II로 제한된 제시를 위해 효율적으로 처리될 수 없기 때문에, 전체 유기체 내에서 체액성 면역 반응을 유도하는 경향이 덜하다.

본 명세서에 아미노산은 IUPAC-IUB 생화학 명명법 위원회 (Biochemical Nomenclature Commission)에 의해 권장된 것으로 흔하게 알려진 세 글자 기호 또는 한 글자 기호에 의해 지칭될 수 있다. 마찬가지로, 뉴클레오티드도 통상적으로 허용되는 한 글자의 암호에 의해 지칭될 수 있다.

"보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 양자 모두에 적용된다. 특정 핵산 서열과 관련하여, "보존적으로 변형된 변이체"는 동일하거나 또는 근본적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 지칭하거나, 또는 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우에는 근본적으로 동일한 서열을 지칭한다. 유전자 암호의 축퇴성으로 인하여, 대다수의 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 주어진 단백질을 코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해 특정되는 모든 위치에서, 코돈은 코딩된 폴리펩티드를 변화시키지 않고 기술된 임의의 대응 코돈으로 변화될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 보존적으로 변형된 변이의 일종인 "잠재성 변이 (silent variation)"이다. 본 명세서에서 폴리펩티드를 코딩하는 모든 핵산 서열은 또한 핵산에 있어서 가능한 모든 잠재성 변이를 기술하고 있다. 당업자라면 핵산의 각 코돈 (통상적으로 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG 및 통상 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG는 제외)이 변형되어 기능적으로 동일한 분자를 생성할 수 있다는 점을 알 수 있을 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 각 잠재성 변이는 각각의 기술되는 서열에 내재하고 있는 것이다.

아미노산 서열과 관련하여, 당업자라면 코딩된 서열 내에 단일 아미노산 또는 소량 퍼센트의 아미노산을 변화시키거나, 첨가하거나 또는 결실시키는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에 대하여 이렇게 개별적으로 치환, 결실 또는 첨가하는 것이 결국 아미노산의 결실, 아미노산의 첨가, 화학적 유사 아미노산을 이용한 아미노산의 첨가를 가져오는 "보존적으로 변형된 변이체"라는 것을 이해할 수 있을 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 보존적으로 변형된 변이체로서는 본 발명의 다형성 변이체, 종간 동족체 및 대립유전자 이외에도 존재하며, 이러한 변이체는 본 발명의 다형성 변이체, 종간 동족체 및 대립유전자를 배제하지는 않는다.

기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표가 당업자에게 공지되어 있다. 하기의 8개 군은 각각 서로 보존적 치환물인 아미노산을 함유한다.

1) 알라닌(A), 글리신(G);

2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E);

3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);

4) 아르기닌(R), 리신(K);

5) 이소루신(I), 루신(L), 메티오닌(M), 발린(V);

6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W);

7) 세린(S), 트레오닌(T); 및

8) 시스테인(C), 메티오닌(M)

(예를 들어, 문헌 [Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2nd Edition (December 1993)] 참조)

2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련한 내용에서 "동일한" 또는 % "동일성"이라는 용어는 동일한 2개 이상의 서열 또는 부분서열을 지칭한다. 대상 서열들을 하기 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하거나 또는 수동 정렬 및 육안 조사에 의해 측정하여, 비교 창 또는 지정된 영역에 대한 최대 관련성을 비교하여 정렬할 때, 서열들이 동일한 (즉, 특정 영역에 대하여 약 60% 동일성, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90% 또는 약 95% 동일성) 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 %를 갖는 경우, 그 서열들은 "실질적으로 동일하다"고 한다. 또한, 이 정의는 시험 서열의 보체를 지칭하기도 한다. 동일성은 길이가 약 50개 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드인 영역, 또는 길이가 75-100개의 아미노산 또는 뉴클레오티드인 영역에 걸쳐 존재할 수 있거나, 또는 특정되지 않은 경우에는, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 전체 서열에 걸쳐 존재할 수 있다. 인간 이외의 종의 동족체를 비롯한 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 엄격한 하이브리드 조건 하에 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편을 갖는 표지된 프로브를 사용하여 라이브러리를 스크리닝하는 단계 및 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 전장 cDNA와 유전체 클론을 단리하는 단계를 포함하는 과정에 의해 수득될 수 있다. 이러한 하이브리드화 기법들은 당업자에게 잘 알려져 있다.

서열 비교시, 보통 하나의 서열이 기준 서열로서 역할을 하는데, 여기에 시험 서열을 비교하게 된다. 서열 비교 알고리즘을 사용하여 시험 서열 및 기준 서열을 컴퓨터에 입력하는 경우, 부분서열 좌표가 지정되고, 필요에 따라서는, 서열 알고리즘 프로그램 매개변수가 지정된다. 디폴트 프로그램 매개변수를 사용하거나, 또는 대체 매개변수를 지정할 수 있다. 그렇게 되면, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 매개변수를 기초로 기준 서열에 대한 시험 서열의 % 서열 동일성을 계산한다.

본 명세서에 사용된 "비교 창"이라는 용어는 20개 내지 600개, 통상적으로 약 50개 내지 약 200개, 보다 통상적으로는 약 100개 내지 약 150개의 인접 위치 수로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 한 인접 위치 수를 갖는 한 분절에 대한 기준을 포함하며, 이로부터 서열은 두 개의 서열이 최적으로 정렬된 후 동일한 인접 위치 수를 갖는 기준 서열과 비교될 수 있는 것이다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 문헌 [Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2: 482c]에 기재된 국소 상동성 알고리즘, 문헌 [Needleman and Wunsch (1970) J Mol. Biol. 48: 443]에 기재된 상동성 정렬 알고리즘, 문헌 [Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85; 2444]에 기재된 유사성 방법 연구, 이러한 알고리즘들의 컴퓨터 처리 실행 [미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)의 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package)의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA], 또는 수동 정렬 및 육안 조사 [예를 들어, 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)] 참조]에 의해 수행될 수 있다.

% 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하기에 적합한 알고리즘의 한 예로서는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이 있는데, 이들은 각각 문헌 [Altschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402] 및 [Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410]에 기재되어 있다. BLAST 분석 수행을 위한 소프트웨어는 인터넷 주소 www.ncbi.nlm.nih.gov의 국립 생명공학 정보 센터 (National Center for Biotechnology Information)를 통해 공개적으로 입수가능하다. BLAST 알고리즘 매개변수 W, T 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오티드 서열의 경우)은 디폴트로서 단어 길이 (W) 11, 기대값 (E) 10, M = 5, N = -4 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 단어 길이 3, 기대값 (E) 10, BLOSUM62 스코어링 매트릭스 (문헌 [Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915] 참조) 정렬 (B) 50, 기대값 (E) 10, M = 5, N = -4 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다. 보통, BLAST 알고리즘은 "단순반복서열을 거르는(low complexity)" 필터를 작동시키지 않고 수행된다.

또한, BLAST 알고리즘은 두 서열 사이의 유사성을 통계적으로 분석한다 (예를 들어, 문헌 [Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성을 측정하는 한 기준은 최소 합계 확률 (P(N))인데, 이는 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 매칭 (matching)이 우연으로 발생하는 확률의 지표를 제공한다. 예를 들어, 기준 핵산에 대해 시험 핵산을 비교할 때 최소 합계 확률이 약 0.2 미만, 또는 약 0.01 미만, 또는 약 0.001 미만이면, 그 핵산은 기준 서열과 유사한 것으로 간주한다.

"...에 선택적으로 (또는 특이적으로) 하이브리드화하다"라는 말은 서열이 복합체 혼합물 (총 세포성 혹은 라이브러리 DNA 또는 RNA를 포함하며 이에 한정되지 않음) 중에 존재하는 경우, 엄격한 하이브리드화 조건 하에서 특정한 뉴클레오티드 서열에만 분자를 결합시키거나, 이중체를 형성하거나 또는 하이브리드화하는 것을 지칭한다.

"엄격한 하이브리드화 조건"이라는 말은 당업계에 공지된 바와 같이 낮은 이온 강도 및 고온의 조건 하에서 DNA, RNA, PNA 또는 다른 핵산 모방체 또는 이들의 조합체를 하이브리드화한다는 것을 의미한다. 보통, 엄격한 조건 하에서, 프로브는 핵산의 복합체 혼합물 (총 세포성 혹은 라이브러리 DNA 또는 RNA를 포함하며 이에 한정되지 않음) 중의 그의 표적 부분서열에 하이브리드화하지만, 복합체 혼합물 중의 다른 서열에는 하이브리드화하지 않는다. 엄격한 조건은 서열 의존적이며, 다른 환경에서는 상이할 수 있다. 서열이 길수록 더 높은 온도에서 특이적으로 하이브리드화한다. 핵산의 하이브리드화에 대해서는 문헌 [Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology -- Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)]으로부터 광범위하게 안내를 받을 수 있다. 일반적으로, 엄격한 조건은 정해진 이온 강도 pH에서 특정 서열에 대한 열 융점 (T_m)보다 약 5-10℃ 낮게끔 선택된다. T_m은 표적에 상보적인 프로브의 50%가 평형 상태에서 표적 서열에 하이브리드화하는 (표적 서열이 과량으로 존재하기 때문에, T_m에서 프로브의 50%가 평형 상태에서 점유됨) 온도 (정해진 이온 강도, pH 및 핵산 농도 하에서)이다. 엄격한 조건이라는 것은, 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.0 M 미만의 나트륨 이온 농도, 보통 약 0.01 내지 1.0 M의 나트륨 이온 농도 (또는 다른 염)이고, 온도는 짧은 프로브 (10개 내지 50개의 뉴클레오티드를 포함하며 이에 한정되지 않음)의 경우 약 30℃ 이상이고, 긴 프로브 (50개 초과의 뉴클레오티드를 포함하며 이에 한정되지 않음)의 경우 약 60℃ 이상인 조건일 수 있다. 또한, 엄격한 조건은 포름아미드와 같은 탈안정화제를 첨가하여 달성할 수 있다. 선택적 하이브리드화 또는 특이적 하이브리드화의 경우, 양성 신호는 백그라운드 하이브리드화의 2배 이상, 임의로는 10배일 수 있다. 대표적인 엄격한 하이브리드화 조건은 다음과 같을 수 있다: 50% 포름아미드, 5X SSC 및 1% SDS, 42℃에서 인큐베이션, 또는 5X SSC, 1% SDS, 65℃에서 인큐베이션과 65℃에서 0.2X SSC 및 0.1% SDS 중에서 세척. 이러한 세척은 5분, 15분, 30분, 60분, 120분 이상 수행될 수 있다.

본 명세서에 사용된 "진핵 생물"이라는 용어는 동물 (포유류, 곤충, 파충류, 조류 등을 포함하며 이에 한정되지 않음), 섬모충, 식물 (외떡잎 식물, 쌍떡잎 식물, 해조류 등을 포함하며 이에 한정되지 않음), 진균류, 효모, 편모충, 미포자충, 원생생물 등과 같은 진핵생물류 (Eucarya) 계통발생 영역에 속하는 유기체를 지칭한다.

본 명세서에 사용된 "비진핵 생물"이라는 용어는 비진핵 생물 유기체를 지칭한다. 예를 들어, 비진핵 생물 유기체는 진정세균 [대장균, 써머스 써모필루스(Thermos thermophilus), 바실러스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 등을 포함하며 이에 한정되지 않음] 계통발생 영역, 또는 고세균 [메타노코쿠스 잔나스치(Methanococcus jannaschii), 메타노박테리움 써모오토트로피쿰(Methanobacterium thermoautotrophicum), 할로박테리움(Halobacterium), 예를 들어 할로페락스 볼카니(Haloferax volcanii) 및 할로박테리움 종 NRC-1, 아키오글로부스 풀지더스(Archaeoglobus fulgidus), 파이로코커스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus), 파이로코커스 호리코시(Pyrococcus horikoshii), 오로피룸 페르닉스(Aeuropyrum pernix) 등을 포함하며 이에 한정되지 않음] 계통발생 영역에 속할 수 있다.

본 명세서에 사용된 "피험체"라는 용어는 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 동물을 지칭하는 것으로, 일부 실시 양태에서는 포유류, 다른 실시 양태에서는 인간을 지칭한다. 동물이라 하면 애완동물(예컨대, 개, 고양이 등), 가축(예컨대, 소, 양, 돼지, 말 등) 또는 실험용 동물(예컨대, 랫트, 마우스, 기니아 피그 등)일 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "유효량"은 치료의 대상이 되는 질병, 질환 또는 장애의 증상 중 하나 이상 증상을 어느 정도로 경감시키도록 투여되는 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 양을 지칭한다. 본 명세서에 기재된 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 조성물은 예방을 위한 치료, 강화를 위한 치료 및/또는 치료를 위한 치료의 목적으로 투여될 수 있다.

"강화(향상)시키다" 또는 "강화(향상)"라는 용어는 원하는 효과의 효능 또는 그 지속시간을 증가시키거나 또는 연장하는 것을 의미한다. 따라서, 치료제의 효과를 강화시키는 것과 관련하여, "강화(향상)"이라는 용어는 한 시스템에 대한 다른 치료제의 효능 또는 지속시간을 증가시키거나 또는 연장시킬 수 있는 능력을 지칭한다. 본 명세서에 사용된 "강화 유효량"이라는 말은 원하는 시스템에서 또 다른 치료제의 효과를 강화시키는 데 적합한 양을 지칭한다. 환자에 대해서 사용되는 경우, 이러한 용도로 유효한 양은 질병, 장애 또는 질환의 중증도 및 추이, 이전에 행했던 요법, 환자의 건강 상태 및 약물에 대한 반응, 그리고 전임 치료 의사의 판단에 따라 다를 것이다.

본 명세서에 사용된 "변형된"이라는 용어는 주어진 폴리펩티드에 행해진 임의의 변화, 예컨대, 폴리펩티드의 길이, 아미노산 서열, 화학 구조, 협력 번역(co-translation) 변형물 또는 번역 후 변형물에 대한 변형을 가리킨다. "(변형된)" 형태라는 용어는 여기에 거론되는 폴리펩티드가 임의로 변형된다는 것, 즉 논의되는 폴리펩티드가 변형될 수도 있고 또는 변형되지 않을 수도 있다는 것을 의미한다.

"번역 후 변형된"이라는 용어는 자연 또는 비천연 아미노산이 폴리펩티드 사슬에 통합된 후 이러한 아미노산에 발생할 수 있는 임의의 변형을 지칭하는 것이다. 이 용어는 생체 내 협력 번역 변형물, 시험관 내 협력 번역 변형물(예컨대, 세포가 없는 번역 시스템 내), 생체 내 번역 후 변형물 및 시험관 내 번역 후 변형물을 포함하나, 이들은 예시를 위한 것일 뿐 이들에 한정되지는 않는다.

예방학적 용도에서, 인슐린 폴리펩티드를 함유하는 조성물을 특정 질병, 장애 또는 질환에 걸리기 쉽거나 또는 걸릴 위험이 있는 환자에게 투여한다. 이러한 양을 "예방학적 유효량"으로 정의한다. 이러한 용도에 있어서, 정확한 양도 환자의 건강 상태, 체중 등에 따라 좌우된다. 통상적인 실험 (예를 들어, 용량 증가 임상 시험)에 의해서 이러한 예방학적 유효량을 결정하는 것은 당업계의 숙련자라면 잘 알 수 있다.

"보호된"이라는 용어는 특정한 반응 조건 하에서 화학 반응성 작용기의 반응을 방지하는 "보호기" 또는 부분의 존재를 지칭한다. 보호기는 보호되는 화학 반응성 기의 유형에 따라 다양할 것이다. 예를 들어, 화학 반응성 기가 아민 또는 히드라지드인 경우, 보호기는 tert-부틸옥시카르보닐 (t-Boc) 및 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc)의 군으로부터 선택될 수 있다. 화학 반응성 기가 티올인 경우, 보호기는 오르쏘피리딜디설피드일 수 있다. 화학 반응성 기가 카르복실산, 예컨대 부탄산 또는 프로피온산, 또는 히드록실 기인 경우, 보호기는 벤질 또는 알킬 기, 예컨대면 메틸, 에틸, 또는 tert-부틸일 수 있다. 또한, 당업계에 공지된 다른 보호기들도 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 사용될 수 있거나 또는 이들과 함께 사용될 수 있다.

이에 제한되는 건 아니지만 예를 들어, 차단기/보호기는 하기로부터 선택될 수 있다:

다른 보호기들은 문헌 [Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, NY, 1999](본원에 그 내용 전체가 참고로 포함됨)에 기재되어 있다.

치료를 위한 용도에서, 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 조성물을 이미 질병, 질환 또는 장애를 앓고 있는 환자에게 이러한 질병, 질환 또는 장애의 증상을 치유하거나 또는 적어도 부분적으로 정지시키기 충분한 양으로 투여한다. 이러한 양은 "치료적 유효량"으로 정의되며, 질병, 장애 또는 질환의 중증도 및 추이, 이전에 행했던 요법, 환자의 건강 상태 및 약물에 대한 반응, 그리고 치료 전임 의사의 판단에 따라 좌우되게 된다. 이러한 치료적 유효량을 통상적인 실험 (예를 들어, 투여량 증가 임상 시험)에 의한 결정하는 것은 당업계의 숙련자라면 잘 알 수 있을 것이다.

"치료(처치)"라는 용어는 예방을 위한 치료 및/또는 치료를 위한 치료를 지칭하는 데 사용된다.

본 명세서에 제시된 비천연적으로 코딩된 아미노산 폴리펩티드는 하나 이상의 원자가 자연 상에서 흔히 발견되는 원자량 또는 질량수와는 다른 원자량 또는 질량수를 갖는 원자로 치환된 것인 동위원소 표지된 화합물을 포함한다. 본 발명의 화합물에 포함될 수 있는 동위원소의 예로서는, 수소, 탄소, 질소, 산소, 불소 및 염소의 동위원소, 예컨대 각각 ²H, ³H, ¹³C, ¹⁴C, ¹⁵N, ¹⁸O, ¹⁷O, ³⁵S, ¹⁸F, ³⁶Cl을 포함한다. 본원에 기술된 특정 동위원소 표지된 화합물, 예를 들어 ³H와 ¹⁴C와 같은 방사성 동위원소가 포함되는 것들이 약물 및/또는 기질 조적 분포 평가에 있어서 유용할 수 있다. 또한, 중수소, 즉 ²H와 같은 동위원소를 이용한 치환은, 예를 들어 증가된 생체 내 반감기 또는 감소된 투여량 요건과 같이 대사적으로 더 큰 안정성으로 인해 확실한 치료적 장점을 제공할 수 있다.

모든 이성체, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 부분입체 이성체, 거울상 이성체 및 이들의 혼합물이 본 명세서에 기술된 조성물의 일부로서 고려된다. 추가의 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산 폴리펩티드는 원하는 치료 효과를 비롯한 목적하는 효과를 만들어 내는데 사용될 대사물질을 생성할 필요에 따라 유기체에 투여하게 되면 대사작용이 이루어진다. 추가의 실시 양태는 비천연적으로 코딩된 아미노산 폴리펩티드의 활성 대사물질이다.

어떤 경우에는, 비천연적으로 코딩된 아미노산 폴리펩티드는 호변 이성체로서 존재할 수 있다. 또한, 본 명세서에 기술된 비천연적으로 코딩된 아미노산 폴리펩티드는 용매화되지 않은 형태뿐만 아니라, 물, 에탄올 등과 같이 약학적으로 허용가능한 용매와 함께 용매화된 형태로 존재할 수 있다. 용매화된 형태도 본원에서 개시된 것으로 간주된다. 당업자라면 본 명세서에 기재된 일부 화합물이 수 개의 호면 이성체 형태로 존재할 수 있다는 사실을 알 수 있을 것이다. 이러한 모든 호변 이성체 형태는 본 명세서에 기술된 조성물의 일부로서 간주된다.

달리 언급이 없으면, 당업계의 기법에 속하는 질량 분광법, NMR, HPLC, 단백질 화학, 생화학, 재조합 DNA 기법 및 약리학의 통상적인 방법이 사용된다.

발명의 상세한 설명

I. 도입

본 발명에서는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 인슐린 폴리펩티드가 제공된다. 본 발명의 특정한 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연 아미노산을 갖는 인슐린 폴리펩티드는 하나 이상의 번역 후 변형을 포함한다. 한 실시 양태에서, 상기 하나 이상의 번역 후 변형은 제2 반응성 기를 포함하는 표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜의 유도체, 광가교결합제, 방사성 핵종, 세포독성 화합물, 약물, 친화성 표지, 광친화성 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이트제, 보조인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 사카라이드, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 억제성 리보핵산, 생체 적합 물질, 나노입자, 스핀 표지, 형광발색단, 금속 함유 부분, 방사성 부분, 신규한 작용기, 다른 분자와 공유 또는 비공유적으로 상호작용하는 기, 포토케이징된(photocaged) 부분, 화학 방사선으로 여기가능한 부분, 광이성질화 가능한 부분, 비오틴, 비오틴의 유도체, 비오틴 유사체, 무거운 원자를 도입하는 부분, 화학적으로 분절가능한 기, 광분절성(photocleavable) 기, 연장된 측쇄, 탄소 결합된 당, 산화환원 활성제, 아미노 티오산, 독성 부분, 동위원소로 표지된 부분, 생물리학적 프로브, 형광 기, 화학발광기, 고 전자 밀도 기, 자성 기, 삽입 기, 발색단, 에너지 전달제, 생물학적 활성제, 검출가능한 표지, 소분자, 양자점, 나노전달물질, 방사성 핵종, 방사성 전달물질, 중성자 포획제, 또는 상기한 것들의 임의의 혼합물 혹은 임의의 다른 바람직한 화합물 또는 물질을 비롯한 분자(이들에 한정되지는 않음)를, 특정 반응성 기에 적합한 것으로 당업자에게 공지되어 있는 화학 방법론을 이용하여 제1 반응성 기를 포함하는 하나 이상의 비천연 아미노산에 부착시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, 제1 반응성 기는 알키닐 부분 (예컨대, 이에 한정하지는 않으나, 비천연 아미노산인 p-프로파르길옥시페닐알라닌 중의 알키닐 부분을 포함하며, 여기서 프로파르길기는 때로는 아세틸렌 부분으로도 지칭됨)이고, 제2 반응성 기는 아지도 부분이고, [3 + 2] 시클로 첨가 화학 방법론이 사용된다. 또 다른 예에서는, 제1 반응성 기는 아지도 부분 (비천연 아미노산인 p-아지도-L-페닐알라닌 중의 아지도 부분을 포함하며 이에 한정되지 않음)이고, 제2 반응성 기는 알키닐 부분이다. 본 발명의 변형된 인슐린 폴리펩티드의 특정한 실시 양태에서, 하나 이상의 번역 후 변형을 포함하는 하나 이상의 비천연 아미노산 (케토 작용기를 함유하는 비천연 아미노산을 포함하며 이에 한정되지 않음)은 하나 이상의 번역 후 변형이 사카라이드 부분을 포함하는 경우에 사용된다. 특정한 실시 양태에서, 번역 후 변형은 진핵 세포 또는 비진핵 세포 중에서 생체 내 생성된다. 링커, 중합체, 수용성 중합체 도는 다른 분자는 폴리펩티드에 분자를 부착시킬 수 있다. 분자는 폴리펩티드에 직접 결합될 수 있다.

특정한 실시 양태에서, 단백질은 하나의 숙주 세포에 의해 생체 내에서 이루어지는 하나 이상의 번역 후 변형을 포함하며, 여기서 번역 후 변형은 또 다른 종류의 숙주 세포에 의해서는 정상적으로 이루어지지 않는다. 특정한 실시 양태에서, 단백질은 진핵 세포에 의해 생체 내에서 이루어지는 하나 이상의 번역 후 변형을 포함하며, 여기서 번역 후 변형은 비진핵 세포에 의해서는 정상적으로 이루어지지 않는다. 번역 후 변형의 예로서는 글루코실화, 아세틸화, 아실화, 지질 변형, 팔미토일화, 팔미테이트 첨가, 인산화, 당지질 결합 변형 등을 포함하며 이에 한정되지 않는다.

일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 폴리펩티드의 글루코실화, 아세틸화, 아실화, 지질 변형, 팔미토일화, 팔미테이트 첨가, 인산화 또는 당지질 결합 변형을 위한 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 폴리펩티드의 글리코실화를 위한 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 폴리펩티드의 글루코실화, 아세틸화, 아실화, 지질 변형, 팔미토일화, 팔미테이트 첨가, 인산화 또는 당지질 결합 변형을 위한 하나 이상의 천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 폴리펩티드의 글리코실화를 위한 하나 이상의 천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다.

일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 폴리펩티드의 글리코실화를 향상시키는 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산 첨가 및/또는 치환을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 폴리펩티드의 글리코실화를 향상시키는 하나 이상의 결실을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 폴리펩티드 내에서 서로 다른 아미노산의 글루코실화를 향상시키는 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산 첨가 및/또는 치환을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 폴리펩티드 내에서 서로 다른 아미노산의 글루코실화를 향상시키는 하나 이상의 결실을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 폴리펩티드 내에서 비천연적으로 코딩된 아미노산의 글루코실화를 향상시키는 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산 첨가 및/또는 치환을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 폴리펩티드 내에서 천연적으로 코딩된 아미노산의 글루코실화를 향상시키는 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산 첨가 및/또는 치환을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 폴리펩티드 내에서 서로 다른 아미노산의 글루코실화를 향상시키는 하나 이상의 천연적으로 코딩된 아미노산 첨가 및/또는 치환을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 폴리펩티드 내에서 천연적으로 코딩된 아미노산의 글루코실화를 향상시키는 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산 첨가 및/또는 치환을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 폴리펩티드 내에서 비천연적으로 코딩된 아미노산의 글루코실화를 향상시키는 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산 첨가 및/또는 치환을 포함한다.

한 실시 양태에서, 번역 후 변형은 GlcNAc-아스파라긴 결합에 의해 올리고사카라이드를 아스파라긴에 부착시키는 단계를 포함한다 (올리고사카라이드가 (GlcNAc-Man)₂-Man-GlcNAc-GlcNAc 등의 경우를 포함하며 이에 한정되지 않음). 또 다른 실시 양태에서, 번역 후 변형은 GalNAc-세린, GalNAc-트레오닌, GlcNAc-세린, 또는 GlcNAc-트레오닌 결합에 의해 올리고사카라이드(Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc 등을 포함하며 이에 한정되지 않음)를 세린 또는 트레오닌에 부착시키는 단계를 포함한다. 특정한 실시 양태에서, 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드는 분비 또는 국소화 서열, 에피토프 태그 (tag), FLAG 태그, 폴리히스티딘 태그, GST 융합 등을 포함할 수 있다. 분비 신호 서열의 예로서는, 이에 제한되지는 않지만, 원핵 세포성 분비 신호 서열, 진핵 세포성 분비 신호 서열, 세균 발현을 위해 5'-최적화된 진핵 세포성 분비 신호 서열, 신규한 분비 신호 서열, 펙트산 분해 효소 분비 신호 서열, Omp A 분비 신호 서열 및 파지 분비 신호 서열을 포함한다. 분비 신호 서열의 예로서는, 이에 한정하는 것은 아니지만, STII(원핵 세포), Fd GIII와 M13(파지), Bg12(효모) 및 트랜스포존으로부터 유래된 신호 서열 bla를 포함한다. 이러한 서열들은, 예컨대 하나의 신호 서열을 다른 신호 서열로 치환하는 방법, 리더 서열을 다른 리더 서열로 치환하는 방법 등(방법은 이에 한정하지 않음)으로 변형되어 폴리펩티드에 원하는 결과를 제공할 수 있다.

본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드는 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상의 비천연 아미노산을 함유할 수 있다. 비천연 아미노산은 동일하거나 또는 서로 다를 수 있으며, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 서로 다른 비천연 아미노산을 포함하는 단백질 중에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 서로 다른 부위가 존재할 수 있다. 특정한 실시 양태에서, 자연적으로 발생된 형태의 단백질로 존재하는 특정 아미노산 중 하나 이상(그러나 전체는 해당안됨)의 특정 아미노산이 비천연 아미노산으로 치환된다.

본 발명은 비천연적으로 코딩된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 인슐린을 기반으로 하는 방법 및 조성물을 제공한다. 비천연적으로 코딩된 하나 이상의 아미노산을 인슐린에 도입시킴으로 인해서, 통상적으로 발생하는 20개의 아미노산과 반응하지 않으면서 비천연적으로 코딩된 하나 이상의 아미노산(이에 한정되지는 않음)과의 특이적 화학 반응을 수반하는 콘쥬게이션(접합) 화학의 응용이 가능하다. 일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 인슐린은 비천연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄를 통해 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 수용성 중합체에 결합된다. 본 발명은 PEG 유도체를 이용하여 매우 효율적인 단백질의 선택적인 변형 방법을 제공하는데, 이러한 방법은 비유전학적으로 코딩된 아미노산, 예컨대 이에 제한되지는 않지만 20개의 자연적으로 도입되는 아미노산 중에서는 나타나지 않는 작용기 또는 치환기를 포함하는 아미노산의 선택적인 도입(예컨대, 이에 제한하지는 않지만 케톤, 아지드 또는 아세틸렌 부분을 셀렉터 코돈에 대응하여 단백질 내로 도입하는 것) 단계 및 적절히 반응성인 PEG 유도체를 이용한 아미노산의 후속 변형 단계를 수반한다. 일단 아미노산 측쇄가 일단 도입되면, 다음으로 비천연적으로 코딩된 아미노산에 존재하는 특정 작용기 또는 치환기에 적합한 것으로서 당업자에게 공지된 화학 방법론을 사용하여 아미노산 측쇄를 변형할 수 있다. 본 발명에서 수용성 중합체를 단백질에 도입하기 위해 적절한 공지된 화학 방법론들은 매우 다양하게 존재한다. 이러한 방법론으로서는, 이에 한정하는 것은 아니지만, 아세틸렌 또는 아지드 유도체(이에 제한되지는 않음) 각각을 이용한 휘스겐 [3 + 2] 시클로 첨가 반응 (예를 들어, 문헌 [Padwa, A. in Comprehensive Organic Synthesis, Vol.4, (1991) Ed. Trost, B. M., Pergamon, Oxford, p. 1069-1109] 및 [Huisgen, R. in 1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry, (1984) Ed. Padwa, A., Wiley, New York, p.1-176] 참조)을 포함한다.

휘스겐 [3 + 2] 시클로 첨가 방법은 친핵성 치환 반응이 아닌 시클로 첨가 반응을 수반하기 때문에, 매우 높은 선택성으로 단백질을 변형시킬 수 있다. 이러한 반응은 우수한 위치선택성 (regioselectivity) (1,4 > 1,5)의 수성 조건으로 실온에서 촉매량의 Cu (I) 염을 반응 혼합물에 첨가함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Tornoe, et al., (2002) J. Org. Chem. 67: 3057-3064], [Rostovtsev, et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41: 2596-2599]; 및 WO 03/101972를 참조할 수 있다. [3 + 2] 시클로 첨가를 통해서 본 발명의 단백질에 첨가될 수 있는 분자로서는, 이에 제한되지는 않지만, 아지도 또는 아세틸렌 유도체를 비롯한 적절한 작용기 또는 치환기를 갖는 거의 모든 분자를 포함한다. 이러한 분자들은 각각 아세틸렌기를 갖는 비천연 아미노산(예컨대, 이에 제한되지는 않지만, p-프로파르길옥시페닐알라닌을 포함함) 또는 아지도기를 갖는 비천연 아미노산(예컨대, 이에 제한되지는 않지만, p-아지도-페닐알라닌)에 첨가될 수 있다.

휘스겐 [3 + 2] 시클로 첨가로부터 유래하는 5원 고리는 환원성 환경에서 일반적으로 가역적이지 않고, 수성 환경에서 가수분해에 대해 장시간 동안 안정하다. 결과적으로, 요구되는 수성 조건에 따라 본 발명의 활성 PEG 유도체를 사용함으로써 여러 가지 다양한 물질의 물리적 및 화학적 특징을 변형시킬 수 있다. 보다 중요한 사실은, 아지드 및 아세틸렌 부분이 서로 특이적 (그리고, 예를 들어, 통상적인 20개의 유전학적으로 코딩된 아미노산 중 그 어느 것과도 반응하지 않음)이기 때문에, 단백질이 극히 높은 선택성으로 하나 이상의 특이적 부위에서 변형될 수 있다는 점이다.

또한, 본 발명은 하나 이상의 아세틸렌 또는 아지드 부분을 보유하고, 수용성이며 수분에 안정한, PEG 유도체 및 이와 관련된 친수성 중합체의 유도체를 제공한다. 아세틸렌 부분을 함유하는 PEG 중합체 유도체는 셀렉터 코돈에 대응해 단백질 내에 선택적으로 도입된 아지드 부분과의 커플링에 대해 매우 특이적이다. 이와 유사하게, 아지드 부분을 함유하는 PEG 중합체 유도체는 셀렉터 코돈에 대응하여 단백질 내에 선택적으로 도입된 아세틸렌 부분과의 커플링에 대해 매우 특이적이다.

보다 구체적으로, 아지드 부분은 이에 제한하지는 않지만, 알킬 아지드, 아릴 아지드 및 이러한 아지드들의 유도체를 포함한다. 알킬과 아릴 아지드의 유도체는 아세틸렌-특이적 반응성이 유지되는 한 다른 치환기를 포함할 수 있다. 아세틸렌 부분은 알킬과 아릴 아세틸렌 및 이들의 유도체를 포함한다. 알킬과 아릴 아세틸렌의 유도체는 아지드 특이적 반응성이 유지되는 한 다른 치환기를 포함할 수 있다.

본 발명은 매우 다양한 작용기, 치환기 또는 부분을 보유하는 물질과, 다른 물질, 예컨대 이에 한정하는 것은 아니지만, 표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜의 유도체, 광가교결합제, 방사성 핵종, 세포독성 화합물, 약물, 친화성 표지, 광친화성 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이트제, 보조인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 사카라이드, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 억제성 리보핵산, 생체 적합 물질, 나노입자, 스핀 표지, 형광발색단, 금속 함유 부분, 방사성 부분, 신규한 작용기, 다른 분자와 공유 또는 비공유적으로 상호작용하는 기, 포토케이징된(photocaged) 부분, 화학 방사선으로 여기가능한 부분, 광이성질화 가능한 부분, 비오틴, 비오틴의 유도체, 비오틴 유사체, 무거운 원자를 도입하는 부분, 화학적으로 분절가능한 기, 광분절성(photocleavable) 기, 연장된 측쇄, 탄소 결합된 당, 산화환원 활성제, 아미노 티오산, 독성 부분, 동위원소로 표지된 부분, 생물리학적 프로브, 형광 기, 화학발광기, 고 전자 밀도 기, 자성 기, 삽입 기, 발색단, 에너지 전달제, 생물학적 활성제, 검출가능한 표지, 소분자, 양자점, 나노전달물질, 방사성 핵종, 방사성 전달물질, 중성자 포획제, 또는 상기한 것들의 임의의 혼합물 혹은 임의의 다른 바람직한 화합물 또는 물질과의 접합체를 제공한다. 또한, 본 발명은 아지드 또는 아세틸렌 부분을 갖는 물질과, 이에 대응하는 아세틸렌 또는 아지드 부분을 갖는 PEG 중합체 유도체와의 접합체를 포함한다. 예를 들어, 아지드 부분을 함유하는 PEG 중합체는 아세틸렌 작용성을 보유하는 비유전학적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 단백질 내 한 위치에서 생물학적 활성 분자에 커플링될 수 있다. PEG와 생물학적 활성 분자가 커플링되어 이루어지는 결합은, 이에 제한되지는 않지만, 휘스겐 [3 + 2] 시클로 첨가 생성물을 포함한다.

PEG가 생체 적합 물질의 표면을 변형시키는 데 사용될 수 있다는 사실은 당업계에 확립되어 있다 (예를 들어, 본 명세서에 참고 문헌으로 포함되는 미국 특허 제6,610,281호, 문헌 [Mehvar, R., J. Pharmaceut. Sci., 3(1); 125-136 (2000)] 참조). 또한, 본 발명은 하나 이상의 반응성 아지드 또는 아세틸렌 부위를 갖는 표면과, 상기 표면에 휘스겐 [3 + 2] 시클로 첨가 결합으로 커플링된 하나 이상의 본 발명의 아지드 함유 또는 아세틸렌 함유 중합체를 포함하는 생체 적합 물질도 포함한다. 또한, 생체 적합 물질 및 다른 물질들도 아지드 또는 아세틸렌 결합 이외의 결합, 예를 들어 카르복실산, 아민, 알콜 또는 티올 부분을 포함하는 결합을 통해서 아지드 활성화 중합체 유도체 또는 아세틸렌 활성화 중합체 유도체에 커플링됨으로써 후속 반응에 이용가능한 아지드 또는 아세틸렌 부분을 남겨 놓을 수 있다.

본 발명은 본원의 아지드 함유 중합체 또는 아세틸렌 함유 중합체를 합성하는 방법을 포함한다. 아지드 함유 PEG 유도체의 경우, 아지드는 중합체의 탄소 원자에 직접적으로 결합될 수 있다. 다르게는, 아지드 함유 PEG 유도체는 한 말단에서 아지드 부분을 갖는 가교제를 통상적인 활성화 중합체에 부착시킴으로써 결과적으로 생성되는 중합체가 그의 말단에 아지드 부분을 가지도록 제조될 수 있다. 아세틸렌 함유 PEG 유도체의 경우, 아세틸렌은 중합체의 탄소 원자에 직접적으로 결합할 수 있다. 다르게는, 아세틸렌 함유 PEG 유도체는 한 말단에서 아세틸렌 부분을 갖는 가교제를 통상적인 활성화 중합체에 부착시킴으로써 결과적으로 생성되는 중합체가 그의 말단에 아세틸렌 부분을 가지도록 제조될 수 있다.

보다 구체적으로, 아지드 함유 PEG 유도체의 경우, 하나 이상의 활성 히드록실 부분을 갖는 수용성 중합체는 메실레이트, 트레실레이트, 토실레이트 또는 할로겐 이탈기와 같은 보다 반응성인 부분을 갖는 치환된 중합체를 생성하는 반응을 수행하게 된다. 설포닐산 할라이드, 할로겐 원자 및 다른 이탈기를 함유하는 PEG 유도체의 제조 및 용도는 당업자에게 공지되어 있다. 결과적으로 생성되는 치환된 중합체는 이후 중합체의 말단의 아지드 부분을 보다 반응성인 부분으로 치환하는 반응을 수행하게 된다. 다르게는, 하나 이상의 친핵성 또는 친전자성 활성 부분을 갖는 수용성 중합체는 한 말단에 아지드를 갖는 가교제와 반응을 수행하여, PEG 중합체와 가교제 사이에 공유 결합이 형성되고, 아지드 부분이 중합체의 말단에 위치하도록 한다. 아민, 티올, 히드라지드, 히드라진, 알콜, 카르복실레이트, 알데히드, 케톤, 티오에스테르 등을 비롯한 친핵성 및 친전자성 부분은 당업자에게 공지되어 있다.

보다 구체적으로, 아세틸렌 함유 PEG 유도체의 경우, 하나 이상의 활성 히드록실 부분을 갖는 수용성 중합체는 아세틸렌 부분을 포함하는 전구체로부터 할로겐 또는 다른 활성화된 이탈기를 분리시키는 반응을 수행하게 된다. 다르게는, 하나 이상의 친핵성 또는 친전자성 활성 부분을 갖는 수용성 중합체는 한 말단에 아세틸렌을 갖는 가교제와 반응을 수행하여, PEG 중합체와 가교제 사이에 공유 결합이 형성되고, 아세틸렌 부분이 중합체의 말단에 위치하도록 한다. PEG 유도체의 유기 합성과 그의 제조 및 용도와 관련한 할로겐 부분, 활성화 이탈기, 친핵성 및 친전자성 부분도 역시 당업계에 숙련자들에게는 잘 알려져 있다.

또한, 본 발명은 변형된 단백질, 예컨대 이에 제한되지는 않지만 아지드 또는 아세틸렌 부분을 함유하는 PEG 및 PEG 유도체와 같은 수용성 중합체에 다른 물질들을 첨가하는 것인 단백질의 선택적 변형 방법을 제공한다. 아지드 함유 PEG 유도체 및 아세틸렌 함유 PEG 유도체는 생체적합성, 안정성, 가용성, 및 면역원성 결핍 상태가 중요하고 동시에 종래 당업계에 공지된 것에 비해 PEG 유도체를 단백질에 부착시키는 선택적 방법을 더 많이 제공하는 표면 및 분자의 성질을 변화시키는 데 사용될 수 있다.

본 발명에 사용하기 위한 핵산의 일반적인 재조합 방법

본 발명의 여러 실시 양태에서, 본 발명의 인슐린 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 재조합 방법을 사용하여 단리되고, 클로닝되어, 변화되는 경우가 많다. 이러한 실시 양태는, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 단백질 발현을 위해서나, 또는 변이체, 유도체, 발현 카세트 또는 인슐린 폴리펩티드로부터 유도된 다른 서열의 생성 중 사용된다. 일부 실시 양태에서, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 이종성 프로모터에 작동가능하게 결합된다.

비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 인슐린 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 모(parent) 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기초로 하여 합성될 수 있으며, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 서열번호 1과 2에 기재된 아미노산 서열을 가지도록 합성될 수 있으며, 그 후 관련 아미노산 잔기(들)의 도입 (즉, 통합 또는 치환) 또는 제거 (즉, 결실 또는 치환)를 유효화하기 위해 뉴클레오티드 서열을 변화시킨다. 뉴클레오티드 서열은 통상적인 방법에 따라 특정 부위 돌연변이 유발법에 의해 알맞게 변형될 수 있다. 다르게는, 뉴클레오티드 서열은 화학적 합성, 에컨대 이에 제한되지는 않지만, 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하여 제조될 수 있으며(여기서 상기 올리고뉴클레오티드는 원하는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기초로 고안됨), 바람직하게는, 재조합 폴리펩티드가 생성되는 숙주 세포에서 유리한 코돈을 선택함으로써 제조될 수 있다.

본 발명은 재조합체 유전학 분야의 통상적인 기법을 사용한다. 본 발명에 사용되는 일반적 방법을 개시하고 있는 기본서로는 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001)], [Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)] 및 [Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994)]를 포함한다.

분자 생물학 기법을 기술하고 있는 일반적인 서적으로는 문헌 [Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger)], [Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 ("Sambrook")] 및 [Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (supplemented through 1999) ("Ausubel")]을 포함한다. 이러한 문헌들은 돌연변이 유발법, 벡터의 용도, 프로모터에 대해 기술하고 있으며, 비천연 아미노산, 오르쏘고날 tRNA, 오르쏘고날 합성효소 및 이들의 쌍을 포함하는 단백질을 생산하기 위한 셀렉터 코돈을 포함하는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드의 생성(이에 한정하지 않음)을 비롯한 것과 관련된 다양한 다른 관련 주제를 기술하고 있다.

다양한 유형의 돌연변이 유발법이, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드 내에서, 신규한 합성효소 또는 tRNA의 생성, tRNA 분자의 돌연변이 생성, 합성효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 돌연변이 생성, tRNA의 라이브러리 생성, 합성효소의 라이브러리 생성, 셀렉터 코돈 생성, 비천연 아미노산을 코딩하는 셀렉터 코돈 삽입 등의 다양한 목적을 위해 본 발명에서 사용된다. 이들은 이에 제한되지는 않지만, 특정 부위 돌연변이 유발법, 무작위 지점 돌연변이 유발법, 동종성 재조합법, DNA 셔플링 또는 다른 순환성 돌연변이 유발법, 키메라 구축법, 우라실 함유 주형을 이용한 돌연변이 유발법, 특정 올리고뉴클레오티드 돌연변이 유발법, 포스포로티오에이트 변형된 DNA 돌연변이 유발법, 갭핑된 이중체 DNA를 사용한 돌연변이 유발법, PCT 매개성 돌연변이 유발법 등, 또는 이들을 임의로 조합한 방법을 포함한다. 추가의 적절한 방법으로서는 점 복제실수 복구(point mismatch repair), 복구 결손 숙주 균주를 사용한 돌연변이 유발법, 제한 선택과 제한 정제, 결실 돌연변이 유발법, 총 유전자 합성에 의한 돌연변이 유발법, 이중 가닥 손상 복구 등을 포함한다. 이에 제한되지는 않지만, 키메라 구축물이 관련되는 돌연변이 유발법도 본 발명에 포함된다. 한 실시 양태에서, 돌연변이 유발은 자연 발생 분자 또는 변형되거나 돌연변이가 나타난 자연 발생 분자의 공지된 정보, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 서열, 서열 비교, 물리적 특성, 2차, 3차 또는 4차 구조, 결정 구조 등에 의해 설명될 수 있다.

본 명세서에서 제시하는 서적 및 예들은 이러한 절차들을 기술하고 있다. 하기의 간행물 및 거기에 인용된 참조 문헌에서 추가의 정보를 찾을 수 있다: 문헌 [Ling et al., Approaches to DNA mutagenesis: an overview, Anal Biochem. 254 (2): 157-178 (1997)], [Dale et al., Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, Methods Mol. Biol. 57: 369-374 (1996)], [Smith, In vitro mutagenesis, Ann. Rev. Genet. 19: 423-462 (1985)], [Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, Science 229: 1193-1201 (1985)], [Carter, Site-directed mutagenesis, Biochem. J. 237: 1-7 (1986)], [Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D.M.J. eds., Springer Verlag, Berlin) (1987)], [Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-492 (1985)], [Kunkel et al., Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods in Enzymol. 154, 367-382 (1987)], [Bass et al., Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities, Science 242: 240-245 (1988)], [Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, Nucleic Acids Res. 10: 6487-6500 (1982)], [Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors, Methods in Enzymol. 100: 468-500 (1983)], [Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template, Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987)], [Taylor et al., The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764 (1985)], [Taylor et al., The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8765-8787 (1985)], [Nakamaye & Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698 (1986)], [Sayers et al., 5'-3' Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 16: 791-802 (1988)], [Sayers et al., Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide, (1988) Nucl. Acids Res. 16: 803-814], [Kramer et al., The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456 (1984)], [Kramer & Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA, Methods in Enzymol. 154: 350-367 (1987)], [Kramer et al., Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations, Nucl. Acids Res. 16: 7207 (1988)], [Fritz et al., Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999 (1988)], [Kramer et al., Different base/base mismatches are corrected with different efficiencies by the methyl-directed DNA mismatch-repair system of E. coli, Cell 38: 879-887 (1984)], [Carter, et al., Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors, Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443 (1985)], [Carter, Improved oligotiucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors, Methods in Enzymol. 154: 382-403 (1987)], [Eghtedarzadeh & Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large deletions, Nucl. Acids Res. 14: 5115 (1986)], [Wells et al., Importance of Hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin, Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423 (1986)], [Nambiar et al., Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, Science 223: 1299-1301 (1984)], [Sakamar and Khorana, Total synthesis and expression of a gene for the α-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin), Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372 (1988)], [Wells et al., Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, Gene 34: 315-323 (1985)], [Grundstrom et al., Oligonucleotide-directed mutagenesis by 'shot-gun' gene synthesis, Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316 (1985)], [Mandecki, Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 7177-7181 (1986)], [Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinion in Biotechnology 4: 450-455 (1993)], [Sieber, et al., Nature Biotechnology, 19: 456-460 (2001)], [W.P.C. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994)] 및 [I.A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res. 23, 3067-8 (1995)]. 상기한 다양한 방법들에 대한 추가적인 상세한 설명은 문헌 [Methods in Enzymology Volume 154]에서도 찾을 수 있으며, 이 문헌은 다양한 돌연변이 생성 방법을 사용할 때 생기는 문제를 해결하는데 유용한 조언들도 기술하고 있다.

예를 들어, 본 발명의 돌연변이 유발법, 예컨대 합성효소 라이브러리의 돌연변이 생성, 또는 tRNA의 변형에서 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 문헌 [Needham-VanDevanter et al., Nucleic Acids Res., 12: 6159-6168 (1984)]에 기술된 바와 같은 자동 합성기를 이용하여 통상 문헌 [Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letts. 22(20): 1859-1862, (1981)]에 기술된 고체상 포스포라미다이트 트리에스테르 방법에 따라 화학적으로 합성된다.

또한, 본 발명은 오르쏘고날 tRNA/RS 쌍을 통해 비천연 아미노산을 생체 내로 도입하기 위한 진핵 생물 숙주 세포, 비진핵 생물 숙주 세포 및 유기체에 관한 것이다. 숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 이용하거나, 또는 예컨대, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있는 본 발명의 벡터를 비롯하여(이에 한정되지 않음) 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 구축물을 사용하여 유전자 조작된다 (형질전환, 형질도입 또는 형질감염을 포함하며 이에 한정되지 않음). 예를 들어, 오르쏘고날 tRNA, 오르쏘고날 tRNA 합성효소 및 유도될 단백질을 위한 코딩 영역은 원하는 숙주 세포 내에서 기능을 하는 유전자 발현 조절 요소들과 작동가능하게 결합된다. 벡터는 예를 들어, 플라스미드, 코스미드, 파지, 세균, 바이러스, 네이키드형 폴리뉴클레오티드 또는 접합된 폴리뉴클레오티드의 형태일 수 있다. 상기 벡터들은 전기천공법 (문헌 [Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5824 (1985)] 참조), 바이러스 벡터에 의한 감염, 작은 비드 혹은 입자의 매트릭스 내, 또는 작은 비드 혹은 입자의 매트릭스 표면의 핵산을 이용하는 작은 입자에 의한 고속 탄두 침투(ballistic penetration) (문헌 [Klein et al., Nature 327, 70-73 (1987)] 참조) 등을 비롯한 표준 방법들을 이용하여 세포 및/또는 미생물에 도입된다. 시험관 내 세포 내로 핵산을 이동시키는데 적절한 기법으로서는 리포좀을 이용하는 방법, 미량주사법, 세포 융합법, DEAE-덱스트란, 인산칼슘 침전법 등을 포함한다. 생체 내 유전자 이동 방법으로서는, 이에 제한하지는 않지만, 바이러스성 (보통 레트로바이러스) 벡터를 이용한 형질감염과 바이러스성 피복 단백질-리포좀 매개성 형질감염 (문헌 [Dzau et al., Trends in Biotechnology 11: 205-210 (1993)] 참조)을 포함한다. 어떤 경우에는, 세포 표면 막 단백질 또는 표적 세포에 특이적인 항체, 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드와 같은 표적 세포를 표적으로 삼는 제제와 함께 핵산 공급원을 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 리포좀이 사용되는 경우에는, 세포 이물 흡수(엔도사이토시스)와 관련된 세포 표면 막 단백질에 결합하는 단백질이 표적화 및/또는 흡수 촉진을 위해 사용될 수 있는데, 예를 들어, 특정 세포 유형의 영양을 위한 캡시드 단백질 또는 이의 단편, 주기적으로 세포 내 함입을 수행하는 단백질에 대한 항체, 세포 내 국소화를 표적으로 삼아 세포 내 반감기를 향상시키는 단백질이 사용될 수 있다.

유전자 조작된 숙주 세포는 예를 들어, 스크리닝 단계, 프로모터를 활성화하거나 또는 형질전환체를 선택하는 단계와 같은 활동에 적합하도록 변형된 통상적인 영양 배지 중에서 배양될 수 있다. 이러한 세포들은 유전자도입 유기체 내로 배양될 수 있다. 세포 단리 및 배양 (예를 들어, 후속 핵산 단리)(이에 한정되지 않음)에 대한 다른 유용한 참조 문헌으로서는 문헌 [Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third Edition, Wiley-Liss, New York]과 여기에 인용된 참조 문헌 [Payne et al., (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY], [Gamborg and Phillips (eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture], [Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York)] 및 [Atlas and Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL]을 포함한다.

표적 핵산을 세포 내로 도입시키는 공지된 여러 방법이 이용가능하며, 이들 중 어느 것이라도 본 발명에 사용할 수 있다. 이러한 방법들로서는 DNA를 함유하는 세균 원형질체를 수용 세포와 융합시키는 방법, 전기천공법, 발사체 포격 (projectile bombardment) 및 바이러스 벡터를 사용해 감염시키는 방법 (이하에서 추가로 논의됨) 등을 포함한다. 세균 세포는 본 발명의 DNA 구축물을 함유하는 플라스미드의 수를 증폭시키는 데 사용될 수 있다. 세균은 지수 기(log phase)로 성장하여서 세균 내 플라스미드는 당업계에 공지된 다양한 방법 (예를 들어, 문헌 [Sambrook] 참조)에 의해 단리될 수 있다. 또한, 세균으로부터 플라스미드를 정제하기 위한 여러 가지 키트들이 시판된다 [예를 들어, 파마시아 바이오테크 (Pharmacia Biotech)의 이지프렙 (EasyPrep^TM), 플렉시프렙 (FlexiPrep^TM); 스트라타진 (Stratagene)의 스트라타클린 (StrataClean^TM); 및 퀴아겐 (Qiagen)의 퀴아프렙 (QIAprep^TM)을 참고할 수 있음]. 단리되어 정제된 플라스미드는 이후 추가로 조작하여 다른 플라스미드를 생산하거나, 세포를 형질감염시키는 데 사용하거나, 또는 관련 벡터에 도입하여 유기체를 감염시키게 된다. 통상적인 벡터는 전사 및 번역 종결자, 전사 및 번역 개시 서열, 그리고 특정한 표적 핵산의 발현 조절에 유용한 프로모터를 포함한다. 벡터는 하나 이상의 독립적인 종결자 서열, 진핵 생물 혹은 원핵 생물 혹은 양자 모두에서 카세트의 복제를 허용하는 서열 (셔틀 벡터를 포함하며 이에 한정되지 않음) 및 원핵 시스템과 진핵 시스템 양자 모두에 대한 선별 마커를 함유하는 일반 발현 카세트를 포함할 수 있다. 벡터는 원핵 생물, 진핵 생물 또는 양자 모두에서 복제 및 통합에 적합하다. 문헌 [Giliman & Smith, Gene 8: 81 (1979)], [Roberts, et al., Nature, 328: 731 (1987)], [Schneider, B., et al., Protein Expr. Purif. 6435: 10 (1995)]; [Ausubel, Sambrook, Berger (모두 상기와 동일)]을 참조할 수 있다. 클로닝에 유용한 세균 및 박테리오파지의 목록은, 예컨대 ATCC에 의해 ATCC에 의해 간행된 문헌 [The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage (1992) Gherna et al., (eds)]에 제공되어 있다. 또한, 분자 생물학에서 사용하는 시퀀싱, 클로닝 및 다른 측면들에 대한 기본적인 절차와 기초적인 이론적 고려 사항들은 문헌 [Watson et al., (1992) Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books, NY]에서 찾아볼 수 있다. 또한, 임의의 필수 핵산 (및 표준형 또는 비표준형이든 간에 사실상 거의 모두 표지된 핵산)은 다양한 판매처, 예를 들어 미국 텍사스주 미드랜드 소재의 미드랜드 써티파이드 리에이젼트 캄파니 (Midland Certified Reagent Company) (www.mcrc.com), 미국 캘리포니아주 라모나 소재의 더 그레이트 아메리칸 진 캄파니 (The Great American Gene Company) (www.genco.com), 미국 일리노이주 시카고 소재의 익스프레스젠 인코포레이티드 (ExpressGen Inc.) (www.expressgen.com), 미국 캘리포니아주 알라메다 소재의 오페론 테크놀로지스 인코포레이티드 (Operon Technologies Inc.) 및 이 밖에 다른 판매처들로부터 주문한 맞춤형이거나 표준형일 수 있다.

셀렉터 코돈

본 발명의 셀렉터 코돈은 단백질 생합성 세포 소기관의 유전자 코돈 골격을 확장시킨다. 예를 들어, 셀렉터 코돈은, 이에 한정하지는 않으나, 유니크한 3개의 염기 코돈, 넌센스 코돈, 예컨대 앰버 코돈 (UAG), 오커 코돈 또는 오팔 코돈 (UGA)(이에 한정되지는 않음)을 비롯한 정지 코돈, 비천연 코돈, 4개 이상의 염기 코돈, 희귀 코돈 등을 포함한다. 원하는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입될 수 있는 셀렉터 코돈의 수는, 예를 들어 적어도 일부의 인슐린 폴리펩티드를 코딩하는 단일 폴리뉴클레오티드에서 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 이상(이에 한정되지 않음)과 같이 광범위하다는 사실은 당업자에게 자명하다. 원하는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입될 수 있는 셀렉터 코돈의 수는, 예를 들어 적어도 일부의 인슐린 폴리펩티드를 코딩하는 A 사슬 및 B 사슬 폴리뉴클레오티드 서열에서 발견되는 전체수가 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 이상(이에 한정되지 않음)과 같이 광범위하다는 사실은 당업자에게 자명하다.

한 실시 양태에서, 본 방법은 하나 이상의 비천연 아미노산을 생체 내로 도입시키기 위해 정지 코돈인 셀렉터 코돈을 사용하는 단계를 수반한다. 예를 들어, 정지 코돈, 예컨대 이에 제한되지는 않지만 UAG를 인지하는 O-tRNA를 생성하고, 원하는 비천연 아미노산을 사용하여 O-RS로 아미노아실화시킨다. 이러한 O-tRNA는 자연 발생 숙주의 아미노아실-tRNA 합성효소에 의해 인지된다. 해당 폴리펩티드 소정의 부위에 정지 코돈, 예컨대 이에 제한되지는 않지만 TAG를 도입시키는데 통상적인 특정 부위 돌연변이 유발법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Sayers, J.R., et al., (1988), 5'-3' Exonuclease in a phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res, 16: 791-802]을 참조할 수 있다. 상기 O-RS, O-tRNA 및 해당 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 생체 내에서 조합되는 경우, 비천연 아미노산은 UAG 코돈에 대응해 통합되어 특정한 위치에 비천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드를 제공하게 된다.

생체 내 비천연 아미노산의 도입은 진핵 숙주 세포에 큰 변화를 주지 않고 수행될 수 있다. 예를 들어, UAG 코돈에 대한 억제 효율은 O-tRNA (앰버 억제제 tRNA를 포함하며 이에 한정되지 않음)와 진핵 방출 인자 (eRF를 포함하며 이에 한정되지 않음) (이것은 정지 코돈에 결합하여 리보좀으로부터 성장 펩티드의 방출을 개시함) 사이의 경쟁에 따라 좌우되기 때문에, 상기 억제 효율은 O-tRNA 및/또는 억제제 tRNA의 발현량을 증가시키는 것 등(이에 한정되지 않음)에 의해 조절될 수 있다.

비천연 아미노산은 희귀 코돈으로도 코딩될 수 있다. 예를 들어, 시험관 내 단백질 합성 반응에서 아르기닌 농도가 감소되는 경우, 희귀 아르기닌 코돈인 AGG는 알라닌으로 아실화된 합성 tRNA에 의해 Ala의 삽입에 효율적인 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 문헌 [Ma et al., Biochemistry, 32:7939 (1993)]을 참조할 수 있다. 이 경우, 상기 합성 tRNA는 대장균 내에서 소수의 종으로 존재하는 자연 발생 tRNAArg와 경쟁한다. 어떤 유기체들은 세글자 코돈 모두를 사용하는 것은 아니다. 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus)의 비지정된 코돈 AGA는 시험관 내 전사/번역 추출물 내의 아미노산 삽입을 위해 이용되어 왔다. 예를 들어, 문헌 [Kowal and Oliver, Nucl. Acid. Res., 25:4685 (1997)]을 참조할 수 있다. 본 발명의 성분들이 생체 내에서 이러한 희귀 코돈들을 사용하도록 제조될 수 있다.

또한, 셀렉터 코돈은 4개 이상의 염기 코돈, 예를 들어, 4개, 5개, 6개 또는 그 이상의 염기 코돈(이에 한정되지 않음)을 비롯한 연장된 코돈을 포함한다. 4개의 염기 코돈의 예로서는, 이에 제한되지는 않지만, AGGA, CUAG, UAGA, CCCU 등을 포함한다. 5개의 염기 코돈의 예로서는, 이에 한정하지는 않지만, AGGAC, CCCCU, CCCUC, CUAGA, CUACU, UAGGC 등을 포함한다. 본 발명의 한 특징으로서 골격이동 (frameshift) 억제를 기초로 한 연장된 코돈을 사용한다는 점을 포함한다. 4개 이상의 염기 코돈은 예컨대, 하나 또는 다수의 비천연 아미노산(이에 제한되지 않음)을 동일한 단백질에 삽입시킬 수 있다. 예를 들어, 돌연변이 유발된 O-tRNA(예컨대, 이에 제한되지는 않지만 8-10 nt 이상의 안티코돈 루프를 갖는 특정 골격이동 억제자 tRNA를 포함함)의 존재 하에서는, 4개 이상의 염기 코돈은 단일 아미노산으로서 판독된다. 다른 실시 양태에서, 안티코돈 루프는 이에 한정되지는 않지만, 4개 이상의 염기 코돈, 5개 이상의 염기 코돈, 또는 6개 이상의 염기 코돈 또는 그 이상의 염기 코돈을 디코딩 (decoding) 할 수 있다. 256 개의 가능한 4-염기 코돈이 존재하기 때문에, 다수의 비천연 아미노산은 4개 이상의 염기 코돈을 사용하여 동일한 세포 내에서 코딩될 수 있다. 문헌 [Anderson et al., (2002) Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size, Chemistry and Biology, 9: 237-244], [Magliery, (2001) Expanding the Genetic Code: Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of "Shifty" Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli, J. Mol. Biol. 307: 755-769]을 참조할 수 있다.

예를 들어, 4-염기 코돈은 시험관 내 생합성 방법을 사용해 비천연 아미노산을 단백질에 도입시키는 데 사용되어 왔다. 이것과 관련해서는, 예를 들어, 문헌 [Ma et al., (1993) Biochemistry. 32: 7939] 및 [Hohsaka et al., (1999) J. Am. Chem. Soc. 121: 34]을 참조할 수 있다. CGGG 및 AGGU는 2개의 화학적으로 아실화된 골격이동 억제자 tRNA를 사용하여 시험관 내에서 2-나프틸알라닌 및 리신의 NBD 유도체를 스트렙타비딘에 동시 도입시키는 데 사용되었다. 이와 관련해서는, 예를 들어, 문헌 [Hohsaka et al., (1999) J. Am. Chem. Soc., 121: 12194]을 참조할 수 있다. 생체 내 연구에서, 무어 (Moore) 등은 UAGN 코돈 (N은 U, A, G 또는 C일 수 있음)을 억제하는 NCUA 안티코돈을 갖는 tRNALeu 유도체의 역량을 조사하여, 4중체 UAGA가 0 또는 -1 골격(frame)에서 거의 디코딩하지 않으면서 UCUA 안티코돈을 갖는 tRNALeu에 의하여 13% 내지 26%의 효율로 디코딩될 수 있다는 것을 발견하였다. 이와 관련해서는, 문헌 [Moore et al., (2000) J. Mol. Biol., 298: 195]을 참조할 수 있다. 한 실시 양태에서, 희귀 코돈 또는 넌센스 코돈을 기초로 한 연장된 코돈은 본 발명에서 사용되어, 다른 원치 않는 부위에서 착의 통독 (missense readthrough) 및 골격이동 억제를 감소시킬 수 있다.

자연 염기 코돈을 사용하지 않는 (또는 드물게 사용하는) 내인성 시스템인 하나의 소정의 시스템에 있어서, 셀렉터 코돈은 3개의 자연 염기 코돈 중 하나를 포함할 수도 있다. 예를 들어, 이러한 것으로는 3개의 자연 염기 코돈을 인식하는 tRNA가 결여된 시스템 및/또는 3개의 염기 코돈이 희귀 코돈인 시스템을 포함한다.

셀렉터 코돈은 비천연 염기쌍을 포함할 수 있다. 이러한 비천연 염기쌍은 기존의 유전자 알파벳을 더 확장시킨다. 여분의 한 염기쌍은 3중 코돈의 수를 64개에서 125개로 증가시킨다. 세 번째 염기쌍의 특성으로는 안정하고 선택적인 염기쌍 맞춤, 중합효소에 의해 높은 정확도를 갖는 DNA로의 효율적인 효소적 도입, 그리고 비천연 염기쌍의 신생 합성 후 프라이머 신장의 효과적인 지속성을 포함한다. 본 발명의 방법 및 조성물에 적용할 수 있는 비천연 염기쌍에 대한 상세한 설명이 기재된 문헌으로서는 예를 들어, 문헌 [Hirao, et al., (2002) An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein, Nature Biotechnology. 20: 177-182]을 포함한다. 또한, 문헌 [Wu, Y., et al., (2002) J. Am. Chem. Soc. 124: 14626-14630]을 참조할 수 있다. 다른 관련 간행물들은 하기에 열거된다.

생체 내 사용에 있어서, 비천연 뉴클레오사이드는 막 투과성이며, 인산화되어 이에 해당하는 3인산염을 형성한다. 또한, 증가된 유전 정보는 안정하며 세포 효소에 의해 파괴되지 않는다. 종래 베너 (Benner) 및 다른 연구자들은 고전적인 왓슨-크릭의 염기쌍의 경우와는 다른 수소 결합 패턴을 이용하려고 애썼는데, 이들 중 가장 주목할만한 예는 이소-C:이소-G 쌍이다. 이와 관련해서는 예를 들어, 문헌 [Switzer et al., (1989) J. Am. Chem. Soc., 111: 8322], [Piccirilli et al., (1990) Nature, 343: 33] 및 [Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4: 602]을 참조할 수 있다. 이러한 염기들은 일반적으로 자연 염기와는 다소 쌍맞춤에서 착오가 발생 (mispairing)하여 효소적으로 복제될 수 없다. 쿨 (Kool) 및 그의 공동연구자들은 염기들 간의 소수성 패킹 (packing) 상호작용이 수소 결합을 대체하여 염기쌍의 형성을 유도할 수 있다는 사실을 입증하였다. 이와 관련해서는 문헌 [Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4: 602] 및 [Guckian and Kool, (1998) Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 36, 2825]을 참조할 수 있다. 상기한 요건을 모두 만족하는 비천연 염기쌍을 개발하려는 노력의 일환으로서, 슐츠 (Schultz), 로메스버그 (Romesberg) 및 그들의 공동연구자들은 일련의 비천연 소수성 염기들을 체계적으로 합성하여 이를 연구하였다. PICS:PICS 자체 쌍 (self-pair)은 자연 염기쌍보다 안정하여, 대장균 DNA 중합효소 I (KF)의 클레노우 (Klenow) 단편에 의해 DNA 내로 효과적으로 도입될 수 있음이 밝혀졌다. 예를 들어, 문헌 [McMinn et al., (1999) J. Am. Chem. Soc., 121: 11585-6] 및 [Ogawa et al., (2000) J. Am. Chem. Soc., 122: 3274]을 참조할 수 있다. 3MN:3MN 자체 쌍은 생물학적 기능에 충분히 효율적이고 선택적으로 KF에 의해 합성될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Ogawa et al., (2000) J. Am. Chem. Soc. 122: 8803]을 참조할 수 있다. 그러나, 이러한 염기들은 모두 추가의 복제에 대한 사슬 종결자로서 작용한다. 최근에는, PICS 자체 쌍을 복제하는 데 사용될 수 있도록 하는 DNA 중합효소 돌연변이체가 개발되었다. 또한, 7AI 자체 쌍도 복제될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Tae et al., (2001) J. Am. Chem. Soc., 123: 7439]을 참조할 수 있다. 또한, 신규한 금속성 염기쌍, Dipic:Py도 개발되었는데, 이는 Cu(II)와 결합할 때 안정한 쌍을 형성한다. 이에 대해서는 문헌 [Meggers et al., (2000) J. Am. Chem. Soc., 122: 10714]을 참조할 수 있다. 연장된 코돈 및 비천연 코돈은 본래 천연 코돈에 직교하기 때문에, 본 발명의 방법은 이러한 특성을 이용해 이들에 대해서 오르쏘고날 tRNA를 생성할 수 있다.

또한, 우회 번역 (translational bypassing) 시스템을 사용하면 비천연 아미노산을 원하는 폴리펩티드 내에 도입할 수 있다. 우회 번역 시스템에서, 큰 서열은 유전자로 도입되긴 하지만 단백질로 번역되지 않는다. 여기서 이 서열은 리보좀으로 하여금 그 서열을 건너뛰어서 하류에 삽입된 서열의 번역을 재개하라는 신호로 작용하는 구조를 포함한다.

특정 실시 양태에서, 본 발명의 방법 및/또는 조성물 중의 단백질 또는 해당 폴리펩티드 (또는 이의 일부분)는 핵산에 의하여 코딩된다. 보통, 상기 핵산은 하나 이상의 셀렉터 코돈, 2개 이상의 셀렉터 코돈, 3개 이상의 셀렉터 코돈, 4개 이상의 셀렉터 코돈, 5개 이상의 셀렉터 코돈, 6개 이상의 셀렉터 코돈, 7개 이상의 셀렉터 코돈, 8개 이상의 셀렉터 코돈, 9개 이상의 셀렉터 코돈, 10개 이상의 셀렉터 코돈을 포함한다.

해당 단백질 또는 폴리펩티드에 대한 유전자 코딩에 대해서는, 예를 들어 비천연 아미노산의 도입을 위한 하나 이상의 셀렉터 코돈을 비롯하여 당업자의 숙련자에게 공지되고 본 명세서에 기술된 방법을 사용해 돌연변이를 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 해당 단백질에 대한 핵산에 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하도록 돌연변이를 생성시켜 하나 이상의 비천연 아미노산을 도입할 수 있다. 본 발명은 예컨대, 이에 제한되지는 않으나 임의의 이러한 변이체(예컨대 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 임의의 단백질의 돌연변이체 형태를 포함하며 이에 한정되지는 않음)를 포함한다. 이와 유사하게, 본 발명은 또한 대응하는 핵산, 즉 하나 이상의 비천연 아미노산을 코딩하는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 보유하는 임의의 핵산도 포함한다.

인슐린 폴리펩티드와 같은 해당 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 쉽게 돌연변이 조작하여 폴리펩티드의 임의의 원하는 위치에 시스테인을 도입할 수 있다. 시스테인은 반응성 분자, 수용성 중합체, 단백질 또는 광범위하게 다양한 기타 분자를 해당 단백질에 도입시키는 데 널리 사용된다. 시스테인을 폴리펩티드의 원하는 위치에 도입시키기에 적절한 방법은 미국 특허 제6,608,183호(본원에 참고로 포함됨)에 기술된 방법들 및 표준 돌연변이 유발 기법과 같이 당업계에 공지되어 있다.

비천연적으로 코딩된 아미노산

본 발명에서 사용하기에 적합한 비천연적으로 코딩된 아미노산은 매우 광범위하게 다양하다. 비천연적으로 코딩된 아미노산은 임의의 수로 인슐린 폴리펩티드에 도입될 수 있다. 일반적으로, 상기 도입된 비천연적으로 코딩된 아미노산은 유전학적으로 코딩된 20개의 통상적인 아미노산(즉, 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린)에 대해 사실상 화학적으로 불활성이다. 일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 20개의 통상적인 아미노산에서 발견되지 않는 작용기(아지도, 케톤, 알데히드 및 아미노옥시 기를 포함하며 이에 한정되지 않음)와 효율적이고 선택적으로 반응하여 안정한 접합체를 형성하는 측쇄 작용기를 포함한다. 예를 들어, 아지도 작용기를 함유하는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 인슐린 폴리펩티드는 중합체[폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하며 이에 한정되지 않음] 또는 다르게는, 알킨 부분을 함유하는 제2 폴리펩티드와 반응해서, 아지드 및 알킨 작용기의 선택적 반응에 의한 휘스겐 [3 + 2] 시클로 첨가 생성물이 만들어진 결과로서 안정한 접합체를 형성할 수 있다.

α-아미노산의 일반적인 구조는 하기와 같이 표현된다(하기 화학식 I 참조).

[화학식 I]

비천연적으로 코딩된 아미노산은 통상 상기 나열된 화학식을 갖는 임의의 구조인데, 여기서 R 기는 20개의 자연 아미노산에 사용되는 것 이외의 임의의 치환기이며, 이는 본 발명에 사용하기에 적합할 수 있다. 본 발명의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 통상 단지 측쇄의 구조에서만 자연 아미노산과 상이하기 때문에, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 다른 아미노산(예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 자연적으로 또는 비천연적으로 코딩된 아미노산)과 동일한 방식(이들이 자연 발생 폴리펩티드에서 형성되는 것과 동일한 방식)으로 아미드 결합을 형성한다.

그러나, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 자연 아미노산과는 구별되는 측쇄 기를 갖는다. 예를 들어, R은 알킬-, 아릴-, 아실-, 케토-, 아지도-, 히드록실-, 히드라진, 시아노-, 할로-, 히드라지드, 알케닐, 알키닐, 에테르, 티올, 셀레노-, 설포닐-, 보레이트, 보로네이트, 포스포, 포스포노, 포스핀, 헤테로시클릭, 에논, 이민, 알데히드, 에스테르, 티오산, 히드록실아민, 아미노 기 등, 또는 이들의 임의의 조합체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합할 수 있는 해당 비자연 발생 아미노산의 다른 종류로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 광활성화 가능한 가교 결합제를 포함하는 아미노산, 스핀 표지화된 아미노산, 형광 아미노산, 금속결합 아미노산, 금속 함유 아미노산, 방사성 아미노산, 신규한 작용기를 갖는 아미노산, 다른 분자와 공유 또는 비공유적으로 상호작용하는 아미노산, 포토케이징되고/되거나 광이성질화 가능한 아미노산, 비오틴 또는 비오틴 유사체를 포함하는 아미노산, 글리코실화 아미노산, 예컨대 당 치환된 세린, 탄수화물이 변형된 다른 아미노산, 케토 함유 아미노산, 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에테르를 포함하는 아미노산, 무거운 원자로 치환된 아미노산, 화학적으로 분절가능하고/하거나 광분절성인 아미노산, 자연 아미노산에 비해 신장된 측쇄(예컨대, 이에 한정되지는 않지만, 약 5개 초과 또는 약 10개를 초과하는 개수의 탄소를 포함하는 장쇄 탄화수소 또는 폴리에테르를 포함함)를 갖는 아미노산, 탄소가 결합된 당 함유 아미노산, 산화환원 활성 아미노산, 아미노 티오산 함유 아미노산 및 하나 이상의 독성 부분을 함유하는 아미노산을 포함한다.

본 발명에서 사용하기에 적합할 수 있으며 수용성 중합체와의 반응에 유용한 대표적인 비천연적으로 코딩된 아미노산으로서는, 이에 한정하는 것은 아니지만, 카르보닐, 아미노옥시, 히드라진, 히드라지드, 세미카르바지드, 아지드 및 알킨 반응성 기를 아미노산들을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 사카라이드 부분을 포함한다. 이러한 아미노산의 예로서는 N-아세틸-L-글루코사미닐-L-세린, N-아세틸-L-갈락토사미닐-L-세린, N-아세틸-L-글루코사미닐-L-트레오닌, N-아세틸-L-글루코사미닐-L-아스파라긴 및 O-만노사미닐-L-세린을 포함한다. 또한, 이러한 아미노산의 예로서 아미노산과 사카라이드 간의 자연 발생 N-결합 또는 0-결합이 자연 상태에서는 흔히 발견되는 것이 아닌 공유 결합, 예컨대 이에 한정되지는 않지만 알켄, 옥심, 티오에테르, 아미드 등의 공유 결합으로 대체되는 아미노산들을 포함한다. 또한, 이러한 아미노산의 예로서 자연 발생 단백질에서는 통상 발견되는 것이 아닌 사카라이드, 예컨대 2-데옥시-글루코스, 2-데옥시갈락토스 등을 포함한다.

본 명세서에 제공된 다수의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 예를 들어, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) (미국 미주리주 세인트 루이스 소재), 노나바이오켐(Novabiochem) [독일 다름슈타트 소재의 이엠디 바이오사이언시즈(EMD Biosciences)의 분사], 또는 펩테크(Peptech) (미국 메사추세츠주 버링톤 소재)에서 시판된다. 시판되지 않은 것들은 본 명세서에 제공된 바와 같이 또는 당업자에게 공지된 표준 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 유기 합성 기법에 대해서는, 예를 들어, 문헌 [Organic Chemistry by Fessendon and Fessendon, (1982, Second Edition, Willard Grant Press, Boston Mass.)], [Advanced Organic Chemistry by March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, NewYork)] 및 [Advanced Organic Chemistry by Carey and Sundberg (Third Edition, Parts A and B, 1990, Plenum Press, New York)]을 참조할 수 있다. 또한, 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 제7,045,337호와 제7,083,970호를 참조할 수 있다. 또한, 신규한 측쇄를 함유하는 비천연 아미노산 이외에, 본 발명에 사용하기에 적합할 수 있는 비천연 아미노산은 이에 한정되지는 않으나 하기 화학식 II 및 화학식 III의 구조와 같이 도시되는 변형된 백본 구조를 포함할 수 있다.

[화학식 II]

[화학식 III]

상기 식 중, Z는 통상 OH, NH₂, SH, NH-R' 또는 S-R'를 포함하고, X와 Y는 동일하거나 또는 서로 다를 수 있으며, 보통 S 또는 O를 포함하고, R 및 R'는 동일하거나 또는 서로 다를 수 있으며, 통상 화학식 I을 갖는 비천연 아미노산에 대해서 상기에서 기술한 R 기에 대한 구성 성분의 동일한 목록뿐만 아니라 수소로부터 선택된다. 예를 들어, 본 발명의 비천연 아미노산은 화학식 II 및 화학식 III으로 도시되는 바와 같이 아미노 또는 카르복실기에서 치환을 포함한다. 이러한 종류의 비천연 아미노산은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 예컨대 통상적인 20개의 천연 아미노산에 대응하는 측쇄 또는 비천연 측쇄(이에 한정되지 않음)를 갖는 α-히드록시산, α-티오산, α-아미노티오카르복실레이트를 포함한다. 또한, α-탄소에서의 치환은 이에 제한되지는 않지만 L, D 또는 α-α-이치환된 아미노산, 예컨대 D-글루타메이트, D-알라닌, D-메틸-O-티로신, 아미노부티르산 등을 포함한다. 기타 구조적 대체물로서는 시클릭 아미노산, 예컨대 프롤린 유사체뿐만 아니라 3원, 4원, 6원, 7원, 8원 및 9원 고리 프롤린 유사체, β 및 γ 아미노산, 예컨대 치환된 β-알라닌 및 γ-아미노 부티르산을 포함한다.

다수의 비천연 아미노산은 자연 아미노산, 예를 들어 티로신, 글루타민, 페닐알라닌 등을 기반으로 하여 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 티로신 유사체는 이에 한정되지는 않지만, 파라 치환된 티로신, 오르쏘 치환된 티로신 및 메타 치환된 티로신을 포함하며, 여기서 상기 치환된 티로신은 이에 한정하지는 않으나 케토기(아세틸 기를 포함하며 이에 한정되지 않음), 벤조일기, 아미노기, 히드라진, 히드록시아민, 티올기, 카르복시기, 이소프로필기, 메틸기, C₆-C₂₀ 직쇄형 또는 분지쇄형 탄화수소, 포화 또는 불포화 탄화수소, O-메틸기, 폴리에테르기, 니트로기, 알키닐기 등을 포함한다. 또한, 다중 치환된 아릴 고리도 고려된다. 본 발명에서 사용하기에 적합할 수 있는 글루타민 유사체로서는, 이에 한정하지는 않으나 α-히드록시 유도체, γ-치환된 유도체, 시클릭 유도체 및 아미드 치환된 글루타민 유도체를 포함한다. 본 발명에서 사용하기에 적합할 수 있는 예시적인 페닐알라닌 유사체로서는, 이에 한정하지는 않지만 파라 치환된 페닐알라닌, 오르쏘 치환된 페닐알라닌 및 메타 치환된 페닐알라닌을 포함하며, 여기서 상기 치환기는 이에 한정되지는 않지만 히드록시기, 메톡시기, 메틸기, 알릴기, 알데히드, 아지도, 요오도, 브로모, 케토기(아세틸 기를 포함하며 이에 한정되지 않음), 벤조일, 알키닐기 등을 포함한다. 본 발명에서 사용하기에 적합할 수 있는 비천연 아미노산의 구체적인 예로서는, 이에 제한되지는 않지만, p-아세틸-L-페닐알라닌, O-메틸-L-티로신, L-3-(2-나프틸)알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, O-4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, 트리-O-아세틸-GlcNAc-β-세린, L-도파(Dopa), 불소화 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, L-포스포세린, 포스포노세린, 포스포노티로신, p-요오도-페닐알라닌, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L-페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌 및 p-프로파르길옥시-페닐알라닌 등을 포함한다. 본 발명에 사용하기 적합할 수 있는 다양한 비천연 아미노산의 구조의 예로서는, 예를 들어 발명의 명칭이 "In vivo incorporation of unnatural amino acids"인 WO 2002/085923에 제공되어 있다. 또한, 추가의 메티오닌 유사체들에 대해서는 문헌 [Kiick et al., (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99: 19-24](본원에 참고로 포함됨)을 참조할 수 있다. 발명의 명칭이 "Compositions Containing, Methods Involving, and Uses of Non-natural Amino Acids and Polypeptides"인 국제특허 PCT/US06/47822(본 발명에 참고로 포함됨)는 방향족 아민 부분, 예컨대 이에 제한하지는 않지만, p-아미노-페닐알라닌의 환원적 알킬화 및 환원적 아민화를 기술하고 있다.

한 실시 양태에서, 비천연 아미노산 (예를 들어, p-(프로파르길옥시)-페닐알라닌)을 포함하는 인슐린 폴리펩티드의 조성물이 제공된다. 또한, p-(프로파르길옥시)-페닐알라닌을 포함하고, 이에 한정하지는 않으나 단백질 및/또는 세포도 포함하는 다양한 조성물도 제공된다. 한 측면에서, p-(프로파르길옥시)-페닐알라닌 비천연 아미노산을 포함하는 조성물은 오르쏘고날 tRNA를 더 포함한다. 비천연 아미노산은 오르쏘고날 tRNA에 결합(공유 결합을 포함하며 이에 한정되지 않음)할 수 있는데, 이러한 예로서는 이에 한정하는 것은 아니나, 아미노-아실 결합을 통해 오르쏘고날 tRNA에 공유 결합하는 예, 오르쏘고날 tRNA의 말단 리보오스 당의 3' OH 또는 2' OH에 공유 결합하는 예 등을 포함할 수 있다.

비천연 아미노산을 통해 단백질로 통합될 수 있는 화학적 부분은 여러 가지 이점 및 다양한 단백질의 처리 조작 형태를 제공한다. 예를 들어, 케토 작용기의 독특한 반응성은 히드라진 또는 히드록실아민을 함유하는 임의 다수의 시약을 이용하여 단백질을 시험관 내 및 생체 내에서 선택적으로 변형시킬 수 있게 한다. 무거운 원자의 비천연 아미노산은, 예컨대 X선 구조 데이터를 위상 조정하는 데 유용할 수 있다. 또한, 비천연 아미노산을 사용한 무거운 원자의 부위 특이적 도입은 무거운 원자에 대한 위치를 선택하는 데 있어서 선택성과 유연성을 제공한다. 예를 들어, 광반응성 비천연 아미노산[예컨대, 이에 한정되지는 않지만, 벤조페논 및 아릴아지드(페닐아지드를 포함하며 이에 한정되지 않음) 측쇄를 갖는 아미노산을 포함함]은 생체 내 및 시험관 내에서 단백질의 효과적인 광가교 결합을 가능하게 한다. 광반응성 비천연 아미노산의 예로서는, 이에 한정하지는 않으나, p-아지도-페닐알라닌 및 p-벤조일-페닐알라닌을 포함한다. 상기 광반응성 비천연 아미노산을 갖는 단백질은 광반응성기를 제공하는 시간 제어(temporal control)의 여기 방식에 의해 원하는 대로 가교 결합시킬 수 있다. 일례로, 비천연 아미노의 메틸기는, 핵자기공명 및 진동 분광학을 포함하며 이에 한정되지 않는 역학을 이용하여, 국소 구조의 프로브로서 동위 원소 표지된, 예컨대 메틸기(이에 한정하지 않음)로 치환될 수 있다. 예를 들어, 알키닐 또는 아지도 작용기는 분자들의 [3 + 2] 시클로 첨가 반응을 통해 단백질을 선택적으로 변형시킨다.

폴리펩티드의 아미노 말단에 도입된 비천연 아미노산은 20개의 자연 아미노산에서 사용되는 것 이외의 임의의 치환기인 R기와, α-아미노산 중에 통상적으로 존재하는 NH₂기(화학식 I 참조)와는 다른 제2 반응성기로 이루어질 수 있다. α-아미노산 중에 통상적으로 존재하는 COOH기(화학식 I 참조)와는 다른 제2 반응성기를 갖는 유사한 비천연 아미노산이 카르복실 말단에 도입될 수 있다.

본 발명의 비천연 아미노산은 20개의 자연 아미노산에서는 찾아볼 수 없는 추가적인 특성들을 제공하도록 선택되거나 고안될 수 있다. 예를 들어, 비천연 아미노산은 예컨대 그들이 도입되는 단백질의 생물학적 특성들을 변화시키도록 고안되거나 선택될 수 있다. 예를 들어, 단백질 내로 비천연 아미노산을 포함시켜 하기의 특성들을 임의적으로 변화시킬 수 있다: 독성, 생체 편재율, 가용성, 안정성, 예를 들어, 열 안정성, 수분에 대한 안정성, 산화 안정성, 효소적 분해에 대한 저항성 등, 정제 및 처리 기능성, 구조적 특성, 분광학적 특성, 화학 및/또는 광화학적 특성, 촉매 활성, 산화환원 전위, 반감기, 다른 분자와의 반응 역량(예를 들어, 공유 또는 비공유적으로 결합하는 능력 등).

비천연 아미노산의 구조 및 합성: 카르보닐기, 유사 카르보닐기, 차폐된 카르보닐기, 보호된 카르보닐기 및 히드록실아민기

일부 실시 양태에서, 본 발명은 옥심 결합에 의해 수용성 중합체 예를 들어, PEG에 결합된 인슐린을 제공한다.

여러 유형의 비천연적으로 코딩된 아미노산들이 옥심 결합을 형성하는데 적합하다. 이러한 것들로서는, 이에 한정되지는 않지만, 카르보닐기, 디카르보닐기 또는 히드록실아민기를 함유하는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다. 이러한 아미노산들은 미국특허공보 제2006/0194256호, 제2006/0217532호 및 제2006/0217289호 그리고 발명의 명칭이 "Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides"인 WO 2006/069246(본원에 이 내용 전체가 참고로 포함됨)에 기술되어 있다. 비천연적으로 코딩된 아미노산들에 대해서는 미국특허 제7,083,970호 및 미국특허 제7,045,337호(이들은 그 내용 전체가 본원에 참조로 포함됨)에도 기술되어 있다.

본 발명의 일부 실시 양태는 하나 이상의 위치에서 파라-아세틸페닐알라닌 아미노산으로 치환된 인슐린 폴리펩티드를 이용한다. p-아세틸-(+/-)-페닐알라닌과 m-아세틸-(+/-)-페닐알라닌의 합성에 대해서는 문헌 [Zhang, Z., et al., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003)](본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 카르보닐 또는 디카르보닐을 함유하는 다른 아미노산은 당업계의 숙련자들에 의해 유사한 방식으로 제조될 수 있다. 또한, 본원에 포함되는 비천연 아미노산의 비제한적인 대표적 합성효소는 미국특허 제7,083,970호(본원에 그 내용 전체가 참조로 포함됨)의 도면 4, 24-34 및 36-39에 제시되어 있다.

친전자성 반응기를 갖는 아미노산은 여러 반응 중에서도 친핵성 첨가 반응을 통해 다양한 결합을 허용하여 분자들을 결합시킨다. 이러한 친전자성 반응기로서는 카르보닐기(케토기 및 디카르보닐기를 포함함), 유사 카르보닐기(카르보닐기(케토기 및 디카르보닐기를 포함함)와 유사한 반응성을 가지며, 카르보닐기와 구조적으로 유사함), 차폐된 카르보닐기(카르보닐기(케토기 및 디카르보닐기를 포함함)로 쉽게 전환될 수 있음) 또는 보호된 카르보닐기(탈보호시 카르보닐기(케토기 및 디카르보닐기를 포함함)와 유사한 반응성을 가짐)를 포함한다. 이러한 아미노산으로서는 하기 화학식 IV의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다.

[화학식 IV]

상기 식 중,

A는 선택적인 것으로, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌 또는 치환된 아랄킬렌이고,

B는 선택적인 것으로, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)_kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(0)_kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N= -C(R')₂-N=N- 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택된 링커(여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬임)이고,

J는

이며,

R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고, 각각의 R"는 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬 또는 보호기이거나, 또는 하나 이상의 R"기가 존재하는 경우, 2개의 R"는 헤테로시클로알킬을 형성할 수 있으며,

R₁은 선택적인 것으로, 존재하는 경우에는 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고,

R₂는 선택적인 것으로, 존재하는 경우에는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며,

R₃ 및 R₄는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환된 저급 알킬이거나, R₃와 R₄ 혹은 2개의 R₃기가 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성할 수 있고,

또는 -A-B-J-R 기들은 함께 하나 이상의 카르보닐기, 예컨대 디카르보닐기, 보호된 카르보닐기, 예컨대 보호된 디카르보닐기, 또는 차폐된 카르보닐기, 예컨대 차폐된 디카르보닐기를 포함하는 바이시클릭 또는 트리시클릭 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하며,

또는 -J-R 기는 함께 하나 이상의 카르보닐기, 예컨대 디카르보닐기, 보호된 카르보닐기, 예컨대 보호된 디카르보닐기, 또는 차폐된 카르보닐기, 예컨대 차폐된 디카르보닐기를 포함하는 모노시클릭 또는 바이시클릭 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;

단, A가 페닐렌이고 R₃이 각각 H인 경우, B가 존재하며; A가 -(CH₂)₄-이고 R₃이 각각 H인 경우, B는 -NHC(O)(CH₂CH₂)-가 아니고; A와 B가 부재하며 R₃이 각각 H인 경우, R은 메틸이 아니다.

또한, 하기 화학식 V의 구조를 갖는 아미노산들도 포함된다.

[화학식 V]

상기 식 중,

R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고,

단, A가 페닐렌인 경우, B가 존재하며; A가 -(CH₂)₄-인 경우, B는 -NHC(O)(CH₂CH₂)-가 아니고; A와 B가 부재하는 경우, R은 메틸이 아니다.

또한, 하기 화학식 VI의 구조를 갖는 아미노산들도 포함된다.

[화학식 VI]

상기 식 중,

B는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)_kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(0)_kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N= -C(R')₂-N=N- 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택된 링커(여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬임)이고,

각각의 R_a는 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')₂, -C(0)_kR'(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -C(0)N(R')₂, -OR' 및 -S(O)_kR'로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다(여기서, 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임).

또한, 하기 아미노산들도 포함된다.

여기서, 이러한 화합물들은 아미노 보호, 카르복실 보호될 수 있으며, 이러한 것들의 염일 수 있다. 또한, 하기의 비천연 아미노산들 중 임의의 아미노산이 비천연 아미노산 폴리펩티드 내로 도입될 수 있다.

또한, 하기 화학식 VII의 구조를 갖는 아미노산들도 포함된다.

[화학식 VII]

상기 식 중,

각각의 R_a는 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')₂, -C(0)_kR'(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -C(0)N(R')₂, -OR' 및 -S(O)_kR'로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고(여기서, 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임), n은 0 내지 8이다.

또한, 하기 아미노산들도 포함된다.

여기서, 이러한 화합물들은 아미노 보호, 카르복실 보호, 아미노 및 카르복실 보호될 수 있으며, 이러한 것들의 염일 수 있다. 또한, 이러한 비천연 아미노산들과, 하기의 비천연 아미노산들 중 임의의 아미노산이 비천연 아미노산 폴리펩티드 내로 도입될 수 있다.

또한, 하기 화학식 VIII의 구조를 갖는 아미노산들도 포함된다.

[화학식 VIII]

상기 식 중,

R₂는 선택적인 것으로, 존재하는 경우에는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이다.

또한, 하기 화학식 IX의 구조를 갖는 아미노산들도 포함된다.

[화학식 IX]

상기 식 중,

또한, 하기 아미노산들도 포함된다.

또한, 하기 화학식 X의 구조를 갖는 아미노산들도 포함된다.

[화학식 X]

상기 식 중,

또한, 하기 아미노산들도 포함된다.

모노카르보닐 구조 이외에도, 본 명세서에 기술된 비천연 아미노산은 디카르보닐기, 유사 디카르보닐기, 차폐된 디카르보닐기 및 보호된 디카르보닐기와 같은 기들을 포함할 수 있다.

예를 들어, 하기 화학식 XI의 구조를 갖는 하기의 아미노산들도 포함된다.

[화학식 XI]

상기 식 중,

또한, 하기 화학식 XII의 구조를 갖는 아미노산들도 포함된다.

[화학식 XII]

상기 식 중,

또한, 하기 아미노산들도 포함된다.

또한, 하기 화학식 XIII의 구조를 갖는 아미노산들도 포함된다.

[화학식 XIII]

상기 식 중,

또한, 하기 아미노산들도 포함된다.

또한, 하기 화학식 XIV의 구조를 갖는 아미노산들도 포함된다.

[화학식 XIV]

상기 식 중,

R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이며,

X₁은 C, S 또는 S(O)이고, L은 알킬렌, 치환된 알킬렌, N(R')(알킬렌) 또는 N(R')(치환된 알킬렌)이며, 여기서 R'는 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이다.

또한, 하기 화학식 XIV-A의 구조를 갖는 하기 아미노산들도 포함된다.

[화학식 XIV-A]

상기 식 중,

L은 알킬렌, 치환된 알킬렌, N(R')(알킬렌) 또는 N(R')(치환된 알킬렌)이며, 여기서 R'는 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이다.

또한, 하기 화학식 XIV-B의 구조를 갖는 하기 아미노산들도 포함된다.

[화학식 XIV-B]

상기 식 중,

또한, 하기 화학식 XV의 구조를 갖는 하기 아미노산들도 포함된다.

[화학식 XV]

상기 식 중,

X₁은 C, S 또는 S(O)이고, n은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이며, CR⁸R⁹기 상의 R⁸과 R⁹는 H, 알콕시, 알킬아민, 할로겐, 알킬 및 아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 임의의 R⁸과 R⁹는 함께 =0 또는 시클로알킬을 형성할 수 있거나, 또는 R⁸기에 인접한 임의의 기들은 함께 시클로알킬을 형성할 수 있다.

또한, 하기 화학식 XV-A의 구조를 갖는 아미노산들도 포함된다.

[화학식 XV-A]

상기 식 중,

n은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이며, CR⁸R⁹기 상의 R⁸과 R⁹는 H, 알콕시, 알킬아민, 할로겐, 알킬 및 아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 임의의 R⁸과 R⁹는 함께 =0 또는 시클로알킬을 형성할 수 있거나, 또는 R⁸기에 인접한 임의의 기들은 함께 시클로알킬을 형성할 수 있다.

또한, 하기 화학식 XV-B의 구조를 갖는 아미노산들도 포함된다.

[화학식 XV-B]

상기 식 중,

또한, 하기 화학식 XVI의 구조를 갖는 하기 아미노산들도 포함된다.

[화학식 XVI]

상기 식 중,

또한, 하기 화학식 XVI-A의 구조를 갖는 아미노산들도 포함된다.

[화학식 XVI-A]

상기 식 중,

또한, 하기 화학식 XVI-B의 구조를 갖는 아미노산들도 포함된다.

[화학식 XVI-B]

상기 식 중,

또한, 하기 화학식 XVII의 구조를 갖는 아미노산들도 포함된다.

[화학식 XVII]

상기 식 중,

M은 -C(R₃)-,

이며,

여기서 (a)는 A기에 대한 결합을 나타내고 (b)는 각각의 카르보닐기들에 대한 결합을 나타내며, R₃과 R₄는 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 R₃과 R₄ 혹은 2개의 R₃기 혹은 2개의 R₄기는 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성할 수 있고,

R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이며,

T₃은 하나의 결합, C(R)(R), O 또는 S이고, R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이며;

또한, 하기 화학식 XVIII의 구조를 갖는 아미노산들도 포함된다.

[화학식 XVIII]

상기 식 중,

M은 -C(R₃)-,

이며,

또한, 하기 화학식 XIX의 구조를 갖는 아미노산들도 포함된다.

[화학식 XIX]

상기 식 중,

R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고,

T₃은 O 또는 S이다.

또한, 하기 화학식 XX의 구조를 갖는 아미노산들도 포함된다.

[화학식 XX]

상기 식 중,

R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이다.

또한, 하기 화학식 XXI의 구조를 갖는 아미노산들도 포함된다.

일부 실시 양태에서, 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 반응성 카르보닐 또는 디카르보닐 작용기를 만들어 내도록 화학적으로 변형된다. 예를 들어, 콘쥬게이션(접합) 반응에 유용한 알데히드 작용기 특성은 인접하는 아미노 및 히드록실기를 갖는 작용기 특성으로부터 생성될 수 있다. 생물학적 활성 분자가 폴리펩티드인 경우에는, 예를 들어, N-말단 세린 또는 트레오닌(이들은 통상적으로 존재하는 것이거나 화학적 소화 또는 효소적 소화를 통해 노출될 수 있음)은 과요오드를 이용하여 온화한 산화 분절 조건 하에 알데히드 작용기성을 만들어 내는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Gaertner, et. al., Bioconjug. Chem. 3: 262-268 (1992)], [Geoghegan, K. & Stroh, J., Bioconjug. Chem. 3: 138-146 (1992)], [Gaertner et al., J. Biol. Chem. 269: 7224-7230 (1994)]를 참조할 수 있다. 그러나, 당업계에 공지된 방법들은 펩티드 또는 단백질의 N-말단의 아미노산에 제한되어 있다.

본 발명에서, 인접하는 히드록실기 및 아미노기를 함유하는 아미노산은 "차폐된" 알데히드 작용기성으로서 폴리펩티드 내에 도입될 수 있다. 예를 들어, 5-히드록시리신은 ε-아민에 인접한 히드록실기를 보유한다. 알데히드를 생성하기 위한 반응 조건은 통상 온화한 조건 하에서 폴리펩티드 내의 다른 부위들의 산화를 피하기 위해 몰 초과량으로 메타과요오드산 나트륨을 첨가하는 단계를 수반한다. 산화 반응의 pH는 보통 약 7.0이다. 통상적인 반응은 폴리펩티드의 완충 용액에 약 1.5 몰 초과량의 메타과요오드산 나트륨을 첨가한 후, 암실에서 약 10분 동안 배양하는 단계를 수반한다. 이와 관련해서는, 예를 들어 미국특허 제6,423,685호를 참조할 수 있다.

카르보닐 또는 디카르보닐 작용기는 수용액 중의 온화한 조건 하에 히드록실아민 함유 시약과 선택적으로 반응하여 생리학적 조건 하에서 안정한 해당 옥심 결합을 형성할 수 있다. 이와 관련해서는, 예를 들어, 문헌 [Jencks, W.P., J. Am. Chem. Soc. 81, 475-481 (1959)], [Shao, J. and Tam, J.P., J. Am. Chem. Soc. 117: 3893-3899 (1995)]를 참조할 수 있다. 게다가, 카르보닐 또는 디카르보닐기의 독특한 반응성으로 인해 다른 아미노산 측쇄들의 존재 하에서 선택적인 변형이 가능하다. 이와 관련해서는, 예를 들어, 문헌 [Cornish, V.W., et al., J. Am. Chem. Soc. 118: 8150-8151 (1996)], [Geoghegan, K.F. & Stroh, J.G., Bioconjug. Chem. 3: 138-146 (1992)], [Mahal, L.K., et al., Science 276: 1125-1128 (1997)]을 참조할 수 있다.

비천연 아미노산의 구조 및 합성 : 히드록실아민 함유 아미노산

미국특허출원 제11/316,534호(공보 제20060189529호)는 그 내용 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다. 따라서, 미국특허출원 제11/316,534호(공보 제20060189529호)의 섹션 V(부제는 "Non-natural Amino Acids"), 파트 B(부제는 "Structure and Synthesis of Non-Natural Amino Acids: Hydroxylamine-Containing Amino Acids")는 이러한 개시 내용이 마치 본 명세서에도 전부 제시되어 있는 것과 마찬가지로, 본원에 기술된 방법, 조성물(화학식 I-XXXV 포함), 기법, 그리고 본원에 기술된 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용 전략에도 전부 적용된다. 미국특허 공보 제2006/0194256호, 제2006/0217532호 및 제2006/0217289호 그리고 발명의 명칭이 "Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides"인 WO 2006/069246도 그 내용 전체가 본원에 참조로 포함된다.

비천연 아미노산의 화학적 합성

본 발명에서 사용하기에 적합한 여러 가지 비천연 아미노산들은 예를 들어, 시그마(미국) 또는 알드리치(미국 위스콘신주 밀워키 소재)에서 시판된다. 시판되지 않는 것들은 본 명세서에 제시된 내용과 같이 합성될 수 있거나, 또는 여러 간행물에 제공된 내용과 같이 합성될 수 있거나, 또는 당업자에게 공지된 표준 방법들을 이용하여 합성될 수 있다. 유기 합성 기법에 대해서는, 예를 들어, 문헌 [Organic Chemistry by Fessendon and Fessendon, (1982, Second Edition, Willard Grant Press, Boston Mass.)], [Advanced Organic Chemistry by March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York)] 및 [Advanced Organic Chemistry by Carey and Sundberg (Third Edition, Parts A and B, 1990, Plenum Press, New York)]을 참조할 수 있다. 비천연 아미노산의 합성에 대해 기술하고 있는 추가적인 간행물로서는 예를 들어, 발명의 명칭이 "In vivo incorporation of Unnatural Amino Acids"인 WO 2002/085923, 문헌 [Matsoukas et al., (1995) J. Med. Chem., 38, 4660-4669], [King, F.E. & Kidd, D.A.A. (1949) A New Synthesis of Glutamine and of γ-Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediates. J. Chem. Soc., 3315-3319], [Friedman, O.M. & Chatterrji, R. (1959) Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti-Tumor Agents. J. Am. Chem. Soc. 81, 3750-3752], [Craig, J. C. et al., (1988) Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4-[[4-(diethylamino)-1-methylbutyl]amino]quinoline (Chloroquine). J. Org. Chem. 53, 1167-1170], [Azoulay, M., Vilmont, M. & Frappier, F. (1991) Glutamine analogues as Potential Antimalarials,. Eur. J. Med. Chem. 26, 201-5], [Koskinen, A.M.P. & Rapoport, H. (1989) Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino Acid Analogues. J. Org. Chem. 54, 1859-1866], [Christie, B.D. & Rapoport, H. (1985) Synthesis of Optically Pure Pipecolates from L-Asparagine: Application to the Total Synthesis of (+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization. J. Org. Chem. 50: 1239-1246], [Barton et al., (1987) Synthesis of Novel α-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry: Synthesis of L- and D-α-Amino-Adipic Acids, L-α-aminopimelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives. Tetrahedron 43: 4297-4308] 및 [Subasinghe et al., (1992) Quisqualic acid analogues: synthesis of beta-heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novel quisqualate-sensitized site. J. Med. Chem. 35: 4602-7]을 포함한다. 또한, 발명의 명칭이 "Protein Arrays"인 미국특허 공보 US 2004/0198637(본원에 참조로 포함됨)도 참조할 수 있다.

A. 카르보닐 반응성 기

카르보닐 반응성 기를 갖는 아미노산은 다양한 반응을 통해, 특히 친핵성 첨가 또는 알돌 축합 반응을 통하여 분자(예컨대, 이에 한정되지는 않지만 PEG 또는 다른 수용성 분자)들을 결합시킨다.

예시적인 카르보닐 함유 아미노산은 다음과 같이 나타낼 수 있다.

상기 식 중, n은 0-10이고, R₁은 알킬, 아릴, 치환된 알킬 또는 치환된 아릴이며, R₂는 H, 알킬, 아릴, 치환된 알킬 및 치환된 아릴이고, R₃은 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 아미노 말단 변형 기이며, R₄는 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 카르복시 말단 변형 기이다. 일부 실시 양태에서, n은 1이고, R₁은 페닐이며, R₂는 단순 알킬(즉, 메틸, 에틸 또는 프로필)이고, 케톤 부분은 알킬 측쇄를 기준으로 파라 위치에 위치한다. 일부 실시 양태에서, n은 1이고, R₁은 페닐이며, R₂는 단순 알킬(즉, 메틸, 에틸 또는 프로필)이고, 케톤 부분은 알킬 측쇄를 기준으로 메타 위치에 위치한다.

p-아세틸-(+/-)-페닐알라닌과 m-아세틸-(+/-)-페닐알라닌의 합성에 대해서는 본 명세서에 참고 문헌으로 포함되는 문헌 [Zhang, Z., et al., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003)]에 기술되어 있다. 카르보닐을 함유하는 다른 아미노산은 당업자에 의해 유사한 방식으로 제조될 수 있다.

일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 반응성 카르보닐 작용기를 만들어 내도록 화학적으로 변형된다. 예를 들어, 콘쥬게이션 반응에 유용한 알데히드 작용기 특성은 인접하는 아미노기 및 히드록실기를 갖는 작용기 특성으로부터 생성될 수 있다. 생물학적 활성 분자가 폴리펩티드인 경우에는, 예를 들어, N-말단 세린 또는 트레오닌(이들은 통상적으로 존재하는 것이거나 화학적 소화 또는 효소적 소화를 통해 노출될 수 있음)은 과요오드를 이용하여 온화한 산화 분절 조건 하에 알데히드 작용기 특성을 만들어 내는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Gaertner, et. al., Bioconjug. Chem. 3: 262-268 (1992)], [Geoghegan, K. & Stroh, J., Bioconjug. Chem. 3: 138-146 (1992)], [Gaertner et al., J. Biol. Chem. 269: 7224-7230 (1994)]를 참조할 수 있다. 그러나, 당업계에 공지된 방법들은 펩티드 또는 단백질의 N-말단의 아미노산에 제한되어 있다.

본 발명에서, 인접하는 히드록실기 및 아미노기를 함유하는 비천연적으로 코딩된 아미노산은 "차폐된" 알데히드 작용기 특성으로서 폴리펩티드 내에 도입될 수 있다. 예를 들어, 5-히드록시리신은 ε-아민에 인접한 히드록실기를 보유한다. 알데히드를 생성하기 위한 반응 조건은 통상 온화한 조건 하에서 폴리펩티드 내의 다른 부위들의 산화를 피하기 위해 몰 초과량으로 메타과요오드산 나트륨을 첨가하는 단계를 수반한다. 산화 반응의 pH는 보통 약 7.0이다. 통상적인 반응은 폴리펩티드의 완충 용액에 약 1.5 몰 초과량의 메타과요오드산 나트륨을 첨가한 후, 암실에서 약 10분 동안 배양하는 단계를 수반한다. 이와 관련해서는, 예를 들어 미국특허 제6,423,685호를 참조할 수 있다.

카르보닐 작용기는 수용액 중의 온화한 조건 하에 히드라진 함유 시약, 히드라지드 함유 시약, 히드록실아민 함유 시약 또는 세미카르바지드 함유 시약과 선택적으로 반응하여 각각 생리학적 조건 하에서 안정한 해당 히드라존, 옥심 또는 세미카르바존 결합을 형성할 수 있다. 이와 관련해서는, 예를 들어, 문헌 [Jencks, W.P., J. Am. Chem. Soc. 81, 475-481 (1959)], [Shao, J. and Tam, J.P., J. Am. Chem. Soc. 117: 3893-3899 (1995)]를 참조할 수 있다. 게다가, 카르보닐기의 독특한 반응성으로 인해 다른 아미노산 측쇄들의 존재 하에서 선택적인 변형이 가능하다. 이와 관련해서는, 예를 들어, 문헌 [Cornish, V.W., et al., J. Am. Chem. Soc. 118: 8150-8151 (1996)], [Geoghegan, K.F. & Stroh, J.G., Bioconjug. Chem. 3: 138-146 (1992)], [Mahal, L.K., et al., Science 276: 1125-1128 (1997)]을 참조할 수 있다.

B. 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드 반응성 기

히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드와 같은 친핵성 기를 함유하는 비천연적으로 코딩된 아미노산은 다양한 친전자성 기와 반응하여 (예컨대, 이에 한정되지는 않지만, PEG 또는 다른 수용성 중합체와의) 접합체를 형성하게 한다.

예시적인 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드 함유 아미노산은 다음과 같이 나타낼 수 있다.

상기 식 중, n은 0-10이고, R₁은 알킬, 아릴, 치환된 알킬 또는 치환된 아릴이거나 존재하지 않으며, X는 O, N 또는 S이거나 존재하지 않고, R₂는 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 아미노 말단 변형 기이며, R₃은 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 카르복시 말단 변형 기이다.

일부 실시 양태에서, n은 4이고, R₁은 존재하지 않으며, X는 N이다. 일부 실시 양태에서, n은 2이고, R₁은 존재하지 않으며, X는 존재하지 않는다. 일부 실시 양태에서, n은 1이고, R₁은 페닐이며, X는 O이고, 산소 원자는 아릴 고리 상의 지방족 기에 대해 파라 자리에 위치한다.

히드라지드 함유 아미노산, 히드라진 함유 아미노산 및 세미카르바지드 함유 아미노산은 제품 공급업체로부터 입수가능하다. 예를 들어, L-글루타메이트-γ-히드라지드는 시그마 케미칼(Sigma Chemical)(미국 미주리주 세인트 루이스 소재)로부터 입수가능하다. 시판되지 않는 다른 아미노산들은 당업자에 의해 제조될 수 있다. 이와 관련해서는, 예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함되는 미국특허 제6,281,211호를 참조할 수 있다.

히드라지드, 히드라진 또는 세미카르바지드 작용기를 함유하는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 폴리펩티드는 알데히드 또는 유사한 화학적 반응성을 갖는 다른 작용기를 함유하는 여러 분자와 효율적이고 선택적으로 반응할 수 있다. 이와 관련해서는, 예를 들어, 문헌 [Shao, J. and Tam, J., J. Am. Chem. Soc. 117: 3893-3899 (1995)]을 참조할 수 있다. 히드라지드, 히드라진 및 세미카르바지드 작용기의 독특한 반응성은 알데히드, 케톤 및 다른 친전자성 기에 대한 반응성에 있어서, 20개의 통상적인 아미노산에 존재하는 친핵성 기(세린 또는 트레오닌의 히드록실기, 또는 리신 및 N-말단의 아미노기를 포함하며 이에 한정되지 않음)에 비해 보다 현저함을 나타낸다.

C. 아미노옥시 함유 아미노산

아미노옥시(히드록실아민으로도 불림) 기를 함유하는 비천연적으로 코딩된 아미노산은 다양한 친전자성 기와 반응하여 (예컨대, 이에 한정되지는 않으나, PEG 또는 다른 수용성 중합체와의) 접합체를 형성시킨다. 히드라진, 히드라지드 및 세미카르바지드와 마찬가지로, 아미노옥시기의 강화된 친핵성으로 인하여 이들은 알데히드 또는 유사한 화학적 반응성을 갖는 다른 작용기를 함유하는 여러 분자와 효율적이고 선택적으로 반응할 수 있다. 이와 관련해서는, 예를 들어, 문헌 [Shao, J. and Tam, J., J. Am. Chem. Soc. 117: 3893-3899 (1995)], [H. Hang and C. Bertozzi, Acc. Chem. Res. 34: 727-736 (2001)]을 참조할 수 있다. 히드라진기와 반응한 결과로 이에 대응하는 히드라존이 생성되는 한편, 옥심은 일반적으로 아미노옥시기와 카르보닐을 함유하는 기, 예컨대 케톤의 반응으로부터 생성된다.

아미노옥시기를 함유하는 예시적인 아미노산은 다음과 같이 나타낼 수 있다.

상기 식 중, n은 0-10이고, R₁은 알킬, 아릴, 치환된 알킬 또는 치환된 아릴이거나 존재하지 않으며, X는 O, N, S이거나 존재하지 않고, m은 0-10이며, Y는 =C(O)이거나 존재하지 않으며, R₂는 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 아미노 말단 변형 기이고, R₃은 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 카르복시 말단 변형 기이다. 일부 실시 양태에서, n은 1이고, R₁은 페닐이며, X는 O이고, m은 1이며, Y는 존재한다. 일부 실시 양태에서, n은 2이고, R₁ 및 X는 존재하지 않으며, m은 0이고, Y는 존재하지 않는다.

아미노옥시 함유 아미노산은 쉽게 입수가능한 아미노산 전구체(호모세린, 세린 및 트레오닌)로부터 제조될 수 있다. 이와 관련해서는, 예를 들어, 문헌 [M. Carrasco and R. Brown, J. Org. Chem. 68: 8853-8858 (2003)]을 참조할 수 있다. 특정 아미노옥시 함유 아미노산, 예를 들어 L-2-아미노-4-(아미노옥시)부티르산은 천연 공급원으로부터 단리되었다(문헌 [Rosenthal, G., Life Sci. 60: 1635-1641 (1997)] 참조). 아미노옥시를 함유하는 다른 아미노산은 당업자에 의해 제조될 수 있다.

D. 아지드 및 알킨 반응성 기

아지드 및 알킨 작용기의 독특한 반응성으로 인해 이들은 폴리펩티드 및 다른 생물학적 분자의 선택적인 변형에 있어 매우 유용하다. 유기 아지드, 특히 지방족 아지드, 그리고 알킨은 통상적인 화학 반응 조건에 대해 일반적으로 안정하다. 특히, 아지드 및 알킨 작용기는 양자 모두 자연 발생 폴리펩티드에서 발견되는 20개의 통상적인 아미노산의 측쇄(즉, R기)에 대해 불활성이다. 그러나, 좀더 면밀히 살펴보면, 아지드 및 알킨 기의 "스프링 로딩(spring-loaded)" 특성이 드러나며, 이들은 휘스겐 [3 + 2] 시클로 첨가 반응을 통해 선택적이며 효율적으로 반응하여 해당 트리아졸을 생성하게 된다. 이와 관련해서는, 예를 들어, 문헌 [Chin J., et al., Science 301: 964-7 (2003)], [Wang, Q., et al., J. Am. Chem. Soc. 125, 3192-3193 (2003)], [Chin, J. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 124: 9026-9027 (2002)]을 참조할 수 있다.

휘스겐 시클로 첨가 반응은 친핵성 치환이라기보다는 선택적인 시클로 첨가 반응을 수반하기 때문에(예를 들어, 문헌 [Padwa, A., in COMPREHENSIVE ORGANIC SYNTHESIS, Vol. 4, (ed. Trost, B.M., 1991), p.1069-1109], [Huisgen, R. in 1,3-DIPOLAR CYCLOADDITION CHEMISTRY, (ed. Padwa, A., 1984), p.1-176] 참조), 아지드 및 알킨 함유 측쇄를 함유하는 비천연적으로 코딩된 아미노산의 도입으로 인하여, 결과적으로 생성된 폴리펩티드는 비천연적으로 코딩된 아미노산의 위치에서 선택적으로 변형되는 것이다. 아지드 또는 알킨 함유 인슐린 폴리펩티드에 관련된 시클로 첨가 반응은, 수성 조건 하의 실온에서 동일 반응계의 촉매량으로 Cu(II)를 Cu(I)으로 환원시키기 위한 환원제의 존재 하에, Cu(II)(촉매량의 CuSO₄의 형태를 포함하며 이에 한정되지 않음)를 첨가함으로써 수행될 수 있다. 이와 관련해서는, 예를 들어, 문헌 [Wang, Q., et al ., J. Am . Chem . Soc . 125, 3192-3193 (2003)], [Tornoe, C. W., et al ., J. Org . Chem . 67: 3057-3064 (2002)], [Rostovtsev, et al., Angew . Chem . Int . Ed . 41: 2596-2599 (2002)]을 참조할 수 있다. 대표적인 환원제로서는, 이에 제한되지는 않지만 아스코르베이트, 금속성 구리, 퀴닌, 히드로퀴논, 비타민 K, 글루타티온, 시스테인, Fe² ⁺, Co² ⁺ 및 인가된 전위를 포함한다.

아지드와 알킨 간에 휘스겐 [3 + 2] 시클로 첨가 반응이 바람직한 경우에는, 인슐린 폴리펩티드는 알킨 부분을 포함하는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하고, 아미노산에 부착되는 수용성 중합체는 아지드 부분을 포함한다. 다르게는, 반대의 반응 (즉, 아미노산 상의 아지드 부분 및 수용성 중합체 상에 존재하는 알킨 부분과의 반응)도 수행할 수 있다.

또한, 아지드 작용기는 아릴 에스테르를 함유하며 아릴 포스핀 부분으로 적절하게 작용기화된 수용성 중합체와 선택적으로 반응하여 아미드 결합을 생성할 수 있다. 상기 아릴 포스핀기는 동일 반응계에서 아지드를 환원시키며, 이렇게 해서 생성되는 아민은 이후 근접한 에스테르 결합과 유효하게 반응하여 해당 아미드를 생성시키게 된다. 이와 관련해서는, 예를 들어, 문헌 [E. Saxon and C. Bertozzi, Science 287, 2007-2010 (2000)]을 참조할 수 있다. 아지드를 함유하는 아미노산은 알킬 아지드(2-아미노-6-아지도-1-헥산산을 포함하며 이에 한정되지 않음) 또는 아릴 아지드(p-아지도-페닐알라닌)일 수 있다.

아릴 에스테르 및 포스핀 부분을 포함하는 예시적인 수용성 중합체는 다음과 같이 나타낼 수 있다.

상기 식 중, X는 O, N, S이거나 존재하지 않을 수 있고, Ph는 페닐이며, W는 수용성 중합체이고, R은 H, 알킬, 아릴, 치환된 알킬 및 치환된 아릴 기일 수 있다. 대표적인 R기로서는, 이에 한정되지는 않지만, -CH₂, -C(CH₃)₃, -OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -C(O)R', -CONR'R", -S(O)₂R', -S(O)₂NR'R", -CN 및 -NO₂를 포함한다. R', R", R"' 및 R""는 각각 독립적으로 수소, 치환되거나 또는 치환되지 않은 헤테로알킬, 치환되거나 치환되지 않은 아릴, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 1-3 개의 할로겐으로 치환된 아릴, 치환되거나 또는 치환되지 않은 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시기 또는 아릴알킬기를 지칭한다. 본 발명의 화합물이 하나 이상의 R기를 포함하는 경우, 예를 들어, 각각의 R기는 R', R", R"' 및 R"" 중 하나 이상이 존재하는 경우의 각 R', R", R"' 및 R"" 기와 마찬가지로 독립적으로 선택된다. R' 및 R"가 동일한 질소 원자에 부착되는 경우, 이들은 질소 원자와 조합되어 5원, 6원 또는 7원 고리를 형성할 수 있다. 예를 들어, -NR'R"는 이에 한정하는 것은 아니나, 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함한다. 치환기의 상기 논의로부터, 당업자라면 "알킬"이라는 용어가 수소기 이외의 기에 결합된 탄소 원자를 비롯한 기, 예를 들어 할로알킬(-CF₃ 및 -CH₂CF₃를 포함하며 이에 한정되지 않음) 및 아실(-C(O)CH₃, -C(O)CF₃, -C(O)CH₂OCH₃ 등을 포함하며 이에 한정되지 않음)를 포함한다는 점을 이해할 수 있을 것이다.

또한, 아지드 작용기는 티오에스테르를 함유하며 아릴 포스핀 부분으로 적절히 작용기화된 수용성 중합체와 선택적으로 반응하여 아미드 결합을 생성할 수 있다. 상기 아릴 포스핀기는 동일 반응계에서 아지드를 환원시키며, 이렇게 해서 생성되는 아민은 이후 티오에스테르 결합과 유효하게 반응하여 해당 아미드를 생성시키게 된다. 티오에스테르 및 포스핀 부분을 포함하는 예시적인 수용성 중합체는 다음과 같이 나타낼 수 있다.

상기 식 중, n은 1-10이고, X는 O, N, S이거나 존재하지 않을 수 있으며, Ph는 페닐이고, W는 수용성 중합체이다.

예시적인 알킨 함유 아미노산은 다음과 같이 나타낼 수 있다.

상기 식 중, n은 0-10이고, R₁은 알킬, 아릴, 치환된 알킬 또는 치환된 아릴이거나 존재하지 않으며, X는 O, N, S이거나 존재하지 않고, m은 0-10이며, R₂는 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 아미노 말단 변형 기이고, R₃은 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 카르복시 말단 변형 기이다. 일부 실시 양태에서, n은 1이고, R₁은 페닐이며, X는 존재하지 않고, m은 0이며, 아세틸렌 부분은 알킬 측쇄를 기준으로 파라 위치에 위치된다. 일부 실시 양태에서, n은 1이고, R₁은 페닐이며, X는 O이고, m은 1이며, 프로파르길옥시기는 알킬 측쇄를 기준으로 파라 위치에 위치된다(즉, O-프로파르길-티로신). 일부 실시 양태에서, n은 1이고, R¹ 및 X는 존재하지 않으며, m은 0이다(즉, 프로파르길글리신).

알킨 함유 아미노산은 시판된다. 예를 들어, 프로파르길글리신은 펩테크(메사추세츠주 버링톤 소재)에서 시판된다. 다르게는, 알킨 함유 아미노산은 표준 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, p-프로파르길옥시페닐알라닌은 예를 들어, 문헌 [Deiters, A., et al ., J. Acid . Chem . Soc . 125: 11782-11783 (2003)]에 기재된 바와 같이 합성될 수 있고, 4-알키닐-L-페닐알라닌은 문헌 [Kayser, B., et al ., Tetrahedron 53(7): 2475-2484 (1997)]에 기재된 바와 같이 합성될 수 있다. 알킨을 함유하는 다른 아미노산은 당업자에 의해 제조될 수 있다.

예시적인 아지드 함유 아미노산은 다음과 같이 나타낼 수 있다.

상기 식 중, n은 0-10이고, R₁은 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 치환된 아릴이거나 존재하지 않으며, X는 O, N, S이거나 존재하지 않고, m은 0-10이며, R₂는 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 아미노 말단 변형 기이고, R₃은 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 카르복시 말단 변형 기이다. 일부 실시 양태에서, n은 1이고, R₁은 페닐이며, X는 존재하지 않고, m은 0이며, 아지드 부분은 알킬 측쇄에 대해 파라 위치에 위치한다. 일부 실시 양태에서, n은 0-4이고, R₁ 및 X는 존재하지 않으며, m = 0이다. 일부 실시 양태에서, n은 1이고, R₁는 페닐이며, X는 O이고, m은 2이며, β-아지도에톡시 부분은 알킬 측쇄를 기준으로 파라 위치에 위치한다.

아지드 함유 아미노산은 제품 공급업체로부터 입수가능하다. 예를 들어, 4-아지도페닐알라닌은 켐-임펙스 인터내셔널 인코포레이티드(Chem-Impex International, Inc.)(미국 일리노이주 우드 대일 소재)로부터 입수할 수 있다. 시판되지 않는 아지드 함유 아미노산의 경우, 아지드기는 이에 한정되지는 않으나 적절한 이탈기(할라이드, 메실레이트, 토실레이트를 포함하며 이에 한정되지 않음)의 치환을 통한 방법 또는 적절히 보호된 락톤의 개방을 통한 방법을 비롯한 당업자에게 공지된 표준 방법들을 사용하여 비교적 쉽게 제조될 수 있다. 이와 관련해서는, 예를 들어, 문헌 [Advanced Organic Chemistry by March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York)]을 참조할 수 있다.

E. 아미노티올 반응성 기

β-치환된 아미노티올 작용기의 독특한 반응성으로 인해 이들은 티아졸리딘의 형성을 통해 알데히드 기를 함유하는 폴리펩티드 및 다른 생물학적 분자의 선택적 변형에 있어서 매우 유용하다. 예를 들어, 문헌 [J. Shao and J. Tam, J. Am . Chem. Soc . 1995, 117 (14) 3893-3899]을 참조할 수 있다. 일부 실시 양태에서, β-치환된 아미노티올 아미노산은 인슐린 폴리펩티드에 도입된 후, 알데히드 작용기를 포함하는 수용성 중합체와 반응할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 수용성 중합체, 약물 접합체 또는 다른 탑재물질(payload)을 티아졸리딘의 형성을 통하여 β-치환된 아미노티올 아미노산을 포함하는 인슐린 폴리펩티드에 커플링시킬 수 있다.

F. 추가의 반응성 기

본 발명의 인슐린 폴리펩티드에 도입될 수 있는 추가의 반응성 기 및 비천연적으로 코딩된 아미노산(예컨대 이에 제한되지는 않지만, 파라-아미노-페닐알라닌을 포함함)에 대해서는 하기의 특허 출원 문건들(이들 모두는 그 내용 전체가 본원 명세서에 참고로 포함됨)에 기술되어 있다: 미국 특허 공보 제2006/0194256호, 미국 특허 공보 제2006/0217532호, 미국 특허 공보 제2006/0217289호, 미국 가특허출원 제60/755,338호, 미국 가특허출원 제60/755,711호, 미국 가특허출원 제60/755,018호, 국제 특허 출원 PCT/US06/49397, WO 2006/069246, 미국 가특허출원 제60/743,041호, 미국 가특허출원 제60/743,040호, 국제 특허 출원 PCT/US06/47822, 미국 가특허출원 제60/882,819호, 미국 가특허출원 제60/882,500호 및 미국 가특허출원 제60/870,594호. 이러한 출원 문건들은 콘쥬게이션을 위한 PEG 또는 다른 중합체, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 히드록실아민(아미노옥시) 기 상에 존재할 수 있는 반응성 기들에 대해 논의하고 있기도 하다.

비천연 아미노산의 세포 흡수

세포에 의한 비천연 아미노산 흡수는, 예컨대 이에 한정되지는 않지만 비천연 아미노산을 단백질에 도입시키기 위한 경우를 포함하여, 비천연 아미노산을 고안하고 선택하는 경우에 통상적으로 고려되는 문제이다. 예를 들어, α-아미노산의 높은 전하 밀도는 이러한 화합물들이 세포 투과성이기가 쉽지 않다는 사실을 시사하고 있다. 천연 아미노산은 단백질 기반의 수송 시스템의 결집을 통해 진핵 세포 내로 흡수된다. 여기서 신속한 스크리닝을 수행하여 비천연 아미노산이 존재한다면 어떤 종류의 비천연 아미노산이 세포에 의해 흡수되는지 평가할 수 있다. 이와 과련해서는, 예를 들어, 발명의 명칭이 "Protein Arrays"인 미국 특허 공보 제2004/0198637호(본원에 참고로 포함됨) 및 문헌 [Liu, D. R. & Schultz, P.G. (1999) Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code. PNAS United States 96: 4780-4785]에 기재된 독성 분석시험에 관한 내용을 참조할 수 있다. 흡수에 대해서는 다양한 분석시험들을 이용하여 쉽게 분석할 수 있다 하더라도, 세포 흡수 경로를 따르는 비천연 아미노산을 고안하는 것에 대한 대안은 생합성 경로를 제공하여 생체 내에서 아미노산을 생성해야 하는 것이다.

비천연 아미노산의 생합성

세포에 있어서 아미노산 및 다른 화합물을 생산하는 여러 가지 생합성 경로들은 이미 존재한다. 어떤 비천연 아미노산에 대한 생합성 방법은, 예컨대 이에 제한되지는 않지만 세포를 비롯한 자연계에 존재하지 않을 수 있는데, 본 발명은 이러한 방법을 제공하게 된다. 예를 들어, 비천연 아미노산에 대한 생합성 경로는 새로운 효소를 첨가하거나 또는 이미 존재하는 숙주 세포 경로를 변화시킴으로써 숙주 세포 내에서 만들어 지게 된다. 추가적인 새로운 효소로서는 자연 발생 효소 또는 인공적으로 발현된 효소들을 들 수가 있다. 예를 들어, p-아미노페닐알라닌의 생합성(발명의 명칭이 "In vivo incorporation of unnatural amino acids"인 WO 2002/085923에서 실시예로서 제시됨)은 공지된 다른 유기체 효소의 조합체를 첨가하는 단계를 필요로 한다. 이러한 효소들에 대한 유전자는 그 유전자를 포함하는 플라스미드를 사용한 세포의 형질전환에 의해 진핵 세포 내로 도입될 수 있다. 유전자가 세포에서 발현되면, 효소적 경로를 제공하여 원하는 화합물을 합성하게 된다. 첨가될 수 있는 효소 종류의 예들은 하기 실시예에 제공된다. 추가적인 효소 서열은 예를 들어, 진뱅크 (Genbank)에서 찾을 수 있다. 또한, 인공적으로 발현된 효소도 동일한 방식으로 세포에 첨가될 수 있다. 이러한 방식으로, 세포 소기관 및 세포의 재원들을 조작하여 비천연 아미노산을 생산한다.

생합성 경로에서 사용하기 위한 신규한 효소를 생산하거나, 또는 현존하는 경로를 진전시키기 위해서 여러 가지 방법들을 이용할 수 있다. 예를 들어, 이에 제한되지는 않지만, 멕시겐 인코포레이티드(Maxygen, Inc.)(www.maxygen.com 상에서 이용가능)에 의해 개발된 재조합법을 비롯한 반복적 재조합이 신규한 효소 및 경로를 개발하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Stemmer (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370(4): 389-391] 및 [Stemmer, (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91: 10747-10751]을 참조할 수 있다. 이와 유사하게, 제넨코어(Genencor)(www.genencor.com 상에서 이용가능)에 의해 개발된 디자인패쓰 (DesignPath^TM)는, 이에 한정되지는 않지만 세포 내에서 0-메틸-L-티로신을 생성하기 위해 경로를 조작하는 것을 비롯한 대사 경로 조작을 위해 사용될 수 있다. 이러한 기법은, 예컨대 이에 제한되지는 않지만 기능 유전체학과 분자 진화학 및 분자 고안을 통해 동정된 것들을 비롯한 신규한 유전자들의 조합을 이용하여 숙주 유기체 중에 현존하는 경로를 재구성하게 된다. 또한, 다이버사 코퍼레이션(Diversa Corporation)(www.diversa.com 상에서 이용가능)도 유전자 라이브러리 및 유전자 경로를 신속하게 스크리닝하는 기법(예컨대, 이에 제한되지는 않지만 새로운 경로를 개척하는 것을 포함함)을 제공한다.

통상적으로, 본 발명의 조작된 생합성 경로로 생산된 비천연 아미노산은 효율적인 단백질 생합성을 위해 충분한 농도, 예컨대 이에 제한되지는 않지만 다른 아미노산의 농도에 영향을 미치거나 세포 재원을 고갈시키는 정도는 아닌 천연 세포의 양으로 생산된다. 이러한 방식으로 생체 내에서 생산되는 통상적인 농도는 약 10 mM 내지 약 0.05 mM이다. 일단 세포를 특정 경로에 필요한 효소를 생산하는데 쓰이는 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환시켜 비천연 아미노산이 생성되면, 생체 내 선별을 이용하여 리보좀의 단백질 합성 및 세포 성장 양자 모두를 위해 비천연 아미노산의 생성을 추가로 최적화할 수 있다.

비천연 아미노산을 갖는 폴리펩티드

비천연 아미노산의 도입은 예컨대, 이에 한정되는 것은 아니나 단백질 구조 및/또는 기능에 생기는 변화를 조정하거나, 프로테아제 표적 부위의 크기, 산도, 친핵성, 수소 결합, 소수성, 접근성을 변화시키거나, 부분(기)에 대한 표적화를 수행(예컨대, 단백질 어레이에 대한 경우를 포함하며 이에 한정되지 않음)하거나, 생물학적 활성 분자를 첨가하거나, 중합체를 부착시키거나, 방사성 핵종을 부착시키거나, 혈청 반감기를 조절하거나, 조직 투과성을 조절하거나(예컨대, 종양), 능동 수송을 조절하거나, 조직, 세포 또는 기관 특이성 또는 그 편재를 조절하거나, 면역원성을 조절하거나, 프로테아제 저항성을 조절하는 등의 여러 가지 목적을 위해 수행될 수 있다. 비천연 아미노산을 포함하는 단백질은 강화되거나 또는 심지어는 완전히 새로운 촉매 특성 또는 생물리학적 특성을 보유할 수 있다. 예를 들어, 비천연 아미노산을 단백질에 도입하여 하기의 성질들을 변형시킬 수 있다: 독성, 생체 편재율, 구조적 특성, 분광학적 특성, 화학적 특성 및/또는 광화학적 성질, 촉매 작용 능력, 반감기(혈청 반감기를 포함하며 이에 한정되지 않음), 다른 분자와 반응할 수 있는 능력, 예컨대 이에 제한되지는 않으나, 공유 또는 비공유적으로 반응할 수 있는 능력 등. 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 단백질을 포함하는 조성물은 예컨대 이에 한정되지는 않지만 신규한 치료제, 진단제, 촉매 작용 효소, 산업용 효소, 결합 단백질(항체를 포함하며 이에 한정되지 않음), 그리고 이에 한정되지는 않지만 단백질의 구조 및 기능의 연구 등을 비롯한 작업에 유용하다. 예를 들어, 문헌 [Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology. 4: 645-652]을 참조할 수 있다.

본 발명의 한 측면에서, 본 조성물은 1개 이상, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상 또는 그 이상의 비천연 아미노산을 갖는 적어도 하나 이상의 단백질을 포함한다. 비천연 아미노산은 동일하거나 서로 다를 수 있는데, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 이상 또는 10 개 이상의 서로 다른 비천연 아미노산들을 포함하는 단백질 중에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 이상 또는 10개 이상의 서로 다른 부위가 존재할 수 있다. 또 다른 측면에서, 조성물은 단백질 중에 존재하는 특정 아미노산 중 하나 이상(전체 아미노산들의 경우는 제외)의 아미노산이 비천연 아미노산으로 치환되는 단백질을 포함한다. 하나 이상의 비천연 아미노산을 갖는 특정 단백질에 있어서, 상기 비천연 아미노산은 동일하거나 서로 다를 수 있다(예컨대, 이에 한정되지는 않으나, 상기 단백질은 2개 이상의 서로 다른 유형의 비천연 아미노산을 포함할 수 있거나, 또는 2가지의 동일한 비천연 아미노산을 포함할 수 있음). 2개 이상의 비천연 아미노산을 갖는 특정 단백질에 있어서, 상기 비천연 아미노산은 동일하거나, 서로 다르거나, 또는 동일한 종류로 된 다수의 비천연 아미노산과 하나 이상의 서로 다른 비천연 아미노산의 조합물일 수 있다.

하나 이상의 비천연 아미노산을 갖는 해당 단백질 또는 폴리펩티드는 본 발명의 특징을 이룬다. 또한, 본 발명은 본 발명의 조성물 및 방법을 사용하여 생산된 하나 이상의 비천연 아미노산을 갖는 폴리펩티드 또는 단백질을 포함한다. 부형제(예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함함)도 단백질과 함께 존재할 수 있다.

진핵 세포에서 하나 이상의 비천연 아미노산을 갖는 해당 단백질 또는 폴리펩티드를 생산함으로써, 이러한 단백질 또는 폴리펩티드는 일반적으로 번역 후 진핵 세포 변형물을 포함하게 될 것이다. 특정 실시 양태에서, 단백질은 하나 이상의 비천연 아미노산과, 진핵 세포에 의해 생체 내에서 만들어진 하나 이상의 번역 후 변형을 포함하며, 여기서 상기 번역 후 변형은 원핵 세포에 의해서는 생성되지는 않는다. 예를 들어, 상기 번역 후 변형은, 예컨대 이에 한정되지는 않지만, 아세틸화, 아실화, 지질 변형, 팔미토일화, 팔미테이트 첨가, 인산화, 당지질 결합 변형, 글리코실화 등을 포함한다. 한 측면에서, 상기 번역 후 변형은 GlcNAc-아스파라긴 결합에 의해 올리고사카라이드(예컨대, 이에 제한되지는 않지만, (GlcNAc-Man)₂-Man-GlcNAc-GlcNAc)를 포함함)를 아스파라긴에 부착시키는 단계를 포함한다. 표 1에 진핵 세포 단백질의 N-결합된 올리고사카라이드의 일부 예들을 나열하였으니 이를 참고할 수 있다(추가적인 잔기들도 존재할 수 있으며, 이들은 나타내지 않았음). 또 다른 측면에서, 번역 후 변형은 GalNAc-세린 또는 GalNAc-트레오닌 결합, 또는 GlcNAc-세린 또는 GlcNAc-트레오닌 결합에 의해 올리고사카라이드(예컨대, 이에 한정되지는 않지만, Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc 등을 포함함)를 세린 또는 트레오닌에 부착시키는 단계를 포함한다.

또 다른 측면에서, 번역 후 변형은 전구체(예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 칼시토닌 전구체, 칼시토닌 유전자 연관 펩티드 전구체, 프리프로(prepro)-부갑상선 호르몬, 프리프로인슐린, 프로인슐린, 프리프로-오피오멜라노코르틴(opiomelanocortin), 프로-오피오멜라코르틴 등을 포함함)의 단백질 가수분해성 처리, 다중 서브유닛 단백질 또는 거대분자 조립체 내로의 조립, 세포 내의 또 다른 부위로(예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 세포 소기관, 예컨대 소포체, 골지체, 핵, 리소좀, 퍼옥시좀, 미토콘드리아, 엽록체, 액포 등으로, 또는 분비성 경로를 통하는 것을 포함함) 번역시키는 것을 포함한다. 특정 실시 양태에서, 단백질은 분비 또는 국소화된 서열, 에피토프 태그, FLAG 태그, 폴리히스티딘 태그, GST 융합체 등을 포함한다.

비천연 아미노산의 한 장점은 추가의 분자를 첨가하는데 쓰일 수 있는 화학적 부분을 추가로 제공한다는 점이다. 이러한 변형은 진핵 세포 또는 비진핵 세포의 생체 내에서, 또는 시험관 내에서 이루어질 수 있다. 따라서, 특정 실시 양태에서, 번역 후 변형은 비천연 아미노산을 통해서 이루어진다. 예를 들어, 번역 후 변형은 친핵성-친전자성 반응을 통해 이루어질 수 있다. 단백질의 선택적 변형에서 현재 사용되는 대부분의 반응들은, 이에 한정되지는 않지만, α-할로케톤과 히스티딘 또는 시스테인 측쇄의 반응을 비롯한 친핵성 반응 파트너와 친전자성 반응 파트너 간에 공유 결합이 형성되는 단계를 포함한다. 이러한 경우들에 있어서, 선택성은 단백질 중의 친핵성 잔기의 수와 이에 대한 접근성에 의해 결정된다. 본 발명의 단백질에서는, 보다 선택적인 다른 반응들, 예를 들어 비천연 케토-아미노산과 히드라지드 또는 아미노옥시 화합물의 시험관 내 또는 생체 내 반응을 사용할 수 있다. 예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Cornish, et al., (1996) Am. Chem. Soc., 118: 8150-8151], [Mahal, et al., (1997) Science, 276: 1125-1128], [Wang, et al., (2001) Science 292: 498-500], [Chin, et al., (2002) Am. Chem. Soc. 124: 9026-9027], [Chin, et al., (2002) Proc. Natl. Acad. Sci., 99: 11020-11024], [Wang, et al., (2003) Proc. Natl. Acad. Sci., 100: 56-61], [Zhang, et al., (2003) Biochemistry, 42: 6735-6746] 및 [Chin, et al., (2003) Science, 301: 964-7]을 참조할 수 있다. 이로써 형광단, 가교 결합제, 사카라이드 유도체 및 세포독성 분자를 비롯한 시약으로 된 숙주를 사용하면 사실상 모든 단백질을 선택적인 표지가 가능하다. 또한, 발명의 명칭이 "Glycoprotein synthesis"인 미국 특허 출원 제6,927,042호(본원에 참고로 포함됨)도 참조할 수 있다. 또한, 번역 후 변형(예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 아지도 아미노산을 통한 번역 후 변형 포함)은 스타우딩거 결찰(Staudinger ligation)(트리아릴포스핀 시약을 사용하는 것을 포함하며 이에 한정되지 않음)을 통해서도 이루어질 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Kiick et al., (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99: 19-24]을 참조할 수 있다.

본 발명은 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 아지드 또는 알키닐 부분을 함유하는 비천연 아미노산을 셀렉터 코돈에 대응하여 단백질에 유전자 도입시키는 단계를 수반하는 단백질의 선택적 변형에 있어서 또 다른 매우 효과적인 방법을 제공한다. 이러한 아미노산 측쇄는 이후 예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 알키닐 또는 아지드 유도체(이에 제한되지는 않음) 각각을 이용한 휘스겐 [3 + 2] 시클로 첨가 반응(예를 들어, 문헌 [Padwa, A. in Comprehensive Organic Synthesis, Vol.4, (1991) Ed. Trost, B. M., Pergamon, Oxford, p. 1069-1109] 및 [Huisgen, R. in 1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry, (1984) Ed. Padwa, A., Wiley, New York, p.1-176] 참조)을 비롯한 반응에 의해 변형될 수 있다. 이 방법은 친핵성 치환이라기보다는 시클로 첨가를 수반하기 때문에, 단백질은 매우 높은 선택성으로 변형될 수 있다. 이러한 반응은 우수한 위치선택성(regioselectivity)(1,4 > 1,5)의 수성 조건으로 실온에서 촉매량의 Cu(I) 염을 반응 혼합물에 첨가함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Tornoe, et al., (2002) J. Org. Chem. 67: 3057-3064] 및 [Rostovtsev, et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41: 2596-2599]를 참조할 수 있다. 사용될 수 있는 또 다른 방법은 테트라시스테인 모티프를 이용한 비스비소(bisarsenic) 화합물 상에서 리간드 교환을 하는 것이 있다(예를 들어, 문헌 [Griffin, et al., (1998) Science 281: 269-272] 참조).

[3 + 2] 시클로 첨가를 통해 본 발명의 단백질에 첨가될 수 있는 분자는 아지드 또는 알키닐 유도체를 갖는 거의 모든 분자를 포함한다. 이러한 분자로서는, 이에 제한되지는 않지만, 염료, 형광단, 가교 결합제, 사카라이드 유도체, 중합체(폴리에틸렌 글리콜의 유도체를 포함하며 이에 한정되지 않음), 광가교결합제, 세포독성 화합물, 친화성 표지, 비오틴의 유도체, 수지, 비드, 제2 단백질 또는 폴리펩티드(또는 그 이상), 폴리뉴클레오티드(들)(DNA, RNA 등을 포함하며 이에 한정되지 않음), 금속 킬레이트제, 보조인자, 지방산, 탄수화물 등을 포함한다. 이러한 분자들은 각각 알키닐기를 갖는 비천연 아미노산(p-프로파르길옥시페닐알라닌을 포함하며 이에 한정되지 않음) 또는 아지도기를 갖는 비천연 아미노산(p-아지도-페닐알라닌을 포함하며 이에 한정되지 않음)에 첨가될 수 있다.

비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 인슐린 폴리펩티드의 생체 내 생성

본 발명의 인슐린 폴리펩티드는 변형된 tRNA 및 tRNA 합성효소를 사용하여 생체 내에서 생성되어, 자연 발생 시스템에서는 코딩되지 않는 아미노산에 첨가되거나 또는 이를 치환할 수 있다.

자연 발생 시스템에서 코딩되지 않는 아미노산을 사용하여 tRNA 및 tRNA 합성효소를 생성하는 방법들은 예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 제7,045,337호와 제7,083,970호에 기재되어 있다. 이러한 방법들은 번역 시스템에 대해 내인성인 합성효소 및 tRNA와는 관계없이 기능(따라서, "오르쏘고날"이라고도 지칭됨)하는 번역 소기관을 생성하는 단계를 수반한다. 통상, 번역 시스템은 오르쏘고날 tRNA(O-tRNA) 및 오르쏘고날 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS)를 포함한다. 통상적으로, O-RS는 번역 시스템에서 하나 이상의 비자연 발생 아미노산을 사용하여 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하고, O-tRNA는 이 시스템 중에서 다른 tRNA에 의해 인식되지 못하는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 인식한다. 따라서, 번역 시스템은 코딩된 셀렉터 코돈에 대응하여 상기 시스템 중에서 생산된 단백질에 비천연적으로 코딩된 아미노산을 삽입함으로써 코딩된 폴리펩티드 중의 한 위치에 하나의 아미노산을 "치환"시켜 넣게 된다.

특정 합성 아미노산을 폴리펩티드에 삽입하기 위해서 광범위하게 다양한 오르쏘고날 tRNA 및 아미노아실 tRNA 합성효소들이 당업계에서 사용되어 왔으며, 이들은 일반적으로 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 예를 들어, 케토-특이적 O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소는 문헌 [Wang, L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 56-61 (2003)] 및 [Zhang, Z. et al., Biochem. 42(22): 6735-6746 (2003)]에 기재되어 있다. 예시적인 O-RS 또는 이의 일부분은 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되며, 미국 특허 제7,045,337호와 제7,083,970호(본원에 참고로 포함됨)에 개시된 아미노산 서열을 포함한다. 또한, O-RS와 함께 사용하기 위해 이에 대응하는 O-tRNA 분자들도 본 명세서에 참고로 포함되는 제7,045,337호와 제7,083,970호에 기재되어 있다. O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소 쌍의 추가의 예들은 WO 2005/007870, WO 2005/007624 및 WO 2005/0191415에 기술되어 있다.

아지드-특이적 O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소 시스템의 예는 문헌 [Chin, J. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 124: 9026-9027 (2002)]에 기재되어 있다. p-아지도-L-Phe에 대한 예시적인 O-RS 서열로서는, 이에 제한되지는 않지만, 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 제7,083,970호에 개시된 뉴클레오티드 서열인 서열번호 14-16 및 29-32와 아미노산 서열인 서열번호 46-48 및 61-64를 포함한다. 본 발명에 사용하기 적합한 예시적인 O-tRNA 서열로서는, 이에 제한되지는 않지만, 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 제7,083,970호에 개시된 뉴클레오티드 서열인 서열번호 1-3을 포함한다. 비천연적으로 코딩된 특정 아미노산에 대해 특이적인 0-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소 쌍의 다른 예로서는, 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 제7,045,337호에 기재되어 있다. S. 세레비시아 내에 케토 함유 아미노산 및 아지드 함유 아미노산을 모두를 도입시키는 O-RS와 O-tRNA는 문헌 [Chin, J. W., et al., Science 301: 964-967 (2003)]에 기술되어 있다.

수개의 다른 오르쏘고날 쌍이 보고된 바 있다. S. 세레비시아 tRNA의 시스템으로부터 유래한 글루타미닐(예를 들어, 문헌 [Liu, D.R., and Schultz, P.G. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 4780-4785] 참조), 아스파르틸(예를 들어, 문헌 [Pastrnak, M., et al., (2000) Helv. Chim. Acta 83: 2277-2286] 참조) 및 티로실(예를 들어, 문헌 [Ohno, S., et al., (1998) J. Biochem. (Tokyo, Jpn.) 124: 1065-1068] 및 [Kowal, A.K., et al., (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98: 2268-2273] 참조) 시스템과 합성효소들은 대장균 내에서의 비천연 아미노산의 도입 가능성에 대하여 기술되어 왔다. 대장균 글루타미닐(예를 들어, 문헌 [Kowal, A.K., et al., (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98: 2268-2273] 참조) 및 티로실(예를 들어, 문헌 [Edwards, H., and Schimmel, P. (1990) Mol. Cell. Biol. 10: 1633-1641] 참조) 합성효소들은 S. 세레비시아에서 사용하는 것으로 기술되어 왔다. 대장균 티로실 시스템은 포유류 세포에 3-요오드-L-티로신을 생체 내 도입을 위해 사용되어 왔다. 이에 대해서는, 문헌 [Sakamoto, K., et al., (2002) Nucleic Acids Res. 30: 4692-4699]을 참조할 수 있다.

O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소의 사용은 비천연적으로 코딩된 아미노산을 코딩하는 특정 코돈을 선택하는 단계를 수반한다. 어느 코돈이라도 사용할 수 있지만, 일반적으로는 O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소가 발현되는 세포에서 드물게 사용되거나 또는 전혀 사용되지 않는 코돈을 선택하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 대표적인 코돈으로는, 넌센스 코돈, 예컨대 정지 코돈(앰버, 오커 및 오팔), 4개 이상의 염기로 된 코돈 및 드물게 사용되거나 또는 전혀 사용되지 않는 다른 천연 3-염기 코돈을 포함한다.

특정 셀렉터 코돈(들)은 당업계에 공지된 돌연변이 유발법(부위 특이적 돌연변이 유발법, 카세트 돌연변이 유발법, 제한 선택 돌연변이 유발법 등을 포함하며 이에 한정되지 않음)을 사용하여 인슐린 폴리뉴클레오티드 코딩 서열 내에 적절한 위치에 도입될 수 있다.

비천연적으로 코딩된 아미노산을 도입하는 데 사용될 수 있는 단백질 생합성 소기관의 구성 요소들, 예컨대 O-RS, O-tRNA 및 오르쏘고날 O-tRNA/O-RS 쌍을 제조하는 방법은 문헌 [Wang, L., et al., Science 292: 498-500 (2001)], [Chin, J.W., et al., J. Am. Chem. Soc. 124: 9026-9027 (2002)], [Zhang, Z. et al., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003)]에 기재되어 있다. 비천연적으로 코딩된 아미노산의 생체 내 도입을 위한 방법 및 이를 위한 조성물은 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 제7,045,337호에 기재되어 있다. 또한, 유기체의 생체 내 번역 시스템에 사용하기 위해 오르쏘고날 tRNA-tRNA 합성효소 쌍을 선택하는 방법도 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 제7,045,337호와 제7,083,970호에 기재되어 있다. 발명의 명칭이 "Site Specific Incorporation of Keto Amino Acids into Proteins"인 PCT 공보 WO 04/035743(본원에 참고로 포함됨)은 케토 아미노산의 도입을 위한 오르쏘고날 RS 및 tRNA 쌍에 대해 기술하고 있다. 발명의 명칭이 "Expanding the Eukaryotic Genetic Code"인 PCT 공보 WO 04/094593(본원에 참고로 포함됨)은 진핵 숙주 세포 내에 비천연적으로 코딩된 아미노산의 도입을 위한 오르쏘고날 RS 및 tRNA 쌍에 대해 기술하고 있다.

하나 이상의 재조합 오르쏘고날 아미노아실-tRNA 합성효소(O-RS)를 제조하는 방법은 (a) 제1 유기체, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 메타노코쿠스 잔나스치, 메타노박테리움 써모오토트로피쿰, 할로박테리움, 대장균, A. 풀지더스, P. 푸리오수스, P. 호리코시, A. 페르닉스, T. 써모필루스 등과 같은 원핵 생물 유기체 또는 진핵 생물 유기체의 하나 이상의 아미노아실-tRNA 합성효소(RS)로부터 유래한 (돌연변이체일 수 있는) RS의 라이브러리를 생성하는 단계, (b) 비천연적으로 코딩된 아미노산 및 천연 아미노산의 존재 하에, 오르쏘고날 tRNA(O-tRNA)를 아미노아실화하는 구성원을 위한 RS(돌연변이체 RS일 수 있음)의 라이브러리를 선별(및/또는 스크리닝)하여, 활성인 (돌연변이체일 수 있는) RS의 집합체(pool)를 제공하는 단계, 및/또는 (c) 비천연적으로 코딩된 아미노산의 부재 하에, O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 활성 RS(돌연변이체 RS를 포함하며 이에 한정되지 않음)에 대한 집합체를 선별(음성 선별을 이용할 수 있음)하여, 하나 이상의 재조합 O-RS를 제공하는 단계(여기서, 상기 하나 이상의 재조합 O-RS는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 사용하여 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화함).

한 실시 양태에서, 상기 RS는 비활성 RS이다. 이러한 비활성 RS는 활성 RS에 돌연변이를 유발시킴으로써 생성될 수 있다. 예를 들어, 이러한 비활성 RS는 약 1개 이상, 약 2개 이상, 약 3개 이상, 약 4개 이상, 약 5개 이상, 약 6개 이상 또는 약 10개 이상의 아미노산을 이와는 다른 아미노산(예컨대 이에 제한되지는 않지만, 알라닌을 포함함)으로 돌연변이 시킴으로써 생성될 수 있다.

돌연변이체 RS의 라이브러리는 당업계에 공지된 다양한 기법들, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 단백질 3차원 RS 구조에 기초한 합리적 디자인 기법, 또는 무작위 혹은 합리적 디자인 기법에서의 RS 뉴클레오티드의 돌연변이를 유발하는 것등을 이용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이체 RS는 부위 특이적 돌연변이, 무작위 돌연변이, 다양성 생성 재조합 돌연변이, 키메라 구조체, 합리적 디자인 및 본 명세서에 기재되거나 또는 당업계에 공지된 다른 방법들에 의해 생성될 수 있다.

한 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산 및 천연 아미노산의 존재 하에, 활성인 구성원, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 오르쏘고날 tRNA(O-tRNA)를 아미노아실화하는 구성원을 위한 RS(돌연변이체 RS일 수 있음)의 라이브러리를 선별(및/또는 스크리닝)하는 것은 하기의 단계들을 포함한다: 양성 선별 마커 또는 스크리닝 마커, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 항생제 저항성 유전자 등(여기서, 양성 선별 마커 및/또는 스크리닝 마커는 하나 이상의 셀렉터 코돈, 예컨대 이에 한정되지는 않지만, 앰버, 오커, 또는 오팔 코돈을 포함함)과 (돌연변이체일 수 있는) RS의 라이브러리를 다수의 세포에 도입시키는 단계; 선별 시약의 존재 하에 상기 다수의 세포를 성장시키는 단계; 및 양성 선별 또는 스크리닝 마커 중 하나 이상의 셀렉터 코돈을 억제하는 방법을 이용해 선별 시약 및/또는 스크리닝 시약의 존재 하에서 생존(또는 특이적 반응을 나타내는)하는 세포를 동정함으로써, 활성인 (돌연변이체일 수 있는) RS의 집합체를 포함하는 양성 선별된 세포로 된 일부 집단을 제공하는 단계. 임의로, 선별 시약 및/또는 스크리닝 시약의 농도는 변할 수 있다.

한 측면에서, 양성 선별 마커는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(chloramphenicol acetyltransferase: CAT) 유전자이고, 셀렉터 코돈은 CAT 유전자 중의 앰버 정지 코돈이다. 임의로, 양성 선별 마커는 β-락타마아제 유전자이고, 셀렉터 코돈은 β-락타마아제 유전자 중의 앰버 정지 코돈이다. 또 다른 측면에서, 양성 스크리닝 마커는 형광 또는 발광 스크리닝 마커 또는 친화성을 기반으로 한 스크리닝 마커(예컨대, 이에 한정되지는 않지만, 세포 표면 마커를 포함함)를 포함한다.

한 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산의 부재 하에, O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 활성 RS(돌연변이체일 수 있음)에 대한 집합체를 음성적으로 선별하거나 또는 스크리닝하는 것은 하기의 단계들을 포함한다: 양성 선별 또는 스크리닝의 활성 (돌연변이체일 수 있는) RS의 집합체를 사용하여 음성 선별 마커 또는 스크리닝 마커(여기서, 음성 선별 마커 또는 스크리닝 마커는 하나 이상의 셀렉터 코돈(예컨대 이에 제한되지는 않지만, 항생제 저항성 유전자, 예컨대 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT) 유전자를 포함함)를 다수의 제2 유기체의 세포에 도입시키는 단계; 및 비천연적으로 코딩된 아미노산과 스크리닝 시약 또는 선별 시약이 보충된 제1 배지에서 생존하거나 또는 특이적 스크리닝 반응을 보이나, 비천연적으로 코딩된 아미노산과 스크리닝 시약 또는 선별 시약이 보충되지 않은 제2 배지에서는 생존하지 못하거나 또는 특이적 스크리닝 반응을 보이지 않는 세포를 동정하여, 생존하는 세포 또는 스크리닝된 세포에 하나 이상의 재조합 O-RS를 제공하는 단계. 예를 들어, CAT 동정 프로토콜은 적절한 O-RS 재조합물의 결정에 있어서 양성 선별 및/또는 음성 스크리닝으로 작용할 수 있다. 예를 들어, 클론의 집합체는 비천연적으로 코딩된 하나 이상의 아미노산을 함유하거나 또는 함유하지 않는 CAT(이는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함함)를 포함하는 성장 플레이트 상에서 복제될 수 있다. 따라서, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 플레이트에서만 성장하는 콜로니는 재조합 O-RS를 함유하는 것으로 간주된다. 한 측면에서, 선별 시약(및/또는 스크리닝 시약)의 농도는 변화한다. 일부 측면에서, 제1 유기체와 제2 유기체는 서로 다르다. 따라서, 제1 유기체 및/또는 제2 유기체는 원핵 생물, 진핵 생물, 포유류, 대장균, 진균류, 효모, 고세균, 진정세균, 식물, 곤충, 원생 생물 등을 포함할 수 있다. 다른 실시 양태에서, 스크리닝 마커는 형광 또는 발광 스크리닝 마커 또는 친화성을 기반으로 한 스크리닝 마커를 포함한다.

또 다른 실시 양태에서, 활성 (돌연변이체일 수 있는) RS에 대한 집합체를 스크리닝하거나 또는 선별(음성적으로 선택하는 것을 포함하며 이에 한정되지 않음)하는 것은 하기의 단계들을 포함한다: 양성 선별 단계 (b)의 활성 돌연변이체 RS의 집합체를 단리시키는 단계; 음성 선별 또는 스크리닝 마커(여기서, 음성 선별 또는 스크리닝 마커는 하나 이상의 셀렉터 코돈(예컨대 이에 제한되지는 않지만, 독성 마커 유전자, 예컨대 이에 제한되지는 않으나, 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하는 리보뉴클레아제 바르나제(ribonuclease barnase) 유전자를 포함함)과 활성 (돌연변이체일 수 있는) RS의 집합체를 다수의 제2 유기체의 세포에 도입시키는 단계; 및 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 보충되지 않은 제1 배지에서 생존하거나 또는 특이적 스크리닝 반응을 나타내지만, 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 보충된 제2 배지에서는 생존하지 못하거나 또는 특이적 스크리닝 반응을 나타내지 않는 세포를 동정하여, 생존하거나 또는 스크리닝된 세포에 하나 이상의 재조합 O-RS(상기 비천연적으로 코딩된 아미노산에 대해 특이적임)를 제공하는 단계를 포함한다. 한 측면에서, 하나 이상의 셀렉터 코돈은 약 2개 이상의 셀렉터 코돈을 포함한다. 이러한 실시 양태는 임의로는, 하나 이상의 셀렉터 코돈이 2개 이상의 셀렉터 코돈을 포함하는 경우와, 제1 유기체와 제2 유기체가 서로 다른(예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 각 유기체는 원핵 생물, 진핵 생물, 포유류, 대장균, 진균류, 효모, 고세균, 진정세균, 식물, 곤충, 원생 생물 등을 포함할 수 있음) 경우를 포함할 수 있다. 또한, 일부 측면들로서는 음성 선별 마커가 리보뉴클레아제 바르나제 유전자(이는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함함)를 포함하는 경우를 포함한다. 다른 측면들로서는 스크리닝 마커가 형광 또는 발광 스크리닝 마커 또는 친화성을 기반으로 한 스크리닝 마커를 포함하는 경우를 포함한다. 본 명세서의 실시 양태에서, 상기 스크리닝 및/또는 선별은 스크리닝 및/또는 선별의 엄격성을 변화시키는 경우도 포함할 수 있다.

한 실시 양태에서, 하나 이상의 재조합 오르쏘고날 아미노아실-tRNA 합성효소(O-RS)를 제조하는 방법은 (d) 하나 이상의 재조합 O-RS를 단리시키는 단계; (e) 하나 이상의 재조합 O-RS로부터 유도된 O-RS(돌연변이 시킬 수 있음)의 제2 집합체를 생성하는 단계; 및 (f) O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 능력을 갖는 돌연변이 시킨 O-RS가 얻어질 때까지 단계 (b) 및 (c)를 반복하는 단계를 더 포함할 수 있다. 단계 (d)-(f)는 예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 약 2회 이상 반복할 수 있다. 한 측면에서, 하나 이상의 재조합 O-RS로부터 유도된 돌연변이화된 O-RS의 제2 집합체는 예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 무작위 돌연변이 유발법, 부위 특이적 돌연변이 유발법, 재조합법 또는 이들을 조합한 방법에 의해 생성될 수 있다.

상기에서 기술한 방법들에 있어서, 선별/스크리닝 단계들, 예컨대 이에 제한되지는 않으나, 양성 선별/스크리닝 단계 (b), 음성 선별/스크리닝 단계 (c), 또는 양성 및 음성 선별/스크리닝 단계 (b) 및 (c) 양자 단계의 엄격성은 선택/스크리닝의 엄격성을 변화시키는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, 양성 선별/스크리닝 단계 (b), 음성 선별/스크리닝 단계 (c), 또는 양성 및 음성 선별/스크리닝 단계 (b) 및 (c) 양자 모두는 리포터를 사용하는 것을 포함하며, 여기서 리포터는 형광 활성화 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting; FACS)에 의해 검출되거나 또는 발광에 의해 검출된다. 리포터는 세포 표면, 파지 디스플레이 등에서 발현되고, 비천연적으로 코딩된 아미노산 또는 유사체와 관련된 친화성 또는 촉매 활성을 기초로 선택된다. 한 실시 양태에서, 돌연변이화된 합성효소는 세포 표면, 파지 디스플레이 등에서 발현된다.

재조합 오르쏘고날 tRNA (O-tRNA)를 생산하는 방법은 (a) 하나 이상의 tRNA, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 제1 유기체의 억제제 tRNA로부터 유도된 돌연변이체 tRNA의 라이브러리를 생성하는 단계, (b) 제1 유기체의 RS 부재 하에, 제2 유기체의 아미노아실-tRNA 합성효소 (RS)에 의해 아미노아실화된 (돌연변이체일 수 있는) tRNA에 대한 라이브러리를 선별(음성적으로 선택하는 것을 포함하며 이에 한정되지 않음)하거나 또는 스크리닝하여 tRNA(돌연변이체일 수 있음)의 집합체를 제공하는 단계; 및 (c) 도입된 오르쏘고날 RS(O-RS)에 의해 아미노아실화된 구성원에 대한 tRNA(돌연변이체일 수 있음)의 집합체를 선택하거나 또는 스크리닝함으로써 하나 이상의 재조합 O-tRNA(여기서, 하나 이상의 재조합 O-tRNA는 셀렉터 코돈을 인식하고, 제2 유기체의 RS에 의해서는 유효하게 인식되지 않으며, O-RS에 의해 우선적으로 아미노아실화됨)를 제공하는 단계를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 tRNA는 억제제 tRNA이고/이거나, 천연 및/또는 비천연 염기로 된 독특한 3-염기 코돈을 포함하거나, 또는 넌센스 코돈, 희귀 코돈, 비천연 코돈, 4개 이상의 염기를 포함하는 코돈, 앰버 코돈, 오커 코돈 혹은 오팔 정지 코돈이다. 한 실시 양태에서, 재조합 O-tRNA는 개선된 직교성을 보유한다. 일부 실시 양태에서, O-tRNA는 변형될 필요 없이 제2 유기체로부터 제1 유기체로 도입될 수 있다는 사실이 명확이 이해될 것이다. 다양한 실시 양태에서, 제1 유기체 및 제2 유기체는 동일하거나 또는 서로 다르며, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 원핵 생물(예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 메타노코쿠스 잔나스치, 메타노박테리움 써모오토트로피쿰, 대장균, 할로박테리움 등을 포함함), 진핵 생물, 포유류, 진균류, 효모, 고세균, 진정세균, 식물, 곤충, 원생생물 등으로부터 선택될 수 있다. 또한, 재조합 tRNA는 비천연적으로 코딩된 아미노산에 의해 아미노아실화될 수 있으며, 여기서 상기 비천연적으로 코딩된 아미노산은 자연적으로 또는 유전자 조작을 통해 생체 내에서 생합성된다. 상기 비천연적으로 코딩된 아미노산은 적어도 제1 유기체 또는 제2 유기체를 위한 성장 배지에 첨가될 수 있다.

한 측면에서, 아미노아실-tRNA 합성효소에 의해 아미노아실화된 (돌연변이체일 수 있는) tRNA에 대한 라이브러리를 선별(음성적으로 선별하는 것을 포함하며 이에 한정되지 않음)하거나 또는 스크리닝하는 단계(단계 (b))는, 독성 마커 유전자(여기서, 독성 마커 유전자는 하나 이상의 셀렉터 코돈(혹은 독성 제제 또는 항균제 생산을 유도하는 유전자, 또는 마커 유전자가 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하는 유기체에 필수적인 유전자)을 포함함) 및 (돌연변이체일 수 있는) tRNA의 라이브러리를 다수의 제2 유기체 세포에 도입시키는 단계; 및 하나 이상의 오르쏘고날 tRNA 또는 비기능적 tRNA를 함유하는 (돌연변이체일 수 있는) tRNA의 집합체를 포함하는 생존 세포를 선택하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 생존 세포는 비교 율 세포 밀도 분석시험을 사용함으로써 선택될 수 있다.

또 다른 측면에서, 상기 독성 마커 유전자는 2개 이상의 셀렉터 코돈을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법의 또 다른 실시 양태에서, 상기 독성 마커 유전자는 리보뉴클레아제 바르나제 유전자이며, 여기서 리보뉴클레아제 바르나제 유전자는 하나 이상의 앰버 코돈을 포함한다. 임의로는, 리보뉴클레아제 바르나제 유전자는 2개 이상의 앰버 코돈을 포함할 수 있다.

한 실시 양태에서, 도입된 오르쏘고날 RS(O-RS)에 의해 아미노아실화된 구성원에 대하여 (돌연변이체일 수 있는) tRNA의 집합체를 선택하거나 또는 스크리닝하는 단계는, 양성 선별 또는 스크리닝 마커 유전자(여기서, 양성 마커 유전자는 약물 저항성 유전자(하나 이상의 셀렉터 코돈, 예를 들어 하나 이상의 앰버 정지 코돈을 포함하는 β-락타마아제 유전자를 포함하며 이에 한정되지 않음) 또는 유기체에 필수적인 유전자, 또는 O-RS와 함께 독성 제제 해독을 유도하는 유전자를 포함함) 및 (돌연변이체일 수 있는) tRNA의 집합체를 다수의 제2 유기체의 세포에 도입시키는 단계; 및 선택제 또는 스크리닝 제제, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 항생제의 존재 하에 성장한 생존 세포 또는 스크리닝된 세포를 동정함으로써, 하나 이상의 재조합 tRNA(여기서, 하나 이상의 재조합 tRNA는 O-RS에 의해 아미노아실화되어, 하나 이상의 셀렉터 코돈에 대응하여 양성 마커 유전자에 의해 코딩된 번역 생성물에 아미노산을 삽입하게 됨)를 보유하는 세포의 집합체를 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, 선택제 및/또는 스크리닝 제제의 농도는 다양하게 할 수 있다.

특이적 O-tRNA/O-RS 쌍을 생성하는 방법이 제공된다. 이 방법은 (a) 제1 유기체의 하나 이상의 tRNA로부터 유도된 돌연변이체 tRNA의 라이브러리를 생성하는 단계, (b) 제1 유기체의 RS 부재 하에 제2 유기체의 아미노아실-tRNA 합성효소(RS)에 의해 아미노아실화된 (돌연변이체일 수 있는) tRNA에 대한 라이브러리를 음성적으로 선택하거나 또는 스크리닝하여, (돌연변이체일 수 있는) tRNA의 집합체를 제공하는 단계; (c) 도입된 오르쏘고날 RS(O-RS)에 의해 아미노아실화된 구성원에 대한 (돌연변이체일 수 있는) tRNA의 집합체를 선택하거나 또는 스크리닝하여, 하나 이상의 재조합 O-tRNA를 제공하는 단계를 포함한다. 하나 이상의 재조합 O-tRNA는 셀렉터 코돈을 인식하며, 제2 유기체의 RS에 의해서는 효율적으로 인식되지 않고, O-RS에 의해 우선적으로 아미노아실화된다. 또한, 이 방법은 (d) 제3 유기체의 하나 이상의 아미노아실-tRNA 합성효소(RS)로부터 유도된 (돌연변이체일 수 있는) RS의 라이브러리를 생성하는 단계; (e) 비천연적으로 코딩된 아미노산 및 천연 아미노산의 존재 하에서 하나 이상의 재조합 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 구성원에 대한 돌연변이체 RS의 라이브러리를 선택하거나 또는 스크리닝하여, 활성 (돌연변이체일 수 있는) RS의 집합체를 제공하는 단계; 및 (f) 비천연적으로 코딩된 아미노산의 부재 하에서 하나 이상의 재조합 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 활성 (돌연변이체일 수 있는) RS에 대한 집합체를 음성적으로 선택하거나 또는 스크리닝하여, 하나 이상의 특이적 O-tRNA/O-RS 쌍(여기서, 하나 이상의 특이적 O-tRNA/O-RS 쌍은 비천연적으로 코딩된 아미노산에 특이적인 하나 이상의 재조합 O-RS 및 하나 이상의 재조합 O-tRNA를 포함함)을 제공하는 단계를 포함한다. 상기 방법에 의해 생산된 특이적인 0-tRNA/O-RS 쌍이 포함된다. 예를 들어, 특이적 O-tRNA/O-RS 쌍은, 이에 제한되지는 않지만, mutRNATyr-mutTyrRS 쌍, 예컨대 mutRNATyr-SS12TyrRS 쌍, mutRNALeu-mutLeuRS 쌍, mutRNAThr-mutThrRS 쌍, mutRNAGlu-mutGluRS 쌍 등을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 방법은 제1 유기체와 제3 유기체가 동일한 경우(메타노코쿠스 잔나스치를 포함하며 이에 한정되지 않음)를 포함한다.

또한, 제2 유기체의 생체 내 번역 시스템에서 사용하기 위한 오르쏘고날 tRNA-tRNA 합성효소 쌍을 선택하는 방법도 본 발명에 포함된다. 이 방법은 마커 유전자, tRNA 및 제1 유기체로부터 단리되거나 또는 유도된 아미노아실-tRNA 합성효소(RS)를 제2 유기체의 제1 세포 집합체로 도입시키는 단계, 상기 마커 유전자 및 tRNA를 제2 유기체의 복제품 세포 집합체에 도입시키는 단계, 복제품 세포 집합체에서는 생존하지 못하는 제1 집합체 내의 생존 세포를 선택하거나 또는 복제품 세포 집합체에서는 이러한 반응을 나타내지 못하는 특이적인 스크리닝 반응을 보이는 세포를 스크리닝하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 제1 집합체 및 복제품 세포 집합체는 선택제 또는 스크리닝 제제의 존재 하에서 성장하고, 상기 생존 세포 또는 스크리닝된 세포는 제2 유기체의 생체 내 번역 시스템에서 사용되는 오르쏘고날 tRNA-tRNA 합성효소 쌍을 포함한다. 한 실시 양태에서, 비교 및 선택 또는 스크리닝하는 단계는 세포 내 상보성 분석시험을 포함한다. 선택제 또는 스크리닝 제제의 농도는 변화할 수 있다.

본 발명의 유기체는 다양한 유기체 및 다양한 조합체들을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 방법의 제1 유기체 및 제2 유기체는 동일하거나 서로 다를 수 있다. 한 실시 양태에서, 상기 유기체는 원핵 생물 유기체, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 메타노코쿠스 잔나스치, 메타노박테리움 써모오토트로피쿰, 할로박테리움, 대장균, A. 풀지더스, P. 푸리오수스, P. 호리코시, A. 페르닉스, T. 써모필루스 등을 포함할 수 있다. 다르게는, 이러한 유기체는 진핵 생물 유기체, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 식물(예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 복합체 식물, 예컨대 외떡잎 식물, 또는 쌍떡잎 식물을 포함함), 해조류, 원생생물, 진균류(효모 등을 포함하며 이에 한정되지 않음), 동물(포유류, 곤충, 절지 동물 등을 포함하며 이에 한정되지 않음)을 포함할 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, 제2 유기체는 원핵 생물 유기체, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 메타노코쿠스 잔나스치, 메타노박테리움 써모오토트로피쿰, 할로박테리움, 대장균, A. 풀지더스, 할로박테리움, P. 푸리오수스, P. 호리코시, A. 페르닉스, T. 써모필루스 등일 수 있다. 다르게는, 제2 유기체는 진핵 생물 유기체, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 효모, 동물 세포, 식물 세포, 진균류, 포유류 세포 등일 수 있다. 다양한 실시 양태에서, 제1 유기체와 제2 유기체는 서로 다르다.

인슐린 폴리펩티드 내의 비천연 발생 아미노산의 위치

본 발명은 하나 이상의 비천연 발생 아미노산을 인슐린 폴리펩티드에 도입시키는 것을 고려한다. 하나 이상의 비천연 발생 아미노산은 폴리펩티드의 활성에 지장을 주지 않는 특정한 위치에 도입될 수 있다. 이는 "보존적" 치환의 수행, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 소수성 아미노산을 소수성 아미노산으로, 벌키 아미노산의 경우 벌키 아미노산으로, 친수성 아미노산의 경우 친수성 아미노산으로 치환하고/하거나 활성이 요구되지 않는 위치에 비천연 발생 아미노산을 삽입시킴으로써 수행될 수 있다.

다양한 생화학적 및 구조적 접근 방법들을 사용하여, 인슐린 폴리펩티드 내에서 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환하고자 하는 부위를 선택할 수 있다. 폴리펩티드 사슬 중 어느 위치를 선택하는 것이 비천연적으로 코딩된 아미노산을 도입시키기에 적합한지에 대해서는 당업자에게는 자명한 것이며, 이러한 선택은 합리적인 디자인에 기초할 수 있거나, 또는 임의의 원하는 특정 목적을 가지거나 혹은 이러한 원하는 특정 목적 없이도 무작위 선택에 기초할 수 있다. 원하는 부위의 선택은 예컨대 이에 제한되지는 않으나, 작용제, 초작용제(super-agonist), 역작용제, 길항제, 수용체 결합 조절제, 수용체 활성 조절제, 이량체 또는 다량체 형성을 비롯한 임의의 원하는 특성 또는 활성을 갖는 인슐린 분자를 생성하기 위한 것이거나, 본래의 분자에 비해 활성 또는 특성에 있어서 변화를 주지 않기 위한 것이거나, 또는 폴리펩티드의 물리적 또는 화학적 특성, 예컨대 가용성, 응집성 또는 안정성을 조작하기 위한 것일 수 있다. 예를 들어, 인슐린 폴리펩티드의 생물학적 활성을 필요로 하는 폴리펩티드 내에서의 위치는 당업계에 공지된 점 돌연변이 분석법, 알라닌 스캐닝, 포화 돌연변이 유발법 및 생물학적 활성 스크리닝, 또는 동족체 스캐닝 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 인슐린 폴리펩티드의 변형이 되었는지에 대해 잔기들을 확인하는 다른 방법로서는, 이에 제한되지는 않지만, 서열 프로파일링(문헌 [Bowie and Eisenberg, Science 253(5016): 164-70, (1991)] 참조), 로타머 라이브러리 선별(문헌 [Dahiyat and Mayo, Protein Sci 5(5): 895-903 (1996)]; [Dahiyat and Mayo, Science 278(5335): 82-7 (1997)]; [Desjarlais and Handel, Protein Science 4: 2006-2018 (1995)]; [Harbury et al, PNAS USA 92(18): 8408-8412 (1995)]; [Kono et al., Proteins: Structure, Function and Genetics 19: 244-255 (1994)]; [Hellinga and Richards, PNAS USA 91: 5803-5807 (1994)] 참조); 및 잔기 쌍 전위(문헌 [Jones, Protein Science 3: 567-574, (1994)] 참조), 그리고 프로틴 디자인 오토메이션(Protein Design Automation®) 기법(본원에 참조로 포함되는 미국특허 제6,188,965호; 제6,269,312호; 제6,403,312호; WO 98/47089를 참조)을 사용할 수 있다. 인슐린 생물활성에 중요한 잔기들, 약학적 안정성과 관련이 있는 잔기들, 항체 에피토프 또는 수용체 결합 잔기들은 돌연변이화 될 수 있다. 본원에 참조로 포함되는 미국특허 제5,580,723호; 제5,834,250호; 제6,013,478호; 제6,428,954호 및 제6,451,561호는 표적 물질을 갖는 폴리펩티드의 활성에 영향을 주는 활성 도메인의 확인에 의하여 인슐린과 같은 폴리펩티드의 구조와 기능에 대해 총체적으로 분석하는 방법을 기술하고 있다. 다르게는, 생물학적 활성에 중요한 것으로 확인된 부위도 역시 폴리펩티드에 얻고자 하는 원하는 활성에 따라 비천연적으로 코딩된 아미노산을 사용한 치환에 있어서 우수한 후보 부위일 수 있다. 또 다른 대안은 폴리펩티드 사슬 상의 각각의 위치에서 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 간단히 연속 치환하여, 폴리펩티드의 활성에 대한 영향을 관찰하는 것이다. 임의의 폴리펩티드 내에 비천연 아미노산을 사용한 치환을 위해 그 위치를 선택하는 데 있어서는, 어떠한 수단, 기술 또는 방법이라도 본 발명에 사용하기 적합하다는 사실은 당업자에게는 명백할 것이다.

또한, 결실된 부분을 포함하는 인슐린 폴리펩티드 돌연변이체의 구조 및 활성을 조사하여 비천연적으로 코딩된 아미노산을 사용한 치환에 내성을 가지기 쉬운 단백질의 영역을 결정할 수 있다. 이와 유사한 방식으로, 프로테아제 소화 및 단일클론 항체를 사용하여 인슐린 수용체의 결합을 담당하는 인슐린의 영역을 확인할 수 있다. 일단 비천연적으로 코딩된 아미노산을 사용한 치환에 내성을 갖지 않을 것으로 보이는 잔기를 제거한 후, 각각의 잔류 위치에서 계획한 치환의 영향을 조사할 수 있다. 모델은 다른 인슐린 부류의 구성원들의 3차원 결정 구조로부터 만들 수 있다. 프로틴 데이터 뱅크(Protein Data Bank, www.rcsb.org 상에서 이용가능)는 단백질 및 핵산의 거대 분자의 3차원 구조 데이터를 포함하는 중앙 데이터베이스이다. 만일 3차원 구조 데이터가 없을 경우에는, 폴리펩티드의 2차 구조 및 3차 구조를 조사하여 모델을 구성할 수 있다. 따라서, 당업자라면 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환될 수 있는 아미노산 위치를 용이하게 확인할 수 있다.

일부 실시 양태에서, 본 발명의 인슐린 폴리펩티드는 폴리펩티드의 구조를 붕괴시키지 않는 단백질의 영역에 위치한 하나 이상의 비천연 발생 아미노산을 포함한다.

비천연적으로 코딩된 아미노산을 도입을 위한 예시적인 잔기는, 가능한 수용체 결합 영역으로부터 제외된 것들일 수 있고, 완전히 또는 부분적으로 용매에 노출될 수 있으며, 이웃 잔기와 수소 결합 상호작용을 최소한으로 가지거나 가지지 않을 수 있고, 이웃하는 반응성 잔기에 최소로 노출될 수 있으며, 하나 이상의 상기 노출된 면 상에 존재할 수 있고, 제2 인슐린, 또는 다른 분자 또는 이의 단편에 병치된 부위 또는 부위들일 수 있으며, 수용체에 결합되거나 혹은 결합되지 않거나, 또는 다른 생물학적 활성 분자에 커플링되거나 혹은 커플링되지 않은 인슐린의 3차원, 2차, 3차 또는 4차 구조에 의해 예측된 바와 같이 매우 유동적이거나 구조적으로 강성한 영역일 수 있거나, 또는 완전한 구조의 유동성 또는 강성을 원하는 대로 변화시킴으로써 인슐린 자체 혹은 하나 이상의 인슐린을 포함하는 이량체 또는 다량체의 형태를 조절할 수 있다.

당업자라면 이러한 인슐린의 분석을 통해 단백질의 3차 구조 내에 매립되어 있는 아미노산 잔기들에 비하여 어느 아미노산 잔기가 표면 노출되어 있는지를 결정할 수 있다는 사실을 알 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명의 실시 양태로서, 표면 노출된 잔기인 아미노산으로 비천연적으로 코딩된 아미노산을 대체하는 것도 해당된다.

일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 하나 이상의 아미노산은 인슐린의 다음의 위치 중 하나 이상의 위치에 도입된다: A 사슬 내에서 1번 위치 앞 (즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22(즉, 단백질의 카르복실 말단) 및 이들의 임의의 조합(서열번호 1) 또는 B 사슬 내에서 1번 위치 앞 (즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 (서열번호 2).

인슐린의 결정 구조 및 인슐린의 그 수용체와의 상호작용을 조사해본 결과는 용매에 대해서 어떤 특정 아미노산이 완전하게 또는 부분적으로 이용가능한 측쇄를 가지고 있는지를 알려줄 수 있다. 이들 위치에서 비천연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄는 단백질 표면에서부터 용매로 향할 수 있다.

일부 실시 양태에서, 이러한 위치들 중 하나 이상의 위치의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 예컨대 이에 제한되지는 않으나, 다음의 위치들에서 수용성 중합체와 결합된다: A 사슬 내에서 1번 위치 앞 (즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22(즉, 단백질의 카르복실 말단) 및 이들의 임의의 조합(서열번호 1) 또는 B 사슬 내에서 1번 위치 앞 (즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 (서열번호 2).

광범위하게 다양한 비천연적으로 코딩된 아미노산은 인슐린 폴리펩티드 내에서 정해진 위치를 치환하거나 또는 이러한 위치로 도입될 수 있다. 일반적으로, 폴리펩티드에 도입하기 위한 비천연적으로 코딩된 특정 아미노산은 인슐린 폴리펩티드 또는 다른 인슐린 부류의 구성원 또는 인슐린 유사체의 그 수용체와의 3차원 결정 구조, 보존적 치환에 대한 선호도(즉, Phe, Tyr 또는 Trp을 아릴을 기반으로 한 비천연적으로 코딩된 아미노산, 예컨대 p-아세틸페닐알라닌 또는 O-프로파르길티로신으로 치환), 그리고 인슐린 폴리펩티드에 도입시키고자 하는 특이적 콘쥬게이션 화학론(예를 들어, 알킨 부분을 보유하는 수용성 중합체를 사용한 휘스겐 [3 + 2] 시클로 첨가를 실시하고자 하는 경우, 또는 아릴 에스테르를 가져서 결과적으로 포스핀 부분을 도입하게 되는 수용성 중합체를 사용한 아미드 결합 형성을 실시하고자 하는 경우, 4-아지도페닐알라닌을 도입시킴)에 대해 조사한 사항을 기초로 선택된다.

한 실시 양태에서, 본 방법은 제1 반응성 기를 포함하는 비천연 아미노산을 단백질에 도입시키는 단계 및 이러한 단백질을 제2 반응성 기를 포함하는 분자(예컨대 이에 제한되지는 않지만, 표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜의 유도체, 광가교결합제, 방사성 핵종, 세포독성 화합물, 약물, 친화성 표지, 광친화성 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이트제, 보조인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 사카라이드, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 억제성 리보핵산, 생체 적합 물질, 나노입자, 스핀 표지, 형광발색단, 금속 함유 부분, 방사성 부분, 신규한 작용기, 다른 분자와 공유 또는 비공유적으로 상호작용하는 기, 포토케이징된 부분, 화학 방사선으로 여기가능한 부분, 광이성질화 가능한 부분, 비오틴, 비오틴의 유도체, 비오틴 유사체, 무거운 원자를 도입하는 부분, 화학적으로 분절가능한 기, 광분절성 기, 연장된 측쇄, 탄소 결합된 당, 산화환원 활성제, 아미노 티오산, 독성 부분, 동위원소로 표지된 부분, 생물리학적 프로브, 형광 기, 화학발광기, 고 전자 밀도 기, 자성 기, 삽입 기, 발색단, 에너지 전달제, 생물학적 활성제, 검출가능한 표지, 소분자, 양자점, 나노전달물질, 방사성 핵종, 방사성 전달물질, 중성자 포획제, 또는 상기한 것들의 임의의 혼합물 혹은 임의의 다른 바람직한 화합물 또는 물질을 포함함)와 접촉시키는 단계를 더 포함한다. 제1 반응성 기는 제2 반응성 기와 반응하여 [3 + 2] 시클로 첨가를 통해 분자를 비천연 아미노산에 부착시킨다. 한 실시 양태에서, 제1 반응성 기는 알키닐 또는 아지도 부분이고, 제2 반응성 기는 아지도 또는 알키닐 부분이다. 예를 들어, 제1 반응성 기는 알키닐 부분(예컨대, 이에 한정하지는 않으나, 비천연 아미노산인 p-프로파르길옥시페닐알라닌 중의 알키닐 부분을 포함함)이고, 제2 반응성 기는 아지도 부분이다. 또 다른 예에서, 제1 반응성 기는 아지도 부분(비천연 아미노산인 p-아지도-L-페닐알라닌 중의 아지도 부분을 포함함)이며, 제2 반응성 기는 알키닐 부분이다.

일부의 경우에 있어서는, 비천연적으로 코딩된 아미노산 치환(들)은 인슐린 폴리펩티드 내에서의 다른 첨가, 치환 또는 결실과 조합되어 인슐린 폴리펩티드의 다른 생물학적 특질에 영향을 미칠 수 있을 것이다. 일부 경우에서는, 상기 다른 첨가, 치환 또는 결실은 인슐린 폴리펩티드의 안정성(단백질 분해성 분해에 대한 저항성을 포함하며 이에 한정되지 않음)을 증가시키거나 또는 인슐린 폴리펩티드의 그 수용체에 대한 친화도를 증가시킬 수 있다. 일부의 경우, 상기 다른 첨가, 치환 또는 결실은 인슐린 폴리펩티드의 약학적 안정성을 증가시킬 수 있다. 일부의 경우, 상기 다른 첨가, 치환 또는 결실은 인슐린 폴리펩티드의 항바이러스 활성을 향상시킬 수 있다. 일부의 경우, 상기 다른 첨가, 치환 또는 결실은 인슐린 폴리펩티드의 가용성(예컨대 이에 제한되지는 않지만, 대장균 또는 다른 숙주 세포에서 발현되는 경우)을 증가시킬 수 있다. 일부 실시 양태에서, 상기 첨가, 치환 또는 결실은 대장균 또는 다른 재조합 숙주 세포에서 발현된 후 폴리펩티드 가용성을 증가시킬 수 있다. 일부 실시 양태에서, 대장균 또는 다른 재조합 숙주 세포에서 발현된 후 폴리펩티드의 가용성 증대를 유도하는 비천연 아미노산의 도입을 위한 또 다른 부위 이외에, 천연적으로 코딩된 아미노산 또는 비천연 아미노산으로 치환하는 부위도 선택된다. 일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 인슐린 폴리펩티드 수용체, 결합 단백질 또는 관련 리간드에 대한 친화도를 조절하거나, 인슐린 수용체에 결합한 후 신호 전달을 조절하거나, 순환 반감기를 조절하거나, 방출 또는 생체 이용률을 조절하거나, 정제를 용이하게 하거나 또는 특정 투여 경로를 개선하거나 변화시키는 또 다른 첨가, 치환 또는 결실을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 인슐린 변이체의 그 수용체와의 친화도를 증가시키는 첨가, 치환 또는 결실을 포함한다. 이와 유사하게, 인슐린 폴리펩티드는 화학적 또는 효소 분절 서열, 프로테아제 분절 서열, 반응성 기, 항체 결합 도메인(FLAG 또는 폴리-His를 포함하며 이에 한정되지 않음) 또는 다른 친화성을 기반으로 한 서열(FLAG, 폴리-His, GST 등을 포함하며 이에 한정되지 않음) 또는 폴리펩티드의 검출(GFP를 포함하며 이에 한정되지 않음), 정제, 조직 또는 세포막을 통한 수송, 프로드러그 방출 또는 활성화, 인슐린 크기 감소, 또는 폴리펩티드의 다른 특질을 개선시키는 결합 분자(비오틴을 포함하며 이에 한정되지 않음)를 포함할 수 있다.

일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산의 치환은 인슐린 길항제를 만들어 낸다. 일부 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 수용체 결합과 관련된 영역에서 치환되거나 추가된다. 일부 실시 양태에서, 인슐린 길항제는 인슐린이 길항제로서 작용하도록 유도하는 하나 이상의 치환을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 인슐린 길항제는 인슐린 분자의 수용체 결합 영역 내에 존재하는 수용성 중합체에 결합된 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다.

일부 실시 양태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 아미노산이 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된다. 일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 천연 발생 아미노산에 대하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산의 치환을 더 포함한다. 예를 들어, 일부 실시 양태에서, 인슐린 내의 하나 이상의 잔기는 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된다. 일부의 경우에는, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 잔기는 저분자량인 하나 이상의 선형 또는 분지형 PEG에 결합되어, 고분자량의 단일 PEG에 부착된 종에 비해 결합 친화도를 향상시키고 비슷한 혈청 반감기를 가지도록 해준다.

일부 실시 양태에서, 하기의 인슐린 잔기들 중 2개까지의 잔기가 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된다.

비진핵 생물 및 진핵 생물에서의 발현

클로닝된 인슐린 폴리뉴클레오티드의 높은 수준의 발현을 얻기 위해서는, 통상 본 발명의 인슐린 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를, 전사를 지시하는 강성 프로모터, 전사/번역 종결자, 그리고 단백질을 코딩하는 핵산의 경우, 번역 개시를 위한 리보좀 결합 부위를 포함하는 발현 벡터 내로 서브클로닝한다. 적절한 세균 프로모터는 당업계에 공지되어 있는데, 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al.] 및 [Ausubel et al.]에 기재되어 있다.

본 발명의 인슐린 폴리펩티드 발현을 위한 세균 발현 시스템은 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 대장균, 바실러스 균속(Bacillus sp.), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 및 살모넬라(Salmonella)에서 이용가능하다(문헌 [Palva et al., Gene 22: 229-235 (1983)], [Mosbach et al., Nature 302: 543-545 (1983)] 참조). 이러한 발현 시스템을 위한 키트는 시판된다. 포유류 세포, 효모 및 곤충 세포용 진핵 발현 시스템은 당업계에 공지되어 있으며, 역시 시판된다. 오르쏘고날 tRNA와 아미노아실 tRNA 합성효소(상기한 바와 같음)를 사용하여 본 발명의 인슐린 폴리펩티드를 발현시키는 경우, 발현을 위한 숙주 세포는 오르쏘고날 성분을 이용할 수 있는 그들의 능력을 기초로 선택된다. 예시적인 숙주 세포로서는 그람-양성(Gram-positive) 세균[B. 브레비스(brevis), B. 서브틸리스(subtilis) 또는 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함하며 이에 한정되지 않음] 및 그람-음성 세균(대장균, 슈도모나스 플루오레센스, 슈도모나스 에어루기노사, 슈도모나스 푸티다)뿐만 아니라 효모와 다른 진핵 세포를 포함한다. O-tRNA/O-RS 쌍을 포함하는 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다.

본 발명의 진핵 숙주 세포 또는 비진핵 숙주 세포는 비천연 아미노산을 유용한 양으로 많이 포함하는 단백질을 합성할 수 있는 능력을 제공한다. 한 측면에서, 조성물은 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 10 ㎍ 이상, 50 ㎍ 이상, 75 ㎍ 이상, 100 ㎍ 이상, 200 ㎍ 이상, 250 ㎍ 이상, 500 ㎍ 이상, 1 ㎎ 이상, 10 ㎎ 이상, 100 ㎎ 이상, 1 g 이상 또는 그 이상의 단백질(비천연 아미노산을 포함하는 단백질)을 포함할 수 있거나, 또는 생체 내 단백질 생산 방법(재조합 단백질 생산 및 정제에 대한 상세한 설명은 본 명세서에 제공됨)을 사용하여 얻어질 수 있는 양을 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, 단백질은 예컨대 이에 제한되지는 않으나, 세포 용해물, 완충액, 약학적 완충액 또는 다른 액체 현탁액(예컨대 이에 제한되지는 않지만, 약 1 nl 내지 약 100 L 범위 중 임의의 수치를 포함하는 부피) 중에서, 1 리터당 10 ㎍ 이상의 단백질, 50 ㎍ 이상의 단백질, 75 ㎍ 이상의 단백질, 100 ㎍ 이상의 단백질, 200 ㎍ 이상의 단백질, 250 ㎍ 이상의 단백질, 500 ㎍ 이상의 단백질, 1 ㎎ 이상의 단백질 또는 10 ㎎ 이상 또는 그 이상의 단백질 농도로 조성물 내에 존재할 수 있다. 진핵 세포에서 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 단백질을 대량(예컨대 이에 제한되는 것은 아니나, 통상 시험관 내 번역을 포함하는 다른 방법을 사용하여 가능한 것보다 더욱 양이 많음) 생산하는 것은 본 발명의 한 특징이다.

본 발명의 진핵 숙주 세포 또는 비진핵 숙주 세포는 비천연 아미노산을 유용한 양으로 많이 포함하는 단백질을 생합성하는 능력을 제공한다. 예를 들어, 비천연 아미노산을 포함하는 단백질은 세포 추출물, 세포 용해물, 배양 배지, 완충액 등 중에서, 예컨대 이에 제한되는 것은 아니지만, 10 ㎍/ℓ 이상, 50 ㎍/ℓ 이상, 75 ㎍/ℓ 이상, 100 ㎍/ℓ 이상, 200 ㎍/ℓ 이상, 250 ㎍/ℓ 이상, 또는 500 ㎍/ℓ 이상, 1 mg/ℓ 이상, 2 mg/ℓ 이상, 3 mg/ℓ 이상, 4 mg/ℓ 이상, 5 mg/ℓ 이상, 6 mg/ℓ 이상, 7 mg/ℓ 이상, 8 mg/ℓ 이상, 9 mg/ℓ 이상, 10 mg/ℓ 이상, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 mg/ℓ 이상, 1 g/ℓ, 5 g/ℓ, 10 g/ℓ 이상 또는 그 이상의 단백질 농도로 생산될 수 있다.

인슐린의 발현에 적합한 다수의 벡터들은 시판되고 있다. 유용한 진핵 세포 숙주용 발현 벡터로서는, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, SV40, 소 유두종 바이러스, 아데노바이러스 및 시토메갈로바이러스의 발현 조절 서열을 포함하는 벡터를 포함한다. 이러한 벡터로서는 pCDNA3.1(+)＼Hyg(인비트로겐(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재) 및 pCI-neo(스트라타진(Stratagene), 미국 캘리포니아주 라호야 소재)를 포함한다. La Jolla, Calif., USA). 박테리아 플라스미드, 예컨대 pBR322, pET3a 및 pET12a를 비롯한 대장균의 플라스미드, RP4와 같은 보다 넓은 숙주 범위의 플라스미드, 파지 DNA, 예를 들어, 파지 λ의 다양한 유도체, 예를 들어 NM989, 그리고 M13과 같은 다른 DNA 파지와 섬사상 단일 가닥 DNA 파지가 사용될 수 있다. 2μ 플라스미드와 이의 유도체, POT1 벡터(본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제4,931,373호 참조), 문헌 [Okkels, Ann. New York Aced. Sci. 782, 202-207, 1996)에 기술된 pJSO37 벡터 및 pPICZ A, B 또는 C(인비트로겐)가 효모 숙주 세포와 함께 사용될 수 있다. 곤충 세포에 있어서, 벡터는 이에 제한되지는 않지만, pVL941, pBG311(문헌 [Cate et al., "Isolation of the Bovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting Substance and Expression of the Human Gene In Animal Cells", Cell, 45, pp.685-698 (1986) 참조], pBluebac 4.5 및 pMelbac(인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)을 포함한다.

인슐린 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 단일 펩티드를 코딩하는 서열을 포함할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 신호 펩티드는 폴리펩티드가 그것이 발현되는 세포로부터 방출되는 경우에 존재한다. 이러한 신호 펩티드는 임의의 서열일 수 있다. 신호 펩티드는 원핵 세포성 또는 진핵 세포성일 수 있다. 문헌 [Coloma, M (1992) J. Imm. Methods 152:89-104]은 포유류 세포에서 사용되는 신호 펩티드에 대해 기술하고 있다(쥐과의 Ig κ 경쇄 신호 펩티드). 다른 신호 펩티드로서는, 이에 제한되지는 않으나, S. 세레비시아의 α-인자 신호 펩티드(본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제4,870,008호 참조), 마우스 타액 아밀라아제의 신호 펩티드(문헌 [O. Hagenbuchle et al., Nature 289, 1981, pp.643-646] 참조), 변형된 카르복시펩티다아제 신호 펩티드(문헌 [L.A. Valls et al., Cell 48, 1987, pp.887-897] 참조), 효모 BAR1 신호 펩티드(본원에 참조로 포함되는 WO 87/02670) 및 효모 아스파르트산 프로테아제 3(YAP3) 신호 펩티드(문헌 [M. Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, pp.127-137] 비교)를 포함한다.

적절한 포유류 숙주 세포의 예들은 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포(예를 들어, CHO-K1; ATCC CCL-61), 사바나 원숭이 세포(COS)(예를 들어, COS 1(ATCC CRL-1650), COS 7(ATCC CRL-1651)), 마우스 세포(예를 들어, NS/O), 어린 햄스터 신장(BHK) 세포주(예를 들어 ATCC CRL-1632 또는 ATCC CCL-IO) 및 인간 세포(예를 들어 HEK 293(ATCC CRL-1573))뿐만 아니라, 조직 배양 중의 식물 세포일 수 있다. 이러한 세포주 및 기타 세포들은 미국 메릴랜드주 락빌에 소재한 미국 미생물 보존센터(ATCC)와 같은 국립 보관소에서 이용가능하게 되어 있다. 인슐린 폴리펩티드의 향상된 글리코실화를 제공하기 위해, 포유류 숙주 세포는 예컨대, 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제5,047,335호에 기술된 바와 같은 시알릴트랜스퍼라아제, 예를 들어 1,6-시알릴트랜스퍼라아제를 발현하도록 변형될 수 있다.

포유류 숙주 세포 내로 외인성 DNA를 도입하는 방법은, 이에 제한되지는 않지만, 인산칼슘 매개성 형질감염, 전기천공법, DEAE-덱스트란 매개성 형질감염, 리포좀 매개성 형질감염, 바이러스 벡터 및 형질 감염법[Lipofectamin 2000을 이용하는 라이프 테크놀로지스 리미티드(Life Technologies Ltd, 영국 페이즐리 소재)에 의해 기술된 형질 감염법, FuGENE 6을 이용하는 로슈 다이어그노스틱스 코포레이션(Roche Diagnostics Corporation, 미국 인디애나폴리스 소재)에 의해 기술된 형질 감염법]을 포함한다. 이러한 방법들은 당업계에 잘 알려져 있으며, 문헌 [Ausbel et al., (eds.), 1996, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, USA]에 기술되어 있다. 포유류 세포의 배양은, 예를 들어 문헌 [Animal Cell Biotechnology, Methods and Protocols, Edited by Nigel Jenkins, 1999, Human Press Inc. Totowa, N.J., USA] 및 [Harrison Mass. and Rae IF, General Techniques of Cell Culture, Cambridge University Press 1997]에 개시된 바와 같이 확립된 방법에 따라 수행될 수 있다.

발현 시스템, 배양 및 단리

인슐린 폴리펩티드는 임의 다수의 적절한 발현 시스템, 예를 들어, 효모, 곤충 세포, 포유류 세포 및 세균에서 발현될 수 있다. 대표적인 발현 시스템에 대해서 하기에 설명한다.

효모 본 명세서에 사용된 "효모"라는 용어는 인슐린 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 발현시킬 수 있는 임의의 다양한 효모를 포함한다. 이러한 효모는 이에 제한되지는 않지만, 자낭포자형성(ascosporogenous) 효모(엔도마이세탈레스(Endomycetales)), 담자포자(basidiosporogenous) 효모 및 불완전 진균류(Fungi imperfecti)(블라스토마이세테스(Blastomycetes)) 군에 속하는 효모를 포함한다. 상기 자낭포자형성 효모는 2개의 과(family), 스퍼모프토라세에(Spermophthoraceae) 및 사카로마이세타세에(Saccharornycetaceae)로 나뉜다. 후자는 4개의 아과, 스키조사카로마이코이데에(Schizosaccharomycoideae)(예를 들어, 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 속), 나드소니오이데에(Nadsonioideae), 리포마이코이데에(Lipomycoideae) 및 사카로마이코이데에(Saccharomycoideae)(예를 들어, 피치아(Pichia) 속, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 속 및 사카로마이세스(Saccharomyces) 속)를 포함한다. 상기 담자포자 효모는 류코스포리디움(Leucosporidium) 속, 로도스포리디움(Rhodosporidium) 속, 스포리디오볼루스(Sporidiobolus) 속, 필로바시디움(Filobasidium) 속 및 필로바시디엘라(Filobasidiella) 속을 포함한다. 불완전 진균류(블라스토마이세테스) 군에 속하는 효모는 2개의 과, 스포로볼로마이세타세에(Sporobolomycetaceae)(예를 들어, 스포로볼로마이세스(Sporobolomyces) 속 및 불레라(Bullera) 속) 및 크립토코카세에(Cryptococcaceae)(예를 들어, 칸디다(Candida) 속)로 나뉜다.

본 발명에서 사용하는데 있어서 특히 중요한 것으로는, 피치아 속, 클루이베로마이세스 속, 사카로마이세스 속, 스키조사카로마이세스 속, 한세눌라(Hansenula) 속, 토룰롭시스 (Torulopsis) 속 및 칸디다 속에 속하는 종으로서, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, P. 파스토리스(P. pastoris), P. 귈러리몬디(P. guillerimondii), S. 세레비시에(S. cerevisiae), S. 칼스버겐시스(S. carlsbergensis), S. 디아스타티쿠스(S. diastaticus), S. 더글라시(S. douglasii), S. 클루이베리(S. kluyveri), S. 노르벤시스(S. norbensis), S. 오비포르미스(S. oviformis), K. 락티스(K. lactis), K. 프라길리스(K. fragilis), C. 알비칸스(C. albicans), C. 말토사(C. maltosa) 및 H. 폴리모르파(H. polymorpha)를 들 수 있다.

인슐린 폴리펩티드의 발현을 위한 적합한 효모의 선택은 당업계의 숙련자라면 누구나 할 수 있다. 발현용 효모 숙주의 선택에 있어서, 적절한 숙주는 예를 들어, 우수한 분비 용량, 낮은 단백질 분해 활성, 우수한 가용성 단백질 생산성 및 전체적인 강인성을 보유하는 것으로 밝혀진 것들을 포함할 수 있다. 효모는 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 미국 캘리포니아 대학(University of California)(미국 캘리포니아주 버클리 소재) 생체물리학 및 의료 물리학부(Department of Biophysics and Medical Physics)의 효모 유전자 저장 센터(Yeast Genetic Stock Center) 및 미국 미생물 보존센터("ATCC")(미국 버지니아주 만나사스 소재)를 비롯한 다양한 공급업체로부터 통상 이용가능하다.

"효모 숙주" 또는 "효모 숙주 세포"라는 용어는 재조합 벡터 또는 다른 전이 DNA에 대한 수용자로서 사용될 수 있거나 또는 사용된 효모를 망라한다. 이 용어는 재조합 벡터 또는 다른 전이 DNA를 수용한 본래의 효모 숙주 세포의 후대의 자손을 포함한다. 단일 모 세포 후대의 자손은 우연한 돌연변이의 발생 또는 의도적인 돌연변이 유발로 인하여 본래의 모체에 비하여 그 형태 또는 그 유전체, 또는 총체적 DNA의 보체가 완전하게 동일하지 않을 수 있다. 인슐린 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드가 존재하는 것과 같은 유의한 특징으로 인해 모체와 충분히 유사한 모 세포 후손은 이러한 상기 정의가 말하는 후손에 포함된다.

다양한 효모 숙주로의 형질 전환을 위하여 염색체 외 레플리콘(extrachromosomal replicon) 또는 통합 벡터를 포함하는 발현 벡터 및 형질전환 벡터들이 개발되었다. 예를 들어, S. 세레비시에(문헌 [Sikorski et al., GENETICS (1998) 112: 19], [Ito et al., J. BACTERIOL. (1983) 153: 163], [Hinnen et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1978) 75: 1929] 참조), C. 알비칸스(문헌 [Kurtz et al., MOL. CELL. BIOL. (1986) 6: 142] 참조), C. 말토사(문헌 [Kunze et al., J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25: 141] 참조), H. 폴리모르파(문헌 [Gleeson et al., J. GEN. MICROBIOL. (1986) 132: 3459], [Roggenkamp et al., MOL. GENETICS AND GENOMICS (1986) 202: 302] 참조)], K. 프라길리스(문헌 [Das et al., J. BACTERIOL. (1984) 158: 1165] 참조), K. 락티스(문헌 [De Louvencourt et al., J. BACTERIOL. (1983) 154: 737], [Van den Berg et al., BIOTECHNOLOGY(NY) (1990) 8: 135] 참조), P. 귈러리몬디(문헌 [Kunze et al., J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25: 141] 참조), P. 파스토리스 (미국 특허 제 5,324,639호, 제 4,929,555호 및 제 4,837,148호, 문헌 [Cregg et al., MOL. CELL. BIOL. (1985) 5: 3376] 참조), 스키조사카로마이세스 폼브(Schizosaccharomyces pombe)(문헌 [Beach et al., NATURE (1982) 300: 706] 참조), Y. 리폴리티카(lipolytica), A. 니둘란스(nidulans)(문헌 [Ballance et al., BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN. (1983) 112: 284-89], [Tilburn et al., GENE (1983) 26: 205-221] 및 [Yelton et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1984) 81: 1470-74] 참조); A. 나이거(niger)(문헌 [Kelly and Hynes, EMBO J. (1985) 4: 475-479] 참조); T. 레시아(reesia)(EP 0 244 234 참조); 그리고 섬사상 진균류, 예를 들어 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium)(WO 91/00357 참조)(상기 각각의 문헌은 본 명세서에 참고 문헌으로 포함됨)에 대하여 발현 벡터들이 개발되었다.

효모 벡터에 대한 조절 서열은 당업자에게 공지되어 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 알콜 디히드로게나제(ADH)(EP 0 284 044 참조); 에놀라아제; 글루코키나아제; 글루코스-6-포스페이트 아이소머라제; 글리세르알데히드-3-포스페이트-디히드로게나제(GAP 또는 GAPDH); 헥소키나아제; 포스포프럭토키나아제; 3-포스포글리세레이트 뮤타아제; 및 피루베이트 키나아제(PyK)(EP 0 329 203 참조)와 같은 유전자의 프로모터 영역을 포함한다. 또한, 산 포스파타아제를 코딩하는 효모 PH05 유전자도 유용한 프로모터 서열을 제공할 수 있다(문헌 [Miyanohara et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1983) 80: 1] 참조). 기타 효모 숙주와 함께 적절히 사용될 수 있는 프로모터 서열로서는, 3-포스포글리세레이트 키나아제(문헌 [Hitzeman et al., J. BIOL. CHEM. (1980) 255: 2073] 참조) 및 다른 해당 효소, 예컨대 피루베이트 디카르복실라아제, 트리오스포스페이트 아이소머라제 및 포스포글루코스 아이소머라제(문헌 [Holland et al., BIOCHEMISTRY (1978) 17: 4900], [Hess et al., J. ADV. ENZYME REG. (1969) 7: 149] 참조)에 대한 프로모터를 포함할 수 있다. 전사가 성장 조건에 의해 조절되는 추가적인 장점을 갖는 유도성 효모 프로모터로서는, 알콜 디히드로게나제 2; 이소시토크롬 C; 산 포스파타아제; 메탈로티오네인(metallothionein); 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나아제; 질소 대사와 관련이 있는 분해성 효소; 및 말토스와 갈락토스 이용을 담당하는 효소에 대한 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 효모 발현에 사용하기 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 0 073 657에 추가로 기재되어 있다.

효모 인핸서(enhancer)도 효모 프로모터와 함께 사용할 수 있다. 또한, 합성 프로모터도 효모 프로모터로서 기능할 수 있다. 예를 들어, 효모 프로모터의 상류부 활성화 서열(UAS)은 다른 효모 프로모터의 전사 활성화 영역과 결합하여 합성된 혼성 프로모터를 생성할 수 있다. 이러한 혼성 프로모터의 예로서는 GAP 전사 활성화 영역에 결합된 ADH 조절 서열을 포함한다. 본 명세서에 참고 문헌으로 포함되는 미국 특허 제 4,880,734호 및 제 4,876,197호를 참조할 수 있다. 혼성 프로모터의 다른 예로서는 해당 효소 유전자의 전사 활성화 영역, 예컨대 GAP 또는 PyK와 조합된 ADH2, GAL4, GAL10 또는 PH05 유전자의 조절 서열로 이루어진 프로모터를 포함한다. 이에 대해서는 EP 0 164 556을 참조할 수 있다. 게다가, 효모 프로모터는 효모 RNA 중합효소에 결합하여 전사를 개시할 수 있는 능력을 가진, 효모가 아닌 것으로부터 유래한 천연 발생 프로모터를 포함할 수 있다.

효모 발현 벡터의 일부를 포함할 수 있는 다른 조절 요소는 예를 들어, GAPDH 또는 에놀라아제 유전자의 종결자를 포함한다(문헌 [Holland et al., J. BIOL. CHEM. (1981) 256: 1385] 참조). 또한, 2μ 플라스미드 기원의 복제 원점은 효모에 적합하다. 효모에 사용하기 적합한 선택 유전자로는 효모 플라스미드에 존재하는 trp1 유전자가 있다. 이에 대해서는, 문헌 [Tschumper et al., GENE (1980) 10: 157], [Kingsman et al., GENE (1979) 7: 141]을 참조할 수 있다. 이러한 trp1 유전자는 트립토판에서 성장할 수 있는 능력이 결여된 효모의 돌연변이체 균주에 대한 선별 마커를 제공한다. 이와 유사하게, Leu2가 결핍된 효모 균주(ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 갖는 공지된 플라스미드에 의해 보충된다.

외인성 DNA를 효모 숙주에 도입시키는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나, 스페로플라스트(spheroplast)의 형질 전환 또는 알칼리 양이온으로 처리된 온전한 효모 숙주 세포의 형질 전환을 포함한다. 예를 들어, 효모의 형질 전환은 문헌 [Hsiao et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1979) 76: 3829] 및 [Van Solingen et al., J. BACT. (1977) 130: 946]에 기재된 방법에 따라 수행될 수 있다. 그러나, 핵 주사, 전기천공법 또는 원형질체 융합과 같은 방법에 의해 DNA를 세포에 도입시키는 기타의 방법도 일반적으로 문헌 [SAMBROOK ET AL., MOLECULAR CLONING: A LAB. MANUAL (2001)]에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. 이후, 효모 숙주 세포는 당업자에게 공지된 표준 기법들을 사용하여 배양할 수 있다.

효모 숙주 세포에서 이종성 단백질을 발현시키는 다른 방법들이 당업자에게 공지되어 있다. 일반적으로, 미국 특허 공보 제20020055169호, 미국 특허 제6,361,969호, 제6,312,923호, 제6,183,985호, 제6,083,723호, 제6,017,731호, 제5,674,706호, 제5,629,203호, 제5,602,034호 및 제5,089,398호; 재심사된 미국 특허 RE37,343 및 RE35,749; PCT 공개 특허 출원 WO 99/07862; WO 98/37208; 및 WO 98/26080; 유럽 특허 출원 EP 0 946 736; EP 0 732 403; EP 0 480 480; WO 90/10277; EP 0 340 986; EP 0 329 203; EP 0 324 274; 및 EP 0 164 556을 참조할 수 있다. 또한, 각각 본 명세서에 참고 문헌으로 포함되는 문헌 [Gellissen et al., ANTONIE VAN LEEUWENHOEK (1992) 62(1-2): 79-93], [Romanos et al., YEAST (1992) 8(6): 423-488], [Goeddel, METHODS IN ENZYMOLOGY (1990) 185: 3-7]을 참조할 수 있다.

효모 숙주 균주는 당업자에게 공지되어 있는 표준 공급물 배치 발효 방법을 사용하여 증폭 단계 동안 발효기에서 성장할 수 있다. 발효 방법은 특정 효모 숙주의 탄소 이용 경로 또는 발현 조절 방식에서의 차이를 고려하여 조정할 수 있다. 예를 들어, 사카로마이세스 효모 숙주의 발효는 단일 글루코스 공급물, 복합 질소 공급원(예를 들어, 카세인 가수분해물) 및 복합 비타민 보충물을 필요로 할 수 있다. 이와는 대조적으로, 메탄영양 효모 P. 파스토리스는 글리세롤, 메탄올 및 미량의 무기질 공급물을 필요로 할 수 있지만, 최적의 성장과 발현을 위해서는 단순히 암모늄(질소) 염만을 필요로 할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 참고 문헌으로 포함되는 미국 특허 제5,324,639호, 문헌 [Elliott et al., J. PROTEIN CHEM. (1990) 9: 95] 및 문헌 [Fieschko et al., BIOTECH. BIOENG. (1987) 29: 1113]을 참조할 수 있다.

그러나, 이러한 발효 방법은 사용되는 효모 숙주 균주와는 독립적으로 특정한 공통 특성을 가질 수 있다. 예를 들어, 통상 성장 제한 영양분인 탄소를 증폭 기간 동안 발효기에 첨가하여 최대 성장을 유발시킬 수 있다. 또한, 발효 방법은 일반적으로 적절한 양의 탄소, 질소, 기본 염, 인 및 다른 부영양분(비타민, 미량의 무기질 및 염 등)을 함유하도록 고안된 발효 배지를 사용한다. 피치아를 사용하는데 적합한 발효 배지의 예들은 본 명세서에 참고 문헌으로 포함되는 미국 특허 제5,324,639호 및 제5,231,178호에 기술되어 있다.

바큘로바이러스 ( Baculovirus )-감염 곤충 세포 "곤충 숙주" 또는 "곤충 숙주 세포"라는 용어는 재조합 벡터 또는 다른 전이 DNA에 대한 수용자로서 사용될 수 있거나 또는 사용된 곤충을 지칭한다. 이 용어는 형질 감염된 본래의 곤충 숙주 세포의 후손을 포함한다. 단일 모 세포 후대의 자손은 우연한 돌연변이의 발생 또는 의도적인 돌연변이 유발로 인하여 본래의 모체에 비하여 그 형태 또는 그 유전체, 또는 총체적 DNA의 보체가 완전하게 동일하지 않을 수 있다. 인슐린 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드가 존재하는 것과 같은 유의한 특징으로 인해 모체와 충분히 유사한 모 세포 후손은 이러한 상기 정의가 말하는 후손에 포함된다. 인슐린 폴리펩티드의 바큘로바이러스 발현, rDNA 기법, 폴리펩티드 또는 이의 전구체의 사용은 본 발명에서 유용하며, 본 발명의 실시 양태로서 세균, 효모 또는 포유류 세포에서의 인슐린, 변형된 인슐린, 인슐린 폴리펩티드 또는 인슐린 유사체의 생합성을 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시 양태로서, 대장균 또는 효모에서 수행한 생합성을 포함한다. 포유류 세포 및 유전자 이식된 동물에 있어서 생합성의 예는 문헌 [Hakola, K., Molecular and Cellular Endocrinology, 127:59-69, (1997)]에 기술되어 있다.

인슐린 폴리펩티드의 발현에 적합한 곤충 세포의 선택에 대해서는 당업자에게 공지되어 있다. 수개의 곤충 종들이 당업계에서는 잘 기술되어 있으며, 에데스 에깁티(Aedes aegypti), 봄빅스 모리(Bombyx mori), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster), 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 및 트리초플루시아 니(Trichoplusia ni)를 비롯한 것들이 시판되고 있다. 발현을 위해 곤충 숙주를 선택함에 있어서, 적합한 숙주로서는 특히, 우수한 분비 용량, 낮은 단백질 분해 활성 및 전체적인 강인성을 가지는 것으로 확인된 것들을 포함할 수 있다. 곤충은 미국 캘리포니아 대학(미국 캘리포니아주 버클리 소재) 생체물리학 및 의료 물리학부의 효모 유전자 저장 센터 및 미국 미생물 보존센터("ATCC")(미국 버지니아주 만나사스 소재)를 비롯한 다양한 공급업체로부터 통상 이용가능하다.

일반적으로, 바큘로바이러스로 감염된 곤충 발현 시스템의 성분은 전이 벡터(보통 바큘로바이러스 유전체의 단편과 발현될 이종성 유전자의 삽입을 위한 적당한 제한 부위 양자 모두를 포함하는 세균 플라스미드임); 상기 전이 벡터 중에서 바큘로바이러스 특이적 단편에 대하여 동종성인 서열을 갖는 야생형 바큘로바이러스(이는 바큘로바이러스 유전체 내로 이종성 유전자의 동종성 재조합을 가능케 함); 및 적절한 곤충 숙주 세포와 성장 배지를 포함한다. 벡터를 구축하고, 세포를 형질 감염시키고, 플라크(plaque)를 선별하고, 배양물 중에서 세포를 성장시키는 등의 작업에 사용되는 물질, 방법 및 기법은 당업계에 공지되어 있으며, 이러한 기술들을 기술하고 있는 매뉴얼도 입수가능하다.

이종성 유전자를 전이 벡터에 삽입시킨 후, 벡터와 야생형 바이러스 유전체를 곤충 숙주 세포로 형질 감염시키면, 이곳에서 벡터와 바이러스 유전체가 재조합하게 된다. 패키징된 재조합 바이러스가 발현되면, 재조합 플라크를 동정하여 정제한다. 바큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템을 위한 재료와 방법들은 예를 들어, 인비트로겐 코퍼레이션(캘리포니아주 칼스버드 소재)이 만든 키트가 시판되고 있다. 이러한 기법들은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있고, 본 명세서에 참고 문헌으로 포함되는 문헌 [SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN No. 1555 (1987)]에 모두 기재되어 있다. 또한, 문헌 [RICHARDSON, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY: BACULOVIRUS EXPRESSION PROTOCOLS (1995)], [AUSUBEL ET AL., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 16.9-16.11 (1994)], [KING AND POSSEE, BACULOVIRUS SYSTEM: A LABORATORY GUIDE (1992)] 및 [O'REILLY ET AL., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992)]을 참조할 수 있다.

실제로, 바큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템을 이용한 다양한 이종성 단백질을 생산하는 것은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 본 명세서에 참고 문헌으로 포함되는 미국 특허 제6,368,825호, 제6,342,216호, 제6,338,846호, 제6,261,805호, 제6,245,528호, 제6,225,060호, 제6,183,987호, 제6,168,932호, 제6,126,944호, 제6,096,304호, 제6,013,433호, 제5,965,393호, 제5,939,285호, 제5,891,676호, 제5,871,986호, 제5,861,279호, 제5,858,368호, 제5,843,733호, 제5,762,939호, 제5,753,220호, 제5,605,827호, 제5,583,023호, 제5,571,709호, 제5,516,657호, 제5,290,686호; WO 02/06305, WO 01/90390, WO 01/27301, WO 01/05956, WO 00/55345, WO 00/20032 WO 99/51721, WO 99/45130, WO 99/31257, WO 99/10515, WO 99/09193, WO 97/26332, WO 96/29400, WO 96/25496, WO 96/06161, WO 95/20672, WO 93/03173, WO 92/16619, WO 92/02628, WO 92/01801, WO 90/14428, WO 90/10078, WO 90/02566, WO 90/02186, WO 90/01556, WO 89/01038, WO 89/01037, WO 88/07082를 참조할 수 있다.

바큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템에 유용한 벡터는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 헬퍼에 의존하지 않는 바이러스 발현 벡터인 바큘로바이러스 오토그라파칼리포르니카(Autographacalifornica) 핵 폴리헤드로시스(polyhedrosis) 바이러스(AcNPV)로부터 유래한 곤충 발현 벡터 및 전이 벡터를 포함한다. 이러한 시스템으로부터 유도된 바이러스 발현 벡터는 통상 강한 바이러스 다각체 유전자 프로모터를 사용하여 이종 유전자 발현을 유발시킨다. 일반적으로, 문헌 [O'Reilly ET AL., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992)]을 참조할 수 있다.

외래 유전자를 바큘로바이러스 유전체에 삽입하기 이전에, 통상 프로모터, 리더(leader)(필요한 경우), 해당 코딩 서열 및 전사 종결 서열을 비롯한 상기 성분들을 중간 전환 구축물(intermediate transplacement construct)(전이 벡터)에 조립시킨다. 중간 전환 구축물은 세균과 같은 숙주에서 안정되게 유지될 수 있는 레플리콘, 예컨대 염색체 외 성분(예를 들어, 플라스미드)에서 흔히 유지된다. 레플리콘은 복제 시스템을 보유하기 때문에, 이를 클로닝과 증폭을 위해 적합한 숙주에서 유지되도록 한다. 보다 구체적으로, 플라스미드는 다각체 폴리아데닐화 신호(문헌 [Miller et al., ANN. REV. MICROBIOL. (1988) 42: 177] 참조) 및 원핵 세포성 암피실린 저항성(amp) 유전자, 그리고 대장균 중에서의 선택과 증식을 위한 복제 원점을 포함할 수 있다.

외래 유전자를 AcNPV로 도입시키는데 통상 사용되는 전이 벡터는 pAc373이다. 당업자에게 공지된 많은 다른 벡터들, 예를 들어, 다각체 출발 코돈을 ATG에서 ATT로 변화시키고, ATT의 하류부에 BamHI 클로닝 부위 32 염기쌍을 도입시키는 pVL985를 비롯한 여러 가지 벡터들이 고안되었다. 문헌 [Luckow and Summers, VIROLOGY 170:31 (1989)]을 참조할 수 있다. 시판되고 있는 다른 벡터로서는 예를 들어, PBlueBac4.5/V5-His, pBlueBacHis2, pMelBac, pBlueBac4.5(인비트로겐 코퍼레이션, 캘리포니아주 칼스버드 소재)를 포함한다.

이종성 유전자의 삽입 후, 전이 벡터와 야생형 바큘로바이러스 유전체는 곤충 세포 숙주 내로 함께 형질 감염된다. 이종성 DNA를 바큘로바이러스 바이러스 내의 원하는 부위로 도입시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 이에 대해서는, 문헌 [SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN No. 1555 (1987)], [Smith et al., MOL. CELL. BIOL. (1983) 3: 2156], [Luckow and Summers, VIROLOGY (1989) 17: 31]을 참조할 수 있다. 예를 들어, 동종성 이중 교차 재조합에 의해 다각체 유전자와 유전자 내로 삽입이 이루어질 수 있고, 또한 원하는 바큘로바이러스 유전자 내로 조작된 제한 효소 부위로도 삽입이 이루어질 수 있다. 문헌 [Miller et al., BIOESSAYS (1989) 11(4): 91]을 참조할 수 있다.

형질 감염은 전기천공법에 의해 수행될 수 있다. 문헌 [TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995)], [Mann and King, J. GEN. VIROL. (1989) 70: 3501]을 참조할 수 있다. 다르게는, 재조합 발현 벡터와 바큘로바이러스를 사용하여 곤충 세포를 형질감염시키는데 리포좀을 사용할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Liebman et al., BIOTECHNIQUES (1999) 26(1): 36], [Graves et al., BIOCHEMISTRY (1998) 37: 6050], [Nomura et al., J. BIOL. CHEM. (1998) 273(22): 13570], [Schmidt et al., PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1998) 12: 323], [Siffert et al., NATURE GENETICS (1998) 18: 45], [TILICNS ET AL., CELL BIOLOGY: A LABORATORY HANDBOOK 145-154 (1998)], [Cai et al., PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1997) 10: 263], [Dolphin et al., NATURE GENETICS (1997) 17: 491], [Kost et al., GENE (1997) 190: 139], [Jakobsson et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271: 22203], [Rowles et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271(37): 22376], [Reversey et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271(39): 23607-10], [Stanley et al., J. BIOL. CHEM. (1995) 270: 4121], [Sisk et al., J. VIROL. (1994) 68(2): 766] 및 [Peng et al., BIOTECHNIQUES (1993) 14(2); 274]을 참조할 수 있다. 시판되고 있는 리포좀으로는 예를 들어, 셀펙틴(Cellfectin®) 및 리포펙틴(Lipofectin®)(인비트로겐 코퍼레이션, 캘리포니아주 칼스버드 소재)을 포함한다. 또한, 인산칼슘 형질 감염도 사용할 수 있다. 문헌 [TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995)], [Kitts, NAR (1990) 18(19): 5667] 및 [Mann and King, J. GEN. VIROL. (1989) 70: 3501]을 참조할 수 있다.

바큘로바이러스 발현 벡터는 통상 바큘로바이러스 프로모터를 포함한다. 바큘로바이러스 프로모터는 바큘로바이러스 RNA 중합효소를 결합시킬 수 있으며, mRNA 내로 코딩 서열(예를 들어, 구조 유전자)의 하류부(3') 전사를 개시할 수 있는 임의의 DNA 서열이다. 프로모터는 통상 코딩 서열의 5' 말단에 근접하게 위치하는 전사 개시 영역을 가지게 된다. 이러한 전사 개시 영역은 보통 RNA 중합효소 결합 부위 및 전사 개시 부위를 포함한다. 또한, 바큘로바이러스 프로모터는 보통 구조 유전자와 원거리에 위치한(존재하는 경우) 인핸서라 불리는 제2 도메인을 가질 수도 있다. 또한, 발현은 조절될 수 있거나 또는 필수적일 수 있다.

감염 주기의 후기에서 다량으로 전사되는 구조 유전자는 특히 유용한 프로모터 서열을 제공한다. 이러한 예로서는 바이러스 다각체 단백질을 코딩하는 유전자(문헌 [FRIESEN ET AL., The Regulation of Baculovirus Gene Expression in THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES (1986)]; EP 0 127 839와 0 155 476 참조) 및 p10 단백질을 코딩하는 유전자(문헌 [Vlak et al., J. GEN. VIROL. (1988) 69: 765] 참조)로부터 유도된 서열을 포함한다.

새로 형성된 바큘로바이러스 발현 벡터는 감염성 재조합 바큘로바이러스에 패키징시키고, 이후 성장한 플라크는 당업자에게 공지되어 있는 기법에 의해 정제될 수 있다. 문헌 [Miller et al., BIOESSAYS (1989) 11(4): 91], [SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN No. 1555 (1987)]을 참조할 수 있다.

재조합 바큘로바이러스 발현 벡터는 수개의 곤충 세포 내로 감염시키기 위해 개발되었다. 예를 들어, 재조합 바큘로바이러스는, 특히, 에데스 에깁티(ATCC 번호 CCL-125), 봄빅스 모리(ATCC 번호 CRL-8910), 드로소필라 멜라노가스터(ATCC 번호 1963), 스포돕테라 프루기페르다 및 트리초플루시아 니에 대하여 개발되었다. 문헌 [Wright, NATURE (1986) 321: 718], [Carbonell et al., J. VIROL. (1985) 56: 153], [Smith et al., MOL. CELL. BIOL. (1983) 3: 2156]을 참조할 수 있다. 일반적으로는, 문헌 [Fraser et al., IN VITRO CELL. DEV. BIOL. (1989) 25: 225]을 참조할 수 있다. 보다 구체적으로, 바큘로바이러스 발현 벡터 시스템에 사용되는 세포주는 이에 제한하지는 않지만, 흔히 Sf9(스포돕테라 프루기페르다)(ATCC 번호 CRL-1711), Sf21(스포돕테라 프루기페르다)(인비트로겐 코퍼레이션, 분류 번호 11497-013(캘리포니아주 칼스버드 소재)), Tri-368 (트리초풀시아 니(Trichopulsia ni)) 및 하이-파이브(High-Five^TM) BTI-TN-5B1-4 (트리초풀시아 니)를 포함한다.

바큘로바이러스/발현에 있어서 이종성 폴리펩티드의 직접 발현 및 융합 발현 양자 모두를 위한 세포와 배양 배지가 시판되고 있으며, 세포 배양 기법은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다.

대장균, 슈도모나스 종 및 기타 원핵 생물 세균 발현 기법은 당업계에 공지되어 있다. 세균 숙주에 사용하기 위한 매우 다양한 벡터들도 입수가능하다. 벡터는 단일 복제 또는 높거나 낮은 다중복제 벡터일 수 있다. 벡터는 클로닝 및/또는 발현을 위해 쓰일 수 있다. 벡터와 관련된 충분한 문헌들, 다양한 벡터들의 상업적 이용가능성, 그리고 심지어는 벡터 및 이들의 제한 지도와 특성들을 기술하고 있는 매뉴얼이 존재한다는 점을 고려할 때, 본 명세서에서 이에 대한 광범위한 논의는 필요 없을 것으로 생각된다. 잘 알려진 바와 같이, 벡터는 통상적으로 선별을 가능케 하는 마커를 포함하는데, 여기서 마커는 세포 독성제에 대한 저항성, 독립영양성 또는 면역성을 제공할 수 있다. 다양한 특징들을 제공하는 다수의 마커들이 존재하는 경우가 많다.

세균 프로모터는 세균 RNA 중합효소를 결합시킬 수 있으며, mRNA 내로 코딩 서열(예를 들어, 구조 유전자)의 하류부(3') 전사를 개시할 수 있는 임의의 DNA 서열이다. 프로모터는 통상 코딩 서열의 5' 말단에 근접하게 위치하는 전사 개시 영역을 가지게 된다. 이러한 전사 개시 영역은 보통 RNA 중합효소 결합 부위 및 전사 개시 부위를 포함한다. 또한, 세균 프로모터는 RNA 합성이 시작되는 인접한 RNA 중합효소 결합 부위와 중첩될 수 있는 작동자(operator)라 불리는 제2 도메인을 가질 수도 있다. 유전자 억제제 단백질이 작동자에 결합하여 특정 유전자의 전사를 억제하기 때문에, 작동자는 음성적으로 조절된 (유도성) 전사를 야기하게 된다. 구조적 발현은 음성적 조절 성분, 예컨대 작동자의 부재 하에서 발생할 수 있다. 또한, 양성적 조절은 통상 RNA 중합효소 결합 서열에 근접(5')한(존재하는 경우) 유전자 활성제 단백질 결합 서열에 의해 수행될 수 있다. 유전자 활성제 단백질의 예로서는 대장균에서 lac 오페론의 전사 개시를 도와주는 이화 생성물 활성제 단백질(CAP)을 들 수 있다(문헌 [Raibaud et al., ANNU. REV. GENET. (1984) 18: 173] 참조). 따라서, 조절된 발현은 양성 또는 음성적으로 조절되는 것이므로 전사를 강화시키거나 또는 감소시킨다.

대사 경로 효소를 코딩하는 서열은 특히 유용한 프로모터 서열을 제공한다. 그 예로서는 당 대사 효소, 예컨대 갈락토스, 락토스(lac)(문헌 [Chang et al., NATURE (1977) 198: 1056] 참조) 및 말토스로부터 유도된 프로모터 서열을 포함한다. 추가적인 예로서는 생합성 효소, 예컨대 트립토판(trp)으로부터 유도된 프로모터 서열을 포함한다(본 명세서에 참고 문헌으로 포함되는 문헌 [Goeddel et al., NUC. ACIDS RES. (1980) 8: 4057], [Yelverton et al., NUCL. ACIDS RES. (1981) 9: 731], 미국 특허 제 4,738,921호, EP 공보 036 776 및 121 775 참조). 또한, β-갈락토시다아제(bla) 프로모터 시스템(본 명세서에 참고 문헌으로 포함되는 문헌 [Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes." In Interferon 3 (Ed. I. Gresser)] 참조), 박테리오파지 λ PL 프로모터 시스템(본 명세서에 참고 문헌으로 포함되는 문헌 [Shimatake et al., NATURE (1981) 292: 128] 참조) 및 T5 프로모터 시스템(본 명세서에 참고 문헌으로 포함되는 미국 특허 제 4,689,406호 참조)도 유용한 프로모터 서열을 제공한다. 본 발명의 바람직한 방법은 강성 프로모터, 예컨대 T7 프로모터를 사용하여 인슐린 폴리펩티드를 높은 수준으로 유도한다. 이러한 벡터의 예들은 당업계에 공지되어 있으며, 노바겐(Novagen)의 pET29 계열과, 본 명세서에 참고 문헌으로 포함되는 WO 99/05297에 기술되어 있는 pPOP 벡터를 포함한다. 이러한 발현 시스템은 숙주 세포의 생존 능력 또는 성장 매개변수를 약화시키지 않으면서 숙주에서 인슐린 폴리펩티드를 높은 수준으로 생산한다. pET19(노바겐)은 당업계에 공지된 또 다른 벡터이다.

또한, 자연계에서 발생하지 않는 합성 프로모터도 세균 프로모터로서 기능을 한다. 예를 들어, 하나의 세균 또는 박테리오파지 프로모터의 전사 활성화 서열을 또 다른 세균 또는 박테리오파지 프로모터의 오페론 서열과 결합시켜 합성한 혼성 프로모터를 생성할 수 있다(본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 제 4,551,433호 참조). 예를 들어, tac 프로모터는 trp 프로모터와 lac 억제제에 의해 조절되는 lac 오페론 서열 양자 모두로 이루어지는 혼성 trp-lac 프로모터이다(문헌 [Amann et al., GENE (1983) 25: 167], [de Boer et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. (1983) 80: 21] 참조). 더욱이, 세균 프로모터는 세균 RNA 중합효소와 결합하여 전사를 개시할 수 있는 능력을 갖는 비세균 기원의 천연 발생 프로모터를 포함할 수 있다. 또한, 비세균 기원의 천연 발생 프로모터는 양립가능한 RNA 중합효소와 커플링되어 원핵 생물에서 일부 유전자를 높은 수준으로 발현시킬 수 있다. 박테리오파지 T7 RNA 중합효소/프로모터 시스템은 커플링된 프로모터 시스템의 일례이다(문헌 [Studier et al., J. MOL. BIOL. (1986) 189: 113], [Tabor et al., Proc Natl. Acad. Sci. (1985) 82: 1074] 참조). 또한, 혼성 프로모터도 박테리오파지 프로모터 및 대장균 작동자 영역으로 이루어질 수 있다(유럽 특허 공보 제267 851호 참조).

또한, 프로모터 서열로 기능하는 것 이외에도, 유효한 리보좀 결합 부위는 원핵 생물에서 외래 유전자의 발현에도 유용하다. 대장균에 있어서, 리보좀 결합 부위는 소위 샤인-달가노(Shine-Dalgarno; SD) 서열로 지칭되며, 개시 코돈(ATG) 및 개시 코돈의 3-11번 뉴클레오티드 상류부에 위치한 길이가 3-9개의 뉴클레오티드인 서열을 포함한다(문헌 [Shine et al., NATURE (1975) 254: 34] 참조). 이러한 SD 서열은 대장균 16S rRNA의 3' 말단과 SD 서열 사이의 염기 짝지움에 의해 mRNA의 리보좀에 대한 결합을 촉진시키는 것으로 보인다(문헌 [Steitz et al., "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA", In Biological Regulation and Development: Gene Expression (Ed. R.F. Goldberger, 1979)] 참조). 약한 리보좀 결합 부위를 사용하여 진핵 세포성 유전자 및 원핵 세포성 유전자를 발현시키는 것에 대해서는 문헌 [Sambrook et al., "Expression of cloned genes in Escherichia coli", Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989]을 참조할 수 있다.

"세균 숙주" 또는 "세균 숙주 세포"라는 용어는 재조합 벡터 또는 다른 전이 DNA에 대한 수용자로서 사용될 수 있거나 또는 사용된 세균을 지칭한다. 이 용어는 형질 감염된 본래의 세균 숙주 세포의 후대의 자손을 포함한다. 단일 모 세포 후대의 자손은 우연한 돌연변이의 발생 또는 의도적인 돌연변이 유발로 인하여 본래의 모체에 비하여 그 형태 또는 그 유전체, 또는 총체적 DNA의 보체가 완전하게 동일하지 않을 수 있다. 인슐린 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드가 존재하는 것과 같은 유의한 특징으로 인해 모체와 충분히 유사한 모 세포 후손은 이러한 상기 정의가 말하는 후손에 포함된다.

인슐린 폴리펩티드의 발현을 위한 적합한 숙주 세균의 선택은 당업계의 숙련자라면 누구나 할 수 있다. 발현용 세균 숙주의 선택에 있어서, 적절한 숙주는 특히, 우수한 내포체 형성 능력, 낮은 단백질 분해 활성 및 전체적인 강인성을 보유하는 것으로 밝혀진 것들을 포함할 수 있다. 세균 숙주는 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 미국 캘리포니아 대학(미국 캘리포니아주 버클리 소재) 생체물리학 및 의료 물리학부의 세균 유전자 저장 센터(Bacterial Genetic Stock Center) 및 미국 미생물 보존센터("ATCC")(미국 버지니아주 만나사스 소재)를 비롯한 다양한 공급업체로부터 통상 이용가능하다. 산업적/제약학적 발효는 K 균주(예를 들어, W3110)로부터 유도된 세균 또는 B 균주(예를 들어, BL21)로부터 유도된 세균을 일반적으로 사용한다. 이러한 균주들은 그들의 성장 매개변수가 널리 공지되어 있고 강인하기 때문에 특히 유용하다. 또한, 이러한 균주는 안정성 및 환경상의 이유로 상업상 중요한 비병원성이다. 적절한 대장균 숙주의 다른 예로서, 이에 제한되지는 않지만, BL21, DH10B 또는 이의 유도체의 균주를 포함한다. 본 발명의 방법의 또 다른 실시 양태에서, 대장균 숙주는 프로테아제 마이너스 균주, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, OMP- 및 LON- 이다. 숙주 세포 균주는 슈도모나스의 종, 예컨대 이에 한정되는 것은 아니나, 슈도모나스 플루오레센스, 슈도모나스 에어루기노사 및 슈도모나스 푸티다일 수 있다. 균주 MB101로 지정된 슈도모나스 플루오레센스 바이오바(fluorescens biovar) 1은 재조합 생산을 위해 유용한 것으로 알려져 있으며, 치료적 단백질 생산 공정용으로 이용가능하다. 슈도모나스 발현 시스템의 예로서는, 숙주 균주로서 다우 케미칼 캄파니(Dow Chemical Company)(미국 미시간주 미드랜드 소재, www.dow.com 상에서 이용가능)로부터 이용가능한 시스템을 포함한다.

일단 재조합 숙주 세포 균주를 확립(즉, 발현 구축물이 숙주 세포로 도입되고, 적절한 발현 구축물을 갖는 숙주 세포가 단리됨)한 후에는, 재조합 숙주 세포 균주를 인슐린 폴리펩티드 생산에 적합한 조건 하에서 배양한다. 당업자라면 명백히 알 수 있듯이, 재조합 숙주 세포 균주의 배양 방법은 사용되는 발현 구축물의 특성 및 숙주 세포의 동일성에 따라 좌우될 것이다. 재조합 숙주 균주는 통상 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 배양된다. 재조합 숙주 세포는 보통 흡수가능한 탄소, 질소 및 무기 염 공급원을 포함하며, 임의로는, 비타민, 아미노산, 성장 인자 및 당업계에 공지된 다른 단백질 배양 보충물을 함유하는 액체 배지 중에서 배양된다. 숙주 세포 배양용 액체 배지는 임의로 바람직하지 못한 미생물의 성장을 방지하는 항생제 또는 항진균제 및/또는 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포의 선택을 위한 항생제(이에 한정되지는 않음)를 비롯한 화합물을 포함할 수 있다.

재조합 숙주 세포는 배치 형식 또는 연속 형식으로 배양될 수 있으며, 배치 형식 또는 연속 형식으로 세포를 수확하거나(인슐린 폴리펩티드가 세포 내 축적되는 경우) 또는 배양 상청액을 수확한다. 원핵 숙주 세포에서 생산하는 경우, 배치 배양 및 세포 수확이 바람직하다.

본 발명의 인슐린 폴리펩티드는 보통 재조합 시스템에서 발현 후 정제된다. 인슐린 폴리펩티드는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 정제될 수 있다. 세균 숙주 세포에서 생산된 인슐린 폴리펩티드는 가용성이 불량하거나 또는 불용성(내포체의 형태의 경우)일 수 있다. 본 발명의 한 실시 양태에서, 아미노산 치환은 본 명세서에 개시된 방법뿐만 아니라 당업계에 공지되어 있는 방법들을 사용하여 재조합 생산된 단백질의 가용성을 증가시킬 목적으로 선택된 인슐린 폴리펩티드 중에서 용이하게 행해질 수 있다. 불용성 단백질의 경우, 단백질은 원심분리에 의해 숙주 세포 용해물로부터 수집될 수 있고, 이후 세포의 균질화를 더 수행할 수 있다. 가용성이 불량한 단백질의 경우, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 폴리에틸렌 이민(PEI)을 비롯한 화합물을 첨가하여 부분적으로 가용성인 단백질의 침전을 유도할 수 있다. 이후, 침전된 단백질을 원심분리에 의해 손쉽게 수거할 수 있다. 재조합 숙주 세포를 당업자에게 공지되어 있는 다양한 방법을 사용하여 붕괴시키거나 또는 균질화하여, 세포 내부에서 내포체를 유리시킬 수 있다. 숙주 세포 붕괴 또는 균질화는 효소 처리에 의한 세포 붕괴, 초음파 처리, 다운스(dounce) 균질화 또는 고압 방출 붕괴(이에 한정되지는 않음)를 비롯하여 잘 알려진 기법들을 사용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 방법의 한 실시 양태에서, 고압 방출 기법을 사용하여 대장균 숙주 세포를 붕괴시킴으로써 인슐린 폴리펩티드의 내포체를 방출시킨다. 인슐린 폴리펩티드의 내포체를 취급하는 경우, 가용화, 기계적 전단 또는 단백질 분해와 같은 요인으로 인한 손실 없이 내포체의 수율을 최대화시키기 위해서는 반복에 대한 균질화 시간을 최소화하는 것이 유리할 수 있다.

이후, 당업계에 공지된 임의의 다수의 적절한 가용화제를 사용하여 불용성 또는 침전된 인슐린 폴리펩티드를 용해시킬 수 있다. 인슐린 폴리펩티드는 우레아 또는 염산 구아니딘으로 용해될 수 있다. 상기 가용화된 인슐린 폴리펩티드의 부피는 편리하게 다룰 수 있는 배치 크기를 사용하여 대량의 배치를 생산할 수 있도록 최소화되어야 한다. 이러한 인자는 재조합 숙주가 수천 리터의 부피를 갖는 배치에서 성장할 수 있는 대규모 상업적 환경에서 중요할 수 있다. 또한, 대규모 상업적 환경에서 인슐린 폴리펩티드를 제조하는 경우, 특히나 인간을 위한 약학적 용도의 경우, 기계와 용기 또는 단백질 생성물 자체에 손상을 줄 수 있는 강력한 화학 물질은 가능하면 반드시 피해야 한다. 본 발명의 방법에서, 더욱 강력한 변성제인 염산 구아니딘 대신에 보다 순한 변성제인 우레아를 사용하여 인슐린 폴리펩티드 내포체를 가용화시킬 수 있다는 점이 밝혀졌다. 우레아의 사용은 인슐린 폴리펩티드 내포체를 유효하게 용해시키면서도, 인슐린 폴리펩티드를 제조하고 정제하는 공정에서 사용되는 스테인레스강 장비에 대한 손상 위험을 현저하게 감소시킨다.

가용성 인슐린 단백질의 경우, 인슐린은 세포질주변 공간 또는 배양 배지 내로 분비될 수 있다. 또한, 가용성 단백질은 숙주 세포의 세포질 내에 존재할 수 있다. 정제 단계를 수행하기 이전에 가용성 단백질을 농축시키는 것이 바람직할 수 있다. 당업자에게 공지된 표준 기법들을 사용하여, 예컨대 세포 용해물 또는 배양 배지의 가용성 인슐린을 농축시킬 수 있다. 또한, 당업자에게 공지된 표준 기법들을 사용하여 숙주 세포를 붕괴시켜서, 숙주 세포의 세포질 또는 세포질주변 공간으로부터 가용성 인슐린을 방출시킬 수 있다.

인슐린 폴리펩티드가 융합 단백질로서 생성되는 경우, 융합 서열을 제거할 수 있다. 융합 서열의 제거는 효소적 분해 또는 화학적 분해에 의해 수행될 수 있다. 융합 서열의 효소적 제거는 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 융합 서열의 제거를 위한 효소의 선택은 융합의 동일성에 의해 결정되게 되며, 반응 조건은 당업자에게 자명한 바와 같이 효소의 선택에 의해 특정될 것이다. 화학적 분해는 당업자에게 공지된 시약, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 브롬화 시아노겐, TEV 프로테아제 및 기타 시약들을 이용하여 수행될 수 있다. 분해된 인슐린 폴리펩티드는 당업자에게 공지된 방법에 의해 분해된 융합 서열로부터 정제된다. 당업자에게 자명하듯이, 이러한 방법은 융합 서열과 인슐린 폴리펩티드의 동일성과 특성에 의해 결정되게 된다. 정제 방법은 이에 제한되지는 않지만, 크기 배제 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 또는 투석 또는 이들 방법을 임의로 조합한 방법을 포함할 수 있다.

또한, 인슐린 폴리펩티드를 정제하여 단백질 용액으로부터 DNA를 제거할 수 있다. DNA는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법, 예컨대 침전 또는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 제거될 수 있으나, 핵산 침전제, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 프로타민 설페이트를 사용한 침전에 의해 제거될 수 있다. 인슐린 폴리펩티드는 잘 알려진 표준 방법, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 원심분리 또는 여과를 사용하여 침전된 DNA로부터 분리될 수 있다. 숙주 핵산 분자의 제거는 인슐린 폴리펩티드가 인간을 치료하는 데 사용되는 환경에서 중요한 한 인자이며, 본 발명의 방법은 숙주 세포 DNA를 약학적으로 허용가능한 수준으로 감소시킨다.

또한, 소규모 발효 또는 대규모 발효을 위한 방법들, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 발효기, 진탕 플라스크, 유동층 생물반응기, 중공 섬유 생물반응기, 롤러 병 배양 시스템 및 교반 탱크 생물반응기 시스템을 단백질 발현에 사용할 수 있다. 이러한 방법들은 각각 배치식, 공급-배치식 또는 연속식 모드 공정으로 수행될 수 있다.

본 발명의 인간 인슐린 폴리펩티드는 일반적으로 당업계의 표준 방법을 사용하여 회수될 수 있다. 예를 들어, 배양 배지 또는 세포 용해물은 원심분리하거나 또는 여과하여 세포 잔해물이 제거될 수 있다. 상청액은 원하는 부피로 농축 또는 희석시키거나, 또는 적절한 완충액 내로 정용여과시켜 추가의 정제를 위한 제제를 컨디셔닝할 수 있다. 본 발명의 인슐린 폴리펩티드의 추가 정제는 본연 그대로의 형태로부터 탈아미드화 및 단축된 형태의 인슐린 폴리펩티드 변이체를 분리하는 단계를 포함한다.

본 발명의 인슐린 폴리펩티드를 정제하는데 있어서 하기의 예시적인 절차들 중 임의의 절차를 사용할 수 있다: 친화성 크로마토그래피; 음이온 교환 또는 양이온 교환 크로마토그래피(DEAE 세파로스(SEPHAROSE)를 사용하는 것을 포함하며 이에 한정되지 않음); 실리카 상 크로마토그래피; 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC); 역상 HPLC; 겔 여과(세파덱스(SEPHADEX) G-75를 사용하는 것을 포함하며 이에 한정되지 않음); 소수성 상호작용 크로마토그래피; 크기 배제 크로마토그래피, 금속 킬레이트 크로마토그래피; 한외여과/정용여과; 에탄올 침전; 황산암모늄 침전; 크로마토포커싱(chromatofocusing); 치환 크로마토그래피; 전기영동 절차(분취 등전점 집초법(isoelectric focusing)을 포함하며 이에 한정되지 않음), 용해도 차이를 이용한 방법(differential solubility)(황산암모늄 침전을 포함하며 이에 한정되지 않음), SDS-PAGE 또는 추출.

본 발명의 단백질, 예컨대 이에 한정되지는 않지만, 비천연 아미노산을 포함하는 단백질, 비천연 아미노산을 포함하는 펩티드, 비천연 아미노산을 포함하는 단백질에 대한 항체, 비천연 아미노산을 포함하는 단백질에 대한 결합 파트너 등은 당업자에게 공지되어 사용되고 있는 표준 절차에 따라 부분적으로 또는 실질적으로 균질하게 정제될 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 당업자에게 공지된 임의 다수의 방법들, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 또는 염기 추출, 컬럼 크로마토그래피, 친화성 컬럼 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 렉틴 크로마토그래피, 겔 전기영동 등의 방법에 의해 회수되어 정제될 수 있다. 필요에 따라, 올바르게 접혀 성숙된 단백질을 제조하고자 하는 경우에는 단백질 리폴딩 단계를 사용할 수 있다. 높은 순도가 요구되는 최종 정제 단계에서는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 친화성 크로마토그래피 또는 기타 적절한 방법을 사용할 수 있다. 한 실시 양태에서, 비천연 아미노산에 대항하여 생성된 항체(또는 비천연 아미노산을 포함하는 단백질 또는 펩티드)는 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 하나 이상의 비천연 아미노산(들)을 포함하는 단백질 또는 펩티드의 친화성 기반 정제를 위한 시약으로 사용된다. 일단 폴리펩티드를 필요에 따라 부분적으로 또는 균질하게 정제하면, 상기 폴리펩티드는 광범위하게 다양한 용도, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 분석시험 성분, 치료제, 예방제, 진단제, 연구 시약 및/또는 항체 생산용 면역원으로 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드에 대항하여 생성된 항체는 통상적인 프로토콜을 사용하여 동물, 바람직하게는 비인간인 동물에게 폴리펩티드 또는 에피토프 함유 단편 또는 세포를 투여함으로써 수득될 수 있다. 당업자라면 공지된 다양한 기법들을 이용하여 항체를 생성시킬 수 있다. 또한, 유전자 이식된 마우스 또는 다른 유기체(다른 포유류 포함함)는 인간화 항체를 발현시키는데 사용될 수도 있다. 상기 기술된 항체들은 폴리펩티드를 발현하는 클론을 단리하거나 또는 동정하거나, 또는 폴리펩티드를 정제하는데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드에 대항하는 항체는 질병을 치료하는데에도 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 백신으로 사용될 수도 있다. 따라서, 추가의 양태에서, 본 발명은 예를 들어, 사이토카인을 생성하는 항체 면역 반응 및/또는 T 세포 또는 세포독성 T 세포를 비롯한 T 세포 면역 반응을 유발하기에 적절하도록 포유류를 본 발명의 폴리펩티드로 접종하는 단계를 포함하여, 질병(이러한 질병은 개체 내에 이미 발생했거나 혹은 존재하던지의 여부에 관계 없음)으로부터 상기 동물을 보호하기 위해 포유류에서 면역학적 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 또한, 포유류에서의 면역학적 반응은 폴리뉴클레오티드의 발현을 지시하는 벡터를 통해 본 발명의 폴리펩티드를 전달하는 단계 및 본 발명의 질병들로부터 상기 동물을 보호하기 위한 항체를 생성하는 이러한 면역학적 반응을 유도하기 위해서 생체 내에서 상기 폴레펩티드를 코딩하는 단계를 포함하는 방법에 의해 유도될 수도 있다. 벡터를 투여하는 하나의 방법으로서는 입자상으로 코팅하여 원하는 세포 내로 가속시키는 것을 들 수 있다. 이러한 핵산 벡터는 DNA, RNA, 변형된 핵산 또는 DNA/RNA 하이브리드를 포함할 수 있다. 백신으로 사용을 위해서는, 폴리펩티드 또는 핵산 벡터는 보통 백신 제형(조성물)로서 제공된다. 상기 제형은 적절한 담체를 더 포함할 수 있다. 폴리펩티드가 위장에서 붕괴될 수 있기 때문에, 비경구적으로 투여할 수 있다(예를 들어, 피하, 근육내, 정맥 내 또는 피부내 주사). 비경구 투여로 적절한 제형으로서는 항산화제, 완충제, 세균 발육 저지제 및 상기 제형을 수용자의 혈액과 등장성으로 해주는 용질을 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 주사액; 및 현탁제 또는 증점제를 포함할 수 있는 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 또한, 백신 제형은 제형의 면역원성을 강화하기 위하여 당업자에게 잘 알려진 아주반트 시스템을 포함할 수 있다. 투여량은 백신의 특이적 활성에 따라 좌우되는 것으로, 통상적인 실험에 의해 쉽게 결정될 수 있다.

대체 시스템에서의 발현

비재조합 숙주 세포, 돌연변이 유발된 숙주 세포 또는 무세포 시스템에 있어서 비천연 아미노산을 단백질에 도입시키는데 여러 가지 전략들이 사용되어 왔다. 또한, 이러한 시스템은 본 발명의 인슐린 폴리펩티드를 제조하는데에도 사용하기 적합하다. 반응성 측쇄, 예컨대 Lys, Cys 및 Tyr을 사용한 아미노산의 유도체화는 리신을 N²-아세틸-리신으로 전환시켰다. 또한, 화학적 합성은 비천연 아미노산을 도입하는 직접적인 방법도 제공한다. 펩티드 단편을 효소적으로 결찰시키는 것과 본래 화학적으로 결찰시키는 방법에 대해서 최근 개발이 이루어져서, 보다 큰 단백질을 제조하는 것이 가능해졌다. 예를 들어, 문헌 [P.E. Dawson and S.B.H. Kent, Annu. Rev . Biochem ., 69: 923 (2000)]을 참조할 수 있다. 화학적 펩티드 결찰 및 본래의 화학적 결찰에 대해서는 미국 특허 제6,184,344호, 미국 특허 공보 제2004/0138412호, 미국 특허 공보 제2003/0208046호, WO 02/098902 및 WO 03/042235(이들 문헌은 모두 본원에 참고로 포함됨)에 기술되어 있다. 원하는 비천연 아미노산에 의해 화학적으로 아실화된 억제제 tRNA가 단백질 생합성을 지원할 수 있는 시험관 내 추출물에 첨가되는 일반적인 시험관 내 생합성 방법을 사용하여, 100개가 넘는 비천연 아미노산을 거의 모든 크기의 다양한 단백질에 부위 특이적으로 도입시켰다. 예를 들어, 문헌 [V.W. Cornish, D. Mendel and P.G. Schultz, Angew. Chem . Int . Ed . Engl ., 1995, 34: 621 (1995)], [C.J. Noren, S.J. Anthony-Cahill, M.C. Griffith, P.G. Schultz, A general method for site -specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science 244: 182-188 (1989)] 및 [J.D. Bain, C.G. Glabe, T.A. Dix, A.R. Chamberlin, E.S. Diala, Biosynthetic site - specific incorporation of a non - natural amino acid into a polypeptide, J. Am . Chem . Soc. 111: 8013-8014 (1989)]을 참조할 수 있다. 광범위한 작용기들이 단백질 안정성, 단백질 접힘, 효소 기작 및 신호 전달의 연구를 위하여 단백질에 도입되었다.

본 명세서에 나타낸 기타 참고 문헌 이외에도, 다양한 정제/단백질 접힘 방법들이 당업자에게 공지되어 있는데, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 문헌 [R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982)], [Deutscher, Methods in Enzymology Vol.182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N.Y. (1990)], [Sandana, (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.], [Bollag et al., (1996) Protein Methods, 2nd Edition Wiley-Liss, NY], [Walker, (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ], [Harris and Angal, (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England], [Harris and Angal, Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England], [Scopes, (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3rd Edition Springer Verlag, NY], [Janson and Ryden, (1998) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, Second Edition Wiley-VCH, NY] 및 [Walker (1998), Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ] 및 상기 문헌들에 인용된 참고 문헌에 기재된 방법들이 당업계에 공지되어 있다.

진핵 숙주 세포 또는 비진핵 숙주 세포에서 비천연 아미노산을 사용하여 해당 단백질 또는 폴리펩티드를 생산하는 것의 한 장점은, 단백질 또는 폴리펩티드가 그들의 본래의 형태로 접힌다는 것이다. 그러나, 본 발명의 특정한 실시 양태에서, 당업자라면 합성, 발현 및/또는 정제 후에, 단백질 또는 펩티드가 관련 폴리펩티드의 원하는 형태와는 다른 형태를 가질 수 있다는 점을 알 수 있을 것이다. 본 발명의 한 측면에서, 발현된 단백질은 변성된 후, 복원될 수 있다. 이는 당업계에 공지된 방법, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 해당 단백질 또는 폴리펩티드에 샤페로닌을 첨가하는 방법에 의해, 단백질을 무질서 유발제(chaotropic agent), 예컨대 염산 구아니딘에 용해시키는 방법에 의해, 단백질 이황화 아이소머라제를 사용하는 방법 등을 이용하여 수행된다.

일반적으로, 발현된 폴리펩티드를 변성 및 환원시킨 후, 폴리펩티드를 바람직한 형태로 리폴딩시키는 것이 바람직한 경우가 있다. 예를 들어, 구아니딘, 우레아, DTT, DTE 및/또는 샤페로닌을 해당 번역 생성물에 첨가할 수 있다. 단백질의 환원, 변성 및 복원 방법은 당업자에게 공지되어 있다(상기 참고 문헌들과 문헌 [Debinski, et al., (1993) J. Biol. Chem., 268: 14065-14070], [Kreitman and Pastan (1993) Bioconjug. Chem., 4: 581-585] 및 [Buchner, et al., (1992) Anal. Biochem., 205: 263-270] 참조). 예를 들어, 데빈스키(Debinski) 등은 구아니딘-DTE 중에서 내포체 단백질의 변성 및 환원에 대해 기술하고 있다. 단백질은 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 산화된 글루타티온 및 L-아르기닌을 포함하는 산화환원 완충액 내에서 리폴딩될 수 있다. 리폴딩 시약은 계속적으로 공급하거나, 하나 이상의 폴리펩티드 또는 다른 발현 생성물과 접촉하도록 이동시킬 수 있으며, 또는 이와 반대의 경우도 가능하다.

인슐린 폴리펩티드의 원핵 세포 생산의 경우에는, 이렇게 생산된 인슐린 폴리펩티드가 잘못 접혀질(misfolding) 수 있기 때문에, 생물학적 활성이 결핍되거나 감소될 수 있다. 단백질의 생체 활성은 "리폴딩"에 의해 회복될 수 있다. 일반적으로, 잘못 접혀진 인슐린 폴리펩티드는 예를 들어, 하나 이상의 무질서 유발제(예를 들어, 우레아 및/또는 구아니딘) 및 이황화 결합을 환원시킬 수 있는 환원제(예를 들어, 디티오트레이톨, DTT 또는 2-머캅토에탄올, 2-ME)를 사용하여 폴리펩티드 사슬을 가용화시키고(여기서, 인슐린 폴리펩티드 역시 불용성임), 풀어 헤치고, 환원시켜 리폴딩(다시 접혀지게)된다. 이후, 중간 농도의 무질서 유발제의 농도에서, 산화제(예를 들어, 산소, 시스틴 또는 시스타민)를 첨가하여 이황화 결합을 재형성시킨다. 인슐린 폴리펩티드는 당업계에 공지된 표준 방법, 예컨대 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 제4,511,502호, 제4,511,503호 및 제4,512,922호에 기재된 방법들을 사용하여 리폴딩될 수 있다. 또한, 인슐린 폴리펩티드는 다른 단백질과 코폴딩하여 이종이량체 또는 이종다량체를 형성할 수도 있다.

리폴딩 후, 인슐린은 추가로 정제될 수 있다. 인슐린의 정제는 당업자에게 공지된 다양한 기법들, 예컨대 소수성 상호작용 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 고성능 액체 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등 또는 이들을 임의로 조합한 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 또한, 추가의 정제는 정제된 단백질의 건조 또는 침전 단계를 포함할 수도 있다.

정제 후, 인슐린은 당업계에 공지된 다양한 방법, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 정용여과 및 투석에 의해 다른 완충액 내로 교환되고/되거나 농축될 수 있다. 한번 정제된 단백질로서 제공된 인슐린은 응집과 침전 과정을 거칠 수 있다.

상기 정제된 인슐린은 그 순도가 90% 이상(역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC), 또는 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 측정시) 또는 95% 이상, 또는 98% 이상, 99% 이상, 또는 그 이상일 수 있다. 인슐린 순도의 정확한 수치 값에 관계없이, 인슐린은 약학 제품으로 사용하기에 또는 PEG와 같은 수용성 중합체와의 접합과 같이 추가의 가공을 위해 사용하기에 충분히 순수하다.

어떤 인슐린 분자는 다른 활성 성분 또는 단백질(부형제, 담체, 안정제, 혈청 알부민 등 이외의 것)의 부재 하에 치료제로서 사용될 수 있거나, 또는 이들은 다른 단백질 또는 중합체와 복합체화될 수 있다.

일반적인 정제 방법 다양한 단리 단계 중 임의의 단계는, 인슐린 폴리펩티드를 포함하는 세포 용해물, 추출물, 배양 배지, 내포체, 숙주 세포의 세포질주변 공간, 숙주 세포의 세포질 또는 다른 물질 상에서 수행하거나, 또는 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC"), 역상-HPLC("RP-HPLC"), 팽창층(expanded bed) 흡착 또는 이들을 임의로 조합한 방법 및/또는 이들을 임의의 적합한 순서로 반복하는 방법을 포함하는 임의의 단리 단계로부터 생성된 임의의 인슐린 폴리펩티드 혼합물 상에서 수행할 수 있다.

본 명세서에 기술된 기법들을 수행하는 데 사용되는 장비와 기타 필요한 물질들은 시판되고 있다. 펌프, 분획 수집기, 모니터, 기록기 및 전반적인 시스템들은 예를 들어, 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems)(미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재), 바이오-라드 래보러토리즈 인코포레이티드(Bio-Rad Laboratories, Inc.)(미국 캘리포니아주 헤라클레스 소재) 및 아머샴 바이오사이언시즈 인코포레이티드(Amersham Biosciences, Inc.)(미국 뉴저지주 피스케타웨이 소재)로부터 입수가능하다. 또한, 크로마토그래피 재료, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 교환 매트릭스 물질, 배지 및 완충제들도 이러한 공급업체들로부터 입수가능하다.

평형 단계 및 본원에 기술된 컬럼 크로마토그래피 공정에서의 기타 단계, 예컨대 세척과 용출 단계는 펌프와 같은 특수화된 장치를 사용하여 보다 신속하게 수행될 수 있다. 시판되고 있는 펌프로서는 이에 제한되지는 않지만, 하이로드(HILOAD®) 펌프 P-50, 연동 펌프 P-1, 펌프 P-901 및 펌프 P-903(미국 뉴저지주 피스케타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)을 포함한다.

분획 수집기의 예로서는 레디프락(RediFrac) 분획 수집기, FRAC-100 분획 수집기, FRAC-200 분획 수집기 및 SUPERFRACS® 분획 수집기(미국 뉴저지주 피스케타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)를 포함한다. 또한, pH 및 선형 농도 구배를 형성하기 위해 혼합기도 이용가능하다. 시판되고 있는 혼합기로서는 그래디언트(Gradient) 혼합기 GM-1 및 인-라인(In-Line) 혼합기(미국 뉴저지주 피스케타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)를 포함한다.

시판되고 있는 임의의 모니터를 사용하여 크로마토그래피 공정을 모니터링할 수 있다. 이러한 모니터는 UV, pH 및 전도율과 같은 정보를 수집하는데 사용될 수 있다. 검출기의 예로서는 모니터 UV-1, 유비코드(UVICORD® S II), 모니터 UV-M II, 모니터 UV-900, 모니터 UPC-900, 모니터 pH/C-900 및 전도율 모니터(Conductivity Monitor)(미국 뉴저지주 피스케이타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)를 포함한다. 실제로, 아머샴 바이오사이언시즈(미국 뉴저지주 피스케타웨이 소재)의 다양한 AKTA® 시스템을 비롯한 전반적인 시스템들이 시판되고 있다.

본 발명의 한 실시 양태에서, 예를 들어, 인슐린 폴리펩티드는 먼저 우레아 중에서 생성된 정제된 인슐린 폴리펩티드를 변성시킨 후, 적절한 pH에서 환원제(예컨대, DTT)를 함유하는 TRIS 완충액으로 희석시킴으로써 환원 및 변성될 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 약 2M 내지 약 9M의 농도 범위의 우레아 중에서 변성된 후, 약 5.0 내지 약 8.0의 범위의 pH에서 TRIS 완충제 중에서 희석된다. 다음으로, 이 실시 양태의 리폴딩 혼합물을 배양할 수 있다. 한 실시 양태에서, 상기 리폴딩 혼합물은 실온에서 4시간 내지 24시간 동안 배양된다. 이후, 상기 환원 및 변성된 인슐린 폴리펩티드 혼합물은 추가로 단리되거나 또는 정제될 수 있다.

본 명세서에 언급된 바와 같이, 제1 인슐린 폴리펩티드의 pH는 임의의 후속 단리 단계를 수행하기 전에 조절될 수 있다. 또한, 제1 인슐린 폴리펩티드 혼합물 또는 이들의 임의의 후속 혼합물은 당업계에 공지되어 있는 기법을 사용하여 농축시킬 수 있다. 또한, 제1 인슐린 폴리펩티드 혼합물 또는 이들의 임의의 후속 혼합물을 포함하는 용출 완충액은 당업자에게 공지되어 있는 기법들을 사용하여 다음 단리 단계에 적절한 완충액으로 교환될 수 있다.

이온 교환 크로마토그래피 한 실시 양태에서, 그리고 하나의 임의적인 추가 단계로서, 이온 교환 크로마토그래피가 제1 인슐린 폴리펩티드 혼합물 상에서 수행될 수 있다. 일반적으로, 문헌 [ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY: PRINCIPLES AND METHODS](분류 번호 18-1114-21, 아머샴 바이오사이언시즈(미국 뉴저지주 피스케타웨이 소재))을 참조할 수 있다. 시판되고 있는 이온 교환 컬럼으로서는 하이트랩(HITRAP®), 하이프랩(HIPREP®) 및 하이로드® 컬럼(뉴저지주 피스케타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)을 포함한다. 이러한 컬럼들은 강한 음이온 교환기, 예컨대 Q 세파로스® 패스트 플로우(Fast Flow), Q 세파로스® 하이 퍼포먼스(High Performance) 및 Q 세파로스® XL; 강한 양이온 교환기, 예컨대 SP 세파로스® 하이 퍼포먼스, SP 세파로스® 패스트 플로우 및 SP 세파로스® XL; 약한 음이온 교환기, 예컨대 DEAE 세파로스® 패스트 플로우; 및 약한 양이온 교환기, 예컨대 CM 세파로스® 패스트 플로우(미국 뉴저지주 피스케타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)를 사용한다. 정제 공정 중 임의의 단계의 인슐린 폴리펩티드 상에서 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 실질적으로 정제된 인슐린 폴리펩티드를 단리시킬 수 있다. 양이온 교환 크로마토그래피 단계는 임의의 적절한 양이온 교환 매트릭스를 사용하여 수행될 수 있다. 유용한 양이온 교환 매트릭스로서는, 이에 제한되지는 않지만, 섬유상, 다공성, 비다공성, 미세과립상, 비드형 또는 가교 결합된 양이온 교환 매트릭스 물질을 포함한다. 이러한 양이온 교환 매트릭스 물질은 이에 제한되지는 않지만, 셀룰로스, 아가로스, 덱스트란, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐, 폴리스티렌, 실리카, 폴리에테르, 또는 상기 임의의 것들로 이루어진 복합체를 포함한다.

양이온 교환 매트릭스는 강한 양이온 교환기와 약한 양이온 교환기를 포함하는 임의의 적절한 양이온 교환기일 수 있다. 강한 양이온 교환기는 광범위한 pH 범위에 걸쳐 이온 상태로 잔류할 수 있기 때문에, 광범위한 pH 범위에 걸쳐 인슐린과 결합할 수 있게 된다. 그러나, 약한 양이온 교환기는 pH의 함수로서 이온화 상태 잃어버릴 수 있다. 예를 들어, 약한 양이온 교환기는 pH가 약 pH 4 또는 pH 5 미만으로 떨어지는 경우 전하를 잃어버릴 수 있다. 강한 양이온 교환기로 적절한 것으로서는, 이에 제한되지는 않지만, 설포프로필(SP), 메틸 설포네이트(S) 또는 설포에틸(SE)와 같이 하전된 작용기들을 포함한다. 양이온 교환 매트릭스는 바람직하기로는 약 2.5 내지 약 6.0의 인슐린 결합 pH 범위를 갖는 강한 양이온 교환기일 수 있다. 다르게는, 강한 양이온 교환기는 약 pH 2.5 내지 약 pH 5.5의 인슐린 결합 pH 범위를 가질 수 있다. 양이온 교환 매트릭스는 약 3.0의 인슐린 결합 pH를 가지는 강한 양이온 교환기일 수 있다. 다르게는, 양이온 교환 매트릭스는 바람직하기로는 약 6.0 내지 약 8.0의 인슐린 결합 pH 범위를 갖는 강한 양이온 교환기일 수 있다. 양이온 교환 매트릭스는 바람직하게는 약 pH 8.0 내지 약 pH 12.5의 인슐린 결합 pH 범위를 가지는 강한 양이온 교환기일 수 있다. 다르게는, 강한 양이온 교환기는 약 pH 8.0 내지 약 pH 12.0의 인슐린 결합 pH 범위를 가질 수 있다.

인슐린을 로딩하기 전에, 양이온 교환 매트릭스는 예를 들어 수 컬럼 부피의 희석물인 약산, 예컨대 4 컬럼 부피의 20 mM 아세트산(pH 3)을 이용하여 평형 상태에 이를 수 있다. 평형에 도달한 후, 약한 아세트산 또는 인산 용액과 같은 약산 용액도 사용하여 실질적으로 정제된 인슐린이 용출되기 전에, 인슐린이 첨가될 수 있으며, 컬럼은 1회 내지 수회 세척될 수 있다. 예를 들어, 약 2-4 컬럼 부피의 20 mM 아세트산(pH 3)이 컬럼을 세척하는데 사용될 수 있다. 2-4 컬럼 부피의 0.05 M 아세트산나트륨(pH 5.5) 또는 0.1 M 염화나트륨과 혼합된 0.05 M 아세트산나트륨(pH 5.5)을 이용한 추가의 세척도 사용될 수 있다. 다르게는, 당업계에 공지된 방법들을 사용한 양이온 교환 매트릭스는 수 컬럼 부피의 희석물인 약염기를 이용하여 평형에 다다를 수 있다.

다르게는, 실질적으로 정제된 인슐린은 양이온 교환기 매트릭스를 충분히 낮은 pH 또는 이온 강도를 갖는 완충제와 접촉시켜 매트릭스로부터 인슐린을 방출시킴으로써 용출될 수 있다. 용출 완충제의 pH는 약 pH 2.5 내지 약 pH 6.0의 범위일 수 있다. 보다 구체적으로는, 용출 완충제의 pH는 약 pH 2.5 내지 약 pH 5.5, 약 pH 2.5 내지 약 pH 5.0의 범위일 수 있다. 용출 완충제는 약 3.0의 pH를 가질 수 있다. 또한, 용출 완충제의 양은 광범위하게 다양할 수 있으며, 일반적으로는 약 2 내지 약 10 컬럼 부피 범위이다.

양이온 교환기 매트릭스에 인슐린 폴리펩티드가 흡착된 후, 실질적으로 정제된 인슐린 폴리펩티드는 매트릭스를 충분히 높은 pH 또는 이온 강도를 갖는 완충제와 접촉시켜 매트릭스로부터 인슐린 폴리펩티드를 방출시킴으로써 용출될 수 있다. 실질적으로 정제된 인슐린 폴리펩티드의 높은 pH 용출에서 사용하기 적절한 완충제로서는, 이에 제한되지는 않으나, 약 5 mM 이상 내지 적어도 약 100 mM 농도 범위의 시트레이트, 포스페이트, 포르메이트, 아세테이트, HEPES 및 MES 완충제를 포함한다.

역상 크로마토그래피 당업자에게 공지되어 있는 적합한 프로토콜에 따라 RP-HPLC를 수행하여 단백질을 정제할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Pearson et al., ANAL BIOCHEM. (1982) 124: 217-230 (1982)], [Rivier et al., J. CHROM. (1983) 268: 112-119], [Kunitani et al., J. CHROM. (1986) 359: 391-402]을 참조할 수 있다. RP-HPLC를 인슐린 폴리펩티드 상에서 수행하여 실질적으로 정제된 인슐린 폴리펩티드를 단리시킬 수 있다. 이와 관련하여, 예컨대 이에 제한되지는 않으나, 약 C₃ 이상 내지 적어도 약 C₃₀, 약 C₃ 이상 내지 적어도 약 C₂₀, 또는 약 C₃ 이상 내지 적어도 약 C₁₈을 비롯한 매우 다양한 길이의 알킬 작용기를 갖는 실리카 유도체화 수지를 사용할 수 있다. 다르게는, 중합체 수지가 사용될 수 있다. 예를 들어, 스티렌 중합체 수지인 토소하스 암버크롬(TosoHaas Amberchrome) CG1000sd 수지를 사용할 수 있다. 또한, 매우 다양한 알킬 사슬 길이의 시아노 또는 중합체 수지를 사용할 수 있다. 뿐만 아니라, RP-HPLC 컬럼을 에탄올과 같은 용매로 세척할 수 있다. 소스(Source) RP 컬럼은 RP-HPLC 컬럼의 또 다른 예이다.

이온쌍 시약(ion pairing agent) 및 유기 변형제, 예컨대 메탄올, 이소프로판올, 테트라히드로퓨란, 아세토니트릴 또는 에탄올을 포함하는 적절한 용출 완충제를 사용하여 RP-HPLC 컬럼으로부터 인슐린 폴리펩티드를 용출시킬 수 있다. 가장 흔히 사용되는 이온쌍 시약으로서는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 아세트산, 포름산, 과염소산, 인산, 트리플루오로아세트산, 헵타플루오로부티르산, 트리에틸아민, 테트라메틸암모늄, 테트라부틸암모늄, 트리에틸암모늄 아세테이트를 포함한다. 용출은 하나 이상의 구배(변화도) 또는 등용매 조건을 사용하여 수행할 수 있으며, 구배 조건은 분리 시간을 줄이고 피크 폭을 감소시키는 것이 바람직하다. 또 다른 방법은 서로 다른 용매 농도 범위를 갖는 2개의 구배를 사용하는 것을 포함한다. 본 명세서에 사용하기 적절한 용출 완충제의 예로서는, 이에 제한되지는 않지만 암모늄 아세테이트 및 아세토니트릴 용액을 포함할 수 있다.

소수성 상호작용 크로마토그래피 정제 기법 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)는 인슐린 폴리펩티드 상에서 수행될 수 있다. 일반적으로, 본 명세서에 참고로 포함되는 문헌 [HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY HANDBOOK: PRINCIPLES AND METHODS](분류 번호 18-1020-90, 아머샴 바이오사이언시즈(미국 뉴저지주 피스케타웨이 소재)을 참조할 수 있다. 적합한 HIC 매트릭스로는, 이에 제한되지는 않지만, 알킬 또는 아릴 치환된 매트릭스, 예컨대 부틸-, 헥실-, 옥틸- 또는 페닐-치환된 매트릭스(예컨대, 아가로스, 가교 결합된 아가로스, 세파로스, 셀룰로스, 실리카, 덱스트란, 폴리스티렌, 폴리(메타크릴레이트) 매트릭스 포함), 그리고 혼합형 수지, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 폴리에틸렌아민 수지 또는 부틸- 또는 페닐-치환된 폴리(메타크릴레이트) 매트릭스를 포함할 수 있다. 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피를 위한 시판되는 공급 제품으로서는, 이에 제한되지는 않지만, 하이트랩®, 하이프랩® 및 하이로드® 컬럼(미국 뉴저지주 피스케타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)을 포함한다.

간략히 기술하면, 로딩하기 전에 당업자에게 공지된 표준 완충제, 예컨대 아세트산/염화나트륨 용액 또는 황산암모늄을 함유하는 HEPES를 사용하여 HIC 컬럼을 평형 상태로 만들 수 있다. 황산암모늄은 HIC 컬럼에 로딩하기 위한 완충제로서 사용될 수 있다. 인슐린 폴리펩티드를 로딩시킨 후, 컬럼을 표준 완충제 및 조건들을 사용하여 세척하여 HIC 컬럼 상의 인슐린 폴리펩티드는 보유하면서 불필요한 물질들을 제거할 수 있다. 인슐린 폴리펩티드는 약 3 내지 약 10 컬럼 부피의 표준 완충제, 예컨대 특히 EDTA 및 평형 완충제보다 낮은 황산암모늄 농도를 함유하는 HEPES 완충제, 또는 아세트산/염화나트륨 완충제 등을 사용하여 용출시킬 수 있다. 또한, 인슐린 분자를 용출하는데 있어서 예를 들어, 인산칼륨의 구배를 사용하는 감소성 선형 염 구배를 이용할 수도 있다. 다음으로, 용출물은 예를 들어, 정용여과 또는 한외여과와 같은 여과에 의해 농축시킬 수 있다. 정용여과를 사용하여 인슐린 폴리펩티드를 용출시키는데 사용되는 염을 제거할 수 있다.

기타 정제 기법 예를 들어, 겔 여과(본 명세서에 참고로 포함되는 문헌 [GEL FILTRATION: PRINCIPLES AND METHODS](분류 번호 18-1022-18, 미국 뉴저지주 피스케타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈), 히드록시아파타이트 크로마토그래피(적절한 매트릭스로서는 이에 제한되지는 않지만, HA-울트로겔(Ultrogel), 하이 레졸루션(High Resolution, Calbiochem), CHT 세라믹 히드록시 아파타이트(BioRad), 바이오-겔(Bio-Gel) HTP 히드록시아파타이트(BioRad)를 포함함), HPLC, 팽창층 흡착, 한외여과, 정용여과, 동결건조 등을 사용하여 또 다른 단리 단계를 제1 인슐린 폴리펩티드 혼합물 또는 이들의 임의의 후속 혼합물 상에서 수행함으로써, 임의의 초과량의 염을 제거하고, 완충제를 차후 단리 단계 또는 심지어 최종 약물 제품의 제조에 적절한 완충제로 대체시킬 수 있다.

실질적으로 정제된 인슐린 폴리펩티드를 포함하는 인슐린 폴리펩티드의 수율은 본원에 기술된 각 단계에서 당업자에게 공지된 기법을 이용하여 모니터링될 수 있다. 이러한 기법들은 마지막 단리 단계 후 실질적으로 정제된 인슐린 폴리펩티드의 수율을 평가하는 데에도 사용할 수 있다. 예를 들어, 인슐린 폴리펩티드의 수율은, 다양한 알킬 사슬 길이를 갖는 수개의 역상 고압 액체 크로마토그래피 컬럼, 예컨대 시아노 RP-HPLC, C₁₈RP-HPLC 뿐만 아니라 양이온 교환 HPLC 및 겔 여과 HPLC 중 임의의 칼럼을 사용하여 모니터링될 수 있다.

본 발명의 특정 실시 양태에서, 각 정제 단계 후의 인슐린 수율은 각 정제 단계에 있어서 출발 물질 중 인슐린이 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 약 99.9%, 또는 약 99.99% 이상일 수 있다.

표준 기법, 예컨대 SDS-PAGE를 사용하거나, 또는 웨스턴 블롯 및 ELISA 분석시험을 사용하여 인슐린 폴리펩티드를 측정함으로써 순도를 결정할 수 있다. 예를 들어, 다클론 항체는 음성적 조절 효모 발효 및 양이온 교환 회수로부터 단리된 단백질에 대항하여 생성될 수 있다. 또한, 항체는 오염되는 숙주 세포 단백질의 존재에 대한 프로브로서 사용될 수 있다.

RP-HPLC 재료인 비다크(Vydac) C4(비다크)는 실리카 겔 입자로 이루어져 있는데, 그 표면은 C4-알킬 사슬을 수반하고 있다. 단백질 불순물로부터 인슐린 폴리펩티드를 분리시키는 일은 소수성 상호작용에 있어서 그 강도의 차이를 기초로 한다. 용출은 희석된 트리플루오로아세트산 중의 아세토니트릴 구배를 사용하여 수행한다. 분취 HPLC는 스테인레스강 컬럼(2.8 내지 3.2 리터의 비다크 C4 실리카 겔로 충전시킴)을 사용하여 수행한다. 히드록시아파타이트 울트로겔 용출액은 트리플루오로아세트산을 첨가하여 산성화하고, 비다크 C4 컬럼에 로딩한다. 세척 및 용출을 위해, 희석된 트리플루오로아세트산 중의 아세토니트릴 구배를 사용한다. 분획물들을 수거하고, 즉시 포스페이트 완충제로 중화시킨다. IPC 한계 내에 존재하는 인슐린 폴리펩티드 분획물을 집합적으로 수거한다.

DEAE 세파로스(Pharmacia) 물질은 세파로스 비드의 표면에 공유 결합된 디에틸아미노에틸(DEAE) 기로 이루어져 있다. DEAE 기에 대한 인슐린 폴리펩티드의 결합은 이온성 상호작용에 의해 매개된다. 아세토니트릴 및 트리플루오로아세트산은 남아 있지 않게 컬럼을 통과시킨다. 이러한 물질들을 세척하여 제거한 후, 미량의 불순물은 낮은 pH에서 아세테이트 완충제를 사용해 컬럼을 세척함으로써 제거한다. 다음으로, 컬럼을 중성 포스페이트 완충제로 세척하고, 인슐린 폴리펩티드를 증가된 이온 강도를 갖는 완충제로 용출시킨다. 컬럼을 DEAE 세파로스 패스트 플로우로 패킹시킨다. 컬럼 부피를 겔 1 ㎖ 당 인슐린 폴리펩티드 3-10 mg의 범위로 인슐린 폴리펩티드 로딩이 이루어지도록 조절한다. 컬럼을 물과 평형 완충제(인산나트륨/인산칼륨)로 세척한다. HPLC 용출물의 수집된 분획물을 로딩하고, 컬럼을 평형 완충제로 세척한다. 이후, 컬럼을 세척 완충제(아세트산나트륨 완충제)로 세척한 후, 평형 완충제로 세척한다. 추후, 인슐린 폴리펩티드를 용출 완충제(염화나트륨, 인산나트륨/인산칼륨)를 사용하여 컬럼으로부터 용출시켜, 마스터 용출 프로파일에 따라 단일 분획물로 수거한다. DEAE 세파로스 컬럼의 용출물을 특정한 전도율을 가지도록 조절한다. 생성되는 약물 물질을 멸균 여과하여 테플론(Teflon) 병에 넣고, -70℃에서 저장한다.

추가로 사용될 수 있는 방법으로서는, 이에 제한되지는 않지만, 내독소를 제거하는 단계를 포함한다. 내독소는 예컨대 대장균과 같은 그람 음성 숙주 세포의 외막 상에 위치하는 리포폴리-사카라이드(LPS)이다. 내독소 수준을 감소시키는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 이에 제한되지는 않지만, 실리카 지지체, 유리 분말 또는 히드록시아파타이트, 역상, 친화성, 크기 배제, 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용한 정제 기법들, 이러한 방법들을 조합한 방법 등을 포함한다. 변형 및 추가의 방법들은 해당 폴리펩티드로부터 공동 이송(co-migrating) 단백질과 같은 오염원을 제거하는 것을 필요로 할 수 있다. 내독소 수준을 측정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 이에 제한되지는 않지만, 투구게 혈구 추출액(Limulus Amebocyte Lysate, LAL) 분석시험을 포함한다. 엔도세이프(Endosafe)TM-PTS 분석시험은 포켓용 분광 광도계와 마찬가지로 LAL 시약, 색원체 기질 및 대조군 표준 내독소를 미리 로딩시킨 카트리지를 이용하는 색체계 단일 튜브 시스템이다. 대안적인 방법으로는, 이에 제한되지는 않지만, 탁도계로서 96 웰 포맷을 사용하는 키네틱(Kinetic) LAL 방법을 포함한다.

광범위하게 다양한 방법들과 절차들, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 브래드포드(Bradford) 분석시험, SDS-PAGE, 은 염색 SDS-PAGE, 쿠마시 염색 SDS-PAGE, 질량 분석법(MALDI-TOF를 포함하며 이에 한정되지 않음) 및 당업자에게 공지되어 있는 단백질의 특성을 규명하는 기타의 방법들이, 비천연적으로 코딩된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 인슐린 단백질의 수율과 순도를 평가하는 데 사용될 수 있다.

추가의 방법들로는 이에 제한되지는 않지만, 하기를 포함한다: 단백질 염색 방법과 짝지워진 SDS-PAGE, 면역블롯팅, 매트릭스 보조된 레이저 탈착/이온화 질량분석법(MALDI-MS), 액체 크로마토그래피/질량 분광법, 등전점 집초법, 음이온 교환 분석법, 크로마토포커싱 및 원편광 이색성 분광 분석법.

야생형 합성효소의 무차별적인 난잡함을 이용하기 위해 선택적 압력 도입이라고 불리는 생체 내 기법을 개발하게 되었다. 예를 들어, 문헌 [N. Budisa, C. Minks, S. Alefelder, W. Wenger, F.M. Dong, L. Moroder and R. Huber, FASEB J., 13: 41 (1999)]을 참조할 수 있다. 영양요구성 균주는, 세포에게 특정 천연 아미노산을 공급하는 관련 대사 경로가 작동하지 않아, 제한된 농도의 천연 아미노산을 함유하는 최소 배지에서 성장하는 한편, 표적 유전자의 전사는 억제된다. 성장 정지기가 개시되면, 천연 아미노산은 고갈되어 비천연 아미노산 유사체로 대체된다. 재조합 단백질 발현이 유도되어 비천연 유사체를 함유하는 단백질의 축적이 이루어진다. 예를 들어, 이러한 전략을 사용해 o, m 및 p-플루오로페닐알라닌을 단백질에 도입시켰더니, 용이하게 확인가능한 UV 스펙트럼 중에서 2개의 특징적인 견부(shoulder)가 나타나며(예를 들어, 문헌 [C. Minks, R. Huber, L. Moroder and N. Budisa, Anal . Biochem ., 284:29 (2000)] 참조), 박테리오파지 T4 리소자임(lysozyme)에서 메티오닌을 대체하는데 사용된 트리플루오로메티오닌을 ¹⁹F NMR에 의해 키토올리고사카라이드 리간드와의 상호작용을 연구하였고(예를 들어, 문헌 [H. Duewel, E. Daub, V. Robinson and J.F. Honek, Biochemistry. 36:3404 (1997)] 참조), 루신 대신에 트리플루오로루신을 도입한 결과, 루신-지퍼 단백질의 열 안정성 및 화학적 안정성이 증가되었다. 예를 들어, 문헌 [Y. Tang, G. Ghirlanda, W.A. Petka, T. Nakajima, W.F. DeGrado and D.A. Tirrell, Angew . Chem. Int . Ed . Engl ., 40:1494 (2001)]을 참조할 수 있다. 더욱이, 셀레노메티오닌(selenomethionine)과 텔루로메티오닌(telluromethionine)을 다양한 재조합 단백질에 도입하여 X선 결정학에서의 위상의 해석에 진전을 가져왔다. 예를 들어, 문헌 [W.A. Hendrickson, J.R. Horton and D.M. Lemaster, EMBO J., 9:1665 (1990)], [J.O. Boles, K. Lewinski, M. Kunkle, J.D. Odom, B. Dunlap, L. Lebioda and M. Hatada, Nat . Struct . Biol ., 1:283 (1994)], [N. Budisa, B. Steipe, P. Demange, C. Eckerskorn, J. Kellermann and R. Huber, Eur . J. Biochem ., 230:788 (1995)] 및 [N. Budisa, W. Karnbrock, S. Steinbacher, A. Humm, L. Prade, T. Neuefeind, L. Moroder and R. Huber, J. Mol . Biol . 270:616 (1997)]을 참조할 수 있다. 또한, 알켄 또는 알킨 작용기를 갖는 메티오닌 유사체를 유효하게 도입함으로써 화학적 수단에 의한 단백질의 추가적인 변형을 가능케 하였다. 예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함되는 문헌 [J.C. van Hest and D.A. Tirrell, FEBS Lett., 428:68 (1998)], [J.C. van Hest, K.L. Kiick and D.A. Tirrell, J. Am . Chem. Soc ., 122:1282 (2000)] 및 [K.L. Kiick and D. A. Tirrell, Tetrahedron, 56:9487 (2000)]; 미국 특허 제 6,586,207호; 미국 특허 공보 제2002/0042097호를 참조할 수 있다.

이러한 방법의 성공은 아미노아실-tRNA 합성효소가 비천연 아미노산 유사체를 인지하느냐의 여부에 따라 좌우되는 것으로, 이는 보통 단백질 번역의 충실도를 보장하는 높은 선택성을 필요로 한다. 이러한 방법의 범위를 확장시키는 한 방법은 아미노아실-tRNA 합성효소의 기질 특이성을 완화시키는 것인데, 이는 제한된 경우의 수로 달성되었다. 예를 들어, 대장균 페닐알라닐-tRNA 합성효소(PheRS)에서 Gly에 의한 Ala²⁹⁴의 치환은 기질 결합 포켓의 크기를 증가시켜, p-Cl-페닐알라닌(p-Cl-Phe)에 의한 tRNAPhe의 아실화를 야기하게 된다. 문헌 [M. Ibba, P. Kast and H. Hennecke, Biochemistry. 33:7107 (1994)]을 참조할 수 있다. 이러한 돌연변이체 PheRS가 번식하고 있는 대장균 균주는 페닐알라닌 대신에 p-Cl-페닐알라닌 또는 p-Br-페닐알라닌의 도입을 허용한다. 예를 들어, 문헌 [M. Ibba and H. Hennecke, FEBS Lett ., 364:272 (1995)] 및 [N. Sharma, R. Furter, P. Kast and D.A. Tirrell, FEBS Lett ., 467:37 (2000)]을 참조할 수 있다. 이와 유사하게, 대장균 티로실-tRNA 합성효소의 아미노산 결합 부위 근방의 점 돌연변이 Phe130Ser는 티로신보다 아자티로신을 더욱 효율적으로 도입시키는 것으로 밝혀졌다. 문헌 [F. Hamano-Takaku, T. Iwama, S. Saito-Yano, K. Takaku, Y. Monden, M. Kitabatake, D. Soll and S. Nishimura, J. Biol . Chem ., 275:40324 (2000)]을 참조할 수 있다.

비천연 아미노산을 생체 내 단백질에 도입하는 또 다른 전략은 교정 기전을 갖는 합성효소를 변형시키는 것이다. 이러한 합성효소는 식별 능력이 없기 때문에 동족성 천연 아미노산과 구조적으로 유사한 아미노산을 활성화시킨다. 이러한 오류는 별도의 한 부위에서 수정되는데, 여기서 tRNA의 충전이 잘못된(mischarged) 아미노산을 탈아실화시켜 단백질 번역의 충실도를 유지하게 된다. 상기 합성효소의 교정 활성이 망가진 경우, 잘못 활성화된 구조적 유사체는 수정(editing)되는 기능을 피해서 도입될 수 있다. 이러한 접근 방법은 발릴-tRNA 합성효소(ValRS)를 사용하여 최근에 입증되었다. 문헌 [V. Doring, H.D. Mootz, L.A. Nangle, T.L. Hendrickson, V. de Crecy-Lagard, P. Schimmel and P. Marliere, Science, 292:501 (2001)]을 참조할 수 있다. ValRS는 Cys, Thr 또는 아미노부티레이트(Abu)를 사용하여 tRNAVal에 대한 아미노아실화를 잘못 수행할 수 있고, 이러한 비동족성 아미노산들은 추후 수정 도메인에 의해 가수분해된다. 대장균 염색체의 무작위 돌연변이 유발 후, ValRS의 수정 부위에서 돌연변이를 갖는 돌연변이체 대장균 균주를 선택하였다. 이러한 수정 과정이 결손된 ValRS는 tRNAVal을 Cys로 올바르지 않게 충전시킨다. Abu는 입체적으로 Cys와 유사하게 때문에(Cys의 -SH 기는 Abu 중에서 -CH₃로 대체됨), 이러한 돌연변이체 대장균 균주가 Abu의 존재 하에서 성장하는 경우에 돌연변이체 ValRS도 Abu를 단백질에 도입시킨다. 질량 분광 분석은 본래의 단백질의 각각의 발린 위치에서 발린 중 약 24%가 Abu로 대체됨을 나타내고 있다.

또한, 고체상 합성 및 반합성 방법으로도 신규한 아미노산을 함유하는 다수의 단백질을 합성할 수 있다. 예를 들어, 하기와 같은 간행물 및 이러한 간행물에 인용된 참조 문헌을 참고할 수 있다: 문헌 [Crick, F.H.C., Barrett, L. Brenner, S. Watts-Tobin, R. General nature of the genetic code for proteins . Nature, 192:1227-1232 (1961)], [Hofmann, K., Bohn, H. Studies on polypeptides . XXXVI . The effect of pyrazole - imidazole replacements on the S- protein activating potency of an S- peptide fragment, J. Am Chem, 88(24):5914-5919 (1966)], [Kaiser, E.T. Synthetic approaches to biologically active peptides and proteins including enzymes, Acc Chem Res, 47-54 (1989)], [Nakatsuka, T., Sasaki, T., Kaiser, E.T. Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiosubtilisin, J Am Chem Soc, 109:3808-3810 (1987)], [Schnolzer, M., Kent, S B H. Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides : backbone - engineered HIV protease, Science, 256(5054):221-225 (1992)], [Chaiken, I.M. Semisynthetic peptides and proteins, CRC Crit Rev Biochem, 11(3):255-301 (1981)], [Offord, R.E. Protein engineering by chemical means? Protein Eng ., 1(3):151-157 (1987)] 및 [Jackson, D.Y., Burnier, J., Quan, C., Stanley, M., Tom, J., Wells, J.A. A Designed Peptide Ligase for Total Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues, Science, 266(5183):243 (1994)].

화학적 변형은 보조인자, 스핀 표지 및 올리고뉴클레오티드를 비롯한 다양한 비천연 측쇄를 시험관 내의 단백질에 도입시키는 데 사용되어 왔다. 예를 들어, 문헌 [Corey, D.R., Schultz, P.G. Generation of a hybrid sequence - specific single-stranded deoxyribonuclease, Science, 238(4832):1401-1403 (1987)], [Kaiser, E.T., Lawrence D.S., Rokita, S.E. The chemical modification of enzymatic specificity, Annu Rev Biochem, 54:565-595 (1985)], [Kaiser, E.T., Lawrence, D.S. Chemical mutation of enzyme active sites, Science, 226(4674):505-511 (1984)], [Neet, K.E., Nanci A, Koshland, D.E. Properties of thiol-subtilisin, J. Biol . Chem, 243(24):6392-6401 (1968)], [Polgar, L. et M.L. Bender. A new enzyme containing a synthetically formed active site . Thiol-subtilisin. J. Am Chem Soc, 88:3153-3154 (1966)] 및 [Pollack, S.J., Nakayama, G. Schultz, P.G. Introduction of nucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites, Science, 242(4881):1038-1040 (1988)]을 참조할 수 있다.

다르게는, 화학적으로 변형된 아미노아실-tRNA를 사용하는 생합성 방법이 수개의 생체물리적 프로브를 시험관 내 합성된 단백질에 도입시키기 위해 사용되어 왔다. 하기와 같은 간행물 및 이 간행물에 인용된 참조 문헌을 참고할 수 있다: 문헌 [Brunner, J. New Photolabeling and crosslinking methods, Annu . Rev Biochem, 62:483-514 (1993)] 및 [Krieg, U.C., Walter, P., Hohnson, A.E. Photocrosslinking of the signal sequence of nascent preprolactin of the 54-kilodalton polypeptide of the signal recognition particle, Proc . Natl . Acad . Sci, 83(22):8604-8608 (1986)].

종래에, 원하는 앰버 넌센스 돌연변이를 함유하는 유전자로 프로그래밍된 단백질 합성 반응에 화학적으로 아미노아실화된 억제제 tRNA를 첨가함으로써, 비천연 아미노산이 시험관 내의 단백질에 부위 특이적으로 도입될 수 있다는 점이 밝혀졌다. 이러한 접근 방법을 이용한다면, 특정 아미노산에 대해 영양요구성인 균주를 사용해 일반적인 20개의 아미노산을 다수를 구조적으로 근접한 동족체로 치환할 수 있는데, 예를 들어 페닐알라닌의 경우에는 플루오로페닐알라닌으로 치환시킬 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Noren, C.J., Anthony-Cahill, Griffith, M.C., Schultz, P.G. A general method for site - specific incorporation of unnatural amino acid into proteins, Science, 244:182-188 (1989)], [M.W. Nowak, et al., Science 268:439-42 (1995)], [Bain, J.D., Glabe, C.G., Dix, T.A., Chamberlin, A.R., Diala, E.S. Biosynthetic site - specific Incorporation of a non - natural amino acid into a polypeptide, J. Am Chem Soc, 111:8013-8014 (1989)], [N. Budisa et al., FASEB J. 13:41-51 (1999)], [Ellman, J.A., Mendel, D., Anthony-Cahill, S., Noren, C.J., Schultz, P.G. Biosynthetic method for introducing unnatural amino acid site - specifically into proteins, Methods in Enz ., vol.202, 301-336 (1992)] 및 [Mendel, D., Cornish, V.W. & Schultz, P.G. Site - Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code, Annu Rev Biophys . Biomol Struct. 24, 435-62 (1995)]을 참조할 수 있다.

예를 들어, 억제제 tRNA는 정지 코돈 UAG를 인식하도록 제조하고, 비천연 아미노산을 사용하여 화학적으로 아미노아실화하였다. 통상적인 특정 부위 돌연변이 유발법을 사용하여 단백질 유전자의 해당 부위에 정지 코돈 TAG를 도입하였다. 예를 들어, 문헌 [Sayers, J.R., Schmidt, W. Eckstein, F. 5'-3' Exonuclease in phosphorothioate-based olignoucleotide - directed mutagenesis, Nucleic Acids Res, 16(3):791-802 (1988)]을 참조할 수 있다. 아실화된 억제제 tRNA와 돌연변이체 유전자가 시험관 내 전사/번역 시스템에서 결합된 경우, 특정 위치에서 그 아미노산을 함유하는 단백질을 제공하는 UAG 코돈에 대응하여 비천연 아미노산을 도입하였다. [³H]-Phe를 사용한 실험과 α-히드록시산을 사용한 실험은 원하는 아미노산만이 UAG 코돈에 의해 특정된 위치에 도입되며, 단백질 내에 임의의 다른 부위에서는 도입되지 않는다는 점을 입증하였다. 예를 들어, 문헌 [Noren, et al., 상기와 동일], [Kobayashi et al., (2003) Nature Structural Biology 10(6):425-432] 및 [Ellman, J.A., Mendel, D., Schultz, P.G. Site - specific incorporation of novel backbone structures into proteins, Science, 255(5041):197-200 (1992)]을 참조할 수 있다.

tRNA는 이에 제한되지는 않지만, 화학적 아미노아실화 또는 효소적 아미노아실화를 비롯한 임의의 방법 또는 기법들을 사용하여 원하는 아미노산으로 아미노아실화될 수 있다.

아미노아실화는 아미노아실 tRNA 합성효소에 의해, 또는 다른 효소 분자, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 리보자임에 의해 수행될 수 있다. "리보자임"이라는 용어는 "촉매 RNA"와 상호교환되어 사용된다. 체크(Cech)와 그의 공동 연구자들(문헌 [Cech, 1987, Science, 236:1532-1539], [McCorkle et al., 1987, Concepts Biochem. 64:221-226])은 촉매로 작용할 수 있는 자연 발생 RNA(리보자임)의 존재를 입증하였다. 그러나, 이러한 천연 RNA 촉매가 분해 및 스플라이싱을 위해 리보핵산 기질에 작용한다는 사실만이 입증되었음에도 불구하고, 최근 리보자임의 인공적 개발의 진전은 다양한 화학 반응에 대한 촉매 작용의 범위를 확장시켰다. 많은 연구들은 자신의 (2')3'-말단 상에 아미노아실-RNA 결합을 촉진시킬 수 있는 RNA 분자(문헌 [Illangakekare et al., 1995 Science 267:643-647] 참조)와 하나의 RNA 분자로부터 또 다른 RNA 분자로 아미노산을 이동시킬 수 있는 RNA 분자를 동정하였다(문헌 [Lohse et al, 1996, Nature 381:442-444] 참조).

미국 특허 출원 공보 제2003/0228593호(본원에 참고로 포함됨)는 리보자임을 구축하는 방법 및 천연적으로 코딩된 아미노산과 비천연적으로 코딩된 아미노산을 사용한 tRNA의 아미노아실화에 있어서 이들의 용도에 대해 기술하고 있다. 이에 제한되지는 않으나, 리보자임을 비롯하여 tRNA를 아미노아실화할 수 있는 기질 고정형 효소 분자들은 아미노아실화 생성물의 효율적인 친화성 정제를 가능케 할 수 있다. 기질의 적절한 예로서는 아가로스, 세파로스 및 자기 비드를 포함한다. 아미노아실화를 위한 기질 고정형 리보자임의 제조와 그 사용에 대해서는 문헌 [Chemistry and Biology 2003, 10:1077-1084] 및 미국 특허 출원 공보 제2003/0228593호(본원에 참고로 포함됨)에 기술되어 있다.

화학적 아미노아실화 방법은, 이에 제한되지는 않지만, 아미노아실화에서 합성효소의 사용을 피하기 위하여, 헤흐트(Hecht)와 그의 공동 연구자들에 의해 소개된 방법들(문헌 [Hecht, S.M, Ace. Chem. Res. 1992, 25, 545], [Heckler, T.G.; Roesser, J.R.; Xu, C; Chang, P.; Hecht, S.M. Biochemistry 1988, 27, 7254], [Hecht, S.M.; Alford, B.L.; Kuroda, Y.; Kitano, S.J. Biol. Chem. 1978, 253, 4517] 참조)과 슐츠(Schultz), 챔버린(Chamberlin), 도허티(Dougherty) 등에 의해 소개된 방법들(문헌 [Cornish, V.W.; Mendel, D.; Schultz, P.G. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995, 34, 621], [Robertson, S.A.; Ellman, J.A.; Schultz, P.G. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 2722], [Noren, C.J.; Anthony-Cahill, S.J.; Griffith, M.C; Schultz, P.G. Science 1989, 244, 182], [Bain, J.D.; Glabe, C.G.; Dix, T.A.; Chamberlin, A.R. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 8013], [Bain, J.D. et al., Nature 1992, 356, 537], [Gallivan, J.P.; Lester, H.A.; Dougherty, D.A. Chem. Biol. 1997, 4, 740], [Turcatti, et al., J. Biol. Chem. 1996, 271, 19991], [Nowak, M.W. et al., Science, 1995, 268, 439], [Saks, M.E. et al., J. Biol. Chem. 1996, 271, 23169], [Hohsaka, T. et al., J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 34] 참조)(이들 문헌은 본원에 참고로 포함됨)을 포함한다. 이러한 방법들 또는 다른 화학적 아미노아실화 방법들은 tRNA 분자를 아미노아실화하는데 사용될 수 있다.

촉매 RNA를 제조하는 방법은 무작위로 뽑은 리보자임 서열들의 별도 집합체를 만드는 단계, 상기 집합체에 대해 방향적 진화(directed evolution)를 수행하는 단계, 바람직한 아미노아실화 활성에 대해 상기 집합체를 스크리닝하는 단계 및 바람직한 아미노아실화 활성을 나타내는 리보자임의 서열을 선별하는 단계를 수반할 수 있다.

리보자임은 아실화 작용을 촉진하는 모티프 및/또는 영역, 예컨대 GGU 모티프 및 U-풍부 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, U-풍부 영역이 아미노산 기질의 인지를 촉진할 수 있고, GGU 모티프가 tRNA의 3' 말단에 염기쌍을 형성할 수 있다는 사실이 보고된 바 있다. 복합적으로, GGU 모티프와 U-풍부 영역은 아미노산과 tRNA 양자 모두의 동시적 인지를 용이하게 하여, tRNA 3' 말단의 아미노아실화를 촉진시킨다.

리보자임은 tRNA^Asn _CCCG와 접합된 부분 무작위 추출된 r24mini를 사용하여 시험관 내에서 선별한 후, 활성 클론에서 발견되는 공통 서열을 전반적으로 조작함으로써 생성될 수 있다. 이러한 방법으로 수득되는 예시적인 리보자임은 "Fx3 리보자임"이라 지칭하며, 이는 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 공보 제2003/0228593호에 기술되어 있으며, 이 리보자임은 동족체 비천연 아미노산으로 충전된 다양한 아미노아실-tRNA의 합성을 위한 다용도의 촉매로서 작용한다.

기질 상 고정화를 통해 아미노아실화된 tRNA의 친화성 정제를 효율적으로 수행할 수 있다. 적절한 기질의 예로서는, 이에 제한되지는 않지만, 아가로스, 세파로스 및 자기 비드를 포함한다. 리보자임은 RNA의 화학적 구조를 이용하여 수지 상에 고정될 수 있는데, 예컨대 RNA의 리보스 상에 3'-cis-디올은 과요오드로 산화되어 해당 디알데히드를 만들어 내기 때문에 수지 상에 RNA의 고정화를 용이하게 할 수 있는 것이다. 환원성 아민화가 수지와 리보자임 간의 상호작용을 비가역적 결합으로 만드는 저가의 히드라지드 수지를 비롯해서, 다양한 유형의 수지들을 사용할 수 있다. 아미노아실-tRNA의 합성은 이러한 컬럼 상 아미노아실화 기법에 의해 현저하게 촉진될 수 있다. 문헌 [Kourouklis et al., Methods 2005; 36:239-4]은 컬럼 기반의 아미노아실화 시스템에 대해 기술하고 있다.

아미노아실화 tRNA의 단리는 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 적절한 한 방법은 10 mM EDTA가 포함된 아세트산나트륨 용액, 50 mM N-(2-히드록시에틸)피페라진-N'-(3-프로판설폰산), 12.5 mM KCl, 10 mM EDTA (pH 7.0)을 포함하는 완충액, 또는 단순한 EDTA 완충수(pH 7.0)와 같은 완충제를 이용하여 컬럼으로부터 아미노아실화된 tRNA를 용출시키는 것이다.

번역 반응에 의해 만들어진 폴리펩티드 내에 선택된 위치에 tRNA를 아미노아실화시킨 그 아미노산을 도입하기 위해서, 아미노아실화된 tRNA를 번역 반응에 첨가할 수 있다. 본 발명의 아미노아실화된 tRNA가 사용될 수 있는 번역 시스템의 예로서는, 이에 제한되지는 않지만, 세포 용해물을 포함한다. 세포 용출물은 제공된 mRNA의 폴리펩티드의 시험관 내 번역을 위해 필요한 반응 성분들을 제공한다. 이러한 반응 성분들의 예로서는, 이에 제한되지는 않지만, 리보좀 단백질, rRNA, 아미노산, tRNA, GTP, ATP, 번역 개시 인자와 신장 인자 그리고 번역과 관련된 추가적인 인자들을 포함한다. 추가로, 번역 시스템은 일괄 번역 시스템 또는 구분된 번역 시스템일 수 있다. 일괄 번역 시스템은 하나의 구획에서 반응 성분들을 혼합하는 반면, 구분된 번역 시스템은 번역 효율성에 방해가 될 수 있는 반응 생성물의 번역 반응 성분들을 분리해 낸다. 이러한 번역 시스템들은 시판되고 있다.

또한, 전사/번역이 커플링된 시스템도 사용될 수 있다. 전사/번역 커플링 시스템은 제공된 DNA가 해당 mRNA로 전사되고, 이것이 결과적으로 반응 성분들에 의해 번역되도록 해준다. 시판되고 있는 전사/번역 커플링된 시스템의 예로서는 래피드 트랜스레이션 시스템(Rapid Translation System, RTS)(로슈 인코포레이티드)을 들 수 있다. 상기 시스템은 리보좀 및 번역 인자들과 같은 번역 성분을 제공하기 위한 대장균 용해물을 함유하는 혼합물을 포함한다. 덧붙여, 제공된 DNA를 번역에쓰이는 mRNA 주형으로 전사시키기 위해서 RNA 중합효소가 포함된다. RTS는 반응 구획들, 예컨대 공급/배출 구획 및 전사/번역 구획 간에 게재된 막을 이용하여 반응 성분들을 구분할 수 있다.

tRNA의 아미노아실화는 예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 전이효소, 중합효소, 촉매 항체, 다작용성 단백질 등을 비롯한 기타의 제제에 의해 수행될 수 있다.

문헌 [Stephan in Scientist 2005 Oct 10;pages 30-33]은 비천연적으로 코딩된 아미노산을 단백질에 도입하는 추가적인 방법들에 대해 기술하고 있다. 문헌 [Lu et al., in Mol Cell. 2001 Oct;8(4):759-69]은 단백질이 비천연 아미노산을 포함하는 합성 펩티드에 화학적으로 결찰되는 방법(단백질 결찰로 표현됨)에 대해 기술하고 있다.

또한, 미세주사 기술을 사용하여 비천연 아미노산을 단백질에 도입시켰다. 예를 들어, 문헌 [M.W. Nowak, P.C. Kearney, J.R. Sampson, M.E. Saks, C.G. Labarca, S.K. Silverman, W.G. Zhong, J. Thorson, J.N. Abelson, N. Davidson, P.G. Schultz, D.A. Dougherty and H.A. Lester, Science, 268:439 (1995)] 및 [D.A. Dougherty, Curr . Opin . Chem . Biol ., 4:645 (2000)]을 참조할 수 있다. 시험관 내 제조된 2개의 RNA 종(해당 아미노산 위치에서 UAG 정지 코돈을 갖는 표적 단백질을 코딩하는 mRNA 및 원하는 비천연 아미노산으로 아미노아실화된 앰버 억제제 tRNA)을 제노푸스(Xenopus) 난모세포에 함께 주사하였다. 이렇게 하면, 난모세포의 번역 기구는 UAG에 의해 특정된 위치에 비천연 아미노산을 삽입시키게 된다. 이러한 방법으로 인해, 일반적으로 시험관 내 발현 시스템을 따르지 않는 내재성 막 단백질의 생체 내 구조-기능 연구 수행이 가능하게 되었다. 이러한 연구 수행의 예로서는, 형광 공명 에너지 전이에 의한 거리를 측정하기 위해 형광 아미노산을 타치키닌(tachykinin) 뉴로키닌(neurokinin)-2 수용체에 도입한 것(예를 들어, 문헌 [G. Turcatti, K. Nemeth, M.D. Edgerton, U. Meseth, F. Talabot, M. Peitsch, J. Knowles, H. Vogel and A. Chollet, J. Biol . Chem ., 271:19991 (1996)] 참조), 이온 채널 내에 표면 노출된 잔기들을 확인하기 위해 비오틴이 부착된 아미노산을 도입한 것(예를 들어, 문헌 [J.P. Gallivan, H.A. Lester and D.A. Dougherty, Chem. Biol ., 4:739 (1997)] 참조); 이온 채널에서 실시간으로 형태 변화를 모니터링하기 위해 케이징된 티로신 유사체를 사용한 것(예를 들어, 문헌 [J.C. Miller, S.K. Silverman, P.M. England, D.A. Dougherty and H.A. Lester, Neuron, 20:619 (1998)] 참조)과 통문(gating) 기작 탐침을 위한 이온 채널 백본을 변화시키는데 α-히드록시 아미노산을 사용한 것을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [P.M. England, Y. Zhang, D.A. Dougherty and H.A. Lester, Cell, 96:89 (1999)], [T. Lu, A.Y. Ting, J. Mainland, L.Y. Jan, P.G. Schultz and J. Yang, Nat . Neurosci ., 4:239 (2001)]을 참조할 수 있다.

생체 내에서 비천연 아미노산을 단백질에 직접 도입시킬 수 있다면, 광범위하게 다양한 이점들, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 높은 수율의 돌연변이체 단백질, 기술적 용이성, 세포 또는 살아있는 유기체에서 돌연변이체 단백질 연구를 할 수 있는 잠재성 및 이러한 돌연변이체 단백질의 치료용 및 진단용으로의 사용의 이점을 제공한다. 다양한 크기, 산도, 친핵성, 소수성 및 기타 특성을 갖는 비천연 아미노산을 단백질에 포함시킬 수 있다면, 단백질의 구조를 합리적이고 체계적으로 조작할 수 있는 역량을 크게 확장시킬 수 있어, 단백질 기능을 살펴서 새로운 특성을 갖는 신규한 단백질 또는 유기체를 생성할 수 있게 된다.

파라-F-Phe를 부위 특이적으로 도입하려는 한 시도로서, 효모 앰버 억제제 tRNAPheCUA/페닐알라닐-tRNA 합성효소 쌍을 p-F-Phe 저항성인 Phe 영양요구성 대장균 균주에서 사용하였다. 예를 들어, 문헌 [R. Furter, Protein Sci . 7:419 (1998)]을 참조할 수 있다.

또한, 무세포(시험관 내) 번역 시스템을 사용하여 본 발명의 인슐린 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 것도 가능할 수 있다. 번역 시스템은 세포성 또는 무세포성일 수 있으며, 원핵 세포성 또는 진핵 세포성일 수 있다. 세포성 번역 시스템은, 이에 제한되지는 않지만, 원하는 핵산 서열이 mRNA로 전사되어 mRNA가 번역할 수 있는 것인 전세포 조제용 물질 예컨대 투과가능하게 처리된 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 무세포 번역 시스템은 시판되고 있으며 다양한 서로 다른 유형의 시스템들이 잘 알려져 있다. 무세포 시스템의 예로서는, 이에 제한되지는 않지만, 원핵 세포 용해물, 예컨대 대장균 용해물, 그리고 진핵 세포 용해물, 예컨대 맥아 추출물, 곤충 세포 용해물, 래빗 망상 적혈구 용해물, 래빗 난모세포 용해물 및 인간 세포 용해물을 포함한다. 진핵 세포 추출물 또는 용해물은 생성되는 단백질이 글리코실화, 인산화 또는 다르게 변형되는 것이 바람직할 수 있는데, 이는 다양한 이런 변형들은 진핵 세포 시스템에서만 가능하기 때문이다. 일부 이러한 추출물과 용해물들은 시판된다(미국 위스콘신주 매디슨 소재의 프로메가(Promega); 미국 캘리포니아주 라호야 소재의 스트라타진; 미국 일리노이주 알링톤 하이츠 소재의 아머샴(Amersham); 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재 GIBCO/BRL). 분비 단백질의 번역을 위해 유용한 막 추출물, 예컨대 마이크로솜 막을 함유하는 개의 췌장 추출물도 시판되고 있다. 주형(시험관 내 번역)으로서 mRNA 또는 주형(시험관 내 전사 및 번역이 결합됨)으로서 DNA를 포함할 수 있는 이러한 시스템에서, 시험관 내 합성은 리보좀에 의해 지시된다. 무세포 단백질 발현 시스템을 개발하기 위한 상당한 노력이 이루어졌다. 예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함되는 문헌 [Kim, D.M. and J.R. Swartz, Biotechraology and Bioengineering, 74:309-316 (2001)], [Kim, D.M. and J.R. Swartz, Biotechnology Letters, 22, 1537-1542, (2000)], [Kim, D.M., and J.R. Swartz, Biotechnology Progress, 16, 385-390, (2000)], [Kim, D.M., and J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineerng, 66, 180-188, (1999)] 및 [Patnaik, R. and J.R. Swartz, Biotechnology 24, 862-868, (1998)], 미국 특허 제6,337,191호; 미국 특허 공보 제2002/0081660호; WO 00/55353, WO 90/05785를 참조할 수 있다. 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 인슐린 폴리펩티드의 발현에 적용될 수 있는 또 다른 접근 방법으로서는 mRNA-펩티드 융합 기법을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [R. Roberts and J. Szostak, Proc. Natl Acad. Sci. (USA) 94:12297-12302 (1997)], [A. Frankel, et al., Chemistry & Biology 10: 1043-1050 (2003)]을 참조할 수 있다. 이러한 접근 방법에서는, 퓨로마이신(puromycin)에 결합된 mRNA 주형이 리보좀 상에서 펩티드로 번역된다. 하나 이상의 tRNA 분자들이 변형된 경우, 비천연 아미노산도 역시 펩티드 내로 도입될 수 있다. 마지막 mRNA 코돈이 판독된 후에는, 퓨로마이신이 펩티드의 C-말단을 포획하게 된다. 생성되는 mRNA-펩티드 접합체가 시험관 내 분석시험에서 흥미있는 성질을 갖는 것으로 발견되는 경우, 그의 정체는 mRNA 서열로부터 용이하게 밝혀질 수 있다. 이러한 방식으로, 비천연적으로 코딩된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 인슐린 폴리펩티드의 라이브러리를 스크리닝하여 원하는 성질을 갖는 폴리펩티드를 동정할 수 있다. 보다 최근에는, 정제된 성분들을 사용한 시험관 내 리보좀 번역이 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된 펩티드의 합성을 가능하게 하는 것으로 보고되었다. 예를 들어, 문헌 [A. Forster et al., Proc. Natl Acad. Sci. (USA) 100:6353 (2003)]을 참조할 수 있다.

재구성된 번역 시스템도 사용될 수 있다. 정제된 번역 인자들의 혼합물도 mRNA를 단백질로 번역하는데 있어서 성공적으로 사용되어 왔으며, 용해물의 혼합물 또는 정제된 번역 인자들, 예컨대 개시 인자-1(IF-1), IF-2, IF-3(α 또는 β), 신장 인자 T(EF-Tu), 또는 종결 인자로 보충된 용해물도 그러하다. 무세포 시스템도 전자/번역 시스템에 커플링될 수 있어, 여기서 DNA가 시스템에 도입되고, mRNA로 전사되며 이 mRNA는 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., editors, Wiley interscience, 1993)](본원에 참고로 포함됨)에 기술된 것과 같이 번역된다. 진핵 세포 전사 시스템에서 전사된 RNA는 이핵성 RNA(hnRNA) 또는 5'-말단 캡(7-메틸 구아노신) 및 3'-말단 폴리 A 꼬리의 성숙한 mRNA의 형태일 수 있으며, 이는 특정 번역 시스템에서 장점이 될 수 있다. 예를 들어, 캡핑된 mRNA들은 망상 적혈구 용해물 시스템에서 고효율로 번역된다.

인슐린 폴리펩티드에 커플링된 거대분자 중합체

본 명세서에 기재된 조성물, 방법, 기법 및 전략들을 사용하여 본원에 기술된 비천연 아미노산 폴리펩티드에 대해 다양한 변형을 수행할 수 있다. 이러한 변형은 폴리펩티드의 비천연 아미노산 성분에 추가의 작용기를 도입하는 단계를 포함하는데, 여기서 추가의 작용기로서는, 이에 제한되지는 않지만, 표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜의 유도체, 광가교결합제, 방사성 핵종, 세포독성 화합물, 약물, 친화성 표지, 광친화성 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이트제, 보조인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 사카라이드, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 억제성 리보핵산, 생체 적합 물질, 나노입자, 스핀 표지, 형광발색단, 금속 함유 부분, 방사성 부분, 신규한 작용기, 다른 분자와 공유 또는 비공유적으로 상호작용하는 기, 포토케이징된 부분, 화학 방사선으로 여기가능한 부분, 광이성질화 가능한 부분, 비오틴, 비오틴의 유도체, 비오틴 유사체, 무거운 원자를 도입하는 부분, 화학적으로 분절가능한 기, 광분절성 기, 연장된 측쇄, 탄소 결합된 당, 산화환원 활성제, 아미노 티오산, 독성 부분, 동위원소로 표지된 부분, 생물리학적 프로브, 형광 기, 화학발광기, 고 전자 밀도 기, 자성 기, 삽입 기, 발색단, 에너지 전달제, 생물학적 활성제, 검출가능한 표지, 소분자, 양자점, 나노전달물질, 방사성 핵종, 방사성 전달물질, 중성자 포획제, 또는 상기한 것들의 임의의 혼합물 혹은 임의의 다른 바람직한 화합물 또는 물질을 들 수 있다. 본 명세서에 기재된 조성물, 방법, 기법 및 전략의 실례가 되는 비제한적인 예로서, 하기의 상세한 설명은 비천연 아미노산 폴리펩티드에 거대분자 중합체를 첨가하는 것에 초점을 맞출 것이지만, 거기에 기재된 조성물, 방법, 기법 및 전략 또한 앞서 나열한 것들을 비롯한 다른 작용기들을 첨가하는 데에도 적용될 수 있다(필요에 따라, 당업자가 본 명세서의 개시내용을 이용하여 실시할 수 있는 적절한 변형 사용을 의미함).

매우 다양한 거대분자 중합체와 다른 분자들이 본 발명의 인슐린 폴리펩티드에 결합하여 인슐린 폴리펩티드의 생물학적 성질을 조절하고/조절하거나 인슐린 분자에 새로운 생물학적 특성을 제공할 수 있다. 이러한 거대분자 중합체는 천연적으로 코딩된 아미노산, 비천연적으로 코딩된 아미노산, 또는 천연 또는 비천연 아미노산으로 된 임의의 작용성 치환체, 또는 천연 또는 비천연 아미노산에 부가되는 임의의 치환체 또는 작용기를 통해 인슐린 폴리펩티드에 결합될 수 있다. 중합체의 분자량은 광범위한 범위, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 약 100 Da 내지 약 100,000 Da 또는 그 이상일 수 있다. 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 100,000 Da, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da 및 100 Da일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 50,000 Da이다. 일부 실시 양태에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시 양태에서, 중합체의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시 양태에서, 중합체의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시 양태에서, 중합체의 분자량은 약 10,000 Da 내지 약 40,000 Da이다.

본 발명은 중합체:단백질 접합체로 된 실질적으로 균질한 조제용 물질을 제공한다. 본 명세서에 사용된 "실질적으로 균질한"이라는 용어는 중합체:단백질 접합체 분자가 총 단백질 중 절반 이상으로 관찰되는 것을 의미한다. 중합체:단백질 접합체는 생물학적 활성을 가지며, 본 명세서에 제공된 본 발명의 "실질적으로 균질한" PEG화된 인슐린 폴리펩티드 조제물은 균질한 조제용 물질의 이점, 예를 들어, 로트 간(lot to lot) 약동학 예측성에 대해 임상적으로 적용하기 용이한 특성을 나타내기에 충분히 균질한 것들이다.

또한, 중합체:단백질 접합체 분자들의 혼합물을 제조하는 것도 선택할 수 있으며, 본 명세서에 제공되는 이점으로서는 혼합물 중에 포함되는 단일중합체:단백질 접합체의 비율을 선택할 수 있다는 점이다. 따라서, 필요하다면, 다양한 수로 부착된 중합체 부분(즉, 디-, 트리-, 테트라- 등)을 갖는 다양한 단백질의 혼합물을 제조할 수 있으며, 본 발명의 방법을 사용하여 제조된 단일중합체:단백질 접합체와 상기 접합체를 혼합할 수 있고, 미리 결정된 비율의 단일중합체:단백질 접합체와 혼합물을 형성할 수도 있다.

선택된 중합체는 부착되는 단백질이 수성 환경, 예컨대 생리학적 환경에서 침전하지 않도록 수용성일 수 있다. 중합체는 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 최종 생성물 조제물의 치료적 용도를 위해서는, 중합체는 약학적으로 허용가능한 것이어야 할 것이다.

중합체의 예로서는, 이에 제한되지는 않으나, 폴리알킬 에테르 및 이의 알콕시 캡핑된 유사체(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌/프로필렌 글리콜 및 이의 메톡시 또는 에톡시 캡핑된 유사체, 특히 폴리옥시에틸렌 글리콜, 후자는 폴리에틸렌글리콜 즉 PEG로도 알려짐); 폴리비닐피롤리돈; 폴리비닐알킬 에테르; 폴리옥사졸린, 폴리알킬 옥사졸린 및 폴리히드록시알킬 옥사졸린; 폴리아크릴아미드, 폴리알킬 아크릴아미드 및 폴리히드록시알킬 아크릴아미드(예를 들어, 폴리히드록시프로필메타크릴아미드 및 이의 유도체); 폴리히드록시알킬 아크릴레이트; 폴리시알산 및 이의 유사체; 친수성 펩티드 서열; 폴리사카라이드 및 이들의 유도체, 예컨대 덱스트란 및 덱스트란 유도체, 예를 들어, 카르복시메틸덱스트란, 덱스트란 설페이트, 아미노덱스트란; 셀룰로스 및 이의 유도체, 예를 들어, 카르복시메틸 셀룰로스, 히드록시알킬 셀룰로스; 키틴 및 이의 유도체, 예를 들어, 키토산, 숙시닐 키토산, 카르복시메틸키틴, 카르복시메틸키토산; 히알루론산 및 이의 유도체; 전분; 알긴산 염류; 콘드로이틴 설페이트; 알부민; 풀루란 및 카르복시메틸 풀루란; 폴리아미노산 및 이의 유도체, 예를 들어, 폴리글루탐산, 폴리리신, 폴리아스파르트산, 폴리아스파르트아미드; 말레산 무수물 공중합체, 예컨대 스티렌 말레산 무수물 공중합체, 디비닐에틸 에테르 말레산 무수물 공중합체; 폴리비닐 알콜; 이의 공중합체; 이의 삼량체; 이의 혼합물; 및 상기한 것들의 유도체를 포함한다.

단백질 분자에 대한 폴리에틸렌 글리콜 분자의 비율은 반응 혼합물 중 그들의 농도에 따라 변하게 될 것이다. 일반적으로, 최적 비율(최소한의 초과량으로 미반응 단백질 또는 중합체가 존재한다는 반응 효율의 관점에서 최적의 비율이라고 칭함)은 선택된 폴리에틸렌 글리콜의 분자량 및 이용가능한 반응성 기의 수에 따라 결정될 수 있다. 분자량에 있어서, 보통 중합체의 분자량이 크면 클수록, 단백질에 부착될 수 있는 중합체 분자의 수는 적어진다. 이와 유사하게, 이들 매개변수를 최적화하는 경우에는 중합체의 분지화 상태를 고려해야 한다. 일반적으로, 분자량이 크면 클수록(또는 분지가 많을수록) 중합체:단백질 비율이 높아진다.

본 명세서에서 PEG:인슐린 폴리펩티드 접합체를 고려하는 경우, "치료적 유효량"이라는 용어는 환자에게 바람직한 이익을 제공하는 양을 지칭한다. 이러한 양은 개인에 따라 달라지며, 환자의 전반적인 신체 조건 및 치료될 질환의 근본적인 원인을 비롯한 다수의 요인들에 좌우될 것이다. 치료를 위해 사용되는 인슐린 폴리펩티드의 양은 허용가능한 변화의 비율을 제공하여 이익이 되는 수준에서 원하는 반응을 유지하게 된다. 본 발명의 조성물의 치료적 유효량은 공개적으로 입수가능한 물질과 절차를 이용하여 당업자에 의해 용이하게 확인될 수 있다.

수용성 중합체는 이에 제한되지는 않지만, 선형, 포크형 또는 분지형을 비롯한 임의의 구조 형태일 수 있다. 보통, 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 글리콜), 예컨대 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)이지만, 다른 수용성 중합체도 사용할 수 있다. 예로써, PEG가 본 발명의 특정한 실시 양태를 기술하는 데 사용한다.

PEG는 시판되거나, 또는 당업자에게 공지된 방법에 따라 에틸렌 글리콜의 개환 중합에 의해 제조될 수 있는 잘 알려진 수용성 중합체이다(문헌 [Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol.3, pages 138-161] 참조). "PEG"라는 용어는 크기 또는 PEG 말단의 변형과는 상관없이 임의의 폴리에틸렌 글리콜 분자를 망라하는 것으로 광범위하게 사용되며, 인슐린 폴리펩티드에 결합된 것으로서는 하기 화학식으로 나타낼 수 있다:

XO-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-Y

상기 식 중,

n은 2 내지 10,000이고, X는 H 또는 말단 변형물, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, C₁ _-4 알킬, 보호기 또는 말단 작용기이다.

어떤 경우에는, 본 발명에 사용되는 PEG는 히드록시 또는 메톡시(즉, X는 H 또는 CH₃임)를 갖는 한 말단으로 종결된다("메톡시 PEG"). 다르게는, PEG는 반응성 기로 종결되어 이작용성 중합체를 형성할 수 있다. 전형적인 반응성 기로서는, 20개의 일반 아미노산에서 발견되는 작용기와 반응하는 데 흔히 사용되는 반응성 기(예컨대, 이에 한정되지는 않지만, 말레이미드 기, 활성화된 카르보네이트(p-니트로페닐 에스테르를 포함하며 이에 한정되지 않음), 활성화된 에스테르(N-히드록시숙신이미드, p-니트로페닐 에스테르를 포함하며 이에 한정되지 않음) 및 알데히드를 포함함) 뿐만 아니라 20개의 일반 아미노산에 대해서는 불활성이지만 비천연적으로 코딩된 아미노산에 존재하는 상보적인 작용기(아지드기, 알킨기를 포함하며 이에 한정되지 않음)와 특이적으로 반응하는 작용기를 포함할 수 있다. 상기 화학식 중에서 Y로 도시되는 PEG의 나머지 한 말단이 자연 발생 아미노산 또는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 통해 인슐린 폴리펩티드에 직접 또는 간접적으로 부착된다는 사실은 주목할 만하다. 예를 들어, Y는 폴리펩티드의 아민기(예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 리신의 ε-아민 또는 N-말단을 포함함)에 대한 아미드, 카르바메이트 또는 우레아 결합일 수 있다. 다르게는, Y는 티올기(시스테인의 티올 기를 포함하며 이에 한정되지 않음)에 대한 말레이미드 결합일 수 있다. 다르게는, Y는 20개의 일반 아미노산을 통해 통상적으로 접근가능하지 않은 잔기에 대한 결합일 수 있다. 예를 들어, PEG 상의 아지드기는 인슐린 폴리펩티드 상의 알킨기와 반응하여 휘스겐 [3 + 2] 시클로 부가 생성물을 형성할 수 있다. 다르게는, PEG 상의 알킨기는 비천연적으로 코딩된 아미노산 중에 존재하는 아지드기와 반응하여 유사한 생성물을 형성할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 강한 친핵성 물질(히드라진, 히드라지드, 히드록실아민, 세미카르바지드를 포함하며 이에 한정되지 않음)은 비천연적으로 코딩된 아미노산 중에 존재하는 알데히드 또는 케톤 기와 반응하여 히드라존, 옥심 또는 세미카르바존을 형성할 수 있으며, 일부 가능한 경우에는 적절한 환원제의 처리에 의해 추가로 환원될 수 있다. 다르게는, 강한 친핵성 물질은 비천연적으로 코딩된 아미노산을 통해 인슐린 폴리펩티드로 도입될 수 있으며, 수용성 중합체 중에 존재하는 케톤 또는 알데히드 기와 우선적으로 반응하는데 사용될 수 있다.

PEG의 분자 질량은 실제 바람직한 대로 임의의 질량, 약 100 달톤 (Da) 내지 100,000 Da 또는 그 이상 바람직한 질량대로(예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 때로 0.1-50 kDa 또는 10-40 kDa를 포함함) 사용될 수 있다. PEG의 분자량은 광범위한 범위, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 약 100 Da 내지 약 100,000 Da 또는 그 이상일 수 있다. PEG의 분자량은 약 100 Da 내지 약 100,000 Da, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da 및 100 Da일 수 있다. 일부 실시 양태에서, PEG의 분자량은 약 100 Da 내지 약 50,000 Da이다. 일부 실시 양태에서, PEG의 분자량은 약 100 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시 양태에서, PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시 양태에서, PEG의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시 양태에서, PEG의 분자량은 약 10,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 분지형 사슬 PEG, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 각각의 사슬이 1-100 kDa(1-50 kDa 또는 5-20 kDa을 포함하며 이에 한정되지 않음) 범위의 MW를 갖는 PEG 분자도 사용할 수 있다. 분지형 사슬 PEG의 각 사슬 분자량은 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 약 1,000 Da 내지 약 100,000 Da 또는 그 이상일 수 있다. 분지형 사슬 PEG의 각 사슬 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 100,000 Da, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da 및 1,000 Da일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 분지형 사슬 PEG의 각 사슬 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시 양태에서, 분지형 사슬 PEG의 각 사슬 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시 양태에서, 분지형 사슬 PEG의 각 사슬 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 20,000 Da이다. 광범위한 범위의 PEG 분자는 예컨대, 이에 제한되지는 않으나, 본 명세서에 참고로 포함되는 문헌 [Shearwater Polymers, Inc. catalog, Nektar Therapeutics catalog]에 기술되어 있다.

일반적으로, PEG 분자의 하나 이상의 말단은 비천연적으로 코딩된 아미노산과의 반응을 위해서 이용가능하다. 예를 들어, 아미노산 측쇄와의 반응을 위해 알킨 및 아지드 부분을 함유하는 PEG 유도체는 본 명세서에 기재된 바와 같이 PEG를 비천연적으로 코딩된 아미노산에 부착시키는데 사용될 수 있다. 비천연적으로 코딩된 아미노산이 아지드를 포함하는 경우, PEG는 통상적으로 알킨 부분을 포함하여 [3 + 2] 시클로 부가 생성물을 형성하거나, 또는 포스핀 기를 함유하는 활성화된 PEG 종(즉, 에스테르, 카르보네이트)을 포함하여 아미드 결합을 형성하게 될 것이다. 다르게는, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 알킨을 포함하는 경우, PEG는 통상적으로 아지드 부분을 포함하여 [3 + 2] 휘스겐 시클로 부가 생성물을 형성하게 될 것이다. 비천연적으로 코딩된 아미노산이 카르보닐 기를 포함하는 경우, PEG는 각각 하기 친핵성 물질에 대응하는 히드라존, 옥심 및 세미카르바존 결합을 형성시키기 위하여 통상적으로 강력한 친핵성 물질(히드라지드, 히드라진, 히드록실아민 또는 세미카르바지드 작용가를 포함하며 이에 한정되지 않음)을 포함할 것이다. 기타의 대안으로, 상기 기술한 반응성 기의 역방향을 사용할 수 있는데, 즉 비천연적으로 코딩된 아미노산 중의 아지드 부분을 알킨을 포함하는 PEG 유도체와 반응시킬 수 있다.

일부 실시 양태에서, PEG 유도체를 갖는 인슐린 폴리펩티드 변이체는 비천연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄 상에 존재하는 화학적 작용기와 반응성을 갖는 화학적 작용기를 함유한다.

일부 실시 양태에서, 본 발명은 약 800 Da 내지 약 100,000 Da의 평균 분자량을 갖는 수용성 중합체 백본을 포함하는 아지드 함유 중합체 유도체 및 아세틸렌 함유 중합체 유도체를 제공한다. 수용성 중합체의 중합체 백본은 폴리(에틸렌 글리콜)일 수 있다. 그러나, 광범위하게 다양한 수용성 중합체들, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 폴리(에틸렌) 글리콜 및 기타 관련 중합체, 예컨대 폴리(덱스트란)과 폴리(프로필렌 글리콜)도 본 발명의 실시에 있어 사용하기에 적합하고, PEG 또는 폴리(에틸렌 글리콜)이라는 용어의 사용은 이러한 모든 분자를 망라하여 포함하려는 의도라는 점에 대한 이해가 있어야 한다. PEG라는 용어는 이에 제한되지는 않지만, 임의의 형태의 폴리(에틸렌 글리콜), 예컨대 이작용성 PEG, 멀티암형(multiarmed) PEG, 유도체화된 PEG, 포크형 PEG, 분지형 PEG, 펜던트 PEG(즉, 중합체 백본에 펜던트된 하나 이상의 작용기를 갖는 PEG 또는 관련 중합체), 또는 분해가능한 결합을 안에 포함하고 있는 PEG를 포함한다.

PEG는 보통 투명하고, 무색이며, 무취이고, 수용성이며, 열에 안정하고, 여러 화학적 제제에 대해 불활성이며, 가수분해가 된다거나 또는 약화되지 않으며, 일반적으로 비독성이다. 폴리(에틸렌 글리콜)은 생체 적합성이 있는 것으로 간주되는데, 이는 즉 PEG가 유해를 가하지 않으면서 생체 조직 또는 유기체와 공존할 수 있다는 말이다. 보다 구체적으로, PEG는 실질적으로 비면역원성인데, 이는 즉 PEG가 체내에서 면역 반응을 일으키는 경향이 없다는 것을 의미한다. PEG가 체내에서 바람직한 기능을 갖는 어떤 분자, 예컨대 생물학적 활성제에 부착된 경우에는, 이러한 제제를 차폐시키는 경향이 있어, 유기체가 이러한 제제의 존재를 견뎌낼 수 있도록 임의의 면역 반응을 감소시키거나 또는 제거할 수 있다. PEG 접합체는 실질적인 면역 반응을 일으키거나 또는 응고되거나 또는 다른 바람직하지 못한 효과를 야기하는 경향을 없다. 화학식 --CH₂CH₂O--(CH₂CH₂O)_n--CH₂CH₂--(여기서, n은 약 3 내지 약 4000, 통상 약 20 내지 약 2000임)을 갖는 PEG가 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 약 800 Da 내지 약 100,000 Da의 분자량을 갖는 PEG가 본 발명의 일부 실시 양태에 있어서 중합체 백본으로서 특히 유용하다. PEG의 분자량은 광범위한 범위, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 약 100 Da 내지 약 100,000 Da 또는 그 이상일 수 있다. PEG의 분자량은 약 100 Da 내지 약 100,000 Da, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da 및 100 Da일 수 있다. 일부 실시 양태에서, PEG의 분자량은 약 100 Da 내지 약 50,000 Da이다. 일부 실시 양태에서, PEG의 분자량은 약 100 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시 양태에서, PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시 양태에서, PEG의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시 양태에서, PEG의 분자량은 약 10,000 Da 내지 약 40,000 Da이다.

중합체 백본은 선형 또는 분지형일 수 있다. 분지형 중합체 백본은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 보통, 분지형 중합체는 중심 분지 코어 부분 및 이러한 중심 분지 코어에 결합된 다수의 선형 중합체 사슬을 가진다. PEG는 다양한 폴리올, 예컨대 글리세롤, 글리세롤 올리고머, 펜타에리트리톨 및 소르비톨에 에틸렌 옥사이드를 첨가함으로써 제조될 수 있는 분지 형태로서 흔히 사용된다. 또한, 중심 분지 부분은 수개의 아미노산들, 예컨대 리신으로부터 유도될 수도 있다. 분지형 폴리(에틸렌 글리콜)은 R(-PEG-OH)_m (여기서, R은 코어 부분, 예컨대 글리세롤, 글리세롤 올리고머 또는 펜타에리트리톨로부터 유도되며, m은 다수의 암(arm)을 나타냄)과 같은 일반적인 형태로 나타낼 수 있다. 멀티암형 PEG 분자, 예컨대 미국 특허 제5,932,462호 제5,643,575호, 제5,229,490호, 제4,289,872호; 미국 특허 출원 제2003/0143596호; WO 96/21469 및 WO 93/21259(이들 문헌은 각각 그 내용 전체가 본원 명세서에 참고로 포함됨)에 기재된 것들도 중합체 백본으로서 사용될 수 있다.

분지형 PEG는 PEG(--YCHZ₂)_n (여기서, Y는 결합기이고, Z는 정해진 길이의 원자 사슬에 의해 CH에 결합된 활성화 말단기임)으로 표현되는 포크형 PEG의 형태로도 존재할 수 있다.

또 다른 분지형 형태인 펜던트 PEG는 PEG 사슬의 말단이 아닌 PEG 백본을 따라서 카르복실기와 같은 반응성 기를 가진다.

이러한 형태의 PEG 이외에도, 중합체는 백본 내에 약한 결합 또는 분해가능한 결합을 사용하여 제조될 수도 있다. 예를 들어, PEG는 가수분해되기 쉬운 중합체 백본 중의 에스테르 결합을 사용하여 제조될 수 있다. 하기에서 나타낸 것과 같이, 이러한 가수분해는 중합체의 분해를 야기하여 저분자량의 단편들로 분절시킨다.

-PEG-CO₂-PEG- + H₂O → PEG-CO₂H + HO-PEG-

당업자라면 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 PEG라는 용어가 당업계에 공지된 모든 형태, 예컨대 이에 제한되지는 않지만 본원에 개시된 것들을 포함하는 모든 형태를 나타낸다는 점을 알 수 있을 것이다.

다른 여러 중합체들도 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 일부 실시 양태에서, 2개 내지 약 300개의 말단을 갖는 수용성인 중합체 백본은 본 발명에서 특히 유용하다. 적절한 중합체의 예로서는, 이에 제한되지는 않지만, 다른 폴리(알킬렌 글리콜), 예컨대 폴리(프로필렌 글리콜)("PPG"), 이들의 공중합체(에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜의 공중합체를 포함하며 이에 한정되지 않음), 그들의 삼량체, 이들의 혼합물 등을 포함한다. 중합체 백본의 각 사슬 분자량이 변할 수 있다 하더라도, 이는 보통 약 800 Da 내지 약 100,000 Da, 흔히는 약 6,000 Da 내지 약 80,000 Da의 범위이다. 중합체 백본의 각 사슬 분자량은 약 100 Da 내지 약 100,000 Da, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da 및 100 Da일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 중합체 백본의 각 사슬 분자량은 약 100 Da 내지 약 50,000 Da이다. 일부 실시 양태에서, 중합체 백본의 각 사슬 분자량은 약 100 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시 양태에서, 중합체 백본의 각 사슬 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시 양태에서, 중합체 백본의 각 사슬 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시 양태에서, 중합체 백본의 각 사슬 분자량은 약 10,000 Da 내지 약 40,000 Da이다.

당업자라면 수용성 백본에 대해 상기에 열거한 것들이 모든 경우의 수를 기재하고 있는 것은 전혀 아니며 오직 예시를 위한 것이라는 점과, 상기 기술한 특성을 가지는 모든 중합체 물질들이 본 발명에서 사용하기에 적합한 것으로 고려된다는 점을 알 수 있을 것이다.

본 발명의 일부 실시 양태에서, 중합체 유도체는 "다작용성"인데, 이는 중합체 백본이 작용기로 기능화되거나 활성화되는 2개 이상의 말단, 많게는 약 300개의 말단을 가진다는 것을 의미한다. 다작용성 중합체 유도체는, 이에 제한되지는 않지만, 각각의 말단이 동일하거나 서로 다를 수 있는 작용기에 결합되는 2개의 말단을 갖는 선형 중합체를 포함한다.

한 실시 양태에서, 중합체 유도체는 하기의 구조를 가진다.

X-A-POLY-B-N=N=N

상기 식 중,

N=N=N은 아지드 부분이고,

B는 결합 부분으로서, 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며,

POLY는 수용성인 비항원성 중합체이고,

A는 결합 부분으로서, 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, B와 동일하거나 서로 다를 수 있으며,

X는 제2 작용기이다.

A 및 B에 대한 결합 부분의 예로서는, 이에 제한되지는 않지만, 18개 이하의 탄소 원자, 1-10개의 탄소 원자를 포함할 수 있는 다중 작용화된 알킬기를 포함한다. 알킬 사슬에 헤테로원자, 예컨대 질소, 산소 또는 황이 포함될 수 있다. 알킬 사슬은 헤테로원자 위치에서 분지형이 될 수도 있다. A 및 B에 대한 결합 부분의 다른 예로서는, 이에 제한되지는 않지만, 10개 이하의 탄소 원자, 5-6개의 탄소 원자를 포함할 수 있는 다중 작용화된 아릴기를 포함한다. 아릴기는 하나 이상의 탄소 원자, 질소, 산소 또는 황 원자로 치환될 수 있다. 적절한 결합 기의 다른 예로서는 미국 특허 제5,932,462호, 제5,643,575호 및 미국 특허 출원 공보 제2003/0143596호(이들 문헌 각각은 본원에 참고로 포함됨)에 기재된 결합 기를 포함한다. 당업자라면 결합 부분에 대해 상기에 열거한 것들이 모든 경우의 수를 기재하고 있는 것은 전혀 아니며 오직 예시를 위한 것이라는 점과, 상기 기술한 특성을 가지는 모든 결합 부분들이 본 발명에서 사용하기에 적합한 것으로 고려된다는 점을 알 수 있을 것이다.

X로 사용하기 적절한 작용기의 예로서는, 이에 제한되지는 않으나, 히드록실, 보호된 히드록실, 알콕실, 활성 에스테르, 예컨대 N-히드록시숙신이미딜 에스테르 및 1-벤조트리아졸릴 에스테르, 활성 카르보네이트, 예컨대 N-히드록시숙신이미딜 카르보네이트 및 1-벤조트리아졸릴 카르보네이트, 아세탈, 알데히드, 알데히드 수화물, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 활성 설폰, 아민, 아미노옥시, 보호된 아민, 히드라지드, 보호된 히드라지드, 보호된 티올, 카르복실산, 보호된 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 비닐설폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요오도아세트아미드, 에폭시드, 글리옥살, 디온, 메실레이트, 토실레이트, 트레실레이트, 알켄, 케톤 및 아지드를 포함한다. 당업자라면 알 수 있는 것과 같이, 선택된 X 부분은 아지드 기와의 반응이 일어나지 않도록 아지드 기와 양립가능해야 한다. 아지드 함유 중합체 유도체는 단일이작용성(제2 작용기(즉, X)도 아지드 부분인 것을 의미함)이거나, 이종이작용성(제2 작용기는 상이한 작용기인 것을 의미함)일 수 있다.

"보호된"이라는 용어는 특정한 반응 조건 하에서 화학적으로 반응성인 작용기의 반응을 방지하는 보호기 또는 부분의 존재를 일컫는다. 보호기는 보호되는 화학적 반응성 기의 유형에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 화학적 반응성 기가 아민 또는 히드라지드인 경우, 보호기는 tert-부틸옥시카르보닐(t-Boc) 및 9-플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc)의 군으로부터 선택될 수 있다. 화학적 반응성 기가 티올인 경우, 보호기는 오르쏘피리딜디설파이드일 수 있다. 화학적 반응성 기가 카르복실산, 예컨대 부탄산 또는 프로피온산이거나, 히드록실기인 경우, 보호기는 벤질 또는 알킬기, 예컨대 메틸, 에틸 또는 tert-부틸일 수 있다. 당업계에 공지된 다른 보호기들도 본 발명에서 사용될 수 있다.

문헌 중에 기재된 말단 작용기의 구체적인 예로서는, N-숙신이미딜 카르보네이트(예를 들어, 미국 특허 제5,281,698호, 제5,468,478호 참조), 아민(예를 들어, 문헌 [Buckmann et al., Makromol. Chem. 182:1379 (1981)], [Zaplipsky et al., Eur. Polym. J. 19:1177 (1983)] 참조), 히드라지드(예를 들어, 문헌 [Andresz et al., Makromol. Chem. 179:301 (1978)] 참조), 숙신이미딜 프로피오네이트 및 숙신이미딜 부타노에이트(예를 들어, 문헌 [Olson et al., in Poly(ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, pp 170-181, Harris & Zaplipsky Eds., ACS, Washington, D.C., 1997] 참조; 또한, 미국 특허 제5,672,662호 참조), 숙신이미딜 숙시네이트(예를 들어, 문헌 [Abuchowski et al., Cancer Biochem. Biophys. 7:175 (1984)] 및 [Joppich et al., Makromol. Chem. 180:1381 (1979)] 참조), 숙신이미딜 에스테르(예를 들어, 미국 특허 제4,670,417호 참조), 벤조트리아졸 카르보네이트(예를 들어, 미국 특허 제5,650,234호 참조), 글리시딜 에테르(예를 들어, 문헌 [Pitha et al., Eur. J Biochem. 94:11 (1979)], [Elling et al., Biotech. Appl. Biochem. 13:354 (1991)] 참조), 옥시카르보닐이미다졸(예를 들어, 문헌 [Beauchamp, et al., Anal. Biochem. 131:25 (1983)], [Tondelli et al., J. Controlled Release 1:251 (1985)] 참조), p-니트로페닐 카르보네이트(예를 들어, 문헌 [Veronese, et al., Appl. Biochem. Biotech., 11:141 (1985)] 및 [Sartore et al., Appl. Biochem. Biotech., 27:45 (1991)] 참조), 알데히드(예를 들어, 문헌 [Harris et al., J. Polym. Sci. Chem. Ed. 22:341 (1984)], 미국 특허 제5,824,784호, 미국 특허 제5,252,714호 참조), 말레이미드(예를 들어, 문헌 [Goodson et al., BioTechnology 8:343 (1990)], [Romani et al., in Chemistry of Peptides and Proteins 2:29 (1984)] 및 [Kogan, Synthetic Comm. 22:2417 (1992)] 참조), 오르쏘피리딜-디설파이드(예를 들어, 문헌 [Woghiren, et al., Bioconj. Chem. 4:314 (1993)] 참조), 아크릴올(예를 들어, 문헌 [Sawhney et al., Macromolecules, 26:581 (1993)] 참조), 비닐설폰(예를 들어, 미국 특허 제5,900,461호 참조)을 포함한다. 상기 모든 참고 문헌 및 특허는 본 명세서에 참고로 포함된다.

본 발명의 특정 실시 양태에서, 본 발명의 중합체 유도체는 하기 구조를 가지는 중합체 백본을 포함한다.

X-CH₂CH₂O--(CH₂CH₂O)_n--CH₂CH₂-N=N=N

상기 식 중,

X는 상기한 바와 같은 작용기이고,

n은 약 20 내지 약 4000이다.

또 다른 실시 양태에서, 본 발명의 중합체 유도체는 하기 구조를 갖는 중합체 백본을 포함한다:

X-CH₂CH₂O--(CH₂CH₂O)_n--CH₂CH₂-O-(CH₂)_m-W-N=N=N

상기 식 중,

W는 1-10개의 탄소 원자를 포함하는 지방족 또는 방향족 링커 부분이고,

n은 약 20 내지 약 4000이며,

X는 상기한 바와 같은 작용기이다. m은 1 내지 10이다.

본 발명의 아지드 함유 PEG 유도체는 당업계에 공지되고/공지되거나 본 명세서에 개시되어 있는 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 하기에 나타낸 한 방법에서, 제1 작용기에 결합된 제1 말단 및 적절한 이탈기에 결합된 제2 말단을 가지며 평균 분자량이 약 800 Da 내지 약 100,000 Da인 수용성 중합체 백본은 아지드 음이온(이는 나트륨, 칼륨, tert-부틸암모늄 등을 비롯한 임의의 다수의 적절한 상대 이온과 쌍을 이룰 수 있음)과 반응한다. 이러한 이탈기는 친핵성 치환을 거쳐 아지드 부분으로 치환되어 원하는 아지드 함유 PEG 중합체를 제공하게 된다.

X-PEG-L + N₃ ^- → X-PEG-N₃

상기에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 사용하기에 적합한 중합체 백본은 화학식 X-PEG-L(여기서, PEG는 폴리(에틸렌 글리콜)이고, X는 아지드 기와 반응하지 않는 작용기이며, L는 적절한 이탈기임)의 구조를 가진다. 적절한 작용기의 예로서는, 이에 제한하지는 않으나, 히드록실, 보호된 히드록실, 아세탈, 알케닐, 아민, 아미노옥시, 보호된 아민, 보호된 히드라지드, 보호된 티올, 카르복실산, 보호된 카르복실산, 말레이미드, 디티오피리딘, 비닐피리딘 및 케톤을 포함한다. 적절한 이탈기의 예로서는, 이에 제한되지는 않지만, 염화물, 브롬화물, 요오드화물, 메실레이트, 트레실레이트 및 토실레이트를 포함한다.

본 발명의 아지드 함유 중합체 유도체를 제조하는 또 다른 방법에서, 아지드 작용기를 갖는 결합제(여기서, 결합제는 PEG 중합체 상의 화학 작용기와 선택적으로 반응하게 될 화학 작용기를 보유함)를 약 800 Da 내지 약 100,000 Da의 평균 분자량을 갖는 수용성 중합체 백본과 접촉시켜, 아지드 함유 중합체 유도체 생성물(여기서, 아지드는 결합기에 의해 중합체 백본으로부터 분리됨)을 형성하게 된다.

예시적인 반응식은 다음과 같이 도시된다.

X-PEG-M + N-링커-N=N=N → PG-X-PEG-링커-N=N=N

상기 식 중,

PEG는 폴리(에틸렌 글리콜)이고, X는 캡핑 기, 예컨대 알콕시 또는 상기에 기술한 것과 같은 작용기이고,

M은 아지드 작용기와 반응하지는 않지만 N 작용기와는 유효하게 선택적으로 반응하는 작용기이다.

적절한 작용기의 예로서는, 이에 제한되지는 않지만, N이 아민인 경우 M은 카르복실산, 카르보네이트 또는 활성 에스테르이고; N이 히드라지드 또는 아미노옥시 부분인 경우 M은 케톤이며; N이 친핵성 물질인 경우 M은 이탈기인 예들을 포함한다.

미정제 생성물의 정제는 공지된 방법, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 생성물을 침전시킨 후, 필요에 따라 크로마토그래피를 수행하는 방법 등으로 수행될 수 있다.

보다 구체적인 예로서는 하기에 PEG 디아민의 경우에 나타내었는데, 여기서 아민들 중 하나는 보호기 부분, 예컨대 tert-부틸-Boc에 의해 보호되며, 생성되는 단일-보호된 PEG 디아민은 아지드 작용기를 보유하는 결합 부분과 반응한다.

BocHN-PEG-NH₂ + H0₂C-(CH₂)₃-N=N=N

이 경우, 아민 기는 다양한 활성화제, 예컨대 염화티오닐 또는 카르보디이미드 시약 및 N-히드록시숙신이미드 또는 N-히드록시벤조트리아졸을 사용하여 카르복실산 기에 커플링되어, 모노아민 PEG 유도체와 아지드 함유 링커 부분 사이에 아미드 결합을 생성할 수 있다. 아미드 결합이 성공적으로 형성된 후, 생성되는 N-tert-부틸-Boc-보호된 아지드 함유 유도체는 생체 활성 분자를 변형시키는데 직접사용될 수 있고, 또는 다른 유용한 작용기가 자리를 잡도록 추가로 정교하게 가공될 수 있다. 예를 들어, N-t-Boc 기는 강산 처리로 가수분해되어 ω-아미노-PEG-아지드를 생성할 수 있다. 생성되는 아민은 중요한 이종이작용성 시약의 생성을 위해 합성 핸들(synthetic handle)로서 사용되어 다른 유용한 작용기, 예컨대 말레이미드기, 활성화된 디설파이드, 활성화된 에스테르 등이 자리를 잡도록 해줄 수 있다.

중합체 각 말단에 서로 다른 분자들을 부착시키는 것이 바람직한 경우, 이종이작용성 유도체가 특히 유용하다. 예를 들어, ω-N-아미노-N-아지도 PEG는 활성화된 친전자성 기, 예컨대 알데히드, 케톤, 활성화된 에스테르, 활성화된 카르보네이트 등을 갖는 분자가 PEG의 한 말단에 부착되는 것을 가능하게 하며, 아세틸렌기를 갖는 분자가 PEG의 나머지 다른 말단에 부착되는 것을 가능케 한다.

본 발명의 또 다른 실시 양태에서, 중합체 유도체는 하기 구조를 가진다.

X-A-POLY-B-C≡C-R

상기 식 중,

R은 H이거나 또는 알킬, 알켄, 알킬옥시이거나, 또는 아릴 또는 치환된 아릴 기일 수 있고,

B는 결합 부분으로서, 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며,

POLY는 수용성인 비항원성 중합체이고,

A는 결합 부분으로서, 존재하거나 또는 존재하지 않을 수 있고, B와 동일하거나 서로 다를 수 있으며,

X는 제2 작용기이다.

X로 사용하기 적절한 작용기의 예로서는, 이에 제한되지는 않으나, 히드록실, 보호된 히드록실, 알콕실, 활성 에스테르, 예컨대 N-히드록시숙신이미딜 에스테르 및 1-벤조트리아졸릴 에스테르, 활성 카르보네이트, 예컨대 N-히드록시숙신이미딜 카르보네이트 및 1-벤조트리아졸릴 카르보네이트, 아세탈, 알데히드, 알데히드 수화물, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 활성 설폰, 아민, 아미노옥시, 보호된 아민, 히드라지드, 보호된 히드라지드, 보호된 티올, 카르복실산, 보호된 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 비닐설폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요오도아세트아미드, 에폭시드, 글리옥살, 디온, 메실레이트, 토실레이트, 트레실레이트, 알켄, 케톤 및 아세틸렌을 포함한다. 당업자라면 알 수 있는 것과 같이, 선택된 X 부분은 아세틸렌 기와의 반응이 일어나지 않도록 아세틸렌 기와 양립가능해야 한다. 아세틸렌 함유 중합체 유도체는 단일이작용성(제2 작용기(즉, X)도 아세틸렌 부분인 것을 의미함)이거나, 이종이작용성(제2 작용기는 상이한 작용기인 것을 의미함)일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시 양태에서, 중합체 유도체는 하기 구조를 갖는 중합체 백본을 포함한다:

X-CH₂CH₂O--(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-0-(CH₂)_m-C≡CH

상기 식 중,

X는 상기 기술된 것과 같은 작용기이고,

n은 약 20 내지 약 4000이며,

m은 1 내지 10이다.

각각의 이종이작용성 PEG 중합체의 구체적인 예는 하기에 나타내는 바와 같다.

본 발명의 아세틸렌 함유 PEG 유도체는 당업계에 공지되고/공지되거나 본 명세서에 개시되어 있는 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 한 방법에서, 제1 작용기에 결합된 제1 말단 및 적절한 친핵성 기에 결합된 제2 말단을 가지며 평균 분자량이 약 800 Da 내지 약 100,000 Da인 수용성 중합체 백본은 아세틸렌 작용기 및 PEG 상의 친핵성 기와 반응하기에 적합한 이탈기 양자 모두를 보유하는 화합물과 반응한다. 친핵성 부분을 보유하는 PEG 중합체 및 이탈기를 보유하는 분자가 혼합되는 경우, 이탈기는 친핵성 치환을 거쳐 친핵성 부분으로 치환되어 원하는 아세틸렌 함유 중합체를 제공하게 된다.

X-PEG-Nu + L-A-C → X-PEG-Nu-A-C≡CR'

상기에 나타낸 바와 같이, 반응에 사용하기 바람직한 중합체 백본은 화학식 X-PEG-Nu(여기서, PEG는 폴리(에틸렌 글리콜)이고, Nu는 친핵성 부분이며, X는 Nu, L 또는 아세틸렌 작용기와 반응하지 않는 작용기임)를 가진다.

Nu의 예로서는, 이에 제한되지는 않으나, 주로 SN2 유형의 기작에 의해 반응하는 아민, 알콕시, 아릴옥시, 설프히드릴, 이미노, 카르복실레이트, 히드라지드, 아민옥시 기들을 포함한다. Nu 기의 추가적인 예로서는 주로 친핵성 부가 반응을 통해 반응하는 작용기들을 포함한다. L 기의 예로서는 염화물, 브롬화물, 요오드화물, 메실레이트, 트레실레이트, 토실레이트 및 친핵성 치환을 거칠 것으로 예상되는 기타의 기들뿐만 아니라 케톤, 알데히드, 티오에스테르, 올레핀, α-β 불포화된 카르보닐 기, 카르보네이트 및 친핵성 물질에 의한 첨가를 거칠 것으로 예상되는 기타의 친전자성 기를 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시 양태에서, A는 1-10 개 탄소 원자의 지방족 링커 또는 6-14 개 탄소 원자의 치환된 아릴 고리이다. X는 아지드 기와 반응하지 않는 작용기이며, L은 적절한 이탈기이다.

본 발명의 아세틸렌 함유 중합체 유도체를 제조하는 또 다른 방법에서, 한 말단에는 보호된 작용기 또는 캡핑제를 보유하고, 나머지 다른 한 말단에는 적절한 이탈기를 보유하며, 평균 분자량이 약 800 Da 내지 약 100,000 Da인 PEG 중합체를 아세틸렌 음이온과 접촉시킨다.

예시적인 반응식은 다음과 같이 도시된다.

X-PEG-L + -C≡CR' → X-PEG-C≡CR'

상기 식 중,

PEG는 폴리(에틸렌 글리콜)이고, X는 캡핑 기, 예컨대 알콕시 또는 상기 기술한 것과 같은 작용기이며,

R'는 H, 알킬, 알콕시, 아릴 또는 아릴옥시기 또는 치환된 알킬, 알콕실, 아릴 또는 아릴옥시기이다.

상기 예에서, 이탈기 L은 충분한 농도의 아세틸렌 음이온과 접촉하는 경우 SN2 유형의 치환을 거치도록 충분히 반응성이 있어야 한다. 아세틸렌 음이온에 의한 이탈기의 SN2 치환을 달성하는 데 필요로 하는 반응 조건은 당업자에게 공지되어 있다.

수용성 중합체는 본 발명의 인슐린 폴리펩티드에 결합될 수 있다. 수용성 중합체는 인슐린 폴리펩티드에 도입된 비천연적으로 코딩된 아미노산, 또는 비천연적으로 코딩된 아미노산 또는 천연적으로 코딩된 아미노산의 임의의 작용기 또는 치환체, 또는 비천연적으로 코딩된 아미노산 또는 천연적으로 코딩된 아미노산에 부가된 임의의 작용기 또는 치환체를 통해 결합될 수 있다. 다르게는, 수용성 중합체는 자연 발생 아미노산(시스테인, 리신 또는 N-말단 잔기의 아민기를 포함하며 이에 한정되지 않음)을 통해 비천연적으로 코딩된 아미노산을 도입하는 인슐린 폴리펩티드에 결합된다. 일부의 경우, 본 발명의 인슐린 폴리펩티드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 비천연 아미노산을 포함하는데, 여기서 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산(들)이 수용성 중합체(들)(PEG 및/또는 올리고사카라이드를 포함하며 이에 한정되지 않음)에 결합된다. 일부의 경우, 본 발명의 인슐린 폴리펩티드는 수용성 중합체에 결합된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 천연적으로 코딩된 아미노산(들)을 더 포함한다. 일부의 경우, 본 발명의 인슐린 폴리펩티드는 수용성 중합체에 결합된 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산(들) 및 수용성 중합체에 결합된 하나 이상의 자연 발생 아미노산을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 본 발명에 사용되는 수용성 중합체는 접합되지 않은 형태에 비하여 인슐린 폴리펩티드의 혈청 반감기를 향상시킨다.

본 발명의 인슐린 폴리펩티드에 결합된 수용성 중합체의 수(즉, PEG화 또는 글리코실화의 정도)는 변화된(증가되거나 또는 감소되는 것을 포함하며 이에 한정되지 않음) 약리학적, 약동학적 또는 약력학적 특징, 예컨대 생체 내 반감기를 제공기 위해 조절될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 인슐린의 반감기는 변형되지 않은 폴리펩티드에 비하여 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90%, 2배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11 배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 50배, 또는 약 100배 이상 증가된다.

강한 친핵성 기(즉, 히드라지드 , 히드라진, 히드록실아민 또는 세미카르바지드 )를 함유하는 PEG 유도체

본 발명의 한 실시 양태에서, 카르보닐 함유의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 인슐린 폴리펩티드는 PEG 백본에 직접 결합된 말단 히드라진, 히드록실아민, 히드라지드 또는 세미카르바지드 부분을 함유하는 PEG 유도체를 사용하여 변형된다.

일부 실시 양태에서, 히드록실아민-말단 PEG 유도체는 하기의 구조를 가진다.

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-O-NH₂

상기 식 중,

R은 단순한 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이며, n은 100-1,000(즉, 평균 분자량은 5-40 kDa임)이다.

일부 실시 양태에서, 히드라진 함유 PEG 유도체 또는 히드라지드 함유 PEG 유도체는 하기의 구조를 가진다.

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-X-NH-NH₂

상기 식 중,

R은 단순한 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이며, n은 100-1,000이고, X는 존재하거나 또는 존재하지 않을 수 있는 카르보닐기(C=O)일 수 있다.

일부 실시 양태에서, 세미카르바지드 함유 PEG 유도체는 하기의 구조를 가진다.

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-NH-C(O)-NH-NH₂

상기 식 중,

R은 단순한 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이며, n은 100-1,000이다.

본 발명의 또 다른 실시 양태에서, 카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 인슐린 폴리펩티드는 아미드 결합에 의해 PEG 백본에 결합되는 말단 히드록실아민, 히드라지드, 히드라진 또는 세미카르바지드 부분을 함유하는 PEG 유도체를 사용하여 변형된다.

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-CO-(CH₂)_m-0-NH₂

상기 식 중,

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_m-X-NH-NH₂

상기 식 중,

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_m-NH-C(O)-NH-NH₂

상기 식 중,

본 발명의 또 다른 실시 양태에서, 카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 인슐린 폴리펩티드는 말단 히드라진, 히드록실아민, 히드라지드 또는 세미카르바지드 부분을 함유하는 분지형 PEG 유도체를 사용하여 변형되며, 이러한 분지형 PEG의 각 사슬은 10-40 kDa 범위, 5-20 kDa 범위일 수 있는 MW를 가진다.

본 발명의 또 다른 실시 양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 인슐린 폴리펩티드는 분지형 구조를 갖는 PEG 유도체를 사용하여 변형된다. 예를 들어, 일부 실시 양태에서, 히드라진-말단 PEG 유도체 또는 히드라지드-말단 PEG 유도체는 하기의 구조를 가진다.

[RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)]₂CH(CH₂)_m-X-NH-NH₂

상기 식 중,

일부 실시 양태에서, 세미카르바지드 기를 함유하는 PEG 유도체는 하기의 구조를 가진다.

[RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂]₂CH-X-(CH₂)_m-NH-C(O)-NH-NH₂

상기 식 중,

R은 단순한 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, X는 NH, 0, S, C(O)일 수 있거나 또는 존재하지 않을 수 있으며, m은 2-10이고, n은 100-1,000이다.

일부 실시 양태에서, 히드록실아민 기를 함유하는 PEG 유도체는 하기의 구조를 가진다.

[RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂]₂CH-X-(CH₂)_m-0-NH₂

상기 식 중,

수용성 중합체(들)가 인슐린 폴리펩티드에 결합되는 정도와 부위로 인슐린 폴리펩티드 수용체에 대한 결합을 조절할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 상기 결합은 인슐린 폴리펩티드가 문헌 [Spencer et al., J. Biol. Chem., 263:7862-7867 (1988)]에 기술된 바와 같이 평형 결합 분석시험으로 측정시, 약 400 nM 이하의 K_d, 150 nM 이하의 K_d 및 일부의 경우 100 nM 이하의 K_d로 인슐린 폴리펩티드 수용체와 결합하도록 배열된다.

중합체의 활성화뿐만 아니라 펩티드의 접합 방법과 화학 작용에 대해서는 문헌에 기술되어 있으며, 당업계에도 공지되어 있다. 흔히 사용되는 중합체의 활성화 방법으로서는, 이에 제한되지는 않으나, 브롬화 시아노겐, 과요오드, 글루타르알데히드, 바이에폭시드, 에피클로로히드린, 디비닐설폰, 카르보디이미드, 설포닐 할라이드, 트리클로로트리아진 등을 사용하여 작용기를 활성화시키는 방법을 포함한다(문헌 [R.F. Taylor, (1991), PROTEIN IMMOBILISATION. FUNDAMENTAL AND APPLICATIONS, Marcel Dekker, N.Y.], [S.S. Wong, (1992), CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING, CRC Press, Boca Raton], [G.T. Hermanson et al., (1993), IMMOBILIZED AFFINITY LIGAND TECHNIQUES, Academic Press, N.Y.], [Dunn, R.L., et al., Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol.469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991] 참조).

PEG의 작용화 및 콘쥬게이션(접합)에 대한 수개의 리뷰와 논문들을 참조할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Harris, Macromol. Chem. Phys. C25:325-373 (1985)], [Scouten, Methods in Enzymology 135:30-65 (1987)], [Wong et al., Enzyme Microb. Technol. 14:866-874 (1992)], [Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9:249-304 (1992)], [Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6: 150-165 (1995)]을 참조할 수 있다.

중합체의 활성화 방법에 대해서는 WO 94/17039, 미국 특허 제5,324,844호, WO 94/18247, WO 94/04193, 미국 특허 제5,219,564호, 미국 특허 제5,122,614호, WO 90/13540, 미국 특허 제5,281,698호, 및 WO 93/15189를 참조할 수 있고, 활성화된 중합체와 효소 간의 접합의 경우에는, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 응집 인자(Coagulation Factor) VIII(WO 94/15625 참조), 헤모글로빈(WO 94/09027 참조), 산소 운반 분자(미국 특허 제4,412,989호 참조), 리보뉴클레아제(ribonuclease) 및 초과산화물(superoxide) 디스뮤타아제(문헌 [Veronese et al., App. Biochem. Biotech. 11: 141-45 (1985)] 참조)의 내용에 대해서는 각각의 참조 문헌을 참조한다. 인용된 모든 참고 문헌들과 특허는 본 명세서에 참고로 포함된다.

비천연적으로 코딩된 아미노산, 예컨대 p-아지도-L-페닐알라닌을 함유하는 인슐린 폴리펩티드의 PEG화(즉, 임의의 수용성 중합체의 첨가)는 임의의 적절한 방법에 의해 수행된다. 예를 들어, 인슐린 폴리펩티드는 알킨-종결 mPEG 유도체로 PEG화된다. 간략하게는, 실온에서 과량의 고체 mPEG(5000)-O-CH₂-C≡CH를 교반하면서 p-아지도-L-Phe 함유 인슐린 폴리펩티드의 수용액에 첨가한다. 통상, 이 수용액은 반응이 수행되는 pH(일반적으로, 약 pH 4-10) 근방의 pK_a를 갖는 완충제로 완충된다. pH 7.5에서 PEG화하기에 적절한 완충제의 예로서는, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, HEPES, 포스페이트, 보레이트, TRIS-HCl, EPPS 및 TES를 포함한다. pH를 연속적으로 모니터링하여 필요에 따라 조절한다. 반응은 보통 약 1-48 시간 동안 지속한다.

이어서, 반응 생성물에 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하여, 차단되지 않은 PEG가 분자의 양 말단에서 활성화되는 경우에 형성될 수 있는 PEG화된 인슐린 폴리펩티드의 임의의 고분자량 복합체 및 유리 mPEG(5000)-O-CH₂-C≡CH로부터 PEG화된 인슐린 폴리펩티드 변이체를 분리시켜, 인슐린 폴리펩티드 변이체 분자들을 가교 결합시킨다. 소수성 상호작용 크로마토그래피 수행시 조건들은, 유리 mPEG(5000)-O-CH₂-C≡CH를 컬럼을 통해 흘러보내면서, 하나 이상의 PEG 기에 접합된 하나의 인슐린 폴리펩티드 변이체 분자를 포함하는 임의의 가교 결합된 PEG화 인슐린 폴리펩티드 변이체 복합체를 원하는 형태를 따라 용출시키는 것이다.적절한 조건은 가교 결합된 복합체:원하는 접합체의 상대적 크기에 따라 다르며, 당업자에 의해 용이하게 결정된다. 원하는 접합체를 함유하는 용출액을 한외여과에 의해 농축시키고, 정용여과에 의해 탈염시킨다.

필요하다면, 소수성 크로마토그래피로부터 수득한 PEG화된 인슐린 폴리펩티드를 당업자에게 공지된 하나 이상의 절차, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 친화성 크로마토그래피; 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피(DEAE 세파로스를 사용하는 것을 포함하며 이에 한정되지 않음); 실리카 상 크로마토그래피; 역상 HPLC; 겔 여과(세파덱스 G-75를 사용하는 것을 포함하며 이에 한정되지 않음); 소수성 상호작용 크로마토그래피; 크기 배제 크로마토그래피, 금속 킬레이트 크로마토그래피; 한외여과/정용여과: 에탄올 침전; 황산암모늄 침전; 크로마토포커싱; 치환 크로마토그래피; 전기영동 절차(분취 등점 집초법을 포함하며 이에 한정되지 않음), 용해도 차이를 이용한 방법(황산암모늄 침전을 포함하며 이에 한정되지 않음), 또는 추출을 비롯한 절차를 사용하여 추가로 정제할 수 있다. 겉보기 분자량은 구형 단백질 표준과의 비교에 의한 GPC를 이용해 추정할 수 있다(문헌 [Prenta, AZ in PROTEIN PURIFICATION METHODS, A PRACTICAL APPROACH (Harris & Angal, Eds.) IRL Press 1989, 293-306] 참조). 인슐린-PEG 접합체의 순도는 단백질 분해성 분해(트립신 분해를 포함하며 이에 한정되지 않음) 후, 질량 분석법을 이용한 분석시험에 의해 평가될 수 있다. 문헌 [Pepinsky RB., et al., J. Pharmacol. & Exp. Ther. 297 (3): 1059-66 (2001)]을 참조할 수 있다.

본 발명의 인슐린 폴리펩티드의 아미노산에 결합된 수용성 중합체는 추가로 유도체화되거나 치환될 수 있으며, 이에 제한은 없다.

아지드 함유 PEG 유도체

본 발명의 또 다른 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 비천연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄 상에 존재하는 알킨 부분과 반응하게 되는 아지드 부분을 함유하는 PEG 유도체를 사용하여 변형된다. 일반적으로, PEG 유도체는 평균 분자량이 1-100 kDa 범위, 일부 실시 양태에서는 10-40 kDa 범위이다.

일부 실시 양태에서, 아지드-말단 PEG 유도체는 하기의 구조를 가진다.

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-N₃

상기 식 중,

또 다른 실시 양태에서, 아지드-말단 PEG 유도체는 하기의 구조를 가진다.

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-NH-C(O)-(CH₂)_p-N₃

상기 식 중,

R은 단순한 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이며, p는 2-10이고, n은 100-1,000(즉, 평균 분자량은 5-40 kDa임)이다.

본 발명의 또 다른 실시 양태에서, 알킨 함유 아미노산을 포함하는 인슐린 폴리펩티드는 말단 아지드 부분을 함유하는 분지형 PEG 유도체를 사용하여 변형되며, 여기서 이러한 분지형 PEG의 각 사슬의 MW는 10-40 kDa 범위, 5-20 kDa 범위일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시 양태에서, 아지드-말단 PEG 유도체는 하기의 구조를 가진다.

[RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)]₂CH(CH₂)_m-X-(CH₂)_pN₃

상기 식 중,

R은 단순한 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이며, p는 2-10이고, n은 100-1,000이며, X는 O, N, S 또는 카르보닐기(C=O)일 수 있고, 각각의 경우 존재하거나 또는 존재하지 않을 수 있다.

알킨 함유 PEG 유도체

본 발명의 또 다른 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 비천연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄 상에 존재하는 아지드 부분과 반응하게 되는 알킬 부분을 함유하는 PEG 유도체를 사용하여 변형된다.

일부 실시 양태에서, 알킨-말단 PEG 유도체는 하기의 구조를 가진다.

상기 식 중,

본 발명의 또 다른 실시 양태에서, 알킨 함유의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 인슐린 폴리펩티드는 아미드 결합에 의해 PEG 백본에 결합된 말단 아지드 부분 또는 말단 알킨 부분을 함유하는 PEG 유도체를 사용하여 변형된다.

상기 식 중,

R은 단순한 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이며, p는 2-10이고, n은 100-1,000이다.

본 발명의 또 다른 실시 양태에서, 아지드 함유 아미노산을 포함하는 인슐린 폴리펩티드는 말단 알킨 부분을 함유하는 분지형 PEG 유도체를 사용하여 변형되며, 이러한 분지형 PEG의 각 사슬의 MW는 10-40 kDa 범위, 5-20 kDa 범위일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시 양태에서, 알킨-말단 PEG 유도체는 하기의 구조를 가진다.

상기 식 중,

R은 단순한 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이며, p는 2-10이고, n은 100-1,000이며, X는 O, N, S 또는 카르보닐기(C=O)일 수 있거나 또는 존재하지 않을 수 있다.

포스핀 함유 PEG 유도체

본 발명의 또 다른 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 비천연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄 상에 존재하는 아지드 부분과 반응하게 되는 아릴 포스핀 기를 추가로 포함하는 활성화된 작용기(에스테르, 카르보네이트를 포함하며 이에 한정되지 않음)를 함유하는 PEG 유도체를 사용하여 변형된다. 일반적으로, PEG 유도체는 1-100 kDa 범위, 일부 실시 양태에서는, 10-40 kDa 범위의 평균 분자량을 가진다.

일부 실시 양태에서, PEG 유도체는 하기의 구조를 가진다.

상기 식 중,

n은 1-10이고, X는 O, N, S일 수 있거나 또는 존재하지 않을 수 있으며, Ph는 페닐이고, W는 수용성 중합체이다.

일부 실시 양태에서, PEG 유도체는 하기의 구조를 가진다.

상기 식 중,

X는 O, N, S일 수 있거나 또는 존재하지 않을 수 있고, Ph는 페닐이며, W는 수용성 중합체이고, R은 H, 알킬, 아릴, 치환된 알킬 및 치환된 아릴 기일 수 있다. 예시적인 R 기로서는, 이에 제한되지는 않으나, -CH₂, -C(CH₃)₃, -OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -C(O)R', -CONR'R", -S(O)₂R', -S(O)₂NR'R", -CN 및 -NO₂를 포함한다. R', R", R"' 및 R""는 각각 독립적으로 수소, 치환되거나 또는 치환되지 않은 헤테로알킬, 치환되거나 치환되지 않은 아릴, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 1-3 개의 할로겐으로 치환된 아릴, 치환되거나 또는 치환되지 않은 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시 기 또는 아릴알킬 기를 지칭한다. 본 발명의 화합물이 하나 이상의 R 기를 포함하는 경우, 예를 들어, 각각의 R기는 R', R", R"' 및 R"" 중 하나 이상의 기가 존재하는 경우의 R', R", R"' 및 R"" 기와 마찬가지로 독립적으로 선택된다. R' 및 R"가 동일한 질소 원자에 부착되는 경우, 이들은 질소 원자와 결합하여 5원, 6원 또는 7원 고리를 형성할 수 있다. 예를 들어, -NR'R"는 이에 제한되지는 않지만, 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함하는 것을 의미한다. 상기 논의한 치환기의 내용으로부터, 당업자라면 "알킬"이라는 용어가 수소 기 이외의 기에 결합된 탄소 원자를 포함하는 기, 예컨대 할로알킬(-CF₃ 및 -CH₂CF₃를 포함하며 이에 한정되지 않음) 및 아실(-C(O)CH₃, -C(O)CF₃, -C(O)CH₂OCH₃ 등을 포함하며 이에 한정되지 않음)을 포함한다는 의미를 알 수 있을 것이다.

기타 PEG 유도체 및 일반적인 PEG 화 기법

인슐린 폴리펩티드에 결합될 수 있는 기타 예시적인 PEG 분자들뿐만 아니라 PEG화 방법에 대해서는, 예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 공보 2004/0001838: 2002/0052009; 2003/0162949; 2004/0013637; 2003/0228274; 2003/0220447; 2003/0158333; 2003/0143596; 2003/0114647; 2003/0105275; 2003/0105224; 2003/0023023; 2002/0156047; 2002/0099133; 2002/0086939; 2002/0082345; 2002/0072573; 2002/0052430; 2002/0040076; 2002/0037949; 2002/0002250; 2001/0056171; 2001/0044526; 2001/0021763; 미국 특허 제6,646,110호, 제5,824,778호, 제5,476,653호, 제5,219,564호, 제5,629,384호, 제5,736,625호, 제4,902,502호, 제5,281,698호, 제5,122,614호, 제5,473,034호, 제5,516,673호, 제5,382,657호, 제6,552,167호, 제6,610,281호, 제6,515,100호, 제6,461,603호, 제6,436,386호, 제6,214,966호, 제5,990,237호, 제5,900,461호, 제5,739,208호, 제5,672,662호, 제5,446,090호, 제5,808,096호, 제5,612,460호, 제5,324,844호, 제5,252,714호, 제6,420,339호, 제6,201,072호, 제6,451,346호, 제6,306,821호, 제5,559,213호, 제5,747,646호, 제5,834,594호, 제5,849,860호, 제5,980,948호, 제6,004,573호, 제6,129,912호; WO 97/32607, EP 229,108, EP 402,378, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28024, WO 95/00162, WO 95/11924, W0 95/13090, WO 95/33490, WO 96/00080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/32134, WO 99/32139, WO 99/32140, WO 96/40791, WO 98/32466, WO 95/06058, EP 439 508, WO 97/03106, WO 96/21469, WO 95/13312, EP 921 131, WO 98/05363, EP 809 996, WO 96/41813, WO 96/07670, EP 605 963, EP 510 356, EP 400 472, EP 183 503 및 EP 154 316에 기재된 것들을 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 PEG 분자는 임의의 형태, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 단일 사슬, 분지형 사슬, 멀티암형 사슬, 단일작용성, 이작용성, 다작용성 형태 또는 이들을 임의의 조합한 형태로 사용할 수 있다.

추가의 중합체 및 PEG 유도체, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 히드록실아민 (아미노옥시) PEG 유도체들은 본원에 그 내용 전체가 참고로 포함되는 하기의 특허 출원들에 기술되어 있다: 미국 특허 공보 2006/0194256, 미국 특허 공보 2006/0217532, 미국 특허 공보 2006/0217289, 미국 가특허 출원 60/755,338; 미국 가특허 출원 60/755,711; 미국 가특허 출원 60/755,018; 국제 특허 출원 PCT/US06/49397; WO 2006/069246; 미국 가특허 출원 60/743,041; 미국 가특허 출원 60/743,040; 국제 특허 출원 PCT/US06/47822; 미국 가특허 출원 60/882,819; 미국 가특허 출원 60/882,500; 및 미국 가특허 출원 60/870,594.

이종성 Fc 융합 단백질

상기 기술된 인슐린 화합물은 면역글로불린의 Fc 부분에 직접적으로 또는 펩티드 링커를 통해서 융합될 수 있다. 면역글로불린은 보통 2개의 경쇄와 2개의 중쇄를 가지며, 이황화 결합에 의해 함께 뭉친 폴리펩티드 사슬을 포함하는 분자이다. 각 사슬에서, 하나의 도메인(V)은 분자의 항체 특이성에 의존하는 가변 아미노산 서열을 가진다. 나머지 하나의 도메인(C)은 동일한 부류의 분자에 공통적인 불변 서열을 가진다.

본원에서, 면역글로불린의 Fc 부분은 면역학 분야의 용어에 통상적으로 주어진 의미를 지닌다. 특히, 이 용어는 항체로부터 2개의 항원 결합 영역(Fab 단편)을 제거하여 수득되는 항체 단편을 지칭한다. Fab 단편을 제거하는 한 방법은 파파인 프로테아제로 면역글로불린을 소화시키는 것이다. 따라서, Fc 부분은 두 중쇄로부터 불변 영역의 단편과 대략 동일한 크기로 형성되며, 이는 비공유 상호작용과 이황화 결합을 통해 결합된다. Fc 부분은 경첩 영역을 포함하여 CH₂ 및 CH₃ 도메인을 통해 항체의 C-말단까지 신장될 수 있다. 인간과 마우스 면역글로불린에 대한 예시적인 경첩 영역에 대해서는 그 교시가 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Antibody Engineering, A Practical Guide, Borrebaeck, C.A.K., ed., W.H. Freeman and Co., 1992]을 참고할 수 있다. Fc 부분은 하나 이상의 글리코실화 부위를 더 포함할 수 있다. 경첩 영역, CH₂ 및 CH₃ 도메인 및 하나의 N-글리코실화 부위를 포함하는 다양한 예시적인 Fc 단백질의 아미노산 서열은 당업계에 잘 알려져 있다.

서로 다른 효과기 기능과 약동학적 특성을 갖는 5가지 유형의 인간 면역글로불린 Fc 영역이 존재한다: IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE. IgG는 혈청 중에 가장 풍부하게 존재하는 면역글로불린이다. IgG도 임의의 면역글로불린 혈청 중에서 가장 긴 반감기(23일)를 가진다. 다른 면역글로불린과는 달리, IgG는 Fc 수용체에 결합한 후 효율적으로 재순환된다. 서로 다른 효과기 기능을 보유하는 4개의 IgG 하위 부류인 G1, G2, G3 및 G4가 존재한다. G1, G2 및 G3은 Clq에 결합하여 보체를 고정시킬 수 있지만, G4는 그럴 수 없다. G3이 G1보다 더 효율적으로 Clq에 결합할 수 있지만, G1은 보체 주재의 세포 용해를 매개하는데에는 더 효율적이다. G2는 매우 비효율적으로 보체를 고정시킨다. IgG 내의 Clq 결합 부위는 CH₂ 도메인의 카르복시 말단 영역에 위치한다.

모든 IgG 하위 부류는 Fc 수용체(CD 16, CD32, CD64)에 결합할 수 있으며, 그 중 G1과 G3이 G2와 G4 보다 더 효율적이다. IgG의 Fc 수용체 결합 영역은 CH₂ 도메인의 경첩 영역과 카르복시 말단 영역 양자 모두에 위치한 잔기들로 형성된다.

IgA는 J-사슬에 의해 함께 뭉쳐 단량체 또는 이량체 형태 양자 모두의 형태로 존재할 수 있다. IgA는 혈청 중에 두 번째로 풍부한 Ig이긴 하나, 그 반감기는 단 6일밖에 되지 않는다. IgA는 3가지의 효과기 기능을 가지고 있다. 이것은 대식 세포 및 호산구 상의 IgA 특이적 수용체에 결합하여, 각각 식세포 작용과 탈과립화를 유발한다. 이것은 또한 알려지지 않은 대체 경로를 통해 보체를 고정시킬 수도 있다.

IgM은 오량체 또는 육량체로 발현되며, 양자 모두 J-사슬에 의해 결합된다. IgM은 5일의 혈청 반감기를 가진다. 이것은 그의 CH3 도메인에 위치한 결합 부위를 통해 Clq에 약하게 결합한다. IgD는 3일의 혈청 반감기를 가진다. 어떤 효과기 기능이 이러한 Ig에 기인하는지는 불분명하다. IgE는 단량체성 Ig이며 2.5일의 혈청 반감기를 가진다. IgE는 탈과립화를 유발하는 2개의 Fc 수용체에 결합하여 염증 유발 인자들의 방출을 야기시킨다.

원하는 생체 내 효과에 따라, 본 발명의 이종성 융합 단백질은 상기 기술된 임의의 동형을 포함할 수 있거나, 또는 보체 및/또는 Fc 수용체 결합 기능이 변형된 돌연변이화된 Fc 영역을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 이종성 융합 단백질은 면역글로불린의 Fc 부분 전체, 면역글로불린의 Fc 부분의 단편, 또는 인터페론-β 화합물에 융합된 이의 유사체를 포함할 수 있다.

본 발명의 융합 단백질은 단일 사슬 단백질 또는 다중 사슬 폴리펩티드로서 이루어질 수 있다. 2개 이상의 Fc 융합 단백질은 이들이 Fc 영역들 간에 자연스레 형성되는 이황화 결합을 통해 상호작용하도록 생성될 수 있다. 이러한 다량체들은 인터페론-β 화합물에 있어서 균질한 상태일 수 있고, 또는 이들은 융합 단백질의 Fc 부분의 N-말단에서 융합된 서로 다른 인터페론-β 화합물을 포함할 수 있다.

융합 단백질의 최종 구조와는 관계없이, Fc 또는 Fc 유사 영역은 N-말단에서 융합된 인터페론-β 화합물의 생체 내 혈장 반감기를 연장하는데 일조할 수 있다. 또한, 융합 단백질 화합물의 인터페론-β 화합물은 인터페론-β의 하나 이상의 생물학적 활성을 보유해야 한다. 치료 반감기 또는 순환 반감기의 증가는 본원에 기술된 방법 또는 당업계에 공지된 방법에 입증될 수 있는데, 여기서 융합 단백질의 반감기는 인터페론-β 화합의 반감기와 단독으로 비교된다. 생물학적 활성은 당업계에 공지된 시험관 내 방법과 생체 내 방법으로 측정될 수 있다.

단백질 분해에 의해 생성된 IgG의 Fc 영역이 온전한 IgG 분자와 생체 내 반감기가 동일하고 Fab 단편이 신속하게 분해되기 때문에, 반감기를 연장하는 관련 서열은 CH₂ 및/또는 CH₃ 도메인 내에 주재하고 있는 것으로 생각된다. 또한, 문헌에서는 높은 친화성을 갖는 Fc 수용체 또는 Clq와 결합하지 않는 IgG 변이체의 이화 속도가 야생형인 모 항체의 클리어랜스 속도와 별다르지 않다고 밝혀졌는데, 이는 그 이화 부위가 Fc 수용체 또는 Clq 결합과 관련된 부위와는 다르다는 사실을 말해준다(문헌 [Wawrzynczak et al., (1992) Molecular Immunology 29:221] 참조). 쥐과의 IgG1 Fc 영역을 이용한 특정 부위 돌연변이 유발 연구는 이화 속도를 조절하는 IgG1 Fc 영역의 부위가 CH₂-CH₃ 도메인 계면에 위치하고 있음을 시사하고 있다. Fc 영역은 융합 단백질의 반감기를 최적화하기 위해 이화 부위에서 변형될 수 있다. 본 발명의 융합 단백질을 위해 사용되는 Fc 영역은 IgG1 또는 IgG4 Fc 영역으로부터 유도될 수 있으며, 경첩 영역을 포함하는 CH₂ 영역과 CH₃ 영역 모두를 포함할 수 있다.

이종성 알부민 융합 단백질

본 명세서에 기술된 인슐린은 직접적으로 또는 펩티드 링커, 수용성 중합체 또는 프로드러그 링커를 통해 알부민 또는 이의 유사체, 이의 단편 또는 이의 유도체에 융합될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 융합 단백질의 일부분인 알부민 단백질은 인간을 비롯한 임의의 종으로부터 클로닝된 알부민으로부터 유도될 수 있다. 인간 혈청 알부민(HSA)은 585개의 아미노산으로 된 단일 비글리코실화 폴리펩티드 사슬로 이루어지며, 그 구조식 분자량은 66,500이다. 인간 HSA의 아미노산 서열은 공지되어 있다(본원에 참고로 포함되는 문헌 [Meloun, et al., (1975) FEBS Letters 58:136], [Behrens, et al., (1975) Fed. Proc. 34:591], [Lawn, et al., (1981) Nucleic Acids Research 9:6102-6114], [Minghetti, et al., (1986) J. Biol. Chem. 261:6747] 참조). 알부민의 다양한 다형성 변이체뿐만 아니라 그의 유사체 및 단편들도 기술된 바 있다(문헌 [Weitkamp, et al., (1973) Ann. Hum. Genet. 37:219] 참조). 예를 들어, EP 322,094에서는, 더 짧은 형태의 다양한 HSA가 개시되었다. 이러한 HSA 단편들의 일부, 예컨대 HSA(1-373), HSA(1-388), HSA(1-389), HSA(1-369) 및 HSA(1-419) 그리고 1-369 내지 1-419 사이의 단편들이 개시되었다. EP 399,666은 HSA(1-177) 및 HSA(1-200)를 포함하는 알부민 단편들, 그리고 HSA(1-177) 내지 HSA(1-200) 사이의 단편들을 개시하고 있다.

본 발명의 이종성 융합 단백질은 임의의 알부민 단백질(단편, 유사체 및 유도체 포함)에 커플링된 인슐린 화합물을 포함하는 것으로 이해해야 하며, 여기서 이러한 융합 단백질은 생물학적으로 활성이고, 인슐린 화합물 단독일 때보다 혈장 반감기가 더 길다. 따라서, 융합 단백질의 알부민 부분의 혈장 반감기는 반드시 본래 인간 알부민의 혈장 반감기와 동일할 필요는 없다. 단편, 유사체 및 유도체들은 공지되어 있거나, 또는 본래 인간 알부민 및 해당 인슐린 화합물의 반감기보다 길게끔 또는 그것의 절반 정도가 되게끔 생성될 수 있다.

본 발명의 이종성 융합 단백질은 인슐린 화합물 및/또는 융합 단백질의 Fc 부분 또는 알부민 부분에 보존적 아미노산 치환물을 갖는 단백질을 포함한다. "보존적 치환"이라는 것은 하나의 아미노산을 동일한 알짜 전하 및 대략적으로 동일한 크기와 형태를 갖는 또 다른 아미노산으로 치환하는 것을 말한다. 지방족 또는 치환된 지방족 아미노산 측쇄를 가지는 아미노산은 측쇄에 탄소와 헤테로원자의 총수가 약 4개 정도 밖에 차이가 나지 않는 경우에 대략적으로 동일한 크기를 가진다. 이들은 측쇄에 분지 수가 1개 정도 밖에 차이가 나지 않는 경우에 대략적으로 동일한 형태를 가진다. 측쇄에 페닐 또는 치환된 페닐기를 갖는 아미노산은 대략 동일한 크기와 형태를 가지는 것으로 간주된다. 본원에 특별하게 달리 제공되지 않는 경우를 제외하고는, 보존적 치환은 자연 발생 아미노산으로 행해지는 것이 바람직하다.

야생형 알부민 및 면역글로불린 단백질은 다양한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 이러한 단백질들은 해당 mRNA를 검출가능한 수준으로 발현하는 조직 또는 세포로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 얻어질 수 있다. 라이브러리는 특정 해당 단백질에 대하여 공개된 DNA 또는 단백질 서열을 사용하여 고안된 프로브로 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 불변 영역에 대해서는 문헌 [Adams, et al., (1980) Biochemistry 19: 2711-2719], [Goughet, et al., (1980) Biochemistry 19: 2702-2710], [Dolby, et al., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 6027-6031], [Rice et al., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7862-7862], [Falkner, et al., (1982) Nature 298: 286-288] 및 [Morrison, et al., (1984) Ann. Rev. Immunol. 2: 239-256]에서 기술하고 있다. 알부민 단백질과 DNA 서열을 개시하고 있는 일부 참조 문헌으로는, 문헌 [Meloun, et al., (1975) FEBS Letters 58: 136], [Behrens, et al., (1975) Fed. Proc. 34: 591], [Lawn, et al., (1981) Nucleic Acids Research 9: 6102-6114] 및 [Minghetti, et al., (1986) J. Biol. Chem. 261: 6747]을 포함한다.

본 발명의 이종성 융합 단백질의 특성 규명

본 발명의 융합 단백질의 특성을 규명하기 위해 다양한 방법들을 사용할 수 있다. 이러한 방법들 중 일부로서, 이에 제한되지는 않지만, 단백질 염색법과 커플링된 SDS-PAGE 또는 항-IgG 또는 항-HSA 항체를 이용한 면역블롯팅을 포함한다. 기타 방법으로서는, 예를 들어, 매트릭스 보조된 레이저 탈착/이온화 질량분석법(MALDI-MS), 액체 크로마토그래피/질량 분광법, 등전점 집초법, 음이온 교환 분석법, 크로마토포커싱 및 원편광 이색성 분광 분석법을 포함한다.

혈청 알부민에 대한 친화성 향상

다양한 분자들을 본 발명의 인슐린 폴리펩티드에 융합시켜 혈청 중 인슐린 폴리펩티드의 반감기를 조절할 수도 있다. 일부 실시 양태에서, 분자들을 본 발명의 인슐린 폴리펩티드에 결합시키거나 융합시켜 동물의 내인성 혈청 알부민에 대한 친화성을 향상시킨다.

일부의 경우를 예를 들면, 인슐린 폴리펩티드와 알부민 결합 서열로 된 재조합 융합체가 제조된다. 예시적인 알부민 결합 서열로서는, 이에 제한되지는 않지만, 연쇄상구균성(streptococcal) 단백질 G의 알부민 결합 도메인(예를 들어, 문헌 [Makrides et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 277:534-542 (1996)] 및 [Sjolander et al., J, Immunol. Methods 201:115-123 (1997)] 참조), 또는 알부민 결합 펩티드(예컨대, 문헌 [Dennis, et al., J. Biol. Chem. 277:35035-35043 (2002)]에 기재된 것들)을 포함한다.

다른 실시 양태에서, 본 발명의 인슐린 폴리펩티드는 지방산으로 아실화된다. 일부의 경우, 지방산은 혈청 알부민에 대한 결합을 촉진시킨다. 예를 들어, 문헌 [Kurtzhals, et al., Biochem. J. 312: 725-731 (1995)]을 참조할 수 있다.

다른 실시 양태에서, 본 발명의 인슐린 폴리펩티드는 혈청 알부민(인간 혈청 알부민을 포함하며 이에 한정되지 않음)에 직접적으로 융합된다. 당업자라면 광범위하게 다양한 다른 분자들 또한 본 발명의 인슐린에 결합시켜 혈청 알부민 또는 다른 혈청 성분에 대한 결합을 조절할 수 있다는 점을 알 수 있을 것이다.

인슐린 폴리펩티드의 글리코실화

본 발명은 사카라이드 잔기를 보유하는 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 도입한 인슐린 폴리펩티드를 포함한다. 사카라이드 잔기는 천연 물질(N-아세틸글루코사민을 포함하며 이에 한정되지 않음) 또는 비천연 물질(3-플루오로갈락토스를 포함하며 이에 한정되지 않음)일 수 있다. 사카라이드는 N-결합 또는 O-결합 글리코시드 결합(N-아세틸갈락토오스-L-세린을 포함하며 이에 한정되지 않음) 또는 비천연 결합(옥심 또는 이에 대응하는 C-결합 또는 S-결합 글리코시드를 포함하며 이에 한정되지 않음)에 의하여 비천연적으로 코딩된 아미노산에 결합될 수 있다.

사카라이드(글리코실을 포함하며 이에 한정되지 않음) 부분은 생체 내 또는 시험관 내에서 인슐린 폴리펩티드에 부가될 수 있다. 본 발명의 일부 실시 양태에서, 카르보닐 함유의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 인슐린 폴리펩티드는 아미노옥시기로 유도체화된 사카라이드를 이용해 변형되어 옥심 결합을 통해 결합된 해당 글리코실화 폴리펩티드를 생성한다. 사카라이드가 일단 비천연적으로 코딩된 아미노산에 부착되면, 당전이효소 및 기타 효소에 의해 추가로 정교하게 처리하여 인슐린 폴리펩티드에 결합된 올리고사카라이드를 생성할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [H. Liu, et al., J. Ain. Chin. Soc. 125:1702-1703 (2003)]을 참조할 수 있다.

본 발명의 일부 실시 양태에서, 카르보닐 함유의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 인슐린 폴리펩티드는 아미노옥시 유도체로 제조된 정해진 구조를 갖는 글리칸을 사용하여 직접적으로 변형된다. 당업자라면 기타의 작용기, 예컨대 아지드, 알킨, 히드라지드, 히드라진 및 세미카르바지드를 사용하여 사카라이드를 비천연적으로 코딩된 아미노산에 결합시킬 수 있다는 점을 알 수 있을 것이다.

본 발명의 일부 실시 양태에서, 아지드 또는 알키닐 함유의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 인슐린 폴리펩티드는, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 각각 알키닐 또는 아지드 유도체와의 휘스겐 [3 + 2] 시클로 부가 반응(이에 제한되지는 않음)에 의해 변형될 수 있다. 이 방법으로 단백질을 매우 높은 선택성을 갖게끔 변형할 수 있다.

인슐린 이량체 및 다량체

또한, 본 발명은 인슐린 및 인슐린 유사체의 조합물, 예컨대 동종이량체, 이종이량체, 동종다량체 또는 이종다량체(즉, 삼량체, 사량체 등)를 제공하는데, 여기서 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 인슐린은, 직접적으로 폴리펩티드 백본으로 또는 링커를 통해서, 또 다른 인슐린 또는 이의 인슐린 변이체, 또는 인슐린 또는 이의 인슐린 변이체가 아닌 임의의 다른 폴리펩티드에 결합된다. 인슐린 이량체 또는 다량체 접합체는 단량체에 비해 증가된 분자량 때문에, 단량체성 인슐린에 비하여 신규한 또는 바람직한 특성들, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 상이한 약리학적 특성, 약동학적 특성, 약력학적 특성, 조절된 치료 반감기, 또는 조절된 혈장 반감기를 나타낼 수 있다. 단량체성 인슐린 유사체의 예에 대해서는, 예를 들어, 미국 특허 제5,164,366호(Balschmidt, P., et al., 1992. 11. 17 등록); 미국 특허 제5,618,913호(Brange, J., et al., 1997. 4. 8 등록); 미국 특허 제5,514,646호(Chance, R.E., et al., 1996. 5. 7 등록); 및 EPO 공보 885,961(Ertl, J., et al., 1998. 12. 23)을 참조한다. 본 발명의 일부 실시 양태는 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산 잔기를 함유하는 단량체성 인슐린 유사체를 제공하며, 일부 실시 양태에서, 이들은 B28 위치가 Asp, Lys, Ile, Leu, Val 또는 Ala이고 B29 위치의 아미노산 잔기가 Lys 또는 Pro인 단량체성 인슐린 유사체; Lys(B28)Pro(B29)-인간 인슐린을 갖는 단량체성 인슐린 유사체; 인간 인슐린; 단량체성 인슐린 유사체 Asp(B28)-인간 인슐린; 및 단량체성 인슐린 유사체 Lys(B3)Ile(B28)-인간 인슐린을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 본 발명의 인슐린 이량체는 인슐린 수용체의 신호 전달을 조절하게 될 것이다. 다른 실시 양태에서, 본 발명의 인슐린 이량체 또는 다량체는 인슐린 수용체 길항제, 작용제 또는 조절제로서 작용할 것이다.

일부 실시 양태에서, 이량체 또는 다량체를 포함하는 인슐린 내에 존재하는 하나 이상의 인슐린 분자는 수용성 중합체에 결합된 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다.

일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드는 예컨대 이에 제한되지는 않으나, Asn-Lys 아미드 결합 또는 Cys-Cys 이황화 결합을 통해 직접 결합된다. 일부 실시 양태에서, 인슐린 폴리펩티드 및/또는 결합된 비인슐린 분자는 상이한 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하여 이합체화를 용이하게 하며, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 제1 인슐린 폴리펩티드의 한 개의 비천연적으로 코딩된 아미노산의 알킨 및 제2 분자의 두 번째의 비천연적으로 코딩된 아미노산의 아지드는 휘스겐 [3 + 2] 시클로 부가를 통해 접합될 것이다. 다르게는, 케톤 함유의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 인슐린 및/또는 결합된 비인슐린 분자는 히드록실아민 함유의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 제2 폴리펩티드에 접합될 수 있으며, 상기 폴리펩티드는 이에 상응하는 옥심의 형성을 통해 반응한다.

다르게는, 2개의 인슐린 폴리펩티드 및/또는 결합된 비인슐린 분자는 링커를 통해 결합된다. 임의의 이종이작용성 또는 동종이작용성 링커는 동일하거나 서로 다른 1차 서열을 가질 수 있는 2개의 분자 및/또는 결합된 비인슐린 분자를 결합시키는데 사용될 수 있다. 일부의 경우, 인슐린 및/또는 결합된 비인슐린 분자를 함께 구속하는데 사용되는 링커는 이작용성 PEG 시약일 수 있다. 링커는 광범위한 분자량 또는 분자 길이를 가질 수 있다. 인슐린과 결합된 실체 간, 또는 인슐린과 그의 수용체 간, 또는 결합된 실체와 그의 결합 파트너 간(존재하는 경우)에 바람직한 공간 관계 또는 형태를 제공하기 위해서는 분자량이 더 크거나 작은 링커를 사용할 수 있다. 또한, 인슐린과 결합된 실체 간, 또는 결합된 실체와 그의 결합 파트너 간(존재하는 경우)에 바람직한 공간 또는 융통성을 제공하기 위해서 분자 길이가 더 길거나 짧은 링커도 사용할 수 있다.

일부 실시 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 아령 구조를 갖는 수용성인 이작용성 링커를 제공한다: a) 중합체 백본의 적어도 제1 말단 상의 아지드, 알킨, 히드라진, 히드라지드, 히드록실아민 또는 카르보닐 함유 부분; 및 b) 적어도 중합체 백본의 제2 말단 상의 제2 작용기. 제2 작용기는 제1 작용기와 동일하거나 서로 다를 수 있다. 일부 실시 양태에서, 제2 작용기는 제1 작용기와 반응하지 않는다. 일부 실시 양태에서, 본 발명은 분지형 분자 구조로 된 하나 이상의 암(arm)을 포함하는 수용성 화합물을 제공한다. 예를 들어, 분지형 분자 구조는 수지상일 수 있다.

일부 실시 양태에서, 본 발명은 하기 구조를 갖는 수용성인 활성화된 중합체와의 반응으로 형성된 하나 이상의 인슐린 폴리펩티드를 포함하는 다량체를 제공한다.

R-(CH₂CH₂O)_n-0-(CH₂)_m-X

상기 식 중,

n은 약 5 내지 3,000이고, m은 2-10이며, X는 아지드, 알킨, 히드라진, 히드라지드, 아미노옥시 기, 히드록실아민, 아세틸 또는 카르보닐 함유 부분일 수 있고, R은 X와 동일하거나 서로 다를 수 있는 캡핑기, 작용기 또는 이탈기이다. R은 예를 들어, 히드록실, 보호된 히드록실, 알콕실, N-히드록시숙신이미딜 에스테르, 1-벤조트리아졸릴 에스테르, N-히드록시숙신이미딜 카르보네이트, 1-벤조트리아졸릴 카르보네이트, 아세탈, 알데히드, 알데히드 수화물, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 활성 설폰, 아민, 아미노옥시, 보호된 아민, 히드라지드, 보호된 히드라지드, 보호된 티올, 카르복실산, 보호된 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 비닐설폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요오도아세트아미드, 에폭시드, 글리옥살, 디온, 메실레이트, 토실레이트, 트레실레이트, 알켄 및 케톤으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기일 수 있다.

인슐린 폴리펩티드 수용체에 대한 인슐린 폴리펩티드의 활성 및 친화성 측정

인슐린 폴리펩티드 활성은 표준 또는 공지된 시험관 내 혹은 생체 내 분석시험을 사용하여 측정할 수 있다. 인슐린 폴리펩티드의 생물학적 활성은 당업계에 공지된 적절한 방법으로 분석할 수 있다. 이러한 분석시험으로서는, 이에 제한되지는 않지만, 문헌 [Meager, J. Immunol. Meth., 261:21-36 (2002)]에 기술된 바와 같이, 인터페론 반응성 유전자의 활성화, 수용체 결합 분석시험, 항바이러스 활성 분석시험, 세포 변성 억제 분석시험(문헌 [Familletti et. al., Meth. Enzymol. 78:387-394] 참조), 항증식성 분석시험(문헌 [Aebersold and Sample, Meth. Enzymol. 119:579-582), 면역조절 분석시험(미국 특허 제4,914,033호, 제4,753,795호) 및 MHC 분자의 유도를 모니터링하는 분석시험(예를 들어, 문헌 [Hokland et al., Meth. Enzymol. 119:688-693] 참조)을 포함한다.

3T3-1 지방세포에서 글루코스 흡수는 하기의 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 3T3-L1 세포는 미국 미생물 보존센터(ATCC, 미국 메릴랜드 주 락빌 소재)에서 입수하였다. 세포를 둘베코 변형 이글 배지 중에 10% 철-풍부 소태아 혈청을 함유하는 성장 배지(GM)에서 배양하였다. 표준적인 지방세포 분화에 있어서는, 세포가 최대 밀도(confluency)에 다다른 후 2일 째(0일로 칭함)에, 세포를 10% 소태아 혈청, 10 ㎍/㎖의 인슐린, 1 μM 덱사메타손 및 0.5 μM 이소부틸메틸크산틴을 함유하는 분화 배지(DM)에서 48시간 동안 놔두었다. 다음으로, 세포를 10% 소태아 혈청 및 10 μg/㎖의 인슐린을 함유하는 후분화 배지에 유지시켰다. 시험관 내 생존 능력은 당업자에게 공지된 글루코스 흡수 분석시험으로 측정될 수 있다. 시험관 내 생존 능력은 세포 기반 분석시험에서 인슐린 화합물의 글루코스 흡수량으로서 정의 될 수 있으며, 인슐린 화합물의 생물학적 능력의 척도이다. 이것은 단일 투여량 반응 실험에서 50% 활성을 유도하는 화합물의 유효 농도인 EC₅₀으로 표현될 수 있다.

0.1 mM 2-데옥시-D-[¹⁴C]글루코스의 축적에 의해 분석되는 글루코스 이동 분석시험(Glucose Transport Assay)--인슐린 의존성 헥소스 흡수(Insulin Dependent--Hexose uptake)는 하기와 같이 측정된다: 12-웰 플레이트의 3T3-L1 지방세포를 37℃로 가온되고 0.2% BSA를 함유하는 KRP 완충제(136 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 10 mM NaPO₄, 0.9 mM CaCl₂, 0.9 mM MgSO₄, pH 7.4)로 2회 세척하고, 0.2% BSA를 함유하는 레이보비츠(Leibovitz's) L-15 배지로 37℃의 실내 공기 중에서 2시간 동안 배양한 후, 0.2% BSA 완충제를 함유하는 KRP로 다시 2회 세척하고, 워트마닌(wortmannin)의 부재(Me₂SO만 존재) 또는 존재 하의 KRP, 0.2% BSA 완충제로 37℃의 실내 공기 중에서 30분 동안 배양한다. 이후, 인슐린을 15분간 최종 농도 100 nM까지 첨가하고, 마지막 4분 동안에 대해서는 2-데옥시-D-[¹⁴C]글루코스 흡수를 측정한다. 10 μM 사이토칼라신(cytochalasin) B의 존재 하에 측정된 비특이적 흡수는 모든 값에서 제외시킨다. 단백질 농도는 피어스 비신코닌산 분석시험(Pierce bicinchoninic acid assay)으로 측정한다. 흡수는 각 실험에 대해 3번 또는 4번 반복하여 측정한다. 인슐린의 존재 하에 FGF-21을 이용한 3T3-L1 지방세포의 단기 및 장기 예비처리의 효과를 조사할 수 있다.

글루코스 이동 분석시험--인슐린 의존성 3T3-L1 섬유아세포(Insulin Independent--3T3-L1 fibroblast)를 96-웰 플레트에 도말하고 지방세포(adipocyte)로 2주 동안 분화시킨다. 분화 후, 이들을 무혈청 배지에서 기근 상태로 한 후 본 발명의 인슐린 폴리펩티드로 24시간 동안 처리한다. 처리시, 세포들을 0.1% BSA를 함유하는 KRBH 완충체로 2회 세척한다. KRBH 완충체 중에서 표지된 글루코스의 존재 하에 글루코스 흡수를 수행한다. 본 발명에 의해 생성된 다양한 인슐린 폴리펩티드 및 이의 유사체, 그리고 본래의 분자의 효율성의 감소를 야기하는 것으로 알려진 PEG화로서 PEG화된 것들에 대해, 서로 다른 인슐린의 효능을 비교함으로써 이들에 대한 정성적 평가가 가능하게 된다. 추가로, 본 발명의 인슐린 폴리펩티드는 체외 조직 모델에서 글루코스 흡수를 유도하는 것으로 나타날 수 있다.

체외 글루코스 이동 모델에서, 글루코스 이동 분석은 하기와 같이 기술한다:

크렙스-헨셀라이트 완충 저장액(Krebs-Henseleit Buffer Stock Solutions)--저장액 1: NaCl(1.16 M); KCl(0.046 M); KH₂PO₄(0.0116 M); NaHCO₃(0.0253 M). 저장액 2: CaCl₂(0.025 M); MgSO₄(2H₂O)(0.0116 M). BSA: 투석을 하지 않고 ICN 콘 분획(Cohn Fraction) V, 지방산 유리 BSA를 직접 사용함. 배지 조제용 물질: 395 ㎖의 dH₂O에 50 ㎖의 크렙스 저장액 1을 첨가하고 95% O₂/5% CO₂로 1시간 동안 통기시킴. 50 ㎖의 저장액 2를 첨가하고 dH₂O로 500 ㎖가 되게 함. 500 ㎎의 ICN 지방산 유리 BSA를 첨가함. 예비배양 및 배양 배지: 32 mM 만니톨, 8 mM 글루코스. 세척 매질: 40 mM 만니톨, 2 mM 피루베이트. 이동 매질: 39 mM 만니톨, 1 mM 2-DG; 32 mM 만니톨, 8 mM 3-O-MG. 인슐린 용액: 최종 농도 2000 μU/㎖ 또는 13.3 nM(돼지 인슐린, 릴리(Lilly) 100,000,000 μU/ml). 방사성 표지 매질 조제용 물질: 특이적 활성에 사용됨: 2-DG = 1.5 mCi/㎖; 3-O-MG = 437 μCi/㎖; 또는 만니톨 = 8 μCi/㎖. 랫트를 체중 100g 당 0.1 cc 농도의 넴뷰탈(Nembutal)로 마취시킨다. 근육 조직을 잘라내어 0.9% 식염수에 헹군 후, 예비배양 배지(2 ㎖)중에서 29℃로 1시간 동안 방치한다. 근육 조직을 배양 배지(2 ㎖; 인슐린 또는 시험 화합물을 포함하는 것을 제외하고 예비배양과 동일함)로 이동시킨 후, 30분 동안(실험 조건에 따라 다름) 배양한다. 다음으로, 근육 조직을 세척 매질(2 ㎖)로 이동시켜 29℃에서 1시간 동안 놔두고, 표지 매질(1.5 ㎖)로 이동시켜 10분(3-0-MG) 또는 20분(2-DG) 동안 놔두었다. 근육 조직을 다듬고 칭량하여 드라이아이스 상의 폴리프로필렌 시험관 내에 놔둔다. 1 ㎖의 1N KOH를 상기 시험관에 첨가한 후, 이 시험관을 70℃의 수조에 10-15분간 방치하고, 수분 간격으로 이 시험관을 볼텍싱한다. 상기 시험관을 얼음에서 냉각시키고 1 ㎖의 1N HCl을 첨가한 후, 잘 혼합한다. 다음으로, 200 ㎕의 상청액을 2개의 똑같은 신틸레이션 바이알에 담고 공지된 방사성 표준과 비교하는 신틸레이션 계수기로 숫자를 셈한다.

근육 수축을 위해 먼저 예비배양/배양 배지 중에서 1시간 동안 배양한다. 1시간 후, 각 쌍 중 하나의 근육(랫트 한 마리 당 한 쌍)을 자극 장치에 고정시키고 나머지 한 근육은 새 배양 배지 플라스크로 이동시킨다. 수축된 근육은 70 Hz의 200 m/sec 트레인(train)으로 자극되는데, 각 자극은 0.1 m/sec의 트레인으로 수행된다. 상기 트레인은 10-15 V에서 2×10분 동안 전달되는데, 1분의 휴지 간격이 있다. 자극기의 마지막에, 근육을 자극 장치로부터 제거하고 세척 매질에 10분 동안 놔둔 후, 상기 개괄된 바와 같은 표지 매질에 방치한다.

본 발명의 인슐린 유사체를 생성하는데 어느 방법이 사용되는가와는 상관없이, 유사체들은 생물학적 활성 분석시험을 거친다. 삼중 수소화 티미딘 분석시험이 세포 분열의 정도를 확인하기 위해 수행될 수 있다. 그러나, 다른 생물학적 분석시험도 원하는 활성을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 인슐린 폴리펩티드의 항바이러스 활성 및/또는 항증식성 활성에 대해서 분석할 수 있다. 항증식성 분석시험에 대해서는 당업자에게 공지되어 있다. 문헌 [Basu et al., in Bioconjugate Chem (2006) 17:618-630]은 증식 정도를 측정하기 위해 A549 세포와 MTT를 이용하는 항증식성 분석시험에 대해 기술하고 있다. 바이러스 복제를 억제하는 능력을 분석하는 것과 같은 생물학적 분석시험도 인슐린 활성의 척도를 제공한다. 당업자에게 공지된 분석시험들도 본 발명의 인슐린 폴리펩티드의 생물학적 활성과 잠재하는 부작용을 평가하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 인슐린, 인슐린 폴리펩티드 및/또는 인슐린 유사체의 평균적인 양은 다양할 수 있으며, 특히 자격이 있는 전문의사의 권고 및 처방에 따라야 할 것이다. 본 발명의 인슐린, 인슐린 폴리펩티드 및/또는 인슐린 유사체의 정확한 양은 치료될 질환의 정확한 유형 및/또는 중증도, 치료될 환자의 상태뿐만 아니라, 조성물 내의 다른 성분들과 같은 요인들에 따른 선호의 문제이다. 또한, 본 발명은 또 다른 활성제의 치료적 유효량을 투여하는 것에 대한 내용을 제공한다. 투여될 양은 인슐린, 이용가능한 인슐린 요법 및/또는 기타 인슐린 유사체를 이용한 요법을 기초로 하여 당업자라면 쉽게 결정할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 통상적인 방식으로 제조될 수 있다.

하기 실시예들은 예시를 위해 제공되는 것이지, 청구된 본 발명을 제한하려는 것은 아니다.

실시예 1

본 실시예는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 인슐린 내로 도입할 때, 그 도입 부위를 선택함에 있어서 다양하게 가능한 기준들 중의 하나를 기술한다.

도 1은 인슐린의 구조와 서열(NP_000198 - 인간 단백질 엑세스 번호)을 나타내며, 하기의 표는 인간 인슐린 서열의 전체 길이인 서열번호 13, 리더를 제외한 인간 인슐린 서열 전체 길이인 서열번호 14를 포함하며, 서열번호 1-12는 인슐린, 리스프로, 아스파르트, 글루리신, 디터머 및 글라진에 대한 A 사슬과 B 사슬을 포함한다. 인슐린 폴리펩티드는 천연적으로 코딩된 아미노산을 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환함으로써 생성하였다. 각 폴리펩티드는 파라-아세틸페닐알라닌 또는 파라-아미노페닐알라닌으로 치환된 아미노산들 중의 하나를 가지고 있다. 생성된 폴리펩티드는 리더 서열이 없으며, A/B 사슬 인슐린 폴리펩티드(서열번호 1-14)이다. 생성된 각 폴리펩티드는 하기의 위치들 중 한 위치에서 비천연적으로 코딩된 아미노산 치환물을 가진다: 서열번호 1의 1, 5, 8, 9, 10, 12, 14, 15, 18, 19 및 21번 위치, 및 서열번호 2의 1, 2, 3, 4, 17, 20, 21, 22, 25, 28 및 29번 위치.

도 2는 PyMOL 소프트웨어(델라노 사이언티픽(DeLano Scientific), 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)를 이용하여 표지된 인간 인슐린의 구조와 본 발명의 인슐린 폴리펩티드에서 파라-아세틸페닐알라닌으로 치환된 것들에 해당하는 일부 아미노산을 보여주고 있다. 도 6은 인슐린과 공지된 인슐린 유사체 간의 서열 동종성을 나타내고 있다.

비천연적으로 코딩된 아미노산을 도입하기 위한 바람직한 부위 선택에 있어서 또 다른 기준으로서는 단백질 데이터 뱅크(Protein Data Bank), 또는 다른 데이터 뱅크의 결정 구조들을 이용하고 비교하는 것을 포함하는데, 이는 인슐린 및 잔기들의 구조가 1) FGF 수용체 또는 헤파린에 대한 결합을 방해하지 않고, 2) 단백질의 내부에 존재하지 않도록 모델링하는데 사용된다. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 이에 제한되지는 않지만, 인슐린의 하기 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: 서열번호 1의 1, 5, 8, 9, 10, 12, 14, 15, 18, 19 및 21번 위치와 서열번호 2의 1, 2, 3, 4, 17, 20, 21, 22, 25, 28 및 29번 위치. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 이에 제한되지는 않지만, 인슐린의 하기 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: 서열번호 1(또는 이에 대응하는 서열번호 3, 5, 7, 9, 11의 아미노산)의 1, 5, 8, 9, 10, 12, 14, 15, 18, 19 및 21번 위치. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 이에 제한되지는 않지만, 인슐린의 하기 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: 서열번호 2(또는 이에 대응하는 서열번호 4, 6, 8, 10, 12의 아미노산)의 1, 2, 3, 4, 17, 20, 21, 22, 25, 28 및 29번 위치. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 이에 제한되지는 않지만, 인슐린의 하기 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: 서열번호 1(또는 이에 대응하는 서열번호 3, 5, 7, 9, 11의 아미노산)의 1, 5, 8, 9, 10 및 12번 위치. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 이에 제한되지는 않지만, 인슐린의 하기 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: 서열번호 2 (또는 이에 대응하는 서열번호 4, 6, 8, 10, 12의 아미노산)의 1, 2, 3, 4, 17 및 20번 위치. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 이에 제한되지는 않지만, 인슐린의 하기 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: 서열번호 1(또는 이에 대응하는 서열번호 3, 5, 7, 9, 11의 아미노산)의 14, 15, 18, 19 및 21번 위치. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 이에 제한되지는 않지만, 인슐린의 하기 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: 서열번호 2(또는 이에 대응하는 서열번호 4, 6, 8, 10, 12의 아미노산)의 21, 22, 25, 28 및 29번 위치.

비천연적으로 코딩된 아미노산의 도입에 대해서 인슐린 및 인슐린 유사체의 각 위치를 평가하는데 하기의 기준들을 사용하였다: 잔기는 (a) 구조 분석에 기초한 인슐린 수용체의 결합을 방해해서는 안되며, (b) 알라닌 또는 동족체 스캐닝 돌연변이 유발에 의해 영향을 받아서는 안되고, (c) 표면 노출되어 최소한의 반데르발스힘 또는 주변의 잔기들과의 수소 결합 상호작용을 나타내야 하며, (d) 결실되거나 인슐린 변이체로 가변성을 나타내어야 하며, (e) 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환시 보존적 변화를 유도해야 하며, (f) 매우 유연한 영역 또는 구조적으로 강성한 영역에서 발견될 수 있어야 한다. 또한, Cx 프로그램(문헌 [Pintar et al., (2002) Bioinformatics, 18, pp. 980] 참조)을 이용해 인슐린 분자에 대한 추가의 계산을 수행함으로써 각 단백질 원자에 대한 돌출 정도를 평가할 수 있다.

일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 인슐린의 하기 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: 1번 위치 앞(즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 (즉, 단백질의 카르복실 말단) (서열번호 1 또는 이에 대응하는 서열번호 3, 5, 7, 9, 11의 아미노산). 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 인슐린의 하기 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: 1번 위치 앞(즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 (즉, 단백질의 카르복실 말단) (서열번호 2 또는 이에 대응하는 서열번호 4, 6, 8, 10, 12의 아미노산). 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 인슐린의 하기 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: 8, 9, 10, 14 (서열번호 1 또는 이에 대응하는 서열번호 3, 5, 7, 9, 11의 아미노산). 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 인슐린의 하기 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: 1, 17, 25, 28 (서열번호 2 또는 이에 대응하는 서열번호 4, 6, 8, 10, 12의 아미노산).

실시예 2

본 실시예는 대장균에 있어서 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 인슐린 폴리펩티드의 클로닝과 발현에 대해서 상술한다.

인슐린을 클로닝하는 방법에 대해서는 당업계에 공지되어 있다. 인슐린 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 서열 및 숙주 세포로 인슐린을 클로닝하는 것에 대해서는 미국 특허 제5,962,267호; 미국 특허 제4,751,180호, 제7,105,314호, 제6,630,348호, 6,777 및 제7,091,032호; 발명의 명칭이 "Expression of a human insulin precursor in P. pastoris"인 애니벌리(Annibali) 특허뿐만 아니라, 미국 특허 공보 20080268519, 20080255045, 20080227205, 20080207877, 20080207877, 20080213828, 20080261311 및 20080227195에 기술되어 있으며, 이들 특허 및 공개된 출원들은 모두 본원에 참고로 포함된다.

인슐린의 리스프로 형태를 코딩하는 cDNA는 서열번호 34, 35, 36 및 37로 나타나 있다. 이의 성숙한 폴리펩티드는 서열번호 3과 4로 나타나 있다.

도입된 번역 시스템(오르쏘고날 tRNA(O-tRNA)와 오르쏘고날 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS)를 포함함)은 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 인슐린 또는 인슐린 유사체를 발현하는데 사용된다. O-RS는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 갖는 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화한다. 그 결과, 상기 번역 시스템은 코딩된 셀렉터 코돈에 반응하여 비천연적으로 코딩된 아미노산을 인슐린 또는 인슐린 유사체로 삽입시킨다. 적절한 O-RS 및 O-tRNA 서열은 발명의 명칭이 "Compositions of Aminoacyl-tRNA Synthetase and Uses Thereof"인 WO 2006/068802 (E9; 서열번호 15) 및 발명의 명칭이 "Compositions of tRNA and Uses Thereof"인 WO 2007/021297 (F13; 서열번호 16)(이들 문헌은 그 내용 전체가 본원에 참고로 포함됨)에 기술되어 있다.

변형된 인슐린 유전자 또는 인슐린 유사체 유전자 및 오르쏘고날 아미노아실 tRNA 합성효소/tRNA 쌍(원하는 비천연적으로 코딩된 아미노산에 특이적임)을 함유하는 플라스미드를 사용한 대장균의 형질전환으로 인해, 인슐린 폴리펩티드 내로 비천연적으로 코딩된 아미노산을 부위 특이적으로 도입하는 것이 가능해졌다.

성숙한 야생형 인슐린은 표준 프로토콜을 이용한 cDNA 합성 반응의 PCR로 증폭시켜 pET30(NcoI-BamHI) 내로 클로닝시킨다. 서열 확인 전에 또는 다르게는 서열을 확인한 후에, N-말단 HHHHHHSGG 서열을 포함하는 인슐린을 대장균 지질단백질 프로모터 서열로부터 유도된 합성 프로모터(문헌 [Miller, J.H., Gene, 1986] 참조)에 의해 구조적으로 제어되는 메타노코쿠스 잔나스치(Mj tRNATyr/CUA)의 앰버 억제제 티로실 tRNATyr/CUA 및 대장균 GlnRS 프로모터에 의해 제어되는 오르쏘고날 티로실-tRNA 합성효소(Mj TyrRS)를 포함하는 억제 벡터 내로 서브클로닝한다. 인슐린의 발현은 T7 프로모터가 제어한다. 앰버 돌연변이는 표준 퀵체인지(quick change) 돌연변이 프로토콜(스트라타진, 미국 캘리포니아주 라호야 소재)을 이용하여 도입된다.

지효성 인슐린 화합물의 시험은 STZ 당뇨병 랫트 모델(PCO 08-400-209)을 이용하여 수행될 수 있다.

파라-아세틸-페닐알라닌( pAcF )을 이용한 억제

플라스미드(pVK6-리스프로 인슐린)를 T7 중합효소의 발현이 아라비노스 유도성 프로모터에 의해 제어되는 대장균의 W3110 B2 균주로 형질전환시켰다. 밤새 세균 배양물을 2X YT 배양 배지를 포함하는 진탕 플라스크 내에 1:100으로 희석하여 37℃에서 ~0.8의 OD₆₀₀까지 성장시켰다. 아라비노스(0.2% 최종 농도)와 파라-아세틸-페닐알라닌(pAcF)을 4 mM의 최종 농도까지 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. 배양물을 37℃에서 5시간 동안 배양하였다. 세포를 펠렛화시키고 B-PER 용해 완충제(Pierce) 100 ㎕/OD/㎖ + 10 ㎍/㎖ DNase 중에 재현탁시킨 후 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 세포성 물질을 원심분리에 의해 제거하고 상청액을 제거하였다. 펠렛을 동량의 SDS-PAGE 단백질 로딩 완충액에 재현탁시켰다. 모든 샘플들을 MES와 DTT와 함께 4-12% PAGE 겔 상에 로딩하였다. 인슐린의 정제 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, SDS-PAGE, 웨스턴 블롯 분석, 또는 전기분무-이온화 이온 트랩 질량 분석법 등에 의해 확인된다.

사용된 플라스미드와 서열은 도 5에 나타나 있으며, N-말단 His 태그된 인슐린의 발현 및 7개의 앰버 부위들에서의 억제는 도 6에 나타나 있다. 프로인슐린 폴리펩티드는 화살표로 표시하였다. 도 6은 B-PER 펠렛 샘플을 보여주고 있다 - 레인 1의 좌측편: 마커, 레인 1: VK6-프로인슐린-pAF-Q15, 레인 2: VK6-프로인슐린-pAF-Y14, 레인 3: VK6-프로인슐린-pAF-R22, 레인 4: VK6-프로인슐린-pAF-F1, 레인 5: VK6-프로인슐린-pAF-G1, 레인 6: VK6-프로인슐린-pAF-S9, 0.2% 아라비노스, 레인 7: VK6-프로인슐린-pAF-K28. 레인 1, 2, 5 및 6에서의 아미노산 치환에 대해 나타낸 위치 번호는 리스프로 인슐린 사슬 A, 서열번호 3을 기초로 한 것이며, 레인 3, 4 및 7에서의 아미노산 치환에 대해 나타낸 위치 번호는 리스프로 인슐린 사슬 B, 서열번호 4를 기초로 한 것이다.

His 태그된 돌연변이 인슐린 단백질은 당업자에게 공지된 방법들을 이용하여 정제될 수 있다. 프로본드 니켈-킬레이트 수지(ProBond Nickel-Chelating Resin, 인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)가 제조업자에 의해 제공된 표준 His 태그된 단백질 정제 절차를 통해 사용될 수 있다. 단백질의 기능 측정은 당업계에 공지된 방법들, 본 출원 및 여기에 포함된 참조 문헌에 제공된 방법들을 통해 수행될 수 있으며, 다르게는 살아있는 세포에 대한 ELISA를 개발하여 본 발명의 인슐린 폴리펩티드를 평가할 수 있다.

실시예 3

본 실시예는 카르보닐 함유 아미노산의 도입 및 아미노옥시 함유 PEG와의 후속 반응을 상술한다.

본 실시예는 약 5,000 MW의 아미노옥시 함유 PEG와 후속 반응하게 되는 케톤 함유의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 도입하는 인슐린 폴리펩티드의 생성 방법을 설명한다. 1번 위치 앞(즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 (즉, 서열번호 1의 단백질의 카르복실 말단 또는 이에 대응하는 서열번호 3, 5, 7, 9, 11의 아미노산)의 각각의 잔기 및 1번 위치 앞(즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 (즉, 서열번호 2의 단백질의 카르복실 말단 또는 이에 대응하는 서열번호 4, 6, 8, 10, 12의 아미노산)의 각각의 잔기들은 하기 구조를 갖는 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 별도 치환된다.

p-아세틸-페닐알라닌을 인슐린에 부위 특이적으로 도입시키는 데 사용되는 서열은 서열번호 1과 2(인슐린의 A 및 B 사슬) 및 서열번호 16 또는 17(muttRNA, M. 잔나스치)과 상기 실시예 2에 기술된 15, 29, 30 또는 31(TyrRS LW1, 5 또는 6)이다.

일단 변형이 되면, 카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 인슐린 폴리펩티드 변이체는 하기의 형태로 된 아미노옥시 함유 PEG 유도체와 반응시킨다.

R-PEG(N)-0-(CH₂)_n-0-NH₂

상기 식 중,

R은 메틸이고, n은 3이며, N은 대략 5,000 MW이다. 25 mM MES(시그마 케미칼(Sigma Chemical), 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)(pH 6.0), 25 mM Hepes(시그마 케미칼, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)(pH 7.0), 또는 10 mM 아세트산나트륨(시그마 케미칼, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)(pH 4.5)에서 10 mg/mL로 용해된 p-아세틸페닐알라닌을 함유하는 정제된 인슐린을 10배 내지 100배 과량의 아미노옥시 함유 PEG와 반응시킨 다음, 10-16시간 동안 실온에서 교반하였다(문헌 [Jencks, W. J. Am. Chem. Soc. 1959, 81, pp 475] 참조). 다음으로, 즉각적인 정제 및 분석을 위해 PEG-인슐린을 적절한 완충제로 희석시켰다.

실시예 4

본 실시예는 약 20,000 MW의 아미노옥시 함유 PEG와 후속 반응하게 되는 케톤 함유의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 도입하는 인슐린 폴리펩티드의 생성 방법을 설명한다. 1번 위치 앞(즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 (즉, 서열번호 1의 단백질의 카르복실 말단 또는 이에 대응하는 서열번호 3, 5, 7, 9, 11의 아미노산)의 각각의 잔기 및 1번 위치 앞(즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 (즉, 서열번호 2의 단백질의 카르복실 말단 또는 이에 대응하는 서열번호 4, 6, 8, 10, 12의 아미노산)의 각각의 잔기들은 하기 구조를 갖는 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 별도 치환된다.

p-아미노페닐알라닌을 인슐린에 부위 특이적으로 도입시키는 데 사용되는 서열은 서열번호 1과 2(인슐린의 A 및 B 사슬) 및 서열번호 16 또는 17(muttRNA, M. 잔나스치)과 상기 기술되고 p-아미노페닐알라닌의 부위 특이적 도입을 위하여 도입된 서열들이다.

R-PEG(N)-0-(CH₂)_n-0-NH₂

상기 식 중,

R은 메틸이고, n은 3이며, N은 대략 20,000 MW이다. 25 mM MES(시그마 케미칼, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)(pH 6.0), 25 mM Hepes(시그마 케미칼, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)(pH 7.0), 또는 10 mM 아세트산나트륨(시그마 케미칼, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)(pH 4.5)에서 10 mg/mL로 용해된 p-아미노페닐알라닌을 함유하는 정제된 인슐린을 10배 내지 100배 과량의 아미노옥시 함유 PEG와 반응시킨 다음, 10-16시간 동안 실온에서 교반하였다(문헌 [Jencks, W. J. Am. Chem. Soc. 1959, 81, pp 475] 참조). 다음으로, 즉각적인 정제 및 분석을 위해 PEG-인슐린을 적절한 완충제로 희석시켰다.

실시예 5

본 실시예는 약 20,000 MW의 아미노옥시 함유 PEG와 후속 반응하게 되는 케톤 함유의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 도입하는 인슐린 폴리펩티드의 생성 방법을 설명한다. 1번 위치 앞(즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111 (즉, 서열번호 13의 단백질의 카르복실 말단)의 각각의 잔기들은 하기 구조를 갖는 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 별도 치환된다.

p-아미노페닐알라닌을 인슐린에 부위 특이적으로 도입시키는 데 사용되는 서열은 서열번호 13 및 서열번호 16 또는 17(muttRNA, M. 잔나스치)과 상기 기술되고 p-아미노페닐알라닌의 부위 특이적 도입을 위하여 도입된 서열들이다.

R-PEG(N)-0-(CH₂)_n-0-NH₂

상기 식 중,

실시예 6

본 실시예는 약 20,000 MW의 아미노옥시 함유 PEG와 후속 반응하게 되는 케톤 함유의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 도입하는 인슐린 폴리펩티드의 생성 방법을 설명한다. 1번 위치 앞(즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87 (즉, 서열번호 14의 단백질의 카르복실 말단)의 각각의 잔기들은 하기 구조를 갖는 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 별도 치환된다.

p-아미노페닐알라닌을 인슐린에 부위 특이적으로 도입시키는 데 사용되는 서열은 서열번호 14 및 서열번호 16 또는 17(muttRNA, M. 잔나스치)과 상기 기술되고 p-아미노페닐알라닌의 부위 특이적 도입을 위하여 도입된 서열들이다.

R-PEG(N)-0-(CH₂)_n-0-NH₂

상기 식 중,

실시예 7

본 실시예는 약 30,000 MW의 아미노옥시 함유 PEG와 후속 반응하게 되는 케톤 함유의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 도입하는 인슐린 폴리펩티드의 생성 방법을 설명한다. 1번 위치 앞(즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111 (즉, 서열번호 13의 단백질의 카르복실 말단 또는 서열번호 1-12 및 14의 이에 대응하는 위치)의 각각의 잔기들은 하기 구조를 갖는 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 별도 치환된다.

p-아미노페닐알라닌을 인슐린에 부위 특이적으로 도입시키는 데 사용되는 서열은 서열번호 13(또는 서열번호 1, 2 또는 14) 및 서열번호 16 또는 17(muttRNA, M. 잔나스치)과 상기 기술되고 p-아미노페닐알라닌의 부위 특이적 도입을 위하여 도입된 서열들이다.

R-PEG(N)-0-(CH₂)_n-0-NH₂

상기 식 중,

R은 메틸이고, n은 3이며, N은 대략 30,000 MW이다. 25 mM MES(시그마 케미칼, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)(pH 6.0), 25 mM Hepes(시그마 케미칼, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)(pH 7.0), 또는 10 mM 아세트산나트륨(시그마 케미칼, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)(pH 4.5)에서 10 mg/mL로 용해된 p-아미노페닐알라닌을 함유하는 정제된 인슐린을 10배 내지 100배 과량의 아미노옥시 함유 PEG와 반응시킨 다음, 10-16시간 동안 실온에서 교반하였다(문헌 [Jencks, W. J. Am. Chem. Soc. 1959, 81, pp 475] 참조). 다음으로, 즉각적인 정제 및 분석을 위해 PEG-인슐린을 적절한 완충제로 희석시켰다.

실시예 8

본 실시예는 약 40,000 MW의 아미노옥시 함유 PEG와 후속 반응하게 되는 케톤 함유의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 도입하는 인슐린 폴리펩티드의 생성 방법을 설명한다. 1번 위치 앞(즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111 (즉, 서열번호 13의 단백질의 카르복실 말단 또는 서열번호 1-12 및 14의 이에 대응하는 위치)의 각각의 잔기들은 하기 구조를 갖는 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 별도 치환된다.

R-PEG(N)-0-(CH₂)_n-0-NH₂

상기 식 중,

R은 메틸이고, n은 3이며, N은 대략 40,000 MW이다. 25 mM MES(시그마 케미칼, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)(pH 6.0), 25 mM Hepes(시그마 케미칼, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)(pH 7.0), 또는 10 mM 아세트산나트륨(시그마 케미칼, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)(pH 4.5)에서 10 mg/mL로 용해된 p-아미노페닐알라닌을 함유하는 정제된 인슐린을 10배 내지 100배 과량의 아미노옥시 함유 PEG와 반응시킨 다음, 10-16시간 동안 실온에서 교반하였다(문헌 [Jencks, W. J. Am. Chem. Soc. 1959, 81, pp 475] 참조). 다음으로, 즉각적인 정제 및 분석을 위해 PEG-인슐린을 적절한 완충제로 희석시켰다.

실시예 9

본 실시예는 약 10,000 MW의 아미노옥시 함유 PEG와 후속 반응하게 되는 케톤 함유의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 도입하는 인슐린 폴리펩티드의 생성 방법을 설명한다. 1번 위치 앞(즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111 (즉, 서열번호 13의 단백질의 카르복실 말단 또는 서열번호 1-12 및 14의 이에 대응하는 위치)의 각각의 잔기들은 하기 구조를 갖는 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 별도 치환된다.

R-PEG(N)-0-(CH₂)_n-0-NH₂

상기 식 중,

R은 메틸이고, n은 3이며, N은 대략 10,000 MW이다. 25 mM MES(시그마 케미칼, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)(pH 6.0), 25 mM Hepes(시그마 케미칼, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)(pH 7.0), 또는 10 mM 아세트산나트륨(시그마 케미칼, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)(pH 4.5)에서 10 mg/mL로 용해된 p-아미노페닐알라닌을 함유하는 정제된 인슐린을 10배 내지 100배 과량의 아미노옥시 함유 PEG와 반응시킨 다음, 10-16시간 동안 실온에서 교반하였다(문헌 [Jencks, W. J. Am. Chem. Soc. 1959, 81, pp 475] 참조). 다음으로, 즉각적인 정제 및 분석을 위해 PEG-인슐린을 적절한 완충제로 희석시켰다.

실시예 10

아미드 결합을 통해 PEG에 결합된 히드록실아민기로 이루어진 PEG와의 접합.

실시예 3-9에 기재된 절차를 사용하여 하기 구조를 갖는 PEG 시약을 케톤 함유의 비천연적으로 코딩된 아미노산에 커플링시켰다.

R-PEG(N)-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_n-0-NH₂

상기 식 중,

R = 메틸이고, n = 4이며, N은 대략 5,000 MW - 40,000 MW이다. 반응, 정제, 및 분석 조건은 상기 기술된 바와 같으며 당업계에 공지되어 있다.

실시예 11

본 실시예는 2개의 서로 다른 비천연적으로 코딩된 아미노산을 인슐린 폴리펩티드 및 인슐린 유사체 폴리펩티드에 도입시키는 것에 대해 상술한다.

본 실시예는 케톤 작용기를 포함하는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 하기 잔기들 중 두 위치에 도입하는 인슐린 폴리펩티드의 생성 방법을 설명한다: 1번 위치 앞(즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111 (즉, 서열번호 13의 단백질의 카르복실 말단 또는 서열번호 1-12 및 14의 이에 대응하는 위치). 인슐린 폴리펩티드는 셀렉터 코돈을 핵산 내 2개의 별도의 부위에 도입하는 것을 제외하고는 상기 기술된 바와 같이 제조하였다.

실시예 12

본 실시예는 인슐린 폴리펩티드 또는 인슐린 유사체 폴리펩티드의 히드라지드 함유 PEG에 대한 접합 및 동일 반응계에서의 후속 환원을 상술한다.

카르보닐 함유 아미노산을 도입한 인슐린 폴리펩티드를 상기 기술한 절차에 따라 제조하였다. 일단 하기 구조를 갖는 히드라지드 함유 PEG를 변형시킨 후, 인슐린 폴리펩티드에 접합시켰다:

R-PEG(N)-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_n-X-NH-NH₂

상기 식 중,

R = 메틸이고, n = 2이며, N = 5,000, 10,000, 20,000, 30,000 또는 40,000 MW이고, X는 카르보닐 (C=O) 기이다. p-아세틸페닐알라닌을 함유하는 정제된 인슐린을 0.1-10 mg/mL로 25 mM MES(시그마 케미칼, 미주리주 세인트 루이스 소재)(pH 6.0), 25 mM Hepes(시그마 케미칼, 미주리주 세인트 루이스 소재)(pH 7.0), 또는 10 mM 아세트산나트륨(시그마 케미칼, 미주리주 세인트 루이스 소재)(pH 4.5) 중에 용해시키고, 1배 내지 100 배 과량의 히드라지드 함유 PEG와 반응시키고, H₂O 중에 용해된 저장액 1M NaCNBH₃(시그마 케미칼, 미주리주 세인트 루이스 소재)를 최종 농도 10-50 mM이 되도록 첨가함으로써 동일 반응계에서 해당 히드라존을 환원시켰다. 반응은 4℃ 내지 RT의 암실에서 18-24시간 동안 수행하였다. 반응을 약 pH 7.6에서 최종 Tris 농도가 50 mM이 되도록 1M Tris(시그마 케미칼, 미주리주 세인트 루이스 소재)를 첨가함으로써 반응을 중지시키거나 또는 즉각적인 정제를 위해 적절한 완충제 내로 희석시켰다.

실시예 13

R-PEG(N)-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_n-X-NH-NH₂

상기 식 중,

R = 메틸이고, n = 2이며, N = 20,000 MW이고, X는 카르보닐 (C=O) 기이다. p-아세틸페닐알라닌을 함유하는 정제된 인슐린을 0.1-10 mg/mL로 25 mM MES(시그마 케미칼, 미주리주 세인트 루이스 소재)(pH 6.0), 25 mM Hepes(시그마 케미칼, 미주리주 세인트 루이스 소재)(pH 7.0), 또는 10 mM 아세트산나트륨(시그마 케미칼, 미주리주 세인트 루이스 소재)(pH 4.5) 중에 용해시키고, 1배 내지 100 배 과량의 히드라지드 함유 PEG와 반응시키고, H₂O 중에 용해된 저장액 1M NaCNBH₃(시그마 케미칼, 미주리주 세인트 루이스 소재)를 최종 농도 10-50 mM이 되도록 첨가함으로써 동일 반응계에서 해당 히드라존을 환원시켰다. 반응은 4℃ 내지 RT의 암실에서 18-24시간 동안 수행하였다. 반응을 약 pH 7.6에서 최종 Tris 농도가 50 mM이 되도록 1M Tris(시그마 케미칼, 미주리주 세인트 루이스 소재)를 첨가함으로써 반응을 중지시키거나 또는 즉각적인 정제를 위해 적절한 완충제 내로 희석시켰다.

실시예 14

본 실시예는 알킨 함유 아미노산의 인슐린 폴리펩티드 또는 인슐린 유사체 폴리펩티드로의 도입 및 mPEG-아지드와의 유도체화에 대해 상술한다.

하기의 잔기들, 1번 위치 앞(즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111 (즉, 서열번호 13의 단백질의 카르복실 말단 또는 서열번호 1-12 및 14의 이에 대응하는 위치)을 각각 하기의 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환시킨다.

p-프로파르길-티로신을 인슐린 부위 특이적으로 도입하는데 이용된 서열은 서열번호 13(또는 서열번호 1-12 및 14의 이에 대응하는 위치), 서열번호 16 또는 17(muttRNA, M. 잔나스치) 및 상기 기술된 22, 23 및 24이다. 프로파르길 티로신을 함유하는 인슐린 폴리펩티드를 대장균에서 발현시키고, 상기 기술된 조건들을 사용하여 정제하였다.

PB 완충제(100 mM 인산나트륨, 0.15 M NaCl, pH = 8)중에 0.1-10 mg/mL로 용해된 프로파르길-티로신을 함유하는 정제된 인슐린 및 10배 내지 1000배 과량의 아지드 함유 PEG를 반응 혼합물에 첨가하였다. 다음으로, 촉매량의 CuSO₄ 및 Cu 선을 반응 혼합물에 첨가하였다. 상기 혼합물을 배양(예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 실온 또는 37℃에서 약 4시간, 또는 4℃에서 밤새)한 후, H₂O를 첨가하고, 혼합물을 투석 막을 통해 여과하였다. 샘플을 예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 실시예 3에 기술된 것과 유사한 절차에 의해 분석할 수 있다. 본 실시예에서, PEG는 다음의 구조를 갖는다.

R-PEG(N)-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_n-N₃

상기 식 중,

R은 메틸이고, n은 4이며, N은 5,000, 10,000, 20,000, 30,000 또는 40,000 MW이다.

실시예 15

본 실시예는 인슐린 폴리펩티드 중 거대한 소수성 아미노산을 프로파르길 티로신으로 치환하는 것에 대해 상술한다.

인슐린의 하기 영역들: 1번 위치 앞(즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111 (즉, 서열번호 13의 단백질의 카르복실 말단 또는 서열번호 1-12 및 14의 이에 대응하는 위치) 중 한 영역 내에 존재하는 Phe, Trp 또는 Tyr 잔기를 상기 기술된 바와 같이 하기의 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환시켰다.

일단 PEG를 변형시킨 후, 알킨 함유 아미노산을 포함하는 인슐린 폴리펩티드 변이체에 부착시켰다. PEG는 하기 구조를 가지며, 커플링 절차는 실시예들에 기재된 절차를 따른다.

Me-PEG(N)-O-(CH₂)₂-N₃

이는 자연 발생의 거대한 소수성 아미노산 중 하나와 대략적으로 등전자성이고, 폴리펩티드 내 별도의 부위에서 PEG 유도체에 의해 변형된 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 인슐린 폴리펩티드 변이체를 생성하게 될 것이다.

실시예 16

본 실시예는 하나 이상의 PEG 링커에 의해 분리된 인슐린 폴리펩티드 동종이량체, 이종이량체, 동종다량체 또는 이종다량체를 생성하는 것에 대해 상술한다. 인슐린 폴리펩티드 다량체는 프로인슐린들 간에 형성되거나 또는 본 발명의 성숙된 A 사슬 인슐린 폴리펩티드와 B 사슬 인슐린 폴리펩티드 간에 형성될 수 있다.

상기 실시예에서 생성된 알킨 함유 인슐린 폴리펩티드 변이체를 하기 형태의 이작용성 PEG 유도체와 반응시켜, 두 개의 인슐린 분자가 PEG에 의해 물리적으로 분리된 해당 인슐린 폴리펩티드 동종이량체를 생성하였다.

N₃-(CH₂)_n-C(O)-NH-(CH₂)₂-O-PEG(N)-O-(CH₂)₂-NH-C(O)-(CH₂)_n-N₃

상기 식 중,

n은 4이고, PEG는 대략 5,000, 10,000, 20,000, 30,000 또는 40,000의 평균 MW를 갖는다.

이와 유사한 방식으로, 인슐린 폴리펩티드를 하나 이상의 다른 폴리펩티드에 커플링시켜 이종이량체, 동종다량체 또는 이종다량체를 형성시킬 수 있다. 커플링, 정제 및 분석은 상기 실시예들에서와 같이 수행하였다.

실시예 17

본 실시예는 하나 이상의 PEG 링커에 의해 분리된 인슐린 폴리펩티드 동종이량체, 이종이량체, 동종다량체 또는 이종다량체를 생성하는 것에 대해 상술한다. 인슐린 폴리펩티드 다량체는 A 사슬과 다른 A 사슬 간에 형성되거나, 또는 B 사슬과 다른 B 사슬 간에 형성될 수 있다.

N₃-(CH₂)_n-C(O)-NH-(CH₂)₂-O-PEG(N)-O-(CH₂)₂-NH-C(O)-(CH₂)_n-N₃

상기 식 중,

실시예 18

본 실시예는 사카라이드 부분을 인슐린 폴리펩티드에 커플링시키는 것에 대해 상술한다.

상기에서 기술한 바와 같이, 하기 중 한 잔기를 하기의 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환시킨다: 1번 위치 앞(즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111 (즉, 서열번호 13의 단백질의 카르복실 말단 또는 서열번호 1-12 및 14의 이에 대응하는 위치).

일단 카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 인슐린 폴리펩티드 변이체를 변형시킨 후, N-아세틸글루코사민(GlcNAc)의 β-결합된 아미노옥시 유사체와 반응시켰다. 인슐린 폴리펩티드 변이체(10 mg/mL) 및 아미노옥시 사카라이드(21 mM)를 100 mM 수성 아세트산나트륨 완충제(pH 5.5) 중에서 혼합시키고, 37℃에서 7시간 내지 26시간 동안 배양하였다. 사카라이드-접합된 인슐린 폴리펩티드(5 mg/mL)를, 150 mM HEPES 완충제(pH 7.4) 중의 UDP-갈락토오스(16 mM) 및 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라아제(0.4 유닛/mL)를 이용하여 주위 온도에서 48시간 동안 배양시킴으로써 제2 사카라이드를 먼저 효소적으로 커플링시켰다(문헌 [Schanbacher et al., J. Biol. Chem. 1970, 245, 5057-5061] 참조).

실시예 19

본 실시예는 PEG화된 인슐린 폴리펩티드 길항제의 생성에 대해 상술한다.

잔기, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 인슐린 수용체 결합과 관련이 있는 잔기들을 상기 기술된 바와 같이 하기의 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환시킨다. 일단 카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 인슐린 폴리펩티드 변이체를 변형시킨 후, 하기 형태로 된 아미노옥시 함유 PEG 유도체와 반응시키면 폴리펩티드 내 단일 부위에서 PEG 유도체에 의해 변형되는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 인슐린 폴리펩티드 길항제를 생성시키게 될 것이다.

R-PEG(N)-0-(CH₂)_n-0-NH₂

상기 식 중,

커플링, 정제 및 분석은 상기 기술된 바와 같이 수행하였다.

실시예 20

인슐린 분자가 직접 결합된 인슐린 폴리펩티드 동종이량체, 이종이량체, 동종다량체 또는 이종다량체의 생성.

알킨 함유 아미노산을 포함하는 인슐린 폴리펩티드 변이체를 아지도 함유 아미노산을 포함하는 또 다른 인슐린 폴리펩티드 변이체에 직접 커플링시킬 수 있다. 이와 유사한 방식으로, 인슐린 폴리펩티드를 하나 이상의 다른 폴리펩티드에 커플링시켜 이종이량체, 동종다량체 또는 이종다량체를 형성시킬 수 있다. 형성될 수 있는 다량체와 관련한 보다 상세한 설명은 상기 실시예 16과 17에 제공되어 있으며, 커플링, 정제 및 분석은 상기 기술된 바와 같이 수행한다.

실시예 21

폴리알킬렌 글리콜(P-OH)은 알킬 할라이드(A)와 반응하여 에테르(B)를 형성한다. 이러한 화합물에서, n은 1 내지 9의 정수이고, R'는 직쇄형 사슬 또는 분지형 사슬, 포화 또는 불포화 C₁ 내지 C₂₀ 알킬 또는 헤테로알킬 기일 수 있다. 또한, R'는 C₃ 내지 C₇ 포화 또는 불포화 시클릭 알킬 또는 시클릭 헤테로알킬, 치환되거나 또는 비치환된 아릴 또는 헤테로아릴 기, 또는 치환되거나 또는 비치환된 알카릴(알킬은 C₁ 내지 C₂₀ 포화 또는 불포화 알킬임) 또는 헤테로알카릴 기일 수 있다. 통상, PEG-OH는 800 달톤 내지 40,000 달톤(Da)의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜(mPEG)이다.

실시예 22

mPEG-OH + Br-CH₂-C≡CH → mPEG-O-CH₂-C≡CH

20,000 Da의 분자량을 갖는 mPEG-OH(mPEG-OH 20 kDa; 2.0 g, 0.1 mmol, 썬바이오(Sunbio))를 THF(35 mL) 중에서 NaH(12 mg, 0.5 mmol)로 처리하였다. 다음으로, 크실렌 중의 80 중량% 용액(0.56 mL, 5 mmol, 50 당량, 알드리치)으로 용해된 브롬화 프로파르길 및 촉매량의 KI의 용액을 상기 용액에 첨가하고, 생성되는 혼합물을 2시간 동안 가열 환류하였다. 다음으로, 물(1 mL)을 첨가하고, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 잔류물에 CH₂Cl₂(25 mL)를 첨가하고, 유기층을 분리시키고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시켜, 부피를 대략 2 mL로 감소시켰다. 이 CH₂Cl₂ 용액을 디에틸 에테르(150 mL)에 적가하였다. 생성되는 침전물을 수거하고, 수 회분의 냉각된 디에틸 에테르로 세척하고, 건조시켜 프로파르길-O-PEG를 수득하였다.

실시예 23

mPEG-OH + Br-(CH₂)₃-C≡CH → mPEG-O-(CH₂)₃-C≡CH

20,000 Da의 분자량을 갖는 mPEG-OH(mPEG-OH 20 kDa; 2.0 g, 0.1 mmol, 썬바이오(Sunbio))를 THF(35 mL) 중에서 NaH(12 mg, 0.5 mmol)로 처리하였다. 다음으로, 50 당량의 5-브로모-1-펜틴(0.53 mL, 5 mmol, 알드리치) 및 촉매량의 KI를 혼합물에 첨가하였다. 생성되는 혼합물을 16시간 동안 가열 환류하였다. 다음으로, 물(1 mL)을 첨가하고, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 잔류물에 CH₂Cl₂(25 mL)를 첨가하고, 유기층을 분리시키고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시켜, 부피를 대략 2 mL로 감소시켰다. 이 CH₂Cl₂ 용액을 디에틸 에테르(150 mL)에 적가하였다. 생성되는 침전물을 수거하고, 수 회분의 냉각된 디에틸 에테르로 세척하고, 건조시켜 대응하는 알킬을 수득하였다. 5-클로로-1-펜틴을 유사한 반응에서 사용할 수 있다.

실시예 24

THF(50 mL) 및 물(2.5 mL) 중의 3-히드록시벤질알콜(2.4 g, 20 mmol)의 용액에 먼저 분말 수산화나트륨(1.5 g, 37.5 mmol)을 첨가한 후, 크실렌(3.36 mL, 30 mmol) 중의 80 중량% 용액으로서 용해된 브롬화 프로파르길 용액을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 6시간 동안 가열 환류하였다. 상기 혼합물에 10 % 시트르산(2.5 mL)을 첨가하고, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트(3 × 15 mL)로 추출하고, 혼합된 유기층을 포화 NaCl 용액(10 mL)으로 세척하고, MgSO₄ 상에서 건조 및 농축시켜 3-프로파르길옥시벤질 알콜을 수득하였다.

염화메탄설포닐(2.5 g, 15.7 mmol) 및 트리에틸아민(2.8 mL, 20 mmol)을 0℃에서 CH₂Cl₂ 중의 화합물 3(2.0 g, 11.0 mmol)의 용액에 첨가하고, 상기 반응물을 냉장고에 16시간 동안 놓아두었다. 통상적인 후처리로 담황색 오일의 메실레이트를 수득하였다. 이 오일(2.4 g, 9.2 mmol)을 THF(20 mL) 중에 용해시키고, LiBr(2.0 g, 23.0 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 1시간 동안 가열 환류한 후, 실온으로 냉각시켰다. 상기 혼합물에 물(2.5 mL)을 첨가하고, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트(3 × 15 mL)로 추출하고, 혼합된 유기층을 포화 NaCl 용액(10 mL)으로 세척하고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조 및 농축시켜 원하는 브롬화물을 수득하였다.

mPEG-OH 20 kDa(1.0 g, 0.05 mmol, 썬바이오)을 THF(20 mL) 중에 용해시키고, 이 용액을 얼음조 중에서 냉각시켰다. NaH(6 mg, 0.25 mmol)를 격렬하게 교반하면서 수분에 걸쳐 첨가한 후, 상기로부터 얻어진 브롬화물(2.55 g, 11.4 mmol) 및 촉매량의 KI를 첨가하였다. 냉각조를 제거하고, 생성되는 혼합물을 12시간 동안 가열 환류하였다. 물(1.0 mL)을 상기 혼합물에 첨가하고, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 잔류물에 CH₂Cl₂(25 mL)를 첨가하고, 유기층을 분리시키고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 부피를 대략 2 mL로 감소시켰다. 에테르 용액(150 mL)을 적가하여 백색 침전물을 얻었으며, 이것이 모아져서 PEG 유도체를 생성하였다.

실시예 25

mPEG-NH₂ + X-C(O)-(CH₂)_n-C≡CR' → mPEG-NH-C(O)-(CH₂)_n-C≡CR'

또한, 말단 알킨 함유 폴리(에틸렌 글리콜) 중합체는, 상기에서 나타낸 바와 같이, 말단 작용기를 포함하는 폴리(에틸렌 글리콜) 중합체를 알킨 작용기를 함유하는 반응성 분자에 커플링시킴으로써 수득될 수도 있다. 상기 식 중, n은 1 내지 10이다. 상기 식 중, R'는 H 또는 C₁ 내지 C₄의 작은 알킬기일 수 있다.

실시예 26

4-펜탄산(2.943 g, 3.0 mmol)을 CH₂Cl₂(25 mL) 중에 용해시켰다. N-히드록시숙신이미드(3.80 g, 3.3 mmol) 및 DCC(4.66 g, 3.0 mmol)를 첨가하고, 이 용액을 밤새 실온에서 교반하였다. 생성되는 미정제 NHS 에스테르 7을 추가의 정제없이 하기 반응에서 사용하였다.

5,000 Da의 분자량을 갖는 mPEG-NH₂(mPEG-NH₂, 1 g, 썬바이오)를 THF(50 mL) 중에 용해시키고, 혼합물을 4℃로 냉각시켰다. NHS 에스테르 7(400 mg, 0.4 mmol)을 격렬하게 교반하면서 조금씩 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온으로 가온시키면서 3시간 동안 교반하였다. 이후, 물(2 mL)을 첨가하고, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 잔류물에 CH₂Cl₂(50 mL)를 첨가하고, 유기층을 분리시키고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 부피를 대략 2 mL로 감소시켰다. 이 CH₂Cl₂ 용액을 에테르(150 mL)에 적가하였다. 생성되는 침전물을 수집하여 진공에서 건조시켰다.

실시예 27

본 실시예는 폴리(에틸렌 글리콜)의 메탄설포네이트 또는 메실레이트로도 지칭되는 폴리(에틸렌 글리콜)의 메탄 설포닐 에스테르의 제조에 대해 기술한다. 대응하는 토실레이트 및 할라이드는 유사한 절차에 의해 제조될 수 있다.

150 mL의 톨루엔 중의 mPEG-OH(MW = 3,400, 25 g, 10 mmol)를 질소 하에서 2시간 동안 공비 증류시키고, 이 용액을 실온으로 냉각시켰다. 40 mL의 무수 CH₂Cl₂ 및 2.1 mL의 무수 트리에틸아민(15 mmol)을 이 용액에 첨가하였다. 상기 용액을 얼음조 중에서 냉각시키고, 1.2 mL의 증류된 염화메탄설포닐(15 mmol)을 적가하였다. 이 용액을 질소 하 실온에서 밤새 교반하고, 2 mL의 무수 에탄올을 첨가함으로써 반응을 중지시켰다. 상기 혼합물을 진공 하에서 증발시켜 주로 톨루엔 이외의 용매를 제거하고, 여과시키고, 진공 하에서 다시 농축시킨 후, 100 mL의 디에틸 에테르로 침전시켰다. 여과액을 수 회분의 냉각된 디에틸 에테르로 세척하고, 진공에서 건조시켜 메실레이트를 수득하였다.

메실레이트 (20 g, 8 mmol)를 75 mL의 THF 중에 용해시키고, 이 용액을 4℃로 냉각시켰다. 상기 냉각된 용액에 아지드 나트륨(1.56 g, 24 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응물을 질소 하에서 2시간 동안 가열 환류하였다. 다음으로, 용매를 증발시키고, 잔여물을 CH₂Cl₂(50 mL)로 희석시켰다. 유기 분획물을 NaCl 용액으로 세척하고, 무수 MgSO₄ 상에서 건조시켰다. 부피를 20 ml로 감소시키고, 150 mL의 냉각된 무수 에테르를 첨가함으로써 생성물을 침전시켰다.

실시예 28

4-아지도벤질 알콜은 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 제5,998,595호에 기재된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 염화메탄설포닐(2.5 g, 15.7 mmol) 및 트리에틸아민(2.8 mL, 20 mmol)을 0℃에서 CH₂Cl₂ 중의 4-아지도벤질 알콜(1.75 g, 11.0 mmol)의 용액에 첨가하고, 반응물을 냉장고에 16시간 동안 놓아두었다. 통상적인 후처리로 담황색 오일의 메실레이트를 수득하였다. 이 오일(9.2 mmol)을 THF(20 mL) 중에 용해시키고, LiBr(2.0 g, 23.0 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 1시간 동안 가열 환류시킨 후, 실온으로 냉각시켰다. 상기 혼합물에 물(2.5mL)을 첨가하고, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트(3 × 15 mL)로 추출하고, 혼합된 유기층을 포화 NaCl 용액(10 mL)으로 세척하고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조 및 농축시켜 원하는 브롬화물을 수득하였다.

mPEG-OH 20 kDa(2.0 g, 0.1 mmol, 썬바이오)를 THF(35 mL) 중의 NaH(12 mg, 0.5 mmol)로 처리하고, 브롬화물(3.32 g, 15 mmol)을 촉매량의 KI와 함께 상기 혼합물에 첨가하였다. 생성되는 혼합물을 12시간 동안 가열 환류시켰다. 물(1.0 mL)을 상기 혼합물에 첨가하고, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 잔류물에 CH₂Cl₂(25 mL)를 첨가하고, 유기층을 분리시키고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시켜 부피를 대략 2 mL로 감소시켰다. 에테르 용액(150 mL)을 적가하여 침전물을 생성하고, 이를 수거하여 mPEG-O-CH₂-C₆H₄-N₃를 얻었다.

실시예 29

NH₂-PEG-O-CH₂CH₂CO₂H(MW 3,400 Da, 2.0 g)를 NaHC0₃(10 mL)의 포화 수용액 중에 용해시키고, 이 용액을 0℃로 냉각시켰다. 3-아지도-1-N-히드록시숙신이미도 프로피오네이트(5 당량)를 격렬하게 교반하면서 첨가하였다. 3시간 후, 20 mL의 H₂O를 첨가하고, 상기 혼합물을 실온에서 추가로 45분 동안 교반하였다. pH를 0.5N H₂SO₄를 사용하여 3으로 조정하고, NaCl을 대략 15 중량%의 농도로 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 CH₂Cl₂(100 mL × 3)로 추출하고, Na₂SO₄ 상에서 건조 및 농축시켰다. 냉각된 디에틸 에테르를 사용하여 침전시킨 후, 생성물을 여과에 의해 수집하고, 진공 하에서 건조시켜 ω-카르복시-아지드 PEG 유도체를 수득하였다.

실시예 30

THF 중에서 -78℃로 냉각된, 당업계에 공지된 바와 같이 제조된 리튬 아세틸라이드(4 당량)의 용액에, THF 중에 용해된 mPEG-OMs의 용액을 격렬하게 교반하면서 적가하였다. 3시간 후, 상기 반응물을 실온으로 가온시키고, 1 mL의 부탄올을 첨가하여 중지시켰다. 이후, 20 mL의 H₂O를 첨가하고, 상기 혼합물을 추가로 45분 동안 실온에서 교반하였다. 0.5N H₂SO₄를 사용하여 pH를 3으로 조정하고, NaCl을 대략 15 중량%의 농도로 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 CH₂Cl₂(100 mL × 3)로 추출하고, Na₂SO₄ 상에서 건조 및 농축시켰다. 냉각된 디에틸 에테르를 사용하여 침전시킨 후, 생성물을 여과에 의해 수집하고, 진공 하에서 건조시켜 1-(부트-3-일옥시)-메톡시폴리에틸렌 글리콜(mPEG)을 수득하였다.

실시예 31

아지드 함유 아미노산 및 아세틸렌 함유 아미노산은, 문헌 [L. Wang, et al., (2001), Science 292:498-500], [J.W. Chin et al., Science 301:964-7 (2003)], [J.W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027], [J.W. Chin, & P.G. Schultz, (2002), Chem Bio Chem 11:1135-1137], [J.W. Chin, et al., (2002), PNAS United States of America 99:11020-11024] 및 [L. Wang, & P.G. Schultz, (2002), Chem. Comm., 1:1-11]에 기재된 방법을 사용하여 단백질 내로 부위 특이적으로 도입될 수 있다. 일단 아미노산을 도입시킨 후, 포스페이트 완충제(PB)(pH 8) 중에서, 2 mM PEG 유도체, 1 mM CuSO₄ 및 ~1 mg Cu 선의 존재 하, 37℃에서 4시간 동안 0.01 mM 단백질을 사용하여 시클로부가 반응을 수행하였다.

실시예 32

본 실시예는 p-아세틸-D,L-페닐알라닌(pAF) 및 m-PEG-히드록실아민 유도체의 합성에 대해 기술한다.

문헌 [Zhang, Z., Smith, B.A.C., Wang, L., Brock, A., Cho, C. & Schultz, P.G., Biochemistry, (2003) 42, 6735-6746]에 종래 기재된 절차를 사용하여 라세미 pAF를 합성하였다.

m-PEG-히드록실아민 유도체를 합성하기 위해, 하기 절차를 수행하였다. 실온에서(RT) 1시간 동안 교반된 디클로로메탄(DCM, 70 mL) 중의 (N-t-Boc-아미노옥시)아세트산(0.382 g, 2.0 mmol) 및 1,3-디이소프로필카르보디이미드(0.16 mL, 1.0 mmol)의 용액에, 메톡시-폴리에틸렌 글리콜 아민(m-PEG-NH₂, 7.5 g, 0.25 mmol, Mt. 30 K, 바이오벡트라(BioVectra)로부터 입수) 및 디이소프로필에틸아민(0.1 mL, 0.5 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응물을 RT에서 48시간 동안 교반한 후, 약 100 mL가 되도록 농축시켰다. 상기 혼합물을 냉각된 에테르(800 mL)에 적가하였다. t-Boc-보호된 생성물을 침전시키고, 여과에 의해 수집하고, 에테르 100 mL로 3회 세척하였다. 이를 DCM(100 mL) 중에 재용해시키고, 에테르(800 mL) 중에서 2회 침전시킴으로써 추가로 정제하였다. 생성물을 진공에서 건조시켜 7.2 g(96 %)을 수득하고, 이를 NMR 및 니히드린(Nihydrin) 시험에 의해 확인하였다.

상기와 같이 수득된 보호된 생성물(7.0 g)의 deBoc을 50% TFA/DCM(40 mL) 중에서 0℃로 1시간 동안 수행한 후, RT에서 1.5시간 동안 수행하였다. 대부분의 TFA를 진공에서 제거한 후, 디옥산(1 mL) 중의 4N HCl을 잔류물에 첨가함으로써 히드록실아민 유도체의 TFA 염을 HCl 염으로 전환시켰다. 상기 침전물을 DCM(50 mL) 중에 용해시키고, 에테르(800 mL) 중에서 재침전시켰다. 최종 생성물(6.8 g, 97 %)을 여과에 의해 수집하고, 에테르 100 mL로 3회 세척하고, 진공에서 건조시키고, 질소 하에서 저장하였다. 다른 PEG(5K, 20 K) 히드록실아민 유도체를 동일한 절차를 사용하여 합성하였다.

실시예 33

PEG-인슐린, 변형되지 않은 인슐린 및 완충 용액을 마우스 또는 랫트에 투여하였다. 그 결과, 본 발명의 PEG화된 인슐린이 변형되지 않은 인슐린보다 월등한 활성 및 연장된 반감기를 나타낼 것이다. 이와 유사하게, 변형된 인슐린, 변형되지 않은 인슐린 및 완충 용액을 마우스 또는 랫트에 투여하였다.

약동학적 분석

본 발명의 인슐린 폴리펩티드를 정맥 내 또는 피하 경로로 마우스에 투여하였다. 상기 동물을 투여 전과 투여 후 시점에 채혈하였다. 각 샘플에서 혈장을 수거하여 방사선 면역분석방법에 의해 분석하였다. 제거 반감기를 계산할 수 있으므로, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 인슐린 폴리펩티드와 야생형 인슐린 또는 본 발명의 다양한 인슐린 유사체 폴리펩티드 간에 이를 비교하였다. 이와 유사하게, 본 발명의 인슐린 폴리펩티드를 사이노몰거스(cynomolgus) 원숭이에 투여할 수 있다. 상기 동물을 투여 전과 투여 후 시점에 채혈하였다. 각 샘플에서 혈장을 수거하여 방사선 면역분석방법에 의해 분석하였다.

본 발명의 폴리펩티드를 ZDF 수컷 랫트(당뇨병이 있는 살찐 랫트; 연구 개시시에 8주령, 찰스 리버(Charles River)-GMI)에 투여할 수 있다. 랫트에게 퓨리나(Purina) 5008 먹이를 마음껏 먹였다. 하기의 시험군들을 설정하였다: 식염수; 인슐린 4U/일(day); 본 발명의 인슐린 폴리펩티드, 8U/일 단기 투약(단기 투약군은 한번에 투여되며, 투여 후 T = O, 2, 4, 8 및 24시간째 채혈); 본 발명의 인슐린 폴리펩티드, 6U/일; 본 발명의 인슐린 폴리펩티드, 4U/일; 본 발명의 인슐린 폴리펩티드, 3U/일; 본 발명의 인슐린 폴리펩티드, 2U/일; 린(Lean) 식염수; 린 인슐린4U/일 및 당뇨병이 없는 랫트에서 본 발명의 인슐린을 6U/일, 4U/일 및 2U/일 투여. 린(Lean) 군들은 당뇨병이 없는 야윈 ZDF 랫트를 나타낸다.

화합물을 하루에 1회 피하 주사한 후, 동일한 양을 투여한 제2 군을 격일로 주사하여 유지시켰다. 대조군 랫트에 비히클(PBS: 0.1 ml)을 주사하였다. 투여한 지 7일이 지난 후, 상기 동물들에게 경구 당부하 검사를 실시하였다. 마취없이 꼬리 절단으로 출혈시켜 글루코스와 트리글리세리드를 위한 혈액을 수거하였다. 인슐린 폴리펩티드는 투여량 의존성 방식으로 혈장 글루코스 수준을 감소시킬 수 있다. 야윈 ZDF 랫트도 야생형 인슐린이 투여된 랫트와 비교하여 본 발명의 인슐린 폴리펩티드에 노출된 후 저혈당증에 대하여 시험할 수 있다.

ob / ob 비만 모델

ob/ob 마우스 모델은 고혈당증, 인슐린 저항성 및 비만에 대한 동물 모델이다. 비히클 및 인슐린 대조군 군들과 비교하여 인슐린 폴리펩티드로 처리된 후의 혈장 글루코스 수준을 ob/ob 마우스에서 측정할 수 있다. 이러한 비만 모델에서는, 수컷 ob/ob 마우스(7주령)의 시험 군들에게 상기 기술된 바와 같이 피하 경로를 통해 비히클 단독(PBS), 인슐린(4U/일) 또는 인슐린 폴리펩티드를 14일간 주사하였다(0.1 ㎖, 하루에 1회 및 다른 시험군에서는 격일에 1회, 그리고 다른 시험군에서는 1주에 1회). 1, 3, 7, 9, 11, 14일째 되는 날에, 제1 화합물을 주사하고 1시간 후 꼬리 절단으로 출혈시켜 혈액을 수거하고 표준 프로토콜을 이용하여 혈장 글루코스 수준을 측정하였다. 비히클 대조군과 비교했을 때, 본 발명의 인슐린 폴리펩티드는 혈장 글루코스 수준이 경우 글루코스 흡수를 촉진한다. 트리글리세리드 수준은 본 발명의 인슐린 폴리펩티드로 처리한 후를 다른 분자들과 비교할 수 있다. 폴리펩티드는 다수 회 투여, 연속 주입 또는 단회 투여 등으로 마우스에게 투여될 수 있다.

실시예 34

노바겐의 유도성 T7 프로모터(본원에 참고로 포함되는 pET 시스템 매뉴얼(버전 9)에 상세히 기술됨), 발현 벡터 pET30a 및 발현 균주 BL21(DE3)를 이용한 인슐린 발현 시스템.

2mL의 LB/카나마이신(10 ㎍/㎖) 배양물을 원하는 유사체로 형질전환된 BL21(DE3) 플레이트의 스윕(sweep)으로 접종하였다. 이는 발현 수준에 있어서 콜로니 대 콜로니 변동성에 의해 야기되는 효과를 감쇠시켜준다. 상기 배양물을 37℃에서 격렬하게 흔들어 주면서 밤새 성장시키고, 다음 날에 10 ㎖ LB/카나마이신 배양물을 밤새 배양한 배양물 1 ㎖로 접종하였다(OD₆₀₀ ~0.4-0.5). 밤새 배양한 배양물의 잔류 mL는 글리세롤 저장액으로 냉동시킬 수 있다.

10 mL의 성장 배양물을 OD₆₀₀이 0.8-0.9에 다다를 때까지 37℃에서 250 rpm으로 30-45분 동안 놓아두었다. 다음으로, 1 mM IPTG(비유도된 배양물 대조군으로 따로 보관해둔 1 mL를 사용)로 유도하여, 유도한지 통상 3-4시간 후에 수거하여 SDS-PAGE 상에서 분석하였다.

또한, 시간대별 발현(예를 들어, 유도 후 1, 2, 4, 6시간의 시점 및 O/N)을 행하여 축적률, 단백질 안정성 등을 측정할 수 있다.

겔 분석: 유도 후 원하는 시점에 1 mL를 배양물로부터 수거하여 세포들을 스핀 다운(spin down)시키고, 초음파 처리로 점도를 낮춘 100 ㎕의 2X SDS-PAGE 중에 재현탁하여 10 ㎕를 SDS-PAGE 상에서 가동하였다. 필요하다면, 이는 비유도된 대조군 또는 대조군들 및/또는 공지된 양성 대조군 또는 표준과 비교하여 발현 수준을 평가할 수 있다(예를 들어, 우수한 발현 수준은 @ > 100 ㎍/㎖일 수 있음). 웨스턴 블롯 분석도 사용할 수 있다. 또한, 4 ㎖의 배양물을 따로 보관하여, 내포체(불용성 유사체를 발현하는 경우)를 제조하고, 이들에 대해 질량 분광 분석을 수득하여 과발현된 단백질의 동일성을 확인하는 것도 가능하다.

더 큰 규모의 단백질 발현에 있어서는, > 250 mL의 LB/카나마이신(10 ㎍/㎖)을 250 ㎕의 냉동 글리세롤 저장액으로 접종하여 밤새 성장시켰다. 다음 날, 10 X 1L LB/카나마이신 배양물을 밤새 배양한 배양물 25 mL로 접종하였다(OD₆₀₀ ~0.1).

1L 배양물을 OD₆₀₀이 0.8-0.9에 다다를 때까지 37℃에서 250 rpm으로 ~2시간까지 성장시켰다. 이후, 1 mM IPTG로 유도하여, 유도한지 4시간 후 또는 다음 날 아침에 수거하였다(수거는 4,000 rpm에서 15분간의 원심분리를 이용할 수 있음). 내독소를 감소시켜 정제를 촉진하는 것이 요구되는 경우엔 펠렛을 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)(50 ㎖/펠렛 + 병을 헹구는 데 50 ㎖)을 이용하여 헹구었다. 펠렛들을 함께 모아서 다시 스피닝하였다.

실시예 35

피치아 발현 연구 - DNA 준비, 전기천공, 발현 프로토콜

본 실시예는 피치아에서 본 발명의 인슐린 폴리펩티드의 제조를 위한 프로토콜을 제공한다. 서열번호 34, 35, 36 및 37을 사용하였고, 도 8은 피치아 내로 클로닝을 위해 사용된 플라스미드를 나타내며, 이러한 플라스미드 또는 다른 변형된 플라스미드들이 피치아에서 인슐린 폴리펩티드의 단백질 발현을 수득하는데 사용될 수 있고, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 플라스미드에 변형을 가할 수도 있다.

프로토콜의 1일째, 통상 2U 효소/㎍ 소화될 DNA를 이용한 밤샘 소화가 진행되며, 1O mL YPhyD 배양물을 30℃에서 260 rpm으로 흔들면서 글리세롤 저장액의 50 mL 플라스크에서 밤새 접종시켰다.

DNA 준비

1/10th 부피의 멸균 3M NaOAc를 먼저 첨가한 다음, 0.7 부피의 멸균 IPA를 가해서 DNA를 침전시킨 후, 샘플을 격렬하게 혼합하여 침전을 -20℃ 또는 -70℃에서 동결될 때까지 지속하였다. 이후, DNA를 원심분리(벤치탑 원심분리 14,000 rpm/10분)로 펠렛화하고, 상청액을 제거한 후, 상기 펠렛을 500 ㎕의 멸균 70% ETOH를 사용하여 세정하였다. 스피닝(벤치탑 원심분리 14,000 rpm/10분)하고 상청액을 따라낸 후, 펠렛을 15-20분간 통풍 건조시켰다. DNA 펠렛을 멸균수로 1 ㎍/㎕까지 재현탁시키고 10 ㎍ DNA로 피치아를 형질전환시켰다.

전기천공

밤새 배양한 OD₆₀₀의 배양물을 사용하여, YPhyD 중에서 OD₆₀₀ = 0.2이 되도록 희석하였다. OD₆₀₀ 이 0.8-1.0에 다다를 때까지 배양물을 30℃에서 260 rpm으로 흔들었다. 원심분리(4000 rpm/5분)로 세포들을 수집하였다. 배지를 따라내고, 세포들을 20 mL의 차가운 멸균 냉수로 세정하고, 다시 따라내고 하기를 반복하였다. 물로 세정한 후, 펠렛을 20 mL의 차가운 멸균 1M 소르비톨 중에서 세정하여 따라내고 상기 세정된 세포 펠렛을 600 ㎕의 1M 소르비톨 중에 재현탁시킨 후, 이를 얼음 상에서 저장하였다.

상기 세정된 세포 50 ㎕를 멸균된 1.5 mL의 에펜도르프 시험관(eppendorf tube) 중의 10 ㎍의 선형 DNA와 혼합하여 가볍게 섞어주고 얼음 상에서 25분간 배양하였다. 세포/DNA 혼합물을 긴 피펫 팁을 이용하여 미리 냉각시킨 0.2 ㎝의 크벳으로 이동시켰다. 2000 V, 200 Ω, 25 μFd (단일 펄스 사용)와 같이 설정된 바이오라드(BioRad) 진펄사(GenePulsar) II 유닛을 사용하여 세포를 전기천공시킨 직후, 0.5 mL YPhyD 배지를 크벳에 첨가하고 피펫팅으로 혼합하였다. 전체 내용물을 멸균된 둥근 바닥 시험관으로 이동시킨 후 30℃에서 30분간 가볍게 흔들어(200 rpm) 주었다. 세포를 플레이팅하고 고르게 도말하한 후, 플레이트를 거꾸로 하여 30℃에서 3일간 배양하였다.

3일간의 배양 후, 루프를 사용해 콜로니를 집어내어 50 ㎖ 플라스크 중의 10 ㎖ BYPhyD 배지 중에 접종하고 30℃에서 3일간 배양하였다. 20 ㎕ 플레이트 상의 콜로니를 계수하여 평균 마리 수를 기록한 후, 일단 균주 명칭과 클론 번호, 인슐린(즉, 발현된 단백질) 및 날짜를 표기한 2세트의 세포동결 바이알(cryovial)을 준비하여 세포들을 수거하였다. 배양물을 15 ㎖ 원뿔형 시험관에 이동시키고, OD₆₀₀의 각 배양물을 수취하여 YPhyD 배지 중에서 배양물을 1:50 또는 1:20으로 희석하였다. 글리세롤 저장액을 위해 배양물의 분취액을 보관해 두었다. 다음으로, 효모를 RT에서 5분간 4000 rpm으로 펠렛화시키고, 상청액을 새롭게 표기한 15 mL 원뿔형 시험관에 옮긴 후, 데이터 분석을 위해 필요할 때까지 -20℃ 또는 -8O℃에서 저장하였다.

샘플을 4-12% NuPAGE TB 겔(노벡스(Novex)) 상에서 가동시켰다. 인비트로겐의 SDS-PAGE 시약을 사용하고, 웨스턴 블롯 또는 염색된 겔 분석에 의해 분석하였다.

배지 조성물

완충된 효모 파이톤 ( Phytone ) 덱스트로스 ( BYPhyD )

효모 추출물 10 g/L

파이톤 펩톤 20 g/L

1 M 인산칼륨 완충제(pH 6) 100 ㎖/L

1OX YNB lOO ㎖/L

20% 덱스트로스 100 ㎖/L

효모 파이톤 덱스트로스 ( YPhyD )

효모 추출물 10 g/L

파이톤 펩톤 20 g/L

20% 덱스트로스 100 ㎖/L

1 OX YNB (아미노산 없이 황산암모늄을 갖는 13.4% 효모 질소 베이스)

효모 질소 베이스 134 g/L

실시예 36

인슐린 A21G 생성

본 실시예에서는, 4.0L 배양물을 발효시켜 13.4 g의 젖은 세포 페이스트를 생성하였고, Triton-X1OO을 사용하거나 이를 사용하지 않고 내포체 제조를 수행하였다. 2.07 g의 젖은 내포체를 이러한 방식으로 생성한 후, 가용화(용해)와 리폴딩을 수행하였다. 상기 내포체를 젖은 내포체(IB) 그램(g) 당 20O mL의 H₂O로 재현탁시켜 최종 농도가 3 mM가 되게 하고 상기 재현탁물에 시스테인을 첨가하였다. 다음으로, RT에서 1시간 동안 pH를 11.5로 증가시킴으로써 IB를 가용화시켰다. 이후, 상기 가용화된 물질의 pH를 10.6±0.1로 떨어뜨리고 2-8℃에서 72시간 동안 저장하여 리폴딩이 일어나게 하고, 이러한 결과들을 도 10에 나타내었다. HCl을 최종 pH가 3.0이 되도록 첨가하여 리폴딩 반응을 중지시키고, 0.45 μM 여과하여 추가로 처리할 때까지 2-8℃에서 저장하였다.

Tris 염기를 사용하여 중지된 리폴딩의 pH를 8.0까지 증가시킴으로써 리폴딩된 단백질을 정제하고(도 11에 나타낸 바와 같음), QHP 컬럼에 직접 로딩하였다. 이 경우 로딩의 전도율은 >3.5 mS/cm이었다. 가동 조건은 (A) 2OmM Tris, 8.0; (B) 2OmM Tris, 8.0; 20OmM NaCl이었고, 30 CV에 대해 0-100% B였다. 올바르게 리폴딩된 프로인슐린을 수집하여 79 mg의 프로인슐린을 회수하였다.

한외여과/정용여과(UF/DF)를 행하고, 25 mM 아연을 이용하여 침전을 수행한 후, 침전된 단백질을 20 mM NaOAc(4.0), 30% ACN, 5 mM EDTA를 이용하여 2mg/mL의 농도로 재현탁시키고, PEG:단백질의 최종 몰비가 10:1이 될 때까지 2OK PEG를 첨가하여 28℃에서 48-72시간 동안 배양하였다.

PEG 반응을 0.5X PEG 완충제 A 중에서 1:10으로 희석하고, 0.22μM 여과시킨 후 SP 650S 컬럼 상에서 가동시켰다. 가동 조건은 (A) 1O mM NaOAc3 4.O, 1 mM EDTA; (B) 1O mM NaOAc, 4.0, 1 mM EDTA, 0.4M NaCl; 20 CV에 대해 0-50% B 및 1O mM(6.5) 시트르산나트륨 중에서 제조된 PEG 샘플; 15OmM NaCl이고, 이를 도 12에 나타내었다.

이러한 방법들은 사용하여, 비천연 아미노산을 갖는 다양한 인슐린 폴리펩티드를 0.1-22 mg 범위의 정제되고 PEG화된 변이체의 최종 단백질 양으로 생성할 수 있었다. ACN이 PEG 반응에서 PEG/단백질 혼합물을 가용화하는데 도움을 주며, pI에서 아연 침전이 CAN의 존재 하에 농축을 촉진시킨다는 점이 밝혀졌다.

실시예 37

STZ 당뇨병 랫트 모델에서 인슐린 폴리펩티드의 시험

랫트 처리는 본 발명의 서로 다른 인슐린 폴리펩티드를 단회 주사함으로써 수행하였다: A14pAF-PEG-A21N 리스프로 인슐린 및 A14pAF-PEG-A21G 리스프로 인슐린(568 nmol/kg; 94 nmol/kg; 56.8 nmol/kg; 및 9.4 nmol/kg (3, 0.5, 0.3, 0.05 mg/kg 인슐린 내용물)의 각각 서로 다른 4개의 수준).

다음으로, 투여 후 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 12O시간 후에 혈당을 측정하여, 곡선 아래 평균 면적, 이들 각각에 대해 0-120시간의 혈당 측정치(비히클만 주입한 대조군도 포함)를 도 9에 나타내었다.

실시예 38

비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화된 인슐린의 안정성 및/또는 효능에 대한 인간 임상 시험

목적: 피하 투여된 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화 재조합 인간 인슐린의 안정성 및 약동학적 특성을 관찰하는 것이다.

환자: 연령대가 20-40세이고 체중이 60-90 kg 범위의 건강한 18명의 지원자들이 본 연구에 참여하였다. 이 피험자들은 혈액학 또는 혈청 화학 및 음성 뇨 독성 스크린, HIV 스크린 및 B형 간염 표면 항원에 대하여 임상적으로 유의한 비정상적인 실험 수치를 보유하지 않는다. 이들은 하기의 이력 중 어느 것이라도 가지지 않아야 한다: 고혈압; 임의의 1차 혈액 질환의 병력; 간, 신장, 심혈관, 위장관, 비뇨생식, 대사, 신경 질환에 있어서 상당한 병력; 빈혈증 또는 발작 장애의 병력; 세균 또는 포유류 유래의 생성물, PEG, 또는 인간 혈청 알부민에 대해 공지된 민감성; 카페인을 함유하는 음료를 습관적으로 다량 복용하는 사람; 연구에 돌입하기 전 30일 이내에 임의의 다른 임상 시험에 참가했다거나 또는 혈액을 수혈받았다거나 또는 수혈을 했던 경우; 연구에 돌입하기 전 3개월 이내에 인슐린에 노출된 경우; 연구에 돌입하기 전 7일 이내에 질병을 앓은 경우; 및 연구에 돌입하기 전 14일 이내에 연구 전 신체 조사 또는 임상 실험 평가에서 유의한 비이상성을 나타낸 경우. 모든 피험자는 안정성에 대해 평가할 수 있으며, 약동학적 분석을 위한 모든 혈액 수집은 예정대로 행한다. 모든 연구는 기관의 윤리 위원회의 승인과 환자의 동의 하에 수행된다.

연구 디자인: 이는 건강한 남성 지원자들에서 단계(Phase) I, 단일-센터, 개방형 표지, 무작위 설정, 2-기간 교차 연구로 이루어진다. 18명의 피험자들을 두 치료 순서 군들 중 하나의 군(군당 9 명의 피험자)에 무작위로 배정하였다. 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 등가 투여량의 PEG화된 인슐린과 선택된 시판 제품을 사용하여, 대퇴부에 볼루스 피하 주사로 별도의 2회 투여 기간에 걸쳐 서 인슐린을 투여하였다. 시판 제품의 투여량 및 투여 빈도는 패키지 표지에 지시된 대로 하였다. 추가의 피험자 군을 포함하게 되면, 시판되는 제품을 사용하여 추가의 투여량, 투여 빈도 또는 필요에 따른 기타 매개변수를 연구에 포함시킬 수 있다. 각 투여 기간은 14일 중지(washout) 기간에 의해 나누었다. 피험자들은 두 번의 각 투여 기간 동안에 적어도 투여하기 전 12시간과 적어도 투여한 후 72시간을 연구 센터에 있었으며, 투여 기간 사이에는 그렇지 않았다. PEG화된 인슐린에 대한 시험에 대해서도, 추가의 투여량, 빈도 또는 기타 매개변수가 존재하는 경우엔 추가의 피험자 군을 부가할 수 있다. 인슐린의 실험용 조제 물질은 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화된 인슐린이다.

혈액 샘플링: 인슐린의 투여 전후 직접적인 정맥 천자에 의해 연속적으로 혈액을 채혈하였다. 혈청 인슐린 농도를 결정하기 위해 정맥혈 샘플(5 mL)을 투여(3 개의 기준 샘플)하기 약 30, 20 및 10분 전과, 투여 후 대략 30분 및 1, 2, 5, 8, 12, 15, 18, 24, 30, 36, 48, 60 및 72시간의 시점에서 채취하였다. 각각의 혈청 샘플을 2 개의 분취액으로 나누었다. 모든 혈청 샘플을 -20℃에서 저장하였다. 혈청 샘플을 드라이아이스 상에 두었다. 금식 임상 실험실 시험(혈액학, 혈청 화학 및 뇨검사)을 제1 일째 개시 투여 직전, 제4 일째 아침, 제16 일째 투여 직전 및 제19 일째 아침에 수행하였다.

생체분석 방법: 혈청 인슐린 농도의 결정을 위해 ELISA 키트를 사용하였다.

안정성 측정: 활력 징후를 각각의 투여 직전(제1 일 및 제16 일)과 각각의 투여 후 6, 24, 48 및 72시간에서 기록하였다. 안정성 결정은 발병률 및 유해한 사건의 유형 및 임상 실험실 시험 변화(기준선으로부터의 변화)에 기초한다. 또한, 혈압을 비롯한 활력 징후 측정에 있어서 이전 연구로부터의 변화와 신체 조사 결과를 평가하였다.

데이터 분석: 투여하기 30, 20 및 10분 전에 수집한 3개 샘플의 인슐린 수치 평균으로 결정된 평균 기준선 인슐린 농도를 각각에 대한 투여 후의 값에서 차감함으로써, 투여 전 기준선 인슐린 농도에 대하여 투여 후의 혈청 농도 값을 보정하였다. 투여 전 혈청 인슐린 농도는 분석시험의 정량 수준 미만인 경우에는 평균 값 계산에 포함시키지 않았다. 약동학적 매개변수는 기준선 인슐린 농도에 대해 보정된 혈청 농도 데이터로부터 결정하였다. 약동학적 매개변수는 가장 최근 버전의 BIOAVL 소프트웨어를 사용하여 디지탈 이큅먼트 코퍼레이션(Digital Equipment Corporation) VAX 8600 컴퓨터 시스템 상에서 모델 독립적 방법에 의해 계산하였다. 다음의 약동학적 매개변수를 결정하였다: 피크 혈청 농도 (C_max); 피크 혈청 농도에 대한 시간 (t_max); 선형 사다리꼴 법칙을 사용하여 계산된 0 내지 마지막 혈액 분취 시간 (AUC₀ _-72)에서의 농도-시간 곡선 (AUC) 아래 면적; 및 제거율 상수로부터 산정된 최종 제거 반감기 (t₁ _/2). 제거율 상수를 로그-선형 농도-시간 플롯의 최종 선형 영역에서의 연속 데이터 점의 선형 회귀에 의해 추정하였다. 각각의 처리군에 대해 약동학적 매개변수의 평균, 표준 편차 (SD) 및 변동 계수 (CV)를 계산하였다. 매개변수 평균의 비 (보존된 제제/비보존된 제제)를 계산하였다.

안정성 결과: 유해한 사건의 발생률은 처리군에 동일하게 분포하였다. 기준선 또는 연구 전 임상 실험실 시험 또는 혈압으로부터 임상적으로 중요한 변화가 없고, 연구 전 신체 조사 결과 및 활력 징후 측정으로부터 뚜렷한 변화가 없었다. 두 처리군에 대한 안정성 프로파일은 유사한 것으로 보여야 한다.

약동학적 결과: 모든 18명의 피험자들에 있어서, 각 시점에 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화된 인슐린을 투여받은 후의 평균 혈청 인슐린 농도-시간 프로파일(기준선 인슐린에 대해 보정되지 않음)을 측정하였다. 모든 피험자들은 정상 생리학적 범위 내에서 투여 전 기준선 인슐린 농도를 가져야 한다. 약동학적 매개변수를 투여 전 평균 기준선 인슐린 농도에 대해 보정된 혈청 데이터로부터 결정하고, C_max 및 t_max를 결정하였다. 선택된 임상적 비교 측정기(comparator)(들)에 대한 평균 t_max는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화된 인슐린에 대한 t_max보다 현저히 짧았다. 최종 반감기 값은 시험된 전임상적 비교 측정기(들)의 경우, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화된 인슐린에 대한 최종 반감기에 비해서 상당히 짧았다.

본 발명의 연구가 건강한 남성 피험자에서 수행된 것이지만, 다른 환자 집단, 예컨대 당뇨를 앓고 있는 남성 또는 여성 환자, 암 또는 만성 신부전을 앓고 있는 남성 또는 여성 환자, 소아 신부전 환자, 자가조직 예치식(autologous predeposit) 프로그램의 환자, 또는 선택(대기) 수술이 예정된 환자에서도 유사한 흡수 특징 및 안정성 프로파일을 기대할 수 있을 것이다.

결론적으로, 피하 투여된 단일 투여량의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화된 인슐린은 안정하고, 건강한 남성 피험자들은 약물 복용에 잘 적응할 수 있었다. 부정적 사건의 비교 발생률, 임상 실험실 값, 활력 징후 및 신체 조사 결과에 기초하면, 시판되는 형태의 인슐린 및 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화된 인슐린의 안정성 프로파일은 같게 될 것이다. 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화된 인슐린은 환자와 헬스케어 제공 기관에 크나큰 임상적 유용성을 제공한다.

본 명세서에 기술된 실시예 및 실시 양태들은 예시를 위한 목적일 뿐이고, 이들의 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 제시될 것이고 이들도 본 출원의 기술사상 및 범위와 첨부되는 청구 범위 내에 포함된다. 본 출원에 언급된 모든 공보, 특허, 특허출원 및 기타 문헌들은, 각각의 개별 공보, 특허, 특허출원 또는 기타 문헌들이 여러 가지 목적을 위해 개별적으로 참조로서 본원에 포함되는 것으로 명시된 바와 같이 동일하게 그 내용 전체가 본 명세서에 여러 가지 목적을 위하여 참조로 포함된다.

표 1: 인용된 서열들

SEQUENCE LISTING <110> Miao, Zhenwei Krawitz, Denise Kraynov, Vadim Tian, Feng Sim, Bee-Cheng Ho, Lillian Hays Putnam, Anna-Maria A Knudsen, Nick DeGuzman, Michael <120> Modified Insulin Polypeptides and Their Uses <130> AMBX-0146.00PCT <160> 37 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30 <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Insulin lispro A chain, amino acid sequence (Humalog) <400> 3 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 4 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Insulin lispro B chain, amino acid sequence (Humalog) <400> 4 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Pro Thr 20 25 30 <210> 5 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Insulin aspart A chain, amino acid sequence (Novolog) <400> 5 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 6 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Insulin aspart B chain, amino acid sequence (Novolog) <400> 6 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Lys Thr 20 25 30 <210> 7 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Insulin glulisine A chain, amino acid sequence (Apidra) <400> 7 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 8 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Insulin glulisine B chain, amino acid sequence (Apidra) <400> 8 Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Glu Thr 20 25 30 <210> 9 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Insulin detemir A chain, amino acid sequence (Levemir) <400> 9 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Gly 20 <210> 10 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Insulin detemir B chain, amino acid sequence (Levemir) <400> 10 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Lys 20 25 <210> 11 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Insulin glargine A chain, amino acid sequence (Lantus) <400> 11 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Gly 20 <210> 12 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Insulin glargine B chain, amino acid sequence (Lantus) <400> 12 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 <210> 13 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15 Trp Gly Pro Asp Pro Ala Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly 20 25 30 Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45 Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly 50 55 60 Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu 65 70 75 80 Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys 85 90 95 Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 110 <210> 14 <211> 86 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys 50 55 60 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85 <210> 15 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutant synthetase derived from Methanococcus jannaschii synthetase <400> 15 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Val 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Tyr Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Glu His Gly Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Gly Ile His 145 150 155 160 Tyr Glu Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 16 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mutant tRNA derived from Methanococcus jannaschii tRNA <400> 16 ccggcggtag ttcagcaggg cagaacggcg gactctaaat ccgcatggcg ctggttcaaa 60 tccagcccgc cggacca 77 <210> 17 <211> 77 <212> DNA <213> Methanococcus jannaschii <400> 17 ccggcggtag ttcagcaggg cagaacggcg gactctaaat ccgcatggcg ctggttcaaa 60 tccggcccgc cggacca 77 <210> 18 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An optimized amber supressor tRNA <400> 18 cccagggtag ccaagctcgg ccaacggcga cggactctaa atccgttctc gtaggagttc 60 gagggttcga atcccttccc tgggacca 88 <210> 19 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An optimized AGGA frameshift supressor tRNA <400> 19 gcgagggtag ccaagctcgg ccaacggcga cggacttcct aatccgttct cgtaggagtt 60 cgagggttcg aatccctccc ctcgcacca 89 <210> 20 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of p-azido-L-phenylalanine <400> 20 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Gly 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Thr Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Thr Tyr Tyr 145 150 155 160 Tyr Leu Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 21 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of p-benzoyl-L-phenylalanine <400> 21 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Gly 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Ser Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Thr Ser His 145 150 155 160 Tyr Leu Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 22 <211> 305 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of propargyl-phenylalanine <400> 22 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Ala 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Pro Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Ala Ile Tyr 145 150 155 160 Leu Ala Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile His 165 170 175 Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His Asn 180 185 190 Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser Lys 195 200 205 Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala Lys 210 215 220 Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro Ile 225 230 235 240 Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys Arg 245 250 255 Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu Leu 260 265 270 Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys Asn 275 280 285 Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys Arg 290 295 300 Leu 305 <210> 23 <211> 305 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of propargyl-phenylalanine <400> 23 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Ala 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Pro Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Ile Pro Tyr 145 150 155 160 Leu Pro Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile His 165 170 175 Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His Asn 180 185 190 Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser Lys 195 200 205 Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala Lys 210 215 220 Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro Ile 225 230 235 240 Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys Arg 245 250 255 Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu Leu 260 265 270 Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys Asn 275 280 285 Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys Arg 290 295 300 Leu 305 <210> 24 <211> 305 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of propargyl-phenylalanine <400> 24 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Ala 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Lys Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Ala Ile Tyr 145 150 155 160 Leu Ala Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile His 165 170 175 Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His Asn 180 185 190 Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser Lys 195 200 205 Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala Lys 210 215 220 Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro Ile 225 230 235 240 Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys Arg 245 250 255 Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu Leu 260 265 270 Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys Asn 275 280 285 Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys Arg 290 295 300 Leu 305 <210> 25 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of p-azido-phenylalanine <400> 25 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Thr 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Asn Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Pro Leu His 145 150 155 160 Tyr Gln Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 26 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of p-azido-phenylalanine <400> 26 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Thr 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Ser Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Pro Leu His 145 150 155 160 Tyr Gln Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 27 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of p-azido-phenylalanine <400> 27 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Leu 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Thr Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Pro Val His 145 150 155 160 Tyr Gln Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 28 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of p-azido-phenylalanine <400> 28 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Thr 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Ser Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Pro Ser His 145 150 155 160 Tyr Gln Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 29 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of p-acetyl-phenylalanine <400> 29 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Thr 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Ser Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Pro Ser His 145 150 155 160 Tyr Gln Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 30 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of p-acetyl -phenylalanine <400> 30 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Leu 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Glu Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Gly Thr His 145 150 155 160 Tyr Arg Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 31 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of p-acetyl-phenylalanine <400> 31 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Ala 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Glu Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Gly Gly His 145 150 155 160 Tyr Leu Gly Val Asp Val Ile Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 32 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of p-azido-phenylalanine <400> 32 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Ala 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Arg Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Val Ile His 145 150 155 160 Tyr Asp Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 33 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of p-azido-phenylalanine <400> 33 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Gly 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Thr Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Thr Tyr Tyr 145 150 155 160 Tyr Leu Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 34 <211> 213 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA Sequences of LisPro Insulin for expression in Pichia <400> 34 aagcgtgagg aggctgaggc tgaggctgag cctaagttcg tcaaccaaca cttgtgcggt 60 tctcacttgg ttgaggccct ttacttggtt tgcggtgagc gtggtttctt ctacaccaag 120 cctactcgtc gtttacaaaa gcgtggtatc gttgagcaat gctgcacctc tatctgctcc 180 ttgtaccaat tggagaacta ctgcaactaa tga 213 <210> 35 <211> 183 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA Sequences of LisPro Insulin for expression in Pichia <400> 35 aagcgtttcg tcaaccaaca cttgtgcggt tctcacttgg ttgaggccct ttacttggtt 60 tgcggtgagc gtggtttctt ctacaccaag cctactcgtc gtttacaaaa gcgtggtatc 120 gttgagcaat gctgcacctc tatctgctcc ttgtaccaat tggagaacta ctgcaactaa 180 tga 183 <210> 36 <211> 171 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA Sequences of LisPro Insulin for expression in Pichia <400> 36 aagcgtttcg tcaaccaaca cttgtgcggt tctcacttgg ttgaggccct ttacttggtt 60 tgcggtgagc gtggtttctt ctacaccaag cctactaagc gtggtatcgt tgagcaatgc 120 tgcacctcta tctgctcctt gtaccaattg gagaactact gcaactaatg a 171 <210> 37 <211> 201 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA Sequences of LisPro Insulin for expression in Pichia <400> 37 aagcgtgagg aggctgaggc tgaggctgag cctaagttcg tcaaccaaca cttgtgcggt 60 tctcacttgg ttgaggccct ttacttggtt tgcggtgagc gtggtttctt ctacaccaag 120 cctactaagc gtggtatcgt tgagcaatgc tgcacctcta tctgctcctt gtaccaattg 180 gagaactact gcaactaatg a 201

Claims

하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 인슐린 폴리펩티드.
A 사슬이 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 것인 인슐린 폴리펩티드.
B 사슬이 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 것인 인슐린 폴리펩티드.
하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 인슐린 유사체.
하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 인슐린 폴리펩티드의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 것인, 대사 장애를 갖는 환자의 치료 방법.