KR100784120B1 - 에틸렌디시스테인(ｅｃ)-약물 접합체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 일반적으로 에틸렌디시스테인(EC)과 킬레이트화된 99m Tc를 사용하는 신규한 표지화 방책을 제공한다. EC를 각종 리간드와 접합시키고, 조직 특이적 질환용 영상화제로서 사용하기 위해 99m Tc와 킬레이트화시킨다. 또한, 본 발명의 약물 접합체는 진단 도구 또는 치료제를 포유동물 체내의 특정 부위로 전달하는 도구로서 사용할 수 있다. 조직 특이적 질환을 영상화하는데 사용하기 위한 키트를 또한 제공한다.
에틸렌디시스테인-약물 접합체, 99mTc, 킬레이트화, 표지화, 영상화

Description

에틸렌디시스테인(ＥＣ)-약물 접합체{Ethylenedicysteine(EC)-drug conjugates}
발명의 배경
정부는 본 발명에 있어서 권리를 소유하지 않는다.
본 발명은 일반적으로는 표지화, 방사성 영상화 및 화학적 합성 분야에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 표적 리간드를 방사성 표지화하기 위한 방책에 관한 것이다. 본 발명은 또한 종양 영상화 및 조직-특이적 질환 영상화에서 방사성 표지된 리간드를 사용하는 방법에 관한 것이다.
신티그래피 종양 영상화는 보다 더 종양 특이적인 방사성 약물의 개발에 의해 광범위하게 측정되도록 개선되었다. 보다 큰 종양 특이성으로 인해, 방사성 표지된 리간드뿐만 아니라 방사성 표지된 항체는 종양의 신티그래피 검출에서 새로운 시대를 열었고, 광범위한 발병전 발현 및 평가를 수행하였다[참조: Mathias et　al., 1996, 1997a, 1997b]. 방사성 핵종 영상화 기법(양전자 방출 토모그래피, PET; 단일 광자 방출 산출 토모그래피, SPECT)은 방사성 핵종-표지된 방사성 트레이서의 위치 및 농도를 맵핑하는 진단 단면 영상화 기술이다. CT 및 MRI는 종양의 위치 및 정도에 대한 상당한 해부학적 정보를 제공하더라도, 이러한 영상화 기법은 침습성 병소를 부종, 방사선 괴사, 분화도 또는 신경교증과 적합하게 식별할 수 없다. PET 및 SPECT를 사용하여, 대사 활성을 측정함으로써 종양의 위치 및 특성을 파악할 수 있다.
새로운 종양 저산소증 제제의 개발이 원발성 및 전이성 병소의 검출뿐만 아니라, 재발에 대한 방사선 반응성 및 시간의 예측을 위해 임상적으로 요망된다. 종양 저산소증의 진단은 병인학적 조사를 필요로 하기 때문에 당대의 어떠한 영상화 기법도 저산소증을 정확하게 측정하지 못한다. 치료된 각각의 종양에서 저산소증의 적어도 기준선을 인지하는 것 없이 저산소성 종양에 대한 치료의 성과를 예측하기란 흔히 어렵다. 에펜도르프 폴라로그래피 산소 미세전극이 종양에서의 산소 분압을 측정할 수 있더라도, 당해 기술은 침습적이고, 숙련된 작동자를 필요로 한다. 또한, 이러한 기술은 단지 접근가능한 종양(예를 들어, 두경부, 자궁) 상에서만 사용할 수 있으며, 다중 판독법을 필요로 한다. 따라서, 종양 저산소증을 측정하는 정확하고 용이한 방법은 환자 선별을 위해 유용할 것이다. 그러나, 종양 대 정상 조직 흡수 비율은 사용되는 방사성 약물에 따라 달라진다. 따라서, 신규한 방사성 약물을 임상적 시행에 도입할 경우에 종양 대 정상 조직 흡수 비율을 저산소증의 금 표준 에펜도르프 전극 측정법과 상호관련시키는 것이 합리적일 것이다.
[18F]FMISO를 사용하여, 두경부 종양, 심근 경색, 염증 및 뇌 허혈을 진단하여 왔다[참조: Martin et al. 1992; Yeh et al. 1994; Yeh et al. 1996; Liu et al. 1994]. 종양 대 정상 조직 흡수 비율을 종양 저산소증을 평가하기 위한 기준선으로서 사용한다[참조: Yet et al. 1996]. [18F]FMISO를 사용하여 종양 저산소증이 명확하게 입증되더라도, 신규한 영상화제를 임상적 시행에 도입하는 것은 용이한 입수가능성 및 동위원소 비용과 같은 몇몇 기타 인자에 의존적이다. [18F]FDG를 사용하는 종양 대사 영상화가 명확하게 입증되더라도, 분자 영상화제를 임상적 시행에 도입하는 것은 용이한 입수가능성 및 동위원소 비용과 같은 몇몇 기타 인자에 의존적이다. [18F]플루오로데옥시글루코스(FDG)가 종양, 심근 경색 및 신경학적 질환을 진단하는데 사용되어 왔다. 또한, PET 방사성 합성은 양전자 동위원소의 짧은 반감기로 인해 신속하여야만 한다. 18F 화학은 또한 복잡하다. 18F 화학은 상이한 분자에서는 재현가능하지 않다. 따라서, 다양한 약물에 접합시킬 수 있는 킬레이터를 개발하는 것이 이상적일 것이다. 바람직한 동위원소는 저비용(18F 경우의 $50/mCi에 대비하여 $0.21/mCi) 및 저에너지(18F 경우의 571Kev에 대비하여 140Kev)로 인해 99m Tc일 것이다. 99m Tc는 99Mo 발생기로부터 용이하게 수득된다. 유리한 물성뿐만 아니라 극도의 저가로 인해, 99m Tc는 방사성 약물을 표지화시키는데 바람직하 였다.
수가지 화합물을 질소 및 황 킬레이트를 이용하여 99m Tc로 표지화시켰다[참조: Blondeau et al., 1967; Davison et al., 1980]. 디아미노디티올 화합물로도 불리는 비스-아미노에탄티올 테트라덴테이트 리간드는 옥소테크네튬 그룹의 2개의 티올황 및 2개의 아민 질소 원자에의 유효한 결합을 기초로 하여 매우 안정한 Tc(V)O 착체를 형성시키는 것으로 공지되어 있다. 99m Tc-L,L-에틸렌디시스테인( 99m Tc-EC)은 N2S2 킬레이트의 최근의 성공적인 예이다. EC는 고도의 방사화학적 순도 및 안정성으로 용이하게 유효하게 99m Tc로 표지화시킬 수 있으며, 이는 활성 세뇨관 수송에 의해 신장을 통해 배출된다[참조: Surma et al., 1994; Van Nerom et al., 1990, 1993; Verbruggen et al., 1990, 1992]. EC의 다른 용도에서는 PET의 경우에 갈륨-68(양전자 방출기, t1/2=68분)로, 및 자기 공명 영상화(MRI)의 경우에 가돌리늄, 철 또는 망간으로 킬레이트화시킬 수 있다. 99m Tc-EC-네오마이신 및 99m Tc-EC-데옥시글루코스를 개발하여, 종양 특성화에서의 이들의 잠재적인 용도를 평가하였다.
발명의 요약
본 발명은 표적 조직을 영상화하기 위한 신규한 방사성 표지화 방책을 제공함으로써 선행 분야의 상기 및 다른 단점을 극복한다. 본 발명은 방사성 표지된 조직-특이적 리간드뿐만 아니라, 당해 방사성 표지된 리간드를 제조하고, 이들을 조직-특이적 질환을 영상화하는데 사용하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명은 조직 특이적 질환 영상화를 위한 조성물을 제공한다. 본 발명의 영상화 조성물은 일반적으로는 에틸렌디시스테인으로 킬레이트화된 방사성 핵종 표지 및 산 아암(arm)의 한쪽 또는 양쪽 상에서 에틸렌디시스테인에 접합된 조직 특이적 리간드를 포함한다. 에틸렌디시스테인은 방사성 핵종 표지와 N2S2 킬레이트를 형성한다. 물론, 킬레이트화된 화합물은 방사성 핵종 표지와 킬레이트화 화합물간의 이온 결합을 포함할 것이다. 용어 "EC-조직 특이적 리간드 접합체", "EC-유도체" 및 "EC-약물 접합체"는 본원에서 상호교환적으로 사용되어 비표지된 에틸렌디시스테인-조직 특이적 리간드 화합물을 언급한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "접합체"는 공유 결합된 화합물을 의미한다.
에틸렌디시스테인은 디아미노디티올(DADT) 화합물로도 공지된 비스-아미노에탄티올(BAT) 테트라덴테이트 리간드이다. 당해 화합물은 옥소테크네튬 그룹의 2개의 티올-황 및 2개의 아민-질소 원자로의 효율적인 결합을 기초로 하여 매우 안정한 Tc(V)O 착체를 형성시키는 것으로 공지되어 있다. 99m Tc 표지된 디에틸에스테르( 99m Tc-L,L-ECD)는 뇌 제제로서 공지되어 있다. 99m Tc-L,L-에틸렌디시스테인( 99m Tc-L,L-EC)은 이의 가장 극성인 대사물질이고, 뇨에서 신속하고 효율적으로 배출되는 것으로 것으로 밝혀졌다. 따라서, 99m Tc-L,L-EC는 신장 기능 제제로서 사용되어 왔다[참조: Verbruggen et　al. 1992].
조직 특이적 리간드는 포유동물 또는 환자의 체내로 도입되는 경우에 조직의 특이적 유형에 특이적으로 결합할 것이다. 본 발명의 조성물은 임의의 공지된 조직 특이적 화합물을 실질적으로 포함할 수 있는 것으로 고려된다. 바람직하게는, 본 발명과 관련하여 사용된 조직 특이적 리간드는 항암제, DNA 토포이소머라제 저해제, 항대사물, 종양 마커, 폴레이트 수용체 표적화 리간드, 종양 아폽토시스 세포 표적화 리간드, 종양 저산소증 표적화 리간드, DNA 삽입제, 수용체 마커, 펩타이드, 뉴클레오타이드, 기관 특이적 리간드, 항미생물제, 예를 들어, 항생제 또는 항진균제, 글루타메이트 펜타펩타이드 또는 글루코스 유사 제제일 것이다. 글루코스 유사 제제는 또한 "슈가"로서도 언급할 수 있다.
바람직한 항암제는 메토트렉세이트, 독소루비신, 타목시펜, 파클리탁셀, 토포테칸, LHRH, 미토마이신 C, 에토포사이드, 토무덱스, 포도필로톡신, 미토크산트론, 캡토테신, 콜치신, 엔도스타틴, 플루다라빈 및 젬시타빈을 포함한다. 바람직한 종양 마커는 PSA, ER, PR, AFP, CA-125, CA-199, CEA, 인터페론, BRCA1, 사이톡산, p53, VEGF, 인테그린, 엔도스타틴, HER-2/neu, 안티센스 마커 또는 모노클로날 항체를 포함한다. 임의의 다른 공지된 종양 마커 또는 임의의 모노클로날 항체가 본 발명과 관련하여 사용하는데 유효할 것으로 고려된다. 바람직한 폴레이트 수용체 표적화 리간드는 폴레이트, 메톡트렉세이트 및 토무덱스를 포함한다. 바람직한 종양 아폽토시스 세포 또는 종양 저산소증 표적화 리간드는 아넥신 V, 콜치신, 니트로이미다졸, 미토신 또는 메트로니다졸을 포함한다. 바람직한 항미생물제는 그 람 음성 및 양성 세균에 대한 암피실린, 아목시실린, 페니실린, 세팔로스포린, 클리다마이신, 겐타마이신, 카나마이신, 네오마이신, 나타마이신, 나프실린, 리팜핀, 테트라사이클린, 반코마이신, 블레오마이신 및 독시사이클린, 및 진균류에 대한 암포테리신 B, 아만타딘, 니스타틴, 케토코나졸, 폴리마이신, 아사이클로비르 및 간시클로비르를 포함한다. 바람직한 글루코스 유사 제제 또는 슈가는 네오마이신, 카나마이신, 겐타마이신, 파로마이신, 아미카신, 토브라마이신, 네틸마이신, 리보스타마이신, 시소마이신, 미크로마이신, 리비도마이신, 디베카신, 이세파마이신, 아스트로마이신, 아미노글리코사이드, 글루코스 또는 글루코사민을 포함한다.
특정 양태에 있어서, 에틸렌디시스테인과 조직 특이적 리간드간의 링커를 포함할 필요가 있다. 링커는 전형적으로는 수용액에서의 약물 용해도를 증가시킬 뿐만 아니라, 약물의 친화성에서의 변화를 최소화시키는데 사용된다. 실질적으로 조성물의 수용해도를 증가시킬 수 있는 임의의 링커는 본 발명과 관련한 사용에 고려되는 한편, 링커는 일반적으로는 폴리아미노산, 수용해성 펩타이드 또는 단일 아미노산일 수 있다. 예를 들어, 조직 특이적 리간드 또는 약물 상의 기능성 그룹이 지방족 또는 페놀계-OH, 예를 들어, 에스트라디올, 토포테칸, 파클리탁셀 또는 랄록시펜, 에토포사이드인 경우에, 링커는 폴리글루탐산(MW 약 750 내지 약 15,000), 폴리아스파르트산(MW 약 2,000 내지 약 15,000), 브로모에틸아세테이트, 글루탐산 또는 아스파르트산일 수 있다. 약물 기능성 그룹이 독소루비신, 미토마이신 C, 엔도스타틴, 아넥신 V, LHRH, 옥트레오타이드 및 VIP에서와 같은 지방족 또는 방향족-NH2 또는 펩타이드인 경우에, 링커는 폴리글루탐산(MW 약 750 내지 약 15,000), 폴리아스파르트산(MW 약 2,000 내지 약 15,000), 글루탐산 또는 아스파르트산일 수 있다. 메토트렉세이트 또는 폴산에서와 같이 약물 기능성 그룹이 카복실산 또는 펩타이드인 경우에, 링커는 에틸렌디아민 또는 라이신일 수 있다.
영상화에 바람직한 방사성 핵종이 99m Tc인 경우에, 특히 치료제로서 사용하기 위해서는 다른 방사성 핵종을 EC-조직 특이적 리간드 접합체, 또는 본 발명의 EC-약물 접합체에 킬레이트화시키는 것을 고려한다. 예를 들어, 다른 유용한 방사성 핵종은 188Re, 186Re, 153Sm, 166Ho, 90Y, 89 Sr, 67Ga, 68Ga, 111In, 153Gd 및 59Fe이다. 이들 조성물은 치료학적 방사성 핵종을 체내의 특이적 병소, 예를 들어, 유방암, 난소암, 전립선암(예를 들어, 186/188Re-EC-폴레이트를 사용) 및 두경부암(예를 들어, 186/188Re-EC-니트로이미다졸을 사용하여)에 전달하는데 유용하다.
본 발명의 구체적 양태는 99m Tc-EC-아넥신 V, 99m Tc-EC-콜치신, 99m Tc-EC-니트로이미다졸, 99m Tc-EC-글루타메이트 펜타펩타이드, 99m Tc-EC-메트로니다졸, 99m Tc-EC-폴레이트, 99m Tc-EC-메토트렉세이트, 99m Tc-EC-토무덱스, 99m Tc-EC-네오마이신, 99m Tc-EC-카나마이신, 99m Tc-EC-아미노글리코사이드, (글루코사민, EC-데옥시글루코스), 99m Tc-EC-겐타마이신 및 99m Tc-EC-토브라마이신을 포함한다.
본 발명은 영상화 또는 치료학적 용도를 위해 방사성 표지된 에틸렌디시스테인 약물 접합제 또는 유도체를 합성하는 방법을 추가로 제공한다. 당해 방법은 조직 특이적 리간드를 수득하고, 당해 리간드를 에틸렌디시스테인(EC)과 혼합하여 EC-조직 특이적 리간드 유도체를 수득하고, EC-조직 특이적 리간드 유도체를 방사성 핵종 및 환원제와 혼합하여 방사성 핵종 표직된 EC-조직 특이적 리간드 유도체를 수득함을 포함한다. 방사성 핵종은 N2S2 킬레이트를 통해 EC에 킬레이트화된다. 조직 특이적 리간드는 EC의 한쪽 또는 양쪽 산 아암에 직접적으로 또는 상기한 바와 같은 링커를 통해 접합된다. 환원제는 바람직하게는 디티오나이트 이온, 제1주석 이온 또는 제1철 이온이다.
본 발명은 영상화, 치료학적 용도 또는 진단적 또는 예후적 용도를 위해 조직 특이적 리간드를 표지화시키는 방법을 추가로 제공한다. 당해 표지화 방법은 조직 특이적 리간드를 수득하는 단계, 당해 조직 특이적 리간드를 에틸렌디시스테인(EC)과 혼합하여 EC-리간드 약물 접합체를 수득하는 단계 및 당해 약물 접합체를 환원제의 존재하에 99m Tc와 반응시켜 에틸렌디시스테인과 99m Tc간에 N2S2 킬레이트를 형성시키는 단계를 포함한다.
상기 양태의 목적을 위해, 조직 특이적 리간드는 위에서 기술하거나 본원에 논의된 바와 같은 임의의 리간드일 수 있다. 환원제는 임의의 공지된 환원제일 수 있으나, 바람직하게는 디티오나이트 이온, 제1주석 이온 또는 제1철 이온일 수 있다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 포유동물 체내 부위를 영상화하는 방법을 제공한다. 영상화 방법은 99m Tc 표지된 에틸렌디시스테인-조직 특이적 리간드 접합체를 포함하는 조성물의 유효한 진단학적 양을 투여하는 단계 및 상기 부위에 위치하는 99m Tc로부터 방사성 시그널을 검출하는 단계를 포함한다. 검출 단계는 전형적으로 상기 조성물의 포유동물 체내로의 도입 후 약 10분 내지 약 4시간 이내에 수행될 것이다. 가장 바람직하게는, 검출 단계는 상기 조성물의 포유동물 체내로의 주사 후 약 1시간 이내에 수행될 것이다.
특정의 바람직한 양태에 있어서, 상기 부위는 감염부, 종양, 심장, 폐, 뇌, 간, 비장, 췌장, 소장 또는 임의의 다른 기관일 수 있다. 종양 또는 감염부는 포유동물 체내 어디에서나 위치할 수 있으나, 일반적으로 유방, 난소, 전립선, 자궁내막, 폐, 뇌 또는 간일 수 있다. 상기 부위는 또한 폴레이트-양성 암 또는 에스트로겐-양성 암일 수 있다.
본 발명은 또한 방사성 약물 제제를 제조하기 위한 키트를 제공한다. 당해 키트는 일반적으로는 예정된 양의 에틸렌디시스테인-조직 특이적 리간드 접합체 조성물 및 접합체를 99m Tc로 표지시키기 위해 충분한 양의 환원제를 밀봉된 바이알 또는 백, 또는 다른 유형의 적합한 용기를 포함한다. 특정 경우에 있어서, 에틸렌디시스테인-조직 특이적 리간드 접합체 조성물은 또한 에틸렌디시스테인과 조직 특이적 리간드간의 링커를 포함할 것이다. 조직 특이적 리간드는 본원에 논의된 것과 같은 임의의 특이적 조직 유형에 특이적으로 결합하는 임의의 리간드일 수 있다. 링커가 조성물내에 포함되는 경우에, 이는 본원에 기술된 바와 같은 임의의 링커일 수 있다.
키트의 성분은 임의의 적합한 형태, 예를 들어, 액상, 동결 또는 건조 형태일 수 있다. 바람직한 양태에 있어서, 키트 성분은 동결건조된 형태로 제공된다. 당해 키트는 또한 항산화제 및/또는 스캐빈저를 포함할 수 있다. 항산화제는 임의의 공지된 항산화제일 수 있으나, 바람직하게는 비타민 C이다. 스캐빈저는 또한 잔류 방사성 핵종을 결합시키기 위해 존재할 수 있다. 가장 상업적으로 이용가능한 키트는 스캐빈저로서 글루코헵토네이트를 함유한다. 그러나, 글루코헵토네이트는 전형적인 키트 성분과 완전하게 반응하지 않아, 약 10 내지 15% 잔류물을 남긴다. 이러한 잔류 글로쿠헵토네이트는 종양에 작용하여, 영상화 결과를 왜곡할 것이다. 따라서, 본 발명자들은 스캐빈저로서 EDTA를 사용하기를 선호하는데, 이는 이것이 보다 저가이며, 보다 완전하게 반응하기 때문이다.
본 발명의 또 다른 국면은 특이적 종양의 치료를 위한 후보 화합물의 잠재적인 유용성을 측정하기 위한 예후적인 방법이다. 통상적으로는, 대부분의 종양을 약물이 몇개월 후 및 수천 달러 소모 후에도 특유한 종양에 대해 실제적으로 유효한지에 대한 어떠한 지시없이 화학요법에서 "선택된 통상의 약물"로 치료된다. 본 발명의 영상화 조성물은 특유한 약물을 표지된 EC-약물 접합체의 형태로 종양 부위로 전달한 다음, 부위를 수시간내에 영상화하여, 특유한 약물인지를 결정하는데 유용하다.
상기와 관련하여, 본 발명의 예후적 방법은 본 발명의 포유동물 체내의 종양 부위를 측정하는 단계, 종양 특이적 암 화학요법 약물 후보물에 접합되어 있는 EC에 킬레이트화된 방사성 핵종을 포함하는 영상화 조성물을 수득하는 단계, 당해 조성물을 포유동물 체내에 투여하는 단계 및 당해 부위를 영상화하여, 종양에 대한 후보 약물의 유효성을 측정하는 단계를 포함한다. 전형적으로는, 영상화 단계는 당해 조성물의 포유동물 체내로의 주사 후 약 10분 내지 약 4시간 이내에 수행될 것이다. 바람직하게는, 영상화 단계는 당해 조성물의 포유동물 체내로의 주사 후 약 1시간 이내에 수행될 것이다.
예후적 조성물 중의 EC에 접합시킬 암 화학요법 약물 후보물은 공지된 암 화학요법 약물로부터 선택할 수 있다. 이러한 약물은 표 2에 제시한다. 특정한 유형의 암에 특이적인 것으로 공지된 다수의 항암제가 존재한다. 그러나, 특이적 유형의 암에 대한 모든 항암제가 모든 환자에서 유효한 것은 아니다. 따라서, 본 발명은 처음으로 치료에 다량의 시간 및 돈을 소비하기 전에 후보 약물의 가능한 유효성을 측정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 신티그래피 영상화제를 제조하기 위한 시약이다. 본 발명의 시약은, 99m Tc 결합 잔기에 공유 결합된, 신티그래피에 의해 검출가능한 영상을 생성시키기에 충분한 생체내 표적화 부위에 대한 친화성을 갖는 조직 특이적 리간드를 포함한다. 99m Tc 결합 잔기는 직접적으로 조직 특이적 리간드에 결합시키거나, 상기한 바와 같은 링커를 통해 리간드에 결합시킨다. 99m Tc 결합 잔기는 바 람직하게는 +4 산화 상태에서의 99m Tc와 에틸렌디시스테인(EC)간의 N2S2 킬레이트이다. 조직 특이적 리간드는 EC의 한쪽 또는 양쪽 산 아암에 직접적으로 또는 상기한 바와 같은 링커를 통해 공유 결합할 것이다. 조직 특이적 리간드는 상기한 바와 같은 임의의 리간드일 수 있다.
다음의 도면은 본 명세서의 일부를 형성하며, 본 발명의 특정 국면을 추가로 명시하기 위해 포함된 것이다. 본 발명은 본원에 제시된 특이적 양태의 상세한 설명과 함께 이들 도면 중 하나 이상을 참조로 하여 보다 잘 이해될 것이다.
도 1: 99m Tc-EC-폴레이트의 합성도.
도 2: 99m Tc-EC-MTX(메토트렉세이트)의 합성도.
도 3: 99m Tc-EC-TDX (토무덱스)의 합성도.
도 4: 99m Tc-EC 및 99m Tc-EC-폴레이트에 대한 체내분포 연구.
도 5: 99m Tc-EC-폴레이트를 사용한 종양/근육 및 종양/혈액 카운트 비율에 대한 차단 연구.
도 6A 및 6B: 99m Tc-EC 주사된 그룹과 비교한 99m Tc-EC-폴레이트 주사된 그룹에서의 종양의 신티그래피 영상.
도 7: EC-MN(메트로니다졸)의 합성도.
도 8A 및 도 8B: EC-NIM에 대해, 도 8A는 합성도를 제시하고, 도 8B는 구조의 1H-NMR 확인을 도시한다.
도 9: 99m Tc-EC-MN, [18F]FMISO 및 [131I]IMISO에 대한 체내분포 연구(종양/혈액 비율).
도 10: 99m Tc-EC, [18F]FMISO 및 [131I]IMISO에 대한 체내분포 연구(종양/근육 비율).
도 11A 및 11B: 9m Tc-EC-MN(도 11A) 및 99m Tc-EC(도 11B) 주사된 그룹에서의 종양의 신티그래피 영상.
도 12: 99m Tc-EC-MN를 주사한지 1시간 후에 수행된 오토라디오그램.
도 13: 개 혈청 샘플내에서의 99m Tc-EC-NIM의 안정성을 도시한다.
도 14A 및 도 14B: 랫트(도 14A) 및 대조군과 비교하여 파클리탁셀로 처리된 랫트(도 14B)에서의 99m Tc-EC-NIM 대 99m Tc-EC의 유방 종양 흡수율을 도시한다.
도 15A, 도 15B, 도 15C 및 도 15D: 랫트(도 15A)에서의 99m Tc-EC-NIM 대 99m Tc-EC의 난소 종양 흡수율을 도시한다. 파클리탁셀로 처리된 랫트(도 15B)에서의 종양 흡수율은 파클리탁셀로 처리되지 않은 랫트(도 15A)에서의 종양 흡수율보다 낮다. 또한, 육종을 가진 랫트에서의 99m Tc-EC-NIM의 종양 흡수율을 도시한다. 도 15C는 파클리탁셀로 처리된 육종 보유 랫트에서의 종양 흡수율을 도시하는 한편, 도 15D는 파클리탁셀로 처리되지 않은 랫트에서의 종양 흡수율을 도시한다. 파클리탁셀로 처리한 후에 99m Tc-EC-NIM의 감소된 흡수율이 존재한다.
도 16: EC-GAP(펜타글루타메이트)의 합성도.
도 17: 99m Tc-EC-GAP 주사된 그룹에서의 유방 종양의 신티그래피 영상.
도 18: 상이한 시간 간격에서 99m Tc-EC-ANNEX V 주사된 그룹에서의 유방 종양의 신티그래피 영상.
도 19A 및 도 19B: 난소 종양 보유 그룹에서의 파클리탁셀 처리 전(도 19A) 및 처리 후(도 19B) 사이의 99m Tc-EC-ANNEX V의 흡수율 차이의 비교.
도 20A 및 도 20B: 육종 종양 보유 그룹에서의 파클리탁셀 처리 전(20A) 및 처리 후(20B) 사이의 99m Tc-EC-ANNEX V의 흡수율 차이의 비교.
도 21: EC-COL(콜치신)의 합성도.
도 22: 어떠한 분해 생성물도 EC-COL 합성에서 관찰되지 않음을 도시한다.
도 23: 99m Tc-EC-COL에 대한 시간 함수로서 종양 대 근육 및 종양 대 혈액의 비율.
도 24: 99m Tc-EC에 대한 시간 함수로서 종양 대 근육 및 종양 대 혈액의 비율.
도 25: 99m Tc-EC-COL를 사용한 유방 종양 보유 랫트에서의 생체내 영상화 연구.
도 26: 99m Tc-EC를 사용한 유방 종양 보유 랫트에서의 생체내 영상화 연구.
도 27: 99m Tc-EC-COL 대 99m Tc-EC의 주사 후 관심의 대상인 컴퓨터 윤곽화 영역.
도 28: 뇌졸중을 앓은 59세 남자 환자의 99m Tc-EC-MN을 사용한 SPECT. 영상은 주사한지 1시간 후에 촬영한다.
도 29: 도 28과 동일한 환자의 MRI T1 강조 영상.
도 30: 뇌졸중 후 1일이 지난 73세 환자에게 99m Tc-EC-MN을 주사한지 1시간 후의 SPECT.
도 31: 뇌졸중 후 12일이 지난 도 30에서 영상화한 바와 같은 73세 환자에게 99m Tc-EC-MN을 주사한지 1시간 후의 SPECT.
도 32: 뇌졸중 후 1일이 지난 도 30에서 영상화한 바와 같은 73세 남성 뇌졸중 환자의 CT.
도 33: 뇌졸중 후 12일이 지난 도 32에서 영상화한 바와 같은 73세 남성 뇌졸중 환자의 CT. 영상화를 위해 CT를 이용한 1일째와 12일째 사이에 두드러진 차이가 없음을 주목한다.
도 34: 뇌졸중을 앓은 72세 남자 환자에게 99m Tc-EC-MN을 주사한지 1시간 후의 SPECT.
도 35: 도 34에서 영상화한 바와 같은 72세 뇌졸중 환자의 CT. CT 영상이 병소 크기를 얼마나 과대화하는지를 주목한다.
도 36: 99m Tc-EC-네오마이신의 합성도.
도 37A: 99m Tc-EC 및 99m Tc-EC-네오마이신(100 mCi/랫트, iv.)의 투여 후의 유방 종양-보유 랫트의 신티그래피 영상은 종양이 주사한지 0.5 내지 4시간 후에 충분히 가시화됨을 제시한다.
도 37B: 유방 종양 환자의 99m Tc-EC-네오마이신(30 mCi, iv.)을 사용한 신티맘모그래피. 영상은 주사한지 2시간 후에 촬영한다.
도 38A: EC의 1H-NMR.
도 38B: 네오마이신의 1H-NMR.
도 38C: EC-네오마이신의 1H-NMR.
도 39A 및 39B: EC-네오마이신(M+ 1112.55)의 질량 분광분석.
도 40A: EC의 UV 파장 스캔.
도 40B.: 네오마이신의 UV 파장 스캔.
도 40C: EC-네오마이신의 UV 파장 스캔.
도 41: 99m Tc-EC-네오마이신의 방사성-TLC 분석.
도 42: 99m Tc-EC-네오마이신의 HPLC 분석(방사성 검출기).
도 43: 99m Tc-EC-네오마이신의 HPLC 분석(UV 254nm).
도 44: 18F-FDG의 HPLC 분석(방사성 검출기).
도 45: 18F-FDG의 HPLC 분석(UV 254nm).
도 46: 폐암 세포주내에서의 일련의 99m Tc-EC-약물 접합체의 시험관내 세포 흡수율 검정. 99m Tc-EC-네오마이신은 시험된 제제에서 가장 높은 흡수율을 나타낸다.
도 47: 99m Tc-EC-네오마이신 및 18F-FDG의 세포(A549) 흡수율에 대한 글루코스의 영향.
도 48A 및 도 48B: 약물 흡수율의 백분율(도 48A) 및 글루코스 부하에 의한 변화의 백분율(도 48B)로서 제시된 99m Tc-EC-네오마이신 및 18F-FDG 의 세포(H1299) 흡수율에 대한 영향.
도 49: 99m Tc-EC-글루코사민의 합성도.
도 50: 글루코스의 헥소키나제 검정.
도 51: 글루코사민의 헥소키나제 검정.
도 52: EC-글루코사민의 헥소키나제 검정.
도 53: EC-GAP-글루코사민의 헥소키나제 검정.
도 54: 99m Tc-EC-GAP-글루코사민의 합성도.
도 55A, 도 55B 및 도 55C: 폐암 세포주(A549)에서의 99m Tc-EC(도 56A), 99m Tc-EC-데옥시글루코스-GAP(도 56B) 및 18F-FDG(도 56C)의 시험관내 세포 흡수율 검정. 99m Tc-EC-DG는 18F-FDG와 비교하여 유사한 흡수율을 나타낸다.
도 56: 유방 종양 보유 랫트에서의 99m Tc-EC-GAP의 종양 대 조직 카운트 밀도 비율.
도 57: 유방암 세포주(13762)에서의 주사한지 2시간 후의 글루코스 부하에 의한 18PDG의 시험관내 세포 흡수율.
도 58: 유방 종양 보유 마우스에서의 99m Tc-EC-네오마이신의 생체내 조직 흡수율.
도 59: 99m Tc-EC-데옥시글루코스의 합성도.
도 60: EC-데옥시글루코스의 질량 분광분석.
도 61: EC-데옥시글루코스(EC-DG)의 1H-NMR.
도 62: 글루코사민의 1H-NMR.
도 63: 99m Tc-EC-DG의 방사성-TLC 분석.
도 64: 99m Tc-EC-데옥시글루코스 및 99m Tc-EC-의 HPLC 분석(방사성 검출기).
도 65: 99m Tc-EC-데옥시글루코스 및 99m Tc-EC의 HPLC 분석(방사성 검출기, 혼합).
도 66: 글루코스의 헥소키나제 검정.
도 67: FDG의 헥소키나제 검정.
도 68: EC-DG의 헥소키나제 검정.
도 69: 폐암 세포주(A549)에서의 99m Tc-EC-데옥시글루코스, 99m Tc-EC 및 18 F-FDG의 시험관내 세포 흡수율 검정. 99m Tc-EC-DG는 18 F-FDG와 비교하여 유사한 흡수율을 나타낸다.
도 70: 99m Tc-EC-DG의 유방 세포(13762 세포주) 흡수율에 대한 d- 및 l-글루코스의 영향.
도 71: 18 F-FDG의 유방 세포(13762 세포주) 흡수율에 대한 d- 및 l-글루코스의 영향.
도 72: 18 F-FDG의 유방 세포(A549 세포주) 흡수율에 대한 d- 및 l-글루코스의 영향.
도 73: 99m Tc-EC-DG의 유방 세포(A549 세포주) 흡수율에 대한 d- 및 l-글루코스의 영향.
도 74: 글루코사민 및 EC-DG(1.2mmol/kg, i.v.)에 의해 유도된 생체내 혈중 글루코스 수준의 영향.
도 75: FDG(1.2 및 1.9mmol/kg, i.v.) 및 인슐린에 의해 유도된 생체내 혈중 글루코스 수준의 영향.
도 76: 유방 종양 보유 랫트에서의 99m Tc-EC-데옥시글루코스의 종양 대 조직 카운트 밀도 비율.
도 77: 유방 종양 보유 랫트에서의 99m Tc-EC-데옥시글루코스의 생체내 체내분포.
도 78: 폐 종양 보유 마우스에서의 99m Tc-EC-데옥시글루코스의 생체내 조직 흡수율.
도 79: 폐 종양 보유 마우스에서의 99m Tc-EC-네오마이신의 생체내 조직 흡수율.
도 80: 폐 종양 보유 마우스에서의 18 F-FDG의 생체내 조직 흡수율.
도 81: 99m Tc-EC 및 99m Tc-EC-데옥시글루코스(100μCi/랫트, iv.)의 투여 후 유방 종양 보유 랫트의 평면 영상은 종양이 주사한지 0.5 내지 4시간 후에 충분히 가시화됨을 제시한다.
도 82A: 악성 성상세포종 환자의 MRI.
도 82B: 악성 성상세포종 환자의 99m Tc-EC-DG를 사용한 SPECT.
도 83A: 출혈성 성상세포종 환자의 MRI.
도 83B: 악성 성상세포종 환자의 99m Tc-EC-DG를 사용한 SPECT.
도 84A: 양성 수막종 환자의 MRI.
도 84B: 양성 수막종 환자의 99m Tc-EC-DG를 사용한 SPECT는 병소 증진된 흡수율을 나타내지 않는다.
도 85A: 폐 TB 환자의 CT.
도 85B: TB 환자의 99m Tc-EC-DG를 사용한 SPECT는 병소 증진된 흡수율을 나타내지 않는다.
도 86A: 폐암 환자의 CT.
도 86B: 폐암 환자의 99m Tc-EC-DG의 전신 영상.
도 86C: 폐암 종양을 갖는 환자의 99m Tc-EC-DG를 사용한 SPECT는 병소 증진된 흡수율을 나타낸다.
핵 의학 분야에서, 소량의 경구-투여된 방사성 표지된 트레이서 화합물(방사성 트레이서 또는 방사성 약물)의 분포를 검출함으로써 특정의 병리학적 상태를 국재화시키거나, 이들의 범위를 평가한다. 이들 방사성 약물을 검출하는 방법은 일반적으로는 영상화 또는 방사성 영상화 방법으로서 공지되어 있다.
방사성 영상화에 있어서, 방사성 표지는 감마-방사선 방출 방사성 핵종이고, 방사성 트레이서는 감마-방사선 검출 카메라를 이용하여 위치화시킨다(당해 방법은 종종 감마 신티그래피로서 언급된다). 영상화된 부위는 방사성 트레이서가 병리학적 부위에서 국재화되도록 선택(양성 대조로 명명됨)되거나, 달리, 방사성 트레이서가 상기 병리학적 부위에서 특이적으로 국재화되지 않도록 선택(음성 대조로 명명됨)되기 때문에 검출가능하다.
67Ga, 99m Tc, 111In, 123I, 125I, 169Yb 또는 186Re를 포함한 다양한 방사성 핵종은 방사성 영상화에 유용한 것으로 공지되어 있다. 보다 더 우수한 영상화 특성 및 보다 저가로 인해, 가능한 경우에 123I, 131I, 67Ga 및 111In 표지된 화합물을 상응하는 99m Tc 표지된 화합물로 대체하고자 하는 시도가 있었다. 보다 유리한 물성뿐만 아니라, 극히 저가($0.21/mCi)로 인해, 99m Tc는 방사성 약물을 표지화하는데 바람직하였다. DTPA-약물 접합체를 99m Tc로 효과적으로 표지시킬 수 있는 것으로 보고되어 있지만[참조: Mathias et　al., 1997], DTPA 잔기는 111In만큼 안정하게 99m Tc와 킬레이트화되지 않는다[참조: Goldsmith, 1997].
사람에서 최적의 방사성 영상화를 위해 다수의 인자를 고려하여야만 한다. 검출의 효율을 최대화시키기 위해, 100 내지 200keV 범위내의 감마 에너지를 방출하는 방사성 핵종이 바람직하다. 환자에게 흡수된 방사선량을 최소화시키기 위해, 방사성 핵종의 물리적 반감기는 영상화 과정이 허용할 수 있는 만큼 짧아야만 한다. 임의의 날짜에 및 임의의 날짜 중 시간에 수행되는 조사를 가능하게 하기 위해, 임상학적 부위에서 항상 입수가능한 방사성 핵종의 공급원을 갖는 것이 유리하다. 99m Tc는 140keV에서 감마 방사선을 방출하기 때문에 바람직한 방사성 핵종이고, 이는 6시간의 물리적 반감기를 가지고, 이는 몰리브덴-99/테크네튬-99m 발생기를 이용하여 부위에서 용이하게 입수가능하다.
디아미노디티올 화합물로도 불리는 비스-아미노에탄티올 테트라덴테이트 리간드는 옥소테크네튬 그룹의 2개의 티올황 및 2개의 아민 질소 원자로의 효율적인 결합을 기초로 하여 매우 안정한 Tc(V)O-착체를 형성하는 것으로 공지되어 있다[참조: Davison et　al., 1980;1981; Verbruggen et　al., 1992]. 99m Tc-L,L-에틸렌디시스테인( 99m Tc-EC)은 N2S2 킬레이트의 가장 최근의 성공적인 예이다[참조: Verbruggen et　al., 1992; Van Nerom et　al., 1993; Surma et　al., 1994]. 신규한 신장부 영상화제인 EC는 방사화학적 고순도 및 안정성을 가지고 99m Tc로 용이하고 효율적으로 표지화시킬 수 있으며, 이는 활성 세뇨관 수송에 의해 신장을 통해 분비된다[참조: Verbruggen et　al., 1992; Van Nerom et　al., 1993; Surma et　al., 1994; Verbruggen et　al., 1990; Van Nerom et　al., 1990; Jamar et　al., 1993]. EC의 다른 용도에서는 PET의 경우에 갈륨-68(양전자 방출기, t1/2=68분)로, 및 자기 공명 영상화(MRI)의 경우에 가돌리늄, 철 또는 망간으로 킬레이트화시킬 수 있다.
본 발명은 표지화 제제로서 99m Tc-EC를 사용하여, 리간드를 영상화에 특이적인 조직 유형에 표적화시킨다. EC와 조직 표적화 리간드와의 접합의 이점은 조직 표적화 리간드의 특이적 결합 특성이 목적하는 대상의 부위에 걸쳐 방사성 시그널을 결집시킨다는 것이다. 99m Tc-EC의 표지화 방책으로서의 사용은 실제적으로 임의의 유형의 화합물과 함께 유효할 수 있는 것으로 고려되지만, 몇몇 제시된 바람직한 리간드를 본원에서 예시 목적으로 제공한다. 본 발명의 99m Tc-EC-약물 접합체는 종양뿐만 아니라, 다른 조직-특이적 상태, 감염, 저산소성 조직(뇌졸중), 심근 경색, 아폽토시스 세포, 알츠하이머병 및 자궁내막증을 영상화하는데 유용할 수 있다.
방사성 표지된 단백질 및 펩타이드는 선행 분야에 보고되어 있다[참조: Ege et　al., 미국 특허 제4,832,940호, Abrams et al., 1990; Bakker et al., 1990; Goldsmith et al., 1995, 1997; Olexa et　al. 1982; Ranby et　al. 1988; Hadley et　al. 1988; Lees et　al. 1989; Sobel et　al. 1989; Stuttle, 1990; Maraganore et　al. 1991; Rodwell et　al. 1991; Tubis et　al. 1968; Sandrehagen 1983]. 그러나, 99m Tc-EC는 본 발명 이전에 디에틸에스테르[참조: Kabasakal, 2000] 이외에는 임의의 리간드와 접합하여 사용된 적이 없다. EC의 디에틸에스테르는 뇌 혈류제로서 사용되었다[참조: Kikukawa, et al., 2000].
방사성 영상화에 최적이더라도, 99m Tc의 화학은 다른 원소의 화학만큼 완전하게 연구되지 않았으며, 이러한 이유는 99m Tc로 방사성 표지화하는 방법이 풍부하지 않기 때문이다. 99m Tc는 통상적으로 몰리브덴-99/테크네튬-99m 발생기로부터 99m Tc 퍼테크네테이트(TcO4 -; +7 산화 상태에서의 테크네튬)로서 통상적으로 수득된다. 그러나, 퍼테크네테이트는 다른 화합물과 잘 결합하지 않는다. 따라서, 화합물을 방사성 표지화시키기 위해서는, 99m Tc 퍼테크네테이트를 또 다른 형태로 전환시켜야만 한다. 테크네튬은 수용액에서 안정한 이온을 형성하지 않기 때문에, 이는 99m Tc의 분해 및 불용성 이산화테크네튬으로의 전환 또는 퍼테크네테이트로의 역전환을 방지하기에 충분한 동역학적 및 열역학적 안정성을 갖는 배위 착체 형태로 상기 용액에 유지되어야만 한다.
방사성 표지의 목적을 위해, 99m Tc 착체를 테크네튬을 둘러싸는 공여체 그룹 모두가 단일 킬레이트화 리간드에 의해 제공되는 킬레이트 - 이 경우, 에틸렌디시스테인으로서 형성시키는 것이 특히 유리하다. 이로써 킬레이트화된 99m Tc가 직접적 으로 또는 에틸렌디시스테인와 리간드간의 링커를 통해 조직 특이적 리간드에 공유 결합시킬 수 있다.
테크네튬은 다수의 산화 상태: +1, +2, +4, +5, +6 및 +7을 갖는다. 테크네튬이 +1 산화 상태인 경우에, 이는 Tc MIBI로 불린다. Tc MIBI는 열 반응을 이용하여 제조하여야만 한다[참조: Seabold et al. 1999]. 본 발명의 목적을 위해, Tc가 +4 산화 상태로 존재하는 것이 중요하다. 이러한 산화 상태는 EC와의 N2S2 킬레이트를 형성시키는데 이상적이다. 따라서, 본 발명의 약물 접합체와의 방사성 테크네튬의 착체를 형성시키는데 있어서, 테크네튬 착체, 바람직하게는 99m Tc 퍼테크네테이트의 염을 환원제의 존재하에 본 발명의 약물 접합체와 반응시킨다.
본 발명에서 사용하기에 바람직한 환원제는 Tc를 이의 +4 산화 상태로 환원시키는 염화제일주석(SnCl2) 형태의 주석 이온이다. 그러나, 다른 환원제, 예를 들어, 디티오네이트 이온 또는 제1철 이온이 본 발명과 관련하여 유용할 수 있음을 고려한다. 또한, 환원제는 고체 상 환원제일 수 있음을 고려한다. 환원제의 양은 콜로이드의 형성을 방지하는데 필요하기 때문에 중요할 수 있다. 예를 들어, Tc 퍼테크네테이트 약 100 내지 약 300mCi당 약 10 내지 약 100㎍ SnCl2를 사용하는 것이 바람직하다. 가장 바람직한 양은 Tc 퍼테크네테이트 약 200mCi 및 약 2ml 염수당 약 0.1mg SnCl2이다. 이는 전형적으로 5명의 환자에서 사용하기에 충분한 Tc-EC-조직 특이적 리간드 접합체를 생성시킨다.
또한, 에틸렌디시스테인의 산화를 방지하기 위해 조성물에 항산화제를 포함시키는 것이 종종 중요하다. 본 발명과 관련하여 사용하기에 바람직한 항산화제는 비타민 C(아스코르브산)이다. 그러나, 다른 항산화제, 예를 들어, 토코페롤, 피리독신, 티아민 또는 루틴이 또한 유용할 수 있음을 고려한다.
일반적으로는, 본 발명과 관련하여 사용하기 위한 리간드는 EC를 한쪽 또는 양쪽 산 아암 상에 접합시킬 수 있는 아미노 또는 하이드록시 그룹을 가질 수 있다. 아미노산 또는 하이드록시 그룹이 입수가능하지 않은 경우(예를 들어, 산 기능성 그룹)에도, 바람직한 리간드는 여전히 링커, 예를 들어, 에틸렌디시스테인, 아미노 프로판올, 디에틸렌트리아민, 아스파르트산, 폴리아스파르트산, 글루탐산, 폴리글루탐산 또는 라이신을 첨가함으로써 본 발명의 방법을 이용하여, EC에 접합시키고 99m Tc로 표지시킬 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위해 고려되는 리간드는 혈관형성/항혈관형성 리간드, DNA 토포이소머라제 저해제, 해당과정 마커, 항대사 리간드, 아폽토시스/저산소성 리간드, DNA 삽입제, 수용체 마커, 펩타이드, 뉴클레오타이드, 항미생물제, 예를 들어, 항생제 또는 항진균제, 기관 특이적 리간드 및 슈가 또는 글루코스 유사 제제를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
EC 자체는 수용성이다. 본 발명의 EC-약물 접합체도 또한 수용성일 필요가 있다. 본 발명과 관련하여 사용되는 다수의 리간드는 수용성이거나, EC에 접합되는 경우에 수용성 화합물을 형성시킬 수 있다. 그러나, 조직 특이적 리간드가 수용성이지 않은 경우에, 리간드의 용해도를 증가시킬 수 있는 링커를 사용할 수 있다. 링커는 지방족 또는 방향족 알콜, 아민 또는 펩타이드에 결합할 수 있거나 카복실산 또는 펩타이드에 결합할 수 있다. 링커는 폴리아미노산(펩타이드) 또는 아미노산, 예를 들어, 글루탐산, 아스파르트산 또는 라이신일 수 있다. 표 1은 특이적 약물 기능성 그룹에 대해 바람직한 링커를 제시한다.
약물 기능성 그룹 링커 예
지방족 또는 폐놀계-OH EC-폴리(글루탐산)(MW. 750-15,000) 또는 EC. 폴리(아스파르트산)(MW. 2000-15,000) 또는 브로모에틸아세테이트 또는 EC-글루탐산 또는 EC-아스파르트산. A
지방족 또는 방향족-NH2 또는 펩타이드 EC-폴리(글루탐산)(MW. 750-15,000) 또는 EC-폴리(아스파르트산)(MW. 2000-15,000) 또는 EC-글루탐산(모노- 또는 디에스테르) 또는 EC-아스파르트산. B
카복실산 또는 펩타이드 에틸렌 디아민, 라이신 C
예: A. 에스트라디올, 토포테칸, 파클리탁셀, 랄록시펜, 에토포사이드 B. 독소루비신, 미토마이신 C, 엔도스타틴, 아넥신 V, LHRH, 옥트레오타이드, VIP C. 메토트렉세이트, 폴산
또한, 본 발명의 EC-조직 특이적 리간드 약물 접합체를 다른 방사성 핵종에 킬레이트화시켜, 방사성 핵종 요법에 사용할 수 있음을 고려한다. 일반적으로는, 실제적으로 α,β-방사체, γ-방사체 또는 β,γ-방사체를 본 발명과 관련하여 사용할 수 있다. 바람직한 β,γ-방사체는 166Ho, 188Re, 186Re, 153 Sm 및 89Sr을 포함한다. 바람직한 β-방사체는 90Y 및 225Ac를 포함한다. 바람직한 γ-방사체는 67 Ga, 68Ga, 64Cu, 62Cu 및 111In을 포함한다. 바람직한 α-방사체는 211At 및 212Bi를 포함한다. 또한, 상자성 물질, 예를 들어, Gd, Mn 및 Fe를 본 발명과 관련하여 EC와 킬 레이트화시킬 수 있음을 고려한다.
착체 및 당해 착체를 제조하기 위한 수단은 편리하게는 표지화시킬 본 발명의 EC-조직 특이적 리간드의 예정된 양 및 접합체를 99m Tc로 표지시키기에 충분한 양의 환원제를 함유하는 밀봉된 바이알을 포함한 키트 형태로 제공된다. 본 발명에 따르는 99m Tc 표지된 신티그래피 영상화제는 적합한 양의 99m Tc 또는 99m Tc 착체를 아래 실시예 1에 기술된 조건하에 EC-조직 특이적 리간드 접합체 및 환원제를 함유하는 바이알로 첨가하여 반응시킴으로써 제조할 수 있다. 당해 키트는 또한 통상의 약제학적 보조 물질, 예를 들어, 삼투압을 조절하기 위한 약제학적으로 허용되는 염, 완충제, 보존제, 항산화제 등을 함유할 수 있다. 키트의 성분은 액상, 동결 또는 건조 형태일 수 있다. 바람직한 양태에 있어서, 키트 성분은 동결건조된 형태로 제공된다.
본 발명에 의해 제공된 방사성 표지된 시약 또는 접합체는 적합한 양의 방사능을 갖도록 제공된다. 99m Tc 방사성 착체를 형성하는데 있어서, mL당 약 0.01밀리퀴리(mCi) 내지 약 300mCi의 농도로 방사능을 함유하는 용액 중에서 방사성 착체를 형성시키는 것이 일반적으로 바람직하다.
본 발명에 의해 제공된 99m Tc 표지된 영상화제를 사용하여, 포유동물 체내 부위를 가시화할 수 있다. 본 발명에 따라서, 99m Tc 표지된 신티그래피 영상화제는 단일 단위의 주사가능한 용량으로 투여한다. 당업자에게 공지된 임의의 통상의 담 체, 예를 들어, 멸균 식염수 또는 혈장을 주사가능한 용액을 제조하기 위해 방사성 표지화시킨 후에 사용하여, 본 발명에 따라서 다양한 기관, 종양 등을 진단학적으로 영상화시킬 수 있다. 투여할 단위 투여량은 약 0.01mCi 내지 약 300 mCi, 바람직하게는 10mCi 내지 약 200 mCi의 방사능이다. 단위 투여량으로 주사할 용액은 약 0.01mL 내지 약 10mL이다. 정맥내 투여 후, 기관 또는 종양의 생체내 영상화를 필여한 경우에 방사성 표지된 시약을 환자에게 유입한지 몇시간 이내에 또는 보다 더 긴 시간 후에 수행한다. 대부분의 예에서, 충분량의 투여량은 약 0.1시간 이내에 영상화할 부위내에 축적되어, 신티포토를 촬영할 수 있다. 진단학적 또는 예후적 목적을 위한 신티그래피 영상화의 임의의 통상적인 방법을 본 발명에 따라서 이용할 수 있다.
본 발명의 99m Tc-EC 표지화 방책을 또한 예후적 목적을 위해 사용할 수 있다. EC를 암 화학요법에 대해 선택된 공지된 약물, 예를 들어, 표 2에 기재된 것들에 접합시킬 수 있음을 고려한다. 다음, 이들 EC-약물 접합체를 99m Tc로 방사성 표지화시켜, 종양을 보유한 환자에게 투여할 수 있다. 표지된 EC-약물 접합체는 종양에 특이적으로 결합할 것이다. 영상화를 수행하여, 특정한 환자의 특유한 종양에 대한 암 화학요법 약물의 효능을 측정할 수 있다. 이러한 방식으로, 의사는 어떠한 치료 양식을 실행할 것인지, 어떠한 화학요법 약물이 가장 효능적인지를 신속하게 결정할 수 있다. 이는 약물을 선택하여, 화학요법의 과정에서 투여함을 포함하는 현행 방법을 능가하는 현저한 개선을 제공한다. 이는 약물의 효능을 측정할 수 있기 전에 환자에게 몇달간의 시간 및 수천 달러가 요구된다.
본 발명에 의해 제공된 99m Tc 표지된 EC-조직 특이적 리간드 접합체 및 착체를 수성 함염 매질과 같은 정맥 주사용 임의의 통상의 매질로 또는 혈장 매질로 정맥내로 투여할 수 있다. 이러한 매질은 또한 통상의 약제학적 보조 물질, 예를 들어, 삼투압을 조절하기 위한 약제학적으로 허용되는 염, 완충제, 보존제, 항산화제 등을 함유할 수 있다. 바람직한 매질 중 하나는 생리 식염수 및 혈장이다.
구체적이면서 바람직한 표적화 방책은 아래에서 보다 상세하게 논의한다.
종양 폴레이트 수용체 표적화
방사성 표지된 리간드, 예를 들어, 펜테트레오타이드 및 혈관작용성 소장 펩타이드는 세포 수용체에 결합하고, 이들 중 몇몇은 종양 세포 상에서 과발현한다[참조: Britton and Granowska, 1996; Krenning et　al., 1995; Reubi et　al., 1992; Goldsmith et　al., 1995; Virgolini et　al., 1994]. 이들 리간드는 면역원성이 아니어서 혈장으로부터 신속하게 제거되기 때문에, 수용체 영상화가 항체 영상화와 비교하여 보다 전망이 있는 것으로 보인다.
폴산뿐만 아니라, 메토트렉세이트와 같은 항폴레이트는 전형적인 환원된-폴레이트 담체 시스템과 더불어 고친화성 폴레이트 수용체(글리코실포스파티딜이노시톨-결합된 막 폴레이트-결합 단백질)를 통해 세포내로 유입된다[참조: Westerhof et　al., 1991; Orr et　al., 1995; Hsueh and Dolnick, 1993]. 폴레이트 수용체(FR)는 다수의 종양성 세포 유형(예를 들어, 폐, 유방, 난소, 자궁경부, 결장직장, 비인두, 신장 선암, 악성 흑생종 및 뇌실막세포종) 상에서 과발현되나, 본질적으로는 단지 수가지 정상 분화된 조직(예를 들어, 맥락막총, 태반, 갑상선 및 신장)에서만 발현된다[참조: Orr et　al., 1995; Weitman et　al., 1992a; Campbell et　al., 1991; Weitman et　al., 1992b; Holm et　al., 1994; Ross et　al., 1994; Franklin et　al., 1994; Weitman et　al., 1994]. FR을 사용하여, 폴레이트-접합된 단백질 독소, 약물/안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 리포좀을 폴레이트 수용체를 과발현시키는 종양 세포내로 전달하였다[참조: Ginobbi et　al., 1997; Leamon and Low, 1991; Leamon and Low, 1992; Leamon et　al., 1993; Lee and Low, 1994]. 또한, 항-T 세포 수용체 항체에 결합된 항-RF 항체를 함유하는 이특이적 항체를 사용하여, T 세포를 FR-양성 종양 세포에 대해 표적화시켰고, 난소 암종에 대해 임상적 시행에서 현재 사용되고 있다[참조: Canevari et　al., 1993; Bolhuis et　al., 1992; Patrick et　al., 1997; Coney et　al., 1994; Kranz et　al., 1995]. 유사하게는, 이러한 특성은 폴레이트 수용체 양성 종양의 영상화를 위해 방사성 표지된 폴레이트-접합체, 예를 들어, 67Ga-데페록사민-폴레이트 및 111In-DTPA-폴레이트를 개발하도록 촉진시켰다[참조: Mathias et　al., 1996; Wang et　al., 1997; Wang et　al., 1996; Mathias et　al., 1997b]. 이들 제제를 사용한 시험관내 및 생체내 연구의 결과는 폴레이트 수용체가 종양 영상화에 대해 잠재적인 표적일 수 있음을 시사한다. 본 발명에 있어서, 본 발명자들은 일련의 신규한 폴레이트 수용체 리간드를 개발하였다. 이들 리간드는 99m Tc-EC-폴레이트, 99m Tc-EC-메토트렉세이트( 99m Tc-EC-MTX) 및 99m Tc-EC-토무덱스( 99m Tc-EC-TDX)이다.
종양 저산소증 표적화
종양 세포는 산소의 부재하에서 보다 존재하에 통상적인 방사선에 보다 민감하며, 종양내의 저산소성 세포의 아주 낮은 백분율은 방사선에 대한 반응을 제한할 수 있다[참조: Hall, 1988; Bush et　al., 1978; Gray et　al., 1953]. 저산소성 방사선 저항성은 다수의 동물 종양에서, 그러나 사람에서는 단지 몇몇 종양 유형에서만 입증되어 있다[참조: Dische, 1991; Gatenby et　al., 1988; Nordsmark et　al., 1996]. 사람 종양에서의 저산소증의 발생은 대부분의 경우에 조직학 발견으로부터 및 동물 종양 연구로부터 추정되었다. 저산소증의 생체내 입증은 산소 전극을 사용한 조직 측정을 필요로 하고, 이들 기술의 침습은 이들의 임상적 용도를 제한하였다.
미소니다졸(MISO)은 저산소성 세포 감작제이고, 상이한 방사성 동위원소(예를 들어, 18F, 123I, 99m Tc)를 사용한 MISO의 표지화는 저산소성이나, 대사적으로 활성인 종양을 PET 또는 평면 신티그래피에 의해 충분히 산소화된 활성 종양과 식별하는데 유용할 수 있다. [18F]플루오로미소니다졸(FMISO)은 종양 저산소증을 평가하기 위해 PET와 함께 사용되었다. 최근의 연구는 [18F]FMISO를 통해 세포 산소 함 량을 모니터링하는 능력을 갖는 PET는 방사선에 대한 종양 반응을 예측하는데 고도의 잠재성을 갖는다는 것을 제시하였다[참조: Koh et al., 1992; Valk et al., 1992; Martin et al., 1989; Rasey et al., 1989; Rasey et al., 1990; Yang et al., 1995]. PET는 시준없이 보다 높은 해상도를 제공하나, 임상 셋팅에서 PET 동위원소를 사용하는 비용은 엄청나다. 요오드로의 MISO의 표지화가 대안이더라도, 갑상선 조직에서의 높은 흡수율이 관찰된다. 따라서, 동위원소가 보다 저가이고, 대부분의 주요 의료 시설에서 용이하게 입수가능한 평면 신티그래피용 화합물을 개발하는 것이 요망된다. 본 발명에 있어서, 본 발명자들은 99m Tc-EC-2-니트로이미다졸 및 99m Tc-EC-메트로니다졸의 합성법을 제공하고, 종양 저산소증 마커로서의 잠재적인 용도를 입증한다.
암의 펩타이드 영상화
펩타이드 및 아미노산이 각종 유형의 종양의 영상화에 성공적으로 사용되어 왔다[참조: Wester et　al., 1999; Coenen and Stocklin, 1988; Raderer et　al., 1996; Lambert et　al., 1990; Bakker et　al., 1990; Stella and Mathew, 1990; Butterfield et　al., 1998; Piper et　al., 1983; Mochizuki et　al., Dickinson and Hiltner, 1981]. 글루탐산계 펩타이드가 암 치료에 대한 약물 담체로서 사용되어 왔다[참조: Stella and Mathew, 1990; Butterfield et　al., 1998; Piper et　al., 1983; Mochizuki et　al., 1985; Dickinson and Hiltner, 1981]. 폴레이트의 글루타메이트 잔기는 생체내에서 분해되어 폴리글루타메이트를 형성하는 것으로 공지되어 있다. 다음, 폴리글루타메이트는 폴레이트에 재접합되어, 폴릴 폴리글루타메이트를 형성시키며, 이는 글루코스 대사에 관련된다. 글루탐산 펩타이드의 표지화는 종양의 악성을 식별하는데 유용할 수 있다. 본 발명에 있어서, 본 발명자들은 EC-글루탐산 펜타펩타이드의 합성법을 보고하고, 종양의 영상화에서의 이의 잠재적인 용도를 평가한다.
종양 아폽토시스 세포의 영상화
아폽토시스는 화학요법 및 방사선으로의 암의 치료 동안 발생한다[참조: Lennon et al., 1991; Abrams et al., 1990; Blakenberg et al., 1998; Blakenberg et al., 1999; Tait and Smith, 1991]. 아넥신 V는 포스포티딜세린에 결합하여, 종양 아폽토시스 세포에 의해 과발현되는 것으로 공지되어 있다[참조: Blakenberg et al., 1999; Tait and Smith, 1991]. 아넥신 V에 의한 아폽토시스 평가는 요법의 효능, 예를 들어, 질환 진행 또는 경감을 평가하는데 유용할 것이다. 본 발명에 있어서, 본 발명자들은 99m Tc-EC-아넥신 V(EC-ANNEX)을 합성하고, 종양의 영상화에서의 이의 잠재적인 용도를 평가한다.
종양 혈관형성의 영상화
혈관형성은 종양 증식 및 전이 발생을 부분적으로 초래한다. 항유사분열 화합물은 항혈관형성성이며, 항암 약물로서의 이들의 잠재적인 용도에 대해 공지되어 있다. 이들 화합물은 세포 주기의 유사분열기 동안 세포 분열을 저해한다. 세포 기능, 예를 들어, 세포 분열, 세포 운동, 분비, 섬모 및 편모 운동, 세포내 수송 및 세포 형태의 유지의 생화학 과정에서, 미세소관이 관여한다. 항유사분열 화합물은 고도의 친화성을 가지고 미세소관 단백질(튜불린)에 결합하여, 미세소관 회합을 붕괴시키고, 증식 세포의 유사분열 정지를 야기시키는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 항유사분열 화합물은 미세소관 저해제 또는 방추사 유해제로서 간주된다[참조: Lu, 1995].
다수 부류의 항유사분열 화합물은 튜불린에 결합하여 미세소관 회합-해체를 제어한다[참조: Lu, 1995; Goh et　al., 1998; Wang et　al., 1998; Rowinsky et　al., 1990; Imbert, 1998]. 콜치시노이드와 같은 화합물은 콜치신-결합 부위 상에서 튜불린과 상호작용하여, 미세소관 회합을 저해한다[참조: Lu, 1995; Goh et　al., 1998; Wang et　al., 1998]. 콜치시노이드 중에서, 콜치신은 급성 통풍의 예방을 처치하는데 사용되는 유효한 소염제이다. 콜치신은 또한 급성 골수성 백혈병에서 사용된다. 콜치시노이드가 특정 유형의 종양 증식에 대해 강력하더라도, 임상적 치료 잠재력은 치료 효과와 독성 효과의 분리에 대한 무능력으로 인해 제한된다[참조: Lu, 1995]. 그러나, 콜치신은 세포 기능을 평가하는 생화학적 수단으로서 유용할 수 있다. 본 발명에 있어서, 본 발명자들은 튜불린 기능에 대한 생화학적 과정의 평가를 위해 99m Tc-EC-콜치신(EC-COL)을 개발하였다.
종양 아폽토시스 세포의 영상화
아폽토시스는 화학요법 및 방사선으로의 암 치료 동안 발생한다. 아넥신 V는 포스포티딜세린에 결합하고 종양 아폽토시스 세포에 의해 과발현되는 것으로 공지되어 있다. 아넥신 V에 의한 아폽토시스의 평가는 요법의 효능, 예를 들어, 질환 진행 또는 경감을 평가하는데 유용할 것이다. 따라서, 99m Tc-EC-아넥신 V(EC-ANNEX)를 개발하였다.
종양 저산소증의 영상화
방사선 요법 전의 영상화 기법에 의한 종양 저산소증의 평가는 방사선 감작물질 또는 생체환원 약물(예를 들어, 티라파자민, 미토마이신 C)을 사용하는 치료에 대해 환자를 선택하는 합리적인 수단을 제공할 것이다. 이러한 환자의 선택은 저산소성 종양을 갖는 환자를 보다 정확하게 치료할 수 있도록 한다. 또한, 종양 억제제 유전자(P53)는 다중 약물 내성과 관련이 있다. 영상화 발견을 화학요법의 전후에 조직병리학에 의한 P53의 과발현과 상호관련시키는 것은 후속적인 종양 치료 반응에서 유용할 것이다. 99m Tc-EC-2-니트로이미다졸 및 99m Tc-EC-메트로니다졸을 개발하였다.
종양 혈관형성의 영상화
혈관형성은 부분적으로 종양 증식 및 전이 발생에 관여한다. 항유사분열 화합물은 항혈관형성성이며, 항암 약물로서의 이들의 잠재적인 용도에 대해 공지되어 있다. 이들 화합물은 세포 주기의 유사분열기 동안 세포 분열을 저해한다. 세포 기능, 예를 들어, 세포 분열, 세포 운동, 분비, 섬모 및 편모 운동, 세포내 수송 및 세포 형태의 유지의 생화학 과정 동안, 미세소관이 관여한다. 항유사분열 화합물은 고도의 친화성을 가지고 미세소관 단백질(튜불린)에 결합하여, 미세소관 회합을 붕괴시키고, 증식 세포의 유사분열 정지를 야기시키는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 항유사분열 화합물은 미세소관 저해제 또는 방추사 유해제로서 간주된다. 강력한 항혈관형성제인 콜치신은 미세소관 중합 및 중기에서 세포 정지를 저해하는 것으로 공지되어 있다. 콜치신(COL)은 세포 기능을 평가하는 생화학적 수단으로서 유용할 수 있다. 따라서, 99m Tc-EC-COL을 개발하였다.
뇌졸중으로 인한 저산소증의 영상화
종양 세포가 다소 저산소증이더라도, 산소 프로브를 사용하여 분압을 측정할 필요가 있다. 저산소증을 모의하기 위해, 본 발명자들은 99m Tc-EC-메트로니다졸( 99m Tc-EC-MN)을 사용하여 뇌졸중을 경험한 11명의 환자를 영상화하였다. 메트로니다졸은 종양 저산소증 마커이다. 뇌졸중 부위에서의 조직은 산소 결핍으로 인해 저산소증으로 된다. SPECT 영상화를 99m Tc-EC-MN의 주사 후 1시간째 및 3시간째 수행한다. 이러한 영상화 연구 모두는 병소를 양성으로 국재화시킨다. CT는 병소를 매우 분명하게 또는 정확하게 제시하지 못한다. 특정 경우에 MRI 및 CT는 병소 크기를 과장한다. 다음은 3명의 환자로부터 선택된 증례이다.
증례 1. 좌대뇌 기저핵에서 뇌졸중을 앓은 59세의 남자 환자. SPECT 99m Tc-EC-MN은 주사한지 1시간 후에 병소를 확인하였으며(도 28), 이는 MRI T1 강조 영상에 상응한다(도 29).
증례 2. 좌중대뇌 동맥(MCA) 부위에서 뇌졸중을 앓은 73세 남자 환자. SPECT 99m Tc-EC-MN은 주사한지 1일 후 및 12일 후에 수득된다(도 30 및 31). 병소는 12일째에 유의하게 증가된 흡수율을 나타낸다. 1일째와 12일째 사이에 두드러진 차이가 없다(도 32 및 33). 이러한 발견은 환자 증상이 조직 생존성으로 인해 개선됨(무산소증으로부터 저산소증으로)을 지시한다. SPECT 99m Tc-EC-MN은 CT 영상보다 더 우수한 기능적 정보를 제공한다.
증례 3. 우측 MCA 및 PCA 부위에서 뇌졸중을 앓은 72세 남자 환자. SPECT 99m Tc-EC-MN은 주사한지 1시간 후에 병소를 확인하였다(도 34). CT는 병소 크기를 과장한다(도 35).
종양 해당과정 표적화
방사성 표지된 리간드, 예를 들어, 다당류(네오마이신, 카나마이신, 토브라마이신) 및 단당류(글루코사민)는 세포 글루코스 수송체에 결합하여, 인산화되고 종양 세포 상에 과도하게 나타난다[참조: Rogers et al., 1968; Fanciulli et　al., 1994; Popovici et　al., 1971; Jones et　al., 1973; Hermann et　al., 2000]. 다당류(네오마이신, 카나마이신, 토브라마이신) 및 단당류(글루코사민) 유도된 글루코스 수준은 인슐린에 의해 억제될 수 있다[참조: Harada et al., 1995; Moller et al., 1991; Offield et al., 1996; Shankar et al., 1998; Yoshino et al., 1999; Villevalois-Cam et al., 2000]. 이들 리간드는 면역원성이 아니어서 혈장으로부터 신속하게 제거되기 때문에, 대사 영상화가 항체 영상화와 비교하여 보다 전망이 있는 것으로 보인다.
다음의 실시예는 본 발명의 바람직한 양태를 제시하기 위해 포함된다. 당업자라면, 다음 실시예에 기재된 기술은 본 발명의 실시에서 충분히 작용하여, 이의 실시에 바람직한 방식을 구성하는 것으로 간주할 수 있는 본 발명자들에게 발견된 기술을 제공함을 숙지하여만 한다. 그러나, 당업자는 본 기재를 고려하여 다수의 변화를 기재된 구체적 양태에서 수행하여, 본 발명의 취지 및 범주를 벗어나지 않으면서 동등하거나 유사한 결과를 수득할 수 있음을 숙지하여야만 한다.
실시예 1: 종양 폴레이트 수용체 표적화
EC의 합성
EC는 앞서 기술된 방법[참조: Ratner and Clarke, 1937; Blondeau et al., 1967; 각각은 본원에서 참조로 인용됨]에 따라서 2-단계 합성으로 제조한다. 전구체인 L-티아졸리딘-4-카복실산을 합성한다(융점: 195℃, 196 내지 197℃로 보고됨). 다음, EC를 제조한다(융점: 237℃, 251 내지 253℃로 보고됨). 구조를 1H-NMR 및 고속 원자 충격 질량 분광법(fast-atom bombardment mass sepctroscopy; FAB-MS)에 의해 확인한다.
메토트렉세이트의 아미노에틸아미도 유사체(MTX-NH2)의 합성
MIX(227mg, 0.5mmol)를 HCl 용액(2N) 1ml에 용해시킨다. pH 값은 3 미만이다. 상기 교반된 용액에 물 2ml 및 N-에톡시카보닐-2-에톡시-1,2-디하이드로퀴놀린(EEDQ, 메탄올 중 6.609%, 1mmol)을 실온에서 첨가한다. 에틸렌디아민(EDA, 0.6ml, 10mmol)를 천천히 첨가한다. 반응 혼합물을 밤새 교반하고, 용매를 진공하에 증발시킨다. 고체 원료를 디에틸 에테르(10ml), 아세토니트릴(10ml) 및 95% 에틸 알콜(50ml)로 세척하여 미반응된 EEDQ 및 EDA를 제거한다. 다음, 생성물을 동결건조시키고, 추가 정제없이 사용한다. 생성물은 황색 분말로서 중량이 210mg(84.7%)이다. 생성물의 융점: 195 내지 198℃(분해, MIX); 1H-NMR (D2O) δ 2.98-3.04 (d, 8H, -(CH2)2CONH(CH0)2NH2), 4.16-4.71 (m, 6H, -CH2-프테리디닐, 방향족-NCH3, NH-CH-COOH 글루타메이트), 6.63-6.64 (d, 2H, 방향족-CO), 7.51-753 (d, 2H. 방향족-N), 8.36 (s, lH, 프테리디닐). C22H28,N10,O4(M) +에 대한 FAB MS m/z 계산치: 496.515, 실측치: 496.835.
폴레이트의 아미노에틸아미도 유사체(폴레이트-NH2)의 합성
폴산 이수화물(1g, 2.0mmol)을 물 10ml에 첨가한다. pH 값은 HCl(2N)을 사용하여 조정한다. 상기 교반된 용액에 N-에톡시카보닐-2-에톡시-1,2-디하이드로퀴놀린(EEDQ, 메탄올 10ml 중의 1g, 4.0 mmol) 및 에틸렌디아민(EDA, 1.3ml, 18mmol)을 천천히 첨가한다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반한다. 용매를 진공하에 증발시킨다. 생성물을 메탄올(50ml)에 침전시키고, 추가로 아세톤(100ml)으로 세척하여 미반응된 EEDQ 및 EDIT를 제거한다. 다음, 생성물을 동결건조시키고, 추가의 정제없이 사용한다. 닌하이드린(메탄올 중 2%) 분무는 아미노 그룹의 양성 강도를 나타낸다. 생성물은 황색 분말로서 중량이 0.6g(수율 60%)이다. 생성물의 융점: 250℃(분해). 1H-NMR (D2O) δ1.97-2.27 (m, 2H, 폴레이트의 -CH2 글루타메이트), 3.05-3.40 (d, 6H, -CH2CONH(CH2)2NH2), 4.27-4.84 (m, 3H, -CH2-프테리디닐, NH-CH-COOH 글루타메이트), 6.68-6.70 (d, 2H, 방향족-CO), 7.60-7.62 (d, 2H, 방향족-N), 8.44 (s, 1H, 프테리디닐). C21H25N9,O5(M)+에 대한 FAB MS m/z 계산치: 483, 실측치: 483.21.
에틸렌디시스테인-폴레이트(EC-폴레이트)의 합성
EC를 용해시키키 위해, NaOH(2N, 0.1ml)를 물(1.5ml) 중의 EC(114mg, 0.425mmol)의 교반된 용액에 첨가한다. 상기 무색 용액에, 설포-NHS(92.3mg, 0.425mmol) 및 EDC(81.5mg, 0.425mmol)를 첨가한다. 다음, 폴레이트-NH2(205mg, 0.425mmol)를 첨가한다. 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반한다. 혼합물을 분자 컷-오프가 500인 Spectra/POR 분자 다공성 막(제조원: Spectrum Medical Industries Inc., Houston, TX)을 사용하여 48시간 동안 투석시킨다. 투석 후, 생성물을 동결건조시킨다. 생성물의 중량은 116mg(수율: 35%)이다. 융점: l95℃(분해); 1H-NMR (D2O) δ1.98-2.28 (m, 2H, 폴레이트의 -CH2 글루타메이트), 2.60-2.95 (m, 4H 및 EC의 -CH2-SH). 3.24-3.34 (m, 10H, -CH2-CO, 폴레이트의 에틸렌디아민 및 EC의 에틸렌디아민), 4.27-4.77 (m, 5H, -CH-프테리디닐, 폴레이트의 NH-CH-COOH 글루타메이트 및 EC의 NH-CH-COOH), 6.60-6.62 (d, 2H, 방향족-CO), 7.58-7.59 (d, 2H. 방향족-N), 8.59 (s, 1H, 프테리디닐). C29H37N11S2 O8Na2(8H2O)에 대한 분석 계산치, FAB MS m/z (M)+ 777.3(무수). C, 37.79; H. 5.75; N, 16.72; S, 6.95. 실측치: m/z (M)+ 777.7 (20), 489.4 (100). C, 37.40; H, 5.42; N. 15.43; S, 7.58.
99m Tc를 사용한 EC-폴레이트 및 EC의 방사성 표지화
99m Tc-EC-폴레이트의 방사성 합성을 필요량의 99m Tc-퍼테크네테이트를 EC-폴레이트의 동결건조된 잔사(3mg), SnCl2(100㎍), Na2HPO4(13.5mg), 아스코르브산(0.5mg) 및 NaEDTA(0.5mg)를 함유하는 자가제 키트에 첨가하여 달성한다. 제제의 최종 pH는 7.4이다. 또한, 99m Tc-EC를 pH 10에서 EC의 동결건조된 잔사(3mg), SnCl2(100㎍), Na2IPO4 (13.5mg), 아스코르브산(0.5mg) 및 NaEDTA(0.5mg)를 함유하는 자가제 키트를 사용하여 수득한다. 다음, 제제의 최종 pH를 7.4로 조정한다. 방사화학적 순도를 각각 아세톤(시스템 A) 및 암모늄 아세테이트(물 중 1M): 메탄올(4:1)(시스템 B)로 용출시키는 TLC(ITLC SG, 제조원: Gelman Sciences, Ann Arbor, MI)에 의해 측정한다. 방사성-TLC(제조원: Bioscan, Washington, DC) 분석으로부터, 방사화학적 순도는 방사성 약물 둘다에 대해 95%를 초과한다. 방사성-TLC 데이터는 표 2에 요약한다. 99m Tc-EC-폴레이트의 합성은 도 1에 제시되어 있다.
암 화학요법용으로 선택된 약물
하기 표에는 미국 및 캐나다에서 암 치료용으로 사용되는 약물 및 이의 주요 부작용이 기재되어 있다. 선택된 약물의 목록은 문헌[Medical Letter]의 고문의 의견을 토대로 한다. 일부 약물에는 이들 약물이 미국 식품의약청(US Food and Drug Admistration)에 의해 승인되지 않았다는 표시를 기재한다. 항암 약물 및 이의 부작용은 다음과 같다. 본 발명의 목적을 위해, 하기 목록은 예시적이며 비포괄적인 것을 의미한다.
선택된 약물
암 선택된 약물 특정 대체물
부신피질** 미토탄 시스플라틴 독소루비신, 스트렙토조신, 에토포사이드
방광* 국소: BCG의 적하주입 전신계: 메토트렉세이트+빈블라스틴+독소루비신+클라플라틴(MVAC) 클라플라틴+메토트렉세이트+빈블라스틴(CMV) 미토마이신, 독소루비신 또는 티오타페의 적하주입 페시탁셀, 배합물 중 클라플라틴을 카르보플라틴으로 대체
뇌 퇴행성 성상세포종* 퇴행성 핍지교종* 교모세포종** 수모세포종 프로카바진+라무아틴+빈크리스틴 프로카르바진+라무스틴+빈크리스틴 카르무스틴 또는 라무스틴 빈크리스틴+카르무스틴±메키오레타민±메토트렉세이트 메키오레타민+빈크리스틴+프로카르바진+프레드니손(MOPP) 빈크리스틴+클라플라틴±사이클로포스파마이드 카르무스틴, 클라플라틴 카르무스틴, 클라플라틴 프로카르바진, 클라플라틴, 에토포사이드
암 선택된 약물 특정 대체물
원발성 중추신경계 림프종 메토트렉세이트(고투여량 정맥내 및/또는 경막내)±시타라빈(정맥내 및/또는 경막내) 사이클로포스파마이드+독소루비신+빈크리스틴+프레드니손(CHOP)
유방 보조적1: 사이클로포스파마이드+메토트렉세이트+플루오로우라실(CMF); 사이클로포스파마이드+독소루비신±플루오로우라실(AC 또는 CAF); 타목시펜 전이성: 수용체-음성 및/또는 호르몬-반응성인 경우 사이클로포스파마이드+메토트렉세이트+플루오로우라실(CMF) 또는 사이클로포스파마이드+독소루비신±플루오로우라실(AC 또는 CAF); 수용체 양성 및/또는 호르몬-민감성2인 경우 타목시펜 파클리탁셀; 티오테파+독소루비신+빈블라스틴; 미토마이신+빈블라스틴;미토마이신+메토트렉세이트+미톡산트론; 연속 주입에 의한 플루오로우라실; 골수 이식3
자궁경부** 클라플라틴 이포스파마이드(수단을 사용) 블레오마이신+이포스파마이드(수단을 사용)+클라플라틴 클로람부실, 빈크리스틴, 플루오로우라실, 독소루비신, 메토트렉세이트, 알트레타민
융모막암종 메토트렉세이트±류코보린 닥티노마이신 메토트렉세이트+닥티노마이신+사이클로포스파마이드(MAC) 에토포사이드+메토트렉세이트_닥티노마이신+사이클로포스파마이드+빈크리스틴
결장직장* 보조 결장4: 플루오로우라실+ 레바미솔; 플루오로우라실+류코보린 전이성: 플루오로우라실+류코보린 간 전이: 간내 동맥 플록수리딘 미토마이신
태아 횡문근육종 빈크리스틴+닥티노마이신±사이클로파스파마이드 빈크리스틴+이포스파마이드(수단을 사용)+에토포사이드 동일물+독소루비신
암 선택된 약물 특정 대체물
자궁내막** 메가스트롤 또는 기타 프로게스틴 독소루비신+클라플라틴±사이클로포스파마이드 플루오로우라실, 타목시펜, 알트레타민
식도* 클라플라틴+플루오로우라실 독소루비신, 메토트락세이트, 미토마이신
유윙(Ewing) 육종5 사이클로포스파마이드(또는 이포스파마이드(수단을 사용))+독소루비신+빈크리스틴(CAV)±닥티노마이신 CAV+에토포사이드
위 플루오로우라실±류코보린 클라플라틴, 독소루비신, 에토포사이드, 메토트렉세이트+류코보린, 미토마이신
두경부 편평세포*6 클라플라틴+플루오로우라실 메토트렉세이트 블레오마이신, 카르보플라틴, 파클리탁셀
소도 세포** 스트렙토조신+독소루비신 스트렙토조신+플루오로우라실; 클로로조토신†; 옥트레오타이드
카포시(Kaposi) 육종*(에이즈와 관련됨) 에토포사이드 또는 인터페론 알파 또는 빈블라스틴 독소루비신+블레오마이신+빈크리스틴 또는 빈블라스틴(ABV) 빈크리스틴, 독소루비신, 블레오마이신
백혈병 급성 림프구성 백혈병(ALL)7 도입: 빈크리스틴+프레드니손+아스파라기나제±다우노루비신 CNS 예방: 경막내 메토트렉세이트±전신성 고투여량 메토트렉세이트와 류코보린±경막내 시스타라빈±경막내 하이드로코르티손 유지: 메토트렉세이트+머캅토푸린 골수 이식38 도입: 동일물±고투여량 메토트렉세이트±시타라빈; 아스파라기나제를 대신한 페가스파르가제 테니포사이드 또는 에토포사이드 고투여량 시타라빈 유지: 동일물+주기적 빈크리스틴+프레드니손
급성 골수성 백혈병(AML)9 도입: 시타라빈+ 다우노루비신 또는 이다루비신 도입후: 고투여량 시타라빈±기타 약물(예:에토포사이드) 골수 이식3 시타라빈+미톡산트론 고투여량 시타라빈
암 선택된 약물 특정 대체물
만성 림프구성 백혈병(CLL) 클로람부실±프레드니손 플루다라빈 클라드리빈, 사이클로포스파마이드, 펜토스타틴, 빈크리스틴, 독소루비신
만성 골수성 백혈병(CML)10 만성기 가속기11 급성기11 모발 세포 백혈병 골수 이식3 인터페론 알파 하이드록시우레아 골수 이식3 림프구: 빈크리스틴+프레드니손+L-아스파라기나제+경막내 메토트렉세이트(±메토트렉세이트+8-머캅토푸린으로 유지) 펜토스타틴 또는 클라드리빈 부술판 하이드록시우레아, 부술판 트레티노인† 암세크린†, 아자시티딘 빈크리스틴±플리카마이신 인터페론 알파, 클로람부실, 플루다라빈
간** 독소루비신 플루오로우라실 간내-동맥 플록수리딘 또는 클라플라틴
폐, 소세포(cat cell) 클라플라틴+에토포사이드(PE) 사이클로포스파마이드+독소루비신+빈크리스틴(CAV) PE와 CAV를 교대로 사용 사이클로포스파마이드+에토포사이드+클라플라틴(CEP) 독소루비신+사이클로포스파마이드+에토포사이드(ACE) 이포스파마이드(수단을 사용)+ 카르보플라틴+에토포사이드(ICE) 매일 경구 에토포사이드 에토포사이드+이포스파마이드(수단을 사용)+클라플라틴(VIP 파클리탁셀)
폐(비소세포)** 클라플라틴+에토포사이드 클라플라틴+빈블라스틴±미토마이신 클라플라틴+빈크리스틴 클라플라틴+플루오로우라실+류코보린 카르보플라틴+파클리탁셀
호지킨(Hodgkin) 림프종12 독소루비신+블레오마이신+빈블라스틴+다카르바진(ABVD) ABVD를 MOPP와 교대로 사용 메클로레타민+빈크리스틴+프로카르바진(±프레드니손)독소루비신+블레오마이신+빈블라스틴(MOP[P]-ABV) 메클로레타민+빈블라스틴+프로카르바진+프레드니손(MOPP_ 클로람부실+빈블라스틴+프로카르바진+프레드니손±카르무스틴 에토포사이드+빈블라스틴+독소루비신 골수 이식3
암 선택된 약물 특정 대체물
비호지킨 버킷트 림프종 사이클로포스파마이드+빈크리스틴+메토트렉세이트 사이클로포스파마이드+고투여량 시타라빈±메토트렉세이트와 류코보린 경막내 메토트렉세이트 또는 시타라빈 이포스파마이드(수단을 사용) 사이클로포스파마이드+독소루비신+빈크리스틴+프레드니손(CHOP)
미만성 대세포 림프종 사이클로포스파마이드+독소루비신+빈크리스틴+프레드니손(CHOP) 때때로 프레드니손을 덱사메타손으로 대체함, 메토트렉세이트, 에토포사이드, 시타라빈, 블레오마이신, 프로카르바진, 이포스파마이드 및 미톡산트론을 포함하는 기타 배합 섭생, 골수 이식3
여포 림프종 사이클로포스파마이드 또는 클로람부실 동일물±빈크리스틴 및 프레드니손±에토포사이드 인터페론 알파, 클라드리빈, 플루다라빈 골수 이식3 사이클로포스파마이드+독소루비신+빈크리스틴+프레드니손(CHOP)
흑색종** 인터페론 알파 다카르바진 카르무스틴, 로무스틴, 시스플라틴, 다카라바진+클라플라틴+카르무스틴+타목시펜 알데스류킨
균상식육종* PUVA(프소랄렌+자외선 A) 메클로레타민(국소) 인터페론 알파 전자 빔 방사선 요법 메토트렉세이트 이소트레티노인, 국소 카르무스틴, 펜토시스틴, 플루다라빈, 클라드리빈, 포토페레시스(photopheresis; 체외 광화학요법), 비호지킨 림포종에서와 같은 화학요법
골수종* 멜팔란(또는 사이클로포스파마이드)+ 프레드니손 멜팔란 ± 카르무스틴+사이클로포스파마이드+프레드니손±빈크리스틴 덱사메타손+독소루비신+빈크리스틴(VAD) 빈크리스틴+카르무스틴+독소루비신+프레드니손(VBAP) 인터페론 알파 골수 이식3 고투여량 덱사메타손
암 선택된 약물 특정 대체물
신경모세포종* 독소루비신+사이클로포스파마이드+클라플라틴+테니포사이드 또는 에토포사이드 독소루비신+사이클로포스파마이드 클라플라틴+사이클로포스파마이드 카르보플라틴, 에토포사이드 골수 이식3
골 육종5 독소루비신+클라플라틴±에토포사이드±이포스파마이드 이포스파마이드(수단을 사용), 에토포사이드, 카르보플라틴, 고투여량의 메토트렉세이트와 류코보린 사이클로포스파마이드+에토포사이드
난소 클라플라틴(또는 카르보플라틴)+파클리탁셀 클라플라틴(또는 카로보플라틴)+사이클로포스파마이드(CP)±독소루비신(CAP) 이포스파마이드(수단을 사용), 파클리탁셀, 타목시펜, 멜팔란, 알트레타민
췌장** 플루오로우라실±류코보린 젬시타빈
전립선 류프롤리드(또는 고세렐린)±플루타마이드 에스트라무스틴±빈블라스틴, 아미노글루테티마이드+하이드로코르티손, 에스트라무스틴+에토포사이드, 디에틸스틸베스트롤, 닐루타마이드
신장** 알데스류킨 인터페론 알파 빈블라스틴, 플록수리딘
망막모세포종5* 독소루비신+사이클로포스파마이드±클라플라틴±에토포사이드±빈크리스틴 카르보플라틴, 에토포사이드, 이포스파마이드(수단을 사용)
성인 연부조직 육종* 독소루비신±다카르바진±사이클로포스파마이드±이포스파마이드(수단을 사용) 미토마이신+독소루비신+클라플라틴 빈크리스틴, 에토포사이드
고환 클라플라틴+에토포사이드±블레오마이신(PEB) 빈블라스탄(또는 에토포사이드)+이포스파마이드(수단을 사용)+클라플라틴(VIP) 골수 이식3
윌름스(Wilms) 종양 닥티노마이신+빈크리스틴±독소루비신±사이클로포스파마이드 이포스파마이드(수단을 사용), 에토포사이드, 카르보플라틴
* 화학요법은 중간 정도의 활성만을 갖는다. ** 화학요법은 적은 활성만을 갖는다. 1 화학요법을 병용하거나 병용하지 않은 타목시펜은 일반적으로 폐경기 에스트로겐 수용체-양성 또는 모드-양성 환자용으로 권장되며 타목시펜을 사용하거나 사용하지 않은 화학요법은 폐경기전 모드-양성용으로 권장된다. 화학요법 및/또는 타목시펜을 사용한 보조 치료는 종양이 보다 크거나 유해한 예후 지표를 나타낸 모드-음성 환자용으로 권장된다. 2 메가스트롤 및 기타 호르몬제는 타목시펜으로 실패한 일부 환자에서 효과적일 수 있다. 3 고투여량 화학요법 후[참조: Medical Letter, 34: 79, 1982). 4 직장암의 경우, 플루오로우라실과 방사선을 사용한 수술후 보조 치료는 플루오로우라실만을 사용한 치료 전과 후에 수행한다. 5 약물은 외과 절제술, 방사선 요법 또는 둘다와 병용한 경우에만 큰 활성을 갖는다. 6 비타민 A 유사체 락트라티노인(아크구타나)는 전-종양성 병변(백반증)을 조절하고 2차 원발성 종양의 속도를 감소시킨다[참조: SE Banner et al, J Natl Cancer Inst, 88:140 1994]. †미국에서 조사용으로만 사용가능 7 고위험 환자(예: 고령, 세포유전적 비정상성, 성인)는 도입, 유지 및 "강화"를 위해 추가의 약물을 요할 수 있다(회복된 후에 추가의 약물을 사용함). 추가의 약물은 사이클로포스파마이드, 미톡산트론 및 티오구아닌을 포함한다. 영국에서 대규모 조절 시험의 결과는 강화가 ALL을 앓는 모든 아동에서 생존율을 증가시킬 수 있다는 것을 제시한다[참조: JM Chasselle et al, Lancet, 34B: 143, Jan 21, 1995]. 8 초기에 예후가 불량한 환자 또는 회복 후 재발한 환자 9 일부 급성 전골수구성 백혈병 환자는 트라타노인에 대해 완전한 반응성을 나타냈다. 이러한 치료는 주로 발열 및 호흡 곤란을 특징으로 하는 독성 증후군을 유발할 수 있다[참조: RP Warrell, Jr et al. N Eng J. Med, 329:177, 1993]. 10 동종이형 HLA-동일 친족 골수 이식은 만성기 CML 환자의 40% 내지 70%, 가속기 CML 환자의 18% 내지 28% 및 15% 미만의 급성기 환자를 치유할 수 있다. 골수 이식 후의 무병 생존율은 50세를 초과하는 연령, 진단후 3년을 초과하는 질병 지속기간 및 항원-불일치 또는 일치된-비관련 공여 골수의 사용에 의해 불리하게 영향을 받는다. 또한, 인터페론은 완전한 세포유전적 반응을 성취하는 만성기 CML 환자를 치유할 수 있다(약 10%); 이는 새로이 만성기 CML로 진단된 80세를 초과하는 연령의 환자 및 동종이형 골수 이식의 후보자가 아닌 모든 환자용으로 선택된 치료이다. 단독의 화학요법은 일시적이다. 11 2차 만성기가 이들 배합제 중 어느 하나로 달성되는 경우, 동종이형 골수 이식이 고려되어야 한다. 2차 만성기에서 골수 이식은 30% 내지 35%의 CML 환자에 대해 치유적일 수 있다. 12 제한기 호지킨(1기 및 2기)는 방사선 요법에 의해 치유될 수 있다. 범발성 질병(3b기 및 4기)는 화학요법을 요한다. 일부 중간기 및 선택된 임상 상황은 둘다에 의해 유리할 수 있다. + 미국에서 조사용으로만 사용가능함
항암 약물 및 호르몬
약물 급성 독성‡ 지연된 독성‡
알데스류킨(인터류킨-2; 제조원: Proleukin-Cetus Oncology) 발열;체액 정체; 고혈압; 호흡 곤란; 발진; 빈혈; 혈소판감소증; 오심 및 구토; 설사;모세혈관누출증후군;신독성; 심근 독성; 간독성; 결절 홍반; 호중구 화학주성 결손 신경정신과 질환; 갑상선 기능저하증; 신증후군; 가능한 급성 백질뇌병증;상완 신경총병변; 장 천공
알트레타민(헥사메틸-멜라민; 제조원: Hexalen - U Bioscience) 오심 및 구토 골수기능억제; CNS 우울증; 말초신경병증; 환각; 출혈, 진전, 탈모증; 발진
아미노글루테티마이드(시타드렌, 제조원: Ciba) 졸음; 오심; 현기증; 발진 갑상선 기능저하증(희박함); 골수기능억제
†암사크린(m-AMSA; 아마이딘; AMSP PD-Parke-Davis, Amsidyl-Warner-Lambert) 졸음 및 구토; 설사; 주입시의 통증 또는 정맥염; 아나필락시. 골수기능억제; 간 손상; 경련; 심실세동;탈모증; 울혈성 심부전; 신장 손상; 간 손상
아스파라긴아제(Elsparmerck; Kidrolase in Canada) 졸음 및 구토; 열; 오한; 두통; 과민성; 과민증; 복통; 혼수 상태를 유발하는 과혈당증 CNS 우울증 또는 과흥분증; 급성 출혈 췌장염; 응고 결함; 혈전증; 신장 손상; 간 손상
자궁경부** 클라플라틴, 이포스파마이드(수단을 사용) 블레오마이신 이포스파마이드(수단을 사용) 클로람부실, 빈크리스틴, 플루오로우라실, 독소루비신, 메토트렉세이트, 알트레타민
융모막암종 메토트렉세이트±류코보린 닥티노마이신 메토트렉세이트+ 닥티노마이신+ 사이클로포스파마이드(MAC) 에토포사이드+ 메토트렉세이트+ 닥티노마이신+ 사이클로포스파마이드+ 빈크리스틴
결장직장* 보조 결장4: 플루오로우라실+ 레바미솔; 플루오로우라실+ 류코보린 전이성: 플루오로우라실+류코보린
태아 횡문근육육종6 빈크리스틴+덱티노마이신±사이클로파스파마이드 빈크리스틴+이포스파마이드(수단을 사용)+에토포사이드 동일+ 독소루비신
자궁내막** 메가스트롤 또는 기타 프로게스틴 독소루비신+클라플라틴± 사이클로포스파마이드 플루오로우라실, 타목시펜, 알트레타민
암 선택된 약물 특정 대체물
식도* 클라플라틴+플루오로우라실 독소루비신, 메토트락세이트, 미토마이신
유윙(Ewing) 육종5 사이클로포스파마이드(또는 이포스파마이드(수단을 사용))+독소루비신+빈크리스틴(CAV)±닥티노마이신 CAV+에토포사이드
위** 플루오로우라실±류코보린 클라플라틴 독소루비신, 에토포사이드, 메토트렉세이트+류코보린, 미토마이신
두경부 편평세포*6 클라플라틴+플루오로우라실 메토트렉세이트 블레오마이신, 카르보플라틴, 파클리탁셀
소도 세포** 스트렙토조신+독소루비신 스트렙토조신+플루오로우라실; 클로로조토신; 옥트레오타이드
카포시(Kaposi) 육종(에이즈와 관련됨)* 에토포사이드 또는 인터페론 알파 또는 빈블라스틴 독소루비신+블레오마이신+빈크리스틴 또는 빈블라스틴(ABV) 빈크리스틴, 독소루비신, 블레오마이신
백혈병 급성 림프루성 백혈병(ALL)7 유도: 빈크리스틴+프레드니손+아스파라기나제±다우노루비신 CNS 예방: 경막내 메토트렉세이트±전신성 고투여량 메토트렉세이트와 류코보린±경막내 시스타라빈±경막내 하이드로코르티손 유지: 메토트렉세이트±머캅토푸린 골수 이식3 유도: 동일물±고투여량 메토트렉세이트±시타라빈; 아스파라기나제를 대신한 페가스파르가제 테니포사이드 또는 에토포사이드 고투여량 시타라빈 유지: 동일+주기적 빈크리스틴%프레드니손
급성 골수성 백혈병(AML)9 유도: 시타라빈+다우노루비신 또는 이다루비신 유도후: 고투여량 시타라빈±기타 약물(예:에토포사이드) 골수 이식3 시타라빈+ 미톡산트론 고투여량 시타라빈
만성 림프구성 백혈병(CLL) 클로람부실±프레드니손 플루다라빈 클라플라틴, 사이클로포스파마이드, 펜토스타틴, 빈크리스틴, 독소루비신
†미국에서 조사용으로만 사용가능 ‡투여량-제한 효과는 굵은 글씨로 표시한다. 피부 반응(때로는 중증), 색소과다침착 및 안 독성은 실질적으로 모든 비호르몬계 항암 약물에서 보고되었다. 다른 약물과의 유해한 상호작용은 문헌[참조: Medical Letter Handbook of Adverse Drug Interactions, 1995]을 참조한다. 1. 미국에서 조사용으로만 사용가능함. 2. 메가스트롤 및 기타 호르몬제는 타목시펜이 효과가 없는 일부 환자에서 효과적일 수 있다. 3. 고투여량 화학요법 후[참조: Medical Letter, 34: 79, 1982). 4. 직장암의 경우, 플루오로우라실과 방사선을 사용한 수술후 보조 치료는 플루오로우라실만을 사용한 치료 전과 후에 수행한다. 5. 약물은 외과 절제술, 방사선 요법 또는 둘다와 병용한 경우에만 큰 활성을 갖는다. 6. 비타민 A 유사체 락트라티노인(아크구타나)는 전-종양성 병변(백반증)을 조절하고 2차 원발성 종양의 속도를 감소시킨다[참조: SE Banner et al, J Natl Cancer Inst, 88:140 1994]. 7. 고위험 환자(예: 고령, 세포유전적 비정상성, 성인)는 유도, 유지 및 "강화"를 위해 추가의 약물을 요할 수 있다(회복된 후에 추가의 약물을 사용함). 추가의 약물은 사이클로포스파마이드, 미톡산트론 및 티오구아닌을 포함한다. 영국에서 한가지 조절된 대규모 시험의 결과는 강화가 ALL을 앓는 모든 아동에서 생존율을 증가시킬 수 있다는 것을 제시한다[참조: JM Chasselle et al, Lancet, 34B: 143, Jan 21, 1995]. 8. 초기에 예후가 불량한 환자 또는 회복 후 재발한 환자 9. 일부 전골수구성 백혈병 환자는 트레토노인에 대해 완전한 반응성을 나타냈다. 이러한 치료는 주로 발열 및 호흡 곤란을 특징으로 하는 독성 증후군을 유발할 수 있다[참조: RP Warrell, Jr et al. N Eng J. Med, 329:177, 1993]. 10. 동종이형 HLA-동일 친족 골수 이식은 만성기 CML 환자의 40% 내지 70%, 가속화기 CML 환자의 18% 내지 28% 및 15% 미만의 급성기 환자를 치유할 수 있다. 골수 이식 후의 무병 생존율은 50세를 초과하는 연경, 진단후 3년을 초과하는 질병 지속기간 및 항원-불일치 또는 일치된-비관련 공여 골수의 사용에 의해 불리하게 영향을 받는다. 또한, 인터페론은 완전한 세포유전적 반응을 성취하는 만성기 CML 환자을 치유할 수 있다(약 10%); 이는 새로이 만성기 CML로 진단된 80세를 초과하는 환자 및 동종이형 골수 이식의 후보가 아닌 모든 환자용으로 선택된 치료이다. 단독의 화학요법은 일시적이다.
99m Tc를 사용한 EC-MTX 및 EC-TDX의 방사성 표지화
EC-폴레이트 합성에 대해 기술된 동일한 방법을 사용하여, EC-MTX 및 EC-TDX를 제조한다. 표지화 과정은 EC-MTX 및 EC-TDX이 사용되는 것을 제외하고는 99m Tc- EC-폴레이트의 제조에 대해 기술한 바와 동일하다. 99m Tc-EC-MTX 및 99m Tc-EC-TDX의 합성은 도 2 및 도 3에 제시한다.
99m Tc-EC-폴레이트, 99m Tc-EC-MTX 및 99m Tc-EC-TDX의 안정성 검정
99m Tc-EC-폴레이트, 99m Tc-EC-MTX 및 99m Tc-EC-TDX의 안정성은 혈청 샘플에서 시험한다. 간략하게, 740KBq의 1mg 99m Tc-EC-폴레이트, 99m Tc-EC-MIX 및 99m Tc-EC-TDX를 개 혈청(200㎕)내에서 37℃에서 4시간 동안 배양한다. 혈청 샘플을 물 중 50% 메탄올로 희석시키고, 방사성-TLC를 상기 기술한 바와 같이 0.5시간째, 2시간째 및 4시간째에 반복한다.
조직 분포 연구
암컷 피셔(Fischer) 344 랫트(150±25g)(공급원: Harlan Sprague-Dawley, Indianapolis, IN)를 25-게이지 바늘을 사용하여 뒷다리에 13762 종양 세포주 현탁액(106개 세포/랫트, 피셔 랫트에 특이적인 종양 세포주)로부터의 포유동물 종양 세포 0.1ml로 피하 접종시킨다. 연구는 착상한지 14일 내지 17일 후 종양이 약 1cm 직경에 도달하면 수행한다. 동물은 각 과정 전에 케타민(10 내지 15mg/랫트, 복강내)으로 마취시킨다.
조직 분포 연구에서, 각 동물에게 370 내지 550KBq의 99m Tc-EC-폴레이트 또는 99m Tc-EC (n=3/시점)를 정맥내 주사한다. 주사된 각 리간드의 질량은 랫트당 10㎍이다. 방사성 약물을 투여한 후 20분째, 1시간째, 2시간째 및 4시간째에, 마취된 동물을 희생시키고 종양 및 선택한 조직을 절개하고, 칭량하고 감마 계수기(제조원: Packard Instruments, Downers Grove, IL)를 사용하여 방사능을 측정한다. 각 샘플중 트레이서의 체내분포는 조직 습식 중량 g당 주사된 투여량의 백분율(%ID/g)로서 계산한다. 본래 주사물의 희색된 샘플로부터의 카운트를 참조용으로 사용한다. 종양/비표적 조직 카운트 밀도 비를 상응하는 %ID/g 값으로부터 계산한다. 스튜던트-t 검정(Student-t test)을 사용하여 두 그룹간의 유의차를 평가한다.
별도의 연구에서, 차단 연구를 수행하여 수용체-매개된 과정을 측정한다. 차단 연구에서, 99m Tc-EC-폴레이트는 폴산 50 및 150μmol/kg과 함께, 종양 보유 랫트(n=3/그룹)에게 동시-투여한다. 동물을 주사한지 1시간 후에 치사시키고 데이터를 수집한다.
신티그래피 영상화 및 오토라디오그래피 연구
신티그래피 영상을, 99m Tc-표지된 방사성 트레이서 18.5MBq를 정맥내 주사한지 0.5시간, 2시간 및 4시간 후에 저에너지 평행구멍형 조준기가 장착된 감마 카메라(제조원: Siemens Medical Systems, Inc., Hoffman Estates, IL)을 사용하여 수 득한다.
전신 오토라디오그램을 정량적 영상 분석기(Cyclone Storage Phosphor System, 제조원: Packard, Meridian, CI.)를 사용하여 수득한다. 99m Tc-EC-폴레이트 37MBq를 정맥내 주사한 후, 동물을 1시간째에 치사시키고 신체를 카복시메틸 셀룰로스(4%)에 고정시킨다. 동결된 신체를 저온조(LKB 2250 cryomicrotome)에 고정시키고 100㎛ 관상 단면으로 절단한다. 각 단면을 해동시키고 슬라이드 위에 고정시킨다. 다음, 슬라이드를 다목적 인광 저장 스크린(MP, 7001480)과 접촉되게 놓고 15시간 동안 노출시킨다( 99m Tc-표지됨). 인광 스크린은 적색 레이저에 의해 여기되고, 미리 흡수된 에너지와 비례하는 생성된 청색 광이 기록된다.
결과
99m Tc-EC-폴레이트의 화학 및 안정성
폴레이트, MTX 및 TDX의 간단하고 빠르며 고수율의 아미노에틸아미도 및 EC 유사체를 개발한다. 이들 유사체의 구조를 NMR 및 질량 분광 분석에 의해 확인한다. EC-폴레이트를 사용한 99m Tc 의 방사성 합성을 높은(>95%) 방사화학적 순도로 달성한다. 99m Tc-EC-폴레이트는 개 혈청 샘플내에서 20분째, 1시간째, 2시간째 및 4시간째에 안정한 것으로 밝혀졌다.
99m Tc-EC-폴레이트의 체내분포
체내분포 연구는, 20분째 내지 4시간째의 종양/혈액 카운트 밀도 비가 99m Tc-EC-폴레이트 경우에는 점차적으로 증가하는 반면에, 이들 수치가 99m Tc-EC의 경우에는 동일 시간에서 감소한다는 것을 제시한다(도 4). 99m Tc-EC-폴레이트 및 99m Tc-EC에 대한 %ID/흡수량 g 값, 종양/혈액 및 종양/근육 비는 표 3 및 4에 각각 제시한다.
유방 종양 보유 랫트에서의 99m Tc-EC-폴레이트의 체내분포
기관 또는 조직마다 주사된 99m Tc-EC-폴레이트 투여량의 %
20분 1시간 2시간 4시간
혈액 폐 간 위 신장 갑상선 근육 장 요도 종양 종양/혈액 종양/근육 0.370±0.049 0.294±0.017 0.274±0.027 0.130±0.002 4.328±0.896 0.311±0.030 0.058±0.004 0.131±0.013 12.637±2.271 0.298±0.033 0.812±0.098 5.157±0.690 0.165±0.028 0.164±0.024 0.185±0.037 0.557±0.389 4.052±0.488 0.149±0.033 0.0257±0.005 0.101±0.071 10.473±3.083 0.147±0.026 0.894±0.069 5.739±0.347 0.086±0.005 0.092±0.002 0.148±0.042 0.118±0.093 5.102±0.276 0.095±0.011 0.016±0.007 0.031±0.006 8.543±2.763 0.106±0.029 1.229±0.325 6.876±2.277 0.058±0.002 0.063±0.003 0.105±0.002 0.073±0.065 4.673±0.399 0.066±0.011 0.008±0.0005 0.108±0.072 2.447±0.376 0.071±0.006 1.227±0.129 8.515±0.307
제시된 수치는 3마리 동물로부터의 데이터의 평균 ± 표준 편차를 나타낸다.
신티그래피 영상화 및 오토라디오그래피 연구
상이한 시점에서 수득된 신티그래피 영상은 99m Tc-EC-폴레이트 주사된 그룹에 서 종양의 가시화를 나타낸다. 대조적으로, 99m Tc-EC 주사된 그룹에서 명백한 종양 흡수는 나타나지 않는다(도 6). 두 방사성 트레이서는 모든 영상에서 명백한 신장 흡수를 나타낸다. 99m Tc-EC-폴레이트를 주사한 후 1시간째에 수행한 오토라디오그램은 종양 활성을 명백하게 입증한다.
실시예 2: 종양 저산소증 표적화
2-(2-메틸-5-니트로-1H 이미다졸릴)에틸아민(메트로니아졸의 아미노 유사체, MN-NH2)
메트로니다졸의 아미노 유사체는 앞서 기술된 방법[참조: Hay et　al., 1994]에 따라서 제조한다. 간략하게, 메트로니다졸을 메실화 유사체(융점: 149 내지 150℃, 153 내지 154℃로 보고됨, TLC:에틸 아세테이트, Rf=0.45)로 전환시켜 75%를 수득한다. 이어서, 메실화 메트로니다졸을 나트륨 아지드와 반응시켜 80%의 수율로 아지도 유사체(TLC: 에틸 아세테이트, Rf=0.52)를 수득한다. 아지도 유사체를 트리페닐 포스핀으로 환원시켜, 목적하는 아미노 유사체(융점: 190 내지 192℃, 194 내지 195℃로 보고됨, TLC: 에틸 아세테이트, Rf=0.15)를 수득한다(수율: 60%). 닌하이드린(메탄올 중 2%) 분무는 MN-MH2의 아미노 그룹의 양성 강도를 나타낸다. 구조를 1H-NMR 및 질량 분광법(FAB-MS)에 의해 확인한다. m/z 171(M+H, 100).
에틸렌디시스테인-메트로니다졸(EC-MN)의 합성
수산화나트륨(2N, O.2ml)을 물(5ml) 중의 EC(134mg, 0.50mmol)의 교반된 용액에 첨가한다. 상기 무색 용액에, 설포-NHS(217mg, 1.0mmol) 및 EDC(192mg, 1.0mmol)를 첨가한다. 다음, MN-NH: 디하이드로클로라이드 염(340mg, 2.0mmol)을 첨가한다. 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반한다. 혼합물을 컷-오프가 500인 Spectra/POR 분자 다공성 막(제조원: Spectrum Medical Industries Inc., Houston, TX)을 사용하여 48시간 동안 투석시킨다. 투석 후, 생성물을 동결건조기(제조원: Labconco, Kansas City, MO)를 사용하여 동결건조시킨다. 생성물의 중량은 315mg(수율: 55%)이다. 1H-NMR (D20) δ 2.93 (s, 6H, 니트로이미다졸-CH 3), 2.60-2.95 (m, 4H 및 EC의 -CH 2-SH), 3.30-3.66 (m, 8H, EC의 에틸렌디아민 및 니트로이미다졸-CH2-CH 2-NH2), 3.70-3.99 (t, 2H, EC의 NH-CH-CO), 5.05 (t, 4H, 메트로니다졸-CH 2-CH2-NH2) (s, 2H, 니트로이미다졸 C=CH). FAB MS m/z 572 (M+, 20). EC-MN의 합성도는 도 7에 제시한다.
3-(2-니트로-1H-이미다졸릴)프로필아민(니트로이미다졸의 아미노 유사체, NIM-NH2)의 합성
디메틸포름아미드(DMF, 50ml) 중의 2-니트로이미다졸(1g, 8.34mmol) 및 Cs2CO3(2.9g, 8.90mmol)을 함유하는 교반된 혼합물에 1,3-디토실프로판(3.84g, 9.99mmol)을 첨가한다. 반응물을 80℃에서 3시간 동안 가열한다. 용매를 진공하에 증발시키고, 잔사를 에틸아세테이트에 현탁시킨다. 고체를 여과하고, 용매를 농축시키고, 실리카 겔-팩킹된 컬럼에 부하하고, 헥산:에틸아세테이트(1:1)로 용출시킨다. 융점이 108 내지 111℃인 생성물 3-토실프로필-(2-니트로이미다졸)(1.67g, 57.5%)을 분리한다. 1H-NMR (CDCl3) δ 2.23 (m, 2H), 2.48 (S. 3H), 4.06 (t, 2H, J=5.7Hz), 4.52 (t, 2H, J=6.8Hz), 7.09 (S. 1H), 7.24 (S. 1H), 7.40 (d, 2H, J=8.2Hz).7.77 (d, 2H, J=8.2Hz).
다음, 토실화 2-니트로이미다졸(1.33g, 4.08 mmol)을 100℃에서 3시간 동안 DMF(10ml) 중의 나트륨 아지드(Q29g, 4.49 mmol)와 반응시킨다. 냉각시킨 후, 물(20ml)를 첨가하고, 생성물을 에틸아세테이트(3×20ml)로부터 추출한다. 용매를 MgSO4에서 건조시키고 증발 건조시켜 아지도 유사체(0.6g, 75%, TLC: 헥산:에틸 아세테이트; 1:1, Rf=0.42)를 수득한다. 1H-NMR (CDCl3) δ 2.14 (m, 2H), 3.41 (t, 2H, J=6.2Hz), 4.54 (t, 2H, J=6.9Hz), 7.17 (S. 2H).
아지도 유사체(0.57g, 2.90mmol)를 실온에서 4시간 동안 테트라하이드로푸란(PHI) 중의 트리페닐 포스핀(1.14g, 4.35mmol)을 사용하여 환원시킨다. 농축 HCl(12ml)을 첨가하고 추가로 5시간 동안 가열한다. 생성물을 에틸아세테이트와 물 혼합물로부터 추출한다. 에틸 아세테이트를 MgSO4에서 건조시키고 증발 건조시켜, 아민 하이드로클로라이드 유사체(360mg, 60%)를 수득한다. 닌하이드린(메탄올 중 2%) 분무는 NIM-NH의 아미노 그룹의 양성 강도를 나타낸다. 1H-NMR (D2O) δ 2.29 (m, 2H), 3.13 (t, 2H, J=7.8Hz), 3.60 (br, 2H), 4.35 (t, 2H, J=7.4Hz), 7.50 (d, 1H, J=2.1Hz),7.63 (d, 1H, J=2.1Hz).
에틸렌디시스테인-니트로이미다졸(EC-NIM)의 합성
수산화나트륨(2N, 0.6ml)을 물(2ml) 중의 EC의 교반된 용액(134mg, 0.50mmol)에 첨가한다. 상기 무색 용액에, 설포-NHS(260.6mg, 1.2mmol), EDC(230mg, 1.2mmol) 및 수산화나트륨(2N, 1ml)을 첨가한다. 다음, NIM-NH2 하이드로클로라이드 염(206.6mg, 1.0mmol)을 첨가한다. 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반한다. 혼합물을 컷-오프가 500인 Spectra/POR 분자 다공성 막(제조원: Spectrum Medical Industries Inc., Houston, TX)을 사용하여 48시간 동안 투석시킨다. 투석 후, 생성물을 동결건조기(제조원: Labconco, Kansas City, MO)을 사용하여 동결건조시킨다. 생성물의 중량은 594.8mg(수율: 98%)이다. EC-NIM의 합성도는 도 8A에 제시한다. 구조를 1H-NMR(D2O)에 의해 확인한다(도 8B).
99m Tc를 사용한 EC-MN 및 EC-NIM의 방사성 표지화
99m Tc-EC-MN 및 99m Tc-EC-NIM의 방사성 합성을, 필요량의 퍼테크네테이트를 EC-MN 또는 EC-NIM의 동결건조된 잔사(3mg), SnCl2(100㎍), Na2HPO4(13.5mg), 아스코르브산(0.5mg) 및 NaEDTA(0.5mg)를 함유하는 자가제 키트에 첨가하여 달성한다. 제제의 최종 pH는 7.4이다. 방사 화학적 순도를 각각 아세톤(시스템 A) 및 암모늄 아세테이트(물 중 1M):메탄올(4:1)(시스템 B)로 용출시키는 TLC(ITLC SG, 제조원: Gelman Sciences, Ann Arbor, MI)에 의해 측정한다. 방사성-TLC(제조원: Bioscan, Washington, DC) 분석으로부터, 방사화학적 순도는 방사성 트레이서 둘다에 대해 95%를 초과한다.
[18F]FMISO 및 [131I]IMISO의 합성
[18F]FMISO는 소용적의 은 표적에서, 농축된 8O-물의 양성자 조사를 사용하여 사이클로트론으로 제조한다. 토실 MISO[참조: Hay et al., 1994](20mg)를 아세토니트릴(1.5ml)에 용해시키고, 크립토픽스-플루오라이드 착체에 첨가한다. 가열하고, 가수분해시키고, 컬럼 정제한 후, 순수한 생성물을 60분째에 충격 종결(end of bombardment; EOB)로 25 내지 40%(붕괴 교정됨)의 수율로서 분리한다. HPLC를 1ml/분의 유속을 사용하여 물/아세토니트릴(80/20)으로 C-18 ODS-20T 컬럼(4.6×25mm, 제조원: Waters Corp., Milford, Mass)에서 수행한다. 담체가 첨가되지 않은 생성물은 동일한 조건하에 비표지된 FMISO의 정체 시간(6.12분)에 상응한다. 방사화학적 순도는 99% 이상이다. UV 검출기(310nm)하에서 다른 불순물 은 존재하지 않는다. 측정된 [18F]FMISO의 비 방사능은 질량 및 방사능이 공지된 샘플의 UV 및 방사능 검출을 기초로 하여 1Ci/μmol이다.
[13I]IMISO는 동일한 전구체[참조: Cherif et al., 1994]를 사용하여 제조하며, 간략하게는, 토실 MISO 5mg을 아세토니트릴(1ml)에 용해시키고, Na131I(0.1ml IN NaOH 중 1μCi)(제조원: Dupont New England Nuclear, Boston, MA)를 첨가한다. 가열 및 정제 후, 생성물(수율: 60 내지 70%)을 수득한다. 용출액으로서 클로로포름:메탄올(7:3)을 사용한 방사성-TLC는 최종 생성물에 대해 0.01의 Rf 값을 나타낸다.
99m Tc-EC-MN 및 99m Tc-EC-NIM의 안정성 검정
표지된 99m Tc-EC-MN 및 99m Tc-EC-NIM의 안정성을 혈청 샘플에서 시험한다. 간략하게, 740KBq의 1mg 99m Tc-EC-MN 및 99m Tc-EC-NIM을 개 혈청(200㎕)내에서 37℃에서 4시간 동안 배양한다. 혈청 샘플을 물 중 50% 메탄올로 희석하고, 방사성-TLC를 상기 기술한 바와 같이 0.5시간, 2시간 및 4시간째에 반복한다.
99m Tc-EC-MN의 조직 분포 연구
암컷 피셔 344 랫트(150±25g)(공급원: Harlan Sprague-Dawley, Indianapolis, IN)를 25-게이지 바늘을 사용하여 뒷다리에 13762 종양 세포주 현탁액(106개 세포/랫트, 피셔 랫트에 특이적인 종양 세포주)로부터의 포유동물 종양 세포 0.1ml로 피하 접종시킨다. 연구는 착상한지 14일 내지 17일 후 종양이 약 1cm 직경에 도달하면 수행한다. 동물은 각 과정 전에 케타민(10 내지 15mg/랫트, 복강내)으로 마취시킨다.
조직 분포 연구에서, 각 동물에게 370 내지 550KBq의 99m Tc-EC-MN 또는 99m Tc-EC(n=3/시점)를 정맥내 주사한다. 주사된 99m Tc-EC-MN의 질량은 랫트당 10㎍이다. 방사성 트레이서를 투여한 후 0.5시간째, 2시간째 및 4시간째에 랫트를 희생시키고 선택된 조직을 절개하고, 칭량하고 방사능을 측정한다. 각 샘플중 트레이서의 체내분포는 조직 습식 중량 g당 주사된 투여량의 백분율(%ID/g)로서 계산한다. 종양/비표적 세포 카운트 밀도 비는 상응하는 %ID/g 값으로부터 계산한다. 데이터는 동일한 동물 모델을 사용하여 [18F]FMISO 및 [131I]IMISO와 비교한다. 스튜던트-t 검정을 사용하여 두 그룹간의 유의차를 평가한다.
신티그래피 영상화 및 오토라디오그래피 연구
신티그래피 영상을, 각 방사성 트레이서 18.5MBq를 정맥내 주사한지 0.5시간, 2시간 및 4시간 후에 저에너지 평행구멍형 조준기가 장착된 감마 카메라(제조원: Siemens Medical Systems, Inc., Hoffman Estates, IL)를 사용하여 수득한다.
전신 오토라디오그램을 정량적 영상 분석기(Cyclone Storage Phosphor System, 제조원: Packard, Meridian, CI.)를 사용하여 수득한다. 37MBq의 99m Tc-EC-MN를 정맥내 주사한 후, 동물을 1시간째에 치사시키고 신체를 앞서 기술된 바와 같이[참조: Yan et al., 1995] 카복시메틸 셀룰로스(4%)에 고정시킨다. 동결된 신체를 저온조(LKB 2250 cryomicrotome)에 고정시키고 100㎛ 관상 단면으로 절단한다. 각 단면을 해동시키고 슬라이드 위에 고정시킨다. 다음, 슬라이드를 다목적 인광 저장 스크린(MP, 7001480)과 접촉되게 놓고 15시간 동안 노출시킨다.
99m Tc-EC-NIM가 화학요법에 대한 종양 반응을 모니터링할 수 있는지를 평가하기 위해, 종양 용적이 1.5cm인 랫트 및 난소 종양 보유 마우스의 그룹을 단일 투여량의 파클리탁셀(40mg/kg/랫트, 80mg/kg/마우스, 정맥내)로 처리한다. 파클리탁셀로 처리한 후 4일째에 영상을 촬영한다. 처리하거나 처리하지 않은 종양 중량 g당 주사된 투여량의 백분율을 측정한다.
폴라로그래피에 의한 산소 미세전극 pO2 측정
종양 저산소증을 확인하기 위해, 에펜도르프(Eppendorf) 컴퓨터화된 히스토그램 시스템을 사용하여 pO2 측정을 수행한다. 2개 내지 3개의 선형 트랙 각각을 따라서 각 종양에서 0.4mm 간격으로 pO2를 20회 내지 25회 측정한다(총 40회 내지 75회 측정). 종양 pO 측정은 종양을 보유하는 3마리의 랫트에서 수행한다. 온-라 인 컴퓨터 시스템을 사용하여, 각 트랙의 포트 측정치를 트랙에 따른 측정 포인트의 위치에 대한 절대값 및 클래스 폭이 2.5mm인, 0과 100mmHg 사이의 pO2 히스토그램에서의 상대적 빈도로서 표현한다.
결과
99m Tc-EC-MN 및 99m Tc-EC-NIM의 방사성 합성 및 안정성
99m Tc를 사용한 EC-MN 및 EC-NIM의 합성은 높은(>95%) 방사화학적 순도로 달성하였으며, 방사화학적 수율은 100%이었다. 99m Tc-EC-MN 및 99m Tc-EC-NIM(도 13)은 개 혈청 샘플내에서 0.5시간째, 2시간째 및 4시간째에 안정한 것으로 밝혀졌다. 분해 생성물은 관찰되지 않았다. MISO의 방사성 불소화 및 방사성 요오드화는 동일한 전구체를 사용하여 용이하게 달성하였다. 표지된 MISO 유사체 둘다에서, 방사화학적 순도는 99% 이상이었다.
생체내 조직 분포 시험
종양 보유 랫트에서의 99m Tc-EC-MN 및 99m Tc-EC의 조직 분포는 표 4 및 5에 제시한다. 이온성 99m Tc에 대한 높은 친화성으로 인해, 현저하고 지속적인 갑상선 흡수는 없었으며, 이는 99m Tc-EC-MN의 생체내 안정을 제시한다(표 5).
유방 종양 보유 랫트에서의 99m Tc-EC의 체내분포
기관 또는 조직마다 주사된 99m Tc-EC 투여량의 %
20분 1시간 2시간 4시간
혈액 폐 간 위 신장 갑상선 근육 소장 뇨 종양 종양/혈액 종양/근육 0.435±0.029 0.272±0.019 0.508±0.062 0.136±0.060 7.914±0.896 0.219±0.036 0.060±0.006 0.173±0.029 9.124±0.808 0.342±0.163 0.776±0.322 5.841±3.253 0.273±0.039 0.187±0.029 0.367±0.006 0.127±0.106 8.991±0.268 0.229±0.118 0.043±0.002 0.787±0.106 11.045±6.158 0.149±0.020 0.544±0.004 3.414±0.325 0.211±0.001 0.144±0.002 0.286±0.073 0.037±0.027 9.116±0.053 0.106±0.003 0.028±0.009 0.401±0.093 13.192±4.505 0.115±0.002 0.546±0.010 4.425±1.397 0.149±0.008 0.120±0.012 0.234±0.016 0.043±0.014 7.834±1.018 0.083±0.005 0.019±0.001 0.103±0.009 8.693±2.981 0.096±0.005 0.649±0.005 5.093±0.223
제시된 수치는 3마리 동물로부터의 데이터의 평균 ± 표준 편차를 나타낸다.
차단 연구에서, 종양/근육 및 종양/혈액 카운트 밀도 비는 염산과 공동-투여한 경우 유의적으로 감소하였다(p<0.01)(도 5).
유방 종양 보유 랫트1에서 99m Tc-EC-메트로니다졸 접합체의 체내분포
30분째 2시간째 4시간째
혈액 폐 간 비장 신장 근육 소장 갑상선 종양 1.46±0.73 0.79±0.39 0.83±0.36 0.37±0.17 4.30±1.07 0.08±0.03 0.27±0.12 0.051±0.16 0.034±0.13 1.19±0.34 0.73±0.02 0.91±0.11 0.41±0.04 5.84±0.43 0.09±0.01 0.39±0.24 0.51±0.09 0.49±0.02 0.76±0.14 0.52±0.07 0.87±0.09 0.37±0.07 6.39±0.48 0.07±0.01 0.22±0.05 0.41±0.02 0.50±0.09
1. 각 랫트에게는 99m Tc-EC-메트로니다졸(10μCi, 정맥내)를 투여한다. 각 수치는 중량 g(n=3)당 주사된 투여량/시간 간격의 백분율이다. 각 데이터는 세 측정치의 평균과 표준 편차를 나타낸다.
체내분포 연구는 0.54시간째에서 종양/혈액 및 종양/근육 카운트 밀도 비가 99m Tc-EC-MN, [18F]FMISO 및 [131I]IMISO의 경우에는 점차적으로 증가하는 반면에, 이들 수치가 동일한 시간에서 99m Tc-EC의 경우에는 변하지 않는다는 것을 제시한다(도 9 및 도 10). [18F]FMISO는 주사 후 30분째, 2시간째 및 4시간째에 [131I]IMISO 및 99m Tc-EC-MN에서 보다 높은 종양 대 혈액 흡수 비를 나타낸다. 주사 후 2시간째 및 4시간째의 99m Tc-EC-MN 및 [131I]IMISO에 대한 종양/혈액 및 종양/근육 비는 유의적으로 상이하지 않다(p<0.05).
신티그래피 영상화 및 오토라디오그래피 연구
상이한 시점에서 수득된 신티그래피 영상은 99m Tc-EC-MN 및 99m Tc-EC-NIM 그룹에서 종양의 가시화를 제시한다. 대조적으로, 99m Tc-EC 주사된 그룹에서 명백한 종양 흡수는 없었다(도　11). 99mTc-EC-MN을 주사한 후 1시간째에 수행한 오토라디오그램은 종양 활성을 명백하게 입증한다(도 12). 99m Tc-EC-MN과 비교하여, 99m Tc-EC-NIM은 종양 대 배경값 비가 높기 때문에 보다 우수한 신티그래피 영상을 제공하는 것으로 간주된다. 유방 종양 보유 랫트에서, 종양 흡수율은 99m Tc-EC에 비해 99m Tc-EC-NIM에서 현저하게 높다(도　14A). 종양 중량 g당 99m Tc-EC-NIM의 주사된 투여량의 백분율로부터 수득된 데이터는 대조군과 비교한 경우 파클리탁셀로 처리한 랫트에서 25% 감소된 흡수율을 나타낸다(도 14B).
난소 종양 보유 마우스에서, 종양 흡수율은 파클리탁셀로 처리한 마우스에서 감소되었다(도 15A 및 도 15B). 유사한 결과는 육종 보유 마우스에서도 관찰되었다(도 15C 및 도 15D). 따라서, 99m Tc-EC-NIM을 파클리탁셀 처리에 대한 종양 반응을 평가하는데 사용할 수 있다.
폴라로그래피에 의한 산소 미세전극 pO2 측정
종양의 종양내 PO2 측정은 정상 근육이 35±10nmHg인 것과 비교하여 종양 산소 분압의 범위가 4.6±1.4mmHg임을 나타낸다. 당해 데이터는 종양이 저산소성임을 나타낸다.
실시예 3: 종양의 펩타이드 영상화
에틸렌디시스테인-펜타글루타메이트(EC-GAP)의 합성
수산화나트륨(1N, 1ml)을 물(10ml) 중의 EC(200mg, 0.75mmol)의 교반된 용액에 첨가한다. 상기 무색 용액에, 설포-NHS(162mg, 0.75mmol) 및 EDC(143mg, 0.75mmol)를 첨가한다. 다음, 펜타글루타메이트 나트륨 염(분자량: 750 내지 1500, 제조원: Sigma Chemical Company)(500mg, 0.67mmol)을 첨가한다. 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반한다. 혼합물을 컷-오프가 500인 Spectra/POR 분자 다공성 막(제조원: Spectrum Medical Industries Inc., Houston, TX)을 사용하여 48시간 동안 투석시킨다. 투석 후, 생성물을 동결건조기(제조원: Labconco, Kansas City, MO)를 사용하여 동결건조시킨다. 생성물의 중량은 0.95g(수율: 35%)이다. EC-GAP의 합성도는 도 16에 제시한다.
99m Tc-EC-GAP의 안정성 검정
99m Tc를 사용한 EC-GAP의 방사성 표지화는 앞서 기술된 동일한 과정을 사용하여 달성한다. 방사화학적 순도는 100%이다. 표지된 99m Tc-EC-GAP의 안정성은 혈청 샘플에서 수행한다. 간략하게, 740KBq의 99m Tc-EC-GAP 1mg을 개 혈청(200㎕)내에서 37℃에서 4시간 동안 배양한다. 혈청 샘플을 물 중 50% 메탄올로 희석하고, 방사성-TLC를 상기 기술한 바와 같이 0.5시간째, 2시간째 및 4시간째에 반복한다.
신티그래피 영상화 연구
신티그래피 영상을 각각의 방사성 트레이서 18.5MBq를 정맥내 주사한지 0.5시간, 2시간 및 4시간 후에 저에너지 평행구멍형 조준기가 장착된 감마 카메라를 사용하여 수득한다.
결과
99m Tc-EC-GAP의 안정성 검정
99m Tc-EC-GAP는 개 혈청내에서 0.5시간째, 2시간째 및 4시간째에 안정한 것으로 밝혀졌다. 분해 생성물은 관찰되지 않았다.
신티그래피 영상화 연구
상이한 시점에서 수득된 신티그래피 영상은 99m Tc-EC-GAP 그룹에서 종양의 가시화를 제시한다. 최적 흡수율은 투여 후 30분 내지 1시간째에 나타난다(도 17).
실시예 4: 종양 아폽토시스 세포의 영상화
에틸렌디시스테인-아넥신 V(EC-ANNEX)의 합성
중탄산나트륨(1N, 1ml)을 EC(5mg, 0.019mmol)의 교반된 용액에 첨가한다. 상기 무색 용액에, 설포-NHS(4mg, 0.019mmol) 및 EDC(4mg, 0.019mmol)를 첨가한다. 다음, 아넥신 V(분자량: 33kD, 사람, 제조원: Sigma Chemical Company)(0.3mg)을 첨가한다. 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반한다. 혼합물을 컷-오프가 10,000인 Spectra/POR 분자 다공성 막(제조원: Spectrum Medical Industries Inc., Houston, TX)을 사용하여 48시간 동안 투석시킨다. 투석 후, 생성물을 동결건조기(제조원: Labconco, Kansas City, MO)를 사용하여 동결건조시킨다. 염 형태인 당해 생성물의 중량은 12mg이다.
99m Tc-EC-ANNEX의 안정성 검정
99m Tc를 사용한 EC-ANNEX의 방사성 표지화는 EC-GAP에서 기술된 동일한 과정을 사용하여 달성한다. 방사화학적 순도는 100%이다. 표지된 99m Tc-EC-ANNEX의 안정성은 혈청 샘플에서 수행한다. 간략하게, 740KBq의 1mg 99m Tc-EC-ANNEX를 개 혈청(200㎕)내에서 37℃에서 4시간 동안 배양한다. 혈청 샘플을 물 중 50% 메탄올로 희석하고, 방사성-TLC를 상기 기술한 바와 같이 0.5시간째, 2시간째 및 4시간째에 반복한다.
신티그래피 영상화 연구
신티그래피 영상을 방사성 트레이서 18.5MBq를 정맥내 주사한지 0.5시간, 2시간 및 4시간 후에 저에너지 평행구멍형 조준기가 장착된 감마 카메라를 사용하여 수득한다. 사용된 동물 모델은 유방, 난소 및 육종이다. 유방 종양 및 난소 종양 보유 랫트는 둘다 고도의 아폽토시스 세포를 과발현하는 것으로 공지되어 있다. 영상화 연구는 세포를 접종한 후 14일째에 수행한다. 종양 처리 반응을 평가하기 위해, 예비영상화된 마우스에게 파클리탁셀(80mg/Kg, 정맥내, 14일째)을 투여하고 영상을 18일째에 촬영한다.
결과
99m Tc-EC-ANNEX의 안정성 검정
99m Tc-EC-ANNEX는 개 혈청내에서 0.5시간째, 2시간째 및 4시간째에 안정한 것으로 밝혀졌다. 분해 생성물은 관찰되지 않았다.
신티그래피 영상화 연구
상이한 시점에서 수득된 신티그래피 영상은 99m Tc-EC-ANNEX 그룹에서 종양의 가시화를 제시한다(도 18 내지 20). 영상은 고도의 아폽토시스 세포가 99m Tc-EC-ANNEX를 보다 많이 흡수한다는 것을 나타낸다. 고 아폽토시스(난소 종양 보유) 그룹(도 19A 및 도 19B) 및 저 아폽토시스(육종 종양 보유) 그룹(도 20A 및 도 20B)에서 파클리탁셀 처리 전과 후 사이의 현저한 차이는 없었다.
실시예 5: 종양 혈관생성의 영상화
(콜치신 아미노 유사체, COL-NH2)의 제조
콜치신의 탈메틸화 아미노 및 하이드록시 유사체를 앞서 기술된 방법[참조: Orr et　al., 1995]에 따라서 합성한다. 간략하게, 콜치신(4g)을 25% 황산을 함유하는 물 100ml에 용해시킨다. 반응 혼합물을 100℃에서 5시간 동안 가열한다. 상기 혼합물을 탄산나트륨으로 중화시킨다. 생성물을 여과하고 동결건조기 상에서 건조시키고, 목적하는 아미노 유사체(융점: 153 내지 155℃, 155 내지 157℃로 보고됨) 2.4g(70%)을 수득한다. 닌하이드린(메탄올 중 2%) 분무는 COL-NH2의 아미노 그룹의 양성 강도를 나타낸다. 구조를 1H-NMR 및 질량 분광법(FAB-MS)에 의해 확인한다. 1H-NMR (CDC13) δ 8.09 (S, 1H), 7.51 (d, 1H, J=12 Hz), 7.30 (d, 1H, J=12Hz), 6.56 (S, 1H), 3.91 (S, 6H), 3.85 (m, 1H), 3.67 (S, 3H), 2.25-2.52 (m, 4H). m/z 308.2(M+, 20), 307.2 (100).
에틸렌디시스테인-콜치신(EC-COL)의 제조
수산화나트륨(2N, O.2ml)을 물(5ml) 중의 EC(134mg, 0.50mmol)의 교반된 용액에 첨가한다. 상기 무색 용액에, 설포-NHS(217mg, 1.0mmol) 및 EDC(192mg, 1.0mmol)를 첨가한다. 다음, COL-NH2(340mg, 2.0mmol)을 첨가한다. 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반한다. 혼합물을 컷-오프가 500인 Spectra/POR 분자 다공성 막(제조원: Spectrum Medical Industries Inc., Houston, TX)을 사용하여 48시간 동안 투석시킨다. 투석 후, 생성물을 동결건조기(제조원: Labconco, Kansas City, MO)를 사용하여 동결건조시킨다. 당해 생성물의 중량은 315mg(수율 55%)이다. 1H-NMR (D2O) d 7.39 (S, 1H), 7.20 (d, 1H, J=12Hz), 7.03 (d, 1H, J=12Hz), 6.78 (S,1H), 4.25-4.40 (m, 1H), 3.87 (S, 3H, -OCH3), 3.84 (S, 3H, -OCH3), 3.53 (S, 3H, -OCH3), 3.42-3.52 (m, 2H), 3.05-3.26 (m, 4H), 2.63-2.82 (m, 4H), 2.19-2.25 (m, 4H). FAB MS m/z 580(나트륨 염, 20). EC-COL의 합성 과정은 도 21에 제시한다.
99m Tc를 사용한 EC-COL 및 EC의 방사성 표지화
99mTc-EC-COL의 방사성 합성을 필요량의 99mTc-퍼테크네테이트를 EC-COL의 동결건조된 잔사(5mg), SnCl2(100㎍), Na2HPO4(13.5mg), 아스코르브산(0.5mg) 및 NaEDTA(0.5mg)를 함유하는 자가제 키트에 첨가하여 달성한다. 제제의 최종 pH는 7.4이다. 또한, 99m Tc-EC를 pH 10에서 EC-COL의 동결건조된 잔사(5mg), SnCl2(100㎍), Na2HPO4(13.5mg), 아스코르브산(0.5mg) 및 NaEDTA(0.5mg)를 함유하는 자가제 키트를 사용하여 수득한다. 다음, 제제의 최종 pH를 7.4로 조정한다. 방사 화학적 순도를 암모늄 아세테이트(물 중 1M): 메탄올(4:1)로 용출시키는 TLC(ITLC SG, 제조원: Gelman Sciences, Ann Arbor, MI)에 의해 측정한다. 방사성-박막 크로마토그래피(TLC, 제조원: Bioscan, Washington, DC)을 사용하여 방사성 트레이서 둘다에 대한 방사화학적 순도를 분석한다.
99m Tc-EC-COL의 안정성 검정
표지된 99m Tc-EC-COL의 안정성은 혈청 샘플에서 시험한다. 간략하게, 740KBq 의 5mg 99m Tc-EC-COL를 래빗트 혈청(500㎕)내에서 37℃에서 4시간 동안 배양한다. 혈청 샘플을 물 중 50% 메탄올로 희석시키고 방사성-TLC를 상기 기술한 바와 같이 0.5시간째, 2시간째 및 4시간째에 반복한다.
조직 분포 연구
암컷 피셔 344 랫트(150±25g)(공급원: Harlan Sprague-Dawley, Indianapolis, IN)를 25-게이지 바늘을 사용하여 뒷다리에 13762 종양 세포주 현탁액(10개 세포/랫트, 피셔 랫트에 특이적인 종양 세포주)로부터의 포유동물 종양 세포 0.1ml로 피하 접종시킨다. 연구는 착상한지 14일 내지 17일 후 종양이 약 1cm 직경에 도달하면 수행한다. 랫트는 각 과정 전에 케타민(10 내지 15mg/랫트, 복강내)으로 마취시킨다.
조직 분포 연구에서, 각 동물에게 370 내지 550KBq의 99m Tc-EC-COL 또는 99m Tc-EC(n=3/시점)을 정맥내 주사한다. 주사된 99m Tc-EC-COL의 질량은 랫트당 10㎍이다. 방사성 트레이서를 투여한 후 0.5시간째, 1시간째, 2시간째 및 4시간째에, 랫트를 희생시키고 선택된 종양을 절개하고, 칭량하고 방사능을 측정한다. 각 샘플중 트레이서의 체내분포는 조직 습식 중량 g당 주사된 투여량의 백분율(%ID/g)로서 계산한다. 종양/비표적 조직 카운트 밀도 비는 상응하는 %ID/g 값으로부터 계산한다. 스튜던트-t 검정을 사용하여 두 그룹간의 유의차를 평가한다.
신티그래피 영상화 연구
신티그래피 영상을 300μCi의 99m Tc-EC-COL 및 99m Tc-EC을 정맥내 주사한지 0.5시간, 2시간 및 4시간 후에 저에너지 평행구멍형 조준기가 장착된 감마 카메라(제조원: Siemens Medical Systems, Inc., Hoffman Estates, IL)을 사용하여 수득한다. 컴퓨터 윤곽화 관심 영역(ROI)를 사용하여 종양 흡수율 대 정상 근육 흡수율을 정량화한다(화소당 카운트).
결과
99m Tc-EC-COL의 방사성 합성 및 안정성
99m Tc를 사용한 EC-COL의 방사선 합성을 높은(>95%) 방사화학적 순도로 달성하였다(도 21). 99m Tc-EC-COL은 래빗트 혈청 샘플내에서 0.5시간째, 2시간째 및 4시간째에 안정한 것으로 밝혀졌다. 분해 생성물은 관찰되지 않았다(도 22).
생체내 체내분포
유방 종양 보유 랫트에서의 99m Tc-EC-COL 및 99m Tc-EC의 생체내 체내분포는 표 4 및 6에 제시한다. 0.5시간째, 2시간째 및 4시간째에서 99m Tc-EC-COL의 종양 흡수율 값(%ID/g)은 0.436±0.089, 0.395±0.154 및 0.221±0.006(표 6)인 반면에, 99m Tc-EC에 대한 종양 흡수율 값은 각각 0.342±0.163, 0.115±0.002 및 0.097±0.005이다(표 4). 시간의 함수로서 증가된 종양 대 혈액(0.52±0.12 대 0.72±0.07) 및 종양 대 근육(3.47 ± 0.40 대 7.97 ±0.93) 비가 99m Tc-EC-COL 그룹에서 관찰되었다(도　23). 이와 반대로, 종양 대 혈액 및 종양 대 근육 값은 동일한 시간에서 99m Tc-EC-COL 그룹과 비교한 경우에 99m Tc-EC에 있어서 시간 의존적 감소를 나타냈다(도　24).
유방 종양 보유 랫트에서의 99m Tc-EC-콜치신의 체내분포
30분째 2시간째 4시간째
혈액 폐 간 비장 신장 근육 위 자궁 갑상선 종양 0.837 ± 0.072 0.636 ± 0.056 1.159 ± 0.095 0.524 ± 0.086 9.705 ± 0.608 0.129 ± 0.040 0.484 ± 0.386 0.502 ± 0.326 3.907 ± 0.997 0.436 ± 0.089 0.606 ± 0.266 0.407 ± 0.151 1.051 ± 0.213 0.559 ± 0.143 14.065 ± 4.007 0.071 ± 0.032 0.342 ± 0.150 0.343 ± 0.370 2.297 ± 0.711 0.395 ± 0.l54 0.307 ± 0.022 0.194 ± 0.009 0.808 ± 0.084 0.358 ± 0.032 11.097 ± 0.108 0.028 ± 0.004 0.171 ± 0.123 0.133 ± 0.014 1.709 ± 0.776 0.221 ± 0.006
* 각 랫트에게는 99m Tc-EC-콜치신(10μCi, 정맥내)를 투여한다. 각 수치는 조직 중량 g(n=3)당 주사된 투여량/시간 간격의 백분율이다. 각 데이터는 세 측정치의 평균과 표준 편차를 나타낸다.
방사성-TLC(ITLC-SG) 연구에 의해 측정된 Rf 값
시스템 A* 시스템 B†
99m Tc-EC-폴레이트 0 1(>95%)
99m Tc-EC- 0 1(>95%)
유리 99m Tc 1 1
환원된 99m Tc 0 0
*아세톤 †암모늄 아세테이트(물 중 1M):메탄올(4:1)
유방 종양 보유 랫트에서의 99m Tc-EC-COL의 감마 신티그래피 영상화
유방 종양을 보유하는 3마리의 랫트에서 투여 후 1시간째에서의 생체내 영상화 연구는, 종양이 99m Tc-EC-COL 그룹(도 25)을 사용하는 경우에는 잘 가시화될 수 있는 반면에, 99m Tc-EC 그룹(도 26)의 종양 흡수는 거의 관찰되지 않음을 나타낸다. 컴퓨터 윤곽화 관심 영역(ROI)은 99m Tc-EC-COL 그룹에서의 종양/배경값 비가 99m Tc-EC 그룹에서의 비보다 유의적으로 높다는 것을 제시한다(도 27).
종양 해당과정 표적화
실시예 6: 99m Tc-EC-네오마이신의 개발
EC의 합성
EC는 앞서 기술한 방법[참조: Ratner and Clarke, 1937; Blondeau et al., 1967]에 따라서 2-단계 합성으로 제조한다. 전구체인 L-티아졸리딘-4-카복실산을 합성한다(융점:195℃, 196 내지 197℃로 보고됨). 다음, EC를 제조한다(융점: 237℃, 251 내지 253℃로 보고됨). 구조를 1H-NMR 및 고속 원자 충격 질량 분광법(FAB-MS)에 의해 확인한다.
에틸렌디시스테인-네오마이신(EC-네오마이신)의 합성
수산화나트륨(2N, O.2ml)을 물(5ml) 중의 EC(134mg, 0.50mmol)의 교반된 용액에 첨가한다. 상기 무색 용액에, 설포-NHS(217mg, 1.0mmol) 및 EDC(192mg, 1.0mmol)를 첨가한다. 다음, 네오마이신 트리설페이트 염(909mg, 1.0mmol)을 첨가한다. 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반한다. 혼합물을 컷-오프가 500인 Spectra/POR 분자 다공성 막(제조원: Spectrum Medical Industries Inc., Houston, TX)을 사용하여 48시간 동안 투석시킨다. 투석 후, 생성물을 동결건조기(제조원: Labconco, Kansas City, MO)를 사용하여 동결건조시킨다. 생성물의 중량은 720mg(수율: 83%)이다. EC-네오마이신의 합성도는 도 36에 제시한다. 구조를 1H-NMR(도 38A-B), 질량 분광법(도 39A-B) 및 원소 분석[참조: Galbraith Laboratories, Inc. Knoxville, TN]에 의해 확인한다. 원소 분석 C39H75N10S4O 19.15H2O (C,H,N,S), 계산치 C:33.77, H:7.58, N:10.11, S:9.23; 실측치 C:32.44, H:5.90, N:10.47, S:10.58. EC-네오마이신의 UV 파장은 EC 및 네오마이신과 비교하여 270.5nm로 이동하였다(도 40A-C).
99m Tc를 사용한 EC-MN 및 EC-네오마이신의 방사성 표지화
99m Tc-EC 및 99m Tc-EC-네오마이신의 방사성 합성을 필요량의 99m Tc-퍼테크네테이트를 EC 또는 EC-네오마이신의 동결건조된 잔사(10mg), SnCl2(100㎍), Na2HPO4(13.5mg) 및 아스코르브산(0.5mg)을 함유하는 자가제 키트에 첨가하여 달성한다. 제제의 최종 pH는 7.4이다. 방사 화학적 순도를 암모늄 아세테이트(물 중 1M): 메탄올(4:1)로 용출시키는 TLC(ITLC SG, 제조원: Gelman Sciences, Ann Arbor, MI)에 의해 측정한다. 방사성-TLC(제조원: Bioscan, Washington, DC) 분석(도 41) 및 HPLC 분석(도 42 내지 45)으로부터, 방사화학적 순도는 방사성 트레이서 둘다에 대해 95%를 초과한다.
99m Tc-EC 및 99m Tc-EC-네오마이신의 안정성 검정
표지된 99m Tc-EC 및 99m Tc-EC-네오마이신의 안정성은 개 혈청 샘플에서 시험한다. 간략하게, 740KBq의 1mg 99m Tc-EC 및 99m Tc-EC-네오마이신을 개 혈청(200㎕)내에서 37℃에서 4시간 동안 배양한다. 혈청 샘플을 물 중 50% 메탄올로 희석시키고, 방사성-TLC를 상기 기술한 바와 같이 0.5시간째, 2시간째 및 4시간째에 반복한다.
99m Tc-EC-네오마이신의 조직 분포 연구
암컷 피셔 344 랫트(150±25g)(공급원: Harlan Sprague-Dawley, Indianapolis, IN)를 25-게이지 바늘을 사용하여 뒷다리에 13762 종양 세포주 현탁액(106개 세포/랫트, 피셔 랫트에 특이적인 종양 세포주)로부터의 포유동물 종양 세포 0.1ml로 피하 접종시킨다. 연구는 착상한지 14일 내지 17일 후 종양이 약 1cm 직경에 도달하면 수행한다. 동물은 각 과정 전에 케타민(10 내지 15mg/랫트, 복강내)으로 마취시킨다.
조직 분포 연구에서, 각 동물에게는 10 내지 20 μCi의 99m Tc-EC 또는 99m Tc-EC-네오마이신(n=3/시점)을 정맥내 주사한다. 주사된 99m Tc-EC-네오마이신의 질량은 랫트당 200㎍이다. 방사성 트레이서를 투여한 후 0.5분째, 2시간째 및 4시간째에, 랫트를 희생시키고 선택된 조직을 절개하고 칭량하고 방사능을 측정한다. 각 샘플 내의 트레이서의 체내분포는 조직 습식 중량 g당 주사된 투여량의 백분율(%ID/g)로서 계산한다. 종양/비표적 세포 카운트 밀도 비는 상응하는 %ID/g 값으로부터 계산한다. 99m Tc-EC(표 4) 및 유리 테크네튬(표 9)를 비교한, 종양 대 조직 비는 99m Tc-EC-네오마이신 그룹에서 시간의 함수로서 증가한다.
신티그래피 영상화 연구
신티그래피 영상을 각 방사성 트레이서 100μCi를 정맥내 주사한지 0.5시간, 2시간 및 4시간 후에 저에너지 평행구멍형 조준기가 장착된 감마 카메라(제조원: Siemens Medical Systems, Inc., Hoffman Estates, IL)을 사용하여 수득한다(도 37A). 예비 임상 영상화 연구를 유방암 환자에서 수행한다. 종양은 99m Tc-EC-네오마이신을 투여한 후 2시간째에 잘 가시화된다(도 37B).
유방 종양 보유 랫트에서의 99m Tc-EC-네오마이신의 체내분포
30분째 1시간째 2시간째 4시간째
혈액 폐 간 위 비장 신장 갑상선 근육 소장 뇨 종양 뇌 심장 종양/혈액 종양/근육 종양/뇌 0.463±0.007 0.344±0.011 0.337±0.012 0.279±0.039 0.159±0.008 8.391±0.395 0.349±0.008 0.093±0.001 0.159±0.004 25.402±8.621 0.419±0.023 0.022±0.001 0.147±0.009 0.906±0.039 4.512±0.220 19.495±1.823 0.262±0.040 0.202±0.030 0.269±0.013 0.147±0.001 0.114±0.013 8.804±0.817 0.202±0.028 0.049±0.010 0.093±0.014 21.786±2.690 0.279±0.042 0.014±0.003 0.081±0.012 1.070±0.028 5.855±0.458 20.001±0.890 0.139±0.016 0.114±0.014 0.221±0.020 0.061±0.008 0.095±0.007 8.356±0.408 0.114±0.007 0.021±0.006 0.061±0.004 0.224±0.000 0.166±0.023 0.010±0.001 0.040±0.004 1.196±0.061 8.364±1.469 17.515±2.035 0.085±0.004 0.080±0.003 0.195±0.012 0.054±0.008 0.089±0.003 8.638±0.251 0.086±0.001 0.010±0.001 0.266±0.200 2.609±2.377 0.131±0.002 0.007±0.001 0.029±0.002 1.536±0.029 12.706±0.783 20.255±1.693
제시된 수치는 3마리 동물로부터의 데이터의 평균 ± 표준 편차를 나타낸다.
유방 종양 보유 랫트에서의 99m Tc 퍼테크네테이트의 체내분포
30분째 2시간째 4시간째
혈액 폐 간 비장 신장 갑상선 근육 소장 종양 뇌 심장 종양/혈액 종양/근육 종양/간 1.218±0.328 0.646±0.291 0.541±0.232 0.331±0.108 0.638±0.197 24.821±5.181 0.130±0.079 0.153±0.068 0.591±0.268 0.038±0.014 0.275±0.089 0.472±0.093 4.788±0.833 1.084±0.023 0.666±0.066 0.632±0.026 0.304±0.026 0.187±0.014 0.489±0.000 11.907±15.412 0.076±0.002 0.186±0.007 0.328±0.016 0.022±0.002 0.145±0.015 0.497±0.073 4.302±0.093 1.084±0.115 0.715±0.052 0.387±0.024 0.501±0.081 0.225±0.017 0.932±0.029 17.232±5.002 0.063±0.003 0.344±0.027 0.423±0.091 0.031±0.009 0.166±0.012 0.597±0.144 6.689±1.458 0.865±0.270
제시된 수치는 3마리 동물로부터의 데이터의 평균 ± 표준 편차를 나타낸다.
99m Tc-EC-약물 접합체의 시험관내 세포 흡수율
99m Tc-EC-약물 접합체의 세포 흡수율을 평가하기 위해, 80,000개의 세포(A549 폐암 세포주)를 함유하는 각각의 웰에 2μCi의 99m Tc-EC-네오마이신 및 18F-FDG를 첨가한다. 0.5시간 내지 4시간 동안 배양한 후, 세포를 포스페이트 완충된 식염수로 3회 세척한 다음, 트립신으로 세척하여 세포를 파괴시킨다. 다음, 세포를 감마 계수로기로 계수한다. 99m Tc-EC-네오마이신은 사람 폐암 세포주에서 시험된 당해 제제 중에서 가장 높은 흡수율을 나타낸다(도 46).
99m Tc-EC-네오마이신 및 18F-FDG의 세포 흡수율에 대한 글루코스의 영향
네오마이신은 글루코스 흡수율에 영향을 미치는 것으로 공지되어 있다[참조: Rogers et al., 1968; Fanciulli et al., 1994]. 이전의 실험은 99m Tc-EC-네오마이신이 사람 폐암 세포주(A549)에서 18F-FDG보다 높은 흡수율을 나타낸다는 것을 제시하였다. 99m Tc-EC-네오마이신이 글루코스-관련 메카니즘을 통해 매개되는지를 측정하기 위해, 글루코스(0.1 mg 내지 2.0mg)를 2μCi의 99m Tc-EC-네오마이신 및 18 F-FDG과 함께, 50,000개의 (유방) 세포 또는 80,000개의 세포(폐)를 함유하는 각각의 웰에 첨가한다. 배양 후, 세포를 포스페이트 완충된 식염수로 3회 세척한 다음, 트립신으로 세척하여 세포를 파괴시킨다. 다음, 세포를 감마 계수기로 계수한다.
글루코스를 0.1 내지 2.0mg/웰의 농도로 첨가하여, 2개의 폐암 세포주 및 하나의 유방 세포주에서 99m Tc-EC-네오마이신의 감소된 흡수율이 관찰되었다. 유사한 결과가 18F-FDG 그룹에서 관찰되었다. 99m Tc-EC(대조군)은 흡수율을 나타내지 않는다. 상기 발견은 99m Tc-EC-네오마이신의 세포 흡수율이 글루코스-관련 메카니즘을 통해 매개될 수 있다는 것을 시사한다(도 47, 48A 및 48B).
실시예 7: 99m Tc-EC-데옥시글루코스를 사용한 종양 대사 영상화
EC-데옥시글루코스(EC-DG)의 합성
수산화나트륨(1N, 1ml)을 물(5ml) 중의 EC(110mg, 0.41mmol)의 교반된 용액에 첨가한다. 상기 무색 용액에, 설포-NHS(241.6mg, 1.12mmol) 및 EDC(218.8mg, 1.15mmol)를 첨가한다. 다음, D-글루코사민 하이드로클로라이드 염(356.8mg, 1.65mmol)을 첨가한다. 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반한다. 혼합물을 컷-오프가 500인 Spectra/POR 분자 다공성 막(제조원: Spectrum Medical Industries Inc., Houston, TX)을 사용하여 48시간 동안 투석시킨다. 투석 후, 생성물을 동결건조기(제조원: Labconco, Kansas City, MO)를 사용하여 동결건조시킨다. 염 형태인 당해 생성물의 중량은 568.8g이다. 당해 합성도는 도 59에 제시한다. 구조를 질량 분광법(도 60) 및 양성자 NMR(도 61 및 62)에 의해 확인한다. 99m Tc-EC-DG의 방사화학적 순도는 방사성-TLC(도 63) 및 HPLC(도 64 및 65) 분석에 의해 측정된 바와 같이 100%이다.
헥소키나제 검정
EC-DG가 글루코스 인산화를 모사하는지를 측정하기 위해, 헥소키나제 검정을 수행한다. 시판 키트(제조원: Sigma Chemical Company)를 사용하여, EC-DG, 글루코사민 글루코스(표준)를 UV 파장 340nm에서 검정한다. 글루코스, EC-DG 및 글루코사민은 양성 헥소키나제 검정(도 66 내지 68)을 나타낸다.
시험관내 세포 흡수율 검정
시험관내 세포 흡수율 검정을 사람 폐암 세포주(A549)를 사용하여 수행한다. 2μCi의 99m Tc-EC-DG 및 18F-FDG를 80,000개의 세포를 함유하는 웰에 각각 첨가한다. 0.5시간 내지 4시간 동안 배양한 후, 세포를 포스페이트 완충된 식염수로 3회 세척한 다음, 트립신으로 세척하여 세포를 파괴시킨다. 다음, 세포를 감마 계수기로 계수한다. 99m Tc-EC-DG의 흡수율은 FDG와 유사하다(도 69).
99m Tc-EC-데옥시글루코스 및 18F-FDG의 세포 흡수율에 대한 d-글루코스 및 l-글루코스의 영향
99m Tc-EC-데옥시글루코스가 d-글루코스 메카니즘을 통해 매개되는지를 평가하기 위해, d- 및 l-글루코스(1mg 및 2.0mg)를 2μCi의 99m Tc-EC-데옥시글루코스 및 18F-FDG과 함께, 유방암 또는 폐암 세포(50,000/0.5ml/웰)를 함유하는 각각의 웰에 첨가한다. 2시간 동안 배양한 후, 세포를 포스페이트 완충된 식염수로 3회 세척한 다음, 트립신으로 세척하여 세포를 파괴시킨다. 세포를 감마 계수기로 계수한다.
글루코스를 1 내지 2.0mg/웰의 농도로 첨가함으로써, 유방암 및 폐암 세포에서 d-글루코스에 의한 99m Tc-EC-데옥시글루코스 및 18F-FDG의 감소된 흡수율이 관찰 되었다. 그러나, 제제 둘다에 대한 l-글루코스에 의한 영향은 없었다(도 70 내지 73). 상기 발견은 99m Tc-EC-데옥시글루코스의 세포 흡수율이 d-글루코스 메카니즘을 통해 매개된다는 것을 제시한다.
정상 랫트에서 혈중 글루코스 수준에 대한 EC-데옥시글루코스 부하의 영향
이전의 실험은 99m Tc-EC-데옥시글루코스의 세포 흡수율이 FDG와 유사하다는 것을 제시하였다. 예를 들어, 헥소키나제 검정(글루코스 인산화)은 양성이었다. 99m Tc-EC-데옥시글루코스의 흡수율은 d-글루코스 메카니즘을 통해 매개된다. 당해 연구는 혈중 글루코스 수준이 FDG 또는 EC-데옥시글루코스에 의해 유도되고 인슐린에 의해 억제될 수 있는지를 측정하기 위함이다.
건강한 정상 344 랫트(체중 145 내지 155g)를 당해 실험에 앞서 밤새 절식시킨다. 제조된 글루코사민 하이드로클로라이드, FDG 및 EC-데옥시글루코스의 농도는 60% 및 164%(mg/ml)이다. 혈중 글루코스 수준(mg/㎗)을 글루코스 계측기(Glucometer DEX, 제조원: Bayer Corporation, Elkhart, IN)로 측정한다. 연구에 앞서 혈중 글루코스 수준의 기준선을 수득한다. 각 랫트(n=3/그룹)에게 글루코사민, FDG 및 EC-데옥시글루코스 1.2mmol/kg을 투여한다. 별도의 실험에서, 랫트의 그룹에게 EC-데옥시글루코스 및 FDG를 투여한다. 인슐린(5단위)을 30분 후에 투여한다. 혈액 샘플을 투여 후 6시간 까지 30분마다 꼬리 정맥으로부터 수집한다.
혈중 글루코스 수준은 글루코사민, FDG 및 EC-데옥시글루코스를 일시적 정맥내 투여함으로써 유도한다. 이러한 증가된 혈중 글루코스 수준은 EC-데옥시글루코스 또는 FDG 및 인슐린을 동시-투여함으로써 억제될 수 있다(도 74 및 75).
99m Tc-EC-DG의 조직 분포 연구
유방 종양 보유 동물 모델의 경우, 암컷 피셔 344 랫트(150±25g)(공급원: Harlan Sprague-Dawley, Indianapolis, IN)를 25-게이지 바늘을 사용하여 뒷다리에 13762 종양 세포주 현탁액(106개 세포/랫트, 피셔 랫트에 특이적인 종양 세포주)로부터의 포유동물 종양 세포 0.1ml로 피하 접종시킨다. 연구는 착상한지 14일 내지 17일 후 종양이 약 1cm 직경에 도달하면 수행한다. 랫트는 각 과정 전에 케타민(10 내지 15mg/랫트, 복강내)으로 마취시킨다.
폐 종양 보유 동물 모델의 경우, 무흉선 누드 마우스(20 내지 25g)에게 25-게이지 바늘을 사용하여 뒷다리에 A549 종양 세포주 현탁액(106개 세포/마우스)로부터의 사람 폐 종양 세포 0.1ml을 피하 접종시킨다. 연구는 착상한지 17일 내지 21일 후 종양이 약 0.6cm 직경에 도달하면 수행한다.
조직 분포 연구에서, 각 동물에게 10 내지 20μCi(랫트마다) 또는 1 내지 2μCi(마우스마다)의 99m Tc-EC 또는 99m Tc-EC-DG(n=3/시점)를 정맥내 주사한다. 주사된 99m Tc-EC-DG의 질량은 랫트당 1mg이다. 방사성 트레이서를 투여한 후 0.5시간째, 2시간째 및 4시간째에, 상기 설취류들을 희생시키고 선택된 조직을 절개하고, 칭량하고 방사능을 측정한다. 각 샘플중 트레이서의 체내분포는 조직 습식 중량 g당 주사된 투여량의 백분율(%ID/g)로서 계산한다. 종양/비표적 세포 카운트 밀도 비는 상응하는 %ID/g 값으로부터 계산한다. 99m Tc-EC(표 4) 및 유리 테크네튬과 비교하여, 종양 대 조직 비는 99m Tc-EC-DG 그룹에서 시간의 함수로서 증가하였다(도 76 내지 80).
신티그래피 영상화 연구
신티그래피 영상을 각 방사성 트레이서 100μCi를 정맥내 주사한지 0.5시간, 2시간 및 4시간 후에 저에너지 평행구멍형 조준기가 장착된 감마 카메라(제조원: Siemens Medical Systems, Inc., Hoffman Estates, IL)을 사용하여 수득한다. 사용되는 동물 모델은 유방 종양 보유 랫트이다. 종양은 99m Tc-EC(대조군)에 비해 잘 가시화될 수 있다(도 81). 예비 임상 영상화 연구를 5명의 환자(3명의 뇌종양 환자 및 2명의 폐 질환 환자)에서 수행한다. 영상은 투여 후 1시간 내지 2시간째에 수득된다. 99m Tc-EC-DG는 양성 종양과 악성 종양을 구별할 수 있다. 예를 들어, 악성 성상세포종은 높은 흡수율을 나타낸다(도 82A, 82B, 83A 및 83B). 양성 수막종은 악성 수막종에 비해 불량한 흡수율을 나타낸다(도 84A 및 84B). 불량한 흡수율은 TB 환자에서 관찰되나(도 85A 및 도 85B), 높은 흡수율은 폐암에서 관찰된다(도 86A, 86B 및 도 86C).
본원에서 기술되고 청구되는 모든 조성물 및/또는 방법은 본 내용의 측면에서 과도한 실험없이도 제조되고 달성될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 양태의 측면에서 기술되며, 변형이 본 발명의 개념, 취지 및 범주에서 벗어남이 없이 본원에서 기술하는 방법의 단계 또는 일련의 단계에서 조성물 및/또는 방법에 적용될 수 있다는 것은 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 보다 구체적으로는, 화학적 및 생리학적으로 모두 관련되는 특정 제제를 본원에서 기술하는 다른 제제로 대체할 수 있으며, 동일하거나 유사한 결과가 달성될 수 있다는 것이 명백할 것이다. 모든 상기 유사한 대체 및 변형은 첨부되는 청구의 범위에 의해 정의되는 바와 같이 본 발명의 취지, 범주 및 개념내에서 고려된다는 것이 당해 분야의 숙련가에게 명백하다.
참조문헌
본원에 제시된 것들에 대한 예시적인 과정 또는 다른 상세한 보충물을 제공하는 범위의 하기 참조문헌을 본원에 참고로 구체적으로 인용한다.
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Claims (58)

  1. 방사성 핵종 표지된 에틸렌디시스테인(EC)에 접합되어 있는 메토트렉세이트, 토무덱스, 글루타메이트 펜타펩타이드, 데옥시글루코스, 글루코스, 글루코사민, 네오마이신, 카나마이신, 겐타마이신, 파로마이신, 아미카신, 토브라마이신, 네틸마이신, 리보스타마이신, 시소마이신, 미크로마이신, 리비도마이신, 디베카신, 이세파마이신, 아스트로마이신 및 아미노글리코사이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 표적화 리간드를 포함하는 종양 또는 감염 부위 영상화용 조성물.
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  13. 제1항에 있어서, 99m Tc-EC-메토트렉세이트로서 한정되는 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 99m Tc-EC-토무덱스로서 한정되는 조성물.
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  22. 제1항에 있어서, 99m Tc-EC-글루타메이트 펜타펩타이드로서 한정되는 조성물.
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  25. 제1항에 있어서, 99m Tc-EC-네오마이신으로서 한정되는 조성물.
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  27. 제1항에 있어서, 99m Tc-EC-데옥시글루코스로서 한정되는 조성물.
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  33. (a) 메토트렉세이트, 토무덱스, 글루타메이트 펜타펩티드, 데옥시글루코스, 글루코스, 글루코사민, 네오마이신, 카나마이신, 겐타마이신, 파로마이신, 아미카신, 토브라마이신, 네틸마이신, 리보스타마이신, 시소마이신, 미크로마이신, 리비도마이신, 디베카신, 이세파마이신, 아스트로마이신 및 아미노글리코사이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 표적화 리간드를 수득하는 단계,
    (b) 상기 리간드를 에틸렌디시스테인(EC)과 혼합하여 EC-표적화 리간드 유도체를 수득하는 단계 및
    (c) 상기 EC-표적화 리간드를 방사성 핵종 및 환원제와 혼합하여 방사성 핵종 표지된 EC-표적화 리간드 유도체를 수득함으로써, EC가 방사성 핵종 표지와 N2S2 킬레이트를 형성하는 단계를 포함하여,
    영상화용 비스-아미노에탄티올 테트라덴테이트 킬레이트화 리간드를 합성하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 환원제가 디티오나이트 이온, 제1주석 이온 또는 제1철 이온인 방법.
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  39. 제1항에 있어서, 부위가 종양인 조성물.
  40. 제1항에 있어서, 부위가 감염 부위인 조성물.
  41. 제1항에 있어서, 부위가 유방암, 난소암, 전립선암, 자궁내막, 심장, 폐, 뇌, 간, 폴레이트 수용체 양성 암, 에스트로겐 수용체 양성 암, 비장, 췌장 또는 소장인 조성물.
  42. 예정된 양의 에틸렌디시스테인-표적화 리간드 접합체 조성물 및 접합체를 선택된 방사성 핵종으로 표지화시키기에 충분한 양의 환원제를 포함하는 밀봉된 용기를 포함하는, 방사성 약물 제제 제조용 키트로서, 상기 표적화 리간드가 메토트렉세이트, 토무덱스, 글루타메이트 펜타펩티드, 데옥시글루코스, 글루코스, 글루코사민, 네오마이신, 카나마이신, 겐타마이신, 파로마이신, 아미카신, 토브라마이신, 네틸마이신, 리보스타마이신, 시소마이신, 미크로마이신, 리비도마이신, 디베카신, 이세파마이신, 아스트로마이신 및 아미노글리코사이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 키트.
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  52. 제1항에 있어서, 에틸렌디시스테인이 방사성 핵종 표지와 N2S2 킬레이트를 형성하는 영상화용 조성물.
  53. 제52항에 있어서, 표적화 리간드가 에틸렌디시스테인의 산 아암(acid arm)의 한쪽 또는 양쪽에서 에틸렌디시스테인과 접합될 수 있는 조성물.
  54. 제52항에 있어서, 방사성 핵종이 99m Tc, 188Re, 186Re, 183Sm, 166Ho, 90Y, 89Sr, 67Ga, 68Ga, 111In, 183Gd, 59Fe, 225Ac, 212Bi, 211At, 64Cu 또는 62Cu인 조성물.
  55. 제54항에 있어서, 방사성 핵종이 99m Tc인 조성물.
  56. 제52항에 있어서, 에틸렌디시스테인을 표적화 리간드에 접합시키는, 수용성 펩타이드, 아미노산, 폴리아미노산, 글루탐산, 폴리글루탐산, 펜타글루타메이트, 아스파르트산, 폴리아스파르트산, 브로모 에틸아세테이트, 에틸렌 디아민 또는 라이신인 링커를 추가로 포함하는 조성물.
  57. 제42항에 있어서, 방사성 핵종이 99m Tc인 키트.
  58. 제42항에 있어서, 에틸렌디시스테인-표적화 리간드 접합체 조성물이 에틸렌디시스테인과 표적화 리간드 사이에 링커를 추가로 포함하는 키트.
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