JP2008208138A - エチレンジシステイン(ec)−薬物結合体 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、放射性標識した組織特異的リガンド、ならびにこの放射性標識したリガンドを作製するための方法および組織特異的疾患を画像化するためにこの放射性標識したリガンドを使用するための方法を提供する。本発明は、組織特異的疾患画像化のための組成物を提供する。本発明のこの画像化組成物は、一般に、エチレンジシステインおよび酸アーム(acid arm)の一方または両方上のエチレンジシステインに結合体化された組織特異的リガンドでキレート化された放射性核種標識を含む。このエチレンジシステインは、放射性核種標識を有するN2S2キレートを形成する。当然、このキレート化した化合物は、放射性核種とキレート化号物との間にイオン結合を含む。
【選択図】なし
Description
政府は、本発明の権利を所有しない。
本発明は、一般に、標識、放射画像化(radioimaging)および化学合成の分野に関する。より詳細には、本発明は、標的化リガンドを放射画像化するための戦略に関する。本発明は、さらに、腫瘍の画像化および組織特異的障害の画像化において、これらの放射性標識したリガンドを使用する方法に関する。
シンチグラフ腫瘍画像化の改善は、さらなる腫瘍特異的放射性医薬品の開発によって、広範囲にわたって決定される。より高い腫瘍特異性に起因して、放射性標識したリガンドおよび放射性標識した抗体は、腫瘍のシンチグラグ検出の新しい時代を開き、そして広範囲の前臨床試験の開発および評価を受けている(非特許文献1〜3(Mathiasら、1996、1997a、1997b))。放射性核種画像化様式(陽子射出放出断層撮影、PET;単一光子放射型コンピュータ断層撮影、SPECT)は、放射性核種標識された放射性トレーサーの位置および密度をマッピングする診断用断層画像化技術である。CTおよびMRIは、腫瘍の位置および範囲に関するかなりの解剖的な情報を提供するが、これらの画像化様式は、浮腫、放射線壊死、グレーディング(grading)または神経膠症由来の侵襲性損傷を十分に区別し得ない。PETおよびSPECTは、代謝活性を測定することによって、腫瘍を局在化および特徴付けするために使用され得る。
Mathiasら,J Nucl Med,37:1003−1008,1996 Mathiasら,J Nucl Med,(Supplement)38:87P,1997a Mathiasら,J Nucl Med,(Supplement)38:133P,1997b
本発明は、画像化用に組織を標的化するための新しい放射性標識の戦略を提供することによって、先行技術のこれらの欠点および他の欠点を克服する。本発明は、放射性標識した組織特異的リガンド、ならびにこの放射性標識したリガンドを作製するための方法および組織特異的疾患を画像化するためにこの放射性標識したリガンドを使用するための方法を提供する。
本発明は、組織特異的疾患画像化のための組成物を提供する。本発明のこの画像化組成物は、一般に、エチレンジシステインおよび酸アーム(acid arm)の一方または両方上のエチレンジシステインに結合体化された組織特異的リガンドでキレート化された放射性核種標識を含む。このエチレンジシステインは、放射性核種標識を有するN2S2キレートを形成する。当然、このキレート化した化合物は、放射性核種とキレート化号物との間にイオン結合を含む。用語「EC−組織特異的リガンド結合体」、「EC−誘導体」および「EC−薬物結合体」は、標識されていないエチレンジシステイン−組織特異的リガンド化合物をいうために、本明細書中で交換可能に使用される。本明細書中で使用される場合、用語「結合体」は、共有結合した化合物をいう。
(項目1) 画像化のための組成物であって、以下:
放射線核種標識;
エチレンジシステイン;および
該エチレンジシステインに結合体化した組織特異的リガンド;
を含み、ここで、該エチレンジシステインが、該放射線核種標識とN 2 S 2 キレートを形成する、組成物。
(項目2) 前記組織特異的リガンドが、前記エチレンジシステインの1つまたは両方の酸アームで該エチレンジシステインと結合体化し得る、項目1に記載の組成物。
(項目3) 前記放射線核種が、 99m Tc、 188 Re、 186 Re、 183 Sm、 166 Ho、 90 Y、 89 Sr、 67 Ga、 68 Ga、 111 In、 183 Gd、 59 Fe、 225 Ac、 212 Bi、 211 At、 64 Cuまたは 62 Cuである、項目1に記載の組成物。
(項目4) 前記放射線核種が 99m Tcである、項目3に記載の組成物。
(項目5) 前記組織特異的リガンドが、抗癌剤、DNAトポイソメラーゼインヒビター、代謝拮抗剤、腫瘍マーカー、ホレートレセプター標的化リガンド、腫瘍アポトーシス細胞標的化リガンド、腫瘍低酸素標的化リガンド、DNAインターカレーター、レセプターマーカー、ペプチド、ヌクレオチド、器官特異的リガンド、抗生物質、抗真菌剤、抗体、グルタミン酸ペンタペプチドまたはグルコースを模倣する因子である、項目1に記載の組成物。
(項目6) 前記組織特異的リガンドが、抗癌剤である、項目5に記載の組成物。
(項目7) 前記抗癌剤が、メトトレキセート、ドキソルビシン、タモキシフェン、パクリタキセル、トポテカン、LHRH、マイトマイシンC、エトポシドトムデックス、ポドフィロトキシン、ミトザントロン、カンプトセシン、コルヒチン、エンドスタチン、フルダラビン、ゲムシタビンおよびトムデックスからなる群より選択され得る、項目6に記載の組成物。
(項目8) 前記組織特異的リガンドが腫瘍マーカーである、項目5に記載の組成物。
(項目9) 前記腫瘍マーカーが、PSA、ER、PR、CA−125、CA−199、CEA AFP、インターフェロン、BRCA1、HER−2/neu、シトキサン、p53、エンドスタチンまたはモノクローナル抗体(例えば、アンチセンス)である、項目8に記載の組成物。
(項目10) 前記組織特異的リガンドが、ホレートレセプター標的化リガンドである、項目5に記載の組成物。
(項目11) 前記ホレートレセプター標的化リガンドが、ホレート、メトトレキセートまたはトムデックスである、項目10に記載の組成物。
(項目12) 99m Tc−EC−ホレートとしてさらに規定される、項目11に記載の組成物。
(項目13) 99m Tc−EC−メトトレキセートとしてさらに規定される、項目11に記載の組成物。
(項目14) 99m Tc−EC−トムデックスとしてさらに規定される、項目11に記載の組成物。
(項目15) 前記組織特異的リガンドが、腫瘍アポトーシス細胞標的化リガンドまたは腫瘍低酸素標的化リガンドである、項目5に記載の組成物。
(項目16) 前記組織特異的リガンドが、アネキシンV、コルヒチン、ニトロイミダゾール、マイトマイシンまたはメトロニダゾルである、項目15に記載の組成物。
(項目17) 99m Tc−EC−アネキシンVとしてさらに規定される、項目16に記載の組成物。
(項目18) 99m Tc−EC−コルヒチンとしてさらに規定される、項目16に記載の組成物。
(項目19) 99m Tc−EC−ニトロイミダゾールとしてさらに規定される、項目16に記載の組成物。
(項目20) 99m TC−EC−メトロニダゾールとしてさらに規定される、項目16に記載の組成物。
(項目21) 前記組織特異的リガンドが、グルタミン酸ペンタペプチド(分子量750〜15,000)である、項目5に記載の組成物。
(項目22) 99m Tc−EC−グルタミン酸ペンタペプチドとしてさらに規定される、項目21に記載の組成物。
(項目23) 前記組織特異的リガンドが、グルコースを模倣する因子である、項目5に記載の組成物。
(項目24) グルコースを模倣する前記因子が、ネオマイシン、カナマイシン、ゲンタマインシン、パロマイシン、アミカシン、トブラマイシン、ネチルマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン、ミクロマイシン、リビドマイシン、ジベカシン、イセパマイシン、アストロマイシン、またはアミノグルコシドである、項目23に記載の組成物。
(項目25) 99m Tc−EC−ネオマイシンとしてさらに規定される、項目24に記載の組成物。
(項目26) 99m Tc−EC−カナマイシンとしてさらに規定される、項目24に記載の組成物。
(項目27) 99m Tc−EC−アミノグリコシドとしてさらに規定される、項目24に記載の組成物。
(項目28) 99m Tc−EC−ゲンタマイシンとしてさらに規定される、項目24に記載の組成物。
(項目29) 99m Tc−EC−トブラマイシンとしてさらに規定される、項目24に記載の組成物。
(項目30) ECを前記組織特異的リガンドに結合体化するリンカーをさらに含む。項目2に記載の組成物。
(項目31) 前記リンカーが、水溶性ペプチド、グルタミン酸、アスパラギン酸、ブロモ酢酸エチル、エチレンジアミンまたはリジンである、項目30に記載の組成物。
(項目32) 前記組織特異的リガンドが、エストラジオール、トポテカン、パクリタキセル、ラロキシフェン、エトポシド、ドキソルビシン、マイトマイシンC、エンドスタチン、アネキシンV、LHRH、オクトレオチド、VIP、メトトレキセートまたは葉酸である、項目31に記載の組成物。
(項目33) 画像化のための放射標識されたエチレンジシステイン誘導体を合成する方法であって、該方法は、以下の工程:
a)組織特異的リガンドを得る工程;
b)該リガンドをエチレンジシステイン(EC)と混合して、EC−組織特異的リガンド誘導体を得る工程;ならびに
c)該EC−組織特異的リガンド誘導体を、放射線核種および還元剤と混合して、放射線核種標識されたEC−組織特異的リガンド誘導体を得る工程であって、ここで、該ECが、該放射線核種とN 2 S 2 キレートを形成する、工程、
を包含する、方法。
(項目34) 前記還元剤が、亜ジチオン酸イオン、第一スズイオン、または第一鉄イオンである、項目33に記載の方法。
(項目35) 画像化のために組織特異的リガンドを標識化する方法であって、該方法は、以下の工程:
a)組織特異的リガンドを得る工程;
b)該組織特異的リガンドをエチレンジシステイン(EC)と混合して、EC−リガンド薬物結合体を得る工程;ならびに
c)該薬物結合体を、還元剤の存在下で 99m Tcと反応させて、該エチレンジシステイン(リンカーありまたはリンカーなし)と該 99m Tcとの間にN 2 S 2 キレートを形成する工程、
を包含する、方法。
(項目36) 前記組織特異的リガンドが、抗癌剤、DNAトポイソメラーゼインヒビター、代謝拮抗剤、腫瘍マーカー、ホレートレセプター標的化リガンド、腫瘍アポトーシス細胞標的化リガンド、腫瘍低酸素標的化リガンド、DNAインターカレーター、レセプターマーカー、ペプチド、器官特異的リガンド、抗生物質、抗真菌剤、グルタミン酸ペンタペプチドまたはグルコースを模倣する因子である、項目35に記載の方法。
(項目37) 前記還元剤が、亜ジチオン酸イオン、第一スズイオン、または第一鉄イオンである、項目36に記載の方法。
(項目38) 哺乳動物身体内の部位を画像化する方法であって、 99m Tc標識されたエチレンジシステイン−組織特異的リガンド結合体を含む診断有効量の組成物を投与する工程、および該部位に局在する 99m Tcからの放射活性シグナルを検出する工程、を包含する、方法。
(項目39) 前記部位が腫瘍である、項目38に記載の方法。
(項目40) 前記部位が感染である、項目38に記載の方法。
(項目41) 前記部位が、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮内膜、心臓、肺、脳、肝臓、ホレート(+)癌、ER(+)癌、脾臓、膵臓、または腸である、項目38に記載の方法。
(項目42) 放射性薬学的調製物を調製するためのキットであって、該キットは、所定量のエチレンジシステイン−組織特異的リガンド結合体組成物および 99m Tcを用いて該結合体を標識するために十分量の還元剤を含むシールされた容器を備える、キット。
(項目43) 前記エチレンジシステイン−組織特異的リガンド結合体組成物が、該エチレンジシステインと該組織特異的リガンドとの間にさらにリンカーを含む、項目42に記載のキット。
(項目44) 前記組織特異的リガンドが、抗癌剤、DNAトポイソメラーゼインヒビター、代謝拮抗剤、腫瘍マーカー、ホレートレセプター標的化リガンド、 腫瘍アポトーシス細胞標的化リガンド、腫瘍低酸素標的化リガンド、DNAインターカレーター、レセプターマーカー、ペプチド、器官リガンド、抗生物質、抗真菌剤、グルタミン酸ペンタペプチドまたはグルコースを模倣する因子である、項目42に記載のキット。
(項目45) 前記組織特異的リガンドが、エストラジオール、トポテカン、パクリタキセル、ラロキシフェン、エトポシド、ドキソルビシン、マイトマイシンC、エンドスタチン、アネキシンV、LHRH、オクトレオチド、VIP、メトトレキセートまたは葉酸である、項目43に記載のキット。
(項目46) 前記リンカーが、水溶性ペプチド、グルタミン酸、ポリグルタミン酸、アスパラギン酸、ポリアスパラギン酸、ブロモ酢酸エチル、エチレンジアミンまたはリジンである、項目45に記載のキット。
(項目47) シンチグラフィー画像化剤を調製するための試薬であって、 99m Tc結合部位に共有結合した組織特異的リガンドを含む、試薬。
(項目48) 前記 99m Tc結合部分が、エチレンジシステインである、項目47に記載の試薬。
(項目49) 前記組織特異的リガンドが、抗癌剤、DNAトポイソメラーゼインヒビター、代謝拮抗剤、腫瘍マーカー、ホレートレセプター標的化リガンド、腫瘍アポトーシス細胞標的化リガンド、腫瘍低酸素標的化リガンド、DNAインターカレーター、レセプターマーカー、ペプチド、器官特異的リガンド、抗生物質、抗真菌剤、グルタミン酸ペンタペプチドまたはグルコースを模倣する因子である、項目48に記載の試薬。
(項目50) 前記組織特異的リガンドと前記 99m Tc結合部位との間にさらにリンカーを含む、項目48に記載の試薬。
(項目51) 腫瘍に対する候補薬物の有効性を決定する方法であって、該方法は、以下:
a)候補薬物を得る工程;
b)該候補薬物をエチレンジシステイン(EC)と結合体化して、EC−候補薬物結合体を生成する工程;
c)該候補薬物結合体を、 99m Tcを用いてキレート化して、 99m Tc−EC−候補薬物結合体を生成する工程;
d)該 99m Tc−EC−候補薬物結合体を、腫瘍を有する患者に導入する工程;および
e)該患者を画像化して、該腫瘍に対する該候補薬物の有効性を決定する工程、
を包含する、方法。
核医学の分野において、特定の病理的状態は、局在化するか、またはそれらの程度が、少量の内部投与される放射性標識されたトレーサ化合物(放射性トレーサまたは放射性薬品と呼ばれる)の分布を検出することによって評価される。これらの放射性薬品を検出するための方法は、画像化法または放射性画像化法として一般的に公知である。
A.エストラジオール、トポテカン、パクリタキセル、ラロキシルフェン(raloxfen)エトポシド
B.ドキソルビシン、マイトマイシンC、エンドスタチン、アネキシンV.LHRH、オクトレオチド、VIP
C.メトトレキサート、葉酸
本発明のEC組織特異的リガンド薬物結合体が他の放射性核種にキレート化し得、放射性核種療法に使用され得ることも想定される。一般的に、実質的に任意のα,β−放射体、γ−放射体、またはβ,γ−放射体が、本発明とともに使用され得ることが考えられる。好ましいβ,γ−放射体としては、166Ho、188Re、186Re、153Sm、および89Srが挙げられる。好ましいβ−放射体としては、90Yおよび225Acが挙げられる。好ましいγ−放射体としては、67Ga、68Ga、64Cu、62Cuおよび111Inが挙げられる。好ましいα−放射体としては、211Atおよび212Biが挙げられる。常磁性物質(例えば、Gd、MnおよびFe)が、本発明と組み合わせた使用のためにECとキレート化され得ることも想定される。
放射標識リガンド(例えば、ペンテトレオチド(pentetreotide)および血管作用性腸ペプチド)は、細胞レセプターに結合し、これらのうちのいくつかは、腫瘍細胞において過剰発現される(BrittonおよびGranowska、1996;Krenningら、1995;Reubiら、1992;Goldsmithら、1995;Virgoliniら、1994)。これらのリガンドが免疫原性でなく、そして血漿から迅速に排除されるので、レセプター画像化は、抗体画像化と比較してより見込みがあるようである。
腫瘍細胞は、酸素の非存在化におけるよりも酸素の存在下において従来の照射により感受性である;腫瘍内の少ない割合の低酸素細胞でさえ、放射線に対する応答を制限し得る(Hall、1988;Bushら、1978;Grayら、1953)。低酸素放射線抵抗性は、多くの動物腫瘍において示されたが、ヒトにおいては少しの腫瘍型のみで示された(Dische、1991;Gatenbyら、1988;Nordsmarkら、1996)。ヒト腫瘍における低酸素の発生は、大部分において、組織学的知見および動物腫瘍研究から推論された。低酸素のインビボ実証は、酸素電極を用いた組織測定を必要とし、そしてこれらの技術の侵襲性は、それらの臨床的適用を限定している。
ペプチドおよびアミノ酸は、種々の型の腫瘍の画像化において首尾よく使用されてきた(Westerら、1999;CoenenおよびStocklin、1988;Radererら、1996;Lambertら、1990;Bakkerら、1990;StellaおよびMathew、1990;Butterfieldら、1998;Piperら、1983;Mochizukiら、DickinsonおよびHiltner、1981)。グルタミン酸ベースのペプチドは、癌処置のための薬物キャリアとして使用されてきた(StellaおよびMathew、1990;Butterfieldら、1998;Piperら、1983;Mochizukiら、1985;DickinsonおよびHiltner、1981)。ホレートのグルタメート部分が分解し、そしてインビボでポリグルタメートを形成することは公知である。次いで、このポリグルタメートは、ホレートに再結合されて、ホリルポリグルタメートを形成し、このホリルポリグルタメートは、グルコース代謝に関係する。グルタミン酸ペプチドを標識することは、腫瘍の悪性度を区別する際に有用であり得る。本発明において、本発明者らは、EC−グルタミン酸ペンタペプチドの合成を報告し、そして腫瘍の画像化におけるその潜在的な使用を評価する。
アポトーシスは、化学療法および放射線を用いる癌の処置の間に生じる(Lennonら、1991;Abramsら、1990;Blakenbergら、1998;Blakenbergら、1999;TaitおよびSmith、1991)。アネキシンVは、ホスホチジルセリンに結合することが知られており、このホスホチジルセリンは、腫瘍アポトーシス細胞によって過剰発現される(Blakenbergら、1999;TaitおよびSmith、1991)。アネキシンVによるアポトーシスの評価は、治療の効力(例えば、疾患の進行または後退)を評価するために有用である。本発明において、本発明者らは、99mTc−EC−アネキシンV(EC−ANNEX)を合成し、そして腫瘍画像化におけるその潜在的な使用を評価する。
新脈管形成は、部分的に、腫瘍増殖および転移の発生の原因である。抗有糸分裂性化合物は、抗脈管形成性であり、そして抗癌薬物としてのそれらの潜在的な使用について知られている。これらの化合物は、細胞サイクルの分裂期の間の細胞分裂を阻害する。細胞機能の生化学的プロセス(例えば、細胞分裂、細胞運動性、分泌、線毛運動およびべん毛運動、細胞内輸送、ならびに細胞の形態の維持)の間に、微小管が関係する。抗有糸分裂性化合物は、高い親和性で、微小管タンパク質(チューブリン)に結合し、微小管アセンブリを乱し、そして増幅細胞の有糸分裂の停止を引き起こすことが知られている。従って、抗有糸分裂性化合物は、微小管インヒビターとして、または紡錘体毒として、みなされる(Lu、1995)。
アポトーシスは、化学療法および放射線を用いる癌の処置の間に生じる。アネキシンVは、ホスホチジルセリンに結合することが知られており、このホスホチジルセリンは、腫瘍アポトーシス細胞によって過剰発現される。アネキシンVによるアポトーシスの評価は、治療の効力(例えば、疾患の進行または後退)を評価するために有用である。従って、99mTc−EC−アネキシンV(EC−ANNEX)を開発した。
放射線治療の前の、画像化様式による腫瘍低酸素症の評価により、放射線増感剤または生体還元薬剤(bioreductive drug)(例えば、チラパザミン(tirapazamine)、マイトマイシンC)での処置のための患者を選択する合理的な手段が提供される。このような患者の選択は、低酸素症性腫瘍を有する患者のより正確な処置を可能にする。さらに、腫瘍サプレッサ遺伝子(P53)は、多重薬物耐性に関係する。化学療法の前後の組織病理学により画像化の知見とP53の過剰発現とを相関付けることは、後の腫瘍処置応答において有用である。99mTc−EC−2−ニトロイミダゾールおよび99mTc−EC−メトロニダゾルを開発した。
新脈管形成は、部分的に、腫瘍増殖および転移の発生の原因である。抗有糸分裂性化合物は、抗脈管形成性であり、そして抗癌薬物としてのそれらの潜在的な使用について知られている。これらの化合物は、細胞サイクルの分裂期の間の細胞分裂を阻害する。細胞機能の生化学的プロセス(例えば、細胞分裂、細胞運動性、分泌、線毛運動およびべん毛運動、細胞内輸送、ならびに細胞の形態の維持)の間に、微小管が関係する。抗有糸分裂性化合物は、高い親和性で、微小管タンパク質(チューブリン)に結合し、微小管アセンブリを乱し、そして増幅細胞の有糸分裂の停止を引き起こすことが知られている。従って、抗有糸分裂性化合物は、微小管インヒビターとして、または紡錘体毒として、見なされる。コルヒチン(これは、強力な抗脈管形成薬剤である)は、微小管重合および中期での細胞停止を阻害することが知られている。コルヒチン(COL)は、細胞機能を評価するための生化学的ツールとして有用であり得る。次いで、99mTc−EC−COLを開発した。
腫瘍細胞は、多少低酸素症的であるが、それは、酸素プローブが、圧力を測定することを必要とする。低酸素症的な条件を模倣するために、本発明者らは、発作を経験した11人の患者を、99mTc−EC−メトロニダゾル(99mTc−EC−MN)を使用して、画像化した。メトロニダゾルは、腫瘍低酸素症マーカーである。発作の範囲の組織は、酸素の欠乏に起因して、低酸素症的となる。このSPECT画像を、99mTc−EC−MNの注射の1時間後と3時間後に行った。全てのこれらの画像化研究は、積極的に、病変を局在化させた。CTは、非常に十分にまたは正確に、病変を示さなかった。いくつかの場合におけるMRIおよびCTは、病変のサイズを誇張した。以下は、3人の患者から選択されたケースである。
99mTc−EC−MNは、注入後1時間で病変を同定し(図28)、これは、MRI T1負荷画像に対応する(図29)。
放射性標識リガンド(例えば、多糖(ネオマイシン、カナマイシン、トブラマイシン)および単糖(例えば、グルコサミン))は、細胞グルコーストランスポータ(腫瘍細胞で過剰発現される)に結合し、続いて、リン酸化される(Rogersら、1968;Fanciulliら、1994;Popoviciら、1971;Jonesら、1973;Hermannら、2000)。多糖(ネオマイシン、カナマイシン、トブラマイシン)および単糖(グルコサミン)によって誘導されるグルコースレベルは、インスリンによって抑制され得る(Haradaら、1995;Mollerら、1991;Offieldら、1996;Shankarら、1998;Yoshinoら、1999;Villevalois−Camら、2000)。これらのリガンドは、免疫原性ではなく、そして細胞質から迅速に浄化されるので、代謝画像化は、抗体画像化と比較して、有望であるようである。
(ECの合成)
ECを、以前に記載された方法(RatnerおよびClarke、1937;Blondeauら、1967;各々は、本明細書中に参考として援用される)に従って、2工程合成で調製した。前駆体L−チアゾリジン−4−カルボン酸を、合成した(m.p.195℃、報告値196−197℃)。次いで、ECを、調製した(m.p.237℃、報告値251−253℃)。この構造を、1H−NMRおよび高速原子ボンバードメント質量分析法(FAB−MS)によって確認した。
MIX(227ma、0.5mmol)を、1mlのHCl溶液(2N)に溶解した。pH値を、<3とした。この攪拌溶液に、2mlの水および4mlのN−エトキシカルボニル−2−エトキシ−1,2−ジヒドロキノリン(EEDQ、メタノール中6.609%、1mmol)を、室温で添加した。エチレンジアミン(EDA、0.6 ml、10mmol)をゆっくりと添加した。この反応混合物を、一晩攪拌し、そして溶媒を減圧下でエバポレートした。未処理の固体物質を、ジエチルエーテル(10ml)、アセトニトリル(10ml)および95%エチルアルコール(50ml)で洗浄して、未反応のEEDQおよびEDAを除去した。次いで、生成物は、凍結乾燥によって乾燥し、そしてさらに精製することなく使用した。この生成物を、210mg(84.7%)であり、黄色粉末であった。生成物の融点:195−198℃(分解、MIX);1H−NMR(D2O)δ 2.98−3.04(d,8H,−(CH2)2CONH(CH0)2NH2),4.16−4.71(m,6H,−CH2−プテリジニル,芳香族−NCH3,NH−CH−COOHグルタメート),6.63−6.64(d,2H,芳香族−CO),7.51−753(d,2H.芳香族−N),8.36(s,1H,プテリジニル)。FAB MS m/z C22H28,N10,O4(M)+についての計算値496.515,実測値496.835。
葉酸二水和物(1g、2.0mmol)を、10mlの水の添加した。pH値を、HCl(2N)を使用して、2に調節した。この攪拌溶液に、N−エトキシカルボニル−2−エトキシ−1,2−ジヒドロキノリン(EEDQ、10mlメタノール中1g、4.0mmol)およびエチレンジアミン(EDA、1.3ml、18mmol)をゆっくりと添加した。この反応混合物を、室温で一晩攪拌した。溶媒を、減圧下でエバポレートした。生成物を、メタノール(50ml)中で沈澱させ、そしてさらに、アセトン(100ml)で洗浄して、未反応のEEDQおよびEDITを除去した。次いで、この生成物を、凍結乾燥し、そしてさらに精製することなく使用した。ニンヒドリン(メタノール中2%)スプレーは、陽性のアミノ基を示した。この生成物は、0.6g(収率60%)であり、黄色粉末であった。生成物の融点:250℃(分解)。1H−NMR(D2O)δ 1.97−2.27(m,2H,ホレートの−CH2グルタメート),3.05−3.40(d,6H,−CH2CONH(CH2)2NH2),4.27−4.84(m,3H,−CH2−プテリジニル,NH−CH−COOHグルタメート),6.68−6.70(d,2H,芳香族−CO)、7.60−7.62(d,2H,芳香族−N),8.44(s,1H,プテリジニル)。FAB MS m/z C21H25N9,O5(M)+のついての計算値:483,実測値483.21。
ECを溶解するために、NaOH(2N、0.1ml)を、水(1.5ml)中のEC(114ma、0.425mmol)の攪拌溶液に添加した。この無色の溶液に、スルホ−NHS(92.3mg、0.425mmol)およびEDC(81.5mg、0.425mmol)を添加した。ホレート−NH2(205mg、0.425mmol)を、次いで、添加した。この混合物を、室温で24時間攪拌した。この混合物を、500の分子カットオフを有するSpectra/POR分子多孔性膜(Spectrum Medical Industries Inc.,Houston,TX)を使用して、48時間透析した。透析の後、生成物を凍結乾燥した。この生成物は、116mg(収率35%)であった。m.p.195℃(分解);1H−NMR(D2O)δ 1.98−2.28(m,2H,ホレートの−CH2グルタメート),2.60−2.95(m,4HおよびECの−CH2−SH),3.24−3.34(m,10H,−CH2−CO,ホレートのエチレンジアミンおよびECのエチレンジアミン),4.27−4.77(m,5H,−CH−プテリジニル,ホレートのNH−CH−COOHグルタメートおよびECのNH−CH−COOH),6.60−6.62(d,2H,芳香族−CO),7.58−7.59(d,2H.芳香族−N),8.59(s,1H,プテリジニル)。C29H37N11S2O8Na2(8H2O)についての分析計算値,FAB MS m/z(M)+777.3(水なし)。C,37.79;H,5.75;N,16.72;S,6.95。実測値:m/z (M)+777.7(20),489.4(100)。C,37.40;H,5.42;N.15.43;S,7.58。
99mTc−EC−ホレートの放射合成(radiosynthesis)を、必要とされる量の99mTc−過テクネチウム酸を、自家製キット(EC−ホレートの凍結乾燥残渣(3mg)、SnCl2(100μg)、Na2HPO4(13.5mg)、アスコルビン酸(0.5mg)およびNaEDTA(0.5mg)を含む)に添加することによって達成した。調製物の最終pHは、7.4であった。99mTc−ECをまた、ECの凍結乾燥残渣(3mg)、SnCl2(100μg)、Na2HPO4(13.5mg)、アスコルビン酸(0.5mg)およびpH10のNaEDTA(0.5mg)を含む自家製キットを使用することによって、得た。次いで、調製物のpHを7.4に調節した。放射化学純度を、各々、アセトン(系A)および酢酸アンモニウム(水中1M):メタノール(4:1)(系B)で溶出するTLC(ITLC SG,Gelman Sciences,Ann Arbor,MI)によって、決定した。radio−TLC (Bioscan,Washington,DC)分析から、放射化学純度は、両方の放射性医薬品について、>95%であった。Radio−TLCデータを表2に要約する。99mTc−EC−ホレートの合成を、図1に示す。
(癌化学療法のための選択された薬物)
以下の表は、USAおよびカナダにおける癌の治療のために使用される薬物およびそれらの主要な有害な影響を列挙する。列挙する選択された薬物は、Medical Letterコンサルタントの意見に基づいた。いくつかの薬物を、それらが、米国食品医薬品庁によって承認されていない指標について列挙する。抗癌薬物およびそれらの有害な影響については、以下の通りである。本発明の目的のために、これらの列挙は、例示を意味し、全てを網羅するものではないことを意味する。
** 化学療法は、少ない活性のみを有する。
1 化学療法を伴うかまたは伴わないタモキシフェンは、一般に、閉経後エストロゲン−レセプター陽性の、モード陽性患者に対して推奨され、そしてタモキシフェンを伴うかまたは伴わない化学療法が、閉経前のモード陽性な患者に対して一般に推奨される。化学療法および/またはタモフェキシンを伴うアジュバント処置が、より大きな腫瘍または他の有害な予後指標を有するモード陰性患者に対して推奨される。
2 メゲストロールおよび他のホルモン剤は、タモキシフェンが作用しないいくらかの患者において有用であり得る。
3 高用量化学療法の後(Medical Letter,34:79,1982)。
4 直腸癌について、フルオロウラシル単独での処置の前後に、フルオロウラシル(fluoroutacil)および放射線を用いる手術後アジュバント処置。
5 手術切除、放射線治療、または両方と組合された場合にのみ、薬物が主要な活性を有する。
6 ビタミンAアナログである、ラクトラチノル(lactratinoln)(Acgutana)は、前腫瘍性病変(白斑症(leukoplakla))を制御し得、そして第二の原発性腫瘍の割合を減少し得る(SE Bannerら、J Natl Cancer Inst,88:140 1994)。
† 調査用途のためにUSAのみで利用可能。
7 高リスク患者(例えば、高カウント、細胞遺伝異常、成人)は、誘導、維持および「強化」(寛解の達成後のさらなる薬物の使用)のためのさらなる薬物を必要とし得る。さらなる薬物としては、シクロホスファミド(cyclophosphamida)、ミトキサトロンおよびチオグアニン(thloguanine)が挙げられる。イギリスにおける1つの大きな制御された試行の結果は、強化が、ALLの全ての子供の生存率を改善し得ることを示唆する(JM Chasselleら、Lancet,34B:143,Jan 21,1995)。
8 初めに悪い予後を有する患者または寛解後に再発した患者。
9 急性前骨髄球白血病を有する何人かの患者は、トラチノイン(tratinoin)に対する完全な応答を有した。このような処置は、主に発熱および呼吸困難により特徴付けられる有毒な症状を引き起こし得る(RP Warrell,Jrら、N Engl J Med.328:177,1993)。
10 同種異系HLA同一同胞骨髄移植は、慢性期のCMLの患者の40%〜70%、加速期のCMLの患者の18%〜28%、急性転化の患者の15%未満を治癒し得る。骨髄移植後の疾患を有さない生存率は、50歳より大きい年齢、診断から3年より長い疾患の持続時間、および1抗原不適合または適合無関係のドナーの骨髄の使用により悪影響を受けた。インターフェロンαはまた、慢性期のCMLを有する患者(この患者は完全な細胞遺伝的応答(約10%)を達成する)において治癒的であり得;これは、新しく慢性期CMLと診断された80歳を越える年齢の患者、および同種異系骨髄移植の候補ではない全ての患者のために選択される処置である。化学治療単独は待機的である。
11 これらの組み合わせのいずれかを用いて第2の慢性期が達成される場合、同種異系骨髄移植が考慮されるべきである。第2の慢性期における骨髄移植は、CMLの患者の30%〜35%に対して治癒的であり得る。
12 極限段階のホジキン病(1段階および2段階)は、放射線治療によって治癒可能である。播種性疾患(3b段階および4段階)は、化学治療を必要とする。いくつかの中間段階および選択された臨床的状況が、この両方から利益を受ける。
‡ 用量制限効果は太字である。皮膚反応(時折、重篤)、色素過剰、および眼毒性は、実質的に全ての非ホルモン性抗癌剤で報告された。他の薬物との悪い相互作用については、Medical Letter Handbook of Adverse Drug Interactions,1995を参照のこと。
1. 研究用途のためのみにUSAで利用可能。
2. メゲストロールおよび他のホルモン剤は、タモキシフェンで失敗した場合の患者において有効であり得る。
3. 高用量化学治療後(Medical Letter,34:78,1992)。
4. 直腸癌について、フルオロウラシルのみを用いる処置の前および後の、フルオロウラシル+放射線を用いる手術後のアジュバント処置。
5. 薬物は、外科的切除、放射線治療またはその両方と組み合わせた場合にのみ、主な活性を有する。
6. ビタミンAアナログのイソトレチノイン(Accutane)は、新生物発生前のイシオン(ision)(白斑症)を制御し、そしてラットの第1の一次腫瘍を減少させ得る(SE Sennerら、J Natl Cancer Inst.88:140,1994)。
7. 高リスク患者(例えば、高カウント、細胞遺伝異常、成人)は、誘導、維持および「強化」(寛解の達成後のさらなる薬物の使用)のためのさらなる薬物を必要とし得る。さらなる薬物としては、シクロホスファミド、ミトキサトロンおよびチオグアニンが挙げられる。イギリスにおける1つの大きな制御された試行の結果は、強化がALLの全ての子供の生存率を改善し得ることを示唆する(JM Chassellaら、Lancet,348:143,Jan 21,1998)。
8. 初めに悪い予後を有する患者または寛解後に再発した患者。
9. 急性前骨髄球白血病を有する何人かの患者は、トレチノインに対する完全な応答を有した。このような処置は、主に発熱および呼吸困難により特徴付けられる有毒な症状を引き起こし得る(RP Warrell,Jrら、N Engl J Med.329:177,1993)。
10. 同種異系HLA同一同胞骨髄移植は、慢性期のCMLの患者の40%〜70%、加速期のCMLの患者の15%〜25%、急性転化の患者の15%未満を治癒し得る。骨髄移植後の疾患を有さない生存率は、50歳より大きい年齢、診断から3年より長い疾患の持続時間、および1抗原不適合または適合無関係のドナーの骨髄の使用により悪影響を受けた。インターフェロンαはまた、慢性期のCMLを有する患者(この患者は完全な細胞遺伝的応答(約10%)を達成する)において治癒的であり得;これは、新しく慢性期CMLと診断された50歳を越える年齢の患者、および同種異系骨髄移植の候補ではない全ての患者のために選択される処置である。化学治療単独は待機的である。
EC−ホレートの合成について記載された同じ方法を使用して、EC−MTXおよびEC−TDXを調製した。標識手順は、EC−MTXおよびEC−TDXを使用したこと以外は、99mTc−EC−ホレートの調製について記載された手順と同じである。99mTc−EC−MTXおよび99mTc−EC−TDXの合成を、図2および図3に示す。
99mTc−EC−ホレート、99mTc−EC−MTXおよび99mTc−EC−TDXの安定性を、血清サンプル中で試験した。簡単には、740KBqの1mgの99mTc−EC−ホレート、99mTc−EC−MTXおよび99mTc−EC−TDXを、イヌ血清(200μl)中で、37℃で4時間インキュベートした。この血清サンプルを、水中50%メタノールで希釈し、そして放射性TLCを、上記のように、0.5時間、2時間および4時間で繰り返した。
雌性Fischer 344ラット(150±25g)(Harlan Sprague−Dawley,Indianapolis,IN)に、0.1mlの乳癌細胞を、25ゲージ針を使用して、013762腫瘍細胞株懸濁液(106細胞/ラット、Fixcherラットに特異的な腫瘍細胞株)から後脚に皮下接種した。腫瘍の直径が約1cmに達した場合、移植後14〜17日間研究を実施した。各手順の前に、動物をケタミン(10〜15mg/ラット、腹腔内)で麻酔した。
シンチグラフィー画像を、低エネルギー平行穴型コリメーターを備えるγ線カメラ(Siemens Medical Systems,Inc.,Hoffman Estates,IL)を使用して、18.5MBqの99mTc標識放射性トレーサーの静脈内注射後0.5時間、2時間および4時間で得た。
(99mTc−EC−ホレートの化学および安定性)
単純であり、高速かつ高収率のホレートのアミノエチルアミドおよびECアナログ、MTXおよびTDXを開発した。これらのアナログの構造を、NMRおよび質量分光分析により確認した。EC−ホレートの99mTcでの放射性合成を、高い(>95%)放射化学的純度で達成した。99mTc−ECホレートは、イヌ血清サンプル中で、20分、1時間、2時間および4時間において安定であることが見出された。
体内分布研究により、20分〜4時間における腫瘍/血液計数密度比は、99mTc−EC−ホレートについて、徐々に増加し、一方、これらの値は、同じ時間における99mTc−ECについて減少することが示された(図4)。99mTC−EC−ホレートおよび99mTc−ECの%ID/g取込み値、腫瘍/血液比、および腫瘍/筋肉比を、それぞれ、表3および4に示した。
乳房腫瘍保有ラットにおける99mTc−EC−ホレートの体内分布
異なる時点において得られたシンチグラフィー画像は、99mTc−EC−葉酸を注射した群における腫瘍の可視化を示した。対照的に、99mTc−ECを注射した群においては、明らかな腫瘍取り込みが存在しなかった(図6)。両方の放射性トレーサーは、全ての画像における明らかな腎臓取込みを示した。99mTc−EC−葉酸の注射の1時間後に実施したオートラジオグラムは、腫瘍の活性を明らかに示した。
(2−(2−メチル−5−ニトロ−1Hイミダゾリル)エチルアミン(メトロニダゾルのアミノアナログMN−NH2)の合成)
メトロニダゾルのアミノアナログを、以前に記載された方法に従って合成した(Hayら、1994)。簡単に言えば、メトロニダゾルをメシル化アナログ(m.p.149〜150℃、報告値153〜154℃、TLC:酢酸エチル、Rf=0.45)に転換し、75%を得た。次いで、メシル化メトロニダゾルをアジ化ナトリウムと反応させて、アジドアナログ(TLC:酢酸エチル、Rf=0.52)を、収率80%で得た。このアジドアナログを、トリフェニルホスフィンによって還元し、そして所望のアミノアナログ(m.p.190〜192℃、報告値194〜195℃、TLC:酢酸エチル、Rf=0.15)を得た(60%)。ニンヒドリン(メタノール中2%)のスプレーは、MN−NH2のアミノ基の陽性を示した。構造を、1H−NMRおよび質量分析(FAB−MS)m/z 171(M+H,100)によって確認した。
水酸化ナトリウム(2N、0.2ml)を、水(5ml)中EC(134ma、0.50mmol)の攪拌溶液に添加した。この無色の溶液に、スルホ−NHS(217mg、1.0mmol)および1〜)C(192ma.1.0mmol)を添加した。次いで、MN−NH:二塩酸塩(340mg、2.0mmol)を添加した。この材料(mature)を室温で24時間攪拌した。この混合物を、500でのカットオフを有するSpectra/POR分子多孔質膜(Spectrum MedicalIndustries Inc.,Houston,TX)を使用して、48時間透析した。透析後、生成物を、凍結乾燥機(Labconco,Kansas City,MO)を使用してフリーズドライした。生成物の重量は、315mgであった(収率55%)。1H−NMR(D2O)δ2.93(s、6H、ニトロイミダゾール−CH 3)、2.60〜2.95(m,4HおよびECの−CH 2−SH)、3.30〜3.66(m、8H、ECのエチレンジアミンおよびニトロイミダゾール−CH2−CH 2−NH2)、3.70〜3.99(t、2H、ECのNH−CH−CO)、5.05(t、4H、メトロニダゾル−CH 2−CH2−NH2)、(s、2H、ニトロイミダゾールC=CH)。FAB MS m/z 572(M+,20)。EC−MNの合成スキームを、図7に示す。
2−ニトロイミダゾール(1g、8.34mmol)およびSc2CO3(2.9g,8.90mmol)を含むジメチルホルムアミド(DMF、50ml)中の攪拌溶液に、1,3−ジトシルプロパン(3.84g、9.99mmol)を添加した。この反応物を80℃で3時間加熱した。溶媒を減圧下でエバポレートし、そして残渣を酢酸エチル中に懸濁させた。固体を濾過し、溶媒を濃縮し、シリカゲルを充填したカラムに装填し、そして、ヘキサン:酢酸エチル(1:1)で溶出した。生成物である、3−トシルプロピル−(2−ニトロイミダゾール)を、m.p.108〜111℃で単離した(1.67g、収率57.5%)。1H−NMR(CDCl3)δ2.23(m、2H)、2.48(S、3H)、4.06(t、2H、J=5.7Hz)、4.52(t、2H、J=6.8Hz)、7.09(S、1H)、7.24(S、1H)、7.40(d、2H、J=8.2Hz)、7.77(d、2H、J=8.2Hz)。
水酸化ナトリウム(2N、0.6ml)を、EC(134ma、0.50mmol)の水(2ml)中の攪拌溶液に添加した。この無色の溶液に、スルホ−NHS(260.6mg、1.2mmol)、EDC(230ma、1.2mmol)および水酸化ナトリウム(2N、1ml)を添加した。次いでNIM−NH2塩酸塩(206.6mg、1.0mmol)を添加した。この混合物を室温で24時間攪拌した。この混合物を、500でのカットオフを有するSpectra/POR分子多孔質膜(Spectrum Medical Industries Inc.,Houston,TX)を使用して、48時間透析した。透析後、生成物を、凍結乾燥機(Labconco,Kansas City,MO)を使用してフリーズドライした。生成物の重量は、594.8mgであった(収率98%)。EC−NIMの合成スキームを、図8Aに示す。構造を、1H−NMR(D2O)によって確認する(図8B)。
99mTc−EC−MNおよび99mTc−EC−NIMの放射線合成を、必要量の過テクネチウム酸を、EC−MNまたはEC−NIMの凍結乾燥した残渣(3mg)、SnCl2(100μg)、Na2HPO4(13.5mg)、アスコルビン酸(0.5mg)およびNaEDTA(0.5mg)を含む自家製のキットに添加することによって、達成した。調製物の最終pHは、7.4であった。放射化学的純度を、それぞれアセトン(系A)および酢酸アンモニウム(水中1M):メタノール(4:1)(系B)で溶出するTLC(ITLAC SG、Gelman Sciences,Ann Arbor、MI)によって決定した。放射線TLC(Bioscan,Washington,DC)分析から、両方の放射線トレースに対して放射化学的純度は96%より高かった。
[F]フッ素を、小容量の銀標的において富化された18O−水のプロトン照射を使用するサイクロトロンによって、生成した。トシルMISO(Hayら、1994)(20mg)を、アセトニトリル(1.5ml)に溶解し、クリプトフィックス−フッ化物錯体に添加した。加熱後、加水分解およびカラム精製により、25〜40%の収率(崩壊を補正した)の純粋な生成物を、60分のボンバードメントの終了(EOB)において、単離した。HPLCを、C−18 ODS−20Tカラム(4.6×25mm)(Waters Corp.,Milford,Mass)において、水/アセトニトリル(80/20)を用いて、1ml/分の流速を使用して実施した。キャリアが添加されていない生成物は、類似の条件下での非標識FMISOの保持時間(6.12分)に対応した。放射化学的純度は、99%より高かった。UV検出器(310nm)のもとで、他の不純物は存在しなかった。決定した[18F]FMISOの比活性は、既知の質量および放射能のサンプルのUVおよび放射能検出に基づいて、1Ci/μmolであった。
標識された99mTc−EC−MNおよび99mTc−EC−NIMの安定性を、血清サンプルにおいて試験した。簡単に言えば、740KBqの1mgの99mTc−EC−MNおよび99mTc−EC−NIMを、イヌ血清(200μl)中37℃で4時間インキュベートした。これらの血清サンプルを、水中50%メタノールで希釈し、そして放射線TLCを、上記のように、0.5時間、2時間および4時間において繰り返した。
雌性Fischer344ラット(150±25g)(Harlan Sprague−Dawley,Indianapolis,IN)に、13762腫瘍細胞株懸濁液(106細胞/ラット、Fischerラットに対して特異的な腫瘍細胞株)由来の0.1mlの哺乳動物腫瘍細胞を、25ゲージの針を使用して後肢に皮下接種した。研究を、移植の14〜17日後に、腫瘍がおおよそ1cmの直径に達したときに実施した。ラットをケタミン(10〜15mg/ラット、腹腔内)で麻酔し、その後、それぞれの手順を行った。
低エネルギーの平行穴コリメータを備えるγ線カメラ(Siemens Medical Systems,Inc.,Hoffman Estates,IL)を使用するシンチグラフィー画像を、18.5MBqの各放射線トレーサーの静脈内注射の0.5時間後、2時間後および4時間後に得た。
腫瘍の低酸素症を確認するために、腫瘍内のpO2測定を、エッペンドルフコンピュータ化ヒストグラムシステムを使用して、実施した。2〜3の直線軌道の各々に沿った、20〜25のpO2測定を各腫瘍において0.4mmの間隔で実施した(合計40〜75の測定)。腫瘍pO測定を、3匹の腫瘍保有ラットにおいて実施した。オンラインコンピュータシステムを使用して、各軌道のポット測定を、この軌道に沿った測定点の位置に対して絶対的な値として表現し、そして2.5mmのクラス幅の0mmHgと100mmHgとの間のpO2ヒストグラムの相対頻度として、表した。
(99mTc−EC−MNおよび99mTc−EC−NIMの放射線合成および安定性)
EC−MNおよびEC−NIMの、99mTcでの放射線合成を、高い放射化学的純度(95%より高い)で達成し、放射化学的収率は100%であった。99mTc−EC−MNおよび99mTc−EC−NIM(図13)は、イヌ血清サンプルにおいて、0.5時間、2時間および4時間安定であることが見出された。分解生成物は、観察されなかった。MISOの放射性フッ素化および放射性ヨウ素化は、同じ前駆体を使用して、容易に達成された。両方の標識されたMISOアナログにおいて、放射化学的純度は、99%より高かった。
99mTc−EC−MNおよび99mTc−ECの、腫瘍保有ラットにおける組織分布を、表4および5に示す。イオン性99mTcに対する高い親和性に起因して、有意な一貫した甲状腺取り込みは存在せず、インビボでの99mTc−EC−MNの安定性を示唆する(表5)。
異なる時点において得られたシンチグラフィー画像は、99mTc−EC−MNおよび99mTc−EC−NIM群における腫瘍の可視化を示した。対照的に、99mTc−ECを注射した群においては、明らかな腫瘍の取り込みが存在しなかった(図11)。99mTc−EC−MNの注射の1時間後に実施したオートラジオグラムは、明らかに、腫瘍活性を示した(図12)。99mTc−EC−NMと比較して、99mTc−EC−NIMは、より高い腫瘍対バックグラウンドの比に起因して、より良好なシンチグラフィー画像を提供するようであった。乳房腫瘍保有ラットにおいて、腫瘍の取り込みは、99mTc−ECと比較して、99mTc−EC−NIM群において顕著に高かった(図14A)。1グラムの腫瘍の重量あたりの99mTc−EC−NIMの注射用量の百分率から得たれたデータは、コントロール群と比較した場合に、パクリタキセルで処置したラットにおいて、25%が取り込みを低下したことを示した(図14B)。
腫瘍の腫瘍内PO2測定は、腫瘍の酸素圧力が、正常筋肉の35±10mmHgと比較して、4.6±4.1mmHgの範囲であることを示した。このデータは、腫瘍が低酸素症であることを示す。
(エチレンジシステイン−ペンタグルタミン酸(EC−GAP)の合成)
水酸化ナトリウム(1N,1ml)を、水(10ml)中のEC(200mg、0.75mmol)の撹拌溶液に添加した。この無色溶液に、スルホNHS(162mg、0.75mmol)およびEDC(143mg、0.75mmol)を添加した。次いでペンタグルタミン酸ナトリウム塩(M.W.750〜1500、Sigma Chemical Company)(500mg、0.67mmol)を添加した。混合物を24時間室温で撹拌した。混合物を、500のカットオフを有するSpectra/POR分子多孔膜(Spectrum Medical Industries Inc.,Houston,TX)を使用して48時間透析した。透析後、生成物を、凍結乾燥機(Labconco,Kansas City,MO)を使用して凍結乾燥した。塩形態の生成物は、0.95gの重さであった。EC−GAPの合成スキームは、図16に示す。
99mTcでのEC−GAPの放射性標識を、以前に記載されたのと同じ手順を使用して達成した。放射化学純度は、100%であった。99mTc−EC−GAPの安定性を、血清サンプル中で試験した。手短にいうと、740KBqの1mg99mTc−EC−GAPを、37℃で4時間、イヌ血清(200μl)中でインキュベートした。血清サンプルを、水中50%メタノールで希釈し、そして放射性TLCを、上記のように、0.5時間、2時間、および4時間で繰り返した。
低エネルギーの、平行な穴のコリメータを備えたγカメラを使用して、シンチグラフィー画像を、18.5MBqの各放射性トレーサーの静脈内注射の0.5時間、2時間および4時間後に得た。
(99mTc−EC−GAPの安定性アッセイ)
99mTc−EC−GAPは、イヌ血清サンプル中で、0.5時間、2時間および4時間で安定であることが見出された。分解産物は、観察されなかった。
異なる時点で得られたシンチグラフィー画像は、99mTc−EC−GAP群において腫瘍の可視化を示した。最適な取り込みは、投与後30分〜1時間である(図17)。
(エチレンジシステイン−アネキシンV(EC−ANNEX)の合成)
炭酸水素ナトリウム(1N、1ml)を、EC(5mg、0.019mmol)の撹拌溶液に添加した。この無色溶液に、スルホNHS(4mg、0.019mmol)およびEDC(4mg、0.019mmol)を添加した。次いでアネキシンV(M.W.33kD、ヒト、Sigma Chemical Company)(0.3mg)を添加した。混合物を24時間室温で撹拌した。混合物を、10,000のカットオフを有するSpectra/POR分子多孔膜(Spectrum Medical Industries Inc.,Houston,TX)を使用して48時間透析した。透析後、生成物を、凍結乾燥機(Labconco,Kansas City,MO)を使用して凍結乾燥した。塩形態の生成物は、12mgの重さであった。
99mTcでのEC−ANNEXの放射性標識を、EC−GAPにおいて記載されたのと同じ手順を使用して達成した。放射化学純度は、100%であった。標識した99mTc−EC−ANNEXの安定性を、血清サンプル中で試験した。手短にいうと、740KBqの1mg99mTc−EC−ANNEXを、37℃で4時間、イヌ血清(200μl)中でインキュベートした。血清サンプルを、水中50%メタノールで希釈し、そして放射性TLCを、上記のように、0.5時間、2時間、および4時間で繰り返した。
低エネルギーの、平行な穴のコリメータを備えたγカメラを使用して、シンチグラフィー画像を、18.5MBqの各放射性トレーサーの静脈内注射の0.5時間、2時間および4時間後に得た。使用した動物モデルは、乳房、卵巣および肉腫であった。乳房腫瘍および卵巣腫瘍を有する両方のラットは、高いアポトーシス性の細胞を過剰発現することが知られている。画像化研究を、腫瘍細胞接種後14日で行なった。腫瘍処置応答を確かめるために、画像化前のマウスを、パクリタキセル投与し(80mg/Kg、静脈内注射、14日目)、そして画像を18日目に取った。
(99mTc−EC−ANNEXの安定性アッセイ)
99mTc−EC−ANNEXは、イヌ血清サンプル中で、0.5時間、2時間および4時間で安定であることが見出された。分解産物は、観察されなかった。
異なる時点で得られたシンチグラフィー画像は、99mTc−EC−ANNEX群において腫瘍の可視化を示した(図18〜20)。画像は、高度にアポトーシス性の細胞が、より多くの99mTc−EC−ANNEXの取り込みを有することを示した。高いアポトーシス(卵巣腫瘍保有)群(図19Aおよび図19B)および低アポトーシス(肉腫腫瘍保有)群(図20Aおよび図20B)におけるパクリタキセル処理前とパクリタキセル処理後との間に、腫瘍取り込みの顕著な差異は、存在しなかった。
((コルヒチンのアミノアナログ、COL−NH2)の合成)
コルヒチンの脱メチル化アミノアナログおよび脱メチル化ヒドロキシアナログを以前に記載された方法(Orrら、1995)に従って合成した。手短にいうと、コルヒチン(4g)を、25%硫酸を含む100mlの水中に溶解した。反応混合物を、100℃で5時間加熱した。混合物を、炭酸ナトリウムを用いて中和した。生成物をろ過し、そして、凍結乾燥機で乾燥し、2.4g(70%)の所望のアミノアナログ(融点153〜155℃、155〜157℃と報告されている)を生じた。ニンヒドリン(メタノール中2%)噴霧は、COL−NH2のアミノ基の陽性を示した。構造を、1H−NMRおよび質量分析法(FAB−MS)によって確かめた。
水酸化ナトリウム(2N,0.2ml)を、水(5ml)中のEC(134mg、0.50mmol)の撹拌溶液に添加した。この無色溶液に、スルホNHS(217mg、1.0mmol)およびEDC(192mg、1.0mmol)を添加した。次いでCOL−NH2(340mg、2.0mmol)を添加した。混合物を24時間室温で撹拌した。混合物を、500のカットオフを有するSpectra/POR分子多孔膜(Spectrum Medical Industries Inc.,Houston,TX)を使用して48時間透析した。透析後、生成物を、凍結乾燥機(Labconco,Kansas City,MO)を使用して凍結乾燥した。塩形態の生成物は、315mgの重さであった(収率55%)。
99mTc−EC−COLの放射性合成を、EC−COLの凍結乾燥残渣(5mg)、SnCl2(100μg)、Na2HPO4(13.5mg)、アスコルビン酸(0.5mg)およびNaEDTA(0.5mg)を含む自家製キットへ必要な量の99mTc−過テクネチウム酸を添加することによって達成した。調製物の最終pHは、7.4であった。99mTc−ECはまた、pH10で、ECの凍結乾燥残渣(5mg)、SnCl2(100μg)、Na2HPO4(13.5mg)、アスコルビン酸(0.5mg)およびNaEDTA(0.5mg)を含む自家製キットを使用することによって得た。次いで、調製物の最終pHを7.4に調整した。放射化学純度を、酢酸アンモニウム(水中1M):メタノール(4:1)を用いて溶出するTLC(ITLC SG,Gelman Sciences,Ann Arbor,MI)によって決定した。放射線−薄層クロマトグラフィー(TLC,Bioscan,Washington,DC)を使用して、両方の放射線トレーサについての放射化学純度を分析した。
標識された99mTc−EC−COLの安定性を、血清サンプル中で試験した。手短にいうと、740KBqの5mg99mTc−EC−COLを、37℃で4時間、ウサギ(rabbinate)血清(500μl)中でインキュベートした。血清サンプルを、水中50%メタノールで希釈し、そして放射性TLCを、上記のように、0.5時間、2時間、および4時間で繰り返した。
雌性Fischer344ラット(150±25g)(Harlan Sprague−Dawley,Indianapolis,IN)を、25ゲージ針を使用して後肢に、13762腫瘍細胞株懸濁液(10細胞/ラット、Fischerラットに特異的な腫瘍細胞株)由来の0.1mlの乳房腫瘍細胞で皮下接種した。研究を、腫瘍が直径約1cmに達した、移植後14〜17日で行なった。ラットを、各手順の前に、ケタミン(10〜15mg/ラット、腹腔内)で麻酔した。
低エネルギーの、平行な穴のコリメータを備えたγカメラ(Siemens Medical Systems,Inc.,Hoffman Estates,IL)を使用して、シンチグラフィー画像を、300μCiの99mTc−EC−COLおよび99mTc−ECの静脈内注射の0.5時間、2時間および4時間後に得た。コンピューターで概略した目的の領域(ROI)を使用して、腫瘍取り込み対正常筋肉取り込みを定量する(1画素当りのカウント)。
(99mTc−EC−COLの放射性合成および安定性)
99mTcでのEC−COLの放射性合成を、高い(>95%)放射化学的純度で達成した(図21)。99mTc−EC−COLは、は、ウサギ血清サンプル中で、0.5時間、2時間および4時間で安定であることが見出された。分解産物は、観察されなかった(図22)。
乳房腫瘍保有ラットにおける99mTc−EC−COLおよび99mTc−ECのインビボ体内分布を、表4および6に示す。0.5時間、2時間および4時間における99mTc−EC−COLの腫瘍取り込み値(%ID/g)は、0.436±0.089、0.395±0.154および0.221±0.006であったが(表6)、99mTc−ECについての体内分布は、それぞれ0.342±0.163、0.115±0.002および0.097±0.005であった(表4)。時間の関数としての増加した腫瘍対血液比(0.52±0.12から0.72±0.07)および腫瘍対筋肉比(3.47±0.40から7.97±0.93)は、99mTc−EC−COL群において観察された(図23)。逆に、腫瘍対血液値および腫瘍対筋肉値は、同じ期間における99mTc−EC−COL群と比較した場合、99mTc−ECでの時間依存性の減少を示した(図24)。
投与後1時間での3匹の乳房腫瘍保有ラットにおけるインビトロ画像化研究は、腫瘍が99mTc−EC−COL群で十分に可視化され得ることを示したが(図25)、99mTc−EC群においてより少ない腫瘍取り込みが観察された(図26)。コンピューターで概略した目的の領域(ROI)は、99mTc−EC−COL群における腫瘍/バックグラウンド比が、99mTc−EC群よりも有意に高いことを示した(図27)。
(実施例6:99mTc−EC−ネオマイシンの開発)
(ECの合成)
ECを、以前に記載された方法(RatnerおよびClarke,1937;Blondeauら、1967)に従って、2工程合成で調製した。前駆体(L−チアゾリジン−4−カルボン酸)を合成した(融点195°、196〜197°と報告されている)。次いでECを調製した(融点237°、251〜253°と報告されている)。構造を、1H−NMRおよび高速原子衝撃質量分析(FAB−MS)によって確認した。
水酸化ナトリウム(2N、0.2ml)を、水中(5ml)のEC(134mg、0.50mmol)の攪拌した溶液に添加した。この無色の溶液に、スルホ−NHS(217mg、1.0mmol)およびEDC(192mg、1.0mmol)を添加した。次いで、ネオマイシントリスルフェート塩(909mg、1.0mmol)を添加した。この混合物を、室温にて24時間攪拌した。この混合物を、500のカットオフ値を有するSpectra/POR分子多孔性膜(Spectrum Medical Industries Inc.,Houston,TX)を使用して48時間透析した。透析後、生成物を、凍結乾燥器(Labconco,Kansas City,MO)を使用して凍結乾燥した。生成物の重量は、720mg(収率83%)であった。EC−ネオマイシンの合成スキームを図36に示す。この構造を、1H−NMR(図38A〜B)、質量分析計(図39A〜B)および元素分析(Galbraith Laboratories,Inc,Knoxville,TN)によって確かめる。元素分析C39H75N10S4O19・15H2O(C、H、N、S)、計算値 C:33.77、H:7.58、N:10.11、S:9.23;実測値 C:32.44、H:5.90、N:10.47、S:10.58.EC−ネオマイシンのUV波長は、ECおよびネオマイシンと比較した場合に、270.5nmシフトした(図40A〜C)。
99mTc−ECおよび99mTc−EC−ネオマイシンの放射合成(radiosynthesis)を、ECまたはEC−ネオマイシンの凍結乾燥化残渣(10mg)、SnCl2(100μg)、Na2HPO4(13.5mg)およびアスコルビン酸(0.5mg)を含む手製のキットに、必要量の99mTc−パラテクネテート(pertechnetate)を添加することによって達成した。次いで、0.1ml水中のNaEDTA(0.5mg)を添加した。調製物の最終pHは、7.4であった。放射化学的純度を、酢酸アンモニウム(水中1M):メタノール(4:1)で溶出されるTLC(ITLC SG,Gelman Sciences,Ann Arbor,MI)によって決定した。放射TLC(Bioscan,Washington,DC)分析(図41)およびHPLC分析(図42〜45)から、放射化学的純度は、両方の放射性トレーサーについて95%を超えた。
標識した99mTc−ECおよび99mTc−EC−ネオマイシンの安定性を、イヌ血清サンプル中で試験した。手短に言うと、740KBqの1mgの99mTc−ECおよび99mTc−EC−ネオマイシンを、イヌ血清中(200μl)で37℃にて4時間インキュベートした。この血清サンプルを、水中の50%メタノールで希釈し、そして放射−TLCを、上記のように0.5時間、2時間および4時間で繰り返した。
雌性Fishcer 344ラット(150±25g)(Harlan Sprague−Dawley,Indianapolis,IN)に、25ゲージ針を用いて、13762腫瘍細胞株懸濁液由来の0.1mlの乳房腫瘍細胞(106細胞/ラット、Fischerラットに特異的な腫瘍細胞株)を後脚に皮下接種した。腫瘍が約1cm直径に到達する移植後14〜17日に、研究を行った。ラットを、各手順の前にケタミン(10〜15mg/ラット、腹腔内)で麻酔した。
低エネルギーの平行穴コリメーターを備えたγカメラ(Simens Medical Systems,Inc.,Hoffman Estates,IL)を使用して、シンチグラフィー画像を、100μCiの各放射トレーサーの静脈内注射後0.5時間、2時間および4時間で得た。99mTc−ECと比較して、腫瘍中の高い取り込みが観察された(図37A)。予備的な臨床画像化研究を、乳癌を有する患者において行った。腫瘍は、99mTc−EC−ネオマイシンの投与後2時間で十分に可視化された(図37B)。
(乳房腫瘍保有ラットにおける99mTc−EC−ネオマイシンの体内分布)
(乳房腫瘍保有ラットにおける99mTcパーテクネテートの体内分布)
99mTc−EC−薬物結合体の細胞取り込みを評価するために、80,000個の細胞(A549肺癌細胞株)を含む各ウェルに、2μCiの99mTc−EC−ネオマイシンおよび18F−FDGを添加した。インキュベーション後0.5〜4時間で、細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水で3回洗浄し、次いで、トリプシンによって細胞を死なせた。次いで、細胞を、γカウンターによって計数した。99mTc−EC−ネオマイシンは、ヒト肺癌細胞株中で試験した薬剤中で最も高い取り込みを示した(図46)。
ネオマイシンは、グルコース吸収に影響を及ぼすことが知られている(Rogersら、1968;Fanciulliら、1994)。先の実験は、99mTc−EC−ネオマイシンが、ヒト肺癌細胞株(A549)中で18F−FDGよりも高い取り込みを有することを示した。99mTc−EC−ネオマイシンの取り込みがグルコース関連機構を介して媒介されるか否かを決定するために、グルコース(0.1mg〜2.0mg)を、50,000個の(乳房)細胞または80,000個の(肺)細胞のいずれかを含有する各ウェルに、2μCiの99mTc−EC−ネオマイシンおよび18F−FDGと共に添加した。インキュベーション後、細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水で3回洗浄し、次いで、トリプシンによって細胞を死なせた。次いで、細胞を、γカウンターによって計数した。
(EC−デオキシグルコース(EC−DC)の合成)
水酸化ナトリウム(1N、1ml)を、水中(5ml)のEC(110mg、0.41mmol)の攪拌した溶液に添加した。この無色の溶液に、スルホ−NHS(241.6mg、1.12mmol)およびEDC(218.8mg、1.15mmol)を添加した。次いで、D−グルコサミン塩酸塩(356.8mg、1.65mmol)を添加した。この混合物を、室温にて24時間攪拌した。この混合物を、500のカットオフ値を有するSpectra/POR分子多孔性膜(Spectrum Medical Industries Inc.,Houston,TX)を使用して48時間透析した。透析後、生成物を、凍結乾燥器(Labconco,Kansas City,MO)を使用して凍結乾燥した。塩形態の生成物の重量は、568.8mgであった。この合成スキームを図59に示す。この構造を、質量分析計(図60)およびプロトンNMR(図61および62)で確かめた。99mTc−EC−DCの放射化学的純度は、放射−TLC(図63)およびHPLC(図64および65)分析によって決定した場合100%であった。
EC−DGがグルコースリン酸化を模倣するか否かを決定するために、ヘキソキナーゼアッセイを行った。既製のキット(Sigma Chemical Company)を使用して、EC−DG、グルコサミンおよびグルコース(標準)を、UV波長340nmでアッセイした。グルコース、EC−DGおよびグルコサミンは、陽性ヘキソキナーゼアッセイを示した(図66〜68)。
インビトロ細胞取り込みアッセイを、ヒト肺癌細胞株(A549)を使用することによって行った。2μCiの99mTc−EC−DGおよび18F−FDGを、各80,000個の細胞を含有するウェルに添加した。インキュベーション後0.5〜4時間で、細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水で3回洗浄し、次いで、トリプシンによって細胞を死なせた。次いで、細胞を、γカウンターによって計数した。99mTc−EC−DGの取り込みは、FDGに匹敵した(図69)。
99mTc−EC−デオキシグルコースの取り込みがd−グルコース関連機構を介して媒介されるか否かを評価するために、d−グルコースおよびl−グルコース(1mgおよび2.0mg)を、乳癌細胞または肺癌細胞(50,000個/0.5ml/ウェル)のいずれかを含有する各ウェルに、2μCiの99mTc−EC−デオキシグルコースおよび18F−FDGと共に添加した。2時間のインキュベーション後、細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水で3回洗浄し、次いで、トリプシンによって細胞を死なせた。細胞を、γカウンターによって計数した。
先の実験は、99mTc−EC−デオキシグルコースの細胞取り込みが、FDGに類似することを示した。例えば、ヘキソキナーゼアッセイ(グルコースリン酸化)は、陽性であった。99mTc−EC−デオキシグルコースの取り込みは、d−グルコース機構を介して媒介される。この研究は、血中グルコースレベルがFDGまたはEC−デオキシグルコースのいずれかによって誘導され得、そしてインスリンによって抑制され得るか否かを決定することである。
乳房腫瘍保有動物モデルについて、雌性Fishcer 344ラット(150±25g)(Harlan Sprague−Dawley,Indianapolis,IN)に、25ゲージ針を用いて、13762腫瘍細胞株懸濁液由来の0.1mlの乳房腫瘍細胞(106細胞/ラット、Fischerラットに特異的な腫瘍細胞株)を後脚に皮下接種した。腫瘍が約1cm直径に到達する移植後14〜17日に、研究を行った。ラットを、各手順の前にケタミン(10〜15mg/ラット、腹腔内)で麻酔した。
低エネルギーの平行穴コリメーターを備えたγカメラを使用して、シンチグラフィー画像を、100μCiの放射トレーサーの静脈内注射後0.5時間、2時間および4時間で得た。使用した動物モデルは、乳房腫瘍保有ラットであった。99mTc−EC(コントロール群)と比較した場合、腫瘍は十分に可視化され得た(図81)。予備的な臨床画像化研究を、5人の患者(3人の脳腫瘍および2人肺疾患患者)において行った。画像を、投与後1〜2時間で得た。99mTc−EC−DGは、良性腫瘍を悪性腫瘍に対して区別し得た。例えば、悪性星状細胞腫は、高い取り込みを示した(図82A,82B、83Aおよび83B)。良性髄膜腫は、悪性髄膜腫と比較して乏しい取り込みを示した(図84AおよびB)。乏しい取り込みは、TBを有する患者において観察されたが(図85Aおよび図85B)、高い取り込みが、肺腫瘍において観察された(図86A,図86B、および図86C)。
以下の参考文献は、これらが本明細書中に記載されるものに対して補助的な、例示的手順または他の詳細を提供する程度まで、本明細書中に参考として詳細に援用される。
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