PL212211B1 - Kompozycja do wytwarzania scyntygraficznego środka obrazującego, kompozycja do obrazowania scyntograficznego, sposób syntezy znakowanego radionuklidem koniugatu etylenodicysteiny z ligandem naprowadzającym do obrazowania, zastosowanie kompozycji zawierającej znakowany radionklidem konigat etylenodiscysteiny z ligandem naprowadzającym do wytwarzania środków farmaceutycznych do obrazowania nowotworu albo miejsca infekcji oraz zestaw do wytwarzania preparatów radiofarmaceutycznych - Google Patents

Description

Dziedzina wynalazku

Wynalazek dotyczy ogólnie dziedzin znakowania, radioobrazowania i syntezy chemicznej. W szczególności, dotyczy on strategii radioznakowania ligandów docelowych, a ponadto dotyczy sposobów stosowania tych radioznakowanych ligandów do obrazowania nowotworów oraz do obrazowania chorób tkankowo-specyficznych.

Stan techniki

Postęp w scyntygraficznym obrazowaniu nowotworów jest w znacznym stopniu wyznaczony przez powstawanie radiofarmaceutyków o zwiększonej specyficzności w stosunku do tkanki nowotworowej. Radioznakowane (znakowane radioizotopami) Iigandy oraz radioznakowane przeciwciała, dzięki ich większej specyficzności, rozpoczęły nową erę w scyntygraficznym wykrywaniu nowotworów i były przedmiotem szeroko zakrojonych badań oraz były wprowadzone do praktyki preklinicznej (Mathias et al., 1996, 1997a, 1997b). Sposoby postępowania oparte na obrazowaniu z wykorzystaniem radionuklidów (emisyjna tomografia pozytronowa, PET; obliczeniowa tomografia emisyjna pojedynczego fotonu, SPECT) są przekrojowymi, diagnostycznymi technikami obrazującymi, które ukazują mapę lokalizacji i stężenia radioznaczników oznakowanych radionuklidami. Chociaż techniki CT (tomografia komputerowa) i MRI (obrazowanie za pomocą rezonansu jądrowego) dostarczają znaczną ilość informacji anatomicznych co do lokalizacji i rozmiarów nowotworów, jednakże za pomocą tych sposobów nie można adekwatnie odróżnić inwazyjnych uszkodzeń chorobowych od obrzęku, martwicy radiacyjnej, gradingu albo glejozy. PET i SPECT mogą być stosowane do lokalizowania i charakteryzowania nowotworów na drodze pomiaru aktywności metabolicznej.

Rozwój środków wywołujących niedotlenienie tkanek nowotworowych (hipoksję) jest w praktyce klinicznej potrzebny do detekcji zmian pierwotnych i przerzutowych, jak również do przewidywania wrażliwości na promieniowanie oraz czasu nawrotu. Żaden ze współczesnych sposobów obrazowania nie mierzy dokładnie hipoksji gdyż diagnozowanie hipoksji nowotworu wymaga badania patologicznego. Często trudno jest przewidzieć wyniki terapii nowotworu hipoksyjnego bez znajomości przynajmniej poziomu podstawowego hipoksji dla każdego z leczonych nowotworów. Chociaż tlenowa polarograficzna mikroelektroda Eppendorfa może być użyta do pomiaru parcjalnego ciśnienia tlenu w nowotworze, technika ta jest inwazyjna i wymaga sprawnego operatora. Technika ta może być stosowana jedynie w przypadku nowotworów dostępnych (np. głowy i szyi, szyjki macicy), a ponadto konieczne są wielokrotne odczyty. Dlatego też dokładna i łatwa metoda pomiaru hipoksji nowotworu będzie użyteczna do selekcji pacjentów. Jednakże ilorazy wychwytu przez tkankę nowotworową i zdrową różnią się od siebie w zależności od zastosowanego radiofarmaceutyku. Dlatego też, w przypadkach kiedy nowe radiofarmaceutyki wprowadzane są do praktyki klinicznej byłoby racjonalnym, aby korelować iloraz wychwytu przez tkankę nowotworową i normalną ze standardowym pomiarem hipoksji za pomocą elektrody Eppendorfa.

[¹⁸F]FMISO jest stosowany w diagnozowaniu nowotworów głowy i szyi, zawału serca, stanów zapalnych i niedokrwienia mózgu (Martin et al., 1992; Yeh et al., 1994; Yeh et al., 1996; Liu et al., 1994). Iloraz wychwytu przez tkankę nowotworową do normalnej był stosowany jako wskaźnik poziomu podstawowego przy ocenie hipoksji nowotworów (Yeh et al., 1996). Chociaż hipoksja nowotworów przy użyciu [¹⁸F]FMISO została jasno udokumentowana, wprowadzenie nowych środków obrazujących do praktyki klinicznej zależy od niektórych innych czynników, takich jak łatwość osiągania czy koszt izotopów. Chociaż metaboliczne obrazowanie nowotworów z zastosowaniem [¹⁸F]FDG zostało jasno udokumentowane, wprowadzenie molekularnych środków obrazujących do praktyki klinicznej zależy od niektórych innych czynników takich jak łatwa osiągalność czy koszt izotopu. [¹⁸F]fluorodeoksyglukoza (FDG) jest stosowana do diagnozowania nowotworów, zawału serca i chorób neurologicznych. Dodatkowo, radiosynteza PET musi być szybka z uwagi na krótkie okresy półtrwania izotopów emitujących pozytrony. Chemia fluoru ¹⁸F jest również skomplikowana. Chemia fluoru ¹⁸F nie jest powtarzalna dla różnych cząsteczek. Tak więc idealnie byłoby wytworzyć środek chelatujący, który mógłby sprzęgać się z różnymi lekami. Korzystnym izotopem byłby ^99mTc z uwagi na niski koszt (0.21 USD/mCi, w porównaniu z 50 USD/mCi w przypadku ¹⁸F) i z uwagi na małą energię (140 KeV, w porównaniu z 571 KeV w przypadku ¹⁸F). ^99mTc uzyskuje się łatwo z generatora ⁹⁹Mo. ^99mTc jest korzystny w znakowaniu radiofarmaceutyków z uwagi na korzystną charakterystykę fizyczną oraz wyjątkowo niska cenę.

PL 212 211 B1

Znana jest pewna liczba związków znakowanych ^99mTc z zastosowaniem chelatów azotowych i siarkowych (Blondeau et al., 1967; Davison et al., 1980). Wiadomo, że czterokleszczowe Iigandy bis-aminoetanotiolu, zwane również związkami diaminoditiolowymi, tworzą bardzo trwałe kompleksy Tc(V)O, co wynika z silnego wiązania grupy oksotechnetiowej z dwoma atomami siarki tiolowej i dwoma atomami azotu aminowego. ^99mTc-L,L-etylenodicysteina (^99mTe-LQ) jest jednym z nowszych i kojarzonych z sukcesem przykładów chelatów N2S2. EC może być znakowana za pomocą ^99mTe łatwo i wydajnie, prowadząc do chelatów o wysokiej czystością radiochemiczną i dużej trwałości, a ponadto jest wydalana poprzez kanaliki nerkowe, w transporcie aktywnym (Surma et al., 1994; Van Nerom et al, 1990, 1993; Verbruggen et al, 1990, 1992). W innych zastosowaniach, EC może być chelatowana galem-68 (emiter pozytronów, t1/2=68 min) w celach PET, albo też gadolinem, żelazem albo magnezem w celach obrazowania w magnetycznym rezonansie (MRI). Wytworzono także ^99mTc-EC-neomycynę oraz ^99mTc-EC deoksyglukozę, które oceniono pod kątem potencjalnych zastosowań do charakterystyki nowotworów.

Istota wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja do wytwarzania scyntygraficznego środka obrazującego zawierająca etylenodicysteinę skoniugowaną z Iigandem naprowadzającym, charakteryzująca się tym, że Iigandem naprowadzającym jest środek naśladujący glukozę wybrany spośród dezoksyglukozy, glukozy, glukozaminy, neomycyny, kanamycyny, gentamycyny, paromycyny, amikacyny, tobramycyny, netilmycyny, rybostamycyny, sysomycyny, mikromycyny, liwidomycyny, dibekacyny, isepamycyny i astromycyny.

W jednym z korzystnych wariantów kompozycji według wynalazku Iigand naprowadzający może być skoniugowany z etylenodicysteiną poprzez jedno albo poprzez obydwa ugrupowania kwasowe etylenodicysteiny. W innym korzystnym wariancie kompozycja według wynalazku zawiera ponadto łącznik sprzęgający etylenodicysteinę z Iigandem naprowadzającym. W szczególnie korzystnym przypadku łącznik ten jest rozpuszczalnym w wodzie peptydem, aminokwasem, poli(aminokwasem), kwasem glutaminowym, poli(kwasem glutaminowym), kwasem asparaginowym, poli(kwasem asparaginowym), octanem bromoetylu, etylenodiaminą albo lizyną.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja do obrazowania scyntygraficznego zawierająca etylenodicysteinę skoniugowaną z Iigandem naprowadzającym, cechująca się tym, że zawiera ponadto znacznik radionuklidowy, przy czym etylenodicysteina tworzy chelat N2S2 z tym znacznikiem radionuklidowym, zaś Iigandem naprowadzającym jest środek naśladujący glukozę wybrany spośród dezoksyglukozy, glukozy, glukozaminy, neomycyny, kanamycyny, gentamycyny, paromycyny, amikacyny, tobramycyny, netilmycyny, rybostamycyny, sysomycyny, mikromycyny, liwidomycyny, dibekacyny, isepamycyny i astromycyny. W jednym z korzystnych wariantów tej kompozycji Iigand naprowadzający może być skoniugowany z etylenodicysteiną poprzez jedno albo poprzez obydwa ugrupowania kwasowe etylenodicysteiny. W innym korzystnym wariancie tej kompozycji radionuklidem jest ^99mT, ¹⁸⁸Re, ¹⁸⁶Re, ¹¹¹In, ¹⁸³Gd, ⁵⁹Fe,

W szczególnie korzystnym przypadku radionuklidem jest ^99mTc. W dalszym korzystnym wariancie re183

Sm, ¹⁶⁶Ho, ⁹⁰Y, ⁸⁹Sr, ⁶⁷Ga,

Ga, ²²⁵Ac, ²¹²Bi, ²¹¹At, ⁶⁴Cu albo ⁶²Cu.

alizacji ta kompozycja ma postać ^99mTc-EC-neomycyny. W innym korzystnym wariancie realizacji ta kompozycja ma postać ^99mTc-EC-dezoksyglukozy. W jeszcze innym korzystnym wariancie realizacji ta kompozycja ma postać ^99mTc-EC-gIukozaminy. W kolejnym korzystnym wariancie wspomniana kompozycja zawiera ponadto łącznik sprzęgający etylenodicysteinę z Iigandem naprowadzającym. W szczególnie korzystnym przypadku łącznik ten jest rozpuszczalnym w wodzie peptydem, aminokwasem, poli(aminokwasem), kwasem glutaminowym, poli(kwasem glutaminowym), kwasem asparaginowym, poli(kwasem asparaginowym), octanem bromoetylu, etylenodiaminą albo lizyną.

Ponadto, przedmiotem wynalazku jest sposób syntezy znakowanego radionuklidem koniugatu etylenodicysteiny z Iigandem naprowadzającym do obrazowania, w którym najpierw otrzymuje się Iigand naprowadzający stanowiący środek naśladujący glukozę wybrany spośród dezoksyglukozy, glukozy, glukozaminy, neomycyny, kanamycyny, gentamycyny, paromycyny, amikacyny, tobramycyny, netilmycyny, rybostamycyny, sysomycyny, mikromycyny, liwidomycyny, dibekacyny, isepamycyny i astromycyny, następnie miesza się ten Iigand naprowadzający z etylenodicysteiną do otrzymania koniugatu etylenodicysteiny z Iigandem naprowadzającym, po czym uzyskany koniugat etylenodicysteiny z Iigandem naprowadzającym miesza się z radionuklidem i z czynnikiem redukującym do utworzenia znakowanego radionuklidem koniugatu etylenodicysteiny z Iigandem naprowadzającym, przy czym etylenodicysteiną tworzy z radionuklidem chelat N2S2. W jednym z korzystnych wariantów reali4

PL 212 211 B1 zacji sposobu według wynalazku jako czynnik redukujący stosuje się jon ditioninowy S2O4²⁺, jon cynowy (II) Sn²⁺ lub jon żelazowy (II) Fe²⁺.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie kompozycji zawierającej znakowany radionuklidem koniugat etylenodicysteiny z Iigandem naprowadzającym do wytwarzania środków farmaceutycznych do obrazowania nowotworu albo miejsca infekcji, przy czym Iigand naprowadzający stanowiący środek naśladujący glukozę jest wybrany spośród dezoksyglukozy, glukozy, glukozaminy, neomycyny, kanamycyny, gentamycyny, paromycyny, amikacyny, tobramycyny, netilmycyny, rybostamycyny, sysomycyny, mikromycyny, liwidomycyny, dibekacyny, isepamycyny i astromycyny. W jednym z korzystnych wariantów realizacji zastosowania według wynalazku obszarem obrazowania jest nowotwór. W innym korzystnym wariancie realizacji zastosowania według wynalazku obszarem obrazowania jest obszar infekcji. W jeszcze innym korzystnym wariancie realizacji zastosowania według wynalazku obszarem obrazowania jest rak sutka, rak jajnika, rak prostaty, śluzówka macicy, serce, płuco, mózg, wątroba, rak folianowopozytywny, rak ER(+), śledziona, trzustka lub jelito. W kolejnym korzystnym wariancie realizacji zastosowania według wynalazku radionuklidem jest ^99mTc.

Dalszym przedmiotem wynalazku jest zestaw do wytwarzania preparatów radiofarmaceutycznych, obejmujący szczelnie zamknięty pojemnik, taki, jak torba, zawierający uprzednio wyznaczoną ilość kompozycji koniugatu etylenodicysteiny z Iigandem naprowadzającym oraz wystarczającą ilość czynnika redukującego do znakowania tego koniugatu za pomocą wybranego radionuklidu, przy czym Iigandem naprowadzającym jest środek naśladujący glukozę wybrany spośród dezoksyglukozy, glukozy, glukozaminy, neomycyny, kanamycyny, gentamycyny, paromycyny, amikacyny, tobramycyny, netilmycyny, rybostamycyny, sysomycyny, mikromycyny, liwidomycyny, dibekacyny, isepamycyny i astromycyny. W jednym z korzystnych wariantów zestawu według wynalazku radionuklidem jest ^99mTc. W innym korzystnym wariancie zestawu według wynalazku koniugat etylenodicysteiny z Iigandem naprowadzającym zawiera ponadto łącznik sprzęgający etylenodicysteinę z Iigandem naprowadzającym. W szczególnie korzystnym przypadku łącznikiem tym jest rozpuszczalny w wodzie peptyd, kwas glutaminowy, kwas poliglutaminowy, kwas asparaginowy, kwas poliasparaginowy, octan bromoetylu, etylenodiamina albo lizyna.

Poprzez wprowadzenie nowej strategii znakowania radioizotopami (radioznakowania) obecny wynalazek eliminuje niedobory w stanie techniki, zarówno te wymienione powyżej, jak i inne.

W kompozycji według wynalazku do obrazowania scyntygraficznego etylenodicysteiną tworzy chelat N2S2 ze znacznikiem radionuklidowym. Chelatowany związek zawiera wiązanie jonowe pomiędzy radionuklidem i związkiem chelatującym. Terminy „koniugat EC-Iigand naprowadzający, „pochodna EC oraz „koniugat EC-lek stosowane są w niniejszym opisie zamiennie i oznaczają nieznakowany związek etylenodicysteiny z Iigandem naprowadzającym. W niniejszym rozumieniu termin „koniugat dotyczy związku wiązanego kowalencyjnie.

Etylenodicysteina jest Iigandem czterokleszczowym, bis-aminoetanotiolowym (BAT). Takie Iigandy są również znane jako związki diaminoditiolowe (DADT). Wiadomo, że takie związki tworzą bardzo trwałe kompleksy Tc(V)O z uwagi na bardzo efektywne wiązanie grupy oksotechnetiowej z dwoma tiolowymi atomami siarki i z dwoma aminowymi atomami azotu. Znakowany technetem ^99mTc ester dietylowy (^99mTc-L,L-ECD) jest znany w badaniach mózgu. ^99mTc-L,L-etylenodicysteina (^99mTc-L,L-EC) jest jego najbardziej polarnym metabolitem i odkryto, że jest ona wydalana, szybko i sprawnie, z moczem. W związku z tym ^99mTc-L,L-EC była stosowana jako środek w badaniach funkcji nerek (Verbruggen et al., 1992).

Ligand naprowadzający, zwany również Iigandem tkankowo-specyficznym jest związkiem, który po wprowadzeniu do ciała ssaka albo pacjenta wiąże się ze specyficznym rodzajem tkanki. Jak wspomniano powyżej, w rozwiązaniu według niniejszego wynalazku Iigandem naprowadzającym jest środek naśladujący glukozę wybrany spośród dezoksyglukozy, glukozy, glukozaminy, neomycyny, kanamycyny, gentamycyny, paromycyny, amikacyny, tobramycyny, netilmycyny, rybostamycyny, sysomycyny, mikromycyny, liwidomycyny, dibekacyny, isepamycyny i astromycyny.

W niektórych kompozycjach według wynalazku konieczne jest wprowadzenie łącznika pomiędzy etylenodicysteiną a Iigandem naprowadzającym. Łącznik jest zazwyczaj stosowany w celu zwiększenia rozpuszczalności leku w roztworach wodnych, jak również w celu minimalizowania zmian w powinowactwie leków. O ile w zasadzie dowolny łącznik zwiększający rozpuszczalność kompozycji w wodzie jest dopuszczalny do stosowania według wynalazku, w praktyce najczęściej stosuje się poli(aminokwas), peptyd rozpuszczalny w wodzie albo pojedynczy aminokwas. Na przykład, kiedy grupą funkcyjną Iigandu naprowadzającego albo leku jest alifatyczna albo fenolowa grupa -OH, wtedy łączPL 212 211 B1 nikiem może być kwas poligIutaminowy (o masie cząsteczkowej od około 750 do około 15000), kwas poliasparaginowy (o masie cząsteczkowej od około 2000 do około 15000), octan bromoetylu, kwas glutaminowy albo kwas asparaginowy. W przypadku gdy grupą funkcyjną leku jest alifatyczna albo aromatyczna grupa -NH2 albo grupa peptydowa, wówczas łącznikiem może być kwas poligIutaminowy (o masie cząsteczkowej od około 750 do około 15000), kwas poliasparginowy (o masie cząsteczkowej od około 2000 do około 15000), kwas glutaminowy albo kwas asparginowy. Kiedy grupę funkcyjną leku stanowi ugrupowanie kwasu karboksylowego albo peptydu, wówczas łącznikiem może być etylenodiamina albo lizyna.

Niniejszy wynalazek znajduje zastosowanie w sposobie obrazowania rejonu w ciele ssaków. Sposób obrazowania obejmuje etapy: podania efektywnej, diagnostycznej ilości kompozycji zawierającej znakowany ^99mTc koniugat etylenodicysteina-ligand naprowadzający oraz detekcji sygnału radioaktywnego pochodzącego od ^99mTc zlokalizowanego w danym rejonie ciała. Etap detekcji typowo wykonuje się w czasie od około 10 minut do około 4 godzin po wprowadzeniu kompozycji do ciała ssaka. Najkorzystniej, etap detekcji wykonuje się około 1 godzinę po wykonaniu iniekcji kompozycji do ciała ssaka. Rejonem poddawanym obrazowaniu może być przy tym obszar infekcji, nowotwór, serce, płuco, mózg, wątroba, śledziona, trzustka, jelito albo dowolny inny organ. Nowotwór albo infekcja mogą być zlokalizowane w dowolnym miejscu ciała ssaka, ale najczęściej będą w sutku, jajniku, gruczole krokowym, endometrium, płucu, mózgu albo wątrobie. Rejon może być rakiem folanowo-pozytywnym albo estrogenowo-pozytywnym.

Zestaw według wynalazku zawiera wymienione wyżej składniki w szczelnym pojemniku taki, jak fiolka lub torba. Składniki zestawu mogą mieć dowolną odpowiednią formę, taką jak ciecz, forma zamrożona albo sucha. Korzystnie, składniki zestawu dostarczone są w formie liofilizowanej. Zestaw może też zawierać przeciwutleniacz i/albo pomocniczą substancje wychwytującą. Przeciwutleniaczem może być dowolny znany przeciwutleniacz ale korzystnie jest nim witamina C. Pomocnicze substancje wychwytujące również mogą być obecne w celu wiązania pozostałego, niezużytego radionuklidu. Większość handlowo dostępnych zestawów zawiera glukoheptonian jako pomocniczą substancję wychwytującą. Jednakże glukoheptonian nie reaguje całkowicie z typowymi składnikami zestawu, zostawiając około 10-15% pozostałości. Ten pozostały glukoheptonian trafia do tkanki nowotworowej i zniekształca wynik obrazowania. Dlatego też twórcy uważają za korzystne zastosowanie EDTA jako pomocniczej substancji wychwytującej, ponieważ EDTA jest tańszy i reaguje w większym stopniu.

Krótki opis rysunków

Rysunki przedstawione poniżej stanowią część obecnego opisu i są załączone w celu dodatkowego udokumentowania pewnych aspektów obecnego wynalazku. Wynalazek może być lepiej rozumiany poprzez odniesienie się do jednego albo większej liczby tych rysunków w kombinacji ze szczegółowym opisem specyficznych wariantów wynalazku tu prezentowanych.

Fig. 10. Badania biodystrybucji (ilorazy nowotwór/mięsień) dla ^99mTc-EC, [¹⁸F]FMISO i [¹³¹I]IMISO.

Fig. 24. Proporcje nowotwór/mięsień i nowotwór/krew w funkcji czasu dla ^99mTc-EC.

Fig. 26. Badania typu obrazowania in vivo z zastosowaniem ^99mTc-EC przeprowadzone na szczurach z nowotworem sutka.

Fig. 36. Schemat syntezy ^99mTc-EC-neomycyna.

Fig. 37A. Obraz scyntygraficzny szczurów z nowotworem sutka po podaniu ^99mTc-EC oraz ^mTc-EC-neomycyna (100 •Ci/szczura, dożylnie) wykazujący, że nowotwór można dobrze uwidocznić w okresie 0.5-4 godziny po iniekcji.

Fig. 37B. Scyntymammografia wykonana przy pomocy ^99mTc-EC-neomycyna (30 mCi, dożylnie) u pacjentki z nowotworem sutka. Obrazy uzyskano 2 godziny po iniekcji.

Fig. 38A. Widmo ¹H-NMR EC.

Fig. 38B. Widmo ¹H-NMR neomycyny.

Fig. 38C. Widmo ¹H-NMR związku EC-neomycyna.

Fig. 39A i Fig. 39B. Widmo spektrometrii masowej związku EC-neomycyna (M⁺ 1112.55).

Fig. 40A. Widmo UV EC.

Fig. 40B. Widmo UV neomycyny.

Fig. 40C. Widmo UV związku EC-neomycyna.

Fig. 41. Analiza radio-TLC koniugatu ^99mTc-EC-neomycyna.

Fig. 42. Analiza HPLC ^99mTc-EC-neomycyna (zastosowano detektor radioaktywności).

Fig. 43. Analiza HPLC ^99mTc-EC-neomycyna (zastosowano detekcję UV przy 254 nm).

Fig. 44. Analiza HPLC ¹⁸F-FDG (zastosowano detektor radioaktywności).

PL 212 211 B1

Fig. 45. Analiza HPLC ¹⁸F-FDG (zastosowano detekcję UV przy 254 nm).

Fig. 46. Oznaczenie in vitro wychwytu komórkowego dla serii koniugatów ^99mTc-EC-Iek w linii komórkowej raka płuc. Koniugat ^99mTc-EC-neomycyna wykazał największą wartość wychwytu spośród wszystkich analizowanych środków.

Fig. 47. Wpływ glukozy na komórkowy (A549) wychwyt koniugatu ^99mTc-EC-neomycyna oraz ¹⁸F-FDG.

Fig. 48A i Fig. 48B. Wpływ glukozy na komórkowy (H1299) wychwyt koniugatu ^99mTc-EC-neomycyna oraz ¹⁸F-FGD, przedstawiony jako procent wychwytu leku (Fig. 48A) oraz jako zmiana procentowa, w zależności od zawartości glukozy (fig. 48B).

Fig. 49. Schemat syntezy koniugatu ^99mTc-EC-GIukozamina.

Fig. 50. Oznaczenie heksokinazowe dla glukozy.

Fig. 51. Oznaczenie heksokinazowe dla glukozaminy.

Fig. 52. Oznaczenie heksokinazowe dla związku EC-glukozamina.

Fig. 53. Oznaczenie heksokinazowe dla EC-GAP-glukozamina.

Fig. 54. Schemat syntezy koniugatu ^99mTc-EC-GAP-glukozamina.

Fig. 55A, Fig. 55B, Fig. 55C. Oznaczenie in vitro wychwytu komórkowego ^99mTc-EC (Fig. 55A), ^99mTc-EC-deoksyglukoza-GAP (Fig. 55B), i ¹⁸F-FDG (Fig. 55C) dla linii komórkowej raka płuc (A549). ^99mTc-EC-DG wykazywał wychwyt podobny jak ¹⁸F-FDG.

Fig. 56. Ilorazy rozkładu gęstości zliczeń nowotwór/tkanka dla ^99mTc-EC-GAP u szczurów z nowotworem sutka.

Fig. 57. In vitro wychwyt komórkowy ¹⁸FDG przy różnych zawartościach glukozy w 2 godziny po iniekcji, dla linii komórkowej raka sutka (13762).

Fig. 58. In vitro wychwyt komórkowy koniugatu ^99mTc-EC-neomyeyna w myszach z nowotworem sutka.

Fig. 59. Schemat syntezy koniugatu ^99mTc-EC-deoksyglukoza.

Fig. 60. Spektrometria masowa związku EC-deoksyglukoza.

Fig. 61. Widmo ¹H-NMR związku EC-deoksyglukoza (EC-DG).

Fig. 62. Widmo ¹H-NMR glukozaminy.

Fig. 63. Analiza radio-TLC koniugatu ^99mTc-EC-DG.

Fig. 64. Analiza HPLC koniugatu ^99mTc-EC-deoksyglukoza i ^99mTc-EC (zastosowano detektor radioaktywności).

Fig. 65. Analiza HPLC koniugatu ^99mTc-EC-deoksyglukoza i ^99mTc-EC (zastosowano detektor radioaktywności, oznaczenie wykonano dla mieszaniny).

Fig. 66. Oznaczenie heksokinazowe dla glukozy.

Fig. 67. Oznaczenie heksokinazowe dla FDG.

Fig. 68. Oznaczenie heksokinazowe dla EC-DG.

Fig. 69. Oznaczenie in vitro wychwytu komórkowego koniugatu ^99mTc-EC-deoksyglukoza, ^99mTc-EC i ¹⁸F-FDG dla linii komórkowej raka płuc (A549). ^99mTc-EC-DG wykazywał wychwyt podobny jak ¹⁸F-FDG.

Fig. 70. Wpływ D- i L-glukozy na wychwyt ^99mTc-EC-DG w komórkach sutka (linia komórkowa 13762).

Fig. 71. Wpływ D- i L-glukozy na wychwyt ¹⁸F-FDG w komórkach sutka (linia komórkowa 13762).

Fig. 72. Wpływ D- i L-glukozy na wychwyt ¹⁸F-FDG w komórkach płucnych (linia komórkowa A549).

Fig. 73. Wpływ D- i L-glukozy na wychwyt ^99mTc-EC-DG w komórkach płucnych (linia komórkowa A549).

Fig. 74. Wpływ na poziom in vivo glukozy we krwi, indukowany glukozaminą i EC-DG (1.2 mmol/kg, dożylnie).

Fig. 75. Wpływ na poziom in vivo glukozy we krwi, indukowany FDG (1.2 i 1.9 mmol/kg, dożylnie) oraz insuliną.

Fig. 76. Ilorazy rozkładu gęstości zliczeń nowotwór/tkanka dla koniugatu ^99mTc-EC-deoksyglukoza u szczurów z nowotworem sutka.

Fig. 77. Biodystrybucja in vivo koniugatu ^99mTc-EC-deoksyglukoza u szczurów z nowotworem sutka.

Fig. 78. Wychwyt tkankowy in vivo koniugatu ^99mTc-EC-deoksyglukoza u myszy z nowotworem płuca.

PL 212 211 B1

Fig. 79. Wychwyt tkankowy in vivo koniugatu ^99mTc-EC-neomycyna u myszy z nowotworem płuca.

Fig. 80. Wychwyt tkankowy in vivo ¹⁸F-FDG u myszy z nowotworem płuca.

Fig. 81. Przekrojowy obraz szczurów z nowotworem sutka po podaniu ^99mTc-EC oraz ^99mTc-EC-deoksyglukoza (100 •Ci/szczur, dożylnie) wykazał, że nowotwór może być dobrze uwidoczniony w czasie 0.5-4 godzin po iniekcji.

Fig. 82A. MRI pacjenta z gwiaździakiem złośliwym.

Fig. 82B. SPECT wykonany przy użyciu ^99mTc-EC-DG u pacjenta z gwiaździakiem złośliwym.

Fig. 83A. MRI pacjenta z gwiaździakiem krwotocznym.

Fig. 83B. SPECT wykonany przy użyciu ^99mTc-EC-DG u pacjenta z gwiaździakiem złośliwym (krwotocznym ).

Fig. 84A. MRI pacjenta z oponiakiem łagodnym.

Fig. 84B. SPECT wykonany z pomocą koniugatu ^99mTc-EC-DG u pacjenta z łagodnym oponiakiem wykazał brak ogniskowo zintensyfikowanego wychwytu.

Fig. 85A. CT pacjenta zarażonego płucnym TB.

Fig. 85B. SPECT wykonany z pomocą koniugatu ^99mTc-EC-DG u pacjenta z TB wykazał brak ogniskowo zintensyfikowanego wychwytu.

Fig. 86A. CT pacjenta z rakiem płuca.

Fig. 86B. Obrazy całego ciała wykonane z pomocą koniugatu ^99mTc-EC-DG u pacjenta z rakiem płuca.

Fig. 86C. SPECT wykonany z pomocą koniugatu ^99mTc-EC-DG u pacjenta z rakiem płuca - nowotwór wykazał ogniskowo zintensyfikowany wychwyt.

Szczegółowy opis wynalazku

W dziedzinie medycyny nuklearnej lokalizuje się pewne stany patologiczne, albo też ocenia się ich stopień zaawansowania, poprzez wykrywanie rozmieszczenia małych ilości podanych wewnętrznie radioaktywnie znakowanych związków wskaźnikowych (zwanych wskaźnikami izotopowymi albo radiofarmaceutykami). Sposoby wykrywania radiofarmaceutyków znane są ogólnie jako obrazowanie albo obrazowanie izotopowe (radioobrazowanie).

W obrazowaniu izotopowym znacznikiem jest radionuklid emitujący promieniowanie gamma, zaś wskaźnik izotopowy lokalizowany jest przy zastosowaniu kamery wykrywającej promieniowanie gamma (proces ten często bywa nazywany scyntygrafią gamma). Obrazowany rejon jest wykrywalny, ponieważ wskaźnik izotopowy jest tak wybierany aby koncentrował się w obszarze patologicznym (zwany jest wówczas kontrastem pozytywnym), albo, alternatywnie, wskaźnik izotopowy wybierany jest tak aby nie lokalizował się w obszarach patologicznych (zwie się go wówczas kontrastem negatywnym).

Różnorodne radionuklidy znane są ze swej użyteczności w obrazowaniu izotopowym, włączając w to ⁶⁷Ga, ^99mTc, ¹¹¹In, ¹²³I, ¹²⁵I, ¹⁶⁹Yb oraz ¹⁸⁶Re. Z uwagi na lepsze właściwości w obrazowaniu oraz 123 131 67 niższą cenę, czyni się wysiłki aby zamienić, gdy to tylko możliwe, związki znakowane ¹²³I, ¹³¹I, ⁶⁷Ga

111 QQ/n i ¹¹¹In odpowiednimi związkami znakowanymi ^99mTc. Z uwagi na korzystne właściwości fizyczne jak również wyjątkowo niską cenę (0.21USD/mCi) ^99mTc jest korzystny w znakowania radiofarmaceutyków. Chociaż istnieje raport o możliwości efektywnego znakowania koniugatu DTPA-Iek za pomocą ^99mTc (Mathias et al., 1997), fragment strukturalny, jakim jest DTPA, nie tworzy równie trwałych chelatów z ^99mTc jak z ¹¹¹In (Goldsmith, 1997).

Cały szereg czynników musi być brany pod uwagę w celu uzyskania optymalnego obrazowania izotopowego ludzi. W celu uzyskania największej efektywności detekcji korzystne są radionuklidy emitujące energię gamma w zakresie od 100 do 200 keV. Aby zminimalizować dawkę pochłoniętą przez pacjenta czas fizycznego półtrwania radionuklidu powinien być tak krótki, jak tylko na to pozwala procedura stosowana do obrazowania. W celu umożliwienia przeprowadzenia badania w dowolnym dniu i o dowolnej porze korzystnie jest mieć źródło radionuklidu zawsze do dyspozycji bezpośrednio w jednostce klinicznej. ^99mTc jest radionuklidem korzystnym, ponieważ emituje promieniowanie gamma przy 140 keV, ma czas fizycznego półtrwania równy 6 godzin oraz jest łatwo osiągalny w jednostce klinicznej z zastosowaniem generatora molibden-99/technet-99m.

Ligandy czterokleszczowe pochodne bis-aminoetanotiolu, zwane też związkami diaminoditiolowymi, tworzą bardzo trwałe kompleksy Tc(V)O, co wiadomo na podstawie efektywnego wiązania grupy oksotechnetiowej do dwóch tiolowych atomów siarki i dwóch aminowych atomów azotu. (Davison et al., 1980, 1981; Verbruggen et al., 1992). ^99mTc-L,L-etylenodicysteina (^99mTc-EC) jest najnowszym i uznanym za skuteczny przykładem chelatu N2S2. (Verbruggen et al., 1992; Van Nerom et al., 1993; Surma et al., 1994). EC, nowy czynnik stosowany do obrazowania nerek, może być znakowany ^99mTc

PL 212 211 B1 łatwo, wydajnie, trwale i z dużą czystością radiochemiczną oraz jest wydalany przez nerki w aktywnym transporcie kanalikowym. (Verbruggen et al., 1992; Van Nerom et al., 1993; Surma et al., 1994; Verbruggen et al., 1990; Van Nerom et al., 1990; Jamar et al, 1993). Inne zastosowania EC to chelatowanie galem-68 (emiter pozytronów, t1/2= 68 minut) w celach PET, a także gadolinem, żelazem albo manganem w celach obrazowania rezonansem jądrowym (MRI).

Zgodnie z obecnym wynalazkiem wykorzystuje się ^99mTc-EC jako czynnik znakujący, naprowadzający Iigandy na specyficzne rodzaje tkanki w celu jej obrazowania. Zaleta koniugowania EC z Iigandami mającymi na celu poszczególne tkanki polega na tym, że właściwość specyficznego (wybiórczego) wiązania Iigandu mającego na celu daną tkankę powoduje zarazem skoncentrowanie sygnału radioaktywnego w pożądanym rejonie. Chociaż uważa się, że stosowanie ^99mTc-EC może być efektywną strategia znakowania dla dowolnego związku, to jednak zasugerowano aby w celach zilustrowania problematyki dokonać tu wyboru ligandów korzystnych. Rozważana jest też możliwość, że koniugaty ^99mTc-EC-Iek według wynalazku mogą być użyteczne do obrazowania nie tylko nowotworów, ale także innych stanów tkankowo-specyficznych, takich jak infekcje, tkanka hipoksyjna (niedotleniona; np. w udarach mózgu), zawał mięśnia sercowego, komórki apoptotyczne, choroba Alzheimera i gruczolistość (endometrioza).

Istnieją doniesienia w stanie techniki o znakowanych radioizotopami proteinach i peptydach. (Ege et al., patent Stanów Zjednoczonych Ameryki US-4832940; Abrams et al, 1990; Bakker et al., 1990; Goldsmith et al., 1995, 1997; Olexa et al., 1982; Ranby et al., 1988; Hadley et al., 1988; Lees et al., 1989; Sobel et al., 1989; Stuttle, 1990; Maraganore et al., 1991; Rodwell et al., 1991; Tubis et al., 1968; Sandrehagen 1983). Jednakże, do czasu obecnego wynalazku, ^99mTc-EC nie był stosowany w powiązaniu z żadnymi innymi ligandami, za wyjątkiem estru dietylowego (Kabasakal, 2000). Ester dietylowy EC zastosowano w badaniach przepływu krwi mózgowej (Kikukawa, et al., 2000).

Chociaż chemia ^99mTc jest optymalna do radioobrazowania, nie była ona badana równie starannie jak chemia innych pierwiastków i z tego powodu sposoby radioznakowania za pomocą ^99mTc są nieliczne. ^99mTc zazwyczaj otrzymuje się jako ^99mTc nadtechnetian (TcO4^-; technet na +7 stopniu utlenienia), zazwyczaj w generatorze molybden-99/technet-99m. Jednakże nadtechnetian nie wiąże się łatwo z innymi związkami. Dlatego też, w celu znakowania radioizotopem, ^99mTc nadtechnetian musi być przeprowadzony w inną formę. Ponieważ technet nie tworzy trwałych jonów w roztworach wodnych, musi być utrzymywany w takich roztworach w formie kompleksu koordynacyjnego o wystarczającej trwałości kinetycznej i termodynamicznej, tak, aby uniknąć rozkładu dającego w wyniku przemianę ^99mTc do nierozpuszczalnego dwutlenku technetu albo na powrót do nadtechnetianu.

W celach znakowania radioizotopowego jest szczególnie korzystne aby kompleks ^99mTc tworzył się w formie chelatu, w którym wszystkie grupy donorowe otaczające atom technetu pochodzą od jednego chelatującego Iigandu - w tym przypadku od etylenodicysteiny. Pozwala to na kowalencyjne połączenie chelatowanego ^99mTc z Iigandem naprowadzającym, albo bezpośrednio, albo poprzez pojedynczy łącznik pomiędzy etylenodicysteiną a Iigandem.

Technet występuje na szeregu stopni utlenienia: +1, +2, +4, +5, +6 i +7. Technet na +1 stopniu utlenienia nazywany jest Tc MIBI. Tc MIBI powstaje wyłącznie w wyniku reakcji termicznej. (Seabold et al., 1999). Dla celów obecnego wynalazku ważne jest, aby Tc był na +4 stopniu utlenienia. Taki stopień utlenienia doskonale odpowiada tworzeniu chelatów N2S2 z EC. Tak więc poprzez utworzenie kompleksu radioaktywnego technetu z koniugatami leków według obecnego wynalazku, tenże kompleks technetu, korzystnie sól ^99mTc nadtechnetianu, poddawany jest reakcji z koniugatami leków według wynalazku w obecności czynnika redukującego.

Korzystnym czynnikiem redukujące stosowanym w obecnym wynalazku w celu zredukowania

Tc do +4 stopnia utlenienia jest jon cynawy w formie chlorku cyny(II) (SnCI2). Jednakże rozważa się 2- 2+ inne czynniki redukujące, takie jak jon ditioninowy S2O4^2-, albo jon żelazawy (żelazowy(II)], Fe²⁺, które mogą być stosowane w związku z obecnym wynalazkiem. Rozważa się też możliwość, że czynnik redukujący może być czynnikiem redukującym na fazie stałej. Ilość czynnika redukującego może mieć znaczenie ponieważ należy unikać wytworzenia koloidu. Korzystne jest stosowanie na przykład od około 10 do około 100 μg SnCI₂ na każde około 100 do około 300 mCi Tc nadtechnetianu. Najbardziej korzystna ilość wynosi około 0,1 mg SnCI2 na około 200 mCi Tc nadtechnetianu i około 2 mL solanki.

Takie warunki zazwyczaj prowadzą do wytworzenia ilości koniugatu Tc-EC-Iigand naprowadzający wystarczającej do zastosowania u pięciu pacjentów.

Często ważne jest też aby kompozycja zawierała przeciwutleniacz w celu zapobiegania utlenieniu etylenodicysteiny. Korzystnym przeciwutleniaczem do stosowania według wynalazku jest witamina C

PL 212 211 B1 (kwas askorbinowy). Jednakże rozważa się możliwość, że inne przeciwutleniacze, takie jak tokoferol, pirydoksyna albo rutyna mogą również być użyteczne.

Ogólnie, Iigandy stosowane według wynalazku posiadają grupy aminowe albo hydroksylowe zdolne do koniugowania EC, poprzez jedno albo poprzez obydwa ugrupowania kwasowe EC. Jeśli grupy aminowe albo hydroksylowe nie występują (np. w przypadku kwasowej grupy funkcyjnej) wówczas odpowiedni Iigand nadal może być skoniugowany z EC i znakowany ^99mTc stosując sposoby według wynalazku polegające na dodaniu łącznika takiego jak etylenodiamina, aminopropanol, dietylenotriamina, kwas asparaginowy, kwas poliasparaginowy, kwas glutaminowy, kwas poligIutaminowy albo lizyna.

EC jest rozpuszczalna w wodzie. Konieczne jest, aby koniugat EC-Iek według wynalazku również był rozpuszczalny w wodzie. Wiele spośród ligandów stosowanych w związku z obecnym wynalazkiem jest rozpuszczalne w wodzie albo tworzy związek rozpuszczalny w wodzie po skoniugowaniu z EC. Jednakże, gdy Iigand naprowadzający nie jest rozpuszczalny w wodzie, wówczas można stosować łącznik, który zwiększa rozpuszczalność Iigandu. Łączniki mogą być dołączone do alkoholu alifatycznego albo aromatycznego, aminy albo peptydu, albo do kwasu karboksylowego. Łącznikiem może być poliaminokwas (peptyd) albo aminokwas, taki jak kwas glutaminowy, kwas asparaginowy albo lizyna.

Tabela 1 ilustruje pożądane łączniki dla wybranych grup funkcyjnych leków.

T a b e l a 1

Grupa funkcyjna leku	Łącznik	Przykład
Alifatyczna albo fenolowa -OH	EC-kwas poligIutaminowy (m.cz. 750-15000) albo EC-kwas poliasparaginowy (m.cz. 2000-15000) albo octan bromoetylu albo EC-kwas glutaminowy albo EC-kwas asparginowy	A
Alifatyczna albo	EC-kwas poliglutaminowy (m.cz. 750-15000) albo	B
aromatyczna -NH2 albo peptyd	EC-kwas poliasparaginowy (m.cz. 2000-15000) albo EC-kwas glutaminowy (mono- albo diester) albo EC-kwas asparaginowy
Kwas karboksylowy albo peptyd	Etylenodiamina, lizyna	C

Uważa się też, że koniugaty według wynalazku: EC-Iigand naprowadzający-lek mogą być chelatowane innymi radionuklidami i stosowane w terapii radionuklidami. Ogólnie uważa się, że faktycznie dowolny α,β-emiter, γ-emiter albo β,γ-emiter może być stosowany zgodnie z wynalazkiem. Korzystne β,γ-emitery zawierają ¹⁶⁶Ho, ¹⁸⁸Re, ¹⁸⁶Re, ¹⁵³Sm, i ⁸⁹Sr. Korzystne β-emitery zawierają ⁹⁰Y i ²²⁵Ac. Korzystne γ-emitery zawierają ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁶⁴Cu, ⁶²Cu i ¹¹¹In. Korzystne α-emitery zawierają ²¹¹At i ²¹²Bi. Uważa się też, że substancje paramagnetyczne takie jak Gd, Mn i Fe mogą być chelatowane EC w celu zastosowań według obecnego wynalazku.

Kompleksy, oraz środki do wytwarzania takich kompleksów, oferowane są w formie wygodnego zestawu zawierającego szczelnie zamkniętą fiolkę zawierającą uprzednio odmierzoną ilość koniugatu EC-Iigand naprowadzający według wynalazku przeznaczoną do znakowania oraz wystarczającą ilość czynnika redukującego do znakowania tego koniugatu za pomocą ^99mTc. Znakowane ^99mTc obrazujące środki scyntygraficzne według obecnego wynalazku mogą być wytwarzane przez dodanie odpowiedniej ilości ^99mTc albo kompleksu ^99m Tc do fiolki zawierającej koniugat EC-Iigand naprowadzający oraz czynnik redukujący, w warunkach reakcji opisanych w przykładzie 1 przytaczanym poniżej w niniejszym opisie. Zestaw może także zawierać konwencjonalne farmaceutyczne materiały pomocnicze takie jak na przykład farmaceutycznie dopuszczalne sole do regulowania ciśnienia osmotycznego, bufory, środki konserwujące, przeciwutleniacze i temu podobne. Składniki zestawu mogą występować w formie ciekłej, zamrożonej albo suchej. W korzystnym wariancie, mleko składniki zestawu dostarcza się w formie liofilizowanej.

Radioaktywnie znakowane reagenty albo koniugaty według wynalazku mają odpowiednią ilość radioaktywności. Jest ogólnie korzystnie przy tworzeniu radioaktywnych kompleksów ^99mTc aby tworzyć te kompleksy w roztworach zawierających radioaktywność w stężeniach od około 0,01 mCi do około 300 mCi na 1 mL.

Scyntygraficzne środki obrazujące znakowane ^99mTc według obecnego wynalazku mogą być stosowane do obrazowania rejonów w ciele ssaków. Wspomniane scyntygraficzne środki obrazujące

PL 212 211 B1 znakowane ^99mTc podaje się w jednorazowej dawce iniekcyjnej. Każdy ze zwykłych nośników znany specjalistom, taki jak sterylny roztwór soli filologicznej albo osocze krwi, może być stosowany po znakowaniu radionuklidem, w celu wytworzenia roztworu do iniekcji stosowanej do diagnostycznego obrazowania różnych organów, nowotworów i tym podobnych. Ogólnie, jednorazowa dawka do podania ma radioaktywność od około 0,01 mCi do około 300 mCi, korzystnie 10 mCi do około 200 mCi. Objętość roztworu do iniekcji w dawce jednorazowej jest od około 0,01 mL do około 10 mL. Po dożylnym podaniu może nastąpić obrazowanie organu albo nowotworu in vivo, jeśli jest to pożądane, w czasie godzin albo nawet w jeszcze dłuższym czasie po wprowadzeniu do ciała pacjenta reagenta znakowanego radioizotopami. W większości przypadków wystarczająca ilość podanej dawki nagromadzi się w rejonie poddawanym obrazowaniu w ciągu 0,1 godziny, umożliwiając uzyskanie zdjęć scyntygraficznych. Stosować można dowolny konwencjonalny sposób obrazowania scyntygraficznego dla celów diagnostycznych albo prognostycznych.

Strategia znakowania ^99mTc-EC opisana w niniejszym zgłoszeniu może też być stosowana w celach prognozowania. Uważa się, że EC może być koniugowane do znanych leków „z wyboru stosowanych w terapii raka, takich jak przedstawione w tabeli 2. Te koniugaty EC-Iek mogą następnie być radioznakowane ^99mTc i podane pacjentowi z nowotworem. Znakowane koniugaty EC-Iek wiążą się specyficznie z nowotworem. Może zostać wykonane obrazowanie w celu określenia efektywności leku chemioterapii rakowej przeciwko konkretnemu nowotworowi u danego pacjenta. W ten sposób lekarze mogą szybko wyznaczyć sposób leczenia i określić, który lek chemioterapeutyczny będzie najbardziej skuteczny. Stanowi to dramatyczną poprawę w porównaniu z dotychczasowymi sposobami, które obejmują wybór leku i zaaplikowanie serii chemioterapii. Oznacza to całe miesiące czasu pacjenta i wiele tysięcy dolarów zanim da się wyznaczyć skuteczność leku.

Znakowane ^99mTc koniugaty EC-Iigand naprowadzający i kompleksy według obecnego wynalazku mogą być podawane dożylnie w dowolnym konwencjonalnym środowisku stosowanym do iniekcji dożylnych, takim jak środowisko wodnego roztworu soli albo środowisko osocza krwi. Takie środowisko może też zawierać konwencjonalne farmaceutyczne środki pomocnicze takie jak na przykład farmaceutycznie dopuszczalne sole do regulowania ciśnienia osmotycznego, bufory, środki konserwujące, przeciwutleniacze i temu podobne. Do korzystnych środowisk należy izotoniczny roztwór soli oraz osocze krwi.

Specyficzne, korzystne sposoby omawiane są bardziej szczegółowo poniżej.

Wykorzystanie glikolizy nowotworowej

Ligandy znakowane radioizotopami, takie jak policukry (neomycyna, kanamycyna, tobramycyna) i monocukry (glukozamina) wiążą się z komórkowym transporterem glukozy, a następnie ulegają fosforylacji, które to procesy są nadmiernie ekspresjonowane w komórkach nowotworowych. (Rogers et al., 1968; Fanciulli et al., 1994; Popovici et al., 1971; Jones et al., 1973; Hermann et al., 2000). Poziom glukozy wywołany przez policukry (neomycyna, kanamycyna, tobramycyna) i monocukry (glukozamina) może być obniżony za pomocą insuliny (Harada et al., 1995; Molier et al., 1991; Offield et al., 1996; Shankar et al., 1998; Yoshino et al, 1999; Villevalois-Cam et al, 2000). Ponieważ te Iigandy nie są imunogeniczne i są szybko usuwane z osocza, obrazowanie metaboliczne wydawałoby się bardziej obiecujące niż obrazowanie z udziałem przeciwciał.

Poniżej przytacza się przykłady w celu przedstawienia korzystnych wariantów wynalazku. Specjaliści powinni wziąć pod uwagę, że sposoby przedstawione w poniższych przykładach ilustrują metody, które, jak to zostało potwierdzone przez twórców, sprawdzają się dobrze w praktycznym stosowaniu wynalazku i dlatego mogą być uważane za stanowiące korzystne warianty realizacji wynalazku. Jednakże znawcy dziedziny wynalazku, w świetle obecnego opisu powinni wziąć pod uwagę, że można dokonać wielu zmian w specyficznych wariantach tu przedstawionych i mimo to uzyskać bardzo podobny albo podobny wynik, nie oddalając się zbytnio od istotnej treści i zakresu obecnego wynalazku.

Synteza EC

EC wytworzono na drodze syntezy dwuetapowej według uprzednio opisanych sposobów (Ratner i Clarke, 1937; Blondeau et al., 1967; obydwie prace przytacza się tutaj w charakterze odnośnika). Substrat do syntezy EC, kwas L-tiazolidyno-4-karboksylowy, otrzymano na drodze syntezy (temperatura topnienia 195°C, literaturowa 196-197°C). Następnie dokonano syntezy EC (temperatura topnie₁ nia 237°C, literaturowa 251-253°C). Struktura została potwierdzona za pomocą ¹H-NMR i spektrometrii masowej „bombardowania szybkimi atomami (FAB-MS).

PL 212 211 B1

Synteza [¹⁸F]FMISO i [¹³¹I]IMISO ¹⁸F-fluorek wytworzono za pomocą cyklotronu stosując naświetlanie protonami wody wzbogaconej w ¹⁸O-H2O, w tarczy srebrnej o małej objętości. Związek tosylo-MISO (Hay et al, 1994) (20 mg) rozpuszczono w acetonitrylu (1.5 mL) i dodano do kompleksu kryptofiksfluorek. Po ogrzewaniu, hydrolizie i oczyszczaniu kolumnowym, po czasie zakończenia napromieniowania (EOB) równym 60 minut, wyizolowano czysty produkt z wydajnością 25-40% (po korekcie na rozpad). HPLC wykonano przy użyciu kolumny C-18 ODS-20T, 4.6 x 25 mm (Waters Corp., Milford, Mass.), stosując jako eluent H2O/acetonitryl (80/20), przy szybkości przepływu 1 mL/minutę. Produkt bez nośnika odpowiadał czasowi retencji (6.12 min) nieznakowanego FMISO, wyznaczonemu w podobnych warunkach. Czystość radiochemiczna była powyżej 99%. Przy użyciu detektora UV (310 nm) nie stwierdzono żadnych innych zanieczyszczeń. Aktywność właściwa wyznaczona dla [¹⁸F]FMISO wyniosła 1 Ci-mol, w oparciu o wyniki UV i pomiaru radioaktywności próbki o znanej masie i radioaktywności.

131

[¹³¹I]IMISO wytworzono z tego samego prekursora (Cherif et al., 1994). Pokrótce, 5 mg tosylo131

-MISO rozpuszczono w acetonitrylu (1 mL) i dodano Na¹³¹I (lmCi, w 1N NaOH, 0.1 mL) (Dupont, New England, Boston, MA). Po ogrzewaniu i oczyszczeniu otrzymano produkt (wydajność 60-70%). Analiza radio-TLC, przy użyciu jako eluenta układu chloroform-metanol (7:3), wykazała wartość Rf= 0.01 dla produktu finalnego.

Badania dystrybucji w tkankach in vivo

Dystrybucja w tkankach ^99mTc-EC u szczurów z nowotworem jest przedstawiona w tabeli 4

T a b e l a 4

Biodystrybucja ^99mTc-EC u szczurów z nowotworem sutka

	%Podanej iniekcyjnie dawki mTc-EC w przeliczeniu na ciężar narządu albo tkanki
20minut	1 godzina	2 godziny	4 godziny
Krew	0,435±0,029	0,273±0,039	0,211±0,001	0,149±0,008
Płuco	0,272±0,019	0,187±0,029	0,144±0,002	0,120±0,012
Wątroba	0,508±0,062	0,367±0,006	0,286±0,073	0,234±0,016
Żołądek	0,136±0,060	0,127±0,106	0,037±0,027	0,043±0,014
Nerki	7,914±0,896	8,991 ±0,268	9,116±0,053	7,83411,018
Tarczyca	0,219±0,036	0,229±0,118	0,106±0,003	0,083±0,005
Mięśnie	0,060±0,006	0,043±0,002	0,028±0,009	0,019±0,001
Jelita	0,173±0,029	0,787±0,106	0,401±0,093	0,103±0,009
Mocz	9,124±0,808	11,045±6,158	13,192±4,505	8,693±2,981
Nowotwór	0,342±0,163	0,149±0,020	0,115±0,002	0,096±0,005
Nowotwór/ krew	0,776±0,322	0,544±0,004	0,546±0,010	0,649±0,005
Nowotwór/ mięśnie	5,841±3,253	3,414±0,325	4,425±1,397	5,093±0,223

Pokazane wartości reprezentują średnie ± odchylenie standardowe danych dla 3 zwierząt.

Wykorzystanie glikolizy nowotworów

P r z y k ł a d 6. Wprowadzenie do praktyki koniugatu ^99mTc-EC-neomycyna

Synteza EC

EC wytworzono na drodze syntezy dwuetapowej według uprzednio opisanych sposobów (Ratner i Clarke, 1937; Blondeau et al., 1967). Prekursor do syntezy EC, kwas L-tiazolidyno-4-karboksylowy, otrzymano na drodze syntezy (temperatura topnienia 195°C, literaturowa 196-197°C). Następnie syntezowano EC (temperatura topnienia 237°C, literaturowa 251-253°C). Struktura została potwierdzona za pomocą ¹H-NMR i spektrometrii masowej bombardowania szybkimi atomami (FAB-MS).

Synteza związku etylenodicysteina-neomycyna (EC-neomycyna)

Wodorotlenek sodu (2N, 0.2 mL) dodano do mieszanego roztworu EC (134 mg, 0.50 mmola) w wodzie (5 mL). Następnie do tak uzyskanego bezbarwnego roztworu dodano sulfo-NHS (217 mg, 1.0 mmola) i EDC (192 mg, 1.0 mmola), po czym dodano sól trisiarczanową neomycyny (909 mg, 1.0 mmola). Mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej w ciągu 24 godzin, następnie dializowano przez 48 godzin stosując porowatą membranę molekularną Spectra/POR z molekularnym odcinaniem progowym przy 500 (Spectrum Medical Industries Inc., Houston, ΊΓΧ). Po dializie produkt liofili12

PL 212 211 B1 zowano z wykorzystaniem Iiofilizatora Labconco, Kansas City, MO. Produkt ważył 720 mg (wydajność 83%). Schemat syntezy EC-neomycyna przedstawiono na Fig. 36. Struktura jest potwierdzona za pomocą 1H-NMR (Fig. 38A i 38B), spektrometrii masowej (Fig. 39A i 39B) i analizy elementarnej (Galbraith Laboratories, Inc., Knoxville, TN). Analiza elementarna, dla: C39H75N10S4O19 x 15H2O (C,H,N,S); obliczono C:33.77, H:7.58, N:10.11, S:9.23; znaleziono C:32.44, H:5.90, N:10.47, S:10.58. Długość fali światła UV absorpcji EC-neomycyna (270.5 mm) uległa przesunięciu w porównaniu z absorpcją EC i neomycyny (Fig. 40A, 40B i 40C).

Radioznakowanie EC-MN i EC-neomycyna za pomocą ^99mTc

Radiosyntezy ^99mTc-EC i ^99mTc-EC-neomycyna zostały osiągnięte poprzez dodanie wymaganej ilości ^99mTc-nadtechnetianu do niehandlowego zestawu zawierającego: liofilizowaną próbkę EC albo

EC-neomycyna (10 mg), SnCI₂ (100 μg), Na₂HPO₄ (13.5 mg) i kwas askorbinowy (0.5 mg). Następnie dodano NaEDTA (0.5 mg) w 0.1 ml wody. Końcowe pH preparatów wynosiło 7.4. Czystość radiochemiczną wyznaczano za pomocą TLC (ITLC SG, Gelman Sciences, Ann Arbor, MI) wymywanej układem octan amonu (1M w wodzie) - metanol (4:1). Na podstawie analizy radio-TLC (Bioscan, Washington, DC) (Fig. 41) oraz analizy HPLC (Fig. 42-45) czystość wyniosła > 95% dla obydwu wskaźników izotopowych.

Test trwałości ^99mTc-EC i ^99mTc-EC-neomycyna

Trwałość ^99mTc-EC i ^99mTc-EC-neomycyna były badane dla próbek w osoczu krwi psa. Pokrótce, 740 kBq 1 mg próbki ^mTc-EC i ^mTc-EC-neomycyna poddawano inkubacji w osoczu krwi psa (200 •I) w 37⁰C przez 4 godziny. Próbki serum rozcieńczano 50% roztworem metanolu w wodzie i poddawano analizie radio-TLC powtarzanej po czasie 0.5, 2 i 4 godziny, jak to opisano powyżej.

Badania dystrybucji koniugatu ^99mTc-EC-neomycyna w tkankach

344 Samice szczurów Fischera (150 ± 25 g) (Harlan Sprague-Dawley, Indianapolis, IN) zostały podskórnie zaszczepione 0.1 ml komórek nowotworu sutkowego z suspensji komórek nowotworowych linii 13762 (10⁶ komórek/szczura, linia komórek nowotworowych specyficzna dla szczurów Fischera), w tylne kończyny, stosując igły rozmiaru gauge 25. Badanie przeprowadzano 14 do 17 dni po implantacji, kiedy guzy nowotworowe osiągnęły rozmiar około 1 cm średnicy. Zwierzęta znieczulano ketaminą (10-15 mg/szczura, dootrzewnowo) przed przeprowadzeniem każdej procedury.

W badaniach dystrybucji w tkankach, każde zwierzę otrzymywało dożylną iniekcję 10-20 -Ci koniugatu ^99mTc-EC-neomycyna albo związku ^99mTc-EC (n=3/punkt czasowy). Iniekcyjnie podana ilość ^99mTc-EC-COL wynosiła 200 -g na szczura. Po czasie: 0.5, 2 i 4 godziny po podaniu wskaźników radioizotopowych, szczury były uśmiercane, a wybrane tkanki były wycinane, ważone i ich radioaktywność była zliczana. Biodystrybucja wskaźnika izotopowego w każdej próbce była obliczana jako procent dawki nastrzykniętej na gram ciężaru mokrej tkanki (%ID/g). Ilorazy rozkładu gęstości zliczeń nowotwór/ tkanka nie- docelowa obliczano na podstawie odpowiednich wartości %ID/g. W porównaniu z ^99mTc-EC (Tabela 4) i wolnym technetem (Tabela 9), w grupie ^99mTc-EC-neomycyna proporcje nowotwór/tkanka zwiększały się w funkcji czasu (Tabela 8).

Badania obrazowania scyntygraficznego

Obrazy scyntygraficzne otrzymywano z zastosowaniem kamery gamma (Siemens Medical Systems, Inc., Hoffman Estates, IL) wyposażonej w niskoenergetyczny, równoległowiązkowy kolimator, w czasie 0.5, 2 i 4 godzin po dożylnym podaniu iniekcyjnym 100 •Ci każdego znacznika radioizotopowego. W przypadku koniugatu ^99mTc-EC-neomycyna obserwowano wysoki wychwyt, porównując z ^99mTc-EC (Fig. 37A). Wstępne badania kliniczne przeprowadzono u pacjentki z rakiem sutka. Nowotwór został dobrze uwidoczniony 2 godziny po podaniu ^99mTc-EC-neomycyna (Fig. 37B).

T a b e l a 8

Biodystrybucja ^99mTc-EC-neomycyna w szczurach z nowotworem sutka

	30 Minut	1 Godzina	2 Godziny	4 Godziny
1	2	3	4	5
Krew	0,46310,007	0,26210,040	0,13910,016	0,08510,004
Płuco	0,34410,011	0,20210,030	0,11410,014	0,08010,003
Wątroba	0,33710,012	0,26910,013	0,22110,020	0,19510,012
Żołądek	0,27910,039	0,14710,001	0,06110,008	0,05410,008
Śledziona	0,15910,008	0,11410,013	0,09510,007	0,08910,003

PL 212 211 B1 cd. tabeli 8

1	2	3	4	5
Nerka	8,39110,395	8,80410,817	8,35610,408	8,63810,251
T arczyca	0,34910,008	0,20210,028	0,11410,007	0,08610,001
Mięśnie	0,09310,001	0,04910,010	0,02110,006	0,01010,001
Jelito	0,15910,004	0,09310,014	0,06110,004	0,26610,200
Mocz	25,40218,621	21,78612,690	0,22410,000	2,60912,377
Nowotwór	0,41910,023	0,27910,042	0,16610,023	0,13110,002
Mózg	0,02210,001	0,01410,003	0,01010,001	0,00710,001
Serce	0,14710,009	0,08110,012	0,04010,004	0,02910,002
Nowotwór/krew	0,90610,039	1,07010,028	1,19610,061	1,53610,029
Nowotwór/mięsień	4,51210,220	5,85510,458	8,36411,469	12,70610,783
Nowotwór/mózg	19,49511,823	20,00110,890	17,51512,035	20,25511,693

Pokazane wartości reprezentują średnie ± odchylenie standardowe danych dla 3 szczurów. T a b e l a 9

Biodystrybucja ^99mTc nadtechnetianu w szczurach z nowotworem sutka

	30 Minut	2 Godziny	4 Godziny
Krew	1,21810,328	0,66610,066	0,71510,052
Płuco	0,6461 0,291	0,63210,026	0,38710,024
Wątroba	0,54110,232	0,30410,026	0,50110,081
Śledziona	0,33110,108	0,18710,014	0,22510,017
Nerka	0,63810,197	0,48910,000	0,93210,029
T arczyca	24,82115,181	11,907115,412	17,23215,002
Mięśnie	0,13010,079	0,07610,002	0,06310,003
Jelito	0,15310,068	0,18610,007	0,34410,027
Nowotwór	0,59110,268	0,32810,016	0,42310,091
Mózg	0,03810,014	0,02210,002	0,03110,009
Serce	0,27510,089	0,14510,015	0,16610,012
Nowotwór/krew	0,47210,093	0,49710,073	0,59710,144
Nowotwór/mięsień	4,78810,833	4,30210,093	6,68911,458
Nowotwór/wątroba	1,08410,023	1,08410,115	0,86510,270

Pokazane wartości reprezentują średnie ± odchylenie standardowe danych dla 3 szczurów. Wychwyt komórkowy in vitro koniugatów ^99mTc-EC-Iek W celu oszacowania wychwytu komórkowego koniugatów ^99mTc-EC-lek, do każdej studzienki zawierającej 80000 komórek (linia komórek raka płuca A549) dodawano 2 •Ci ^mTc-EC-neomycyna i ¹⁸F-FDG. Po inkubacji przez 0,5-4 godzin, komórki trzykrotnie przemywano solanką buforowaną buforem fosforanowym, a następnie trypsyną w celu rozbicia komórek, po czym zliczano radioaktywność licznikiem gamma. Dla ^99mTc-EC-neomycyny obserwowano najwyższy wychwyt pośród środków badanych na linii komórek ludzkiego raka płuca (Fig. 46).

Wpływ glukozy na wychwyt komórkowy koniugatu ^99mTc-EC-neomycyna i ¹⁸F-FDG Wiadomo, że neomycyna wywiera wpływ na absorpcję glukozy (Rogers et al, 1968; Fanciulli et al,

1994). Uprzednio wykonane eksperymenty wykazały, że ^99mTc-EC-neomycyna charakteryzuje się wyższym wychwytem niż ¹⁸F-FDG w linii komórkowej ludzkiego raka płuca (A549). W celu określenia,

PL 212 211 B1 czy wychwyt ^99mTc-EC-neomycyna zachodzi poprzez mechanizm z udziałem glukozy, dodawano glukozę (0.1 mg-2.0 mg) do każdej studzienki zawierającej albo 50000 komórek (sutkowe) albo 80000 (płucne), wraz z 2 •Ci koniugatu ^mTc-EC-neomycyna albo ¹⁸F-FDG. Po inkubacji, komórki trzykrotnie przemywano solanką buforowaną buforem fosforanowym, a następnie trypsyną w celu rozbicia komórek, po czym zliczano radioaktywność licznikiem gamma.

Dodawanie glukozy o stężeniu 0.1-2.0 mg/ studzienkę spowodowało obserwowane zmniejszenie wychwytu koniugatu ^99mTc-EC-neomycyna w przypadku dwóch linii komórkowych ludzkiego raka płuca i jednej linii komórkowej sutka. Podobne wyniki obserwowano w grupach ¹⁸F-FDG. ^99mTc-EC (grupa kontrolna) nie wykazała wychwytu. Te wyniki badań sugerują, że komórkowy wychwyt koniugatu ^99mTc-EC-neomycyna może zachodzić z udziałem mechanizmu zależnego od glukozy (Fig. 47, 48A i 48B).

P r z y k ł a d 7. Metaboliczne obrazowanie nowotworów za pomocą koniugatu ^99mTc-EC-deoksyglukoza

Synteza związku EC-deoksyglukoza (EC-DG)

Wodorotlenek sodu (1N, 1 mL) dodano do mieszanego roztworu EC (110 mg, 0.41 mmola) w wodzie (5 mL). Następnie, do tak uzyskanego bezbarwnego roztworu dodano sulfo-NHS (241.6 mg, 1.12 mmola) i EDC (218.8 mg, 1.15 mmola), po czym dodano chlorowodorkową sól D-glukozaminy (356.8 mg, 1.65 mmola). Mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Następnie mieszaninę dializowano przez 48 godzin stosując porowatą membranę molekularną Spectra/POR z molekularnym odcinaniem progowym przy 500 (Spectrum Medical Industries Inc., Houston, TX). Po dializie produkt liofilizowano z wykorzystaniem Iiofilizatora Labconco, Kansas City, MO. Produkt otrzymany w formie soli ważył 568.8 mg. Schemat syntezy przedstawiono na Fig. 59. Struktura została potwierdzona za pomocą spektrometrii masowej (Fig. 60) i protonowego NMR (Fig. 61 i Fig. 62). Czystość radiochemiczna ^99mTc-EC-DG była 100%, w oparciu o analizy radio-TLC (Fig. 63) i HPLC (Fig. 64 i Fig. 65).

Oznaczenie heksokinazy

W celu określenia, czy EC-DG przebiega tak samo jak proces fosforylacji glukozy, przeprowadzono oznaczenie heksokinazy. Stosując gotowy zestaw (Sigma Chemical Company), przy długości fali UV 340 nm oznaczono EC-DG, glukozaminę, i glukozę (standard). Glukoza, EC-DG i glukozamina dały dodatni wynik w oznaczeniu heksokinazowym (Fig. 66-68).

Oznaczenie wychwytu komórkowego in vitro

Oznaczenie wychwytu komórkowego in vitro wykonano przy użyciu linii komórkowej ludzkiego raka płuca (A549). Do studzienek zawierających po 80000 komórek dodawano 2 •Ci ^99mTc-EC-DG i ¹⁸F-FDG. Po okresie inkubacji 0.5-4 godziny, komórki trzykrotnie przemywano solanką buforowaną buforem fosforanowym, a następnie trypsyną w celu rozbicia komórek, po czym zliczano radioaktywność licznikiem gamma. ^99mTc-EC-DG dała wynik porównywalny z FDG (Fig. 69).

Wpływ D- i L-glukozy na wychwyt komórkowy koniugatu ^99mTc-EC-deoksyglukoza i ¹⁸F-FDG

W celu określenia, czy wychwyt ^99mTc-EC-deoksyglukoza zachodzi poprzez mechanizm z udziałem D-glukozy, dodawano D- i L-glukozę (1 mg i 2.0 mg) do każdej studzienki zawierającej komórki raka sutka albo raka płuca (50000 komórek/0.5mL/studzienka), wraz z 2 -Ci koniugatu ^99mTc-EC-deoksyglukoza albo ¹⁸F-FDG. Po 2 godzinnej inkubacji, komórki trzykrotnie przemywano solanką buforowaną buforem fosforanowym, a następnie trypsyną w celu rozbicia komórek, po czym zliczano radioaktywność licznikiem gamma.

Dodawanie glukozy o stężeniu 1-2.0 mg/ studzienkę spowodowało obserwowane zmniejszenie wychwytu koniugatu ^99mTc-EC-deoksyglukoza przez D-glukozę, w przypadku komórek raka płuca i raka sutka. Jednakże L-glukoza nie wywierała wpływu na żadne z tych rodzajów komórek (Fig. 70- 73). Te wyniki badań sugerują, że komórkowy wychwyt koniugatu ^99mTc-EC-deoksyglukoza zachodzi z udziałem mechanizmu zależnego od D- glukozy.

Wpływ zawartości koniugatu ^99mTc-EC-deoksyglukoza na poziom glukozy we krwi u zdrowych szczurów.

Poprzednie eksperymenty wykazały, że wychwyt komórkowy ^99mTc-EC-deoksyglukoza jest podobny do FDG. Na przykład, oznaczenie heksokinazy (fosforylacja glukozy) dało wynik pozytywny. Wychwyt ^99mTc-EC-deoksyglukoza zachodzi poprzez mechanizm z udziałem D-glukozy. Niniejsze badanie ma na celu określenie, czy FDG albo EC-deoksyglukoza mogłyby mieć wpływ na poziom glukozy we krwi oraz czy taki wpływ może być odwrócony przez insulinę.

PL 212 211 B1

344 Zdrowe standardowe szczury Fischera (145-155 g) nie były karmione przez noc przed eksperymentem. Stężenia przygotowanych roztworów chlorowodorku glukozaminy, FDG i EC-deoksygIukozy wynosiły 60% i 164% (mg/ml). Poziom glukozy we krwi (mg/dL) wyznaczono za pomocą glukometru (Glucometer DEX, Bayer Corporation, Elkhart, 1N). Przed badaniem uzyskano linię podstawową poziomu glukozy we krwi. Każdemu ze szczurów (n=3/ grupę) podano 1.2 mmola/kg glukozaminy, FDG i EC-deoksyglukozy. W odrębnym eksperymencie, grupie szczurów podano EC-deoksygIukozę i FDG. Insulinę (5 jednostek) podano po 30 minutach. Próbki krwi pobierano z żyły ogonowej co 30 minut w czasie do 6 godzin po podaniu insuliny.

Poziom cukru we krwi wyznaczono przez dożylne podanie glukozaminy, FDG i EC-deoksyglukozy, w jednej szybko podanej dawce. Tak zwiększone poziomy glukozy we krwi były supresjonowane przez jednoczesne podanie insuliny z EC-deoksyglukozą albo z FDG (Fig. 74 i Fig. 75).

Badania dystrybucji ^99mTc-EC-OG w tkankach

W przypadku zwierzęcego modelu raka sutka, 344 samice szczurów Fischera (150 ± 25 g) (Harlan Sprague-Dawley, Indianapolis, 1N) zostały podskórnie zaszczepione 0.1 ml komórek nowotworu sutkowego z suspensji komórek nowotworowych linii 13762 (10⁶ komórek/szczura, jest to linia komórek nowotworowych specyficzna dla szczurów Fischera) w tylne kończyny, stosując igły rozmiaru „gauge 25. Badania przeprowadzano 14 do 17 dni po implantacji, kiedy guzy nowotworowe osiągnęły rozmiar około 1 cm średnicy. Szczury znieczulano ketaminą (10-15 mg/szczura, dootrzewnowo) przed przeprowadzeniem każdej procedury.

W przypadku zwierzęcego modelu raka płuca, każda pozbawiona grasicy naga mysz (20-25 g) była podskórnie zaszczepiona 0.1 mL komórek ludzkiego raka płuc z suspensji linii komórkowej A549 (10⁶ komórek/mysz) w tylne kończyny, stosując igły rozmiaru gauge 25. Badania przeprowadzano 17 do 21 dni po implantacji, kiedy guzy nowotworowe osiągnęły rozmiar około 0.6 cm średnicy.

W badaniach dystrybucji w tkankach, każde zwierzę otrzymywało dożylną iniekcję 10-20 •Ci (na szczura) albo 1-2 •Ci (na mysz) koniugatu ^mTc-EC-DG albo związku ^mTc-EC (n=3/punkt czasowy). Iniekcyjnie podana masa ^99mTc-EC-DG wynosiła 1 mg na szczura. W czasie: 0.5, 2 i 4 godziny po podaniu znaczników radioizotopowych gryzonie były uśmiercane, a wybrane tkanki były wycinane, ważone i zliczano ich radioaktywność. Biodystrybucja wskaźnika w każdej próbce była obliczana jako procent dawki nastrzykniętej na gram ciężaru mokrej tkanki (%ID/g). Ilorazy rozkładu gęstości zliczeń nowotwór/ tkanka nie-docelowa obliczano na podstawie odpowiednich wartości %ID/g. W porównaniu z ^99mTc-EC (Tabela 4) i z wolnym technetem (Tabela 9), w grupie ^99mTc-EC-DG ilorazy nowotwór/ tkanka rosły w funkcji czasu (Fig. 76- 80).

Badania obrazowania scyntygraficznego

Obrazy scyntygraficzne otrzymywano z zastosowaniem kamery gamma wyposażonej w niskoenergetyczny, równoległowiązkowy kolimator, w czasie 0.5, 2 i 4 godzin po dożylnym podaniu iniekcyjnym 100 •Ci wskaźnika radioizotopowego. Zastosowano model zwierzęcy szczurów z nowotworem sutka. Nowotwór był dobrze uwidoczniony, w porównaniu z ^99mTc-EC (grupa kontrolna) (Fig. 81). Wstępne badania kliniczne przeprowadzono na 5 pacjentach (3 nowotwory mózgu i 2 przypadki choroby płuc). Obrazy otrzymywano w 1-2 godziny po podaniu. ^99mTc-EC-DG potrafił wykazać różnicę pomiędzy nowotworami łagodnymi a złośliwymi. Na przykład, złośliwy gwiaździak wykazał wysokie wychwyty (Fig. 82A, 82B, 83A, i 83B). Łagodny oponiak wykazał niewielki wychwyt w porównaniu ze złośliwym oponiakiem (Fig. 84A i Fig. 84B). Niewielki wychwyt obserwowano u pacjenta z TB (Fig. 85A i 85B), ale znaczny wychwyt obserwowano w raku płuca (Fig. 86A, 86B i 86C).

Odnośniki

Następujący spis odnośników literaturowych, w zakresie, w jakim przedstawiają one przykładowe szczegóły dotyczące sposobu postępowania lub inne szczegóły, stanowiące uzupełnienie do tutaj przedstawionych, przytacza się tutaj wyłącznie w charakterze odnośnika.

Abrams, Juweid, Tenkate „Technetium-99m-human polyclonal IgG radiolabeled via the hydrazino nicotinamide derivative for imaging focal sites of infection in rats, J. Nucl. Med., 31:2022-2028, 1990.

Bakker, Krenning, Breeman, Kiper, Kooij, Reubi, Klijn, Visser, Docter, Lamberts „Receptor scintigraphy with a radioiodinated somatostatin analogue: radiolabeling, purification, biologie activity and in vivo application in animals, J. Nucl. Med., 31:1501-1509, 1990.

Blakenberg, Katsikis, Tait et at., „In vivo detection and imaging of phosphatidylserine expression during programmed cell death, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:6349-6354, 1998.

PL 212 211 B1

Blakenberg, Katsikis, Tait, Davis, Naumovski, Ohtsuki, Kopiwoda, Abrams, Strauss „Imaging of apoptosis (programmed cell death) with ^99mTc annexin V., J. Nucl. Med., 40:184-191, 1999.

Blondeau, Berse, Gravel „Dimerization of an intermediate during the sodium in Iiquid ammonia reduction of L-thiazolidine-4-carboxylic acid, Can. J. Chem, 45:49-52, 1967.

Bolhuis, Lamers, Goey et al., „Adoptive immunotherapy of ovarian carcinoma with Bs-MAb targeted lymphocytes. A multicenter study, Int. J. Cancer, 7:78-81, 1992.

Britton and Granowska „Imaging of tumors, in tomography in nuclear medicine, Proceedings of an International Symposium, Vienna, Austria, IAEA, 91-105, 1996.

Bush, Jenkins, Alit, Beale, Bena, Dembo, Pringle „Definitive evidence for hypoxic cells influencing cure in cancer therapy, Br. J. Cancer, (Suppl. III) 37:302-306, 1978.

Butterfield, Fuji, Ladd, Snow, Tan, Toner „Segmented chelating polymers as imaging and therapeutic agents, Patent Stanów Zjednoczonych Ameryki US-4730968, March 24, 1998.

Campbell, Jones, Foulkes, Trowsdale „Folate-binding protein is a marker for ovarian cancer, Cancer Res., 51:5329-5338, 1991.

Canevari, Miotti, Bottero, Valota, Colnaghi „Ovarian carcinoma therapy with monoclonal antibodies, Hybridoma, 12:501-507, 1993.

Cherif, Yang, Tansey, Kim, Wallace „Synthesis of [¹⁸F]fluoromisonidazole, Pharm. Res., 11:466-469, 1994.

Coenen and Stocklin „Evaluation of radiohalogenated amino acid analogues as potential tracers for PET and SPECT studies of protein synthesis, Radioisot. Klinik Forschung, 18:402-440, 1988.

Coney, Mezzanzanica, Sanborn, Casalini, Colnaghi, Żurawski „Chimeric munne-human antibodies directed against folate binding receptor are eff~cient mediators of ovarian carcinoma cell killing, Cancer Res., 54:2448-2455, 1994.

Davison, Jones, Orvig, Sohn „A new class of oxotechnetium(+5) chelate complexes containing a TcON2S2 Core, Inorg. Chem., 20:1629-1632, 1980.

Dickinson and Hiltner „Biodegradation of poly(%-amino acid) hydrogel. II. In vitro, J. Biomed.

Mater. Res., 15:591, 1981.

Dische „A review of hypoxic-cell radiosensitizadon, Int. J. Radiat. Oncol Biot. Phys., 20:147-152,

1991.

Fanciulli, Paggi, Bruno, et al., Glycolysis and growth rate in normal and in hexokinasetransfected NIH-3T3 cells, OncoL Res. 6(9):405-9, 1994.

Franklin, Waintrub, Edwards, Christensen, Prendegrast, Woods, Bunn, Kolhouse „New antilung-cancer antibody cluster 12 reacts with human folate receptors present on adenocarcinoma, Int.

J. Cancer-Supplement, 8:89-95, 1994.

Gatenby, Kessler, Rosenblum, Coia, Moldofsky, Hartz, Broder ,,Oxygen distribution in squamous cell carcinoma metastases and its relationship to outcome of radiation therapy,” Int. J. Radiat. OneoL Biol. Phys., 14:831-838, 1988.

Ginobbi, Geiser, Ombres, Citro „Folie acid-polylysine carrier improves efficacy of c-myc antisense oligodeoxynucleotides on human melanoma (M14) cells, Anticancer Res., 17:29-35, 1997a.

Goh, Pricher, Lobie „Growth hormone promotion of tublin polymerization stablizes the microtubule network and protects against colchicine-induced apoptosis, Endocrinology, 139:4364-4372,

1998.

Goldsmith „Receptor imaging: Competitive or complementary to antibody imaging, Sem. Nucl.

Med., 27:85-93, 1997.

Goldsmith, Macapinlac, O'Brien „Somatostatin receptor imaging in lymphoma, Sem. Nud Med.,

25:262-271, 1995.

Gray, Conger, Elbert, Morsney, Scold „The concentration of oxygen dissolved in tissues at the time of irradiation as a factor in radiotherapy, Br. J. Radiol, 26:638-648, 1953.

Hall „The oxygen effect and reoxygenation, In. E. J. Hall (ed.) Radiobiology for the radiobiologist, 3rd Edition, J.B. Lippincott Co., Philadelphia, PA, 137-160, 1988.

Harada, Smith, Smith et al., Insulin-induced egr-1 and c-fos expression in 32D cells requires insulin receptor, Shc, and mitogen-activated protein kinase, but not insulin receptor substrate-1 and phosphatidylinositol 3-kinase activation, J. Biol. Chem. 271(47):30222-6, 1996.

Hay, Wilson, Moselen, Palmer, Denny „Hypoxia-selective antitumor agents. Bis(nitroimidazolyl) aIkanecarboxamides: a new class of hypoxia-selective cytotoxins and hypoxic cell radiosensitizers, J. Med. Chem., 37:381-391, 1994.

PL 212 211 B1

Hermann, Patel. Adaptive recognition by nucleic acid aptamers, Science, 287(5454):820-5,

2000.

Holm, Hansen, Hoier-Madsen, Sondergaard, Bzorek „Folate receptor of human mammary adenocarcinoma, APMIS, 102:413-419, 1994.

Hsueh and Dolnick „Altered folate-binding protein mRNA stability in KB cells grown in folatedeficient medium, Biochem. Pharmacol., 45:2537-2545, 1993.

Imbert ,,Discovery of podophylIotoxins, Biochimie, 80:207-222, 1998.

Jamar, Stoffel, Van Nerom, et al., „Clinical evaluation of Tc-99m L,L-ethylenedicysteine, a new renal tracer, in transplanted patients, J. Nucl. Med., 34:129P, 1993a.

Jamar, Van Nerom, Verbruggen, et al., „Clearance of the new tubular agent Tc-99m L,L-ethylenedicysteine: Estimation by a simplified method, J. Nucl. Med., 34:129P, 1993b.

Kabasakal. Technetium-99m ethylene dicysteine: a new renal tubular function agent, Eur. J. Nucl. Med. 27(3):351-7, 2000.

Kikukawa, Toyama, Katayama, et al., Early and delayed Tc-99m ECD brain SPECT in SLE patients with CNS involvement, Ann. Nucl. Med. 14(1):25-32, 2000.

Koh, Rasey, Evans, Grierson, Lewellen, Graham, Krohn, Griffin „Imaging of hypoxia in human tumors with [18F]fluoromisonidazole, Int. J. Radiat. Oncol Biol Phys., 22:199-212, 1992.

Kranz, Patrick, Brigle, Spinella, Roy „Conjugates of folate and anti-T-cell-receptor antibodies specifically target folate-receptor-positive tumor cells for lysis, Proc. Natl Acad. Sci., 92:9057-9061,

1995.

Krenning, Kwokkeboom, Bakker, et al., „Somatostatin receptor scintigraphy with [In-111-DTPA-D-Phe] and [I-123-Tyr]-octretide: The Rotterdam experience with more than 1000 patients, Eur. J. Nucl. Med., 7:716-731, 1995.

Lambert, Bakker, Reubi, Krenning „Somatostatin receptor imaging in vivo Iocalization of tumors with a radiolabeled somatostatin analog, J. Steoid. Biochem. Mol Biol., 37:1079-1082, 1990.

Leamon and Low ,,Cytotoxicity of momordin-folate conjugates in cultured human cells, J. Biol. Chem., 267:24966-24971, 1992.

Leamon and Low „Delivery of macromolecules into Iiving cells: a method that exploits folate receptor endocytosis, Proc. Natl Acad. Sci., 88:5572-5576, 1991.

Leamon, Pastan, Low „Cytotoxicity of folate-pseudomonas exotoxin conjugates toward tumor cells, J. Biol Chem., 268:24847-24854, 1993.

Lee and Low „Delivery of Iiposomes into cultured KB cells via folate receptor-mediated endocytosis, J. Biol. Chem., 269:3198-3204, 1994.

Lennon, Martin, Cotter „Dose-dependent induction of apoptosis in human tumor cell Iines by widely diverging stimuli, Cell Prolif., 24:203-214, 1991.

Lu „Antimitotic agents, In: Foye, WO. Ed. „Cancer chemotherapeutic agents, Washington, DC: American Chemical Society, 345-368, 1995.

Martin, Caldwell, Rasey, Grunbaum, Cerqueia, Krohn Enhanced binding of the hypoxic cell marker [¹⁸F]fluoromisonidazole in ischemic myocardium, J. Nucl. Med., 30:194-201, 1989.

Mathias, Hubers, Trump, Wang, Luo, Waters, Fuchs, Low, Green Synthesis of Tc-99m-DTPA-folate and preliminary evaluation as a folate-receptor-targeted radiopharmaceutical (Abstract),

J. Nucl. Med., (Supplement); 38:87P, 1997a.

Mathias, Wang, Waters, Turek, Low, Green Indium-111-DTPA-folate as a radiopharmaceutical for targeting tumor-associated folate binding protein (Abstract), J. Nucl. Med., (Supplement) 38:133P, 1997.

Mathias, Wang, Lee, Waters, Low, Green Tumor-selective radiopharmaceudcal targeting via receptor-mediated endocytosis of Gallium-67-deferoxamine-folate, J. Nucl. Med., 37:1003-1008,

1996.

Moller, Benecke, Flier. Biologie activities of naturally occurring human insulin receptor mutations. Evidence that metabolic effects of insulin can be mediated by a kinase-deficient insulin receptor mutant, J. Biol. Chem. 15;266(17):10995-1001, 1991.

Mochizuki, Inaki, Takeymoto „Synthesis of polygIutamates containing 5-substituted uracil moieties, Nucl.eic Acids Res., 16:121-124, 1985.

Nordsmark, Overgaard, Overgaard „Pretreatment oxygenation predicts radiation response in advanced squamous cell carcinoma of the head and neck, Radiother Oncol, 41:31-39, 1996.

PL 212 211 B1

Offield, Jetton, Labosky, et al, PDX-1 is required for pancreatic outgrowth and differentiation of the rostral duodenum, Development. 122(3):983-95, 1996.

Orr, Kreisler, Kamen „Similarity of folate receptor expression in UMSCC 38 cells to squamous celi carcinoma differentiation markers, J. Natl. Cancer. Inst., 87:299-303, 1995.

Patrick, Kranz, van Dyke, Roy „Folate receptors as potendal therapeutic targets in choroid plexus tumors of SV40 transgenic mice, J. NeurooncolL, 32:111-123, 1997.

Piper, McCaIeb, Montgomery „A synthetic approach to poly(glutamyl) conjugates of metotreksate, J. Med. Chem., 26:291-294, 1983.

Popovici, Mungiu, Trandafirescu, et al., The influence of some antibiotics on hexokinase and pyruvate-kinase activity in the rat Iiver and kidney”', Arch. Int. Pharmacodyn. Ther. 193(1):80-6, 1971.

Raderer, Becherer, Kurtaran, Angelberger, Li, Leimer, Weinlaender, Kornek, Kletter, Scheithauer, Virgolini Comparison of Iodine-123-vasoactive intestinal peptide receptor scintigraphy and Indium-Ill CFT-102 immunoscintigraphy, J. Nucl.. Med., 37:1480-1487, 1996.

Raffauf, Farren, Ullyot Colchicine. Derivatives of trimethylcolchicinic acid, J. Am. Chem. Soc., 75:5292-5294, 1953.

Rasey, Koh, Griesohn, Grunbaum, Krohn Radiolabeled fluoromisonidazole as an imaging agent for tumor hypoxia, Int. J. Radiat Oncol. Biol Phys, 17:985-991, 1989.

Rasey, Nelson, Chin, Evans, Grunbaum Characterization of the binding of Iabeled fluoromisonidazole in cells in vitro, Radiat. Res., 122:301-308, 1990.

Ratner and Clarke „The action of formaldehyde upon cysteine, J. Am Chem. Soc., 59:200-206,

1937.

Reubi, Krenning, Lamberts etat. „In vitro detection of somatostatin receptors in human tumors,

Metabolism, 41:104-110 (suppl 2), 1992.

Rogers, Bachorik, Nunn. Neomycin effects on glucose transport by rat smali intestine, Digestion. 1(3):159-64, 1968.

Ross, Chaudhuri, Ratnam „Differential regulation of folate receptor isoforms in normal and malignant tissue in vivo and in established cell lines, Cancer, 73:2432-2443, 1994.

Rowinsky, Cazenave, Donehower „Taxol: a novel investigational antimicrotuble agent, J. Natl. Cancer Institute, 82(15):1247-1259, 1990.

Seabold, Gurll, Schurrer, Aktay, Kirchner, Comparison of ^99mTc-MethoxyisobutyI Isonitrile and ²⁰¹ Tl 131

Scintigraphy for Detection of Residual Thyroid Cancer After ¹³¹I Ablative Therapy, J. Nucl.. Med., 40(9):1434-1440,1999.

Shankar, Zhu, Baron et al.,Glucosamine infusion in rats mimics the beta-cell dysfunction of non-insulin-dependent diabetes mellitus, Metabolism. 47(5):573-7, 1998.

Stella and Mathew „Derivatives of taxol, pharmaceutical compositions thereof and methods for preparation thereof, Patent Stanów Zjednoczonych Ameryki US-4960790, October 2, 1990.

Surma, Wiewiora, Linieeki „Usefulness of Tc-99m-N,N'-ethylene-1-dicysteine complex for dynamic kidney investigations, Nucl.. Med. Comm., 15:628-635, 1994.

Tait and Smith „Site-specific mutagenesis of annexin V: role of residues from Arg-200 to Lys-207 in phospholipid binding, Arch. Biochem. Biophys., 288:141-144, 1991.

Valk, Mathis, Prados, Gilbert, Budinger „Hypoxia in human gliomas: Demonstration by PET with

[¹⁸F]fluoromisonidazole,” J. Nucl.. Med., 33: 2133-2137, 1992.

Van Nerom, Bormans, Bauwens, Vandecruys, De Roo, Verbruggen „Comparative evaluation of Tc-99m L,L-ethylenedicysteine and Tc-99m MAG3 in volunteers, Eur. J. Nucl. Med., 16:417, 1990.

Van Nerom, Bormans, De Roo, et al., „First experience in healthy volunteers with Tc-99m-L,L-ethylenedicysteine, a new renal imaging agent, Eur. J. Nucl.. Med., 20:738-746, 1993.

Verbruggen, Nosco, Van Nerom et al., „Tc-99m-L,L-ethylenedicysteine: A renal imaging agent.

I. Labelling and evaluation in animals, J. Nucl. Med., 33:551-557, 1992.

Verbruggen, Nosco, Van Nerom, Bormans, Adriacns, De Roo „Evaluation of Tc-99m-L,L-ethylenedicysteine as a potential alternative to Tc-99m MAG3, Eur. J. Nucl.. Med., 16:429, 1990.

Villevalois-Cam, Tahiri, Chauvet, et al., Insulin-induced redistribution of the insulin-like growth factor II/mannose 6-phosphate receptor in intact rat liver, J. Cell. Biochem. 77(2):310-22, 2000.

Virgolini, Raderer, Kurtaran „Vasoactive intestinal peptide (VIP) receptor imaging in the Iocalization of intestinal adenocarcinomas and endocrine tumors, N. Eng. J. Med., 331:1116-1121, 1994.

PL 212 211 B1

Wang, Lee, Mathias, Green, Low „Synthesis, purification, and tumor cell uptake of Ga-67 deferoxamine-folate, a potential radiopharmaceutical for tumor imaging, Bioconjugate Chem., 7:56-62, 1996.

Wang, Luo, Lantrip, Waters, Mathias, Green, Fuchs, Low „Design and synthesis of [¹¹¹In]DTPA-folate for use as a tumor-targeted radiopharmaceutical, Bioconjugate Chem., 8:673-679, 1997.

Wang, Wang, Ichijo, Giannakakou, Foster, Fojo, Wimalasena „Microtubule-interfering agents activate c-Jun N-terminal kinasae/stress-activated protein kinase through both Ras and apoptosis signal-regulating kinase pathways, J. Biol Chem., 273:4928-4936, 1998.

Weitman, Frazier, Kamen „The folate receptor in central nervous system malignancies of childhood, J. Neuro-Oncology, 21:107-112, 1994.

Weitman, Lark, Coney et al., „Distribution of folate GP38 in normal and malignant cell Iines and tissues, Cancer Res., 52:3396-3400, 1992a.

Weitman, Weinberg, Coney, Zurawski, Jennings, Kamen Cellular Iocalization of the folate receptor: potential role in drug toxicity and folate homeostasis, Cancer Res., 52:6708-6711, 1992b.

Wester, Herz, Weber, Heiss, Schmidtke, Schwaiger, Stocklin Synthesis and radiopharmacology of -O(2-[¹⁸F]fluoroethyl)-L-Tyrosine for tumor imaging, J. Nucl. Med., 40:205-212, 1999.

Westerhof, Jansen, Emmerik, Kathmann, Rijksen, Jackman, Schornagel „Membrane transport of natural folates and antifolate compounds in murine L1210 leukemia cells: Role of carrier- and receptor- mediated transport systems, Cancer Res., 51:5507-5513, 1991.

Yang, Wallace, Cherif, Li, Gretzer, Kim, Podoloff ,,Development of F-18-labeled fluoroerythronitroimidazole as a PET agent for imaging tumor hypoxia, Radiology, 194:795-800, 1995.

Yoshino, Takeda, Sugimoto, et al., Differential effects of troglitazone and D-chiroinositol on glucosamine-induced insulin resistance in vivo in rats, Metabolism. 48(11):1418-23,1999.

Claims (24)

1. Kompozycja do wytwarzania scyntygraficznego środka obrazującego zawierająca etylenodicysteinę skoniugowaną z Iigandem naprowadzającym, znamienna tym, że Iigandem naprowadzającym jest środek naśladujący glukozę wybrany spośród dezoksyglukozy, glukozy, glukozaminy, neomycyny, kanamycyny, gentamycyny, paromycyny, amikacyny, tobramycyny, netilmycyny, rybostamycyny, sysomycyny, mikromycyny, liwidomycyny, dibekacyny, isepamycyny i astromycyny.

2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że Iigand naprowadzający może być skoniugowany z etylenodicysteiną poprzez jedno albo poprzez obydwa ugrupowania kwasowe etylenodicysteiny.

3. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera ponadto łącznik sprzęgający etylenodicysteinę z Iigandem naprowadzającym.

4. Kompozycja według zastrz. 3, znamienna tym, że łącznik jest rozpuszczalnym w wodzie peptydem, aminokwasem, poli(aminokwasem), kwasem glutaminowym, poli(kwasem glutaminowym), kwasem asparaginowym, poli(kwasem asparaginowym), octanem bromoetylu, etylenodiaminą albo lizyną.

5. Kompozycja do obrazowania scyntygraficznego zawierająca etylenodicysteinę skoniugowaną z Iigandem naprowadzającym, znamienna tym, że zawiera ponadto znacznik radionuklidowy, przy czym etylenodicysteina tworzy chelat N2S2 z tym znacznikiem radionuklidowym, zaś Iigandem naprowadzającym jest środek naśladujący glukozę wybrany spośród dezoksyglukozy, glukozy, glukozaminy, neomycyny, kanamycyny, gentamycyny, paromycyny, amikacyny, tobramycyny, netilmycyny, rybostamycyny, sysomycyny, mikromycyny, liwidomycyny, dibekacyny, isepamycyny i astromycyny.

6. Kompozycja według zastrz. 5, znamienna tym, że Iigand naprowadzający może być skoniugowany z etylenodicysteiną poprzez jedno albo poprzez obydwa ugrupowania kwasowe etylenodicysteiny.

7. Kompozycja według zastrz. 5, znamienna tym, że radionuklidem jest ^99mTc, ¹⁸⁸Re, ¹⁸⁶Re, ¹⁸³Sm, ¹⁶⁶Ho, ⁹⁰Y, ⁸⁹Sr, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ¹¹¹In, ¹⁸³Gd, ⁵⁹Fe, ²²⁵Ac, ²¹²Bi, ²¹¹At, ⁶⁴Cu albo ⁶²Cu.

8. Kompozycja według zastrz. 7, znamienna tym, że radionuklidem jest ^99mTc.

9. Kompozycja według zastrz. 5, znamienna tym, że ma postać ^99mTc-EC-neomycyny.

10. Kompozycja według zastrz. 5, znamienna tym, że ma postać ^99mTc-EC-dezoksyglukozy.

PL 212 211 B1

11. Kompozycja według zastrz. 5, znamienna tym, że ma postać ^99mTc-EC-glukozaminy.

12. Kompozycja według zastrz. 5, znamienna tym, że zawiera ponadto łącznik sprzęgający etylenodicysteinę z Iigandem naprowadzającym.

13. Kompozycja według zastrz. 12, znamienna tym, że łącznik jest rozpuszczalnym w wodzie peptydem, aminokwasem, poli(aminokwasem), kwasem glutaminowym, poli(kwasem glutaminowym), kwasem asparaginowym, poli(kwasem asparaginowym), octanem bromoetylu, etylenodiaminą albo lizyną.

14. Sposób syntezy znakowanego radionuklidem koniugatu etylenodicysteiny z Iigandem naprowadzającym do obrazowania, znamienny tym, że najpierw otrzymuje się Iigand naprowadzający stanowiący środek naśladujący glukozę wybrany spośród dezoksyglukozy, glukozy, glukozaminy, neomycyny, kanamycyny, gentamycyny, paromycyny, amikacyny, tobramycyny, netilmycyny, rybostamycyny, sysomycyny, mikromycyny, liwidomycyny, dibekacyny, isepamycyny i astromycyny, następnie miesza się ten Iigand naprowadzający z etylenodicysteiną do otrzymania koniugatu etylenodicysteiny z Iigandem naprowadzającym, po czym uzyskany koniugat etylenodicysteiny z Iigandem naprowadzającym miesza się z radionuklidem i z czynnikiem redukującym do utworzenia znakowanego radionuklidem koniugatu etylenodicysteiny z Iigandem naprowadzającym, przy czym etylenodicysteina tworzy z radionuklidem chelat N2S2.

15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że jako czynnik redukujący stosuje się jon ditioninowy S₂O₄ ^2-, jon cynowy (II) Sn²⁺ lub jon żelazowy (II) Fe²⁺.

16. Zastosowanie kompozycji zawierającej znakowany radionuklidem koniugat etylenodicysteiny z Iigandem naprowadzającym do wytwarzania środków farmaceutycznych do obrazowania nowotworu albo miejsca infekcji, przy czym Iigand naprowadzający stanowiący środek naśladujący glukozę jest wybrany spośród dezoksyglukozy, glukozy, glukozaminy, neomycyny, kanamycyny, gentamycyny, paromycyny, amikacyny, tobramycyny, netilmycyny, rybostamycyny, sysomycyny, mikromycyny, liwidomycyny, dibekacyny, isepamycyny i astromycyny.

17. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że obszarem obrazowania jest nowotwór.

18. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że obszarem obrazowania jest obszar infekcji.

19. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że obszarem obrazowania jest rak sutka, rak jajnika, rak prostaty, śluzówka macicy, serce, płuco, mózg, wątroba, rak folianowopozytywny, rak ER(+), śledziona, trzustka lub jelito.

20. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że radionuklidem jest ^99mTc.

21. Zestaw do wytwarzania preparatów radiofarmaceutycznych, znamienny tym, że obejmuje szczelnie zamknięty pojemnik, taki, jak torba, zawierający uprzednio wyznaczoną ilość kompozycji koniugatu etylenodicysteiny z Iigandem naprowadzającym oraz wystarczającą ilość czynnika redukującego do znakowania tego koniugatu za pomocą wybranego radionuklidu, przy czym Iigandem naprowadzającym jest środek naśladujący glukozę wybrany spośród dezoksyglukozy, glukozy, glukozaminy, neomycyny, kanamycyny, gentamycyny, paromycyny, amikacyny, tobramycyny, netilmycyny, rybostamycyny, sysomycyny, mikromycyny, liwidomycyny, dibekacyny, isepamycyny i astromycyny.

22. Zestaw według zastrz. 21, znamienny tym, że radionuklidem jest ^99mTc.

23. Zestaw według zastrz. 21 albo 22, znamienny tym, że koniugat etylenodicysteiny z Iigandem naprowadzającym zawiera ponadto łącznik sprzęgający etylenodicysteinę z Iigandem naprowadzającym.

24. Zestaw według zastrz. 23, znamienny tym, że łącznikiem jest rozpuszczalny w wodzie peptyd, kwas glutaminowy, kwas poligIutaminowy, kwas asparaginowy, kwas poliasparaginowy, octan bromoetylu, etylenodiamina albo lizyna.