CN1438899A - 乙二半胱氨酸(ec)－药物缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明总的来说提供了采用与乙二半胱氨酸(EC)螯合的99mTC的新标记策略。EC与多种配体缀合并螯合至99mTC以用作组织特异性疾病的显像剂。本发明的药物缀合物还可用作预测工具或作为将治疗剂送递至哺乳动物体内特定部位的工具。还提供了用于组织特异性疾病显像的试剂盒。

Description

乙二半胱氨酸(EC)-药物缀合物
发明背景
政府对本发明不享有权利。
1.发明领域
本发明总地涉及标记、放射显像和化学合成领域。更具体地说，本发明涉及放射性标记靶配体的策略。本发明进一步涉及在肿瘤显像和组织特异性疾病显像中使用那些放射性标记配体的方法。
2.相关技术的描述
开发更多的肿瘤特异性放射性药物广泛确定了闪烁肿瘤显像的改进。由于其肿瘤特异性更强，放射性标记配体以及放射性标记抗体已在闪烁显像检测肿瘤方面开辟了新纪元，并且接受了广泛的临床前开发和评估(Mathias等，1996，1997a，1997b)。放射性核素显像方式(正电子发射体层摄影，PET；单光子发射计算体层摄影，SPECT)是标识放射性核素标记的放射性示踪剂的位置和浓度的诊断性横断面显像技术。尽管CT和MRI提供了关于肿瘤位置和范围的重要的解剖学信息，这些显像方式不能充分地区分侵袭性病变与水肿、辐射坏死、分级或神经胶质增生。PET和SPECT可通过测定代谢活性而用于定位和表征肿瘤。
临床上期望开发新的肿瘤缺氧剂，以检测原发病变和转移病变以及预测放射有效性和复发时间。目前的显像方式均不能准确地测量缺氧，因为肿瘤缺氧的诊断需要病理学检查。在至少各被治疗肿瘤中缺氧的基线都不知道的情况下，经常难于预测治疗缺氧肿瘤的结果。虽然Eppendorf极谱氧微电极可以测量肿瘤中的氧压力，这种技术是侵入性的并且需要技术熟练的操作者。此外，这种技术只能用于可及的肿瘤(例如头部和颈部，宫颈)，并且需要多次读数。因此，准确而简便的测量肿瘤缺氧的方法会对选择患者有用。但是，肿瘤与正常组织摄取之比会因所用的放射性药物而不同。所以，当将新的放射性药物引入临床实践时，要将肿瘤与正常组织摄取之比与金标准Eppendorf电极测量缺氧相关联。
[18F]FMISO已用于诊断头部和颈部肿瘤、心肌梗塞、炎症和脑缺血(Martin等，1992；Yeh等，1994；Yeh等，1996；Liu等，1994)。肿瘤与正常组织摄取之比用作基线以评估肿瘤缺氧(Yet等，1996)。尽管已清楚证实了使用[18F]FMISO确定的肿瘤缺氧，将新的显像剂引入临床实践取决于某些其它因素，如是否易于获得和同位素成本。尽管已清楚证实了使用[18F]FDG进行的肿瘤代谢显像，将新的显像剂引入临床实践取决于某些其它因素，如是否易于获得和同位素成本。[18F]氟脱氧葡萄糖(FDG)已用于诊断肿瘤、心肌梗塞和神经系统疾病。此外，PET放射合成必须迅速，因为正电子同位素的半衰期很短。18F化学性质也很复杂，它在不同的分子中并不是可重复的。所以，理想的是发展一种可与各种药物缀合的螯合剂。优选的同位素会是99mTc，由于其成本低($0.21/mCi，相对于18F的$50/mCi)并且能量低(140Kev，相对于18F的571Kev)。从99Mo发生器可容易地获得99mTc。由于其良好的物理特性以及极其低廉的价格，优选用99mTc标记放射性药物。
使用氮和硫螯合物已用99mTc标记了几种化合物(Blondeau等，1967；Davison等，1980)。已知双-氨基乙硫醇四齿配位体，亦称作二氨基二硫醇化合物，在氧代锝基团与两个硫醇硫原子和两个胺氮原子有效结合的基础之上形成非常稳定的Tc(V)O络合物。99mTc-L，L-乙二半胱氨酸(ethylenedicysteine)(99mTc-EC)是一种新近成功的N2S2螯合物的例子。EC可以用99mTc容易和高效地标记，获得高的放射化学纯度和稳定性，并且通过主动小管运输通过肾脏排泄(Surma等，1994；Van Neron等，1990，1993；Verbruggen等，1990，1992)。EC的其它应用是与镓-68(一种正电子发射体，t1/2＝68分钟)螯合用于PET，以及与钆、铁或锰螯合用于磁共振成象(MRI)。开发了99mTc-EC-新霉素和99mTc-EC-脱氧葡萄糖并评估了其在肿瘤表征方面的潜在用途。
发明概述
本发明克服了现有技术的这些和其它缺陷，提供了一种新的导向组织用于显像的放射性标记策略。本发明提供了放射性标记的组织特异性配体，以及制备放射性标记配体和使用其显示组织特异性疾病影像的方法。
本发明提供了用于组织特异性疾病显像的组合物。本发明的显像组合物一般包括与乙二半胱氨酸螯合的放射性核素标记以及与乙二半胱氨酸在其一条或两条酸臂之上缀合的组织特异性配体。乙二半胱氨酸与放射性核素标记形成N2S2螯合物。当然，螯合的化合物在放射性核素与螯合化合物之间会包含离子键。术语“EC-组织特异性配体缀合物”、“EC-衍生物”和“EC-药物缀合物”在本文中可互换使用，指未标记的乙二半胱氨酸-组织特异性配体化合物。本文所用的术语“缀合物”指共价键合的化合物。
乙二半胱氨酸是一种双-氨基乙硫醇(BAT)四齿配位体，亦称为二氨基二硫醇(DADT)化合物。已知这种化合物在氧代锝基团与两个硫醇硫原子和两个胺氮原子有效结合的基础之上形成非常稳定的Tc(V)O络合物。已知99mTc标记的二乙酯(99mTc-L，L-ECD)是一种脑药剂。99mTc-L，L-乙二半胱氨酸(99mTc-L，L-EC)是其最具极性的代谢产物，并发现它在尿中迅速有效地排泄。因此99mTc-L，L-EC已被用作肾功能药剂(Verbruggen等，1992)。
组织特异性配体是这样一种化合物，当引入哺乳动物或患者体内时，将特异性地与特定类型的组织结合。预计本发明的组合物可以包括实际上任何已知的组织特异性化合物。优选与本发明一起应用的组织特异性配体是抗癌剂、DNA拓扑异构酶抑制剂、抗代谢物、肿瘤标记、叶酸受体引导配体、肿瘤凋亡细胞引导配体、肿瘤缺氧引导配体、DNA嵌入剂、受体标记、肽、核苷酸、器官特异性配体、抗微生物剂如抗生素或抗真菌剂、谷氨酸五肽或模拟葡萄糖的药剂。模拟葡萄糖的药剂也可称为糖类”。
优选的抗癌剂包括氨甲蝶呤、阿霉素、他莫昔芬、紫杉醇、托泊替堪、LHRH、丝裂霉素C、依托泊甙、tomudex、鬼臼毒素、米托蒽醌、喜树碱、秋水仙碱、内抑素(endostatin)、氟达拉滨和吉西他滨。优选的肿瘤标记包括PSA、ER、PR、AFP、CA-125、CA-199、CEA、干扰素、BRCA1、环磷酰胺(cytoxan)、p53、VEGF、整联蛋白、内抑素、HER-2/neu、反义标记或单克隆抗体。预计任何其它已知的肿瘤标记或任何单克隆抗体会有效地与本发明一起应用。优选的叶酸受体引导配体包括叶酸、氨甲蝶呤和tomudex。优选的肿瘤凋亡细胞或肿瘤缺氧引导配体包括膜联蛋白V、秋水仙碱、硝基咪唑、丝裂霉素或甲硝唑。优选的抗微生物剂包括氨苄西林、阿莫西林、青霉素、头孢菌素、克林霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、那他霉素、萘夫西林、利福平、四环素、万古霉素、博来霉素和多西环素用于革兰氏阳性和阴性细菌；以及两性霉素B、金刚烷胺、制霉菌素、酮康唑、多粘菌素、阿昔洛韦和更昔洛韦用于真菌。优选的模拟葡萄糖的药剂，或糖类，包括新霉素、卡那霉素、庆大霉素、巴龙霉素、阿米卡星、妥布霉素、奈替米星、核糖霉素、西索米星、小诺米星(micromicin)、利维霉素、地贝卡星、异帕米星、阿司米星、氨基糖甙类、葡萄糖或葡糖胺。
在某些技术方案中，在乙二半胱氨酸与组织特异性配体之间必需包括接头。通常接头用于增加药物在水溶液中的溶解度，并将药物亲和性的改变降至最低。尽管预计实际上任何会增加组合物水溶性的接头均可与本发明一起应用，接头通常是聚-氨基酸，一种水溶性肽，或单一氨基酸。例如，当组织特异性配体或药物上的官能基团是脂族-OH或酚-OH，如对于雌二醇、托泊替堪、紫杉醇或雷洛昔芬、依托泊甙，接头可以是聚谷氨酸(MV约750至约15,000)、聚-天冬氨酸(MV约2,000至约15,000)、乙酸溴乙酯、谷氨酸或天冬氨酸。当药物官能基团是脂族-NH2或芳族-NH2或肽时,如在阿霉素、丝裂霉素C、内抑素、膜联蛋白V、LHRH、奥曲肽和VIP中，接头可以是聚谷氨酸(MV约750至约15,000)、聚-天冬氨酸(MV约2,000至约15,000)、谷氨酸或天冬氨酸。当药物官能基团是羧酸或肽时，如在氨甲蝶呤或叶酸中，接头可以是乙二胺或赖氨酸。
尽管优选用于显像的放射性核素是99mTc，预计其它放射性核素可以螯合至本发明的EC-组织特异性配体缀合物、或EC-药物缀合物，特别用作治疗。例如，其它有用的放射性核素是188Re、186Re、153Sm、166Ho、90Y、89Sr、67Ga、68Ga、111In、153Gd和59Fe。这些组合物可用于将治疗性放射性核素送递至体内特定病变处，如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌(使用例如186/188Re-EC-叶酸)和头颈部癌症(使用例如186/188Re-EC-硝基咪唑)。
本发明的具体技术方案包括99mTc-EC-膜联蛋白V、99mTc-EC-秋水仙碱、99mTc-EC-硝基咪唑、99mTc-EC-谷氨酸五肽、99mTc-EC-甲硝唑、99mTc-EC-叶酸、99mTc-EC-氨甲蝶呤、99mTc-EC-tomudex、99mTc-EC-新霉素、99mTc-EC-卡那霉素、99mTc-EC-氨基糖甙类、(葡糖胺、EC-脱氧葡萄糖)、99mTc-EC-庆大霉素和99mTc-EC-妥布霉素。
本发明进一步提供了合成放射性标记的乙二半胱氨酸药物缀合物或衍生物用于显像或治疗应用的方法。所述方法包括获得组织特异性配体，将配体与乙二半胱氨酸(EC)混合以得到EC-组织特异性配体衍生物，和将EC-组织特异性配体衍生物与放射性核素和还原剂混合以得到放射性核素标记的EC-组织特异性配体衍生物。放射性核素通过N2S2螯合物与EC螯合。组织特异性配体直接或通过上述接头缀合至EC的一条或两条酸臂。还原剂优选连二亚硫酸离子、锡离子或亚铁离子。
本发明进一步提供了标记组织特异性配体用于显像、治疗应用或用于诊断或判断预后应用的方法。所述标记方法包括以下步骤：获得组织特异性配体，将组织特异性配体与乙二半胱氨酸(EC)混合以得到EC-配体药物缀合物，和将药物缀合物与99mTc在还原剂存在下反应从而在乙二半胱氨酸与99mTc之间形成N2S2螯合物。
为了实现该技术方案的目的，组织特异性配体可以是任何上述的或本文讨论的配体。还原剂可以是任何已知的还原剂，但优选连二亚硫酸离子、锡离子或亚铁离子。
在另一个技术方案中，本发明提供了哺乳动物体内部位的显像方法。所述显像方法包括以下步骤：施用有效诊断量的包含99mTc标记的乙二半胱氨酸-组织特异性配体缀合物的组合物并检测来自定位于该部位局部的99mTc的放射性信号。检测步骤通常在将组合物引入哺乳动物体内后约10分钟至约4小时进行。最优选检测步骤在将组合物注射入哺乳动物体内后约1小时进行。
在某些优选的技术方案中，所述部位是感染、肿瘤、心脏、肺、脑、肝、脾、胰腺、小肠或任何其它器官。肿瘤或感染可位于哺乳动物体内任何部位，但通常在乳腺、卵巢、前列腺、子宫内膜、肺、脑或肝。所述部位也可以是叶酸-阳性的癌症或雌激素-阳性的癌症。
本发明还提供了用于制备放射性药物制剂的试剂盒。所述试剂盒通常包括密封的小瓶或袋，或任何其它类型的合适容器，其中含有预定量的乙二半胱氨酸-组织特异性配体缀合物组合物和足量的还原剂以用99mTc标记缀合物。在某些情况下，乙二半胱氨酸-组织特异性配体缀合物组合物在乙二半胱氨酸与组织特异性配体之间还包括接头。组织特异性配体可以是特异性结合任何特定组织类型的任何配体，如本文所讨论的配体。当组合物中包括接头时，其可以是如本文描述的任何接头。
试剂盒的组分可以取任何适宜的形式，如液体、冷冻或干燥的形式。在优选的技术方案中，所述试剂盒组分以冻干形式提供。所述试剂盒还可包括抗氧化剂和/或清除剂。抗氧化剂可以是任何已知的抗氧化剂但优选维生素C。还可以有清除剂存在以结合剩余的放射性核素。最常见的商业化试剂盒含有葡庚糖酸盐作为清除剂。但是，葡庚糖酸盐不完全与通常的试剂盒成分发生反应，剩余大约10-15％。该剩余的葡庚糖酸盐会进入肿瘤并使显像结果偏斜。因此，本发明人优选使用EDTA作为清除剂，因为其更廉价且反应更完全。
本发明的另一方面是确定候选化合物治疗特定肿瘤的潜在有效性的预测方法。目前，大多数肿瘤在化疗中以“通常选用药物”治疗，而没有任何指示该药物是否对该特定肿瘤实际上有效，直到数月并花费了大量金钱之后。本发明的显像组合物可用于将特定药物以标记的EC-药物缀合物的形式送递至肿瘤部位，并且随后在数小时内使该部位显像以确定是否为特定药物。
在这方面，本发明的预测方法包括以下步骤：确定哺乳动物体内肿瘤的部位；获得显像组合物，其包括螯合至EC的放射性核素，而EC缀合至肿瘤特异性癌症化疗候选药物；将组合物施用于哺乳动物身体并使该部位显像以确定候选药物对抗肿瘤的有效性。通常，显像步骤在将组合物注射至哺乳动物体内之后大约10分钟至大约4小时内进行。优选显像步骤在将组合物注射至哺乳动物体内之后大约1小时内进行。
在预测组合物中待缀合至EC的癌症化疗候选药物可选自已知的癌症化疗药物。这种药物如表2所示。有许多已知对某些类型癌症具有特异性的抗癌剂。但是，并不是每一种针对特定类型癌症的抗癌剂在每个患者身上都有效。因此，本发明第一次提供了在花费许多时间和金钱进行治疗之前确定候选药物可能的有效性的方法。
本发明的另一个技术方案是用于制备闪烁显像剂的试剂。本发明的试剂包括组织特异性配体，其在体内对靶向部位的亲和性足以产生可由闪烁法检测到的影像，并且共价连接至99mTc结合部分。99mTc结合部分直接连到组织特异性配体上或通过上述接头连到配体上。99mTc结合部分优选是处于+4氧化态的99mTc与乙二半胱氨酸(EC)之间的N2S2螯合物。组织特异性配体直接或通过上述接头共价连接至EC的一条或两条酸臂。组织特异性配体可以是任何上述的配体。
附图简要说明
下列附图构成本说明书的一部分并被包括在内以进一步证实本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一幅或多幅并结合本文呈现的具体实施方案的详细描述将更好地理解本发明。
图1.99mTc-EC-叶酸的合成方案。
图2.99mTc-EC-MTX(氨甲蝶呤)的合成方案。
图3.99mTc-EC-TDX(tomudex)的合成方案。
图4.99mTc-EC和99mTc-EC-叶酸的生物分布研究。
图5.对99mTc-EC-叶酸肿瘤/肌肉和肿瘤/血液计数比的阻断研究。
图6A和6B.注射99mTc-EC-叶酸组与注射99mTc-EC组相比肿瘤的闪烁显像。
图7.EC-MN(甲硝唑)的合成方案。
图8A和图8B.对于EC-NIM，图8A显示了合成方案，而图8B显示了对其结构的1H-NMR证实结果。
图9.对99mTc-EC-MN、[18F]FMISO和[131I]IMISO的生物分布研究(肿瘤/血液比)。
图10.对99mTc-EC、[18F]FMISO和[131I]IMISO的生物分布研究(肿瘤/肌肉比)。
图11A和11B.注射99mTc-EC-MN(图11A)组与注射99mTc-EC(图11B)组中肿瘤的闪烁显像。
图12.在注射99mTc-EC-MN之后1小时进行的放射自显影。
图13.说明了99mTc-EC-NIM在狗血清样本中的稳定性。
图14A和图14B.说明了在大鼠中乳腺肿瘤对99mTc-EC-NIM vs.99mTc-EC的摄取(图14A)以及与对照相比在用紫杉醇治疗的大鼠中的摄取(图14B)。
图15A、图15B、图15C和图15D.说明了在大鼠中卵巢肿瘤对99mTc-EC-NIM vs.99mTc-EC的摄取(图15A)。在用紫杉醇治疗的大鼠(图15B)中的肿瘤摄取低于在未用紫杉醇治疗的大鼠(图15A)中的肿瘤摄取。还说明了在患有肉瘤的大鼠中99mTc-EC-NIM的肿瘤摄取。图15C显示了在用紫杉醇治疗的携带肉瘤的大鼠中的肿瘤摄取，而图15D显示了在未用紫杉醇治疗的大鼠中的肿瘤摄取。在用紫杉醇治疗后99mTc-EC-NIM的摄取减少。
图16.EC-GAP(五谷氨酸)的合成方案。
图17.在注射99mTc-EC-GAP组中乳腺肿瘤的闪烁显像。
图18.在注射99mTc-EC-ANNEX V组中不同时间间隔乳腺肿瘤的闪烁显像。
图19A和图19B.在携带卵巢肿瘤组中比较在紫杉醇治疗之前(图19A)和之后(图19B)摄取99mTc-EC-ANNEX V的差异。
图20A和图20B.在携带肉瘤组中比较在紫杉醇治疗之前(图20A)和之后(图20B)摄取99mTc-EC-ANNEX V的差异。
图21.EC-COL(秋水仙碱)的合成方案。
图22.说明在EC-COL合成中没有观察到降解产物。
图23.对于99mTc-EC-COL，肿瘤/肌肉和肿瘤/血液之比对时间的函数。
图24.对于99mTc-EC，肿瘤/肌肉和肿瘤/血液之比对时间的函数。
图25.在携带乳腺肿瘤的大鼠中用99mTc-EC-COL进行的体内显像研究。
图26.在携带乳腺肿瘤的大鼠中用99mTc-EC进行的体内显像研究。
图27.在注射99mTc-EC-COL vs.99mTc-EC之后计算机勾画出的感兴趣区域。
图28.对患有中风的59岁男性患者用99mTc-EC-MN进行的SPECT。注射后1小时取的影像。
图29.与图28相同的患者的MRI T1加权像。
图30.73岁男性患者中风后1天注射99mTc-EC-MN后1小时的SPECT。
图31.与图30相同的73岁患者中风后12天注射99mTc-EC-MN后1小时的SPECT。
图32.与图30相同的73岁男性中风患者中风后1天的CT。
图33.与图32相同的73岁男性中风患者中风后12天的CT。注意，使用CT显像在第1天与第12天之间没有显著差异。
图34.患有中风的72岁男性患者注射99mTc-EC-MN后1小时的SPECT。
图35.与图34相同的72岁中风患者的CT。注意CT影像如何夸大了病变大小。
图36.99mTc-EC-新霉素的合成方案。
图37A.携带乳腺肿瘤的大鼠施用99mTc-EC和99mTc-EC-新霉素(100μCi/大鼠，iv.)后的闪烁显像显示注射后0.5-4小时肿瘤可清楚显现。
图37B.乳腺癌患者用99mTc-EC-新霉素(30mCi，iv.)的闪烁乳房摄影。注射后2小时取的影像。
图38A.EC的1H-NMR。
图38B.新霉素的1H-NMR。
图38C.EC-新霉素的1H-NMR。
图39A和图39B.EC-新霉素的质谱分析(M+1112.55)。
图40A.EC的UV波长扫描。
图40B.新霉素的UV波长扫描。
图40C.EC-新霉素的UV波长扫描。
图41.99mTc-EC-新霉素的放射-TLC分析。
图42.99mTc-EC-新霉素的HPLC分析(放射性探测器)。
图43.99mTc-EC-新霉素的HPLC分析(UV 254nm)。
图44.18F-FDG的HPLC分析(放射性探测器)。
图45.18F-FDG的HPLC分析(UV 254nm)。
图46.在肺癌细胞系中一系列99mTc-EC-药物缀合物的体外细胞摄取测定。99mTc-EC-新霉素在所测试的药剂中显示出最高的摄取。
图47.葡萄糖对细胞(A549)摄取99mTc-EC-新霉素和18F-FDG的影响。
图48A和图48B.葡萄糖对细胞(H1299)摄取99mTc-EC-新霉素和18F-FDG的影响显示为药物摄取百分比(图48A)和伴随葡萄糖负荷的变化百分比(图48B)。
图49.99mTc-EC-葡糖胺的合成方案。
图50.葡萄糖的己糖激酶测定。
图51.葡糖胺的己糖激酶测定。
图52.EC-葡糖胺的己糖激酶测定。
图53.EC-GAP-葡糖胺的己糖激酶测定。
图54.99mTc-EC-GAP-葡糖胺的合成方案。
图55A、图55B、图55C.在肺癌细胞系(A549)中99mTc-EC(图55A)、99mTc-EC-脱氧葡萄糖-GAP(图55B)和18F-FDG(图55C)的体外细胞摄取测定。99mTc-EC-DG与18F-FDG相比显示出相似的摄取。
图56.在携带乳腺肿瘤的大鼠中99mTc-EC-GAP的肿瘤/组织的计数密度比。
图57.在乳腺癌细胞系(13762)中注射后2小时伴随葡萄糖负荷的18PDG的体外细胞摄取。
图58.在携带乳腺肿瘤的小鼠中99mTc-EC-新霉素的体内组织摄取。
图59.99mTc-EC-脱氧葡萄糖的合成方案。
图60.EC-脱氧葡萄糖的质谱分析。
图61.EC-脱氧葡萄糖(EC-DG)的1H-NMR。
图62.葡糖胺的1H-NMR。
图63.99mTc-EC-DG的放射-TLC分析。
图64.99mTc-EC-脱氧葡萄糖和99mTc-EC的HPLC分析(放射性探测器)。
图65.99mTc-EC-脱氧葡萄糖和99mTc-EC的HPLC分析(放射性探测器，混合的)。
图66.葡萄糖的己糖激酶测定。
图67.FDG的己糖激酶测定。
图68.EC-DG的己糖激酶测定。
图69.在肺癌细胞系(A549)中99mTc-EC-脱氧葡萄糖、99mTc-EC和18F-FDG的体外细胞摄取测定。99mTc-EC-DG与18F-FDG相比显示出相似的摄取。
图70.d-和1-葡萄糖对乳腺细胞(13762细胞系)摄取99mTc-EC-DG的影响。
图71.d-和1-葡萄糖对乳腺细胞(13762细胞系)摄取18F-FDG的影响。
图72.d-和1-葡萄糖对肺细胞(A549细胞系)摄取18F-FDG的影响。
图73.d-和1-葡萄糖对肺细胞(A549细胞系)摄取99mTc-EC-DG的影响。
图74.由葡糖胺和EC-DG(1.2mmol/kg，i.v.)诱导的体内血糖水平的效应。
图75.由FDG(1.2和1.9mmol/kg，i.v.)和胰岛素诱导的体内血糖水平的效应。
图76.在携带乳腺肿瘤的大鼠中99mTc-EC-脱氧葡萄糖的肿瘤/组织计数密度比。
图77.99mTc-EC-脱氧葡萄糖在携带乳腺肿瘤的大鼠中的体内生物分布。
图78.在携带肺肿瘤的小鼠中99mTc-EC-脱氧葡萄糖的体内组织摄取。
图79.在携带肺肿瘤的小鼠中99mTc-EC-新霉素的体内组织摄取。
图80.在携带肺肿瘤的小鼠中18F-FDG的体内组织摄取。
图81.携带乳腺肿瘤的大鼠施用99mTc-EC和99mTc-EC-脱氧葡萄糖(100μCi/大鼠，iv.)后的平面显像显示注射后0.5-4小时肿瘤可清楚显现。
图82A.恶性星形细胞瘤患者的MRI。
图82B.恶性星形细胞瘤患者用99mTc-EC-DG进行的SPECT。
图83A.出血性星形细胞瘤患者的MRI。
图83B.恶性星形细胞瘤患者用99mTc-EC-DG进行的SPECT。
图84A.良性脑膜瘤患者的MRI。
图84B.良性脑膜瘤患者用99mTc-EC-DG进行的SPECT显示没有局部增强的摄取。
图85A.肺TB患者的CT。
图85B.TB患者用99mTc-EC-DG进行的SPECT显示没有局部增强的摄取。
图86A.肺癌患者的CT。
图86B.肺癌患者的99mTc-EC-DG全身显像。
图86C.肺癌患者用99mTc-EC-DG进行的SPECT，肿瘤显示局部增强摄取。
示例技术方案的描述
在核医学领域，通过检测少量体内施用的放射性标记的示踪化合物(称作放射性示踪剂和放射性药物)对某些病理状况进行定位，或估计它们的范围。检测这些放射性药物的方法通常称为显像或放射显像方法。
在放射显像中，放射性标记是发射γ-射线的放射性核素，并且用γ-射线探测照相机将放射性示踪剂定位(这一过程经常称为γ闪烁照相)。由于选择放射性示踪剂在病变部位局限(称为正对比)，或选择放射性示踪剂特异性地不在这样的病变部位局限(称为负对比)，因此显像的部位可以检测到。
已知多种放射性核素可用于放射显像，包括67Ga、99mTc、111In、123I、125I、169Yb或186Re。由于更好的显像特性和更低的价格，曾尝试在可能时用相应的99mTc标记的化合物替换123I、131I、67Ga和111In标记的化合物。由于良好的物理特性以及极低的价格($0.21/mCi)，已优选用99mTc标记放射性药物。尽管有报道DTPA-药物缀合物可用99mTc有效地标记(Mathias等，1997)，DTPA部分与99mTc螯合不如与111In螯合稳定(Goldsmith，1997)。
为了在人体中实现最佳放射显像，必须考虑多个因素。为了使检测的效率达到最大，优选发射γ能量在100-200ke V范围内的放射性核素。为了使患者吸收的照射剂量最低，放射性核素的物理半衰期应该短至显像过程所允许的程度。为了使检查能在任何一天和在一天中的任何时间进行，在临床地点总能得到放射性核素来源是有利的。99mTc是优选的放射性核素，因为它发射的γ射线为140ke V，物理半衰期为6小时，并且容易在现场用钼-99/锝-99m发生器得到。
已知双-氨基乙硫醇四齿配位体，也称作二氨基二硫醇化合物，在氧代锝基团与两个硫醇硫原子和两个胺氮原子有效结合的基础之上形成非常稳定的Tc(V)O络合物(Davison等，1980；1981；Verbruggen等，1992)。99mTc-L，L-乙二半胱氨酸(99mTc-EC)是最新的成功的N2S2螯合物的例子(Verbruggen等，1992；Van Nerom等，1993；Surma等，1994)。EC是一种新的肾显像剂，其可以容易并有效地用99mTc标记，具有高的放射化学纯度和稳定性，并通过主动小管运输从肾排泄(Verbruggen等，1992；Van Nerom等，1993；Surma等，1994；Verbruggen等，1990；Van Nerom等，1990；Jamar等，1993)。EC的其它应用可以是与镓-68(一种正电子发射体，t1/2-68分钟)螯合用于PET，以及与钆、铁或锰螯合用于磁共振成象(MRI)。
本发明采用99mTc-EC作为标记剂以将配体引导到特定的组织类型用于显像。将组织引导配体与EC缀合的优点在于组织引导配体的特异性结合性质将放射性信号浓聚到感兴趣的区域。尽管预计使用99mTc-EC作为标记策略可以对实际上任何类型的化合物都有效，在此提供某些建议使用的优选配体用于举例说明目的。预计本发明的99mTc-EC-药物缀合物不仅可用于肿瘤显像，还可以用于其它组织特异性病症的显像，如感染、缺氧组织(中风)、心肌梗塞、凋亡细胞、阿尔兹海默氏病和子宫内膜异位。
在现有技术中已报道了放射性标记的蛋白和肽(Ege等，美国专利4,832,940，Abrams等，1990；Bakker等，1990；Goldsmith等，1995，1997；Olexa等，1982；Ranby等，1988；Hadley等，1988；Lee等，1989；Sobel等，1989；Stuttle，1990；Maraganore等，1991；Rodwell等，1991；Tubis等，1968；Sandrehagen，1983)。但是，在本发明之前，除了作为二乙酯(Kabasakal，2000)以外，99mTc-EC未与任何配体联合使用过。EC的二乙酯被用作脑血流药剂(Kikukawa等，2000)。
尽管对于放射显像是最优的，99mTc的化学性质不如其它元素研究得那么透彻，并且因此用99mTc进行放射性标记的方法不是很多。通常得到的99mTc为99mTc高锝酸盐(TcO4 -；锝处于+7氧化态)，通常来自钼-99/锝-99m发生器。然而，高锝酸盐与其它化合物结合得不好。因此，为了对化合物进行放射性标记，99mTc高锝酸盐必须转变为另一种形式。由于锝在水溶液中不形成稳定的离子，它必须以配位化合物的形式处于这种溶液中，所述配位化合物具有的动力学和热力学稳定性足以防止99mTc的分解和由此转变为不溶性二氧化锝或变回高锝酸盐。
为了实现放射性标记的目的，对于99mTc络合物而言特别有利的是形成螯合物，其中所有围绕锝离子周围的供体基团由单一螯合配体提供-在这种情况下是乙二半胱氨酸。这使得螯合的99mTc直接或通过乙二半胱氨酸与配体之间的单一接头共价结合至组织特异性配体。
锝具有多种氧化态：+1，+2，+4，+5，+6和+7。当它处于+1氧化态时，称为TcMIBI。TcMIBI的产生必须伴有加热反应(Seabold等，1999)。为了本发明的目的，Tc处于+4氧化态很重要。该氧化态对与EC形成N2S2螯合物是理想的。因此，在形成放射性锝与本发明的药物缀合物的络合物的过程之中，锝络合物，优选99mTc高锝酸盐，与本发明的药物缀合物在还原剂存在下反应。
用于本发明的优选的还原剂是氯化锡(SnCl2)形式的锡离子，以将Tc还原到其+4氧化态。但是，预计其它还原剂，如连二硫酸离子或亚铁离子也可以用于本发明。还预计所述还原剂可以是固相还原剂。还原剂的量可以很重要，因为必需避免形成胶体。优选地，例如，每约100至约300mCi的Tc高锝酸盐使用约10至约100μg SnCl2。最优选的量是每约200mCi的Tc高锝酸盐和约2ml盐水使用约0.1mg SnCl2。这通常产生足够5个患者使用的Tc-EC-组织特异性配体缀合物。
通常也很重要在组合物中包含抗氧化剂，以防止乙二半胱氨酸的氧化。优选用于本发明的抗氧化剂是维生素C(抗坏血酸)。但是，预计也可以使用其它抗氧化剂，如生育酚、吡哆素、硫胺素或芸香苷。
一般来说，用于本发明的配体会具有能与EC在一条或两条酸臂上缀合的氨基或羟基基团。如果不能得到氨基或羟基基团(例如酸官能团)，理想的配体使用本发明的方法仍可以缀合至EC并用99mTc标记，这是通过添加一个接头实现的，如乙二胺、氨丙醇、二亚乙基三胺、天冬氨酸、聚天冬氨酸、谷氨酸、聚谷氨酸或赖氨酸。预计用于本发明的配体包括但不限于血管发生/抗血管发生配体、DNA拓扑异构酶抑制剂、糖酵解标志、抗代谢配体、凋亡/缺氧配体、DNA嵌入剂、受体标记、肽、核苷酸、抗微生物剂如抗生素或抗真菌剂、器官特异性配体和糖类或模拟葡萄糖的药剂。
EC本身是水溶性的。本发明的EC-药物缀合物也必需是水溶性的。用于本发明的许多配体是水溶性的，或者当与EC缀合时形成水溶性化合物。然而，如果组织特异性配体不是水溶性的，则可以使用会增加配体溶解性的接头。接头可以连至脂族醇或芳族醇、胺或肽或连至羧酸或肽。接头可以是聚氨基酸(肽)或氨基酸如谷氨酸、天冬氨酸或赖氨酸。表1列出了对于特定药物官能团理想的接头。
                        表1
药物官能团 接头 实例
脂族-OH或酚-OH EC-聚(谷氨酸)(MW.750-15,000)或EC-聚(天冬氨酸)(MW.2000-15,000)或乙酸溴乙酯或EC-谷氨酸或EC-天冬氨酸 A
脂族-NH2或芳族-NH2或肽 EC-聚(谷氨酸)(MW.750-15,000)或EC-聚(天冬氨酸)(MW.2000-15,000)或EC-谷氨酸(单酯或二酯)或EC-天冬氨酸 B
羧酸或肽 乙二胺、赖氨酸 C
实例：
A.雌二醇、托泊替堪、紫杉醇、雷洛昔芬、依托泊甙
B.阿霉素、丝裂霉素C、内抑素、膜联蛋白V、LHRH、奥曲肽、VIP
C.氨甲蝶呤、叶酸
还预计本发明的EC-组织特异性配体药物缀合物可以螯合至其它放射性核素并用于放射性核素治疗。通常认为实际上任何α、β-辐射体、γ-辐射体，或β、γ-辐射体均可用于本发明。优选的β、γ-辐射体包括166Ho、188Re、186Re、153Sm和89Sr。优选的β-辐射体包括90Y和225Ac。优选的γ-辐射体包括67Ga、68Ga、64Cu、62Cu和111In。优选的α-辐射体包括211At和212Bi。还预计顺磁物质，如Gd、Mn和Fe可与EC螯合用于本发明中。
络合物和用于制备这种络合物的资料以试剂盒形式方便地提供，包括密封的小瓶，其中含有预定量的待标记的本发明的EC-组织特异性配体缀合物，和足量的还原剂以用99mTc标记缀合物。根据本发明的99mTc标记的闪烁显像剂可以通过将适量的99mTc或99mTc络合物加入含有EC-组织特异性配体缀合物和还原剂的小瓶并在以下实施例1中所描述的条件下反应而制备。所述试剂盒还可以含有常规药物添加物质，如可药用盐以调节渗透压、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂等等。所述试剂盒的组分可以是液体、冷冻或干燥的形式。在优选的技术方案中，试剂盒组分以冻干形式提供。
本发明提供的放射性标记的试剂或缀合物具有适量的放射性。在形成99mTc放射性络合物的过程中，通常优选形成放射性络合物溶液中的放射性浓度为每毫升大约0.01微居里(mCi)至大约300mCi。
本发明提供的99mTc标记的闪烁显像剂可用于显现哺乳动物体内的部位。根据本发明，99mTc标记的闪烁显像剂以单一单位注射剂量给予。在进行放射性标记之后，可以使用本领域技术人员已知的任何常用载体，如无菌盐水溶液或血浆，来制备可注射溶液以根据本发明对各种器官、肿瘤等进行诊断性显像。一般来说，给予的单位剂量具有约0.01mCi至约300mCi，优选10mCi至约200mCi的放射性。以单位剂量注射的溶液从大约0.01mL至大约10mL。静脉内给药后，可以进行器官或肿瘤的体内显像，如果期望，在将放射性标记的试剂引入患者体内后数小时或甚至更长时间内发生。在大多数情况下，施用剂量中会有足量在1小时的约0.1之内积聚在待显像的区域以允许拍摄闪烁照片。根据本发明可以采用任何常规的用于诊断或预测目的的闪烁显像方法。
本发明的99mTc-EC标记策略还可以用于预测目的。预计EC可以缀合至已知的癌症化疗选用药物，如表2中所列的那些。然后这些EC-药物缀合物可以用99mTc放射性标记，并施用于肿瘤患者。标记的EC-药物缀合物将特异性地与肿瘤结合。可以进行显像以确定该癌症化疗药物对抗该特定患者的特定肿瘤的有效性。以这种方式，医生可以迅速地确定遵循哪种治疗模式，哪种化疗药物将会最有效。这对于包括选择药物并施用-轮化疗的现有方法来说是显著的改进，现有方法在能确定药物有效性之前将花费患者数月时间和大量金钱。
本发明提供的99mTc标记的EC-组织特异性配体缀合物和络合物可以在任何常规的静脉内注射用介质中进行静脉内给药，如盐水介质，或血浆介质。这种介质还可以含有常规的药物添加物质，如可药用盐以调节渗透压、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂等等。优选的介质是生理盐水和血浆。
下面更具体地讨论具体的优选的寻靶策略。
肿瘤叶酸受体寻靶
放射性标记的配体，如喷曲肽和血管活性肠肽，与细胞受体结合，其中某些受体在肿瘤细胞上过量表达(Britton和Granowska，1996；Krenning等，1995；Reubi等，1992；Goldsmith等，1995；Virgolini等，1994)。由于这些配体不具有免疫原性并从血浆中迅速被清除出去，与抗体显像相比受体显像似乎更具前景。
叶酸以及抗叶酸剂如氨甲蝶呤除了经典的还原-叶酸载体系统之外通过高亲和性叶酸受体(糖基磷脂酰肌醇-连接的膜叶酸-结合蛋白)进入细胞(Westerhof等，1991；Orr等，1995；Hsueh和Dolnick，1993)。叶酸受体(FRs)在许多肿瘤细胞类型上过量表达(如肺、乳腺、卵巢、宫颈、结直肠、鼻咽、肾的腺癌，恶性黑素瘤和室管膜瘤)，但基本上仅在几种正常分化组织上表达(如脉络膜、胎盘、甲状腺和肾)(Orr等，1995；Weitman等，1992a；Campbell等，1991；Weitman等，1992b；Holm等，1994；Ross等，1994；Franklin等，1994；Weitman等，1994)。FRs已被用于将叶酸-缀合的蛋白毒素、药物/反义寡核苷酸和脂质体递送至过量表达叶酸受体的肿瘤细胞中(Ginobbi等，1997；Leamon和Low，1991；Leamon和Low，1992；Leamon等，1993；Lee和Low，1994)。此外，含有与抗T细胞受体抗体连接的抗FR抗体的双特异性抗体已被用于引导T细胞至FR-阳性的肿瘤细胞，并且目前正处于对卵巢腺癌的临床试验中(Canevari等，1993；Bolhuis等，1992；Patrick等，1997；Coney等，1994；Kranz等，1995)。类似地，可以利用该特性开发放射性标记的叶酸-缀合物，如67Ga-去铁胺-叶酸和111In-DTPA-叶酸，用于叶酸受体阳性肿瘤的显像（Mathias等，1996；Wang等，1997；Wang等，1996；Mathias等，1997b)。对这些药剂进行的有限的体外和体内研究的结果提示叶酸受体会是肿瘤显像的潜在靶。在本发明中，发明人开发了一系列新的叶酸受体配体。这些配体是99mTc-EC-叶酸、99mTc-EC-氨甲蝶呤(99mTc-EC-MTX)、99mTc-EC-tomudex(99mTc-EC-TDX)。
肿瘤缺氧寻靶
肿瘤细胞在氧存在下比缺氧情况下对常规放射更为敏感；甚至在肿瘤中小百分比的缺氧细胞也会限制对放射的反应(Hall，1998；Bush等，1978；Gray等，1953)。缺氧抗辐射性在许多动物肿瘤中已得到了证实，但仅在少数人类肿瘤类型中得到证实(Dische，1991；Gatenby等，1988；Nordsmark等，1996)。在人类肿瘤中缺氧的发生，在大多数情况下，是从组织学发现和动物肿瘤研究中得出的。在体内证实缺氧需要用氧电极对组织进行测量，这些技术的侵入性限制了其临床应用。
米索硝唑(MISO)是一种缺氧细胞敏化物，用不同的放射性同位素(如18F、123I、99mTc)标记MISO可用于通过PET或平面闪烁显像区分缺氧但具有代谢活性的肿瘤与供氧良好有活性的肿瘤。[18F]氟米索硝唑(FMISO)已用于PET来评估肿瘤缺氧。近来的研究已显示PET，具有通过[18F]FMISO监测细胞氧含量的能力，非常有潜力用于预测肿瘤对放射的反应(Koh等，1992；Valk等，1992；Martin等，1989；Rasey等，1989；Rasey等，1990；Yang等，1995)。PET具有更高的分辨率而无需校准，但是在临床中使用PET同位素的成本让人却步。尽管用碘标记MISO是一种选择，但观察到在甲状腺组织中的高摄取。所以，期望开发用于平面闪烁显像的化合物，使得在大多数主要医学机构中所用同位素不那么昂贵并且易于获得。在本发明中，发明人呈现了99mTc-EC-2-硝基咪唑和99mTc-EC-甲硝唑的合成，并证实其作为肿瘤缺氧标志的潜在用途。
癌症的肽显像
肽和氨基酸已成功地用于多种类型肿瘤的显像中(Wester等，1999；Coenen和Stocklin，1988；Raderer等，1996；Lambert等，1990；Bakkef等，1990；Stella和Mathew，1990；Butterfield等，1998；Piper等，1983；Mochizuki等，Dickinson和Hiltner，1981)。基于谷氨酸的肽已被用作癌症治疗的药物载体(Stella和Mathew，1990；Butterfield等，1998；Piper等，1983；Mochizuki等，1985；Dickinson和Hiltner，1981)。已知叶酸的谷氨酸部分在体内降解并形成聚谷氨酸。然后聚谷氨酸再缀合至叶酸以形成叶酰聚谷氨酸，其参与葡萄糖代谢。标记谷氨酸肽可用于区分肿瘤的恶性。在本发明中，发明人报道了EC-谷氨酸五肽的合成，并评价了其在肿瘤显像中的潜在用途。
肿瘤凋亡细胞显像
凋亡发生在用化疗和放射治疗癌症的过程中(Lennon等，1991；Abrams等，1990；Blakenberg等，1998；Blakenberg等，1999；Tait和Smith，1991)。已知膜联蛋白V结合磷脂酰丝氨酸，后者由肿瘤凋亡细胞过量表达(Blakenberg等，1999；Tait和Smith，1991)。通过膜联蛋白V评估凋亡可用于评价治疗的效力，如疾病进展或消退。在本发明中，发明人合成了99mTc-EC-膜联蛋白V(EC-ANNEX)并评价了其在肿瘤显像中的潜在用途。
肿瘤血管发生显像
血管发生对肿瘤生长和发生转移负有部分责任。抗有丝分裂化合物是抗血管发生的，并且已知其作为抗癌药物的潜在用途。这些化合物在细胞周期的有丝分裂期间抑制细胞分裂。在细胞功能如细胞分裂、细胞运动、分泌、纤毛和鞭毛运动、胞内转运和维持细胞形状的生物化学过程期间，微管参与其中。已知抗有丝分裂化合物与微管蛋白高亲和力结合，破坏微管组装并引起增殖细胞有丝分裂停滞。因此，认为抗有丝分裂化合物可作为微管抑制剂或作为纺锤体毒药(Lu，1995)。
许多类抗有丝分裂化合物通过与微管蛋白结合控制微管组装-解装配(Lu，1995；Goh等，1998；Wang等，1998；Rowinsky等，1990；Imbert，1998)。诸如类秋水仙碱的化合物与微管蛋白在秋水仙碱结合位点上相互作用并抑制微管组装(Lu，1995；Goh等，1998；Wang等，1998)。在类秋水仙碱中，秋水仙碱是用于治疗预防急性痛风的有效抗炎药物。秋水仙碱还用于慢性粒细胞白血病。虽然类秋水仙碱有效对抗某些类型的肿瘤生长，由于不能分开治疗效果和毒性作用，其临床治疗潜力受到限制(Lu，1995)。但是，秋水仙碱可用作生化工具评价细胞功能。在本发明中，发明人开发了99mTc-EC-秋水仙碱(EC-COL)用于评价微管功能的生化过程。
肿瘤凋亡细胞显像
凋亡发生在用化疗和放射治疗癌症的过程中。已知膜联蛋白V结合磷脂酰丝氨酸，后者由肿瘤凋亡细胞过量表达。通过膜联蛋白V评估凋亡可用于评价治疗的效力，如疾病进展或消退。因此开发了99mTc-EC-膜联蛋白V(EC-ANNEX)。
肿瘤缺氧显像
在放射治疗之前通过显像方式评价肿瘤缺氧会提供选择患者用放射敏化剂或生物还原药物(如替拉扎明、丝裂霉素C)治疗的合理方法。这种对患者的选择可更准确地治疗缺氧肿瘤患者。此外，肿瘤抑制基因(P53)与多重耐药相关。为了将显像结果与P53过量表达相联系，在化疗之前和之后的组织病理学检查可用于随访肿瘤治疗反应。开发了99mTc-EC-2-硝基咪唑和99mTc-EC-甲硝唑。
肿瘤血管发生显像
血管发生对肿瘤生长和发生转移负有部分责任。抗有丝分裂化合物是抗血管发生的，并且已知其作为抗癌药物的潜在用途。这些化合物在细胞周期的有丝分裂期间抑制细胞分裂。在细胞功能如细胞分裂、细胞运动、分泌、纤毛和鞭毛运动、胞内转运和维持细胞形状的生物化学过程期间，微管参与其中。已知抗有丝分裂化合物与微管蛋白高亲和力结合，破坏微管组装并引起增殖细胞有丝分裂停滞。因此，认为抗有丝分裂化合物可作为微管抑制剂或作为纺锤体毒药。已知秋水仙碱，一种有效的抗血管发生剂，抑制微管聚合并使细胞停滞在分裂中期。秋水仙碱(COL)可用作生化工具评价细胞功能。由此开发了99mTc-EC-COL。
中风引起的缺氧的显像
尽管肿瘤细胞或多或少是缺氧的，需要氧探针来测量其压力。为了模拟缺氧条件，发明人对11名中风患者用99mTc-EC-甲硝唑(99mTc-EC-MN)进行了显像。甲硝唑是肿瘤缺氧标志。在中风区域的组织由于缺乏氧气而变为缺氧。在注射99mTc-EC-MN后1和3小时进行SPECT显像。所有这些显像研究都明确定位了病变。CT未很好或准确地显示病变。在某些病例中MRI和CT夸大了病变大小。以下是选自3名患者的病例。
病例1. 59岁男性患者左基底节中风。SPECT 99mTc-EC-MN在注射后1小时确定了病变(图28)，其对应于MRI T1加权像(图29)。
病例2. 73岁男性患者左大脑中动脉(MCA)供血区域中风。在第1天和第12天(图30和31)注射后1小时获得了SPECT99mTc-EC-MN。在第12天病变显示显著增强的摄取。CT显示在病变处广泛的脑出血。在第1天和第12天(图32和33)之间没有观察到显著的差异。上述发现表明患者症状由于组织生存力(从无氧至低氧)而改善。SPECT99mTc-EC-MN提供了比CT显像更好的功能信息。
病例3. 72岁男性患者右MCA和PCA区域中风。SPECT99mTc-EC-MN在注射后1小时确定了病变(图34)。CT夸大了病变大小(图35)。
肿瘤糖酵解寻靶
放射性标记的配体，如多糖(新霉素、卡那霉素、妥布霉素)和单糖(葡糖胺)与细胞葡萄糖转运蛋白结合，然后磷酸化，其在肿瘤细胞上过量表达(Roger等，1968；Fanciulli等，1994；Popovici等，1971；Jones等，1973；Hermann等，2000)。多糖(新霉素、卡那霉素、妥布霉素)和单糖(葡糖胺)诱导的葡萄糖水平可以被胰岛素抑制(Harada等，1995；Moller等，1991；Offield等，1996；Shankar等，1998；Yoshino等，1999；Villevalois-Cam等，2000)。由于这些配体不具有免疫原性并且从血浆中迅速清除，代谢显像似乎比抗体显像更有前途。
下列实施例是为了展示本发明的优选技术方案。本领域的技术人员应该理解在以下实施例中公开的技术代表发明人发现在实施本发明中运行良好的技术，并因此可被认为构成其实施的优选模式。但是，本领域的技术人员应该理解，根据本发明公开的内容，可以在公开的特定技术方案中作许多改变，并仍获得相似或类似的结果，而不偏离本发明的精神和范围。
实施例1：肿瘤叶酸受体寻靶
EC的合成
根据前述方法以两步合成制备EC(Ratner和Clarke，1937；Blondeau等，1967；各引入本文作为参考)。合成前体L-噻唑烷-4-甲酸(mp195°，报道值196-197°)。然后制备EC(mp237°，报道值251-253°)。通过1H-NMR和快原子轰击质谱(FAB-MS)证实其结构。
氨甲蝶呤的氨基乙基酰胺类似物(MTX-NH2)的合成
将MIX(227ma，0.5mmol)溶解于1ml HCl溶液(2N)。pH值＜3。在室温下向该搅拌溶液中加入2ml水和4ml N-乙氧羰基-2-乙氧基-1，2-二氢喹啉(EEDQ，6.609％甲醇溶液，1mmol),缓慢加入乙二胺(EDA，0.6ml，10mmol)。将反应混合物搅拌过夜并真空蒸发溶剂。将未加工的固体物质用乙醚(10ml)、乙腈(10ml)和95％乙醇(50ml)洗涤以除去未反应的EEDQ和EDA。然后将产物通过冻干而干燥，并不经进一步纯化而使用。产物重210mg(84.7％)，为黄色粉末，产物的mp：195-198℃(分解，MIX)；1H-NMR(D2O)δ2.98-3.04(d，8H，-(CH2)2CONH(CH0)2NH2)，4.16-4.71(m，6H，-CH2-蝶啶基，芳族-NCH3，NH-CH-COOH谷氨酸)，6.63-6.64(d，2H，芳族-CO)，7.51-7.53(d，2H，芳族-N)，8.36(s，1H，蝶啶基)。对于C22H28N10，O4，FAB MSm/z(M)+计算值：496.515，实测值：496.835。
叶酸的氨基乙基酰胺类似物(叶酸-NH2)的合成
将叶酸二水合物(1g，2.0mmol)加入10ml水中。用HCl(2N)将pH值调节至2。向该搅拌溶液中，缓慢加入N-乙氧羰基-2-乙氧基-1，2-二氢喹啉(EEDQ，1g在10ml甲醇中，4.0mmol)和乙二胺(EDA，1.3ml，18mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。真空蒸发溶剂。将产物在甲醇(50ml)中沉淀并用丙酮(100ml)洗涤以除去未反应的EEDQ和EDIT。然后将产物冻干并不经进一步纯化而使用。茚三酮(2％甲醇溶液)喷雾表明氨基基团阳性。产物重0.6g(产率60％)，为黄色粉末，产物的mp：250℃(分解)。1H-NMR(D2O)δ1.97-2.27(m，2H，叶酸的-CH2谷氨酸)，3.05-3.40(d，6H，-CH2CONH(CH2)2NH2)，4.27-4.84(m，3H，-CH2-蝶啶基，NH-CH-COOH谷氨酸)，6.68-6.70(d，2H，芳族-CO)，7.60-7.62(d，2H，芳族-N)，8.44(s，1H，蝶啶基)。对于C21H25N9，O5，FAB MS m/z(M)+计算值：483，实测值：483.21。
乙二半胱氨酸-叶酸(EC-叶酸)的合成
为了溶解EC，向EC(114ma，0.425mmol)在水(1.5ml)中的搅拌溶液加入NaOH(2N，0.1ml)。向该无色溶液中加入硫代-NHS(sulfo-NHS)(92.3mg，0.425mmol)和EDC(81.5mg，0.425mmol)。然后加入叶酸-NH2(205mg，0.425mmol)。将混合物在室温下搅拌24小时。将混合物用分子截断值500的Spectra/POR分子多孔膜(Spectrum Medical Industries Inc.，Houston，TX)透析48小时。透析后，将产物冻干。产物重116mg(产率35％)，mp 195℃(分解)；1H-NMR(D2O)δ1.98-2.28(m，2H，叶酸的-CH2谷氨酸)，2.60-2.95(m，4H和叶酸的-CH2-SH)，3.24-3.34(m，10H，-CH2-CO，叶酸的乙二胺和EC的乙二胺)，4.27-4.77(m，5H，-CH-蝶啶基，叶酸的NH-CH-COOH谷氨酸和EC的NH-CH-COOH)，6.60-6.62(d，2H，芳族-CO)，7.58-7.59(d，2H，芳族-N)，8.59(s，1H，蝶啶基)。对于C29H37N11S2O8Na2(8H2O)，FAB MS m/z(M)+分析计算值：777.3(无水)。C，37.79；H，5.75；N，16.72；S，6.95。实测值：m/z(M)+777.7(20)，489.4(100)。C，37.40；H，5.42；N，15.43；S，7.58。
用99mTc放射性标记EC-叶酸和EC
通过将所需量的99mTc-高锝酸盐加入含有EC-叶酸的冻干残余物(3mg)、SnCl2(100μg)、Na2HPO4(13.5mg)、抗坏血酸(0.5mg)和NaEDTA(0.5mg)的自制试剂盒完成99mTc-EC-叶酸的放射合成。制剂的终pH为7.4。99mTc-EC也通过使用含有以下成分的自制试剂盒获得：EC的冻干残余物(3mg)、SnCl2(100μg)、Na2IPO4(13.5mg)、抗坏血酸(0.5mg)和NaEDTA(0.5mg)，pH为10。然后将制剂的终pH调至7.4。通过TLC(ITLC SG，Gelman Sciences，Ann Arbor，MI)测定放射化学纯度，分别用丙酮(体系A)和乙酸铵(1M水溶液)：甲醇(4∶1)(体系B)洗脱。从放射-TLC(Bioscan，Washington，DC)分析，两种放射性药物的放射化学纯度均＞95％。放射-TLC数据概括于表2。99mTc-EC-叶酸的合成如图1所示。
                        表2
                    癌症化疗选用药物
下表列出了在美国和加拿大用于治疗癌症的药物及其主要不良作用。选用药物列表基于Medical Letter顾问的意见。某些针对适应症列出的药物还未得到美国食品和药物管理局(US Food and DrugAdministration)的批准。抗癌药物及其不良作用随后给出。为了本发明的目的，这些列表旨在举例说明而不是穷举。
                       选用药物癌症                    选用药物                           某些备选肾上腺皮质**            米托坦                             阿霉素，链佐星，依
                    顺铂                               托泊甙膀胱*                   局部：BCG灌注                      灌注丝裂霉素、阿霉
                    全身：氨甲蝶呤+长春碱+阿霉素       素或噻替哌
                    +claplatin(MVAC)                   紫杉醇，在组合中用
                    claplatin+氨甲蝶呤+长春碱(CMV)     卡铂置换claplatin脑多形性成胶质细胞瘤*     丙卡巴肼+洛莫司汀+长春新碱         卡氮芥，claplatin间变性少突神经胶质细    丙卡巴肼+洛莫司汀+长春新碱         卡氮芥，claplatin胞瘤*成神经胶质细胞瘤**                                                    丙卡巴肼，claplatin髓母细胞瘤                                                            依托泊甙
                     卡氮芥或洛莫司汀
                     长春新碱+卡氮芥±氮芥±氨甲蝶呤
                     氮芥+长春新碱+丙卡巴肼+强的松(MOPP)
                     长春新碱+claplatin±环磷酰胺原发性中枢神经系统淋     氨甲蝶呤(高剂量静脉内和/或鞘内)±阿巴瘤                     糖胞苷(静脉内和/或鞘内)
                     环磷酰胺+阿霉素+长春新碱+强的松
                     (CHOP)乳腺                     辅助1：环磷酰胺+氨甲蝶呤+氟尿嘧啶
                     (CMF)；
                     环磷酰胺+阿霉素±氟尿嘧啶(AC或CAF)；
                     他莫昔芬
                     转移：环磷酰胺+氨甲蝶呤+氟尿嘧啶(CMF)        紫杉醇；噻替哌+阿霉
                     或环磷酰胺+阿霉素±氟尿嘧啶(AC或CAF)         素+长春碱；丝裂霉素
                     用于受体阴性和/或激素不应；他莫昔芬用        +长春碱；丝裂霉素+
                     于受体阳性和/或激素敏感2                    氨甲蝶呤+米托蒽醌；
                                                                  氟尿嘧啶通过持续灌
                                                                  注；骨髓移植3官颈                    claplatin                                     苯丁酸氮芥，长春新
                    异环磷酰胺with means                          碱，氟尿嘧啶，阿霉
                    博来霉素+异环磷酰胺                           with 素，氨甲蝶呤，六甲
                    means+claplatin                               基蜜胺绒毛膜癌                氨甲蝶呤±甲酰四氢叶酸                        氨甲蝶呤+放线菌素
                    放线菌素D                                     D+环磷酰胺(MAC)
                                                                  依托泊甙+氨甲蝶呤+
                                                                  放线菌素D+环磷酰胺
                                                                  +长春新碱结直肠*                辅助结肠4：氟尿嘧啶+左旋四咪唑；氟尿  肝转移：肝动脉内
                   嘧啶+甲酰四氢叶酸                           氟尿苷
                   转移：氟尿嘧啶+甲酰四氢叶酸                 丝裂霉素胚胎性横纹肌肉瘤5     长春新碱+放线菌素±环磷酰胺                 同样+阿霉素
                   长春新碱+异环磷酰胺with means+依托泊
                   甙子宫内膜**             甲地孕酮或另一种孕激素                      氟尿嘧啶，他莫昔芬，
                   阿霉素+claplatin±环磷酰胺                  六甲基蜜胺食道*                  claplatin+氟尿嘧啶                          阿霉素，
                                                               氨甲蝶呤，丝裂霉素尤因肉瘤5             环磷酰胺(或异环磷酰胺with means)+           CAV+依托泊甙
                   阿霉素+长春新碱(CAV)±放线菌素D胃**                   氟尿嘧啶±甲酰四氢叶酸                      claplatin，阿霉素，
                                                               依托泊甙，氨甲蝶呤+
                                                               甲酰四氢叶酸，丝裂
                                                               霉素头和颈部鳞状细胞*6     claplatih+氟尿嘧啶                         博来霉素，卡铂，紫
                    氨甲蝶呤                                   杉醇胰岛细胞**              链佐星+阿霉素                              链佐星+氟尿嘧啶；
                                                               氯脲菌素 ；奥曲肽卡波西肉瘤*(爱滋病相    依托泊甙或干扰素α或长春碱                 长春新碱，阿霉素，关)                     阿霉素+博来霉素+长春新碱或长春碱           博来霉素
                    (ABV)白血病急性淋巴细胞白血病      诱导：长春新碱+强的松+天冬酰胺酶±放线     诱导：同样±高剂量氨(ALL)7                 菌素D                                      甲蝶呤±阿糖胞苷；培
                    CNS预防：鞘内氨甲蝶呤±全身高剂量氨甲      门冬酶代替天冬酰胺
                    蝶呤及甲酰四氢叶酸±鞘内阿糖胞苷±鞘内     酶
                    氢化可的松                                 替尼泊甙或依托泊甙
                    维持：氨甲蝶呤+巯基嘌呤                    高剂量阿糖胞苷
                    骨髓移植38                                维持：同样+周期性长
                                                               春新碱+强的松急性髓细胞性白血病   诱导：阿糖胞苷+柔红霉素或伊达比星       阿糖胞苷+米托蒽醌(AML)9              诱导后：高剂量阿糖胞苷±其它药物如依托  高剂量阿糖胞苷
                 泊甙
                 骨髓移植3慢性淋巴细胞白血病   苯丁酸氮芥±强的松                      克拉屈滨，环磷酰胺，(CLL)                氟达拉滨                                喷司他丁，长春新碱，
                                                         阿霉素慢性髓细胞性白血病(CML)10慢性期               骨髓移植3                              白消安
                 干扰素α
                 羟基脲加速期11            骨髓移植3                              羟基脲，白消安原始细胞危象11      淋巴性：长春新碱+强的松+L-天冬酰胺酶+   维A酸
Figure A0181160500341
                 鞘内氨甲蝶呤(±用氨甲蝶呤+8巯基嘌呤     安吖啶，
Figure A0181160500342
阿扎胞苷
                 维持)                                   长春新碱±普卡霉素毛细胞白血病         喷司他丁或克拉屈滨                      干扰素α，苯丁酸氮
                                                         芥，氟达拉滨肝**                 阿霉素                                  肝动脉内氟尿苷或
                 氟尿嘧啶                                claplatin肺，小细胞(猫细胞)   claplatin+依托泊甙(PE)                  异环磷酰胺with
                 环磷酰胺+阿霉素+长春新碱(CAV)           means+卡铂+依托泊
                 PE与CAV交替                             甙(ICE)
                 环磷酰胺+依托泊甙+claplatin(CEP)        每日口服依托泊甙
                 阿霉素+环磷酰胺+依托泊甙(ACE)           依托泊甙+异环磷酰
                                                         胺 with means+
                                                         claplatin(VIP)肺                                                           紫杉醇(非小细胞)**        claplatin+依托泊甙                       claplatin+氟尿嘧啶
                claplatin+长春碱±丝裂霉素               +甲酰四氢叶酸
                claplatin+长春新碱                       卡铂+紫杉醇淋巴瘤霍奇金氏12         阿霉素+博来霉素+长春碱+达卡巴嗪  氮芥+长春新碱+丙卡
                  (ABVD)                                  巴肼+强的松(MOPP)
                  ABVD与MOPP交替                          苯丁酸氮芥+长春碱+
                  氮芥+长春新碱+丙卡巴肼(±强的松)+阿     丙卡巴肼+强的松±卡
                  霉素+博来霉素+长春碱(MOP[P]-ABV)        氮芥
                                                          依托泊甙+长春碱+阿
                                                          霉素
                                                          骨髓移植3非霍奇金氏伯基特淋巴瘤          环磷酰胺+长春新碱+氨甲蝶呤              异环磷酰胺with
                  环磷酰胺+高剂量阿糖胞苷±氨甲蝶呤与甲   means
                  酰四氢叶酸                              环磷酰胺+阿霉素+长
                  鞘内氨甲蝶呤或阿糖胞苷                  春新碱+强的松
                                                          (CHOP)弥漫性大细胞淋巴瘤    环磷酰胺+阿霉素+长春新碱+强的松         地塞米松有时替换强
                  (CHOP)                                  的松
                                                          其它组合方案，可包
                                                          括氨甲蝶呤，依托泊
                                                          甙，阿糖胞苷，博来
                                                          霉素，丙卡巴肼，异
                                                          环磷酰胺和米托蒽醌
                                                          骨髓移植3滤泡性淋巴瘤        环磷酰胺或苯丁酸氮芥                      同样±长春新碱和强
                                                          的松，±依托泊甙
                                                          干扰素α，克拉屈滨，
                                                          氟达拉滨
                                                          骨髓移植3
                                                          环磷酰胺+阿霉素+长
                                                          春新碱+强的松
                                                          (CHOP)黑素瘤**            干扰素α，                                卡氮芥，洛莫司汀，
                达卡巴嗪                                  顺铂
                                                          达卡巴嗪+claplatin
                                                          +卡氮芥+他莫昔芬
                                                          阿地白介素蔁样肉芽肿病*      PUVA(补骨脂内酯+紫外线A)                   异维A酸，局部卡氮
               氮芥(局部)                                 芥，喷他司丁，氟达
               干扰素α                                   拉滨，克拉屈滨，光
               光子束放射治疗                             分离复置法(体外光
                氨甲蝶呤                                   化学疗法)，
                                                           如非霍奇金淋巴瘤的
                                                           化疗粘液瘤(mysloma)*    美法仑(或环磷酰胺)+强的松                  干扰素α
                美法仑±卡氮芥+环磷酰胺+强的松+长春新      骨髓移植3
                碱                                         高剂量地塞米松
                地塞米松+阿霉素+长春新碱(VAD)
                长春新碱+卡氮芥+阿霉素+强的松(VBAP)神经母细胞瘤*       阿霉素+环磷酰胺+claplatin+替尼泊甙或       卡铂，依托泊甙
                依托泊甙                                   骨髓移植3
                阿霉素+环磷酰胺
                claplatin+环磷酰胺成骨肉瘤5          阿霉素+claplatin±依托泊甙±异环磷酰胺      异环磷酰胺with
                                                            means，依托泊甙，卡
                                                            铂，高剂量氨甲蝶呤
                                                            及甲酰四氢叶酸
                                                            环磷酰胺+依托泊甙卵巢                  claplatin(或卡铂)+紫杉醇                  异环磷酰胺with
                  claplatin(或卡铂)+环磷酰胺(CP)±阿        means，紫杉醇，他莫
                  霉素(CAP)                                 昔芬，美法仑，六甲
                                                            基蜜胺胰腺**                氟尿嘧啶±甲酰四氢叶酸                    吉西他滨前列腺                亮丙瑞林(或戈舍瑞林)±氟他氨              雌莫司汀±长春碱，
                                                            氨鲁米特+氢化可的
                                                            松，雌莫司汀+依托泊
                                                            甙，
                                                            己烯雌酚，尼鲁米特肾**                  阿地白介素                                长春碱，氟尿苷
                  干扰素α视网膜母细胞瘤5*     阿霉素+环磷酰胺±claplatin±依托泊甙±    卡铂，依托泊甙，异
                  长春新碱                                   环磷酰胺with means肉瘤，软组织，成人*   阿霉素±达卡巴嗪±环磷酰胺±异环磷酰胺     丝裂霉素+阿霉素
                  with means                                 +claplatin
                                                             长春新碱，依托泊甙睾丸                  claplatin+依托泊甙±博来霉素(PEB)          长春碱(或依托泊甙)
                                                    +异环磷酰胺with
                                                    means+claplatin
                                                    (VIP)
                                                    骨髓移植3肾母细胞瘤5   放线菌素D+长春新碱±阿霉素±环磷酰胺     异环磷酰胺with
                                                    means，依托泊甙，卡
                                                    铂
*化疗只有中度活性。
**化疗只有较低活性。
1通常推荐他莫昔芬伴或不伴化疗用于绝经后雌激素受体-阳性，中度阳性患者，化疗伴或不伴他莫昔芬用于绝经前中度阳性患者。推荐辅助治疗伴化疗和/或他莫昔芬用于具有大肿瘤或其它不良预后指征的模式-阴性患者。
2甲地孕酮和其它激素剂可能在某些用他莫昔芬治疗失败的患者中有效。
3高剂量化疗之后(Medical Letter，34；79，1982)。
4对于直肠癌，用氟尿嘧啶加上照射进行术后辅助治疗，之前和之后单独用氟尿嘧啶治疗。
5仅当与手术切除、放疗或两者结合时，药物才具有较大活性。
6维生素A类似物lactratinoln(Acgutana)能控制瘤前病变(粘膜白斑)和减低第二原发肿瘤的速率(SE Banner等，J Natl CancerInst，88：140，1994)。
7高危患者(如，高计数，细胞遗传异常，成人)可能需要额外的药物用于诱导、维持和“强化”(在达到缓解后使用额外药物)。额外的药物包括环磷酰胺、米托蒽醌和硫鸟嘌呤。在英国进行的一项大型对照试验的结果提示强化可提高所有患ALL儿童的存活率(JMChasselle等，Lancet，34B：143，Jan 21，1995)。
8最初预后差的患者或在缓解后复发的患者。
9某些急性前髓细胞白血病患者对维A酸曾具有完全反应。这种治疗可引起一种主要特征为发热和呼吸窘迫的毒性综合征(RP Warre11，Jr等，N Engl J Med.328：177，1993)。
10同种异体HLA-相同同胞骨髓移植可治愈40％-70％处在慢性期的CML患者，18-28％加速期CML患者，和＜15％处于原始细胞危象的患者。骨髓移植后无病生存受到年龄＞50岁、疾病持续时间从诊断起＞3年和使用一个抗原-错配或匹配-不相关供体骨髓的不利影响。干扰素也可治疗获得完全细胞遗传反应(约10％)的慢性期CML患者；它是＞80岁新诊断出慢性期CML的患者和所有不是同种异体骨髓移植候选者的患者的所选治疗。单独化疗是姑息性的。
11如果用这些组合种的任何一种达到第2慢性期，应该考虑同种异体骨髓移植。在第2慢性期进行骨髓移植可治愈30％-35％的CML患者。
12有限阶段的霍奇金病(阶段1和2)通过放疗是可以治愈的。播散性疾病(阶段3b和4)需要化疗。某些中间阶段和选择的临床情形可受益于这两种治疗。
Figure A0181160500381
只在美国可以得到，用于研究。
                      抗癌药物和激素药物                      急性毒性                 延迟毒性
Figure A0181160500383
阿地白介素(白介素-2；     发热；液体潴留；高血压；    神经精神障碍；甲状腺功能Proleukin-Cetus           呼吸窘迫；皮疹；贫血；血    减退；肾病综合征；可能造Oncology)                 小板减少；恶心和呕吐；腹    成急性脑白质病；臂丛病；
                      泻；毛细血管渗漏综合征；    肠穿孔
                      肾毒性；心肌毒性；肝毒性；
                      结节性红斑；中性白细胞
                      趋化缺陷六甲蜜胺(六甲基-蜜胺；    恶心和呕吐                  骨髓抑制；CNS抑制；周围Hexalen-U Bioscience)                                 神经病；幻视；STEXIS；震
                                                  颤；脱发；皮疹氨鲁米特(Cytadren-Ciba)   嗜睡；恶心；头晕；皮疹      甲状腺功能减退(罕见)；
                                                  骨髓抑制；发热；低血压；
                                                  男性化安吖啶(m-AMSA；         恶心和呕吐；腹泻；输液时    骨髓抑制；肝损伤；惊厥；amaidine；               AMSP产生疼痛和静脉炎；过敏   口炎；室颤；脱发；充血性P-D-Parke-Davis，                                     心衰；肾功能障碍Amsidyl-Warner-Lambert)天冬酰胺酶(Elspar-merck；    恶心和呕吐；发热；寒战；               CNS抑制或兴奋性过度；急Kidrolase in Canada)         头痛；过敏；腹痛；高血糖               性出血性胰腺炎；凝血缺
                         导致昏迷                               陷；血栓；肾损伤；肝损伤宫颈                         claplatin                              苯丁酸氮芥，长春新
                         异环磷酰胺with means                   碱，氟尿嘧啶，阿霉
                         博来霉素+异环磷酰胺                    with  素，氨甲蝶呤，六甲
                         means+claplatin                        基蜜胺绒毛膜癌                     氨甲蝶呤±甲酰四氢叶酸                 氨甲蝶呤+放线菌素
                         放线菌素D                              D+环磷酰胺(MAC)
                                                                依托泊甙+氨甲蝶呤+
                                                                放线菌素D+环磷酰胺
                                                                +长春新碱结直肠*                      辅助结肠4：氟尿嘧啶+左旋四咪唑；氟尿   肝转移：肝动脉内
                         嘧啶+甲酰四氢叶酸                      氟尿苷
                         转移：氟尿嘧啶+甲酰四氢叶酸            丝裂霉素胚胎性横纹肌肉瘤5           长春新碱+放线菌素±环磷酰胺            同样+阿霉素
                         长春新碱+异环磷酰胺with means+依托泊
                         甙子宫内膜**                   甲地孕酮或另一种孕激素                 氟尿嘧啶，他莫昔芬，
                         阿霉素+claplatin±环磷酰胺             六甲基蜜胺食道*                        claplatin+氟尿嘧啶                     阿霉素，
                                                                氨甲蝶呤，丝裂霉素尤因肉瘤5           环磷酰胺(或异环磷酰胺with mcans)+            CAV+依托泊甙
                 阿霉素+长春新碱(CAV)±放线菌素D胃**                 氟尿嘧啶±甲酰四氢叶酸                       claplatin，阿霉素，
                                                              依托泊甙，氨甲蝶呤+
                                                              甲酰四氢叶酸，丝裂
                                                              霉素头和颈部鳞状细胞*6   claplatin+氟尿嘧啶                          博来霉素，卡铂，紫
                  氨甲蝶呤                                    杉醇胰岛细胞**            链佐星+阿霉素                               链佐星+氟尿嘧啶；
                                                              氯脲菌素 ；奥曲肽卡波西肉瘤*(爱滋病相   依托泊甙或干扰素α或长春碱                 长春新碱，阿霉素，关)                    阿霉素+博来霉素+长春新碱或长春碱           博来霉素
                   (ABV)白血病急性淋巴细胞白血病     诱导：长春新碱+强的松+天冬酰胺酶±放线     诱导：同样±高剂量氨(ALL)7                菌素D                                      甲蝶呤±阿糖胞苷；培
                   CNS预防：鞘内氨甲蝶呤±全身高剂量氨甲      门冬酶代替天冬酰胺
                   蝶呤及甲酰四氢叶酸±鞘内阿糖胞苷±鞘内     酶
                   氢化可的松                                 替尼泊甙或依托泊甙
                   维持：氨甲蝶呤+巯基嘌呤                    高剂量阿糖胞苷
                   骨髓移植38                                维持：同样+周期性长
                                                              春新碱+强的松急性髓细胞性白血病    诱导：阿糖胞苷+柔红霉素或伊达比星       阿糖胞苷+米托蒽醌(AML)8               诱导后：高剂量阿糖胞苷±其它药物如依托  高剂量阿糖胞苷
                  泊甙
                  骨髓移植3慢性淋巴细胞白血病    苯丁酸氮芥±强的松                      克拉屈滨，环磷酰胺，(CLL)                 氟达拉滨                                喷司他丁，长春新碱，
                                                          阿霉素
Figure A0181160500411
只在美国可以得到，用于研究
Figure A0181160500412
剂量限制效应以粗体表示。实际上所有的非激素抗癌药都已报道了皮肤反应(有时严重)，色素沉着过度和眼毒性。关于与其它药物的不良相互作用，参见the Medical Letter Hahdbook of Adverse DrugInteraction，1995。
1仅在美国可以得到，用于研究。
2甲地孕酮和其它激素剂可能在某些用他莫昔芬治疗失败的患者中有效。
3高剂量化疗之后(Medical Letter，34；79，1982)。
4对于直肠癌，用氟尿嘧啶加上照射进行术后辅助治疗，之前和之后单独用氟尿嘧啶治疗。
5仅当与手术切除、放疗或两者结合时，药物才具有较大活性。
6维生素A类似物异维A酸(Accutane)能控制瘤前病变(粘膜白斑)和减低大鼠第二原发肿瘤的速率(SE Banner等，J Natl CancerInst，88：140，1994)。
7高危患者(如，高计数，细胞遗传异常，成人)可能需要额外的药物用于诱导、维持和“强化”(在达到缓解后使用额外药物)。额外的药物包括环磷酰胺、米托蒽醌和硫鸟嘌呤。在英国进行的一项大型对照试验的结果提示强化可提高所有患ALL儿童的存活率(JMChasselle等，Lancet，34B：143，Jan 21，1995)。
8最初预后差的患者或在缓解后复发的患者。
9某些急性前髓细胞白血病患者对维A酸曾具有完全反应。这种治疗可引起一种主要特征为发热和呼吸窘迫的毒性综合征(RP Warrell，Jr等，N Engl J Med.328：177，1993)。
10同种异体HLA-相同同胞骨髓移植可治愈40％-70％处在慢性期的CML患者，15-25％加速期CML患者，和＜15％处于原始细胞危象的患者。骨髓移植后无病生存受到年龄＞50岁、疾病持续时间从诊断起＞3年和使用一个抗原-错配或匹配-不相关供体骨髓的不利影响。干扰素也可治疗获得完全细胞遗传反应(约10％)的慢性期CML患者；它是＞50岁新诊断出慢性期CML的患者和所有不是同种异体骨髓移植候选者的患者的所选治疗。单独化疗是姑息性的。
用99mTc放射性标记EC-MTX和EC-TDX
使用如EC-叶酸合成所述相同的方法，制备EC-MTX和EC-TDX。标记操作与制备99mTc-EC-叶酸所述相同，除了使用EC-MTX和EC-TDX。99mTc-EC-MTX和99mTc-EC-TDX的合成如图2和图3所示。
99mTc-EC-叶酸、99mTc-EC-MTX和99mTc-EC-TDX的稳定性测定
在血清样本中测试99mTc-EC-叶酸、99mTc-EC-MTX和99mTc-EC-TDX的稳定性。简而言之，将740KBq的1mg99mTc-EC-叶酸、99mTc-EC-MTX和99mTc-EC-TDX置于狗血清(200μl)中在37℃温育4小时。将血清样本用50％的甲醇水溶液稀释并如上所述在0.5、2和4小时重复放射-TLC。
组织分布研究
对雌性Fischer344大鼠(150±25g)(Harlan Sprague-Dawley，Indianapolis，IN)用0.1ml来自13762肿瘤细胞系悬液的乳腺肿瘤细胞用25-口径针头进行皮下接种(106细胞/大鼠，对Fischer大鼠特异性的肿瘤细胞系)至后腿。植入后14至17天当肿瘤达到大约1cm直径时进行研究。在每次操作前用氯胺酮(10-15mg/大鼠，腹膜内)麻醉动物。
在组织分布研究中，对每只动物静脉内注射370-550 KBq的99mTc-EC-叶酸或99mTc-EC(n＝3/时间点)。各配体的注射质量为10μg/大鼠。在施用放射性药物后20分钟、1、2和4小时，处死麻醉动物并切除肿瘤和选择的组织，称重并通过γ计数器(Packard Instruments，Downers Grove，IL)进行放射性计数。示踪剂在各样本中的生物分布计算为注射的剂量/克组织湿重的百分比(％ID/g)。来自原始注射物的稀释样本的计数用作参照。从相应的％ID/g值计算肿瘤/非靶组织计数密度比。用学生-t检验评价两组之间差异的显著性。
在一项单独的研究中，进行阻断研究以确定受体-介导的过程。在阻断研究中，对于99mTc-EC-叶酸，向携带肿瘤的大鼠共同施用(i.v.)50和150μmol/kg叶酸(n＝3/组)。注射后1小时杀死动物并收集数据。
闪烁显像和放射自显影研究
在i.v.注射18.5MBq 99mTc-标记的放射性示踪剂后0.5、2和4小时，用配备有低能平行孔准直仪的γ照相机(Siemens MedicalSystems，Inc.，Hoffman Estates，IL)获得闪烁显像。
通过定量图象分析仪(Cyclone Storage Phophor System，Packard，Meridian，CI.)获得全身放射自显影。i.v.注射37MBq 99mTc-EC-叶酸后，在1小时处死动物并将尸体固定在羧甲基纤维素(4％)中。将冷冻的尸体置于恒冷切片机(LKB 2250低温切片机)上并切成100μm冠状切片。将各切片融化并置于载玻片上。然后将玻片置于与多功能磷光屏存储器屏幕(MP，7001480)接触，并暴露15小时(99mTc标记的)。用红色激光激发磷光屏存储器并记录所产生的与先前吸收的能量成比例的蓝光。
结果
99mTc-EC-叶酸的化学性质和稳定性
开发了一种简单快速并且高产率的叶酸的氨基乙基酰胺和EC类似物、MTX和TDX。这些类似物的结构通过NMR和质谱分析证实。实现了高(＞95％)放射化学纯度的EC-叶酸与99mTc的放射合成。发现99mTc-EC-叶酸在狗血清样本中20分钟、1、2和4小时保持稳定。
99mTc-EC-叶酸的生物分布
生物分布研究显示对99mTc-EC-叶酸在20分钟-4小时肿瘤/血液计数密度比逐渐增加，而对于99mTc-EC在相同时间段内这些值减少(图4)。在表3和4中分别给出了99mTc-EC-叶酸和99mTc-EC的％ID/g摄取值、肿瘤/血液和肿瘤/肌肉比。
                        表3
    99mTc-EC-叶酸在携带乳腺肿瘤的大鼠中的生物分布
             注射的99mTc-EC-叶酸剂量/器官或组织％
             20分钟          1小时          2小时            4小时血液         0.370±0.049    0.165±0.028    0.086±0.005    0.058±0.002肺           0.294±0.017    0.164±0.024    0.092±0.002    0.063±0.003肝           0.274±0.027    0.185±0.037    0.148±0.042    0.105±0.002胃           0.130±0.002    0.557±0.389    0.118±0.093    0.073±0.065肾           4.328±0.896    4.052±0.488    5.102±0.276    4.673±0.399甲状腺       0.311±0.030    0.149±0.033    0.095±0.011    0.066±0.011肌肉         0.058±0.004    0.0257±0.005   0.016±0.007    0.008±0.0005小肠         0.131±0.013    0.101±0.071    0.031±0.006    0.108±0.072尿           12.637±2.271   10.473±3.083   8.543±2.763    2.447±0.376肿瘤         0.298±0.033    0.147±0.026    0.106±0.029    0.071±0.006肿瘤/血液    0.812±0.098    0.894±0.069    1.229±0.325    1.227±0.129肿瘤/肌肉    5.157±0.690    5.739±0.347    6.876±2.277    8.515±0.307
显示的值代表来自3只动物的数据的平均值±标准差。
闪烁显像和放射自显影研究
在不同时间点获得的闪烁显像显示在注射99mTc-EC-叶酸的组中可见肿瘤。相反，在注射99mTc-EC的组中没有明显的肿瘤摄取(图6)。两种放射性示踪剂在所有图象中均显示明显的肾摄取。注射99mTc-EC-叶酸后1小时进行的放射自显影清楚地证实了肿瘤活性。
实施例2：肿瘤缺氧寻靶
2-(2-甲基-5-硝基-1H咪唑基)乙胺(甲硝唑的氨基类似物，MN-NH2)的合成
根据前述的方法(Hay等，1994)合成甲硝唑的氨基类似物。简而言之，将甲硝唑转化为甲磺酰化类似物(mp 149-150℃，报道值153-154℃，TLC：乙酸乙酯，Rf＝0.45)，产率75％。然后甲磺酰化甲硝唑与叠氮化钠反应以得到叠氮类似物(TLC：乙酸乙酯，Rf＝0.52)，产率80％。将该叠氮类似物用三苯膦还原并得到(60％)所希望的氨基类似物((mp 190-192℃，报道值194-195℃，TLC：乙酸乙酯，Rf＝0.15)。茚三酮(2％在甲醇中)喷雾表明MN-NH2氨基基团阳性。通过1H-NMR和质谱(FAB-MS)m/z 171(M+H，100)证实了其结构。
乙二半胱氨酸-甲硝唑(EC-MN)的合成
将氢氧化钠(2N，0.2ml)加入EC(134ma，0.50mmol)在水(5ml)中的搅拌溶液。向该无色溶液中加入硫代-NHS(217mg，1.0mmol)和EDC(192ma，1.0mmol)。然后加入MN-NH：二盐酸盐(340mg，2.0mmol)。将混合物在室温下搅拌24小时。将混合物用截断值500的Spectra/POR分子多孔膜(Spectrum Medical Industries Inc.，Houston，TX)透析48小时。透析后，将产物用冻干器(Labconco，Kansas City，MO)冻干。产物重315mg(产率55％)；1H-NMR(D2O)δ2.93(s，6H，硝基咪唑- CH 3)，2.60-2.95(m，4H和EC的-CH2-SH)，3.30-3.66(m，8H，EC的乙二胺和硝基咪唑-CH2- CH 2-NH2)，3.70-3.99(t，2H，EC的NH-CH-CO)，5.05(t，4H，甲硝唑- CH 2-CH2-NH2)(s，2H，硝基咪唑C＝CH)。FAB MS m/z 572(M+，20)。EC-MN的合成方案如图7所示。
3-(2-硝基-1H-咪唑基)丙胺(硝基咪唑的氨基类似物，NIM-NH2)的合成
向含有2-硝基咪唑(1g，8.34mmol)和Cs2CO3(2.9g，8.90mmol)在二甲基甲酰胺(DMF，50ml)中的搅拌混合物中，加入1，3-二甲苯磺酰基丙烷(3.84g，9.99mmol)。将该反应体系在80℃加热3小时。在真空下蒸发溶剂并将残余物悬于乙酸乙酯中。过滤固体，将溶剂浓缩，装在硅胶柱上并用己烷∶乙酸乙酯(1∶1)洗脱。分离产物3-甲苯磺酰基-(2-硝基咪唑)(1.67g，57.5％)，mp108-111℃。1H-NMR(CDCl3)δ2.23(m，2H)，2.48(S，3H)，4.06(t，2H，J＝5.7Hz)，4.52(t，2H，J＝6.8Hz)，7.09(S，1H)，7.24(S，1H)，7.40(d，2H，J＝8.2Hz)，7.77(d，2H，J＝8.2Hz)。
然后将甲苯磺酰化的2-硝基咪唑(1.33g，4.08mmol)与叠氮化钠(0.29g，4.49mmol)在DMF(10ml)中在100℃下反应3小时。冷却后，加入水(20ml)并将产物从乙酸乙酯(3×20ml)提取。溶剂经MgSO4干燥并蒸发至干以得到叠氮类似物(0.6g，75％，TLC∶己烷∶乙酸乙酯；1∶1，Rf＝0.42)。1H-NMR(CDCl3)δ2.14(m，2H)，3.41(t，2H，J＝6.2Hz)，4.54(t，2H，J＝6.9Hz)，7.17(S，2H)。
将叠氮类似物(0.57g，2.90mmol)用三苯膦(1.14g，4.35mmol)在四氢呋喃(THF)中在室温下还原4小时。加入浓HCl(12ml)并再加热5小时。产物从乙酸乙酯和水混合物中提取。乙酸乙酯经MgSO4干燥并蒸发至干以得到胺氢氯化物类似物(360ma，60％)。茚三酮(2％在甲醇中)喷雾表明NIM-NH氨基基团阳性。1H-NMR(D2O)δ2.29(m，2H)，3.13(t，2H，J＝7.8Hz)，3.60(br，2H)，4.35(t，2H，J＝7.4Hz)，7.50(d，1H，J＝2.1Hz)，7.63(d，1H，J＝2.1Hz)。
乙二半胱氨酸-硝基咪唑(EC-NIM)的合成
将氢氧化钠(2N，0.6ml)加入EC(134ma，0.50mmol)在水(2ml)中的搅拌溶液。向该无色溶液中，加入硫代-NHS(260.6mg，1.2mmol)，EDC(230ma，1.2mmol)和氢氧化钠(2N，1ml)。然后加入NIM-NH2盐酸盐(206.6mg，1.0mmol)。将该混合物在室温下搅拌24小时。将该混合物用截断值500的Spectra/POR分子多孔膜(Spectrum MedicalIndustries Inc.，Houston，TX)透析48小时。透析后，将产物用冻干器(Labconco，Kansas City，MO)冻干。产物重594.8mg(产率98％)。EC-NIM的合成方案见图8A。其结构通过1H-NMR(D2O)(图8B)证实。
用99mTc对EC-MN和EC-NIM进行放射性标记
通过将所需量的99mTc高锝酸盐加入包含EC-MN或EC-NIM的冻干残余物(3mg)、SnCl2(100μg)、Na2HPO4(13.5mg)、抗坏血酸(0.5mg)和NaEDTA(0.5mg)的自制试剂盒完成99mTc-EC-MN和99mTc-EC-NIM的放射合成。制剂的终pH为7.4。通过TLC(ITLACSG，Gelman Sciences，Ann Arbor，MI)测定放射化学纯度，分别用丙酮(体系A)和乙酸铵(1M水溶液)∶甲醇(4∶1)(体系B)洗脱。从放射-TLC(Bioscan，Washington，DC)分析，两种放射性示踪剂的放射化学纯度均＞96％。
[18F]FMISO和[131I]IMISO的合成
通过回旋加速器用质子辐射在小体积银靶中的富集18O-水而产生[18F]。将甲苯磺酰基MISO(Hay等，1994)(20mg)溶于乙腈(1.5ml)中，加入穴状化合物(kryptofix)-氟复合物。加热、水解和柱纯化后，在60分钟用加速器束流(EOB)分离纯产物，产率为25-40％(衰变校正)。在C-18 ODS-20T柱，4.6×25mm(WatersCorp.，Milford，Mass)上进行HPLC，用水/乙腈，(80/20)，流速为1ml/min。未添加载体的产物对应于在相似条件下未标记FMISO的保留时间(6.12分钟)。放射化学纯度大于99％。在UV探测器下(310nm)，没有其它杂质。基于对已知质量和放射性的样本的UV和放射性检测，所测定的[18F]FMISO的特定活性为1Ci/μmol。
用相同的前体制备[131I]IMISO(Cherif等，1994)，简而言之，将5mg甲苯磺酰化MISO溶于乙腈(1ml)中，并加入Na131I(1mCi在0.1ml 1N NaOH中)(Dupont New England Nuclear，Boston.MA)。加热并纯化后，得到产物(60-70％产率)。放射-TLC表明用氯仿∶甲醇(7∶3)作为洗脱剂，终产物的Rf值为0.01。
99mTc-EC-MN和99mTc-EC-NIM的稳定性测定
在血清样本中测试标记的99mTc-EC-MN和99mTc-EC-NIM的稳定性。简而言之，将740KBq的1mg99mTc-EC-MN和99mTc-EC-NIM在狗血清(200μl)中37℃温育4小时。用50％的甲醇水溶液稀释血清样本并如上所述在0.5、2和4小时重复放射-TLC。
99mTc-EC-MN的组织分布研究
将雌性Fischer344大鼠(150±25g)(Harlan Sprague-Dawley，Indianapolis，IN)用0.1ml来自13762肿瘤细胞系悬液的乳腺肿瘤细胞用25-口径针头进行皮下接种(106细胞/大鼠，对Fischer大鼠特异性的肿瘤细胞系)至后腿。植入后14至17天当肿瘤达到大约1cm直径时进行研究。在每次操作前用氯胺酮(10-15mg/大鼠，腹膜内)麻醉动物。
在组织分布研究中，对每只动物静脉内注射370-550KBq的99mTc-EC-MN或99mTc-EC(n＝3/时间点)。99mTc-EC-MN的注射质量为10μg/大鼠。在施用放射性示踪剂后0.5、2和4小时，处死大鼠并切除所选择的组织，称重并进行放射性计数。示踪剂在各样本中的生物分布计算为注射的剂量/克组织温重的百分比(％ID/g)。从相应的％ID/g值计算肿瘤/非靶组织计数密度比。将数据与使用相同动物模型的[18F]FMISO和[131I]IMISO相比较.用学生-t检验评价组间差异的显著性。
闪烁显像和放射自显影研究
在i.v.注射18.5MBq各示踪剂后0.5、2和4小时，用配备有低能平行孔准直仪的γ照相机(Siemens Medical Systems，Inc.，HoffmanEstates，IL)获得闪烁显像。
通过定量图象分析仪(Cyclone Storage Phophor System，Packard，Meridian，CI.)获得全身放射自显影。i.v.注射37MBq 99mTc-EC-MN后，在1小时处死动物并将尸体固定在羧甲基纤维素(4％)中，如先前所述(Yang等，1995)。将冷冻的尸体放到恒冷切片机(LKB 2250低温切片机)上并切成100μm冠状切片。将各切片融化并置于载玻片上。然后将玻片置于与多功能磷光屏存储器屏幕(MP，7001480)相接触，并暴露15小时。
为了确定99mTc-EC-NIM是否能监测肿瘤对化疗的反应，用单一剂量的紫杉醇治疗一组肿瘤体积为1.5cm的大鼠和携带卵巢肿瘤的小鼠(40mg/kg/大鼠，80mg/kg/小鼠，i.v.)。在紫杉醇治疗后第4天取影像。确定治疗或未治疗的情况下注射的剂量/克肿瘤重量的百分比。
极谱氧微电极pO2测量
为了证实肿瘤缺氧，用Eppendorf计算机化组织学系统进行肿瘤内pO2测量。对每个肿瘤以0.4mm间隔沿2-3条线形轨迹的每一条进行20-25次pO2测量(共40-75次测量)。在3只携带肿瘤的大鼠身上进行肿瘤pO2测量。用在线计算机系统，每条轨迹的点测量表示为相对于测量点沿轨迹的位置的绝对值，以及在pO2柱状图中在0-100mmHg(组宽为2.5mm)之间的相对频率。
结果
99mTc-EC-MN和99mTc-EC-NIM的放射合成和稳定性
完成EC-MN和EC-NIM与99mTc的放射合成，具有高放射化学纯度(＞95％)。放射化学产率为100％。发现99mTc-EC-MN和99mTc-EC-NIM(图13)在狗血清样本中在0.5、2和4小时是稳定的。没有观察到降解产物。用相同前体容易地实现MISO的放射氟化和放射碘化。在这两种标记的MISO类似物中，放射化学纯度均大于99％。
体内组织分布研究
99mTc-EC-MN和99mTc-EC在携带肿瘤的大鼠中的组织分布在表4和5中显示。由于对离子99mTc的高亲和性，没有显著和一致的甲状腺摄取，提示99mTc-EC-MN的体内稳定性(表5)。
                    表4
    99mTc-EC在携带乳腺肿瘤的大鼠中的生物分布
            注射的99mTc-EC      剂量/器官或组织％
            20分钟           1小时          2小时           4小时血液         0.435±0.029    0.273±0.039    0.211±0.001    0.149±0.008肺           0.272±0.019    0.187±0.029    0.144±0.002    0.120±0.012肝           0.508±0.062    0.367±0.006    0.286±0.073    0.234±0.016胃           0.136±0.060    0.127±0.106    0.037±0.027    0.043±0.014肾           7.914±0.896    8.991±0.268    9.116±0.053    7.834±1.018甲状腺       0.219±0.036    0.229±0.118    0.106±0.003    0.083±0.005肌肉         0.060±0.006    0.043±0.002    0.028±0.009    0.019±0.001小肠         0.173±0.029    0.787±0.106    0.401±0.093    0.103±0.009尿           9.124±0.808    11.045±6.158   13.192±4.505   8.693±2.981肿瘤         0.342±0.163    0.149±0.020    0.115±0.002    0.096±0.005肿瘤/血液    0.776±0.322    0.544±0.004    0.546±0.010    0.649±0.005肿瘤/肌肉    5.841±3.253    3.414±0.325    4.425±1.397    5.093±0.223显示的数值代表来自3只动物的数据的平均值±标准差。在阻断研究中，同时施用叶酸，肿瘤/肌肉和肿瘤/血液计数密度比显著降低(p＜0.01)(图5)。
                    表5
99mTc-EC-甲硝唑缀合物在携带乳腺肿瘤的大鼠1中的生物分布
            30分钟          2小时             4小时血液          1.46±0.73     1.19±0.34        0.76±0.14肺            0.79±0.39     0.73±0.02        0.52±0.07肝            0.83±0.36     0.91±0.11        0.87±0.09脾            0.37±0.17     0.41±0.04        0.37±0.07肾            4.30±1.07     5.84±0.43        6.39±0.48肌肉          0.08±0.03     0.09±0.01        0.07±0.01小肠          0.27±0.12     0.39±0.24        0.22±0.05甲状腺        0.051±0.16    0.51±0.09        0.41±0.02肿瘤          0.034±0.13    0.49±0.02        0.50±0.09
1.每只大鼠接受99m Tc-EC-甲硝唑(10μCi，iv)。各值是注射剂量/克重量的百分比(n＝3)/时间间隔。各数据代表3次测量的平均值及标准差。
生物分布研究显示，对于99mTc-EC-MN、[18F]FMISO和[131I]IMISO，肿瘤/血液和肿瘤/肌肉计数密度比在0.54小时逐渐增加，而对于99mTc-EC，在相同的时间段内这些值不改变(图9和图10)。[18F]FMISO比起[131I]IMISO和99mTc-EC-MN在注射后30分钟、2和4小时显示最高的肿瘤/血液摄取比。对于99mTc-EC-MN和[131I]IMISO在注射后2和4小时的肿瘤/血液和肿瘤/肌肉比并无显著差异(p＜0.05)。
闪烁显像和放射自显影研究
在不同时间点获得的闪烁显像显示在99mTc-EC-MN和99mTc-EC-NIM组中肿瘤可见。相反，在注射99mTc-EC组中没有明显的肿瘤摄取(图11)。注射99mTc-EC-MN后1小时进行的放射自显影清楚地证实了肿瘤活性(图12)。与99mTc-EC-MN相比，由于更高的肿瘤/背景比，99mTc-EC-NIM似乎提供更好的闪烁显像。在携带乳腺肿瘤的大鼠中，肿瘤摄取在99mTc-EC-NIM组中明显高于99mTc-EC(图14A)。从99mTc-EC-NIM的注射剂量/克肿瘤重量的百分比得到的数据表明，当与对照组相比时，在用紫杉醇治疗的大鼠中摄取减少25％(图14B)。
在携带卵巢肿瘤的小鼠中，在用紫杉醇治疗的小鼠中肿瘤摄取减少(图15A和图15B)。在携带肉瘤的大鼠中观察到类似的结果(图15C和图15D)。由此，99mTc-EC-NIM可用于评估肿瘤对紫杉醇治疗的反应。
极谱氧微电极pO2测量
对肿瘤进行的肿瘤内pO2测量表明，与正常肌肉的35±10mmHg相比，肿瘤氧压力范围为4.6±1.4mmHg。该数据表明肿瘤是缺氧的。
实施例3：癌症的肽显像
乙二半胱氨酸-五谷氨酸(EC-GAP)的合成
将氢氧化钠(1N，1ml)加入EC(200mg，0.75mmol)在水(10ml)中的搅拌溶液。向该无色溶液中加入硫代-NHS(162mg，0.75mmol)和EDC(143mg，0.75mmol)。然后加入五谷氨酸钠盐(M.W.750-1500，Sigma Chemical Company)(500mg，0.67mmol)。将混合物在室温下搅拌24小时。将混合物用截断值500的Spectra/POR分子多孔膜(Spectrum Medical Industries Inc.，Houston，TX)透析48小时。透析后，将产物用冻干器(Labconco，Kansas City，MO)冻干。盐形式的产物重0.95g。EC-GAP的合成方案如图16所示。
99mTc-EC-GAP的稳定性测定
使用先前描述的相同方法用99mTc放射性标记EC-GAP。放射化学纯度为100％。在血清样本中测试标记的99mTc-EC-GAP的稳定性。简而言之，将740KBq的1mg99mTc-EC-GAP在狗血清(200μl)中37℃温育4小时。将血清样本用50％的甲醇水溶液稀释并如上所述在0.5、2和4小时重复放射-TLC。
闪烁显像研究
在i.v.注射18.5 MBq各示踪剂后0.5、2和4小时，用配备有低能平行孔准直仪的γ照相机获得闪烁显像。结果
99mTc-EC-GAP的稳定性测定
发现99mTc-EC-GAP在狗血清样本中在0.5、2和4小时是稳定的。没有观察到降解产物。
闪烁显像研究
在不同时间点获得的闪烁显像显示在99mTc-EC-GAP组中肿瘤可见。最佳摄取在给药后30分钟至1小时(图17)。
实施例4：肿瘤凋亡细胞显像
乙二半胱氨酸-膜联蛋白V(EC-ANNEX)的合成
将碳酸氢钠(1N，1ml)加入EC(5mg，0.019mmol)的搅拌溶液。向该无色溶液中加入硫代-NHS(4mg，0.019mmol)和EDC(4mg，0.019mmol)。然后加入膜联蛋白V(M.W.33kD，人，Sigma ChemicalCompany)(0.3mg)。将混合物在室温下搅拌24小时。将混合物用截断值10,000的Spectra/POR分子多孔膜(Spectrum MedicalIndustries Inc.，Houston，TX)透析48小时。透析后，将产物用冻干器(Labconco，Kansas City，MO)冻干。盐形式的产物重12mg。
99mTc-EC-ANNEX的稳定性测定
使用先前在EC-GAP中描述的相同方法用99mTc放射性标记EC-ANNEX。放射化学纯度为100％。在血清样本中测试标记的99mTc-EC-ANNEX的稳定性。简而言之，将740KBq的lmg99mTc-EC-ANNEX在狗血清(200μl)中37℃温育4小时。将血清样本用50％的甲醇水溶液稀释并如上所述在0.5、2和4小时重复放射-TLC。
闪烁显像研究
在i.v.注射18.5MBq放射性示踪剂后0.5、2和4小时，用配备有低能平行孔准直仪的γ照相机获得闪烁显像。所用的动物模型为乳腺、卵巢和肉瘤。已知携带乳腺和卵巢肿瘤的大鼠均过量表达高凋亡细胞。显像研究在肿瘤细胞接种后第14天进行。为了确定肿瘤治疗反应，对预显像的小鼠施用紫杉醇(80mg/Kg，iv，第14天)并在第18天取影像。
结果
99mTc-EC-ANNEX的稳定性测定
发现99mTc-EC-ANNEX在狗血清样本中在0.5、2和4小时是稳定的。没有观察到降解产物。
闪烁显像研究
在不同时间点获得的闪烁显像显示在99mTc-EC-ANNEX组中肿瘤可见(图18-20)。影像表明高度凋亡细胞具有更多99mTc-EC-ANNEX摄取。在高凋亡(携带卵巢肿瘤)组中(图19A和图19B)和低凋亡(携带肉瘤)组中(图20A和图20B)，[紫杉醇]治疗前和后之间肿瘤摄取无显著差异。
实施例5：肿瘤血管发生显像
秋水仙碱的氨基类似物(COL-NH2)的合成
根据先前描述的方法(Orr等，1995)合成秋水仙碱的脱甲基的氨基和羟基类似物。简而言之，将秋水仙碱(4g)溶于100ml含25％硫酸的水中。将该反应混合物在100℃加热5小时。将该混合物用碳酸钠中和。过滤产物并经冻干器干燥，得到2.4g(70％)所期望的氨基类似物(mp153-155℃，报道值155-157℃)。茚三酮(2％在甲醇中)喷雾表明COL-NH2氨基基团阳性。通过1H-NMR和质谱(FAB-MS)证实其结构。1H-NMR(CDCl3)δ8.09(S，1H)，7.51(d，1H，J＝12Hz)，7.30(d，1H，J＝12Hz)，6.56(S，1H)，3.91(S，6H)，3.85(m，1H)，3.67(S，3H)，2.25-2.52(m，4H).m/z 308.2(M+，20)，307.2(100)。
乙二半胱氨酸-秋水仙碱(EC-COL)的合成
将氢氧化钠(2N，0.2ml)加入EC(134mg，0.50mmol)在水(5ml)中的搅拌溶液。向该无色溶液中加入硫代-NHS(217mg，1.0mmol)和EDC(192mg，1.0mmol)。然后加入COL-NH2(340mg，2.0mmol)。将混合物在室温下搅拌24小时。将混合物用截断值500的Spectra/POR分子多孔膜(Spectrum Medical Industries Inc.，Houston，TX)透析48小时。透析后，将产物用冻干器(Labconco，Kansas City，MO)冻干。产物重315mg(产率55％)。1H-NMR(D2O)δ7.39(S，1H)，7.20(d，1H，J＝12Hz)，7.03(d，1H，J＝12Hz)，6.78(S，1H)，4.25-4.40(m，1H)，3.87(S，3H，-OCH3)，3.84(S，3H，-OCH3)，3.53(S，3H，-OCH3)，3.42-3.52(m，2H)，3.05-3.26(m，4H)，2.63-2.82(m，4H)，2.19-2.25(m，4H).FAB MS m/z 580(钠盐，20)。EC-COL的合成方案如图21所示。
用99mTc放射性标记EC-COL和EC
通过将所需量的99mTc-高锝酸盐加入含有EC-COL的冻干残余物(5mg)、SnCl2(100μg)、Na2HPO4(13.5mg)、抗坏血酸(0.5mg)和NaEDTA(0.5mg)的自制试剂盒完成99mTc-EC-COL的放射合成。制剂的终pH为7.4。99mTc-EC也通过使用含有以下成分的自制试剂盒获得：EC的冻干残余物(5mg)、SnCl2(100μg)、Na2HPO4(13.5mg)、抗坏血酸(0.5mg)和NaEDTA(0.5mg)，pH为10。然后将制剂的终pH调至7.4。通过TLC(ITLC SG，Gelman Sciences，Ann Arbor，MI)测定放射化学纯度，用乙酸铵(1M水溶液)∶甲醇(4∶1)洗脱。用放射-薄层层析(TLC，Bioscan，Washington，DC)分析两种放射性示踪剂的放射化学纯度。
99mTc-EC-COL的稳定性测定
在血清样本中测试标记的99mTc-EC-COL的稳定性。简而言之，将740KBq的5mg99mTc-EC-COL在兔血清(500μl)中37℃温育4小时。用50％的甲醇水溶液稀释血清样本并如上所述在0.5、2和4小时重复放射-TLC。
组织分布研究
将雌性Fischer344大鼠(150±25g)(Harlan Sprague-Dawley，Indianapolis，IN)用0.1ml来自13762肿瘤细胞系悬液的乳腺肿瘤细胞用25-口径针头进行皮下接种(106细胞/大鼠，对Fischer大鼠特异性的肿瘤细胞系)至后腿。植入后14至17天当肿瘤达到大约1cm直径时进行研究。在每次操作前用氯胺酮(10-15mg/大鼠，腹膜内)麻醉动物。
在组织分布研究中，对每只动物静脉内注射370-550KBq的99mTc-EC-COL或99mTc-EC(n＝3/时间点)。99mTc-EC-COL的注射质量为10μg/大鼠。在施用放射性示踪剂后0.5、2和4小时，处死大鼠并切除所选择的组织，称重并进行放射性计数。示踪剂在各样本中的生物分布计算为注射的剂量/克组织湿重的百分比(％ID/g)。从相应的％ID/g值计算肿瘤/非靶组织计数密度比。用学生-t检验评价组间差异的显著性。
闪烁显像研究
在i.v.注射300μCi的99mTc-EC-COL和99mTc-EC后0.5、2和4小时，用配备有低能平行孔准直仪的γ照相机(Siemens Medical Systems，Inc.，Hoffman Estates，IL)获得闪烁显像。用计算机勾画出的感兴趣区域(ROI)定量(计数/象素)肿瘤摄取相对正常肌肉摄取。
结果
99mTc-EC-COL的放射合成和稳定性
完成用99mTc对EC-COL进行的放射合成，放射化学纯度高(＞95％)(图21)。发现99mTc-EC-COL在兔血清样本中在0.5、2和4小时是稳定的。没有观察到降解产物(图22)。
体内生物分布
99mTc-EC-COL和99mTc-EC在携带乳腺肿瘤的大鼠体内的生物分布如表4和6所示。99mTc-EC-COL在0.5、2和4小时的肿瘤摄取值(％ID/g)为0.436±0.089，0.395±0.154和0.221±0.006(表6)，而对于99mTc-EC这些值分别为0.342±0.163，0.115±0.002和0.097±0.005(表4)。在99mTc-EC-COL组中观察到作为对时间函数的肿瘤/血液比(0.52±0.12至0.72±0.07)和肿瘤/肌肉比(3.47±0.40至7.97±0.93)增加(图23)。相反，对于99mTc-EC，在相同的时间段内当与99mTc-EC-COL组相比时，肿瘤/血液和肿瘤/肌肉比值显示时间依赖性降低(图24)。
                    表699mTc-EC-秋水仙碱在携带乳腺肿瘤的大鼠中的生物分布
          30分钟          2小时           4小时血液      0.837±0.072    0.606±0.266    0.307±0.022肺        0.636±0.056    0.407±0.151    0.194±0.009肝        1.159±0.095    1.051±0.213    0.808±0.084脾        0.524±0.086    0.559±0.143    0.358±0.032肾        9.705±0.608    14.065±4.007   11.097±0.108肌肉      0.129±0.040    0.071±0.032    0.028±0.004胃        0.484±0.386    0.342±0.150    0.171±0.123子宫      0.502±0.326    0.343±0.370    0.133±0.014甲状腺    3.907±0.997    2.297±0.711    1.709±0.776肿瘤      0.436±0.089    0.395±0.154    0.221±0.006
*每只大鼠接受99mTc-EC-秋水仙碱(10μCi，iv)。各值是注射剂量/克组织重量的百分比(n＝3)/时间间隔。各数据代表3次测量的平均值及标准差。
                        表7
        由放射-TLC(ITLC-SG)研究测定的Rf值
                       体系A*         体系B
99mTc-EC-叶酸            0           1(＞95％)
99mTc-EC                 0           1(＞95％)
游离99mTc                1           1
还原的99mTc              0           0
*丙酮
Figure A0181160500562
乙酸铵(1M水溶液)∶甲醇(4∶1)
99mTc-EC-COL在携带乳腺肿瘤的大鼠中的γ闪烁显像
在3只携带乳腺肿瘤的大鼠中给药后1小时进行的体内显像研究表明，在99mTc-EC-COL组中肿瘤可良好显现(图25)，而在99mTc-EC组中观察到较低的肿瘤摄取(图26)。计算机勾画的感兴趣区域(ROI)显示在99mTc-EC-COL组中肿瘤/背景比显著高于99mTc-EC组(图27)。
肿瘤糖酵解寻靶
实施例6：开发99mTc-EC-新霉素
EC的合成
根据前述方法以两步合成制备EC(Ratner和Clarke，1937；Blondeau等，1967)。合成前体L-噻唑烷-4-甲酸(mp195°，报道值196-197°)。然后制备EC(mp237°，报道值251-253°)。通过1H-NMR和快原子轰击质谱(FAB-MS)证实其结构。
乙二半胱氨酸-新霉素(EC-新霉素)的合成
将氢氧化钠(2N，0.2ml)加入EC(134mg，0.50mmol)在水(5ml中的搅拌溶液。向该无色溶液中加入硫代-NHS(217mg，1.0mmol)和EDC(192mg，1.0mmol)。然后加入新霉素三硫酸盐(909mg，1.0mmol)。将混合物在室温下搅拌24小时。将混合物用截断值500的Spectra/POR分子多孔膜(Spectrum Medical Industries Inc.，Houston，TX)透析48小时。透析后，将产物用冻干器(Labconco，Kansas City，MO)冻干。产物重720mg(产率83％)。EC-新霉素的合成方案如图36所示。通过1H-NMR(图38A-B)、质谱(图39A-B)和元素分析(Galbraith Laboratories，Inc.，Knoxville，TN)证实其结构。元素分析C39H75N10S4O19.15H2O(C，H，N，S)，计算值：C：33.77，H：7.58，N：10.11，S：9.23；实测值：C：32.44，H：5.90，N：10.47，S：10.58。与EC和新霉素相比，EC-新霉素的UV波长迁移至270.5nm(图40A-C)。
用99mTc放射性标记EC-MN和EC-新霉素
通过将所需量的99mTc-高锝酸盐加入包含EC或EC-新霉素的冻干残余物(10mg)、SnCl2(100μg)、Na2HPO4(13.5mg)和抗坏血酸(0.5mg)的自制试剂盒完成99mTc-EC和99mTc-EC-新霉素的放射合成。然后加入在0.1ml水中的NaEDTA(0.5mg)。制剂的终pH为7.4。通过TLC(ITLCSG，Gelman Sciences，Ann Arbor，MI)测定放射化学纯度，用乙酸铵(1M水溶液)∶甲醇(4∶1)洗脱。从放射-TLC(Bioscan，Washington，DC)分析(图41)和HPLC分析(图42-45)，两种放射性示踪剂的放射化学纯度均＞95％。
99mTc-EC和99mTc-EC-新霉素的稳定性测定
在狗血清样本中测试标记的99mTc-EC和99mTc-EC-新霉素的稳定性。简而言之，将740KBq的1mg99mTc-EC和99mTc-EC-新霉素在狗血清(200μl)中37℃温育4小时。用50％的甲醇水溶液稀释血清样本并如上所述在0.5、2和4小时重复放射-TLC。
99mTc-EC-新霉素的组织分布研究
将雌性Fischer344大鼠(150±25g)(Harlan Sprague-Dawley，Indianapolis，IN)用0.1ml来自13762肿瘤细胞系悬液的乳腺肿瘤细胞用25-口径针头进行皮下接种(106细胞/大鼠，对Fischer大鼠特异性的肿瘤细胞系)至后腿。植入后14至17天当肿瘤达到大约1cm直径时进行研究。在每次操作前用氯胺酮(10-15mg/大鼠，腹膜内)麻醉动物。
在组织分布研究中，对每只动物静脉内注射10-20μCi的99mTc-EC或99mTc-EC-新霉素(n＝3/时间点)。99mTc-EC-新霉素的注射质量为200μg/大鼠。在施用放射性示踪剂后0.5、2和4小时，处死大鼠并切除所选择的组织，称重并进行放射性计数。示踪剂在各样本中的生物分布计算为注射的剂量/克组织湿重的百分比(％ID/g)。从相应的％ID/g值计算肿瘤/非靶组织计数密度比。当与99mTc-EC(表4)和游离锝(表9)相比时，在99mTc-EC-新霉素组中肿瘤/组织比作为对时间的函数而增加(表8)。
闪烁显像研究
在i.v.注射100μCi各示踪剂后0.5、2和4小时，用配备有低能平行孔准直仪的γ照相机(Siemens Medical Systems，Inc.，HoffmanEstates，IL)获得闪烁显像。与99mTc-EC相比，观察到在肿瘤中的高摄取(图37A)。在一名乳腺癌患者中进行了初步临床显像研究。在施用99mTc-EC-新霉素后2小时肿瘤显现良好(图37B)。
                    表899mTc-EC-新霉素在携带乳腺肿瘤的大鼠中的生物分布
             30分钟         1小时           2小时           4小时血液         0.463±0.007    0.262±0.040    0.139±0.016    0.085±0.004肺           0.344±0.011    0.202±0.030    0.114±0.014    0.080±0.003肝           0.337±0.012    0.269±0.013    0.221±0.020    0.195±0.012胃           0.279±0.039    0.147±0.001    0.061±0.008    0.054±0.008脾           0.159±0.008    0.114±0.013    0.095±0.007    0.089±0.003肾           8.391±0.395    8.804±0.817    8.356±0.408    8.638±0.251甲状腺       0.349±0.008    0.202±0.028    0.114±0.007    0.086±0.001肌肉         0.093±0.001    0.049±0.010    0.021±0.006    0.010±0.001小肠         0.159±0.004    0.093±0.014    0.061±0.004    0.266±0.200尿           25.402±8.621   21.786±2.690   0.224±0.000    2.609±2.377肿瘤         0.419±0.023    0.279±0.042    0.166±0.023    0.131±0.002脑           0.022±0.001    0.014±0.003    0.010±0.001    0.007±0.001心脏         0.147±0.009    0.081±0.012    0.040±0.004    0.029±0.002肿瘤/血液    0.906±0.039    1.070±0.028    1.196±0.061    1.536±0.029肿瘤/肌肉    4.512±0.220    5.855±0.458    8.364±1.469    12.706±0.783肿瘤/脑      19.495±1.823   20.001±0.890   17.515±2.035   20.255±1.693显示的值代表来自3只动物的数据的平均值±标准差。
                表999mTc高锝酸盐在携带乳腺肿瘤的大鼠中的生物分布
            30分钟           2小时           4小时血液         1.218±0.328    0.666±0.066    0.715±0.052肺           0.646±0.291    0.632±0.026    0.387±0.024肝           0.541±0.232    0.304±0.026    0.501±0.081脾           0.331±0.108    0.187±0.014    0.225±0.017肾           0.638±0.197    0.489±0.000    0.932±0.029甲状腺       24.821±5.181   11.907±15.412  17.232±5.002肌肉         0.130±0.079    0.076±0.002    0.063±0.003小肠         0.153±0.068    0.186±0.007    0.344±0.027肿瘤         0.591±0.268    0.328±0.016    0.423±0.091脑           0.038±0.014    0.022±0.002    0.031±0.009心脏         0.275±0.089    0.145±0.015    0.166±0.012肿瘤/血液    0.472±0.093    0.497±0.073    0.597±0.144肿瘤/肌肉    4.788±0.833    4.302±0.093    6.689±1.458肿瘤/肝      1.084±0.023    1.084±0.115    0.865±0.270
显示的值代表来自3只动物的数据的平均值±标准差。
99mTc-EC-药物缀合物的体外细胞摄取
为了评价99mTc-EC-药物缀合物的细胞摄取，向含有80,000个细胞(A549肺癌细胞系)的各孔中加入2μCi的99mTc-EC-新霉素和18F-FDG。温育0.5-4小时后，将细胞用磷酸盐缓冲盐水洗3次，然后用胰蛋白酶洗以除下细胞。然后通过γ计数器计数细胞。在人肺癌细胞系中99mTc-EC-新霉素在所测试的药剂中显示出最高的摄取(图46)。
葡萄糖对细胞摄取99mTc-EC-新霉素和18F-FDG的影响
已知新霉素影响葡萄糖吸收(Rogers等，1968；Fanciulli等，1994)。先前的实验已显示在人肺癌细胞系(A549)中，99mTc-EC-新霉素具有比18F-FDG更高的摄取。为了确定99mTc-EC-新霉素的摄取是否通过葡萄糖相关机制介导，将葡萄糖(0.1mg-2.0mg)以及2μCi的99mTc-EC-新霉素和18F-FDG加入含50,000(乳腺)细胞或80,000(肺)细胞的各个孔中。温育后，将细胞用磷酸盐缓冲盐水洗3次，然后用胰蛋白酶洗以除下细胞。然后用γ计数器计数细胞。
通过加入浓度为0.1-2.0mg/孔的葡萄糖，观察到在两个肺癌细胞系和一个乳腺细胞系中99mTc-EC-新霉素摄取减少。在18F-FDG组中观察到类似的结果。99mTc-EC(对照)没有显示出摄取。所述发现提示细胞摄取99mTc-EC-新霉素可能通过葡萄糖相关机制介导(图47，48A和48B)。
实施例7：用99mTc-EC-脱氧葡萄糖进行肿瘤代谢显像
EC-脱氧葡萄糖(EC-DG)的合成
将氢氧化钠(1N，1ml)加入EC(110mg，0.41mmol)在水(5ml)中的搅拌溶液。向该无色溶液中加入硫代-NHS(241.6mg，1.12mmol)和EDC(218.8mg，1.15mmol)。然后加入D-葡糖胺盐酸盐(356.8mg，1.65mmol)。将混合物在室温下搅拌24小时。将混合物用截断值500的Spectra/POR分子多孔膜(Spectrum Medical Industries Inc.，Houston，TX)透析48小时。透析后，将产物用冻干器(Labconco，Kansas City，MO)冻干。盐形式的产物重568.8mg。合成方案如图59所示。通过质谱(图60)和质子NMR(图61和62)证实其结构。99mTc-EC-DG的放射化学纯度为100％，由放射-TLC(图63)和HPLC(图64和65)分析所测定。
己糖激酶测定
为了确定EC-DG是否模拟葡萄糖磷酸化，进行己糖激酶测定。用现成的试剂盒(Sigma Chemical Company)，在UV波长340nm测定EC-DG、葡糖胺和葡萄糖(标准)。葡萄糖、EC-DG和葡糖胺显示出阳性的己糖激酶测定(图66-68)。
体外细胞摄取测定
通过使用人肺癌细胞系(A549)进行体外细胞摄取测定。将2μCi的99mTc-EC-DG和18F-FDG加入各含80,000细胞的孔中。温育0.5-4小时后，将细胞用磷酸缓冲盐水洗3次，然后用胰蛋白酶洗以除下细胞。然后用γ计数器计数细胞。99mTc-EC-DG的摄取可与FDG相比(图69)。
d-和l-葡萄糖对细胞摄取99mTc-EC-脱氧葡萄糖和18F-FDG的影响
为了评价99mTc-EC-脱氧葡萄糖的摄取是否通过d-葡萄糖机制介导，将d-和1-葡萄糖(1mg和2.0mg)以及2μCi的99mTc-EC-脱氧葡萄糖和18F-FDG加入含乳腺或肺癌细胞(50,000/0.5ml/孔)的各孔中。温育2小时后，将细胞用磷酸盐缓冲盐水洗3次，然后用胰蛋白酶洗以除下细胞。用γ计数器计数细胞。
通过加入浓度为1-2.0mg/孔的葡萄糖，观察到在乳腺和肺癌细胞中d-葡萄糖引起99mTc-EC-脱氧葡萄糖和18F-FDG摄取减少。但是，l-葡萄糖对两种药剂均没有影响(图70-73)。所述发现提示细胞摄取99mTc-EC-脱氧葡萄糖通过d-葡萄糖机制介导。
EC-脱氧葡萄糖负荷对正常大鼠中血糖水平的影响
先前的实验已显示细胞摄取99mTc-EC-脱氧葡萄糖与FDG类似。例如，己糖激酶测定(葡萄糖磷酸化)为阳性。99mTc-EC-脱氧葡萄糖的摄取通过d-葡萄糖机制介导。该研究是为了确定血糖水平是否会受FDG或EC-脱氧葡萄糖诱导并且被胰岛素抑制。
在实验之前使正常健康Fischer344大鼠(重145-155g)禁食过夜。制备的葡糖胺盐酸盐、FDG和EC-脱氧葡萄糖的浓度为60％和164％(mg/ml)。用葡萄糖计(Glucometer DEX，Bayer Corporation，Elkhart，IN)测定血糖水平(mg/dl)。研究之前，获得血糖水平的基线。对每只大鼠(n＝3/组)施用1.2mmol/kg的葡糖胺、FDG和EC-脱氧葡萄糖。在单独一项实验中，对一组大鼠施用EC-脱氧葡萄糖和FDG。30分钟后施用胰岛素(5单位)。每30分钟从尾静脉收集血样直至施用后6小时。
一次性静脉内施用葡糖胺、FDG和EC-脱氧葡萄糖诱导血糖水平。该升高的血糖水平可以被共同施用EC-脱氧葡萄糖或FDG和胰岛素所抑制(图74和75)。
99mTc-EC-DG的组织分布研究
关于携带乳腺肿瘤的动物模型，对雌性Fischer344大鼠(150±25g)(Harlan Sprague-Dawley，Indianapolis，IN)将0.1ml来自13762肿瘤细胞系悬液的乳腺肿瘤细胞用25-口径针头进行皮下接种(106细胞/大鼠，对Fischer大鼠特异性的肿瘤细胞系)至后腿。植入后14至17天当肿瘤达到大约1cm直径时进行研究。在每次操作前用氯胺酮(10-15mg/大鼠，腹膜内)麻醉大鼠。
关于携带肺肿瘤的动物模型，对每只无胸腺裸鼠(20-25g)将0.1ml来自A549肿瘤细胞系悬液的人肺肿瘤细胞用25-口径针头进行皮下接种(106细胞/小鼠)至后腿。在植入后17-21天当肿瘤达到大约0.6cm直径时进行研究。
在组织分布研究中，对每只动物静脉内注射10-20μCi(每大鼠)或1-2μCi(每小鼠)的99mTc-EC或99mTc-EC-DG(n＝3/时间点)。99mTc-EC-DG的注射质量为1mg/大鼠。在施用放射性示踪剂后0.5、2和4小时，处死啮齿动物并切除所选择的组织，称重并进行放射性计数。示踪剂在各样本中的生物分布计算为注射的剂量/克组织湿重的百分比(％ID/g)。从相应的％ID/g值计算肿瘤/非靶组织计数密度比。当与99mTc-EC(表4)和游离锝(表9)相比时，在99mTc-EC-DG组中肿瘤/组织比作为对时间的函数而增加(图76-80)。
闪烁显像研究
在i.v.注射100μCi的放射性示踪剂后0.5、2和4小时，用配备有低能平行孔准直仪的γ照相机获得闪烁显像。所用的动物模型是携带乳腺肿瘤的大鼠。当与99mTc-EC(对照组)相比时肿瘤显现良好(图81)。在5名患者中进行了初步临床研究(3例脑肿瘤和2例肺病)。在给药后1-2小时获得影像。99mTc-EC-DG能区分良性和恶性肿瘤。例如，恶性星形细胞瘤显示出高摄取(图82A、82B、83A和83B)。良性脑膜瘤与恶性脑膜瘤相比显示出摄取差(图84A和B)。在TB患者中观察到摄取差(图85A和图85B)，但在肺肿瘤中观察到高摄取(图86A，图86B和图86C)。
本文所公开并要求保护的所有组合物和/或方法根据本发明内容可以制备和实行而无须过度的实验。尽管本发明的组合物和方法已就优选的实施方案进行了描述，对本领域技术人员来说很明显可以对组合物和/或方法以及所述方法的步骤或步骤顺序进行变动，而不偏离本发明的概念、精神和范围。更具体地说，很明显在化学和生理学上相关的某些物质可以替换本文描述的物质，而实现相同或相似的结果。对本领域的技术人员显而易见的所有这些相似的替换和修改被认为都在如所附的权利要求所定义的本发明的精神、范围和概念之内。
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Claims (51)

1.用于显像的组合物，其包含：
a)放射性核素标记；
b)乙二半胱氨酸；和
c)与所述乙二半胱氨酸缀合的组织特异性配体；
其中所述乙二半胱氨酸与所述放射性核素标记形成N2S2螯合物。
2.权利要求1的组合物，其中所述组织特异性配体可以在乙二半胱氨酸的一条或两条酸臂上缀合至所述乙二半胱氨酸。
3.权利要求1的组合物，其中所述放射性核素是99mTc、188Re、186Re、183Sm、166Ho、90Y、89Sr、67Ga、68Ga、111In、183Gd、59Fe、225Ac、212Bi、211At、64Cu或62Cu。
4.权利要求3的组合物，其中所述放射性核素是99mTc。
5.权利要求1的组合物，其中所述组织特异性配体是抗癌剂、DNA拓扑异构酶抑制剂、抗代谢剂、肿瘤标记、叶酸受体引导配体、肿瘤凋亡细胞引导配体、肿瘤缺氧引导配体、DNA嵌入剂、受体标记、肽、核苷酸、器官特异性配体、抗生素、抗真菌剂、抗体、谷氨酸五肽或模拟葡萄糖的药剂。
6.权利要求5的组合物，其中所述组织特异性配体是抗癌剂。
7.权利要求6的组合物，其中所述抗癌剂可以选自氨甲蝶呤、阿霉素、他莫昔芬、紫杉醇、托泊替堪、LHRH、丝裂霉素C、依托泊甙、tomudex、鬼臼毒素、米托蒽醌、喜树碱、秋水仙碱、内抑素、氟达拉滨、吉西他滨和tomudex。
8.权利要求5的组合物，其中所述组织特异性配体是肿瘤标记。
9.权利要求8的组合物，其中所述肿瘤标记是PSA、ER、PR、CA-125、CA-199、CEA、AFP、干扰素、BRCA1、HER-2/neu、环磷酰胺、p53、内抑素或单克隆抗体(例如反义)。
10.权利要求5的组合物，其中所述组织特异性配体是叶酸受体引导配体。
11.权利要求10的组合物，其中所述叶酸受体引导配体是叶酸、氨甲蝶呤或tomudex。
12.权利要求11的组合物，进一步定义为99mTc-EC-叶酸。
13.权利要求11的组合物，进一步定义为99mTc-EC-氨甲蝶呤。
14.权利要求11的组合物，进一步定义为99mTc-EC-tomudex。
15.权利要求5的组合物，其中所述组织特异性配体是肿瘤凋亡细胞引导配体或肿瘤缺氧引导配体。
16.权利要求15的组合物，其中所述组织特异性配体是膜联蛋白V、秋水仙碱、硝基咪唑、丝裂霉素或甲硝唑。
17.权利要求16的组合物，进一步定义为99mTc-EC-膜联蛋白V。
18.权利要求16的组合物，进一步定义为99mTc-EC-秋水仙碱。
19.权利要求16的组合物，进一步定义为99mTc-EC-硝基咪唑。
20.权利要求16的组合物，进一步定义为99mTc-EC-甲硝唑。
21.权利要求5的组合物，其中所述组织特异性配体是谷氨酸五肽(分子量750-15,000)。
22.权利要求21的组合物，进一步定义为99mTc-EC-谷氨酸五肽。
23.权利要求5的组合物，其中所述组织特异性配体是模拟葡萄糖的药剂。
24.权利要求23的组合物，其中所述模拟葡萄糖的药剂是新霉素、卡那霉素、庆大霉素、巴龙霉素、阿米卡星、妥布霉素、奈替米星、核糖霉素、西索米星、小诺米星、利维霉素、地贝卡星、异帕米星、阿司米星或氨基糖甙。
25.权利要求24的组合物，进一步定义为99mTc-EC-新霉素。
26.权利要求24的组合物，进一步定义为99mTc-EC-卡那霉素。
27.权利要求24的组合物，进一步定义为99mTc-EC-氨基糖甙类。
28.权利要求24的组合物，进一步定义为99mTc-EC-庆大霉素。
29.权利要求24的组合物，进一步定义为99mTc-EC-妥布霉素。
30.权利要求2的组合物，还包含将EC缀合至所述组织特异性配体的接头。
31.权利要求30的组合物。其中所述接头是水溶性肽、谷氨酸、天冬氨酸、乙酸溴乙酯、乙二胺或赖氨酸。
32.权利要求31的组合物，其中所述组织特异性配体是雌二醇、托泊替堪、紫杉醇、雷洛昔芬、依托泊甙、阿霉素、丝裂霉素C、内抑素、膜联蛋白V、LHRH、奥曲肽、VIP、氨甲蝶呤或叶酸。
33.合成用于显像的放射性标记的乙二半胱氨酸衍生物的方法，其包括以下步骤：
a)获得组织特异性配体；
b)将所述配体与乙二半胱氨酸(EC)混合，以得到EC-组织特异性配体衍生物；和
c)将所述EC-组织特异性配体衍生物与放射性核素和还原剂混合，以得到放射性核素标记的EC-组织特异性配体衍生物，其中EC与放射性核素形成N2S2螯合物。
34.权利要求33的方法，其中所述还原剂是连二亚硫酸离子、锡离子或亚铁离子。
35.标记用于显像的组织特异性配体的方法，其包括以下步骤：
a)获得组织特异性配体；
b)将所述组织特异性配体与乙二半胱氨酸(EC)混合，以得到EC-配体药物缀合物；和
c)使所述药物缀合物与99mTc在还原剂存在下反应，以在乙二半胱氨酸(有或没有接头)与99mTc之间形成N2S2螯合物。
36.权利要求35的方法，其中所述组织特异性配体是抗癌剂、DNA拓扑异构酶抑制剂、抗代谢剂、肿瘤标记、叶酸受体引导配体、肿瘤凋亡细胞引导配体、肿瘤缺氧引导配体、DNA嵌入剂、受体标记、肽、器官特异性配体、抗生素、抗真菌剂、谷氨酸五肽或模拟葡萄糖的药剂。
37.权利要求36的方法，其中所述还原剂是连二亚硫酸离子、锡离子或亚铁离子。
38.哺乳动物体内部位的显像方法，其包括以下步骤：施用有效诊断量的组合物，所述组合物包含99mTc标记的乙二半胱氨酸-组织特异性配体缀合物，和检测来自局限定位在所述部位的99mTc的放射性信号。
39.权利要求38的方法，其中所述部位是肿瘤。
40.权利要求38的方法，其中所述部位是感染。
41.权利要求38的方法，其中所述部位是乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫内膜、心脏、肺、脑、肝、叶酸(+)癌症、ER(+)癌症、脾、胰腺或小肠。
42.用于制备放射性药物制剂的试剂盒，所述试剂盒包含密封容器，其中包括预定量的乙二半胱氨酸-组织特异性配体缀合物组合物以及足量的还原剂以用99mTc标记该缀合物。
43.权利要求42的试剂盒，其中所述乙二半胱氨酸-组织特异性配体缀合物组合物还包含在乙二半胱氨酸与组织特异性配体之间的接头。
44.权利要求42的试剂盒，其中所述组织特异性配体是抗癌剂、DNA拓扑异构酶抑制剂、抗代谢剂、肿瘤标记、叶酸受体引导配体、肿瘤凋亡细胞引导配体、肿瘤缺氧引导配体、DNA嵌入剂、受体标记、肽、器官配体、抗生素、抗真菌剂、谷氨酸五肽或模拟葡萄糖的药剂。
45.权利要求43的试剂盒，其中所述组织特异性配体是雌二醇、托泊替堪、紫杉醇、雷洛昔芬、依托泊甙、阿霉素、丝裂霉素C、内抑素、膜联蛋白V、LHRH、奥曲肽、VIP、氨甲蝶呤或叶酸。
46.权利要求45的试剂盒，其中所述接头是水溶性肽、谷氨酸、聚谷氨酸、天冬氨酸、聚天冬氨酸、乙酸溴乙酯、乙二胺或赖氨酸。
47.用于制备闪烁显像剂的试剂，包含共价连接至99mTc结合部分的组织特异性配体。
48.权利要求47的试剂，其中所述99mTc结合部分是乙二半胱氨酸。
49.权利要求48的试剂，其中所述组织特异性配体是抗癌剂、DNA拓扑异构酶抑制剂、抗代谢剂、肿瘤标记、叶酸受体引导配体、肿瘤凋亡细胞引导配体、肿瘤缺氧引导配体、DNA嵌入剂、受体标记、肽、器官特异性配体、抗生素、抗真菌剂、谷氨酸五肽或模拟葡萄糖的药剂。
50.权利要求48的试剂，还包含在所述组织特异性配体与所述99mTc结合部分之间的接头。
51.确定候选药物对肿瘤有效性的方法，所述方法包括：
a)获得候选药物；
b)将所述候选药物与乙二半胱氨酸缀合以产生EC-候选药物缀合物；
c)将所述候选药物缀合物与99mTc螯合以产生99mTc-EC-候选药物缀合物；
d)将所述99mTc-EC-候选药物缀合物引入肿瘤患者体内；并
e)对所述患者进行显像以确定候选药物针对肿瘤的有效性。
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