CN112672762A - 用于抗流感化学治疗和免疫治疗的小分子配体靶向药物缀合物 - Google Patents

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Abstract

本文中公开了用于抗流感化学治疗和免疫治疗的小分子靶向药物缀合物。所公开的药物缀合物可形成衔接子以募集另外的CAR T细胞或其他免疫细胞，用于在对象中精确消除被流感病毒感染的细胞。在被流感病毒感染的对象中，同时施用的抗体或预先存在的免疫力与该靶向缀合物一起很好地发挥作用从而消除被病毒感染的细胞，为挽救晚期患者节省了宝贵的时间。

Description

用于抗流感化学治疗和免疫治疗的小分子配体靶向药物缀 合物
技术领域
本公开内容提供了抗流感治疗的靶向递送。特别地，将与流感病毒特异性结合的小分子配体与药物载荷(payload of drug)缀合以引起对被流感病毒感染的细胞的直接杀伤或免疫调节。
背景技术
由流感病毒感染引起的急性发热呼吸系统疾病流行性感冒(也称为“流感”)仍然是最威胁生命的播散性疾病之一。根据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)发布的流感情况说明(Influenza Fact Sheet)，流感以季节性流行在全世界传播，导致每年约3至5百万例严重疾病以及每年约250,000至500,000例死亡。1在美国，每年有12,000至56,000例死亡以及140,000至710,000例住院与流感直接相关。2除了造成高发病率和死亡率之外，流感造成了由生产力损失以及医疗预防和治疗引起的巨大的社会经济负担。在美国，与流感相关的年度总成本已经超过100亿美元。3
当前针对流感的抗流感化学治疗
由于流感病毒通过抗原转换(shift)和漂移(drift)而不断变化，因此疫苗经常变得针对突变毒株无效。因此，抗流感化学治疗在流感的预防和治疗方面仍然发挥重要作用。4目前，美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)已经批准了两类抗流感药物：M2离子通道抑制剂和神经氨酸酶抑制剂。M2离子通道抑制剂包括金刚烷胺和金刚乙胺。这些药物的作用机制是由于阻断了酸激活的病毒M2离子通道并因此抑制了病毒核糖核蛋白从病毒体释放至宿主胞质溶胶。4然而，目前在人中传播的H1N1和H3N2病毒二者均针对这些抑制剂具有抗性。因此，由于药物抗性的迅速出现，疾病预防控制中心(CDC)建议不要使用它们。5常用的神经氨酸酶抑制剂包括奥司他韦(oseltamivir)和扎那米韦(zanamivir)。它们充当与唾液酸竞争与神经氨酸酶的活性位点结合的竞争性抑制剂。4虽然这些抑制剂针对甲型流感病毒(influenza A virus)和乙型流感病毒(influenza Bvirus)二者均有效，但它们有两个主要限制。首先，就症状严重程度的减轻和疾病持续时间的降低(7天中的0.6至0.7天)而言，仅观察到神经氨酸酶抑制剂的小的益处。6其次，这类抗病毒药也遭受药物抗性问题。自2007年至2008年季节，已经注意到奥司他韦抗性毒株的数量提高。鉴于当前抗流感化学治疗的限制，迫切需要开发具有新的作用机制的新抗流感药物。7
发明内容
本公开内容提供了缀合物，其包含针对流感病毒包膜蛋白的靶向配体(targetingligand，TL)、接头(linker，L)和药物载荷(D)，其中TL是与包膜蛋白结合的分子，接头与D和TL二者共价结合，并且D是显像剂、治疗性药物、免疫调节剂、或其组合。
在一些优选的实施方案中，上述接头在TL与D之间包含间隔区和可切割或不可切割的桥(cleavable or noncleavable bridge)。
在一些优选的实施方案中，上述流感病毒包膜蛋白是神经氨酸酶(NA)或血凝素(HA)。
在一些优选的实施方案中，上述TL是扎那米韦。
在一些优选的实施方案中，上述TL选自：奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦(peramivir)和拉尼米韦(1aninamivir)。
在一些优选的实施方案中，上述缀合物包含用于量化流感感染强度的显像剂。
在一些优选的实施方案中，上述显像剂包含含有锝-99m(99mTc)的螯合络合物(chelaton complex)。
在一些优选的实施方案中，上述缀合物与NA的结合亲和力为约1nM至约15nM。
在一些优选的实施方案中，上述D选自：微管溶素B酰肼(tubulysin Bhydrazide)、匹莫迪韦(pimodivir)、奥扎莫德(ozanimod)和SN38。
在一些优选的实施方案中，上述缀合物是以下之一：
Figure BDA0002953761670000031
扎那米韦-EC20、
Figure BDA0002953761670000032
扎那米韦-微管溶素B酰肼、
Figure BDA0002953761670000033
扎那米韦-匹莫迪韦、
Figure BDA0002953761670000041
扎那米韦-奥扎莫德、
Figure BDA0002953761670000042
扎那米韦-SN38、
Figure BDA0002953761670000043
扎那米韦-DNP、
Figure BDA0002953761670000051
扎那米韦-鼠李糖、
Figure BDA0002953761670000052
扎那米韦-FITC、或
Figure BDA0002953761670000053
扎那米韦-罗丹明。
在一些优选的实施方案中，上述可切割的桥包含二硫键或酸不稳定键。
在一些优选的实施方案中，上述酸不稳定键包含酯、腙、肟、缩醛、缩酮、酚醚或席夫碱(Schiffbase)键。
本公开内容还提供了在对象中治疗流感病毒感染的方法，该方法包括向对象提供缀合物，其中所述缀合物包含流感病毒的NA的靶向配体(TL)、接头(L)和药物载荷(D)，其中TL是结合NA的分子，L与D和TL二者共价结合，并且D是显像剂、治疗性药物、免疫调节剂、或其组合。
在一些优选的实施方案中，上述方法使用扎那米韦作为TL。
在一些优选的实施方案中，上述方法使用治疗性药物来杀伤对象中被流感病毒感染的细胞，或抑制流感病毒复制。
在一些优选的实施方案中，上述方法使用选自：微管溶素B酰肼、匹莫迪韦和SN38的治疗性药物。
在一些优选的实施方案中，上述方法使用包含衔接子(adaptor)分子(即，与TL共价结合的荧光素)和抗荧光素CAR T细胞的治疗性药物，其中在与衔接子分子结合之后，所述CAR-T细胞在对象中杀伤表达与TL结合的神经氨酸酶的被流感病毒感染的细胞并由此抑制流感病毒复制。
在一些优选的实施方案中，上述方法使用免疫调节剂来抑制流感病毒诱导的早期细胞因子风暴(cytokine storm)。
在一些优选的实施方案中，上述方法使用免疫调节剂奥扎莫德或被自体抗体识别的半抗原。
在一些优选的实施方案中，上述半抗原由二硝基苯基(DNP)、三硝基苯基(TNP)、鼠李糖或α-半乳糖基部分(moiety)构成。
在一些优选的实施方案中，上述方法使用扎那米韦缀合物通过抗体依赖性细胞吞噬作用(antibody dependent cellular phagocytosis，ADCP)、抗体依赖性细胞的细胞毒作用(antibody dependent cellular cytotoxicity，ADCC)或补体依赖性细胞毒作用(complement-dependent cytotoxicity，CDC)来引发导致清除抗体包被的病毒或被病毒感染的细胞的免疫应答。
在一些优选的实施方案中，上述方法使用抗原或另一部分来与扎那米韦缀合，其中对象具有针对抗原或部分的预先存在的免疫力，或者向对象同时施用有效剂量的针对所述抗原或部分的抗体。例如，该抗原或部分可以是毒素(例如破伤风类毒素)。
本公开内容还提供了包含至少两种组分的系统，第一组分包含缀合物，所述缀合物包含针对流感病毒包膜蛋白的靶向配体(TL)、接头(L)和药物载荷(D)，其中TL是结合包膜蛋白的分子，L与D和TL二者共价结合，并且D是荧光素；第二组分包含结合第一组分的荧光素的抗荧光素CAR T细胞，其中所述系统被促进以杀伤被流感病毒感染的细胞。
代表性的扎那米韦-DNP缀合物的体外结合测定已经显示出其对N1和N2类的神经氨酸酶二者均具有高的结合亲和力。缀合物比扎那米韦或奥司他韦强效得多；其即使在患者中感染已经更进一步发展之后添加也有效；在单次注射我们的药物的情况下可治愈感染，并且针对所有流感毒株均有效。
参考以下附图，结合说明书和权利要求书，本发明的这些和其他特征、方面和优点将变得更好理解。
附图说明
图1扎那米韦-治疗性药物缀合物的作用机制，(a)药物缀合物的示意图，(b)所提出的作用机制。
图2针对扎那米韦靶向治疗性药物缀合物所选择的治疗性药物载荷。
图3扎那米韦-半抗原缀合物靶向免疫治疗的作用机制，(a)扎那米韦-DNP缀合物的示意图，(b)所提出的作用机制。
图4基于扎那米韦的靶向配体的设计。扎那米韦的7-OH基以黄色突出显示。
图5与神经氨酸酶复合的扎那米韦的晶体结构。
图6扎那米韦-罗丹明缀合物与流感病毒A/Puerto Rico/8/34(H1N1)感染的MDCK细胞的结合。(a)药物组的共聚焦显微图像。与50nM扎那米韦-罗丹明缀合物一起孵育的流感病毒感染的MDCK细胞；(b)竞争组的共聚焦显微图像。在5μM扎那米韦存在下与50nM扎那米韦-罗丹明缀合物一起孵育的流感病毒感染的MDCK细胞；(c)结合饱和曲线。
图7 99mTc螯合的扎那米韦-EC20头部缀合物与流感病毒A/Puerto Rico/8/34(H1N1)感染的MDCK细胞的结合。(a)结合饱和曲线；(b)99mTc螯合的扎那米韦-EC20头部缀合物的结构。
图8 99mTc螯合的扎那米韦-EC20头部缀合物在流感病毒A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)感染的小鼠/未被感染的小鼠中的生物分布。
图9扎那米韦-微管溶素B酰肼缀合物及其组分部分对神经氨酸酶转染的HEK 293细胞的体外细胞毒性。描绘了扎那米韦-微管溶素B酰肼缀合物(红色圆圈)、游离微管溶素B酰肼(橙色三角形)和在100倍过量扎那米韦存在下的扎那米韦-微管溶素B酰肼缀合物(蓝色方形)的细胞毒性。
图10扎那米韦-DNP缀合物与神经氨酸酶转染的HEK 293细胞的竞争性结合。(a)扎那米韦-DNP缀合物的对数(剂量)-响应曲线；(b)扎那米韦的对数(剂量)-响应曲线。扎那米韦-罗丹明缀合物用作经标记的配体。
图11流式细胞术分析，其证明了扎那米韦-DNP缀合物同时与细胞表面神经氨酸酶和抗DNP抗体结合的能力。(a)基于流式细胞术的抗体募集测定的示意性描述；(b)使用神经氨酸酶转染的HEK293细胞(293tn NA)的流式细胞术分析；(c)使用未经转染的HEK293细胞(293tn)的流式细胞术分析。
图12当在感染之后2小时施用时，在BALB/c小鼠中扎那米韦-DNP缀合物针对流感病毒A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)感染的体内保护效力。(a)体重曲线；(b)存活曲线。
图13所提出的针对被流感感染的细胞的靶向CAR-T治疗的示意图。
图14荧光素衔接子介导的FITC-扎那米韦缀合物对表达流感表面蛋白NA的细胞的体外抗FITC CAR-T杀伤谱。(A)CAR T∶293NA＝5∶1对293NA细胞具有41％的杀伤；(B)CAR T∶293NA＝10∶1对293NA细胞具有61％的杀伤。
图15扎那米韦-FITC与正常293T细胞不结合。
图16扎那米韦-FITC特异性诱导针对NA的细胞毒性。
图17使用真病毒的体外测定
图18T细胞杀伤流感感染的MDCK相对于CAR-T杀伤流感感染的MDCK的LDH测定。
图19所提出的用于测试流感感染的小鼠的CAR T细胞治疗的小鼠模型。
图20抗流感免疫治疗的作用机制，包括：A.小分子配体靶向药物缀合物；B.扎那米韦-DNP缀合物的结构：扎那米韦(靶配体)与半抗原(2，4-二硝基苯基)通过接头缀合；C.在缀合物与病毒神经氨酸酶结合之后，针对DNP的先天抗体抑制流感病毒复制。因此，系统将抗二硝基苯基(抗DNP)抗体重定向至被流感病毒/病毒感染的细胞，诱导免疫介导的对被流感病毒/病毒感染的细胞的破坏。
图21在流感病毒A/Puerto Rico/8/34(H1N1)感染的MDCK细胞中多个体外结合测定。A.扎那米韦-罗丹明缀合物的结合；B.游离扎那米韦的结合和C.扎那米韦-DNP-缀合物的结合。
图22在流感病毒A/Aichi/2/1968(H3N2)感染的MDCK细胞中多个体外结合测定。A.扎那米韦-罗丹明缀合物的结合；B.游离扎那米韦的结合和C.扎那米韦-DNP-缀合物的结合。
图23在流感病毒A/Puerto Rico/8/34(H1N1)感染的MDCK细胞中进行的抗DNP抗体募集测定。A.测定流程图；B.来自多种缀合物添加的细胞染色结果(PE-红色，TO-RPO-3lolide-蓝色示出细胞核)和结合曲线。
图24在流感病毒A/Aichi/2/1968(H3N2)感染的MDCK细胞中进行的抗DNP抗体募集测定。A.测定流程图；B.来自多种缀合物添加的细胞染色结果(PE-红色，TO-RPO-3 lolide-蓝色示出细胞核)和结合曲线。
图25补体依赖性细胞毒作用测定(CDC)。A.在NA转染的293细胞中进行的补体依赖性细胞毒作用测定的流程图。B.仅需10nM药物缀合物来介导最大的细胞杀伤。
图26抗体依赖性吞噬测定(ADCP)。A.ADCP工作流程。B.在使用之前将THP-1细胞(人巨噬细胞)用PMA处理并用DiD标记。在4℃下用不同浓度的扎那米韦-DNP缀合物和抗DNP抗体(100nM)将293tnNA(GFP+)与THP-1细胞(比例为1∶1)一起孵育30分钟。通过流式细胞术分析ADCP作用。
图27小鼠保护研究操作：通过皮下注射2，4-二硝基苯基-匙孔血蓝蛋白(DNP-KLH)使小鼠免疫；在第5周，将小鼠用致死剂量的流感病毒(100LD50，A/Puerto Rico/8/1934(H1N1))感染；感染之后开始用扎那米韦-DNP缀合物和其他药物处理，并监测小鼠2周；当小鼠减轻了其初始重量的25％或当其濒死时认为小鼠死亡。B.对小鼠进行手术。
图28剂量逐增研究(鼻内施用)。在第0天用50uL H1N1 PR8病毒(100LD50，4.2×105PFU)感染小鼠(每组5只小鼠)。感染之后24小时鼻内给予小鼠PBS/扎那米韦/扎那米韦-DNP缀合物，每天两次，持续5天。当小鼠减轻了其初始重量的25％或当其濒死时认为小鼠死亡。A.体重百分比绘图B.根据定义的存活小鼠的百分比。
图29扎那米韦-DNP缀合物及其组分之间的效力比较(鼻内施用)。操作：在第0天用50uL H1N1 PR8病毒(100LD50，4.2×105PFU)感染小鼠(每组5只小鼠)。感染之后24小时鼻内给予小鼠扎那米韦-DNP缀合物及其组分，每天两次，持续5天。当小鼠减轻了其初始重量的25％或当其濒死时认为小鼠死亡。A.体重百分比绘图B.根据定义的存活小鼠的百分比。
图30延迟开始至治疗研究(delayed-start-to-treat study)(鼻内施用)操作：在第0天用50uL H1N1 PR8病毒(100LD50，4.2×105PFU)感染经DNP-KLH免疫接种的小鼠，感染之后48小时/72小时/96小时鼻内给予小鼠1.5umol/kg扎那米韦-DNP缀合物，每天两次，持续7天。当小鼠减轻了其初始重量的25％或当其濒死时认为小鼠死亡。A.体重百分比绘图B.根据定义的存活小鼠的百分比。
图31一次剂量处理(鼻内施用)操作：在第0天用50uL H1N1 PR8病毒(100LD50，4.2×105PFU)感染小鼠(每组5只小鼠)。感染之后24小时鼻内给予小鼠PBS/扎那米韦-DNP缀合物仅一次。当小鼠减轻了其初始重量的25％或当其濒死时认为小鼠死亡。A.体重百分比绘图B.根据定义的存活小鼠的百分比。
图32生物分布和SPECT/CT成像。A.新的扎那米韦-E20头部缀合物结构。B.根据以下操作的细胞结合放射性：
·实验之前3天通过流感病毒(H1N1)感染小鼠。
·给小鼠静脉内注射10nmol扎那米韦-EC20头部缀合物(150μCi)。
·注射之后4小时计算放射性。
C.在竞争者100×游离扎那米韦的存在下扎那米韦-E20头部的结合曲线。
D.根据以下操作在没有(左)或有100×游离扎那米韦的情况下在注射缀合物之后的SPECT/CT成像：
·实验之前3天通过流感病毒(H1N1)感染小鼠。
·给小鼠静脉内注射50nmol扎那米韦-EC20头部缀合物(750μCi)。
·注射之后4小时进行SPECT/CT成像
图33根据以下操作进行的剂量逐增研究(腹膜内施用)：在第0天用50uL H1N1 PR8病毒(100LD50，4.2×105PFU)感染小鼠(每组5只小鼠)。感染之后24小时腹膜内给予小鼠PBS/扎那米韦/扎那米韦-DNP缀合物，每天两次，持续5天。当小鼠减轻了其初始重量的25％或当其濒死时认为小鼠死亡。A.体重百分比绘图B.根据定义的存活小鼠的百分比。
图34根据以下操作进行对扎那米韦-DNP缀合物及其组分之间的效力进行比较(腹膜内施用)：在第0天用50uL H1N1 PR8病毒(100LD50，4.2×105PFU)感染小鼠(每组5只小鼠)。感染之后24小时腹膜内给予小鼠PBS/扎那米韦/扎那米韦-DNP缀合物，每天两次，持续5天。当小鼠减轻了其初始重量的25％或当其濒死时认为小鼠死亡。A.体重百分比绘图B.根据定义的存活小鼠的百分比。
图35抗体依赖性细胞的细胞毒作用测定(ADCC)。A.ADCC报道基因生物测定(ADCCReporter Bioassay)使用稳定表达FcγRIIIa受体的经改造Jurkat细胞和作为效应细胞的驱动萤火虫萤光素酶表达的NFAT(活化T细胞核因子，nuclear factor of activated T-cell)应答元件。ADCC MOA中的抗体生物学活性通过作为NFAT途径激活的结果而产生的萤光素酶来量化。B.ADCC工作方案和DNP-扎那米韦的结果。
图36H1N1和H3N2感染的MDCK细胞的体外抗病毒测定。A.A/Puerto Rico/8/34(H1N1)和B.A/Aichi/2/1968(H3N2)。
图37对于H3N2病毒感染的小鼠的单剂量治疗(鼻内施用)。A.通过体重维持测量的治疗效果。B.通过存活百分比测量的治疗效果。
图38对于H1N1 PR8病毒感染的小鼠的单剂量治疗(腹膜内施用)。A.通过体重维持测量的治疗效果。B.通过存活百分比测量的治疗效果。
图39对于H3N2病毒感染的小鼠的单剂量治疗(腹膜内施用)。A.通过体重维持测量的治疗效果。B.通过存活百分比测量的治疗效果。
图40通过H1N1 PR8病毒感染的抗DNP抗体和zana-DNP处理的未经免疫接种小鼠。在用致死剂量的H1N1 PR8病毒感染之后一天，对未经免疫接种的小鼠静脉内给予不同剂量的抗DNP抗体，并立即通过单剂量的腹膜内施用的扎那米韦-DNP缀合物进行处理。A.通过体重维持测量的治疗效果。B.通过存活百分比测量的治疗效果。
图41扎那米韦-鼠李糖缀合物的合成方案，扎那米韦-鼠李糖缀合物是利用先天免疫系统产生的抗鼠李糖来标记被流感病毒感染的细胞并诱导针对被流感病毒感染的细胞的免疫攻击的不同的缀合物。
图42使用扎那米韦-罗丹明缀合物作为经标记配体的扎那米韦-DNP鼠李糖缀合物与神经氨酸酶转染的HEK293细胞的竞争性结合。A.扎那米韦Kd为约0.77nM。B.扎那米韦-鼠李糖Kd为约3.57nM。
图43用扎那米韦-鼠李糖缀合物进行的免疫治疗研究。在第0天用50uL H1N1 PR8病毒(100LD50，4.2×105PFU)感染经鼠李糖-OVA免疫接种的小鼠(每组5只小鼠)。感染之后24小时鼻内给予小鼠1.5/0.5/0.17umol/kg的扎那米韦-鼠李糖缀合物/扎那米韦/PBS，每天两次，持续5天，并且当小鼠减轻了其初始重量的25％或当其濒死时认为小鼠死亡。A.通过体重维持测量的治疗效果。B.通过存活百分比测量的治疗效果。
具体实施方式
尽管本公开内容的概念在本文中的附图和说明书中进行了详细示出和描述，但是附图中的结果及其描述应被认为本质上是示例性的而非限制性的；应理解，仅示出和描述了一些示例性实施方案，并且期望保护落入本公开内容的精神内的所有改变和修改。
除非另有定义，否则科学与技术术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
流感病毒概述
流感病毒是包膜病毒。所有流感亚型的总体结构都非常类似。病毒颗粒的直径为80至120纳米，并且通常大致呈球形，但是可出现丝状形式。这些丝状形式在丙型流感(influenza C)中更常见，其可在被感染细胞的表面上形成长至500微米的带状结构。然而，尽管存在这些变化的形状，但所有流感病毒的病毒颗粒在组成上类似。它们由包裹在中心核周围的病毒包膜构成，所述病毒包膜包含两种主要类型的糖蛋白。中心核包含病毒RNA基因组以及包装和保护该RNA的其他病毒蛋白。RNA倾向于是单链的，但在特殊情况下，其是双链的。对病毒而言不寻常的是，其基因组不是单一片段的核酸；相反，它包含七或八个片段的分段负义RNA，每个RNA片段包含一个或两个基因，其编码一种基因产物(蛋白质)。例如，甲型流感基因组在八个RNA片段上包含11个基因，编码11种蛋白质：血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、M1、M2、NS1、NS2(NEP：核输出蛋白，nuclear export protein)、PA、PB1(聚合酶碱性蛋白1，polymerase basic 1)、PB1-F2和PB2。
血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)是在病毒颗粒外部的两个大的糖蛋白。HA是介导病毒与靶细胞的结合以及病毒基因组进入到靶细胞中的凝集素，而NA通过切割与成熟病毒颗粒结合的糖参与子代病毒从被感染细胞中的释放。因此，这些蛋白质是用于抗病毒药物的靶标。此外，它们是可针对其产生抗体的抗原。基于针对HA和NA的抗体应答，甲型流感病毒可分为亚型。这些不同类型的HA和NA形成了例如在H5N1中H和N差异的基础。已知有16个H亚型和9个N亚型，但通常在人中仅发现H 1、2和3以及N1和2。
用于抗病毒治疗的小分子配体靶向药物缀合物
结合了受体特异性配体和治疗性载荷的小分子配体靶向药物缀合物，在许多疾病的治疗中，尤其是在癌症化学治疗中已经显示出了前景。通过将治疗性载荷特异性地递送至被靶向配体识别的细胞，这些药物缀合物表现出朝向恶性细胞的高选择性以及降低的相关附带毒性。迄今为止，许多癌症已经通过靶向肿瘤细胞上过表达的受体的小分子配体靶向药物缀合物被解决。这些过表达受体包括叶酸受体(folate receptor，FR)、前列腺特异性膜抗原(prostate-specific membrane antigen，PSMA)、胆囊收缩素2受体(cholecystokinin 2 receptor，CCK2R)、碳酸酐酶IX(carbonic anhydrase IX，CAIX)等。8
对于包膜病毒，其复制的最后一个步骤涉及在感染的细胞膜上病毒组分的组装以及从被感染细胞的表面出芽。9同时，一些病毒包膜糖蛋白(例如HIV gp120和流感神经氨酸酶/血凝素)在被感染细胞的外部表面上表达。10鉴于这些外源性病毒蛋白仅在被感染细胞上表达的事实，它们具有被配体靶向药物缀合物靶向的潜力。
扎那米韦-治疗性药物缀合物的设计
本公开内容的一般方案是提供与治疗性药物或调节剂的有效载荷缀合的特异性靶向配体以治疗病毒感染。靶向配体将特异性识别仅在被感染细胞的表面上表达的病毒的包膜蛋白。在一些情况下，治疗性药物或调节剂的载荷可以是衔接的表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)。例如，如果药物载荷是荧光素衔接子，则可将抗荧光素CAR T细胞与靶向的配体引导的载荷药物一起施用，以杀伤被病毒感染的细胞或在被感染细胞中抑制病毒复制。关于衔接子分子介导的CAR T细胞治疗及其制备的详细描述，请参见于2016年10月16日提交的美国申请15/296,666，其全部内容通过引用并入本文。
在此，我们设计了靶向流感病毒包膜蛋白，特别是神经氨酸酶(NA)的一系列小分子配体靶向药物缀合物。不受任何理论的束缚，考虑了特异性靶向血凝素(HA)的其他小分子配体也可在该原理下工作。例如，抑制HA介导的流感病毒进入的化合物可被认为是影响被感染细胞的HA的潜在靶向配体。
因此，本文改换了高亲和力神经氨酸酶抑制剂扎那米韦的用途来携带治疗性药物并特异性地将其递送到被病毒感染的细胞以及病毒复制位点(例如，鼻、喉和肺)中。这提出了独特的作用机制，通过该作用机制，可在子代病毒释放之前杀伤被病毒感染的细胞，阻碍病毒复制或抑制由病毒感染诱导的早期细胞因子风暴(图1)。
图2中示出了为此项目选择的治疗性药物载荷。(1)微管溶素B酰肼是抑制微管蛋白聚合的抗有丝分裂四肽。它通过诱导细胞凋亡来杀伤被流感病毒感染的细胞，或者通过破坏流感病毒感染细胞的微管网络来抑制病毒组分的运输。11(2)匹莫迪韦是阻断甲型流感病毒聚合酶复合物的PB2亚基中的m7GTP结合口袋的RNA依赖性RNA聚合酶(RNA-dependentRNA polymerase，RdRp)抑制剂。它通过抑制PB2戴帽(cap-snatching)活性来干扰病毒复制。12，13鉴于流感引起的高发病率和高死亡率是病毒诱导的组织破坏和促炎细胞因子产生的过度诱导(细胞因子风暴)二者的结果的事实，选择了两种免疫调节药物奥扎莫德和SN38，以改善流感治疗的结果。14，15(3)奥扎莫德是研究性的免疫调节药物，其充当鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine-1-phosphate，S1P)受体激动剂。16研究人员发现，S1P受体激动剂可钝化但不消除过量的病毒诱导的细胞因子产生，提供了对抗小鼠中流感病毒感染的显著保护。17，18(4)SN38是拓扑异构酶I抑制剂，其是伊立替康(irinotecan)(喜树碱的类似物)的活性代谢物。19证明SN38通过抑制RNA聚合酶II到先天免疫基因的募集来限制流感病毒诱导的炎性基因的过表达。20另外，SN38还可通过诱导细胞凋亡来杀伤被流感病毒感染的细胞。
当这些分子(包括但不限于微管溶素B酰肼、匹莫迪韦、奥扎莫德或SN38)与病毒包膜蛋白的靶向配体缀合时，它们可发挥杀伤被病毒感染的细胞或抑制被感染细胞内的病毒复制的多种作用。
用于治疗流感的扎那米韦-半抗原缀合物靶向免疫治疗的设计
除了可直接杀伤被流感病毒感染的细胞或抑制被感染细胞内的病毒复制的治疗性药物之外，免疫治疗可通过身体中存在的抗体有效地引发免疫系统来抵抗特定的感染。对于这样的免疫治疗的一种可能候选物是通过制备TL与二硝基苯基(DNP)的缀合物来唤醒循环的抗DNP抗体。
由于扎那米韦对被流感病毒或病毒感染的细胞具有潜在的靶向能力，因此扎那米韦-二硝基苯基(DNP)缀合物也在我们的实验室中被开发(图3)。如图3b中所示，认为扎那米韦-DNP缀合物在被流感病毒/病毒感染的细胞与内源性循环抗DNP抗体之间形成双特异性分子“桥”。该“标记”步骤通过例如抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、抗体依赖性细胞的细胞毒作用(ADCC)和补体依赖性细胞毒作用(CDC)的机制开始导致清除抗体包被的病毒或被病毒感染的细胞的免疫应答。21-23
扎那米韦-DNP缀合物靶向免疫治疗相对于流感疫苗有两个主要优势。首先，目前的流感疫苗是基于在下一季节中可能出现的病毒亚型的预测而制备的。由于这种预测偶尔会失败，因此疫苗无法精确匹配病毒。然而，扎那米韦对所有11种流感NA亚型均以高亲和力有效，并且在临床中几乎未发现扎那米韦抗性病毒。7其次，由于人血流中已经存在抗DNP抗体，因此对于该治疗无需预接种疫苗。24
不受任何理论的束缚，考虑了与任何其他部分(例如三硝基苯基(TNP)、鼠李糖或α-半乳糖基)缀合的扎那米韦可将其各自的抗体募集至被流感感染的细胞以引发抗体依赖性免疫应答。因此，本文中公开的免疫治疗可通过扎那米韦缀合物标记物来靶向被流感病毒感染的细胞。
用于靶向CAR T细胞治疗的流感病毒诱导的肿瘤类型
本公开内容中考虑了与如在美国申请15/296,666或其相关申请(其内容通过引用明确地并入本文)中所述的我们新开发的衔接的CAR T细胞治疗结合，将CAR T细胞靶向递送至被流感病毒感染的细胞以执行CAR T细胞的免疫应答功能。
图13描绘了治疗被流感病毒感染的细胞的CAR T细胞策略。在图13中，产生扎那米韦-FITC缀合物，并将其附着于在表面上表达病毒神经氨酸酶的被流感病毒感染的细胞。值得注意的是，扎那米韦-FITC在此过程中可发挥至少两种不同的功能，一种是用作显像剂以示出流感病毒的感染强度；另一种是用扎那米韦标记被病毒感染的细胞，扎那米韦是一种可阻断病毒从包膜中出芽的NA抑制剂。扎那米韦-FITC缀合物在被感染细胞表面的存在可将与抗FITC抗体衔接的T细胞指导至被病毒感染的细胞，并形成免疫突触。如本领域技术人员可知晓的，这样的抗FITC CAR T细胞可通过与扎那米韦-FITC缀合物的结合而被活化。因此，活化的CAR T细胞可分泌细胞因子，并随后杀伤被病毒感染的细胞，阻止病毒复制。
不受任何理论的束缚，可从多个方面看出使用小分子靶向药物或免疫调节剂缀合物来治疗被流感感染的细胞的优势。目前，疫苗是基于对哪种毒株可能在下一季节期间传播的年度预测而制备的。然而，这样的策略偶尔会失败，并且因此造成疫苗对流行中的主要病毒毒株无效。例示的扎那米韦是一种对所有11种流感NA亚型均有效的NA抑制剂，其阻断病毒从被感染的细胞出芽。因此，有效性适用于流感病毒的所有亚型。同时，与载荷药物(治疗剂或免疫治疗调节剂)或衔接子分子(即荧光素)缀合的扎那米韦介导抗荧光素CAR T细胞，特异性标记被流感感染的细胞以引发必要的免疫应答来清除被病毒感染的细胞。
实施例
实施例1.靶向配体的设计
流感神经氨酸酶(NA)是锚定在流感病毒包膜的脂筏结构域中的跨膜糖蛋白。NA占膜糖蛋白的20％(约80)，并且NA的头部是同四聚体。它通过从膜糖蛋白或糖脂切割唾液酸来帮助子代病毒从被感染细胞中释放(在病毒出芽过程中，流感病毒血凝素可与宿主细胞膜上的唾液酸受体结合，这阻碍了新形成的病毒的释放)。9由于神经氨酸酶在流感病毒表面和被感染细胞膜表面二者上均表达，因此我们小组选择它作为潜在靶标用于设计靶向配体以靶向被流感病毒和病毒感染的细胞。
迄今为止，已经开发出四种作为抗流感药物的神经氨酸酶抑制剂：奥司他韦(Tamiflu；Glide/Roche)、扎那米韦(Relenza；GlaxoSmithKline)、帕拉米韦(Rapivab；BioCryst)和拉尼米韦(Inavir；Daiichi Sankyo)。25因为扎那米韦是来源于天然存在的唾液酸且功能化最低的抑制剂，所以在临床上很少发现扎那米韦抗性病毒。7因此，在神经氨酸酶抑制剂中选择扎那米韦作为用于靶向配体设计的候选物。Honda et al.报道了，扎那米韦的经C-7烷基修饰的类似物保留了其针对神经氨酸酶的抑制活性(图4)，这表明C-7位置对于被修饰为接头连接位点是耐受的。26Honda的结论通过与神经氨酸酶复合的扎那米韦的X射线晶体学结构的结果得到了支持：扎那米韦的7-OH基暴露于溶剂表面区域，并且没有造成与神经氨酸酶的活性位点的直接相互作用(图5)。27此外，数个研究小组还使用C7位置作为连接位点来构建具有提高的抗流感活性的扎那米韦和扎那米韦衍生物的一组多聚体类似物。28总而言之，我们通过修饰扎那米韦的7-OH基作为连接位点设计了基于扎那米韦的新的NA靶向配体(图4)。
实施例2.化合物合成
Figure BDA0002953761670000171
方案1靶向配体的合成。试剂和条件：(a)安伯来特(amberlite)IR-120B(H+形式)，MeOH；(b)乙酸酐，4-(二甲基氨基)吡啶(DMAP)，吡啶；(c)三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯，乙酸乙酯；(d)叠氮三甲基硅烷，叔丁醇；(e)三苯基膦，H2O，THF；(f)N，N’-双(叔丁氧基羰基)-1H-吡唑-1-甲脒，三乙胺，THF；(g)甲醇钠溶液，MeOH；(h)2，2-二甲氧基丙烷，对甲苯磺酸，丙酮；(i)4-硝基苯基氯甲酸酯，DMAP，吡啶；(j)叠氮基-
Figure BDA0002953761670000172
3-胺，DMAP，吡啶；(k)1MNaOH(aq)，THF；(1)TFA。
Figure BDA0002953761670000181
方案2小分子药物缀合物的通用合成方案。
Figure BDA0002953761670000182
方案3扎那米韦-罗丹明缀合物的合成。试剂和条件：(a)DBCO-胺，DIPEA，DMF；(b)DMSO。
Figure BDA0002953761670000183
方案4扎那米韦-EC20缀合物的合成。试剂和条件：(a)1.DMF情况下的湿树脂，2.Fmoc-Asp(OtBu)-OH，PyBop，DIPEA，DMF；(b)1.DMF中20％哌啶，2.Fmoc-DAPA-OH，PyBop，DIPEA，DMF；(c)DMF中20％哌啶；(d)1.DBCO-酸，PyBop，DIPEA，DMF，2.TFA/TIPS/EtSH/H2O(92.5：2.5：2.5：2.5)；(e)DMSO。
Figure BDA0002953761670000191
方案5扎那米韦-微管溶素B-酰肼缀合物的合成。试剂和条件：(a)THF/NaHCO3缓冲液。
Figure BDA0002953761670000192
方案6扎那米韦-DNP缀合物的合成。试剂和条件：(a)TEA，EtOH；(b)DBCO-NHS，DIPEA，DMSO；(c)DMSO。
Figure BDA0002953761670000201
方案7扎那米韦-匹莫迪韦缀合物的合成。试剂和条件：(a)N-Boc-二乙醇胺，EDC，DMAP，DCM；(b)DCM中20％TFA；(c)DBCO-NHS，DIPEA，DMSO；(d)DMSO。
Figure BDA0002953761670000202
方案8扎那米韦-奥扎莫德缀合物的合成。试剂和条件：(a)DBCO-酸，EDC，DMAP，DCM；(b)DMSO。
Figure BDA0002953761670000211
方案9扎那米韦-SN38缀合物的合成。试剂和条件：(a)二碳酸二叔丁酯，吡啶，DCM；(b)DBCO-酸，EDC，DMAP，DCM；(c)DCM中20％TFA；(d)DMSO。
实施例3.用于抗流感化学治疗的小分子配体靶向药物缀合物与流感病毒感染的MDCK细胞的体外结合
(1)用扎那米韦-罗丹明缀合物进行的共聚焦显微镜研究
方法：将MDCK细胞接种在共聚焦板中并孵育过夜。第二天，当细胞达到80％汇合时，将它们用100TCID50流感病毒A/Puerto Rico/8/34(H1N1)感染。在第三天，在存在或不存在5μM扎那米韦的情况下，将被感染的MDCK细胞与50nM扎那米韦-罗丹明缀合物一起孵育。在37℃下孵育1小时之后，将细胞用细胞培养基清洗并送至共聚焦显微镜。
如图6a中所示，当流感病毒感染的MDCK细胞与50nM扎那米韦-罗丹明缀合物一起孵育时观察到强的荧光信号。当通过100倍过量的扎那米韦竞争扎那米韦-罗丹明缀合物与神经氨酸酶的结合时，荧光发射信号消失(图6b)，这表明缀合物的细胞摄取是受体介导的。简而言之，该结果表明扎那米韦-罗丹明缀合物可与流感病毒感染的MDCK细胞结合并被内化到其中。
(2)用扎那米韦-罗丹明缀合物进行结合亲和力研究
方法：将MDCK细胞接种在24孔板中并孵育过夜。第二天，当细胞达到80％汇合时，将它们用100TCID50流感病毒A/Puerto Rico/8/34(H1N1)感染。在第三天，在存在或不存在100倍过量的扎那米韦的情况下，将被感染的MDCK细胞与不同浓度的扎那米韦-罗丹明缀合物一起孵育。在37℃下孵育1小时之后，将细胞用细胞培养基清洗，并通过荧光光谱术来量化剩余的荧光。通过使用GraphPad Prism 4绘制细胞结合的荧光强度相对于添加的扎那米韦-罗丹明缀合物的浓度的图来计算表观Kd。
如图6c中所示，发现扎那米韦-罗丹明缀合物与在被病毒感染的细胞上表达的神经氨酸酶的结合以10.98nM的Kd达到饱和，并且扎那米韦-罗丹明缀合物的这种结合可被100倍过量的扎那米韦竞争。
基于上述共聚焦和结合亲和力研究，证明扎那米韦衍生物是作为针对流感病毒神经氨酸酶的靶向配体的良好候选物。
实施例4.体内生物分布
(1)用99mTc螯合的扎那米韦-EC20头部缀合物进行的结合亲和力研究
方法：将MDCK细胞接种在24孔板中并孵育过夜。第二天，当细胞达到80％汇合时，将它们用100TCID50流感病毒A/Puerto Rico/8/34(H1N1)感染。在第三天，在存在或不存在100倍过量的扎那米韦的情况下，将被感染的MDCK细胞与不同浓度的99mTe螯合的扎那米韦-EC20头部缀合物一起孵育。在37℃下孵育1小时之后，将细胞用细胞培养基清洗，并通过γ计数器量化剩余的99mTc螯合的扎那米韦-EC20头部缀合物的放射性。通过使用GraphPadPrism 4绘制细胞结合的放射性相对于放射示踪剂的浓度的图来计算表观Kd。
发现锝-99m(99mTc)螯合的扎那米韦-EC20头部缀合物与在被病毒感染的细胞上表达的神经氨酸酶的结合以15.09nM的Kd达到饱和，并且99mTc螯合的扎那米韦-EC20头部缀合物的这种结合可被100倍过量的扎那米韦竞争(图7a)。该结合亲和力值与通过扎那米韦-罗丹明缀合物测量的值一致，这进一步证明了扎那米韦衍生物是针对流感病毒神经氨酸酶的良好的靶向配体。
(2)用99mTc螯合的扎那米韦-EC20头部缀合物进行的生物分布研究
方法：首先用50μL流感病毒A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)对BALB/c小鼠(6至7周龄)进行鼻内感染以发展流感症状。3天之后，在存在或不存在100倍过量的扎那米韦的情况下，向小鼠静脉内注射100μL10nmol扎那米韦-EC20头部缀合物(包含20pM 99mTc螯合的缀合物)。注射之后5小时，除去主要组织/器官，并通过γ计数器确定放射性的量。
为了测试扎那米韦衍生物向流感病毒感染的肺特异性递送治疗剂或显像剂的能力，测量了99mTc螯合的扎那米韦-EC20头部缀合物在病毒感染的小鼠/未被感染的小鼠中的生物分布谱。如图8中所示，缀合物在病毒感染的小鼠的肺(流感病毒在其中增殖的主要器官)中表现出最高的摄取。此外，在竞争组或未被感染组中的小鼠中均无99mTc螯合的扎那米韦-EC20缀合物的肺摄取，表明缀合物的肺摄取是受体介导的。除了病毒感染的肺之外，肾是显示出显著放射性信号的唯一器官。然而，在竞争组或未被感染组中信号均未消除，表明99mTc螯合的扎那米韦-EC20头部缀合物在肾中的积累不是神经氨酸酶介导的。总而言之，该结果提供了在该项目中设计的扎那米韦衍生物可用作靶向配体来向病毒感染的肺特异性递送治疗剂或显像剂的有力证据。
实施例5.用扎那米韦-微管溶素B酰肼缀合物进行的体外细胞毒性研究
方法：将神经氨酸酶转染的HEK 293细胞接种在96孔板中，并在37℃下下在存在100倍过量的扎那米韦下与扎那米韦-微管溶素B酰肼缀合物、游离微管溶素B酰肼或扎那米韦-微管溶素B酰肼缀合物一起孵育2小时。然后用新鲜培养基清洗细胞，并在37℃下再孵育48小时。使用ATP检测(CellTiter Glo，Promege Inc.Madison，WT)测量细胞生存力。通过使用GraphPad Prism 4绘制％发光强度相对于药物的对数浓度的图来计算EC50值。
为了确定扎那米韦-微管溶素B酰肼缀合物的细胞毒性和靶向特异性，进行了使用神经氨酸酶转染的HEK293细胞的体外细胞毒性测定。如图9中所示，扎那米韦-微管溶素B酰肼缀合物的EC50为5.2nM，这与游离微管溶素B酰肼的EC50(9.9nM)相当。用100倍过量的扎那米韦对神经氨酸酶结合位点的阻断将细胞毒性降低了＞30倍，表明大多数细胞杀伤是受体介导的。
实施例6.用于抗流感化学治疗和免疫治疗的小分子配体靶向药物缀合物使用扎那米韦-若丹明缀合物作为经标记的配体进行的扎那米韦-DNP缀合物与神经氨酸酶转染的HEK293细胞的竞争性结合
方法：将神经氨酸酶转染的HEK 293细胞接种在24孔板中并孵育过夜。第二天，将细胞与单一浓度的经标记配体(15nM扎那米韦-罗丹明缀合物)以及不同浓度的扎那米韦-DNP缀合物或扎那米韦一起孵育。孵育1小时之后，将细胞用细胞培养基清洗，并通过荧光光谱术来量化剩余的荧光。通过使用GraphPad Prism4中的竞争结合方程绘制细胞结合的荧光强度相对于添加的扎那米韦-DNP缀合物或扎那米韦的对数浓度的图来计算表观Kd。
在竞争性结合实验中测量扎那米韦-DNP缀合物与细胞膜结合神经氨酸酶的结合亲和力。图10示出了测量的扎那米韦-DNP缀合物和扎那米韦的结合亲和力分别为12.81和0.45nM。即使靶向配体的结合亲和力在与DNP部分连接之后降低了28倍，但其结合亲和力仍处于较低的纳摩范围内，这表明扎那米韦-DNP缀合物具有用作配体靶向的半抗原缀合物的潜力。
实施例7.用扎那米韦-DNP缀合物进行的抗DNP抗体募集测定
如图11中所示，扎那米韦-DNP缀合物能够与神经氨酸酶转染的HEK293细胞膜(293tn NA)上的神经氨酸酶特异性结合，并以约10nM募集抗DNP抗体。在未经转染的HEK293细胞(293tn)中未观察到结合。
方法：将293tn NA(神经氨酸酶转染的)和对照(未经转染的293tn)细胞与不同浓度的扎那米韦-DNP缀合物在4℃下一起孵育30分钟，随后用PBS清洗3次。在这之后，将细胞用抗DNP-生物素和链霉亲和素-PE在4℃下下染色30分钟。用PBS清洗细胞3次，并进行流式细胞术。
实施例8.小鼠保护研究
方法：在第1周和第3周用DNP-KLH使BALB/c小鼠(4周龄)免疫两次。在第4周，用50μLLD50流感病毒A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)对经免疫接种和未经免疫接种的小鼠二者进行鼻内感染以发展流感症状。2小时之后，鼻内给予小鼠PBS/扎那米韦/扎那米韦-DNP缀合物(1.5μmol/kg)，每天一次，持续5天。当小鼠减轻了其初始重量的25％或当其濒死时认为小鼠死亡。
如图12中所示，扎那米韦-DNP缀合物(红色倒三角形)具有比剂量为1.5μmol/kg的扎那米韦(绿色三角形)优异的效果。对于扎那米韦-DNP缀合物处理的经免疫接种小鼠，未观察到体重减轻或流感症状(图12a，红色线)。扎那米韦-DNP缀合物保护所有经免疫接种小鼠免受致命的病毒攻击(图12b，红色线)。相比之下，扎那米韦仅挽救了60％的经免疫接种小鼠(图12b，绿色线)。值得一提的是，当将扎那米韦-DNP缀合物给予至未经免疫接种的小鼠时，其效力显著降低(蓝色线)，这强调了扎那米韦-DNP缀合物的免疫功能的重要性。
实施例9.用于靶向CAR T治疗的流感病毒诱导的肿瘤类型
在该实施例中，证明了CAR-T细胞杀伤表达NA的HEK 293细胞的体外研究。
图14示出了使用表达NA的HEK 293细胞(293NA)模拟被流感病毒感染的细胞。图14A和B分别示出了
CAR-T(100,000个细胞)∶293NA(20,000)＝5∶1，造成41％杀伤
CAR-T(200,000个细胞)∶293NA(20,000)＝10∶1，造成61％杀伤
实施例10.扎那米韦-FITC与正常293T细胞不结合
图15示出了扎那米韦-FITC与正常293T细胞不结合。由于扎那米韦与细胞表面上NA的特异性结合，如果不用NA表达转染293细胞，则扎那米韦-FITC将不存在于细胞表面上，因此当正常293细胞在流式细胞仪中设门时无法被检测到。只有在其表面上表达NA的细胞将通过扎那米韦-FITC缀合物被检测到。因此，扎那米韦-FITC可用作鉴定NA表达细胞的探针。
实施例11.针对NA的细胞毒性由扎那米韦-FITC特异性诱导
图16示出了抗FITC CAR T针对HEK 293NA细胞特异性执行其细胞毒性。
将三个不同的组(HEK-293+FITC-扎那米韦、293NA+EC17、293NA+游离扎那米韦)与人CAR-T细胞共培养，并通过LDH测试杀伤％。
在该表/图16中，HEK-293是不表达NA的正常293T细胞，而293NA是表达NA的293T细胞。FITC-扎那米韦是为CAR-T设计的衔接子以靶向表达NA的细胞(本质上是被流感感染的细胞；在本实验中为293NA)。对于EC17，FITC侧可与CAR-T细胞结合，但另一侧不与293NA结合。因此，可将这三组认为是：1.具有正确衔接子的非靶细胞；2.具有错误衔接子的靶细胞；3.具有游离药物的靶细胞。预期这三组的结果为没有杀伤，并且图16中的实验结果支持了该假设(来自293NA+EC17组的3至5％杀伤可能是变动，并且其与图14中的来自实验组(293NA+FITC-扎那米韦)的40至60％杀伤相比不显著。
实施例12.使用真病毒的体外测定
与实施例10类似，可通过扎那米韦-罗丹明缀合物来鉴定真病毒感染的MDCK细胞以检查NA的表达水平，如图17中所示。
通常来说，用100TCID50流感病毒(H1N1)感染汇合的MDCK细胞。在例示的图17中，将细胞用100nM扎那米韦-罗丹明缀合物染色以检查在细胞表面上的NA的表达水平。
在流感病毒感染MDCK细胞约15小时之后，将这些细胞与CAR-T细胞共培养数小时。然后，通过至少两种不同的方法来检查CAR-T杀伤作用的效力：一种是检查细胞裂解，例如LDH测定。图18提供了扎那米韦-FITC缀合物衔接的抗FITC CAR-T细胞杀伤H1N1感染的MDCK。左图示出了文献报道：在共培养18小时之后，常规T细胞以10％的最大比例杀伤MDCK细胞，而衔接的CAR-T细胞在仅共培养7小时之后，引起对流感感染的MDCK细胞的约8.4％的杀伤。此外，衔接的CAR-T细胞不杀伤未被感染的MDCK，表明CAR T对被感染的T细胞极具特异性。检查CAR T杀伤作用的另一种方法是测量上清液中的病毒滴度(例如，使用qPCR测量病毒遗传物质以量化病毒复制)。
实施例13.研究用于靶向CAR-T治疗的流感诱导的肿瘤类型的体内小鼠模型
图19提供了用于使用在先前实施例中描述的靶向衔接子介导的抗FITC CAR-T治疗来研究流感病毒诱导的肿瘤类型的小鼠模型。首先研究了流感病毒感染的NSG小鼠，以确定病毒滴度的LD50。在建立合适的病毒滴度和被感染的NSG小鼠之后，将扎那米韦-FITC缀合的衔接子和抗FITC CAR-T细胞应用于被感染的NSG小鼠以进行挽救。预期在扎那米韦-FITC缀合物和抗FITC CAR-T挽救之后，小鼠的存活将提高。
实施例14.扎那米韦-DNP缀合物对于甲型流感组1神经氨酸酶(由N1表示)和组2神经氨酸酶(由N2表示)二者的结合亲和力
图21提供了流感病毒A/Puerto Rico/8/34(H1N1)感染的MDCK细胞的体外结合测定。
图22提供了流感病毒A/Aichi2/1968(H3N2)感染的MDCK细胞的体外结合测定。
实施例15.扎那米韦-DNP缀合物通过CDC和ADCP作用诱导对被流感病毒感染的细胞的杀伤的能力
图23至24示出了抗DNP抗体可被募集到对于H1N1和H3N2毒株二者的病毒感染的MDCK细胞。
图25示出了扎那米韦-DNP缀合物的补体依赖性细胞毒作用测定，其中仅需要10nM药物缀合物来实现最大杀伤。这表明扎那米韦-DNP缀合物比单独的扎那米韦强效得多。
图26示出了扎那米韦-DNP缀合物可使抗DNP抗体实现抗体依赖性吞噬(ADCP)。
实施例16.一系列的活小鼠研究表明：
a.在治疗流感病毒感染中药物的鼻内施用的效力(图27至29)
b.剂量逐增研究示出了鼻内施用之后的最佳剂量(图27)
c.剂量频率研究示出了在鼻内施用之后单剂量足以产生完全的治愈(图28、31)
d.该治疗可延迟直至检测到流感症状之后72小时，并且在鼻内施用之后仍可实现完全治愈(图29至30)
e.相同的药物可通过腹膜内注射来施用，并且仍然实现完全治愈(图33至34)
f.在所有上述测定中，我们的药物显著胜过扎那米韦(图27至34)
g.BioD数据和spect/CT成像示出了对被感染的肺组织的特异性(图32)
实施例17.用抗体依赖性细胞的细胞毒作用报道基因生物测定来分析用于治疗流感的配体靶向免疫治疗(图35A至B)
在该实施例中，通过萤火虫萤光素酶报道基因测定(ADCC Reporter Bioassays，VVariant，目录号：G7010，Promega)，应用ADCC报道基因生物测定来监测扎那米韦-DNP缀合物诱导的ADCC应答。简言之，使用经改造的Jurkat细胞来稳定表达FcγRIIIa受体，并且使用驱动萤火虫萤光素酶表达的NFAT(活化T细胞核因子)应答元件作为效应细胞，如图35A中所示。ADCC作用模式中的抗体生物学活性通过作为NFAT途径激活的结果而产生的萤光素酶进行量化，这表明扎那米韦-DNP缀合物参与介导针对靶细胞的ADCC作用，如图35B中所示。该实施例显示，扎那米韦-DNP缀合物对于介导ADCC作用发挥重要作用。
实施例18.用针对H1N1和H3N2感染的MDCK细胞的体外抗病毒测定来分析用于治疗流感的配体靶向免疫治疗(图36A至B)
在该实施例中，研究了感染有H1N1或H3N2病毒的MDCK细胞的扎那米韦-DNP缀合物保护作用。如图36A(H1N1)和36B(H3N2)中所示，EC50表示对于病毒感染的MDCK的50％保护的抑制剂浓度。
为确保扎那米韦-DNP缀合物仍可抑制其抑制流感病毒增殖所需的神经氨酸酶活性，我们比较了扎那米韦和扎那米韦-DNP缀合物在MDCK-流感病毒共培养物中抑制流感病毒繁殖的效力。
实施例19.对于H3N2病毒感染的小鼠的单剂量治疗(鼻内施用)(图37A至B)
在该实施例中，在第0天用50uL A/Aichi/2/1968(HA，NA)，x-31b(H3N2)病毒(100LD50)感染经DNP-KLH免疫接种的小鼠(每组5只小鼠)。
感染之后24小时鼻内给予小鼠扎那米韦-DNP缀合物/扎那米韦/PBS仅一次，并且当小鼠减轻了其初始重量的25％或当其濒死时认为小鼠死亡。
如图37A和B中所示，鼻内施用扎那米韦-DNP提供了在感染之后14天的良好的保护(所有小鼠均被治愈)，而单独的扎那米韦没有提供相同的保护。
实施例20.对于H1N1病毒感染的小鼠的单剂量治疗(腹膜内施用)(图38A至B)
在该实施例中，在第0天，用50uL A/Puerto Rico/8/34(100LD50，4.2×105PFU)感染经DNP-KLH免疫接种的小鼠(每组5只小鼠)。
感染之后24小时腹膜内给予小鼠扎那米韦-DNP缀合物/扎那米韦/PBS仅一次，并且当小鼠减轻了其初始重量的25％或当其濒死时认为小鼠死亡。
如图38A和B中所示，腹膜内施用扎那米韦-DNP提供了在感染之后14天的良好的保护(所有小鼠均被治愈)，而单独的扎那米韦没有提供相同的保护。
实施例21.对于H3N2病毒感染的小鼠的单剂量治疗(腹膜内施用)(图39A至B)
在该实施例中，在第0天用50uL A/Aichi/2/1968(HA，NA)，x-31b(H3N2)病毒(100LD50)感染经DNP-KLH免疫接种的小鼠(每组5只小鼠)。
感染之后24小时腹膜内给予小鼠扎那米韦-DNP缀合物/扎那米韦/PBS仅一次，并且当小鼠减轻了其初始重量的25％或当其濒死时认为小鼠死亡。
如图39A至B中所示，腹膜内施用扎那米韦-DNP提供了在感染之后14天的良好的保护(所有小鼠均被治愈)，而单独的扎那米韦没有提供相同的保护。
实施例22.H1N1病毒感染的抗DNP抗体处理的未经免疫接种小鼠(图40A至B)
在该实施例中，在用致死剂量的H1N1病毒感染之后一天，对未经免疫接种的小鼠静脉内给予抗DNP抗体，并通过不同剂量的腹膜内施用的扎那米韦-DNP缀合物立即进行处理。
在预研究中，在第0天，用50uL A/Puefrto Rico/8/34病毒(100LD50，4.2×105PFU)感染小鼠(每组3只小鼠)。
感染之后24小时静脉内给予小鼠抗DNP抗体(多克隆兔IgG)仅一次，并且感染之后24小时鼻内给予扎那米韦-DNP缀合物仅一次。
当小鼠减轻了其初始重量的25％或当其濒死时认为小鼠死亡。
如图40A至B中所示，如果在感染之后24小时同时施用，则低至1mg/kg的静脉内施用的抗DNP抗体以及1.5umol/kg的鼻内施用的zana-DNP缀合物能够提供针对致死剂量的H1N1病毒感染的必要保护。实施例23.扎那米韦-鼠李糖缀合物的合成方案(图41)
在该实施例中，合成了不同的缀合物扎那米韦-鼠李糖以用于诱导针对流感病毒感染的免疫应答。图41中提供了合成方案。
实施例24.使用扎那米韦-罗丹明缀合物作为经标记配体进行的扎那米韦-鼠李糖缀合物与神经氨酸酶转染的HEK293细胞的竞争性结合(图42A至B)
在该实施例中，将神经氨酸酶转染的HEK 293细胞接种在24孔板中并孵育过夜。第二天，将细胞与单一浓度的经标记配体(15nM扎那米韦-罗丹明缀合物)以及不同浓度的扎那米韦-鼠李糖缀合物或扎那米韦一起孵育。孵育1小时之后，将细胞用细胞培养基清洗，并通过荧光光谱术来量化剩余的荧光。通过使用GraphPad Prism 4中的竞争结合方程绘制细胞结合的荧光强度相对于添加的扎那米韦-DNP缀合物或扎那米韦的对数浓度的图来计算表观Kd。与游离扎那米韦的Kd约0.77nM和扎那米韦-罗丹明缀合物的Kd约11.71nM相比，对于扎那米韦-鼠李糖缀合物绘制的Kd为约3.57nM。
实施例25.用扎那米韦-鼠李糖缀合物进行的免疫治疗研究(图43A至B)
在该实施例中，在剂量逐增研究中观察到扎那米韦-鼠李糖缀合物对小鼠的保护。简言之，在第0天，用50uL A/Puerto Rico/8/34病毒(100LD50，4.2×105PFU)感染经鼠李糖-OVA免疫接种的小鼠(每组5只小鼠)。
感染之后24小时鼻内给予小鼠1.5/0.5/0.17umol/kg的扎那米韦-鼠李糖缀合物/扎那米韦/PBS，每天两次，持续5天，并且当小鼠减轻了其初始重量的25％或当其濒死时认为小鼠死亡。
如图43A至B中所示，低至0.17umol/kg的扎那米韦-鼠李糖缀合物b.i.d能够为A/Puerto Rico/8/34(H1N1)病毒致死感染的小鼠提供至少50％的保护。
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Claims (25)

1.缀合物，其包含针对流感病毒包膜蛋白的靶向配体(TL)、接头(L)和药物载荷(D)，其中所述TL是与所述包膜蛋白结合的分子，所述接头与所述D和所述TL二者共价结合，并且所述D是显像剂、治疗性药物、免疫调节剂、或其组合。
2.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述接头在所述TL与所述D之间包含间隔区和可切割或不可切割的桥。
3.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述流感病毒包膜蛋白是神经氨酸酶(NA)或血凝素(HA)。
4.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述TL是扎那米韦。
5.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述TL选自：奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦和拉尼米韦。
6.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述D选自：微管溶素B酰肼、匹莫迪韦、奥扎莫德和SN38。
7.根据权利要求4所述的缀合物，其包含：
Figure FDA0002953761660000011
Figure FDA0002953761660000021
Figure FDA0002953761660000031
Figure FDA0002953761660000041
8.根据权利要求2所述的缀合物，其中所述可切割的桥包含二硫键或酸不稳定键。
9.根据权利要求8所述的缀合物，其中所述酸不稳定键包含酯、腙、肟、缩醛、缩酮、酚醚或席夫碱键。
10.在对象中治疗流感病毒感染的方法，其包括向所述对象提供缀合物，其中所述缀合物包含所述流感病毒的NA的靶向配体(TL)、接头(L)和药物载荷(D)，其中所述TL是结合NA的分子，所述L与所述D和所述TL二者共价结合，并且所述D是显像剂、治疗性药物、免疫调节剂、或其组合。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述TL是扎那米韦。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述治疗性药物杀伤所述对象中被流感病毒感染的细胞，或抑制流感病毒复制。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述治疗性药物选自：微管溶素B酰肼、匹莫迪韦和SN38。
14.根据权利要求10所述的方法，其中所述治疗性药物包含衔接子分子(即，与所述TL结合的荧光素)和抗荧光素CAR T细胞，其中在与所述衔接子结合之后，所述CAR-T细胞在所述对象中杀伤被流感病毒感染的细胞或抑制流感病毒复制。
15.根据权利要求10所述的方法，其中所述免疫调节剂抑制流感病毒诱导的早期细胞因子风暴。
16.根据权利要求10所述的方法，其中所述免疫调节剂是奥扎莫德或被自体抗体识别的半抗原。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述半抗原由二硝基苯基(DNP)、三硝基苯基(TNP)、鼠李糖或α-半乳糖基部分构成。
18.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述缀合物包含用于量化流感感染强度的显像剂。
19.根据权利要求18所述的缀合物，其中所述显像剂包含含有锝-99m(99mTc)的螯合络合物。
20.根据权利要求4所述的缀合物，其中所述缀合物与所述NA的结合亲和力为约1nM至约15nM。
21.根据权利要求11所述的方法，其中扎那米韦缀合物通过抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、抗体依赖性细胞的细胞毒作用(ADCC)或补体依赖性细胞毒作用(CDC)引发导致清除抗体包被的病毒或被病毒感染的细胞的免疫应答。
22.包含至少两种组分的系统，第一组分包含缀合物，所述缀合物包含针对流感病毒包膜蛋白的靶向配体(TL)、接头(L)和药物载荷(D)，其中所述TL是结合所述包膜蛋白的分子，所述L与所述D和所述TL二者共价结合，并且所述D是荧光素；第二组分包含与所述第一组分的荧光素结合的抗荧光素CAR T细胞，其中所述系统被促进以杀伤被流感病毒感染的细胞。
23.根据权利要求10所述的方法，其中D是所述对象具有预先存在免疫力的抗原或部分。
24.根据权利要求23所述的方法，其还包括向所述对象同时施用有效剂量的针对所述抗原或部分的抗体的步骤。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述抗原或部分是细菌毒素。
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