JPS5810396B2 - 新規なエストラジオ−ル結合体とその製造方法及び抗腫瘍剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規な抗腫瘍性ステロイドホルモン結合体に
関するものである。

詳しくは、エストラジオール誘導体と抗腫瘍剤とを化学
的に結合させたエストラジオール誘導体の結合体及び、
本結合体を主成分とする抗腫瘍剤に関するものである。

周知の如く、既知抗腫瘍剤の多くは、癌細胞を破壊する
と同時に、正常細胞にも一部著しい影響を及ぼすものが
多く、副作用が強く、長期投与が困難なために、癌細胞
を根絶することが困難であると考えられている。

本発明者等は、従来の抗腫瘍剤の欠点を解決し、治療効
果の高い抗腫瘍剤を開発するための研究をおこなった結
果、ある種の癌細胞を著しく高選択的に消滅させうると
共に、副作用の著しく少ない新規な抗腫瘍性ステロイド
ホルモン結合体を得た。

本発明のエストラジオール誘導体−クロロシトシン様物
質体は、癌細胞と特異的に結合する特定のステロイド系
ホルモン物質と特定の抗腫瘍性物質の結合体であって、
癌細胞に抗腫瘍性物質を選択的に作用させる特徴がある
。

こ匁でクロロシトシン様物質とはクロシトシンとメチル
オキシ クロロシトシンの６位のアルコールをカルボン
酸に変成した物質を含むものである。

上述の成る特定の癌細胞とは、本結合体の構成成分であ
るエストラジオール誘導体に対して、細胞内にレセプタ
ーを有しているものであって、これが本発明の結合体の
標的に利用される。

したがって、癌細胞内にエストラジオールに対するレセ
プターを有する癌が本結合体の使用対象となる。

この種の癌として、乳癌、前立腺癌、腎癌、甲状腺癌、
子宮内膜癌がある。

特に、乳癌、子宮内膜癌、前立腺癌が本結合体の重要な
適用対象となる。

本発明の新規なエストラジオール誘導体の結合体は、一
般式（Ｖ）で示されるものである。

これらは構造異性のα体、β体を間はない。

該エストラジオール誘導体の結合体（Ｖ）は、エストラ
ジオールと抗腫瘍剤とを結合剤を用いて結合することに
よって得られる。

エストラジオールと抗腫瘍剤との結合に際しては、エス
トラジオールの活性部位が阻害されないように結合させ
ることが重要であり、一方、エストラジオールと結合す
る抗腫瘍剤の部位は、該結合によって抗腫瘍活性を阻害
しない部位でなければならない。

かかる結合は、導入結合剤を用いておこないうる。

導入結合剤を用いる場合、これによって新たな毒性が生
じるようなものであってはならない。

エストラジオールと抗腫瘍剤との結合は、モツプロムア
セチルブロマイド、モノクロルアセチルクロライド、モ
ノクロル酢酸、モノブロム酢酸等の導入結合剤を用い、
エストラジオールの非活性部位の水酸基と反応させて 一般式 （ここに、Ｂはエストラジオールから１個の水酸基がと
れた基を表わし、Ｘは、ハロゲン原子を表わす） で示されるエステルとし、このハロゲンを抗腫瘍剤の所
望の基と反応させて、本発明のエストラジオール−抗腫
瘍剤の結合体を得る。

さらに具体的に反応条件を説明するならば、四塩化炭素
、クロロホルム、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホ
キサイド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ
＞、ピリジン、アセトン等の溶剤中で、エストラジオー
ルの１７位のＯＨ基と上記の導入結合剤すなわち、モノ
ブロムアセチルブロマイド等とを反応させ、次に、該反
応生成物をＤＭＳＯ，ＤＭＦ、ピリジン、トルエン、四
塩化炭素、クロロホルム、テトラヒドロフラン 。

（ＴＨＦ）等の溶剤中で、所定の抗腫瘍剤と反応させる
。

たとえば、反応温度は、通常０乃至１００℃好ましくは
、０乃至５０℃であり、反応時間は、２乃至７４時間で
ある。

得られた反応生成物を常法。により精製することによっ
て、本発明のエストラジオール誘導体の結合体が得られ
る。

この種の製造法の詳細は、下記の実施例より容易に理解
される。

勿論、該実施例は具体的−態様を示すものに過ぎず、上
述の反応において種々の反応条件を考慮しうる。

このようにして得られた本発明の結合体は、赤外吸収ス
ペクトル、紫外吸収スペクトル、該磁気共鳴、元素分析
、融点等の手段により構造を確認した結果、一般式（Ｖ
）で示されるエストラジオール誘導体の結合体であるこ
とを確認した。

さらに、本発明のエストラジオール誘導体の結合体の急
性毒性、エストロゲン感受性を有する細胞へのとりこみ
試験、制癌試験をおこなった結果、毒性が著しく低く、
かつエストロゲン感受性を有する細胞へのとりこみが著
しく、かつ、制癌作用が著しいことが明らかとなった。

本結合体を治療薬として使用する際には、既知制癌剤と
同様な任意慣用の方法で投与用に割裂することが出来る
。

例えば、経口投与用の錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル等
は組成物中に結合剤、賦形剤、包含剤、潤滑剤、界面活
性剤、崩壊剤の如きものを含有してもよい。

又、経口用液体製剤は水性又は油性懸濁液、溶液、シロ
ップ、振とう合剤であってもよい。

座薬は親油性又は親水性基剤と安定剤、分解剤、着色剤
等を配合してもよい。

注射液は水性又は可溶化剤、栄養剤、安定剤、界面活性
剤、等が混入してもよい。

又、場合により薬剤活性を維持又は高めるため、許容範
囲内でアルカリ、酸、塩類等が添加されることもある。

このように目的に応じて製剤化された結合体は、経口、
経皮、筋肉内、腹腔内、静脈内、直腸内、局所等の諸経
路によって投与される。

其の投与量は投与方式及び治療の程度によって異なるも
のであるが、大略、次の通りである。

成人に対し、経口投与１日当り約０．１ ｒｖ／ｋｇ〜
５０■／ゆ成人に対し、静脈注射１日当り約０．０１即
／ｋｙ〜２０■／ｋｇ 而して、係る結合体からなる本発明は、以下の如き優れ
た特徴によって集約される。

（１）レセプターを有する組織が癌化した場合に、その
部位に選択的に作用し癌細胞を攻撃、消滅せしめる。

したがって少量投与で効果がある。（２）既知制癌剤単
独投与に比し、副作用が少な（、長期投与が可能なので
癌細胞を根絶できる。

（３〕 結合体に使われるキャリヤとしてのエストラ
ジオールは明確な単一構造化合物で、且つ、生理作用も
明らかなので安心して使用できる。

（４）結合体に使われる抗腫瘍剤は構造、活性共に既知
のものであるため安心して使用できる。

（５）癌細胞のレセプターを分析し、これに対応するス
テロイドホルモンを結合体のキャリヤに選ぶことにより
、目的をもって多種の癌を治療することができる。

（６）結合体は、経口、注射、座薬等の通常の手段で投
与し得る。

このように優れた特徴をもつ本発明は、今後、医学界は
もとより人類に大きく貢献できるものと思われる。

以下、実施例を以って、本発明を説明するが、特にこれ
によって本発明は限定されない。

実施例 １ １ β−エストラジオール−α−メチルオキシクロロシ
トシン結合体 反応 β−エストラジオール誘導体１３．３１５’をＤＭＳＯ
５０ｍｌに溶解し、次いで、メチルＮ−ベンジルオキシ
カルボニル−α−Ｄ−４ルコサミンウロネート銀塩３．
８７を加え光の遮断下、室温で３日間反応させた。

沈澱として生じたＡｇＢｒは、Ｇ−４フイルターで２回
沢別、更にアセトンで洗滌後、沢液を７０℃にて、シロ
ップ状にまで濃縮し、次いで１００７７１１の蒸留水を
添加し、ＤＭＳＯを除去した。

次に５℃に冷却し、一時間その状態を保持して、得られ
る沈澱物を沢別し、残渣を水洗後、石油エーテル、更に
はエチルエーテルで洗浄して室温で減圧乾燥を行ない５
．３１ｆの粉体を得た。

このものは、赤外吸収スペクトル、元素分析等により、
■である事を確認した。

次に得られた化合物１１５．ＯＳ’をＴＨＦ １５０７
７Ｉｌに溶解させ、内容量５ＱＱｍｌのオートクレーブ
に仕込み次いで１０％Ｐｄ−炭素触媒５．０７を加え水
素ガスで内部ガスを置換した後、水素圧を０．３に！９
／ｃｒＡゲージ圧に充填し、６４時間攪拌を行った。

水添終了確認は、シリカゲル薄層プレートにより原料■
のスポット消失を確認する事によって行った。

反応終了後、触媒を分離し、触媒を若干のＴＨＦで洗浄
後、沢液を水浴上で減圧乾固した。

石油エーテルを加えて析出する結晶を分離乾燥した。

水可溶性不純物を除去する為この物を水に分散させ、残
った白黄色固体を分離乾燥した処、３．８７の■を得た
。

得られた化合物１ｌ１３．８？を、アセトニトリル１５
０ｍ１と水２０ｍ１に分散させ、室温で３０分攪拌を行
った。

このものに、２−クロロエチルイソシアネー） ０．９
３ ？を加え、室温で１時間攪拌した。

反応終了時では、イソシアネート臭は消え、透明溶液で
あった。

反応終了後、３０℃で減圧濃縮し、濃縮物に水１００ｍ
１を加え１時間攪拌すると白色結晶が生成した。

この結晶を沢別乾燥しく収率９２．８％）、更にシリカ
ゲルカラムを用い、酢酸エチル４５ｍ１ニジクロヘキサ
ン４５ｍ１：エタノール１０ｍ１の混合溶媒で展開する
と収率４０％で高純度の化合物■が得られた。

次に、得られた化合物［Ｖ２００ＦＱを酢酸３．２ ｍ
ｌとエタノール６ｍｌよりなる混合溶液に溶解して、５
℃下で攪拌しなからＮ ａ ＮＯ２水溶液（水４ｍｌ、
ＮａＮＯ２３４４ｍ９ ）を滴下し、更に１６時間反応
を行なった。

反応終了後、３０℃で、容積２ｍｌに減圧濃縮し、それ
に水５０ｒｕｌを加えると黄赤色の結晶が析出した。

結晶をＰ別し乾燥した。（収率：９１％）更に、シリカ
ゲルとカラムを用い、酢酸エチル５０容とシクロヘキサ
ン５０容よりなる展開液を通して精製分取した。

得られた結晶体は元素分析、赤外吸収スペクトル、融点
、測定を行い結合体Ｖであることを確認した。

赤外吸収スペクトルの結果を第２図に示す。

実施例 ２ β−エストラジオール−クロロシトシン結合体反応 β−エストラジオール誘導体Ｉ３．４６５ｆをＤＭＳ０
７０ｍｌに溶解し、次いでベンジルＮ−ベンジルオキシ
カルボニル−α−Ｄ−’ｆルコサミンウロネート銀塩４
．６３４ ？を加え光の遮断下、室温で３日間反応させ
た。

沈澱として生じたＡｇＢｒはＧ−４フイルターで２回ろ
別し、更にアセトンで洗滌後、ｒ液を７０℃にて１０ｍ
１に濃縮し、次いで、１００ｍ１の蒸留水を添加し、Ｄ
ＭＳＯを除去した。

次に、５℃に冷却し、一時間その状態に保持して得られ
る沈澱物をろ別し残渣を水洗後、石油エーテル、更には
エチルエーテルで洗滌して室温で減圧乾燥を行ない６．
１９の粉体を得た。

このものは赤外吸収スペクトル、元素分析等により化合
物■であることを確認した。

次ニ得うレタ化合物１１３．５ＳＦをＴＨＦ７０ｒｒＬ
ｌに溶かし、１０％Ｐｄ−炭素触媒３．５７を加え、激
しく攪拌しながら水素ガス１５ｍ１１分を通し６０時間
反応した。

反応終了後、触媒なＧ−４フイルターで分離し、少量の
メタノールで洗滌後、ろ液を室温で減圧乾固した。

乾固物に石油エーテルを加えて析出する結晶を分離乾燥
した。

水可溶性不純物を除去するためにこの物を水に分散させ
残った白黄色固体を分離乾燥した処２．０２の化合物■
を得た。

得られた化合物ｍｏ、ｓｙをアセトニトリル３０ｒｕｌ
と水２１ｒＬｌよりなる混合溶媒に４０℃で加えて溶解
し、次いで冷却して１０〜２０℃に保ってから２Ｊ、ワ
ローエチルイソシアネート０．２０ＴｒＬｌを加え６０
分間攪拌しながら反応させた。

反応後、４０℃で減圧乾固し、蒸発残渣に水５０ｍ１を
加え攪拌すると白色沈澱が得られた。

沈澱物を分離して、エーテル、次いで、酢酸エチルで洗
滌し、更に水洗後減圧乾燥し化合物■を得た。

得られた化合物■０．２９をエチルアルコール６ｍｌに
溶解し、酢酸３．２ ｍｌを加へて５℃に保ち乍ら、こ
れにＮａＮＯ２水溶液（水４ｒｕ１１ＮａＮ０２３４４
〜）を加え１８時間攪拌下に反応させた。

反応終了後、減圧濃縮を行い、次いで、水５０ｍ１を加
えて沈澱を生じさせた。

沈澱は、ろ別し少量の水で洗樹してから室温で減圧乾燥
した。

このものの精製は、シリカゲルカラム（１００Ｍｅｓｈ
以上）を１用い、シクロヘキサン５０容と酢酸５０容よ
りなる展開液を０．１７２ｃｍ／―の速度で流し分画し
た。

分画して得られた結晶物は、元素分析、赤外吸収スペク
トル、融点等により、結合体■であることを確認した。

元素分析値は 実施例 ２ 製剤化例 処方例１ 上記組成物をよく混和し、粉状にしたものを圧縮して直
径１０１１１７１１の錠剤とした。

処方例２ 上記組成の混合物を作り混練したのちエツクペレッター
により押出して顆粒状とする。

これを乾燥し、１０メツシユと２４メツシユの間で選別
して経口投与用顆粒剤とする。

処方例３ 処方例２で得られた顆粒剤を市販のカプセル容器に充て
んしてＱ、５ ｃｃのカプセルとする。

処方例４ を加温混今後、滅菌して注射とする。

本発明のエストラジオール誘導体の結合体の急性毒性、
制癌性試験（ｉｎ ｖｉｔｒｏ 、 ｉｎ ｖｉｖｏ
）をおこなった結果を述べる。

（１）急性毒性 急性毒性はＩＣＲ−ＪＣＬ系マウス（４週令）を用い、
１群８匹を透明なポリケージに入れ、試料を生理食塩水
に溶解又は分散したものを注射筒を用いて所定の置版腔
内投与経路にて投与した。

投４後、中毒症状の観察を続け７日間までの経時間死亡
率を求めＬＤ５ｏ値をリツチフイールドーウイルコツク
ソン（Ｌｉ ｔｃｈｆｉｅｌｄ −Ｗｉｌｃｏｘｏｎ
）図計算法により算出した。

クロロシトシン又はα−メチルオキシクロロシトシンは
ＬＤ５ｏ値がいずれも４８■／ゆであるのに対しエスト
ラジオール誘導体−クロロゾトシノ様結合体はＬＤ、ｏ
値がいずれも１８０■／ｋｇ以上であり明らかにしＤ５
ｏ値が犬さく少な（とも約３．５倍以上である。

即ち安全であることを示している。

（２）エストロゲン感受性を有する細胞への本発明の工
”ストラジオール誘導体の結合体のとりこみ試験 日本生化学編生化学実験講座「ホルモン（上）」２１７
〜２５２頁東京化学同人、１９７７年４月２５日発行、
に記載されている方法に依って試験をおこなった。

即ち３Ｈ標識したエストラジオールホルモンを予め体内
より摘出したウサギの子宮細胞にインキュベートして結
合させた後、検体を添加し、添加量の増加と共に遊離す
る標識エストラジオールホルモン量を測定した。

本発明の結合体は、エストラジオールとほぼ同程度に遊
離する標識エストラジオールが認められ、エストロゲン
感受性を有する細胞へのとりこみが証明された。

第３図に結果を示す。（３）制癌試験（ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ ） 仔牛血清−ＲＰＭ１１６４０（１：９）２ｍＪｌ！；
を入れたシャーレ（３５１ｉφ）に人の乳癌の癌的胞２
ｘ１ｏ’個を植えつけ飽和水蒸気−炭酸ガス含有空気（
ＣＯ２５％）中で３７℃、２４〜２６時間培養してから
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）又は他の有機溶媒に
とかした本発防結合体及び対照物質を培地中の濃度が１
ｐｐｍになるように添加し、更に５日間上記条件で培
養を続げた。

培養終了後、浮遊細胞及びシャーレ底面に付着している
細胞を０．２５％トリプシン処理によってはがし、細胞
数を計算し、次式に従って増殖阻止率を算出した。

増殖阻止率の大きい程制癌効果は高い。

濃度１ ｐｐｍでβ−エストラジオール誘導体−クロロ
ゾトシン様結合体は９２％でありクロロシトシンの増殖
阻止率５８％より大きい。

即ち同量でより抗腫瘍性がすぐれていることを示してい
る。

又α−メチルオキシクロロシトシン系でも同じ結果を示
した。

（４）匍槁試験（ｉｎ ｖｉｖｏ ） ステロイドホルモンレセプターを有する人の乳癌細胞を
ヌードマウス（Ｂ Ａ Ｌ Ｂ ／ Ｃ−ｎｕ 。

ｎｕ）（生後５週令）の腹腔内に移植し増殖を行った。

７日後に、この細胞１Ｘ１０’個を前記検体ヌードマウ
スの腋下部皮下に移植して固型腫瘍とした。

移植後２４時間目より、本発明の結合体と生理食塩水の
所定量と、場合によっては乳剤（ポリソルベート８０）
を用いて便利し、良く分散させたものを投与した。

腹腔内注射（ｉｐ ）は所定の量で、隔日に１０回投与
し、移植後２５日目に腫瘍を摘出し、本発明の結合体の
投与群１０匹の平均腫瘍重量並びに対照群の１０匹の平
均腫瘍重量より、次の式から腫瘍増殖抑制率を求めた。

クロロシトシンはｉｐ投与で投与量３．１０ｍ９／ｋｇ
で増殖抑制率は１８．５８％であった。

β−エストラジオール誘導体−クロロゾトシン様結合体
は投与量１．３ タ／Ｉｖで同様に９０、９２％であっ
た。

同投与量（３１ｒ１ｇ／ｋｇ）で約５倍の値を示した。

又α−メチルオキシクロロシトシン系でも同様の結果を
示した。

このことは本結合体が選択的に乳癌細胞に作用すること
を示唆している。

【図面の簡単な説明】

第１図は、コンペテイライプイム、アッセイ法によるβ
−エストラジオール単体、β−エストラジオール誘導体
−クロロシトシン結合体及びクロロシトシン単体を夫々
用いてウサギの子宮細胞のエストラジオールレセプター
に対する結合能の測定結果を示したものである。 Ａ：β−エストラジオール単体、Ｂ：β−エストラジオ
ール誘導体−クロロゾトシン様結合体、Ｃ：クロロシト
シン単体、横軸はＡ、 Ｂ又はＣの変化量であり、縦軸
はエストラジオールレセプターに結合している３Ｈ標識
エストラジオールの結合量（％）を示す。 第２図は、β−エストラジオール誘導体−α−メチルオ
キシクロロシトシン様結合体の赤外吸収スペクトル、及
び、第３図は、β−エストラジオール誘導体−クロロゾ
トシン様結合体の赤外吸収スペクトルである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式 （但し、ＲはＨ又はＣＨ３） で表わされるエストラジオール誘導体−クロロゾトシン
   様結合体。 ２ 構造式 である特許請求の範囲第１項記載のエストラジオール誘
   導体−クロロゾトシン様結合体。 ３ 構造式 である特許請求の範囲第１項記載のエストラジオール誘
   導体−メチルオキシ リロロゾトシン様結合体。 ４ 一般式 （但し、ＲはＨ又はＣＨ３を示す） で表わされるエストラジオール誘導体−クロロゾトシン
   様結合体を主成分とすることを特徴とする）抗腫瘍剤。 ５ 一般式 （但し、ＲはＨ又はＣＨ３を示す） で表わされるエストラジオール誘導体−クロロゾドシン
   様結合体を主成分とする、該結合体はレセプターを有す
   る癌に選択的に作用することを特徴とする特許請求の範
   囲第３項記載の抗腫瘍剤。 ６ エストラジオール−１７−モツハロゲノアセテート
   にベンジル又はメチルＮ−ベンジルオキシカルボニル−
   Ｄ−グルコサミンウロネート金属塩を作用し、得られた
   反応物を水素で還元し、次いでクロロエチルイソシアネ
   ートをさせ、亜硝酸化合物を反応させることを特徴とす
   る 一般式 （但し、ＲはＨ又はＣＨ３を示す） で表わされるエストラジオール誘導体−クロロシトシン
   様物質体の製造方法。 １ 該金属塩は、銀、ナトリウム、カリウム塩より選ば
   れたものである特許請求の範囲第６項記載の製造方法。