JPH11505729A - ヒドロキシ−フェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼの遺伝子のｄｎａ配列、及びある種の除草剤に耐性のある、ヒドロキシ−フェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼの遺伝子を含む植物の生産 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒドロキシ−フェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼの遺伝子のＤＮＡ配列、及び除草剤に耐性のある、ヒドロキシ−フェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼの遺伝子を含む植物の取得。ヒドロキシ−フェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼの遺伝子のＤＮＡ配列；細菌又は植物からの単離；除草剤に耐性のある植物の取得のための使用。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒドロキシ−フェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼの 遺伝子のＤＮＡ配列、及びある種の除草剤に耐性のあ る、ヒドロキシ−フェニルピルビン酸ジオキシゲナー ゼの遺伝子をむ植物の生産 本発明は、ヒドロキシ−フェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）の 遺伝子、この遺伝子をコード配列として含むキメラ遺伝子、及びある種の除草剤 に耐性がある植物の生産へのこれの使用に関する。 ある種の除草剤、例えば特にフランス特許出願第９５ ０６８００号、及び第 ９５ １３５７０号に記載されているイソキサゾール、特にとうもろこしの選択 的除草剤であるイソキサフルトール、欧州特許出願第０ ４９６ ６３０号、第 ０ ４９６ ６３１号に記載されているようなジケトニトリル、特に２−シアノ −３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ₂ＣＨ₃−４−ＣＦ₃フェニル）プロパン −１，３−ジオン、及び２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯＣＨ₃ −２，３−Ｃｌ₂フェニル）プロパン−１，３−ジオン、欧州特許出願第０ ６ ２５ ５０５号及び第０ ６２５ ５０８号に記載されているトリケトン、 特にスルコトリオンが知られている。しかしながらこのような除草剤に耐性のあ る遺伝子は、まだ記載されたことがない。 ヒドロキシ−フェニルピルビン酸ジオキシケナーゼは、パラ−ヒドロキシ−フ ェニル−ピルベートのホモゲンチゼートへの転換反応を触媒する酵素である。 また、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｐ．Ｊ．８７４に由来するヒドロキシ −フェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼのアミノ酸配列が記載されているが、除 草剤への植物の耐性におけるその役割についての記載はない（リュッチ（Ｒｕｅ ｔｓｃｈｉ）ら：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、２０５巻、４５９−４６６頁、 １９９２年）。この文献には、このタンパク質をコードする遺伝子の記載はない 。 今やこの型の遺伝子の配列が発見され、このような配列は、植物細胞中に一度 組込まれたら、植物中にＨＰＰＤの過剰発現（ｓｕｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）又 はＨＰＰＤの活性を与える。従って最近のいくつかの除草剤、例えばイソキサゾ ール類又はトリケトン類の除草剤に対する耐性を植物に与えることができる。 本発明は、非ヒト起源、非海洋性細菌起源、あるいはさらに は植物起源の遺伝子の単離されたＤＮＡ配列、又はこの単離された配列とハイブ リダイズしうる配列において、これがヒドロキシ−フェニルピルビン酸ジオキシ ゲナーゼ（ＨＰＰＤ）を発現することを特徴とする配列を目的とする。 より詳しくはこの配列は、細菌起源のもの、例えば特にＰｓｅｕｄｏｍｏｎａ ｓ属であってもよく、あるいはさらには植物起源のもの、例えば特に単子葉植物 又は双子葉植物、特にＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ又はセリ科のもの、例えばニンジ ン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔｔａ）であってもよい。これは、天然または野生 のものであってもよく、あるいは場合によっては変異されたものであってもよい 。但し、基本的にはＨＰＰＤ阻害剤、例えばイソキサゾール類又はトリケトン類 の除草剤に対して、除草剤耐性を保持していなければならない。 本発明はまた、前記遺伝子の単離方法において、 ・プライマーとして、ＨＰＰＤのアミノ酸配列に由来するいくつかのオリゴヌ クレオチドを選ぶこと、 ・これらのプライマーから、ＰＣＲにより増幅断片を合成すること、 ・ゲノムバンクの作成及びスクリーニングによって遺伝子を 単離すること、及び ．遺伝子をクローン化すること、 を特徴とする方法を含んでいる。 好ましくは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属の細菌のＨＰＰＤ配列に由来するプラ イマーを用いる。特に好ましくは、これらはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏ ｒｅｓｃｅｎｓに由来するものである。 本発明はさらに、植物の形質転換方法においてＨＰＰＤをコードする遺伝子を 、植物に対してある種の除草剤への耐性を与えることができるマーカー遺伝子、 又はコード配列として用いることをも目的とする。該遺伝子はまた、その他のマ ーカー遺伝子及び／又は農学的特性をコードする配列と組合わせて用いることも できる。 コード遺伝子は、基本的にはＨＰＰＤ阻害剤、例えばイソキサゾール類又はト リケトン類の除草剤に対して除草剤耐性を保持していれば、天然又は野生起源の ものであってもよく、あるいは場合によっては変異されたあらゆる起源のもので あってもよい。コード配列としては特に、前記の本発明によるものを用いること ができる。 植物細胞の形質転換は、あらゆる既知の適切な手段によって行なうことができ る。一連の方法の１つは、ＤＮＡ配列と連結している粒子で、細胞又はプロトプ ラストを衝撃することから成る。 一連の方法のもう１つは、プラスミドに挿入されたキメラ遺伝子の植物への伝 達手段として、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉ又 はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓのＲｉを用いることから 成る。 本発明はさらに、転写方向に、少なくとも１つのプロモーター調節配列、ヒド ロキシ−フェニルピルビン酸ジオキキシゲナーゼを発現する異種コード配列、及 びターミネーター調節又はポリアデニル化配列を含むキメラ遺伝子をも対象とす る。 プロモーター調節配列として、植物中に自然に発現される遺伝子のあらゆるプ ロモーター配列、特に細菌起源、ウイルス起源、又は植物起源のプロモーターを 用いることができる。例えばリブロース−ビスカルボキシラーゼ（ＲｕＢｉｓＣ Ｏ）の小さいサブユニットの遺伝子のプロモーター、又はαチューブリンの遺伝 子のプロモーター（欧州特許出願第０ ６５２ ２８６号）、あるいはさらには 植物ウイルス遺伝子のプロモーター、 カリフラワーモザイクウイルスのプロモーター（ＣＡＭＶ１９Ｓ又は３５Ｓ）が あるが、適切な既知のあらゆるプロモーターを用いることができる。好ましくは 、コード配列の過剰発現を促進するプロモーター調節配列を利用する。例えば欧 州特許出願第０ ５０７６９８号に記載されている、少なくとも１つのヒストン プロモーターを含んでいる配列を利用する。 本発明によれば、プロモーター調節配列と組合わせて、その他の調節配列を用 いることもできる。これらは、プロモーターとコード配列との間に位置するもの であり、例えば転写活性化物質「エンハンサー」、例えば特許出願ＷＯ８７／０ ７６４４号に記載されているたばこのエッチウイルス（ＴＥＶ）の翻訳活性化物 質、又はシングル又はダブルのトランジットペプチドがある。この場合、場合に よっては、中間配列によって分離されているものである。すなわち、転写の方向 に、色素体局在酵素をコードする植物遺伝子のトランジットペプチドをコードす る配列、色素体局在酵素をコードする植物遺伝子の成熟Ｎ末端部分の配列の一部 、ついで色素体局在酵素をコードする植物遺伝子の成熟Ｎ末端部分の配列部分か ら成る、色素体局在酵素をコードする植物遺伝子の第二トランジットペプチドを コー ドする配列を含んでいるものであり、例えば欧州特許出願第０ ５０８ ９０９ 号に記載されているものである。 ターミネーター調節配列又はポリアデニル化配列として、細菌起源のあらゆる 対応配列を用いることができる。例えばＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅ ｆａｃｉｅｎｓのｎｏｓターミネーターがあり、又は植物起源のあらゆる対応配 列、例えば欧州特許出願第０ ６３３ ３１７号に記載されているヒストンター ミネーターがある。 本発明はさらに、植物細胞、単子葉植物又は双子葉植物を対象とする。特に前 記方法の１つによって形質転換され、かつゲノム中にヒドロキシ−フェニルピル ビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）を発現する遺伝子を有効量含む栽培作物を 目的とする。このように形質転換された植物は、最近のいくつかの除草剤に対し て大きな耐性を示すことが観察された。最近の除草剤とは例えば、特にフランス 特許出願第９５ ０６８００号及び第９５ １３５７０号に記載されているイソ キサゾール、特に４−［４−ＣＦ₃−２−（メチルスルフォイル）ベンゾイル］ −５−シクロプロピルイソキサゾール、及び特にトウモロコシの選択的除草剤で あるイソキサフルトール、例えば欧州特許出 願第０ ４９６ ６３０号、第０ ４９６ ６３１号に記載されたジケトニトリ ル、特に２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ₂ＣＨ₃−４−ＣＦ₃ フェニル）プロパン−１，３−ジオン及び２−シアノ−３−シクロプロピル−１ −（２−ＳＯ₂ＣＨ₃−４−２，３−Ｃｌ₂フェニル）プロパン−１，３−ジオン 、欧州特許出願第０ ６２５ ５０５号及び第０ ６２５ ５０８号に記載され たトリケトン、特にスルコトリオンである。 最後に本発明は、植物、特に栽培作物のこの型の除草剤による除草方法におい て、本発明によって形質転換された植物に対して、播種前（ｐｒｅｓｅｍｉｓ） であれ、作物の発芽前（ｐｒｅｌｅｖｅｅ）であれ発芽後（ｐｏｓｔｌｅｖｅｅ ）であれ、この除草剤を使用することを特徴とする方法をも目的とする。 本発明はさらに、植物種の「形質転換−再生」サイクル及び前記除草剤の選択 中における、マーカー遺伝子としてのＨＰＰＤ遺伝子の使用をも目的とする。 本発明の様々な側面は、下記実施例によってよりよく理解できるであろう。実施例１：Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓＡ３２のＨＰＰＤ遺伝子の単離 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｐ．Ｊ．８７４のＨＰＰＤのアミノ酸配列（ リュッチ（Ｒｕｅｔｓｃｈｉ Ｕ）ら、１９９２年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、２０５巻、４５９−４６６頁）から、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓＡ３２（ マッケラー（ＭｃＫｅｌｌａｒ）Ｒ．Ｃ．１９８２年、Ｊ．Ａｐｐｌ Ｂａｃｔ ｅｒｉｏｌ．第５３巻：３０５−３１６頁）によって単離されたもの）のＨＰＰ Ｄのコード配列の一部をＰＣＲによって増幅するための種々のオリゴヌクレオチ ドの配列が導き出される。このＨＰＰＤの遺伝子の増幅断片を用いて、Ｐ．ｆｌ ｕｏｒｅｓｃｅｎｓＡ３２の部分ゲノムバンクをスクリーニングし、この酵素を コードする遺伝子を単離した。 Ａ）Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓＡ３２のゲノムＤＮＡの調製 細菌を、２８℃で４８時間、最小培地Ｍ６３（ＫＨ₂ＰＯ₄ １３．６ｇ／ｌ， （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ２ｇ／ｌ，ＭｇＳＯ₄ ０．２ｇ／ｌ，ＦｅＳＯ₄ ０．００５ｇ ／ｌ ｐＨ７＋唯一の炭素源としてのＬ−チロシン１０ｍＭ）４０ｍｌ中におい て 培養した。 洗浄後、細胞を溶解緩衝液１ｍｌ（トリスＨＣｌ １００ｍＭ ｐＨ８．３、 ＮａＣｌ１．４Ｍ及びＥＤＴＡ １０ｍＭ）中に再び取り、１０分間６５℃でイ ンキュベートする。フェノール／クロロフォルム（２４／ｌ）処理及びクロロフ ォルム処理後、イソプロパノール１容の添加によって核酸を沈殿させ、ついでこ の核酸を滅菌水３００μｌ中に再び取り、最終１０μｇ／ｍｌのＲＮＡｓｅで処 理する。ＤＮＡを再びフェノール／クロロフォルム、クロロフォルムで処理し、 酢酸ナトリウム３Ｍ ｐＨ５ １／１０容とエタノール２容との添加によって、 再沈殿させる。ついでＤＮＡを滅菌水中に再び取り、秤量する。 Ｂ）オリゴヌクレオチドの選択及び合成 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｐ．Ｊ．８７４のＨＰＰＤのアミノ酸配列か ら、５つのオリゴヌクレオチドを選び、２つはタンパク質のＮＨ₂末端において 、タンパク質のＣＯＯＨ末端の方へ向け、３つは逆の方向に向ける（図１参照） 。選択は次の２つの規則に従ったものである： ・安定オリゴヌクレオチドの３’末端部、すなわち一義的な少なくとも２つの 塩基。 ・できるだけ少ない縮重。 選ばれたオリゴヌクレオチドは、次の配列を有する： これらは、商標ＭＩＬＬＰＯＲＥの合成器「サイクロンプラスＤＮＡ合成器」 において合成された。 ＰＣＲによるこれら５つのオリゴヌクレオチドを用いた場合、配列番号１によ って理論的に得られるはずの増幅断片は、次のサイズである： プライマーＰ１及びＰ３を用いた場合→約６９０ｂｐ プライマーＰ１及びＰ４を用いた場合→約７２０ｂｐ プライマーＰ１及びＰ５を用いた場合→約１０００ｂｐ プライマーＰ２及びＰ３を用いた場合→約３９０ｂｐ プライマーＰ２及びＰ４を用いた場合→約４２０ｂｐ プライマーＰ２及びＰ５を用いた場合→約７００ｂｐ Ｃ）Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓＡ３２のＨＰＰＤのコード化部分の増幅 増幅は、装置ＰＣＲ ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ９６００において、Ｔａｑ ポリメラーゼＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲとその緩衝液を用いて標準状態で、すな わち反応液５０μｌあたり２００μＭのｄＮＴＰ、２０μＭのプライマー、Ｔａ ｑポリメラーゼ２．５単位及びＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓＡ３２２．５μｇを 用いて実施した。 用いた増幅計画は、９５℃で５分、ついで３５サイクル＜４５秒９５℃、４５ 秒４９℃、７２℃＞で１分ついで７２℃で５分である。 これらの条件下、得られたすべての増幅断片は、前記理論サイズと相容れるサ イズであり、このことは増幅の特異性が良好であることを示す。 プライマーのセットＰ１／Ｐ４、Ｐ１／Ｐ５、及びＰ２／Ｐ４を用いて得られ た増幅断片は、ＥｃｏＲＶによるこのプラスミドの消化、及びｄｄＴＴＰの存在 下における末端トランスフェラーゼ処理の後、ｐＢＳＩＩＳＫ（−）中に結合す る。これは例えばホルトン（ＨＯＬＴＯＮ）Ｔ．Ａ及びグラハム（ＧＲＡＨＡＭ ） Ｍ．Ｗ．１９９１年、Ｎ．Ａ．Ｒ．第１９巻、５号、１１５６頁に記載され ている。 ３つの型の各々のクローンは一部配列決定されている。このため、これらの３ つの場合に、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓＡ３２のＨＰＰＤのコード領域の一部 が十分に増幅されていることが確認できる。断片Ｐ１／Ｐ４は、Ｐ．ｆｌｕｏｒ ｅｓｃｅｎｓＡ３２の部分ゲノムバンクをスクリーニングし、かつＨＰＰＤの完 全な遺伝子を単離するためのプローブとして保持する。 Ｄ）遺伝子の単離 サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）によって、ＢａｍＨＩ制限酵素によるＰ．ｆｌｕ ｏｒｅｓｃｅｎｓＡ３２のＤＮＡの消化後、７Ｋｂｐ断片が、ＨＰＰＤ Ｐ１／ Ｐ４プーブとハイブリダイズすることが示されている。従ってＢａｍＨＩ制限酵 素によりＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓＡ３２のＤＮＡ ４００μｇを消化し、ア ガロースゲルでＤＮＡ断片を精製した。これで約７Ｋｂｐが生じる。 これらの断片を、ｐＢＳＩＩ ＳＫ（−）中に結合する。ｐＢＳＩＩ ＳＫ（ −）自体は、Ｂａｍ ＨＩによって消化し、アルカリホスファターゼ処理によっ て脱ホスフォリル化したものである。Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０ｂの形質転換後、 部分ゲノムバンクを、ＨＰＰＤ Ｐ１／Ｐ４プローブでスクリーニング する。 陽性クローンを単離し、これをｐＲＰ Ａと名付けた。この単純化された図が 図２に示されている。この図には、ＨＰＰＤ遺伝子のコード化部分の位置が示さ れている。これは、３５８のアミノ酸をコードする１０７７のヌクレオチドから 成っている（配列番号１参照）。Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓＡ３２のＨＰＰＤ は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．株Ｐ．Ｊ．８７４のものと、良好なアミノ 酸相同性を示す。実際、これらの２つのタンパク質間には９２％の同一性がある （図３参照）。実施例２：２つのキメラ遺伝子の構成 植物にＨＰＰＤを阻害する除草剤に対する耐性を与えるために、２つのキメラ 遺伝子を作る。 第一のキメラ遺伝子は、ノパリンシンターゼ遺伝子のターミネーターと共に、 Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓＡ３２のＨＰＰＤ遺伝子のコード部分をヒストン二 重プロモーター（欧州特許出願第０５０７ ６９８号）、ついでタバコエッチウ イルス（ＴＥＶ）翻訳エンハンサー（ｐＲＴＬ−ＧＵＳ（キャリントン（Ｃａｒ ｒｉｎｇｔｏｎ）及びフリード（Ｆｒｅｅｄ）、１９９０年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６４巻、１５９０−１５９７頁） の制御下に置くことから成る。従ってＨＰＰＤは、細胞質中に局在化される。 第二のキメラ遺伝子は、第一のものと同じであるが、但し、翻訳活性物質ＴＥ Ｖと、ＨＰＰＤのコード部分との間に、最適化されたトランジットペプチド（Ｏ ＴＰ）を挿入する（欧州特許出願第０５０８ ９０９号）。従ってＨＰＰＤは、 葉緑体中に局在化される。 Ａ）ベクターｐＲＰＡ−ＲＤ−１５３の構築： − ｐＲＰＡ−ＲＤ−１１： ノパリンシンターゼのポリアデニル化部位（Ｎ ＯＳ ｐｏｌｙＡ）（欧州特許出願第０ ６５２ ２８６号）を含むｐＢＳ−Ｉ Ｉ ＳＫ（−）（ストラタジェーヌ社（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ） カタログ♯２ １２２０６）の誘導体を、ＫｐｎＩ部位とＳａｌＩ部位との間でクローン化する 。ＫｐｎＩ部位を、１５０μＭのデオキシヌクレオチドトリホスフェートの存在 下のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼＩでの処理、ついでＮｏｔＩリンカー（ストラタ ジェーヌ社 カタログ♯１０２９）との連結によって、ＮｏｔＩ部位に変換する 。このようにしてクローンカヤットＮＯＳｐｏｌｙＡが得られる。 − ｐＲＰＡ−ＲＤ−１２７：ｐＲＰＡ−ＲＤ−１１中でクローン化されたｐ ＲＰＡ−ＢＬ−４６６（欧州特許出願第０ ３３７ ８９９号）の誘導体であっ て、ｏｘｙ遺伝子の発現カセットを作り出し、かつリブロース−ビスカルボキシ ラーゼの小サブユニットのプロモーターを含むもの。 「プロモーター（ＳＳＵ）−ｏｘｙ遺伝子−ＮＯＳ ｐｏｌｙＡ」 このプラスミドを作るために、ｐＲＰＡ−ＢＬ−４８８を、ＸｂａＩ及びＨｉ ｎｄＩＩＩで消化し、１．９ｋｂｐ断片を単離した。この１．９ｋｂｐ断片は、 ＳＳＵプロモーター及びｏｘｙ遺伝子を含んでいる。この遺伝子は、適合性酵素 で消化されたプラスミドｐＲＰＡ−ＲＤ−１１中に連結したものである。 − ｐＲＰＡ−ＲＤ−１３２：これは、ｐＲＰＡ−ＲＤ−１２７中でクローン 化されたｐＲＰＡ−ＢＬ−４８８（欧州特許出願第０ ５０７ ６９８号）の誘 導体であり、この時、ヒストン二重プロモターと共にｏｘｙ遺伝子の発現力セッ トを生じる。 「ヒストン二重プロモター−ｏｘｙ遺伝子−ＮＯＳ ｐｏｌｙＡ」 このプラスミドを製造するために、ｐＲＰＡ−ＢＬ−４６６を、ＨｉｎｄＩＩ Ｉによって消化し、Ｋｌｅｎｏｗによって処 理し、ついでＮｃｏＩで再び消化する。ヒストン二重プロモターＨ３Ａ７４８を 含む精製１．３５ｋｂｐ断片を、プラスミドｐＲＰＡ−ＲＤ−１２７と結合する 。このプラスミドは、ＸｂａＩによって消化され、Ｋｌｅｎｏｗによって処理さ れ、ついでＮｃｏＩで再び消化されたものである。 − ｐＲＰＡ−ＲＤ−１５３：これは、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）の翻 訳活性物質を含んでいるｐＲＰＡ−ＲＤ−１３２の誘導体である。ｐＲＴＬ−Ｇ ＵＳ（キャリントン（Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ）及びフリード（Ｆｒｅｅｄ）、１ ９９０年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６４巻、１５９０−１５９７頁）を、ＮｃｏＩ及び ＥｃｏＲＩで消化し、１５０ｂｐ断片を、同じ酵素で消化されたｐＲＰＡ−ＲＤ −１３２中に結合した。従って、プロモーターを含む発現カセットが作られた。 「ヒストン二重プロモーター−ＴＥＶ−ｏｘｙ遺伝子−ＮＯＳｐｏｌｙＡ」 Ｂ）ベクターｐＲＰＡ−ＲＤ−１８５の構成： ｐＵＣ１９／ＧＥＣＡ：数多くのクローン化部位を含むｐＵＣ１９（ジブコ社 （Ｇｉｂｃｏ）カタログ♯１５３６４−０１１）の誘導体。ｐＵＣ−１９を、Ｅ ｃｏＲＩで消化し、オリゴヌ クレオチドリンカーＩと結合する。 リンカーＩ： 選択されたクローンは、ＥｃｏＲＩ部位ついでポリリンカーを含む。このポリ リンカーは下記部位を含む：ＥｃｏＲＩ、ＡｐａＩ、ＡｖｒＩＩ、ＰｍｅＩ、Ｓ ｆｉＩ、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ、ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＳａｌＩ、Ｐ ｓｔＩ、ＳｐｈＩ、及びＨｉｎｄＩＩＩ。 −ｐＲＰＡ−ＲＤ−１８５：これは、修飾ポリリンカーを含むｐＵＣ１９／Ｇ ＥＣＡの誘導体である。ｐＵＣ１９／ＧＥＣＡを、ＨｉｎｄＩＩＩによって消化 し、オリゴヌクレオチドリンカー２と結合する： リンカー２： 選択されたクローンは、ポリリンカーの中にＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。この ポリリンカーは、次の部位を含んでいる：ＥｃｏＲＩ、ＡｐａＩ、ＡｖｒＩＩ、 ＰｍｅＩ、ＳｆｉＩ、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ、ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、 ＳａｌＩ、ＰｓｔＩ、ＳｐｈＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰａｃＩ、 ＡｓｃＩ、ＸｈｏＩ及びＥｃｏＮＩ。 Ｃ）ベクターｐＲＰＴの構築： − ｐＲＰ Ｏ：ＨＰＰＤの発現カセット、すなわちヒストン二重プロモータ ー−ＴＥＶ−ＨＰＰＤ遺伝子−Ｎｏｓターミネーターを含むｐＲＰＡ−ＲＤ−１ ５３の誘導体である。ｐＲＰ Ｏを製造するために、ｐＲＰＡ−ＲＤ−１５３を ＨｉｎｄＩＩＩによって消化し、Ｋｌｅｎｏｗによって処理し、ついでＮｃｏＩ によって再び消化して、ｏｘｙ遺伝子を除去し、これをＨＰＰＤ遺伝子と代える 。このＨＰＰＤ遺伝子は、ＢｓｔＥＩＩ消化、Ｋｌｅｎｏｗ処理、及びＮｃｏＩ 再消化によってプラスミドｐＲＰ Ａから生じたものである。 − ｐＲＰ Ｒ：これを得るためには、プラスミドｐＲＰ Ｏを、ＰｖｕＩＩ 及びＳａｃＩによって消化し、キメラ遺伝子が精製し、ついで同様にＰｖｕＩＩ 及びＳａｃＩによって消化したｐＲＰＡ−ＲＤ−１８５中に結合した。 − ｐＲＰ Ｔ：これは、ＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによる消化後ｐＲＰ Ｒから生じたキメラ遺伝子を、同じ酵素によって消化したプラスミドｐＲＰＡ− ＢＬ １５０アルファ２に連結して得られたものである。（欧州特許出願第０ ５０８ ９０９号）。 従ってベクターｐＲＰ Ｔのキメラ遺伝子は、下記構造を有する： Ｄ）ベクターｐＲＰ Ｖの構築： − ｐＲＰ Ｐ：これは、最適化されたトランジットペプチドついでＨＰＰＤ 遺伝子を含むｐＲＰＡ−ＲＤ−７（欧州特許出願第０ ６５２ ２８６号）の誘 導体である。これは、ＢｓｔＥＩＩ及びＮｃｏＩ消化、Ｋｌｅｎｏｗ処理によっ てｐＲＰＡから得られたＨＰＰＤのコード部分と、によって、ＳｐｈＩ及びＡｃ ｃＩによって消化され、ＤＮＡｓｅポリメラーゼＴ４で処理されたプラスミドｐ ＲＰＡ−ＲＤ−７とを連結して得られたものである。 − ｐＲＰ Ｑ：これは、ＨＰＰＤの発現カセット、すなわちヒストン二重プ ロモーター−ＴＥＶ−ＯＴＰ−ＨＰＰＤ遺伝子−ターミネーターＮｏｓを含むｐ ＲＰＡ−ＲＤ−１５３の誘導体である。これを作るためには、プラスミドｐＲＰ Ａ−ＲＤ−１５３をＳａｌ Ｉで消化し、Ｋｌｅｎｏｗで処理し、ついでＮｃｏ Ｉによって再び消化して、ｏｘｙ遺伝子を除去し、こ れを、ＢｓｔＥＩＩ消化、Ｋｌｅｎｏｗ処理、Ｎｃｏｌ再消化によってプラスミ ドｐＲＰ Ｐから生じたＨＰＰＤ遺伝子と代えられる。 − ｐＲＰ Ｓ：これを得るために、プラスミドｐＲＰ ＱをＰｖｕＩＩ及び ＳａｃＩによって消化して、キメラ遺伝子を切り出し、このキメラ遺伝子を、Ｐ ｖｕＩＩ及びＳａｃＩによって消化したｐＲＰＡ−ＲＤ−１８５に結合した。 − ｐＲＰ Ｖ：これは、ＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによる消化後にｐＲＰ Ｓから生じたキメラ遺伝子を、プラスミドｐＲＰＡ−ＢＬ１５０ アルファ２ に連結して得られたものである（欧州特許出願第０ ５０８ ９０９号）。 従ってベクターｐＲＰ Ｑのキメラ遺伝子は、下記構造を有する： 実施例３：工業たばこＰＢＤ６の形質転換 これらの２つのキメラ遺伝子の効率を測定するため、欧州特許出願第０ ５０ ８ ９０９号に既に記載されている転換及び再生手順に従って、これらのキメラ 遺伝子を工業たばこＰＢＤ ６中に伝達した。 １）形質転換： コスミドｐＴＶＫ２９１（コマリ（Ｋｏｍａｒｉ）ら、１９８６年）を有する Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＥＨＡ１０１の非腫瘍形成性菌株（フード（Ｈｏ ｏｄ）ら、１９８７年）中に、このベクターを導入する。この形質転換技術は、 ホーシュ（Ｈｏｒｓｈ．Ｒ）ら（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ第２２７巻、１２ ２９−１２３１頁の手順に基づいている。 ２）再生： 葉の外植片からのたばこＰＢＤ６（フランス国セータ社（ＳＥＩＴＡ）からの もの）の再生を、ムラシゲ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ）及びスコーグ（Ｓｋｏｏｇ） （ＭＳ）基本培地で実施する。この培地は、サッカロース３０ｇ／ｌとカナマイ シン２００μｇ／ｍｌとを含んでいる。葉の外植片は、温室又は試験管内の植物 から採取し、葉盤（ｄｉｓｑｕｅｓ ｆｏｌｉａｉｒｅｓ）技術（Ｓｃｉｅｎｃ ｅ１９８５年、第２２７巻、１２２９−１２３１頁）に従って、連続する３工程 で形質転換する。第一工程は、ナフチル酢酸（ＡＮＡ）０．０５ｍｇ／ｌとベン ジルアミノプリン（ＢＡＰ）２ｍｇ／ｌを含む、サッカロース３０ ｇ／ｌが添加されたＭＳ培地での１５日間の発芽の誘導である。この工程中に形 成された若芽を、ついで、サッカロース３０ｇ／ｌが添加されてはいるが、ホル モンは含まないＭＳ培地での１０日間の培養によって成長させる。ついで成長し た若芽を採取し、これを、塩、ビタミン及び糖含量が半分で、かつホルモンを含 まないＭＳ発根培地で培養する。約１５日後、発根した若芽を土に移す。実施例４：たばこの４−［４−ＣＦ₃−２−（メチルスルフォニル）ベンゾイル ］−５−シクロプロピルイソキサゾールに対する耐性の測定：発芽後処理 形質転換されたたばこの実生を、試験管から出して、５週間、温室に適応させ （相対湿度６０％；温度：夜間２０℃、日中２３℃）、ついで４−［４−ＣＦ₃ −２−（メチルスルフォニル）ベンゾイル］−５−シクロプロピルイソキサゾー ルで処理する。 形質転換されずに、４−［４−ＣＦ₃−２−（メチルスルフォニル）ベンゾイ ル］−５−シクロプロピルイソキサゾールで５０〜４００ｇ／ｈａの用量で処理 された対照たばこは、約７２時間で退緑を示す。これは１週間で強まり、非常に 顕著な壊死の方へと進行する（末端葉の約８０％を覆う）。 形質転換後、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓのＨＰＰＤを過剰発現するこの同じ たばこは、４−［４−ＣＦ₃−２−（メチルスルフォニル）ベンゾイル］−５− シクロプロピルイソキサゾール４００ｇ／ｈａでの処理に対して、非常によく保 護されている。 過剰発現酵素が細胞質中にある場合、すなわち形質転換がベクターｐＲＰ Ｔ によってもたらされた遺伝子によってなされたものであるならば、植物は非常に 軽度の退緑を示し、これは中間葉の上だけに限定されている。 過剰発現酵素が葉緑体中にある場合、すなわち形質転換がベクターｐＲＰ Ｖ によってもたらされた遺伝子によってなされたものであるならば、植物は完全に 保護され、まったく症状がでない。実施例５：たばこの４−［４−ＣＦ₃−２−（メチルスルフォニル）ベンゾイル ］−５−シクロプロピルイソキサゾールに対する耐性の測定：発芽前処理 ａ）試験管内テスト： 実施例１〜３に記載された、用量４００ｇ／ｈａのイソキサフルトールでの葉 の処理に対して耐性のある、「形質転換−再 生」サイクルから生じた植物から収穫されたたばこの種子を用いる。 これらの種子を、フィタガール（ｐｈｙｔａｇａｒ）１０ｇ／ｌ、及び０〜１ ｍｇ／ｌの様々な濃度のイソキサフルトールを含むボックスに蒔く。ついで明期 １２時間／暗期１２時間の光周期で、２５℃で発芽を行なった。 この手順に従って、野生たばこの種子を発芽させ、２つの型のトランスジェニ ックたばこの種子を発芽させた。すなわちＨＰＰＤが細胞質に局在化されたＣＹ たばこと、ＨＰＰＤが葉緑体に局在化されたＣＯたばこである。 耐性測定は、播種の２〜３週間後に視覚的に実施した。 米国特許第４，７８０，１２７号の生成物Ｎｏ．５１による生成物を用いて同 様な操作を行なって、野生たばこ及びＣＯた ばこについて、濃度０ｍｇ／ｌ及び０．１ｍｇ／ｌで同じ結果が得られる。 ｂ）温室試験 実施例４のように操作を行なう。但しこの処理は、発芽前、播種の２４時間前 に実施する。野生種子の播種は、正常に行なわれる。これらの条件下、処理され ていない対照播種については、少なくとも１０ｇ／ｈａの除草剤用量すべてにつ いて、発芽がないことが観察される。これとは逆に、ＣＹたばこは１００ｇ／ｈ ａまで、上記ａ）で定義されているような症状はまったく示さない。同様に、Ｃ Ｏたばこも、２００ｇ／ｈａまで、上記ａ）で定義されているような症状はまっ たく示さない。 これらの結果が示すことから、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓのＨＰＰＤ遺伝子 が、イソキサフルトールでの発芽前処理に対して、たばこに耐性を与えることが 明らかである。この耐性は、タンパク質が細胞質ではなく葉緑体に局在する場合 に、さらに良好である。実施例６ ： Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓのＨＰＰＤ遺伝子が、植物 種の「形質転換−再生」サイクルの間に、マー カー遺伝子として用いうるかどうかを調べる目的で、たばこをＨＰＰＤ遺伝子で 形質転換した。形質転換された植物は、イソキサフルトールの選択後に得られた 。材料及び方法及び結果 下記ｐＲＰ Ｖキメラ遺伝子を、欧州特許出願第０ ５０８ ９０９号に既に 記載されている形質転換及び再生手順に従って、工業たばこＰＢＤ６に伝達する 。 ベクターｐＲＰ Ｖのキメラ遺伝子は、次の構造を有する。 １）形質転換： ベクターを、コスミドｐＴＶＫ２９１（コマリ（Ｋｏｍａｒｉ）ら、１９８６ 年）を有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＥＨＡ１０１の非腫瘍形成性菌株（ フード（Ｈｏｏｄ）ら、１９８７年）中に導入する。この形質転換技術は、ホー シュ（Ｈｏｒｓｈ．Ｒ）ら（１９８５年）の手順に基づいている。 ２）再生： 葉の外植片からのたばこＰＢＤ６（フランス国セータ社（ＳＥＩＴＡ）からの もの）の再生を、ムラシゲ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ） 及びスコーグ（Ｓｋｏｏｇ）（ＭＳ）基本培地で実施する。この培地は、サッカ ロース３０ｇ／ｌと、セフォタキシム３５０ｍｇ／ｌ及びイソキサフルトール１ ｍｇ／ｌを含んでいる。葉の外植片は、温室又は試験管内の植物から採取され、 葉盤（ｄｉｓｑｕｅ ｆｏｌｉａｉｒｅ）技術（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８５年、 第２２７巻、１２２９−１２３１頁）に従って、連続する３工程で形質転換され る。第一工程は、ナフチル酢酸（ＡＮＡ）０．０５ｍｇ／１とベンジルアミノプ リン（ＢＡＰ）２ｍｇ／ｌを含みサッカロース３０ｇ／ｌ、及びイソキサフルト ール１ｍｇ／ｌが添加されたＭＳ培地での１５日間の発芽の誘導である。この工 程中に形成された緑の若芽を、ついで、サッカロース３０ｇ／ｌ及びイソキサフ ルトール１ｍｇ／ｌが添加されてはいるが、ホルモンは含まないＭＳ培地での１ ０日間の培養によって成長させる。ついで、成長した若芽を採取し、これを、塩 、ビタミン及び糖含量が半分でイソキサフルトール１ｍｇ／ｌを含むが、ホルモ ンを含まないＭＳ発根培地で培養する。約１５日後、発根した若芽を土に移す。 この手順に従って得られたすべての実生を、Ｐ．ｆｌｕｏｒｓｃｅｎｓのＨＰ ＰＤの特定のプライマーを用いてＰＣＲに より分析する。このＰＣＲ分析によって、このようにして得られたすべての実生 は、ＨＰＰＤ遺伝子を十分に組込んでいることが確認できた。 結論として、この試験から確認されたことは、ＨＰＰＤ遺伝子はマーカー遺伝 子として用いることができること、及びイソキサフルトールはこの遺伝子と組合 わされると、良好な選択剤になることである。実施例７及び８：Ａｒａｂｉｄｏｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのＨＰＰＤ遺伝子及 びニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔｔａ）のＨＰＰＤ遺伝子の単離 ａ）ｃＤＮＡバンクの作成 Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａの若い実生から抽出されたｍＲＮ Ａ、及び培養ニンジン細胞から抽出されたｍＲＮＡを用いて、ストラタジェーヌ 社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ）から販売されているベクターＵｎｉ Ｚａｐ^TMＸＲ中 に、２つのｃＤＮＡバンクを形成するのに用いられた。この際、この会社によっ て推奨されている手順に従った。 ｂ）ｃＤＮＡバンクのスクリーニング これらの２つのバンクを、部分的長さのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのｃＤＮＡに対応するプローブを用いてスクリーニングした。 これは、アラビドプシス・バイオロジカル・リソース・センター（Ａｒａｂｉｄ ｏｐｓｉｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ）（米国 オハイオ州）から得られ、ＥＳＴクローンＮｏ．９１Ｂ１３Ｔ７としてリストに 挙げられているものである。このクローンは約５００の塩基対から構成されてお り、このうち２２８だけが、ＭＳＵ−ＤＯＥプラント・リサーチ・ラボラトリー によって、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのｃＤＮＡの無作為配列 の枠内で配列決定されている。本発明者らは、このクローンの使用前に５００塩 基対を完全に配列し、溶菌斑の従来のハイブリダイゼーション技術によって、Ａ ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ及びニンジンのｃＤＮＡバンクをスク リーニングした（文献？）。 ｃ）１３３８塩基対に対応するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのｃ ＤＮＡ（配列番号２）が得られた。このｃＤＮＡは、２５位に翻訳開始コドン、 １３３６位に翻訳終了コドンを有する。従ってこのｃＤＮＡは完全であり、４４ ５のアミノ酸のタンパク質をコードする。 ｄ）１３２９塩基対に対応するニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔｔａ）ｃＤＮＡ（配列番号３）が得られた。このｃＤＮＡは、１位に 翻訳開始コドン、１３２９位に翻訳終了コドンを有する。従ってこのｃＤＮＡは 完全であり、４４２のアミノ酸のタンパク質をコードする。 示された配列は次のとおりである： 配列番号１：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ Ａ３２のＨ ＰＰＤ遺伝子の配列 配列番号２：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのＨＰＰＤのｃＤＮ Ａの配列 配列番号３：Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔｔａのＨＰＰＤのｃＤＮＡの配列 下記図面は、本発明を例証するために示されている。 図１は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．株Ｐ．Ｊ．８７４のＨＰＰＤのタン パク質配列と、対応するコード部分の理論的ヌクレオチド配列とを示す。このコ ード領域の一部の増幅を行なうために選ばれた５つのオリゴヌクレオチドは、５ つの矢印によって示されている。 図２は、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ Ａ３２のＨＰＰＤ遺伝子を含む７ｋｂ のゲノムＤＮＡ断片を有するプラスミドの図 を表わす。 図３は、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ Ａ３２のＨＰＰＤ、及びＰｓｅｕｄｏ ｍｏｎａｓ ｓｐ．株Ｐ．Ｊ．８７４のＨＰＰＤのアミノ酸配列の比較（２つの 配列間の異なるアミノ酸のみが示されている）、並びにコンセンサス配列を示す 。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:39） (31)優先権主張番号 ９６／０５９４４ (32)優先日 1996年５月17日 (33)優先権主張国 フランス（ＦＲ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ， ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，Ｍ Ｋ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 パレツト，ケン イギリス国、エセツクス・シー・エム・ ５・０・エイチ・ダブリユ、オンガー（番 地なし)

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 非ヒト起源又は非海洋性細菌起源の単離された遺伝子配列、又はこの配列 とハイブリダイズしうる配列であって、ヒドロキシ−フェニルピルビン酸ジオキ シゲナーゼ（ＨＰＰＤ）を発現することを特徴とする配列。 ２． 細菌起源又は植物起源であることを特徴とする、請求項１に記載の配列。 ３． Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．に由来することを特徴とする、請求項２ に記載の配列。 ４． Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに由来することを特徴 とする、請求項３に記載の配列。 ５． 植物起源のものであることを特徴とする、請求項１に記載の配列。 ６． Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓに由来することを特徴とする、請求項５に記載の 配列。 ７． セリ科に由来することを特徴とする、請求項５に記載の配列。 ８． プライマーとして、ＨＰＰＤのアミノ酸配列に由来する オリゴヌクレオチドを選び、 これらのプライマーから、ＰＣＲにより増幅断片を合成し、 ゲノムバンクの作成及びスクリーニングによって遺伝子を単離し、 この遺伝子をクローン化する、 ことを特徴とする、請求項１〜４いずれか１つに記載の遺伝子の単離方法。 ９． 転写の方向に、 植物内で自然に発現される遺伝子に由来する少なくとも１つのプロモーター調 節配列、 異種コード配列、 少なくとも１つのポリアデニル化配列、 を含む植物の遺伝的形質転換用のキメラ遺伝子であって、コード配列が、ヒドロ キシ−フェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）を発現する遺伝子の配 列であることを特徴とするキメラ遺伝子。 １０． プロモーター調節配列が、コード配列の過剰発現を促進することを特徴 とする、請求項９に記載のキメラ遺伝子。 １１． プロモーター調節配列が、少なくとも１つのヒストン プロモーターを含むことを特徴とする、請求項１０に記載のキメラ遺伝子。 １２． プロモーター調節配列とコード配列との間に、トランジットペプチドを 含むことを特徴とする、請求項９〜１１のいずれかに記載のキメラ遺伝子。 １３． 色素体局在酵素をコードする植物遺伝子のトランジットペプチドをコー ドする配列、色素体局在酵素をコードする植物遺伝子の成熟Ｎ末端部分の配列の 一部、ついで色素体局在酵素をコードする植物遺伝子の第二トランジットペプチ ドをコードする配列を転写の方向に含む最適化されたトランジットペプチドを、 プロモーター調節配列とコード配列との間に含むことを特徴とする、請求項９に 記載のキメラ遺伝子。 １４． プロモーター調節配列とコード化配列との間に、転写活性化物質（エン ハンサー）の配列を含むことを特徴とする、請求項９〜１３のいずれかに記載の キメラ遺伝子。 １５． 請求項９〜１４のいずれかに記載のキメラ遺伝子を含むことを特徴とす る、植物の遺伝的形質変換に用いうるベクター。 １６． 請求項９〜１４のいずれかに記載のキメラ遺伝子を含 むことを特徴とする植物細胞。 １７． 請求項１６に記載の細胞から再生されることを特徴とする植物。 １８． 双子葉類に属することを特徴とする、請求項１７に記載の植物。 １９． ＨＰＰＤの阻害剤に対して耐性にするための、植物の形質転換方法であ って、外生ＨＰＰＤを発現する遺伝子を植物細胞に導入することを特徴とする方 法。 ２０． 伝達が、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ又はＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓを用いて実施されることを特 徴とする、請求項１９に記載の方法。 ２１． 伝達が、ＤＮＡを含有する粒子による衝撃によってもたらされることを 特徴とする、請求項１９に記載の方法。 ２２． 選択マーカーとして外生ＨＰＰＤを発現する遺伝子を植物細胞に導入す ることを特徴とする、植物の形質転換方法。 ２３． 請求項１７又は１８に記載の植物に、ＨＰＰＤ遺伝子の阻害剤を適用す ることを特徴とする、植物の選択的除草剤処理方法。 ２４． ＨＰＰＤ遺伝子の阻害剤がイソキサゾール類であるこ とを特徴とする、請求項２３に記載の方法。 ２５． イソキサゾールが、４−［４−ＣＦ₃−２−（メチルスルフォイル）ベ ンゾイル］−５−シクロプロピルイソキサゾールであることを特徴とする、請求 項２４に記載の方法。 ２６． ＨＰＰＤ遺伝子の阻害剤がジケトニトリル類であることを特徴とする、 請求項２３に記載の方法。 ２７． ＨＰＰＤ遺伝子の阻害剤がトリケトン類であることを特徴とする、請求 項２３に記載の方法。 ２８． ＨＰＰＤ遺伝子の阻害剤がスルコトリオンであることを特徴とする、請 求項２３に記載の方法。