CN105524931A - 筛选抗hppd抑制剂类除草剂基因的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体而言，涉及一种筛选抗HPPD抑制剂类除草剂基因的方法，该方法以含有HPPD抑制剂的培养基对微生物进行高通量筛选，经16s？rRNA测序法对筛选到的微生物进行鉴定，通过鉴定结果确定其种属，进而克隆到HPPD基因并进行验证。本发明提供的方法可在短时间内筛选、分离和分析抗HPPD抑制剂基因，不用对分离的个别菌株筛选，较传统方法目标性强，操作简便，节约了大量的人力和物力。

Description

筛选抗HPPD抑制剂类除草剂基因的方法及应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体而言，涉及一种筛选抗HPPD抑制剂类除草剂基因的方法及应用。
背景技术
对羟基苯基丙酮酸双氧化酶(4-Hydroxyphenylpyruvatedioxygenase，HPPD)存在于各种生物体中，它是一种铁-酪氨酸蛋白，在植物体内可将对羟基丙酮酸(4-Hydroxyphenylpyruvate，HPP)催化为尿黑酸(2,5-dihydroxyphenylacetate，HGA)，进而转化为光合作用中电子传递所需要的重要物质质体醌和生育酚，其中质体醌还是影响八氢番茄红素去饱和酶催化的关键辅助因子。鉴于其上述重要作用和特点，HPPD成为继ALS、ACC以及Protox之后的又一新的除草剂靶标酶。由于该酶抑制剂用于除草方面时具有广谱、高效、残留低、环境相容性好、使用安全的特点，引起人们对其抑制剂研究的重视，该抑制剂的发现对环境的保护有重大作用，这也是未来除草剂生产发展的趋势。
抗除草剂农作物的种植，更充分地利用了除草剂的优势。在过去20年里，抗除草剂作物给农民和环境都带来了巨大利益。目前生产上种植最多的是抗草甘膦玉米和大豆，从而使草甘膦的施用非常广泛。随着草甘膦的大量使用，抗草甘膦杂草不断出现，从而影响了抗草甘膦作物的有效性。因此，开发新型抗除草剂作物，如抗HPPD抑制剂类除草剂作物，势在必行。
本领域已有一些对抗除草剂HPPD基因的研究，但筛选抗除草剂HPPD基因仍然困难。用植物直接筛选虽然其结果可直接应用，但植物的生长繁殖周期长，传代慢，因此筛选效率非常低，难以用于实践。抗HPPD抑制剂类除草剂HPPD基因的初步筛选往往是在细菌中进行。但这些筛选都需要先分离微生物菌株或将HPPD基因克隆在细菌中，再进行单个评估。这种方法工作量大、范围广、没有针对性，难以进行大规模筛选或从稀有样品中进行筛选。
发明内容
本发明的目的在于提供一种筛选抗HPPD抑制剂类除草剂基因的方法，运用此种方法筛选抗HPPD抑制剂类除草剂基因，不用对分离的个别菌株筛选，较传统方法目标性强，操作简便，可在短时间内筛选得到较多的抗HPPD抑制剂类除草剂基因，也容易从稀有样品中筛选得到抗HPPD抑制剂类除草剂基因。
一种筛选抗HPPD抑制剂类除草剂基因的方法，包括如下步骤：
1)、将含有HPPD抑制剂类除草剂抗性微生物的多种微生物在含有HPPD抑制剂的抗性筛选培养基中培养，得到抗性菌种，并对其纯化培养获得单克隆；
2)、以所述单克隆的基因组为模板扩增该单克隆的HPPD基因的开放阅读框序列，将扩增产物连入质粒中并于细菌中进行原核表达，得到重组菌株；
3)、对重组菌株的HPPD抑制剂抗性进行验证，获得抗HPPD抑制剂类除草剂基因。
HPPD即对羟基苯基丙酮酸双氧化酶(4-Hydroxyphenylpyruvatedioxygenase)。
本发明针对现有的抗HPPD抑制剂基因筛选方法中存在的不足，提供了一种快速而有效地高通量筛选抗HPPD抑制剂类除草剂基因的方法，运用此种方法筛选抗HPPD抑制剂类除草剂基因，不用对分离的个别菌株筛选，较传统方法目标性强，操作简便，可在短时间内筛选得到较多的抗HPPD抑制剂类除草剂基因。
优选的，如上所述的筛选抗HPPD抑制剂类除草剂基因的方法，在步骤1)中，所述培养的具体过程为：
将微生物样本于含有HPPD抑制剂的抗性筛选培养基中培养1～10次，，且培养次数大于1次时，在每相邻两次培养所用抗性筛选培养基中，后一次培养的HPPD抑制剂浓度均不低于前一次，且后一次培养的菌种来源于前一次培养中存活下来的微生物菌种。
用此方法可筛选到针对不同浓度HPPD抑制剂敏感的菌种，亦即该体系能够快速筛选出不同程度的抗HPPD抑制剂类除草剂基因。
进一步优选的，在步骤3)中，抗性验证具体包括：
以步骤1)中筛选到的抗性菌种的HPPD抑制剂浓度为最高浓度设置HPPD抑制剂浓度梯度，将步骤3)中所述重组菌株于HPPD抑制剂含量梯度设置的抗性筛选培养基中培养，以筛选抗HPPD抑制剂类除草剂基因。
由于理论上重组菌株的HPPD抑制剂抗性不会高于抗性菌种的HPPD抑制剂抗性，所以以抗性菌种的HPPD抑制剂浓度为最高浓度。例如筛选到的抗性菌种能够耐受的最高HPPD抑制剂为10mM硝磺草酮，则在步骤3)中，抗性筛选培养基的HPPD抑制剂浓度梯度可设置为0.1mM、0.5mM、1mM、2mM、5mM、10mM硝磺草酮。在具体的应用中，步骤3)中用到的抗性筛选培养基可能与步骤1)中略有不同，如在步骤1)中提供的抗性筛选培养基配方的基础上加上重组菌株所具有抗性对应的抗生素。
优选的，如上所述的筛选抗HPPD抑制剂类除草剂基因的方法，所述HPPD抑制剂为硝磺草酮或环磺酮。
硝磺草酮(Mesotrione)又名甲基磺草酮，分子式C14H13NO7S，分子量339.32，CASNo：104206-82-8。它是一类常用的HPPD抑制剂类除草剂的主要成分。
环磺酮(Tembotrione)，是由拜耳公司报道的三酮类除草剂，分子式C17H16ClF3O6S，分子量440.82，CASNo:335104-84-2。
进一步优选的，在步骤1)中：
HPPD抑制剂含量的范围为1～20mM硝磺草酮或0.25～5mM环磺酮，相邻浓度梯度设置的间距为1.5～5倍。
相邻浓度梯度设置的间距为1.5～5倍的含义即后一次培养中培养基的HPPD抑制剂浓度是前一次培养中培养基的HPPD抑制剂浓度的1.5～5倍。
优选的，如上所述的筛选抗HPPD抑制剂类除草剂基因的方法，所述抗性筛选培养基为含有1～20mM硝磺草酮或0.25～5mM环磺酮的SMNT基本培养基；
按体积份数计，所述SMNT基本培养基包括以下组份：
5×M9盐溶液200份、245～255mM的MgSO4溶液4.8份、97～103mM的CaCl2溶液1份、0.128％酪氨酸溶液778～784份、水9～11份；
所述5×M9盐溶液中包括：Na2HPO4·7H2O60～68g/L、KH2PO414～16g/L、NaCl2.4～2.6g/L、NH4Cl4.8～5.2g/L；
所述5×M9盐溶液、MgSO4溶液、CaCl2溶液及0.128％酪氨酸溶液所用溶剂均为水。
若所筛选的微生物具有HPPD抑制剂抗性，则可在所述抗性筛选培养基中利用酪氨酸，进而合成质体醌和生育酚从而存活下来。
优选的，如上所述的筛选抗HPPD抑制剂类除草剂基因的方法，在步骤2)中：
当所述单克隆种属未知时，则扩增所述单克隆的部分16srRNA序列，并将扩增产物测序以确定所述单克隆种属；
根据得到的种属信息查询所述单克隆的HPPD基因序列并以此为模板设计引物扩增得到具有HPPD抑制剂抗性的HPPD基因片段并测序；
根据测序结果设计引物，将所述具有HPPD抑制剂抗性的HPPD基因的开放阅读框序列连入质粒中并于细菌中进行原核表达。
16srRNA普遍存在于所有细菌染色体基因中。rRNA参与生物蛋白质的合成过程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中其基因序列较为保守，变异较小，可看作为生物演变的时间钟，其可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16srDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。扩增16srRNA的引物如：
https://en.wikipedia.org/wiki/16S_ribosomal_RNA中所述；
本申请优选了上游引物为27F，下游引物为1492R。
由于微生物基因组的多样性，网上查到的序列可能与实际不一致，所以对有些菌株需要先在查到的基因序列上下游较远的地方设计引物将HPPD基因序列完整的克隆出来，再测序验证，进而获得正确的HPPD基因序列的开放阅读框序列。
优选的，如上所述的筛选抗HPPD抑制剂类除草剂基因的方法，在步骤2)中：
所述质粒为pADV3；
所述pADV3的序列由原核表达载体pUC57改造而来，其改造方法为：将pUC57中的MCS序列替换为SEQIDNO:1所示序列。
改造后的pADV3与pUC57相比，只有MCS(MultipleCloningSite，多克隆位点)序列部分不一样。原核表达载体pADV3中启动子和终止子的增加，可以帮助抗HPPD抑制剂在大肠杆菌中更好的表达。
pADV3可与大肠杆菌Trans1-T1搭配使用。
Trans1-T1感受态细胞是目前生长速度最快的感受态细胞，在氨苄青霉素平板上，8～9h可见克隆；用于蓝、白斑筛选，12h可见蓝斑；将过夜培养的单克隆在2ml的LB培养基中培养4～5h即可进行小量质粒提取；适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，减少克隆DNA同源重组的发生，提高质粒DNA的产量和质量；具有T1，T5噬菌体抗性。使用pUC19质粒检测，转化效率可达109cfu/μg。
根据如上所述的筛选抗HPPD抑制剂类除草剂基因的方法获得的抗HPPD抑制剂类除草剂基因在培育抗HPPD抑制剂类除草剂植物品种中的应用。
根据如上所述的所述筛选方法获得的抗HPPD抑制剂类除草剂基因，其序列为SEQIDNO:3所示
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1)、本发明提供的方法可在短时间内筛选、分离和分析抗HPPD抑制剂基因，不用对分离的个别菌株筛选，较传统方法目标性强，操作简便，节约了大量的人力和物力。
2)、本发明提供的方法可从抗性微生物含量极低的稀有样品中筛选、分离出抗HPPD抑制剂的微生物及其基因。
3)、通过本申请提供的方法，可分离获得不同浓度抗性的菌株，具有很广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例5中以pADV3-pfHPPD转化的Trans1-T1大肠杆菌在培养基中的颜色变化结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
一种筛选抗HPPD抑制剂类除草剂基因的方法，包括如下步骤：
S11、将含有HPPD抑制剂类除草剂抗性微生物的多种微生物在含有HPPD抑制剂的抗性筛选培养基中培养，得到抗性菌种，并对其纯化培养获得单克隆；
S12、以所述单克隆的基因组为模板扩增该单克隆的HPPD基因的开放阅读框序列，将扩增产物连入质粒中并于细菌中进行原核表达，得到重组菌株；
S13、对重组菌株的HPPD抑制剂抗性进行验证，获得抗HPPD抑制剂类除草剂基因。
需要说明的是，若待测样本中含有HPPD抑制剂类除草剂抗性微生物，则用本方法即可筛选获得其抗HPPD抑制剂基因。HPPD抑制剂抗性微生物的种属信息已知或未知均可，若种属信息未知，则步骤S12步骤会有所增加，具体参见实施例3～4。
实施例2
本实施例为抗HPPD抑制剂类除草剂菌株的筛选步骤。
具体方法如下：
S21、抗性筛选培养基配置
5×M9S(M9盐)：
121℃，灭菌20min。
SMNT基本培养基(SaltMedium，NitrogenandTyrosine)：
将以上试剂混合后添加HPPD抑制剂类除草剂即得到抗性筛选培养基。以硝磺草酮(Mesotrione，MT)为例将筛选培养基配制成不同浓度梯度的筛选培养基：
SMNT-MT1(TM1)：在SMNT培养基中加入1mM的硝磺草酮；
TM5：在SMNT培养基中加入5mM的硝磺草酮。
S22、抗HPPD抑制剂类除草剂菌株的筛选及抗性测试
取0.1-5g样品加入5ml筛选培养基TM5中，300r/min30℃培养24-48h；
取上清液100μl接种于5ml的TM5中，300r/min30℃培养24-48h；
待菌长出后取上清液5μl接种于2ml的TM5中，300r/min30℃培养24-48h，当菌长到半饱和及以上时，保存菌。此时得到的菌为抗TM5的菌。
分别接种2.5μlTM5菌株于1mlTM10、TM20以及更高的TM培养基中，300r/min30℃培养72h后观察菌的生长情况，若菌长到半饱和及以上，保存菌。综上，不同浓度抗性的菌也就分离得到。
本领域技术人员可根据实际情况，将本实施例中的硝磺草酮替换为0.25～5mM的环磺酮或其他浓度范围的其他HPPD抑制剂。
实施例3
本实施例为分离菌株的鉴定步骤。
具体方法如下：
S31、固体LB培养基的配制：
121℃，灭菌20min。
将保存的菌株划线接种于LB固体培养基上，30℃培养24～48h。
S32、分离菌株的鉴定：
使用16srRNA引物进行鉴定。
16srRNA引物序列如下：
16S-27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；
16S-1492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3。
PCR反应体系：
补无菌双蒸水至50μL。
PCR反应程序：
S33、琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，并送样测序。数据的处理使用NCBIblastn分析分离菌株的同源性，对分离的菌株进行分类整理。测序结果为如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。
实施例4
本实施例为HPPD基因的克隆步骤。
S41、HPPD基因的克隆
根据实施例3中16srRNA鉴定结果，判断该微生物为MTCC5279(Pseudomonasputida)。根据在NCBI中找到的该菌株的HPPD基因序列设计引物，并以查到的HPPD基因为模版，进行PCR扩增，PCR产物取5μL进行琼脂糖凝胶电泳后，剩余的PCR产物送测序。
由于微生物基因组的多样性，网上查到的序列可能与实际不一致，所以对有些菌株需要先在查到的基因序列上下游较远的地方设计引物将HPPD基因序列完整的克隆出来，再测序验证。测序结果为SEQIDNO:3所示的核苷酸序列。
根据测序结果，选取该HPPD基因的开放阅读框(ORF)设计引物，扩增目的基因。
引物设计如下：
HPPD-F：5-ATGGCTGATATCTTCGACAACCCG-3
HPPD-R：5-TTATTCGACGTTCAGGACGCCGC-3
以菌株MTCC5279为模板，克隆HPPD基因。
PCR反应体系如下：
补无菌双蒸水至50μL。
PCR反应程序：
取5μLPCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测后，将剩余PCR产物送测序；测序结果为如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。
S42、HPPD基因表达载体的构建
测序确定该基因为HPPD基因后，使用PCR产物纯化试剂盒(Omega)回收PCR产物，再使用不同限制性内切酶(Pac1和Sbf1)酶切纯化的PCR产物，形成粘性末端；酶切的片段和经过同样酶切处理过的细菌表达载体pADV3进行连接，16℃过夜。构建得到表达载体pADV3-MT79HPPD。
引物设计如下：
MT79-F：
5-ACGAAAAACCTTAATTAAATGGCTGATATCTTCGACAACCCG-3Pac1
MT79-R：
5-ACTAAAAAAACCTGCAGGTTATTCGACGTTCAGGACGCCGC-3Sbf1
划线处为酶切位点Pac1和Sbf1，前面的序列为保护碱基序列。以菌株MTCC5279为模板，克隆HPPD基因。
PCR反应体系如下：
补无菌双蒸水至50μL。
PCR反应程序：
酶切体系如下：
加双蒸水至100μl。
连接体系如下：
16℃连接过夜。
实施例5
本实施例为克隆到的HPPD基因的抗性测试步骤。
将细菌表达载体pADV3-MT79HPPD用热激法转入大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞，PCR及其酶切验证转化结果后做抗性测试。由于pADV3载体可以在大肠杆菌Trans1-T1细胞中表达，因此，将检测阳性pADV3-MT79HPPD转化的Trans1-T1大肠杆菌细胞直接做抗性测试即可。
首先，将单克隆细胞在液体LB培养基中活化过夜；
其次，将活化的菌转接入TM0、TM1、TM5、TM10以及TM20抗性测试培养基中，以pADV3-pfHPPD转化的Trans1-T1大肠杆菌为阳性对照，以空载pADV3质粒转化的Trans1-T1大肠杆菌为阴性对照，于37℃，300r/min摇床中培养并观察颜色的变化。
根据所述抗性筛选培养基颜色的深浅程度对其HPPD抑制剂抗性进行打分评级，若培养基的颜色变为深色，则表示HPPD基因能在加了除草剂的培养基中生长，即该HPPD基因抗该除草剂，颜色越深，则表示HPPD抑制剂抗性越强。若测定的培养基的颜色无变化，而阳性对照的培养基变为深色，则表示该基因不抗测定的除草剂，该实施例的培养基颜色变化结果如图1所示。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种筛选抗HPPD抑制剂类除草剂基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)、将含有HPPD抑制剂类除草剂抗性微生物的多种微生物在含有HPPD抑制剂的抗性筛选培养基中培养，得到抗性菌种，并对其纯化培养获得单克隆；
2)、以所述单克隆的基因组为模板扩增该单克隆的HPPD基因的开放阅读框序列，将扩增产物连入质粒中并于细菌中进行原核表达，得到重组菌株；
3)、对重组菌株的HPPD抑制剂抗性进行验证，获得抗HPPD抑制剂类除草剂基因。
2.如权利要求1所述的筛选抗HPPD抑制剂类除草剂基因的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述培养的具体过程为：
将微生物样本于含有HPPD抑制剂的抗性筛选培养基中培养1～10次，且培养次数大于1次时，在每相邻两次培养所用抗性筛选培养基中，后一次培养的HPPD抑制剂浓度均不低于前一次，且后一次培养的菌种来源于前一次培养中存活下来的微生物菌种。
3.如权利要求2所述的筛选抗HPPD抑制剂类除草剂基因的方法，其特征在于，在步骤3)中，抗性验证具体包括：
以步骤1)中筛选到的抗性菌种的HPPD抑制剂浓度为最高浓度设置HPPD抑制剂浓度梯度，将步骤3)中所述重组菌株于HPPD抑制剂含量梯度设置的抗性筛选培养基中培养，以筛选抗HPPD抑制剂类除草剂基因。
4.如权利要求1～3任一项所述的筛选抗HPPD抑制剂类除草剂基因的方法，其特征在于，所述HPPD抑制剂为硝磺草酮或环磺酮。
5.如权利要求4所述的筛选抗HPPD抑制剂类除草剂基因的方法，其特征在于：
在步骤1)中，HPPD抑制剂含量的范围为1～20mM硝磺草酮或0.25～5mM环磺酮，相邻浓度梯度设置的间距为1.5～5倍。
6.如权利要求1所述的筛选抗HPPD抑制剂类除草剂基因的方法，其特征在于，所述抗性筛选培养基为含有1～20mM硝磺草酮或0.25～5mM环磺酮的SMNT基本培养基；
按体积份数计，所述SMNT基本培养基包括以下组份：
5×M9盐溶液190～210份、245～255mM的MgSO4溶液4.5～5.0份、97～103mM的CaCl2溶液0.8～1.2份、0.128％酪氨酸溶液778～784份、水9～11份；
所述5×M9盐溶液中包括：Na2HPO4·7H2O60～68g/L、KH2PO414～16g/L、NaCl2.4～2.6g/L、NH4Cl4.8～5.2g/L；
所述5×M9盐溶液、MgSO4溶液、CaCl2溶液及0.128％酪氨酸溶液所用溶剂均为水。
7.如权利要求1所述的筛选抗HPPD抑制剂类除草剂基因的方法，其特征在于，在步骤2)中：
当所述单克隆种属未知时，则扩增所述单克隆的部分16srRNA序列，并将扩增产物测序以确定所述单克隆种属；
根据得到的种属信息查询所述单克隆的HPPD基因序列并以此为模板设计引物扩增得到具有HPPD抑制剂抗性的HPPD基因片段并测序；
根据测序结果设计引物，将所述具有HPPD抑制剂抗性的HPPD基因的开放阅读框序列连入质粒中并于细菌中进行原核表达。
8.如权利要求7所述的筛选抗HPPD抑制剂类除草剂基因的方法，其特征在于，在步骤2)中：
所述质粒为pADV3；
所述pADV3的序列由原核表达载体pUC57改造而来，其改造方法为：将pUC57中的MCS序列替换为SEQIDNO:1所示序列。
9.权利要求1～8任一项所述筛选方法获得的抗HPPD抑制剂类除草剂基因在培育抗HPPD抑制剂类除草剂植物品种中的应用。
10.权利要求1～8任一项所述筛选方法获得的抗HPPD抑制剂类除草剂基因，其序列为SEQIDNO:3所示。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1192243A (zh) * 1995-06-02 1998-09-02 罗纳-普朗克农业化学公司 羟苯丙酮酸双加氧酶基因的dna序列以及含有羟苯丙酮酸双加氧酶基因的抗特定除草剂植物的获得

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1192243A (zh) * 1995-06-02 1998-09-02 罗纳-普朗克农业化学公司 羟苯丙酮酸双加氧酶基因的dna序列以及含有羟苯丙酮酸双加氧酶基因的抗特定除草剂植物的获得

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NVCBI: "4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase [Pseudomonas putida]", 《NCBI参考序列WP_043214998.1》 *
黄彦，等: "硝磺草酮抗性菌株的筛选及抗性基因的克隆表达", 《微生物学通报》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114350689A (zh) * 2021-06-15 2022-04-15 南京厚土生物科技有限公司 一种抗性hppd基因的克隆表达的方法

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