JP2013515468A - Hppd阻害剤型除草剤に耐性の植物 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、Blepharismidae科に属する原生生物から得られるヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ(EC1.13.11.27、本明細書において「HPPD」と略記する)をコードする核酸配列およびそれによってコードされるタンパク質、ならびに当該核酸配列を含むキメラ遺伝子、ならびにHPPD阻害剤型除草剤に耐性の植物を得るための当該核酸配列、タンパク質またはキメラ遺伝子の使用に関する。
HPPDは、チロシン分解産物であるp−ヒドロキシフェニルピルビン酸(本明細書においてHPPと略記する)が、植物におけるトコフェロールおよびプラストキノンの前駆体であるホモゲンチジン酸(本明細書においてHGと略記する)に変換される反応を触媒する酵素である(Crouch N.P. et al. (1997) Tetrahedron, 53, 20, 6993-7010, Fritze et al., (2004), Plant Physiology 134:1388-1400)。トコフェロールは、膜結合抗酸化剤として作用する。プラストキノンは、最初にPSIIとチトクロムb6/f複合体の間の電子伝達体として作用し、次にカロテノイドの生合成に関与するフィトエンデサチュラーゼについての酸化還元コファクターである。
1)トリケトン、例えばスルコトリオン[すなわち2−[2−クロロ−4−(メチルスルホニル)ベンゾイル]−1,3−シクロヘキサンジオン]、メソトリオン[すなわち2−[4−(メチルスルホニル)−2−ニトロベンゾイル]−1,3−シクロヘキサンジオン];テンボトリオン[すなわち2−[2−クロロ−4−(メチルスルホニル)−3−[(2,2,2,−トリ−フルオロエトキシ)メチル]ベンゾイル]−1,3−シクロ−ヘキサンジオン];テフリルトリオン[すなわち2−[2−クロロ−4−(メチルスルホニル)−3−[[(テトラヒドロ−2−フラニル)メトキシ]メチル]ベンゾイル]−1,3−シクロヘキサンジオン]];ビシクロピロン[すなわち4−ヒドロキシ−3−[[2−[(2−メトキシエトキシ)メチル]−6−(トリフルオロメチル)−3−ピリジニル]カルボニル]ビシクロ[3.2.1]オクタ−3−エン−2−オン];ベンゾビシクロン[すなわち3−(2−クロロ−4−メシルベンゾイル)−2−フェニルチオビシクロ[3.2.1]オクタ−2−エン−4−オン];
2)ジケトニトリル、例えば2−シアノ−3−シクロプロピル−1−(2−メチルスルホニル−4−トリフルオロメチルフェニル)−プロパン−1,3−ジオンおよび2−シアノ−1−[4−(メチルスルホニル)−2−トリフルオロメチルフェニル]−3−(1−メチルシクロプロピル)プロパン−1,3−ジオン;
3)イソキサゾール、例えばイソキサフルトール[すなわち(5−シクロプロピル−4−イソキサゾリル)[2−(メチルスルホニル)−4−(トリフルオロメチル)フェニル]メタノン](植物ではイソキサフルトールは、HPPD阻害剤の性質を示すジケトニトリル化合物であるDKNに迅速に代謝される);ならびに
4)ピラゾリネート、例えばトプラメゾン[すなわち[3−(4,5−ジヒドロ−3−イソキサゾリル)−2−メチル−4−(メチルスルホニル)フェニル](5−ヒドロキシ−1−メチル−1H−ピラゾール−4−イル)メタノン]、およびピラスルホトール[(5−ヒドロキシ−1,3−ジメチルピラゾール−4−イル(2−メシル−4−トリフルアロ(trifluaro)メチルフェニル)メタノン];ピラゾフェン(pyrazofen)[2−[4−(2,4−ジクロロベンゾイル)−1,3−ジメチルピラゾール−5−イルオキシ]アセトフェノン]。
したがって本発明は、Blepharismidae科に属する生物から入手可能な、または入手されたHPPDタンパク質をコードする遺伝子、およびその変異体または突然変異体を含有するトランスジェニック植物であって、任意の当該HPPDコード導入遺伝子を含有しない植物よりもHPPD阻害剤に対する感受性が低い植物の作製、さらに顕著にはp−ヒドロキシフェニルピルビン酸からホモゲンチジン酸への転換を触媒する性質を示すHPPD酵素をコードする、Blepharisma属に属する生物由来の遺伝子、その変異体または突然変異体に関する。HPPDタンパク質をコードするBlepharismidae由来遺伝子が優れたHPPD阻害剤耐性候補として選択されたが、それは、HPPDタンパク質から実験的および構造的に決定されたように、それらのタンパク質がHPPD阻害剤型除草剤に感受性の参照分子として採用された感受性Arabidopsis HPPDタンパク質に比べて、HPPD阻害剤耐性にとって関連する位置にアミノ酸組成の高い分岐を示すことによる。
属:Aegilops、Agropyron、Agrostis、Alopecurus、Apera、Avena、Brachiaria、Bromus、Cenchrus、Commelina、Cynodon、Cyperus、Dactyloctenium、Digitaria、Echinochloa、Eleocharis、Eleusine、Eragrostis、Eriochloa、Festuca、Fimbristylis、Heteranthera、Imperata、Ischaemum、Leptochloa、Lolium、Monochoria、Panicum、Paspalum、Phalaris、Phleum、Poa、Rottboellia、Sagittaria、Scirpus、Setaria、Sorghumの単子葉有害植物。
属:Abutilon、Amaranthus、Ambrosia、Anoda、Anthemis、Aphanes、Artemisia、Atriplex、Bellis、Bidens、Capsella、Carduus、Cassia、Centaurea、Chenopodium、Cirsium、Convolvulus、Datura、Desmodium、Emex、Erysimum、Euphorbia、Galeopsis、Galinsoga、Galium、Hibiscus、Ipomoea、Kochia、Lamium、Lepidium、Lindernia、Matricaria、Mentha、Mercurialis、Mullugo、Myosotis、Papaver、Pharbitis、Plantago、Polygonum、Portulaca、Ranunculus、Raphanus、Rorippa、Rotala、Rumex、Salsola、Senecio、Sesbania、Sida、Sinapis、Solanum、Sonchus、Sphenoclea、Stellaria、Taraxacum、Thlaspi、Trifolium、Urtica、Veronica、Viola、Xanthiumの双子葉雑草。
− 植物中で合成されたデンプンを改変するための作物のリコンビナント改変(例えば国際公開公報第92/11376号、国際公開公報第92/14827号、国際公開公報第91/19806号)、
− グルホシネート型(例えば、EP-A-0242236、EP-A-242246参照)またはグリフォセート型(国際公開公報第92/00377号)またはスルホニル尿素型(EP-A-0257993、US-A-5013659)の一定の除草剤に耐性のトランスジェニック作物、
− 植物をある病害虫に耐性にするBacillus thuringiensis毒素(Bt毒素)を生成可能なトランスジェニック作物、例えばコーン、ワタもしくはダイズ、またはその雑種もしくは突然変異体(EP-A-0193259)、
− 改変された脂肪酸組成を有するトランスジェニック作物(国際公開公報第91/13972号)、
− 耐病性増加を引き起こす新規な成分または二次代謝物、例えば新規なフィトアレキシンを有する遺伝的に改変された作物(EPA 309862、EPA0464461)、
− より高い収量およびより高いストレス耐性を備える、減少した光呼吸を有する遺伝的に改変された植物(EPA 0305398)、
− 薬学的または診断的に重要なタンパク質を生成するトランスジェニック作物(「分子ファーミング(molecular pharming)」)、
− より高い収量またはより良好な品質によって区別されるトランスジェニック作物、
− 上記の新規な性質の組み合わせなどの新規な性質の組み合わせによって区別されるトランスジェニック作物(「遺伝子スタッキング(gene stacking)」)。
アセトクロール、アシベンゾラル、アシベンゾラル−S−メチル、アシフルオルフェン、アシフルオルフェン−ナトリウム、アクロニフェン、アラクロール、アリドクロル、アロキシジム、アロキシジム−ナトリウム、アメトリン、アミカルバゾン、アミドクロル、アミドスルフロン、アミノシクロピラクロル、アミノピラリド、アミトロール、スルファミン酸アンモニウム、アンシミドール、アニロホス、アシュラム、アトラジン、アザフェニジン、アジムスルフロン、アジプロトリン、BAH−043、BAS−140H、BAS−693H、BAS−714H、BAS−762H、BAS−776H、BAS−800H、ベフルブタミド、ベナゾリン、ベナゾリン−エチル、ベンカルバゾン、ベンフルラリン、ベンフレセート、ベンスリド、ベンスルフロン−メチル、ベンタゾン(bentazone)、ベンズフェンジゾン、ベンゾビシクロン、ベンゾフェナップ、ベンゾフルオル、ベンゾイルプロップ、ビフェノックス、ビラナホス、ビラナホス−ナトリウム、ビスピリバック、ビスピリバック−ナトリウム、ブロマシル、ブロモブチド、ブロモフェノキシム、ブロモキシニル、ブロムロン(bromuron)、ブミナホス、ブソキシノン(busoxinone)、ブタクロール、ブタフェナシル、ブタミホス、ブテナクロール、ブトルアリン、ブトロキシジム、ブチレート、カフェンストロール、カルベタミド、カルフェントラゾン、カルフェントラゾン−エチル、クロメトキシフェン、クロランベン、クロラジホップ、クロラジホップ−ブチル、クロルブロムロン、クロルブファム、クロルフェナック、クロルフェナック−ナトリウム、クロルフェンプロップ、クロルフルレノール、クロルフルレノール−メチル、クロリダゾン、クロリムロン、クロリムロン−エチル、クロルメコート−クロリド、クロルニトロフェン、クロロフタリム、クロルタール−ジメチル、クロロトルロン、クロルスルフロン、シニドン、シニドン−エチル、シンメチリン、シノスルフロン、クレトジム、クロジナホップ、クロジナホップ−プロパルギル、クロフェンセット、クロマゾン、クロメプロップ、クロプロップ、クロピラリド、クロランスラム、クロランスラム−メチル、クミルロン、シアナミド、シアナジン、シクラニリド、シクロエート、シクロスルファムロン、シクロキシジム、シクルロン、シハロホップ、シハロホップ−ブチル、シペルコート、シプラジン、シプラゾール、2,4−D、2,4−DB、ダイムロン(daimuron/dymron)、ダラポン、ダミノジッド、ダゾメット、n−デカノール、デスメディファム、デスメトリン、デトシル−ピラゾレート(DTP)、ジアレート、ジカンバ、ジクロベニル、ジクロルプロップ、ジクロルプロップ−P、ジクロホップ、ジクロホップ−メチル、ジクロホップ−P−メチル、ジクロスラム、ジエタチル、ジエタチル−エチル、ジフェノキスロン、ジフェンゾコート、ジフルフェニカン、ジフルフェンゾピル、ジフルフェンゾピル−ナトリウム、ジメフロン、ジケグラック−ナトリウム、ジメフロン、ジメピペレート、ジメタクロル、ジメタメトリン、ジメテナミド、ジメテナミド−P、ジメチピン、ジメトラスルフロン、ジニトラミン、ジノセブ、ジノテルブ、ジフェナミド、ジプロペトリン、ジクワット、ジクワット−ジブロミド、ジチオピル、ジウロン、DNOC、エグリナジン−エチル、エンドタール、EPTC、エスロプロカルブ、エタルフルラリン、エタメトスルフルロン−メチル、エテホン、エチジムロン、エチオジン、エトフメセート、エトキシフェン、エトキシフェン−エチル、エトキシスルフロン、エトベンザニド、F−5331、すなわちN−[2−クロロ−4−フルオロ−5−[4−(3−フルオロ−プロピル)−4,5−ジヒドロ−5−オキソ−1H−テトラゾール−1−イル]−フェニル]エタンスルホンアミド、フェノプロップ、フェノキサプロップ、フェノキサプロップ−P、フェノキサプロップ−エチル、フェノキサプロップ−P−エチル、フェントラザミド、フェニュロン、フランプロップ、フランプロップ−M−イソプロピル、フランプロップ−M−メチル、フラザスルフロン、フロラスラム、フルアジホップ、フルアジホップ−P、フルアジホップ−ブチル、フルアジホップ−P−ブチル、フルアゾレート、フルカルバゾン、フルカルバゾン−ナトリウム、フルセトスルフロン、フルクロラリン、フルフェナセット(チアフルアミド)、フルフェンピル、フルフェンピル−エチル、フルメトラリン、フルメツラム、フルミクロラック、フルミクロラック−ペンチル、フルミオキサジン、フルミプロピン、フルオメツロン、フロロジフェン、フルオログリコフェン、フルオログリコフェン−エチル、フルポキサム、フルプロパシル、フルプロパネート、フルピルスルフロン、フルピルスルフロン−メチル−ナトリウム、フルレノール、フルレノール−ブチル、フルリドン、フルロクロリドン、フルロキシピル、フルロキシピル−メプチル、フルルプリミドール、フルルタモン、フルチアセット、フルチアセット−メチル、フルチアミド、ホメサフェン、フォラムスルフロン、ホルクロルフェニュロン、ホサミン、フリロキシフェン、ジベレリン酸、グルホシネート、L−グルホシネート、L−グルホシネート−アンモニウム、グルホシネート−アンモニウム、グリフォセート、グリフォセート−イソプロピルアンモニウム、H−9201、ハロサフェン、ハロスルフロン、ハロスルフロン−メチル、ハロキシホップ、ハロキシホップ−P、ハロキシホップ−エトキシエチル、ハロキシホップ−P−エトキシエチル、ハロキシホップ−メチル、ハロキシホップ−P−メチル、ヘキサジノン、HNPC−9908、HOK−201、HW−02、イマザメタベンズ、イマザメタベンズ−メチル、イマザモックス、イマザピック、イマザピル、イマザキン、イマゼタピル、イマゾスルフロン、イナベンフィド、インダノファン、インドール酢酸(IAA)、4−インドール−3−イル酪酸(IBA)、ヨードスルフロン、ヨードスルフロン−メチル−ナトリウム、アイオキシニル、イソカルバミド、イソプロパリン、イソプロツロン、イソウロン、イソキサベン、イソキサクロルトール、イソキサフルトール、イソキサピリホップ、KUH−043、KUH−071、カルブチレート、ケトスプラドックス(ketospiradox)、ラクトフェン、レナシル、リニュロン、マレイン酸ヒドラジド、MCPA、MCPB、MCPB−メチル、−エチルおよび−ナトリウム、メコプロップ、メコプロップ−ナトリウム、メコプロップ−ブトチル(butotyl)、メコプロップ−P−ブトチル、メコプロップ−P−ジメチルアンモニウム、メコプロップ−P−2−エチルヘキシル、メコプロップ−P−カリウム、メフェナセット、メフルイジド、メピコート−クロリド、メソスルフロン、メソスルフロン−メチル、メタベンズチアズロン、メタム、メタミホップ、メタミトロン、メタザクロール、メタゾール、メトキシフェノン、メチルダイムロン、1−メチルシクロプロペン、メチルイソチオシアネート、メトベンズロン、メトベンズロン、メトブロムロン、メトラクロール、S−メトラクロール、メトスラム、メトキスロン、メトリブジン、メトスルフロン、メトスルフロン−メチル、モリネート、モナリッド、モノカルバミド、モノカルバミド二水素硫酸塩、モノリニュロン、モノスルフロン、モニュロン、MT128、MT−5950、すなわちN−[3−クロロ−4−(1−メチルエチル)−フェニル]−2−メチルペンタンアミド、NGGC−011、ナプロアニリド、ナプロパミド、ナプタラム、NC−310、すなわち4−(2,4−ジクロロベンゾイル)−1−メチル−5−ベンジルオキシピラゾール、ネブロン、ニコスルフロン、ニピラクロフェン、ニトラリン、ニトロフェン、ナトリウム−ニトロフェノレート(異性体混合物)、ニトロフルオルフェン、ノナン酸、ノルフルラゾン、オルベンカルブ、オルトスルファムロン、オリザリン、オキサジアルギル、オキサジアゾン、オキサスルフロン、オキサジクロメホン、オキシフローフェン、パクロブトラゾール、パラコート、パラコートジクロリド、ペラルゴン酸(ノナン酸)、ペンディメタリン、ペンドラリン(pendralin)、ペノキススラム、ペンタノクロール、ペントキサゾン、ペルフルイドン、ペトキサミド、フェニソファム、フェンメディファム、フェンメディファム−エチル、ピクロラム、ピコリナフェン、ピノキサデン、ピペロホス、ピリフェノップ(pirifenop)、ピリフェノップ−ブチル、プレチラクロール、プリミスルフロン、プリミスルフロン−メチル、プロベナゾール、プロフルアゾール、プロシアジン、プロジアミン、プリフルラリン(prifluraline)、プロホキシジム、プロヘキサジオン、プロヘキサジオン−カルシウム、プロヒドロジャスモン(prohydrojasmone)、プロメトン、プロメトリン、プロパクロール、プロパニル、プロパキザホップ、プロパジン、プロファム、プロピソクロール、プロポキシカルバゾン、プロポキシカルバゾン−ナトリウム、プロピザミド、プロスルファリン、プロスルホカルブ、プロスルフロン、プリナクロール、ピラクロニル、ピラフルフェン、ピラフルフェン−エチル、ピラゾリネートピラゾレート(ピラゾレート)、ピラゾスルフロン−エチル、ピラゾキシフェン、ピリバムベンズ(pyribambenz)、ピリバムベンズ−イソプロピル、ピリベンゾキシム、ピリブチカルブ、ピリダフォル、ピリデート、ピリフタリド、ピリミノバック、ピリミノバック−メチル、ピリミスルファン、ピリチオバック、ピリチオバック−ナトリウム、ピロキサスルホン、ピロキススラム、キンクロラック、キンメラック、キノクラミン、キザロホップ、キザロホップ−エチル、キザロホップ−P、キザロホップ−P−エチル、キザロホップ−P−テフリル、リムスルフロン、サフルフェナシル、セクブメトン、セトキシジム、シデュロン、シマジン、シメトリン、SN−106279、スルファレート(CDEC)、スルフェントラゾン、スルホメツロン、スルホメツロン−メチル、スルホセート(グリフォセート−トリメシウム)、スルホスルフロン、SYN−523、SYP−249、SYP−298、SYP−300、テブタム、テブチウロン、テクナゼン、テプラロキシジム、ターバシル、テルブカルブ、テルブクロル、テルブメトン、テルブチラジン、テルブトリン、TH−547、テニルクロール、チアフルアミド(thiafluamide)、チアザフルロン、チアゾピル、チジアジミン、チジアズロン、チエンカルバゾン、チエンカルバゾン−メチル、チフェンスルフロン、チフェンスルフロン−メチル、チオベンカルブ、チオカルバジル、トラルコキシジム、トリアレート、トリアスルフロン、トリアジフラム、トリアゾフェナミド、トリベニュロン、トリベニュロン−メチル、トリクロロ酢酸(TCA)、トリクロピル、トリジファン、トリエタジン、トリフロキシスルフロン、トリフロキシスルフロン−ナトリウム、トリフルラリン、トリフルスルフロン、トリフルスルフロン−メチル、トリメツロン、トリネキサパック、トリネキサパック−エチル、トリトスルフロン、チトデフ(tsitodef)、ウニコナゾール、ウニコナゾール−P、バーナレート、ZJ−0166、ZJ−0270、ZJ−0543、ZJ−0862および以下の化合物。
A)式(S−I)
[式中、記号および指数は以下の意味を有する:
nAは、0〜5、好ましくは0〜3の自然数であり;
RA 1は、ハロゲン、(C1−C4)−アルキル、(C1−C4)−アルコキシ、ニトロまたは(C1−C4)−ハロアルキルであり;
WAは、NまたはO型のヘテロ環原子1〜3個を有する、部分不飽和または芳香族五員複素環から成る群より選択される、少なくとも1個の窒素原子および最大で1個の酸素原子が環に存在する不飽和または飽和の二価複素環式基、好ましくは(WA 1)〜(WA 4)、
から成る群からの基であり、
mAは、0または1であり;
RA 2は、ORA 3、SRA 3もしくはNRA 3RA 4であるか、あるいは少なくとも1個の窒素原子および好ましくはOおよびSから成る群からの最大3個のヘテロ原子を有し、(S−I)中のカルボニル基に窒素原子を介して結合している、置換されていないか、または(C1−C4)−アルキル、(C1−C4)−アルコキシおよび場合により置換されたフェニルから成る群からの基によって、好ましくは式ORA 3、NHRA 4もしくはN(CH3)2、特に式ORA 3の基によって置換されている、飽和または不飽和三〜七員複素環であり;
RA 3は、水素、または好ましくは合計1〜18個の炭素原子を有する非置換もしくは置換脂肪族炭化水素基であり;
RA 4は、水素、(C1−C6)−アルキル、(C1−C6)−アルコキシまたは置換もしくは非置換フェニルであり;
RA 5は、H、(C1−C8)−アルキル、(C1−C8)−ハロアルキル)、(C1−C4)−アルコキシ−(C1−C8)−アルキル、シアノまたはCOORA 9であり、ここで、RA 9は、水素、(C1−C8)−アルキル、(C1−C8)−ハロアルキル、(C1−C4)−アルコキシ−(C1−C4)−アルキル、(C1−C6)−ヒドロキシアルキル、(C3−C12)−シクロアルキルまたはトリ−(C1−C4)−アルキルシリルであり;
RA 6、RA 7、RA 8は、同一であるかまたは異なり、水素、(C1−C8)−アルキル、(C1−C8)−ハロアルキル、(C3−C12)−シクロアルキルまたは置換もしくは非置換フェニルである]で示される化合物;
好ましくは:
a)ジクロロフェニルピラゾリン−3−カルボン酸型の化合物、好ましくはエチル1−(2,4−ジクロロフェニル)−5−(エトキシカルボニル)−5−メチル−2−ピラゾリン−3−カルボキシレート(S1−1)などの化合物(「メフェンピル−ジエチル」、Pestic. Man.参照)、および国際公開公報第91/07874号に記載されているような関連化合物;
b)ジクロロフェニルピラゾールカルボン酸の誘導体、好ましくはエチル1−(2,4−ジクロロフェニル)−5−メチルピラゾール−3−カルボキシレート(S1−2)、エチル1−(2,4−ジクロロフェニル)−5−イソプロピルピラゾール−3−カルボキシレート(S1−3)、エチル1−(2,4−ジクロロフェニル)−5−(1,1−ジメチルエチル)ピラゾール−3−カルボキシレート(S1−4)、エチル1−(2,4−ジクロロフェニル)−5−フェニルピラゾール−3−カルボキシレート(S1−5)ならびにEP-A-333 131およびEP-A-269 806に記載されているような関連化合物などの化合物;
c)トリアゾールカルボン酸型の化合物、好ましくはフェンクロラゾール(−エチルエステル)、すなわちエチル1−(2,4−ジクロロフェニル)−5−トリクロロ−メチル−(1H)−1,2,4−トリアゾール−3−カルボキシレート(S1−6)などの化合物、ならびにEP-A-174 562およびEP-A-346 620に記載されているような関連化合物;
d)5−ベンジル−2−イソキサゾリン−3−カルボン酸または5−フェニル−2−イソキサゾリン−3−カルボン酸または5,5−ジフェニル−2−イソキサゾリン−3−カルボン酸型の化合物、好ましくはエチル5−(2,4−ジクロロベンジル)−2−イソキサゾリン−3−カルボキシレート(S1−7)もしくはエチル5−フェニル−2−イソキサゾリン−3−カルボキシレート(S1−8)などの化合物および国際公開公報第91/08202号に記載されているような関連化合物、または特許出願である国際公開公報第−A−95/07897号に記載されているようなエチル5,5−ジフェニル−2−イソキサゾリンカルボキシレート(S1−9)(「イソキサジフェン−エチル」)もしくはn−プロピル5,5−ジフェニル−2−イソキサゾリンカルボキシレート(S1−10)もしくはエチル5−(4−フルオロフェニル)−5−フェニル−2−イソキサゾリン−3−カルボキシレート(S1−11)、
[式中、記号および指数は以下の意味を有する:
RB 1は、ハロゲン、(C1−C4)−アルキル、(C1−C4)−アルコキシ、ニトロまたは(C1−C4)−ハロアルキルであり;
nBは、0〜5、好ましくは0〜3の自然数であり;
RB 2は、ORB 3、SRB 3もしくはNRB 3RB 4であるか、あるいは少なくとも1個の窒素原子および好ましくはOおよびSから成る群からの最大3個のヘテロ原子を有し、(S−II)中のカルボニル基に窒素原子を介して結合している、置換されていないか、または(C1−C4)−アルキル、(C1−C4)−アルコキシもしくは場合により置換されたフェニルからの基によって、好ましくは式ORB 3、NHRB 4もしくはN(CH3)2、特に式ORB 3の基によって置換されている、飽和または不飽和三〜七員複素環であり;
RB 3は、水素、または好ましくは合計1〜18個の炭素原子を有する非置換もしくは置換脂肪族炭化水素基であり;
RB 4は、は、水素、(C1−C6)−アルキル、(C1−C6)−アルコキシまたは置換もしくは非置換フェニルであり;
TBは、非置換の、あるいは1個もしくは2個の(C1−C4)−アルキル基によって、または[(C1−C3)−アルコキシ]カルボニルによって置換されている(C1−またはC2)−アルカンジイル鎖である]で示されるキノリン誘導体;
好ましくは:
a)8−キノリンオキシ酢酸型の化合物(S2)、好ましくは
1−メチルヘキシル(5−クロロ−8−キノリンオキシ)アセテート(慣用名「クロキントセット−メキシル」(S2−1)(Pestic. Man.参照)、
1,3−ジメチルブタ−1−イル(5−クロロ−8−キノリンオキシ)アセテート(S2−2)、
4−アリルオキシブチル(5−クロロ−8−キノリンオキシ)アセテート(S2−3)、
1−アリルオキシプロパ−2−イル(5−クロロ−8−キノリンオキシ)アセテート−(S2−4)、
エチル(5−クロロ−8−キノリンオキシ)アセテート(S2−5)、
メチル(5−クロロ−8−キノリンオキシ)アセテート(S2−6)、
アリル(5−クロロ−8−キノリンオキシ)アセテート(S2−7)、
2−(2−プロピリデンイミノキシ)−1−エチル(5−クロロ−8−キノリンオキシ)アセテート(S2−8)、2−オキソプロパ−1−イル(5−クロロ−8−キノリンオキシ)アセテート(S2−9)およびEP-A-86 750、EP-A-94 349およびEP-A-191 736またはEP-A-0 492 366に記載されているような関連化合物、ならびにまた国際公開公報第−A−2002/034048号に記載されているようなそれらの水和物および塩。
b)(5−クロロ−8−キノリンオキシ)マロン酸型の化合物、好ましくはジエチル(5−クロロ−8−キノリンオキシ)マロネート、ジアリル(5−クロロ−8キノリンオキシ)マロネート、メチルエチル(5−クロロ−8−キノリンオキシ)マロネートなどの化合物およびEP-A-0 582 198に記載されているような関連化合物、
[式中、記号および指数は以下の意味を有する:
RC 1は、(C1−C4)−アルキル、(C1−C4)−ハロアルキル、(C2−C4)−アルケニル、(C2−C4)−ハロアルケニル、(C3−C7)−シクロアルキル、好ましくはジクロロメチルであり;
RC 2、RC 3は、同一であるか、または異なり、水素、(C1−C4)−アルキル、(C2−C4)−アルケニル、(C2−C4)−アルキニル、(C1−C4)−ハロアルキル、(C2−C4)−ハロアルケニル、(C1−C4)−アルキルカルバモイル−(C1−C4)−アルキル、(C2−C4)−アルケニルカルバモイル−(C1−C4)−アルキル、(C1−C4)−アルコキシ−(C1−C4)−アルキル、ジオキソラニル−(C1−C4)−アルキル、チアゾリル、フリル、フリルアルキル、チエニル、ピペリジル、置換もしくは非置換フェニルであるか、またはRC 2およびRC 3は、一緒になって置換もしくは非置換複素環、好ましくはオキサゾリジン、チアゾリジン、ピペリジン、モルホリン、ヘキサヒドロピリミジンもしくはベンゾキサジン環を形成する]で示される化合物;
好ましくは:
出芽前薬害軽減剤(土壌作用性薬害軽減剤)として多くの場合に使用されるジクロロアセトアミド型の活性化合物、例えば、
「ジクロルミド」(Pestic.Man.参照)(=N,N−ジアリル−2,2−ジクロロアセトアミド)、
「R−29148」(=3−ジクロロアセチル−2,2,5−トリメチル−1,3−オキサゾリジン、Stauffer製)、
「R−28725」(=3−ジクロロアセチル−2,2,−ジメチル−1,3−オキサゾリジン、Stauffer製)、
「ベノキサコル」(Pestic. Man.参照)(=4−ジクロロアセチル−3,4−ジヒドロ−3−メチル−2H−1,4−ベンゾキサジン)、
「PPG−1292」(=N−アリル−N−[(1,3−ジオキソラン−2−イル)メチル]ジクロロアセトアミド、PPG Industries製)、
「DKA−24」(=N−アリル−N−[(アリルアミノカルボニル)メチル]ジクロロアセトアミド、Sagro-Chem製)、
「AD−67」または「MON4660」(=3−ジクロロアセチル−1−オキサ−3−アザ−スピロ[4,5]デカン、NitrokemiaまたはMonsanto製)、
「TI−35」(=1−ジクロロアセチルアゼパン、TRI-Chemical RT製)
「ジクロノン(diclonon)」(ジシクロノン)または「BAS145138」または「LAB145138」(=3−ジクロロアセチル−2,5,5−トリメチル−1,3−ジアザビシクロ[4.3.0]ノナン、BASF製)および
「フリラゾール」または「MON13900」(Pestic. Man.参照)(=(RS)−3−ジクロロアセチル−5−(2−フリル)−2,2−ジメチルオキサゾリジン)など、
[式中、
XDは、CHまたはNであり;
RD 1は、CO−NRD 5RD 6またはNHCO−RD 7であり;
RD 2は、ハロゲン、(C1−C4)−ハロアルキル、(C1−C4)−ハロアルコキシ、ニトロ、(C1−C4)−アルキル、(C1−C4)−アルコキシ、(C1−C4)−アルキルスルホニル、(C1−C4)−アルコキシカルボニルまたは(C1−C4)−アルキルカルボニルであり;
RD 3は、水素、(C1−C4)−アルキル、(C2−C4)−アルケニルまたは(C2−C4)−アルキニルであり;
RD 4は、ハロゲン、ニトロ、(C1−C4)−アルキル、(C1−C4)−ハロアルキル、(C1−C4)−ハロアルコキシ、(C3−C6)−シクロアルキル、フェニル、(C1−C4)-アルコキシ、シアノ、(C1−C4)-アルキルチオ、(C1−C4)−アルキルスルフィニル、(C1−C4)−アルキルスルホニル、(C1−C4)−アルコキシカルボニルまたは(C1−C4)−アルキルカルボニルであり;
RD 5は、水素、(C1−C6)−アルキル、(C3−C6)−シクロアルキル、(C2−C6)−アルケニル、(C2−C6)−アルキニル、(C5−C6)−シクロアルケニル、フェニル、または窒素、酸素および硫黄から成る群からのvDヘテロ原子を含有する三〜六員ヘテロシクリルであり、ここで、最後に記載したものから7個までの基は、ハロゲン、(C1−C6)−アルコキシ、(C1−C6)−ハロアルコキシ、(C1−C2)−アルキルスルフィニル、(C1−C2)−アルキルスルホニル、(C3−C6)−シクロアルキル、(C1−C4)−アルコキシカルボニル、(C1−C4)−アルキルカルボニルおよびフェニル、ならびに環式基の場合、さらに(C1−C4)−アルキルおよび(C1−C4)−ハロアルキルから成る群からのvD置換基によって置換されており;
RD 6は、水素、(C1−C6)−アルキル、(C2−C6)−アルケニルまたは(C2−C6)−アルキニルであり、ここで、最後に記載したものから3個までの基は、ハロゲン、ヒドロキシ、(C1−C4)−アルキル、(C1−C4)−アルコキシおよび(C1−C4)−アルキルチオから成る群からのvD基によって置換されているか、または
RD 5およびRD 6は、それらを担持している窒素原子と一緒になってピロリジニルまたはピペリジニル基を形成し;
RD 7は、水素、(C1−C4)−アルキルアミノ、ジ−(C1−C4)−アルキルアミノ、(C1−C6)−アルキル、(C3−C6)−シクロアルキルであり、ここで、最後に記載したものから2個までの基は、ハロゲン、(C1−C4)−アルコキシ、ハロゲン−(C1−C6)−アルコキシおよび(C1−C4)−アルキルチオ、ならびに環式基の場合、さらに(C1−C4)−アルキルおよび(C1−C4)−ハロアルキルから成る群からのvD置換基によって置換されており;
nDは、0、1または2であり;
mDは、1または2であり;
vDは、0、1、2または3である]で示されるN−アシルスルホンアミドおよびそれらの塩;
これらの中で、N−アシルスルホンアミド型の、例えば国際公開公報第97/45016号から公知の、例えば下記式(S−V)
[式中、
RD 7は、(C1−C6)−アルキル、(C3−C6)−シクロアルキルであり、ここで、最後に記載したものから2個までの基は、ハロゲン、(C1−C4)−アルコキシ、ハロゲン−(C1−C6)−アルコキシおよび(C1−C4)−アルキルチオ、ならびに環式基の場合、さらに(C1−C4)−アルキルおよび(C1−C4)−ハロアルキルから成る群からのvD置換基によって置換されており;
RD 4は、ハロゲン、(C1−C4)−アルキル、(C1−C4)−アルコキシ、CF3であり;
mDは、1または2であり;
vDは、0、1、2または3である]で示される化合物;
およびまた、
例えば国際公開公報第99/16744号から公知の、例えば下記式(S−VI)
で示されるアシルスルファモイルベンズアミド、
例えば
RD 5=シクロプロピルおよび(RD 4)=2−OMe(「シプロスルファミド」、S3−1)であり
RD 5=シクロプロピルおよび(RD 4)=5−Cl−2−OMe(S3−2)であり、
RD 5=エチルおよび(RD 4)=2−OMe(S3−3)であり、
RD 5=イソプロピルおよび(RD 4)=5−Cl−2−OMe(S3−4)であり、かつ
RD 5=イソプロピルおよび(RD 4)=2−OMe(S3−5)である化合物;
さらびにまた
例えばEP-A-365484から公知の、式(S−VII)
[式中、
RD 8およびRD 9は、相互に独立して、水素、(C1−C8)−アルキル、(C3−C8)−シクロアルキル、(C3−C6)−アルケニル、(C3−C6)−アルキニルであり、
RD 4は、ハロゲン、(C1−C4)−アルキル、(C1−C4)−アルコキシ、CF3であり、
mDは、1または2である]で示されるN−アシルスルファモイルフェニル尿素型の化合物;
これらの中で特に
1−[4−(N−2−メトキシベンゾイルスルファモイル)フェニル]−3−メチル尿素、
1−[4−(N−2−メトキシベンゾイルスルファモイル)フェニル]−3,3−ジメチル尿素、
1−[4−(N−4,5−ジメチルベンゾイルスルファモイル)フェニル]−3−メチル尿素、
1−[4−(N−ナフトイルスルファモイル)フェニル]−3,3−ジメチル尿素が好まれる、
国際公開公報第2004084631号、国際公開公報第2005015994号、国際公開公報第2006007981号、国際公開公報第2005016001号に記載されているようなエチル3,4,5−トリアセトキシベンゾエート、3,5−ジメトキシ−4−ヒドロキシ安息香酸、3,5−ジヒドロキシ安息香酸、4−ヒドロキシサリチル酸、4−フルオロサリチル酸(salicyclic acid)、1,2−ジヒドロ−2−オキソ−6−トリフルオロメチルピリジン−3−カルボキサミド、2−ヒドロキシ桂皮酸、2,4−ジクロロ桂皮酸;
国際公開公報第2005112630号に記載されているような1−メチル−3−(2−チエニル)−1,2−ジヒドロキノキサリン−2−オン、1−メチル−3−(2−チエニル)−1,2−ジヒドロキノキサリン−2−チオン、1−(2−アミノエチル)−3−(2−チエニル)−1,2−ジヒドロキノキサリン−2−オンヒドロクロリド、1−(2−メチルスルホニルアミノエチル)−3−(2−チエニル)−1,2−ジヒドロ−キノキサリン−2−オンからの活性化合物、
「ジメピペレート」または「MY−93」(Pestic. Man.参照)(=S−1−メチル−1−フェニルエチルピペリジン−1−チオカルボキシレート)(除草剤モリネートによる被害に対するイネ用薬害軽減剤として公知である)、
「ダイムロン」または「SK23」(Pestic. Man.参照)(=1−(1−メチル−1−フェニルエチル)−3−p−トリル−尿素)(除草剤イマゾスルフロンによる被害に対するイネ用薬害軽減剤として公知である)
「クミルロン」=「JC−940」(=3−(2−クロロフェニルメチル)−1−(1−メチル−1−フェニル−エチル)尿素、特開昭60−087254参照)(いくつかの除草剤による被害に対するイネ用薬害軽減剤として公知である)、
「メトキシフェノン」または「NK049」(=3,3’−ジメチル−4−メトキシベンゾフェノン)(いくつかの除草剤による被害に対するイネ用薬害軽減剤として公知である)、
「CSB」(=1−ブロモ−4−(クロロメチルスルホニル)ベンゼン)(CAS登録番号54091−06−4、Kumiai製)(イネにおけるいくつかの除草剤による障害に対する薬害軽減剤として公知である)、
[式中、記号および指数は以下の意味を有する:
RK 1、RK 2は、相互に独立してハロゲン、(C1−C4)−アルキル、(C1−C4)−アルコキシ、(C1−C4)−ハロアルキル、(C1−C4)−アルキルアミノ、ジ−(C1−C4)−アルキルアミノ、ニトロであり;
AKは、COORK 3またはCOORK 4であり、
RK 3、RK 4は、相互に独立して水素、(C1−C4)−アルキル、(C2−C6)−アルケニル、(C2−C4)−アルキニル、シアノアルキル、(C1−C4)−ハロアルキル、フェニル、ニトロフェニル、ベンジル、ハロベンジル、ピリジニルアルキルまたはアルキルアンモニウムであり、
nK 1は、0または1であり、
nK 2、nK 3は、相互に独立して0、1または2である]で示される化合物、
好ましくは:メチル(ジフェニルメトキシ)アセテート(CAS登録番号:41858−19−9)、
[式中、記号および指数は以下の意味を有する:
XLは、CHまたはNであり、
nLは、X=Nの場合0〜4の整数であり、X=CHの場合0〜5の整数であり、
RL 1は、ハロゲン、(C1−C4)−アルキル、(C1−C4)−ハロアルキル、(C1−C4)−アルコキシ、(C1−C4)−ハロアルコキシ、ニトロ、(C1−C4)−アルキルチオ、(C1−C4)−アルキルスルホニル、(C1−C4)−アルコキシカルボニル、場合により置換されたフェニル、場合により置換されたフェノキシであり、
RL 2は、水素または(C1−C4)−アルキルであり、
RL 3は、水素、(C1−C8)−アルキル、(C2−C4)−アルケニル、(C2−C4)−アルキニルまたはアリールであり、ここで、上記炭素含有基のそれぞれは、置換されていないか、またはハロゲンおよびアルコキシから成る群からの、1個もしくは複数、好ましくは最大3個の同一のもしくは異なる基によって置換されている]で示される化合物またはその塩、
[式中、
RN 1は、ハロゲン、(C1−C4)−アルキル、メトキシ、ニトロ、シアノ、CF3、OCF3であり、
Y、Zは、相互に独立してOまたはSであり、
nNは、0〜4の整数であり、
RN 2は、(C1−C16)−アルキル、(C2−C6)−アルケニル、(C3−C6)−シクロアルキル、アリール、ベンジル、ハロベンジルであり、
RN 3は、水素、(C1−C6)アルキルである]で示される化合物、
1,8−ナフタル酸無水物、
O,O−ジエチルS−2−エチルチオエチルホスホロジチオエート(ジスルホトン)、
4−クロロフェニルメチルカルバメート(メフェネート(mephenate))、
O,O−ジエチルO−フェニルホスホロチオエート(ジエトレート(dietholate))、
4−カルボキシ−3,4−ジヒドロ−2H−1−ベンゾピラン−4−酢酸(CL−304415、CAS登録番号:31541−57−8)、
2−プロペニル1−オキサ−4−アザスピロ[4.5]デカン−4−カルボジチオエート(MG−838、CAS登録番号:133993−74−5)、
メチル[(3−オキソ−1H−2−ベンゾチオピラン−4(3H)−イリデン)メトキシ]アセテート(国際公開公報第−A−98/13361号から;CAS登録番号:205121−04−6)、
シアノメトキシイミノ(フェニル)アセトニトリル(シオメトリニル)、
1,3−ジオキソラン−2−イルメトキシイミノ(フェニル)アセトニトリル(オキサベトリニル)、
4’−クロロ−2,2,2−トリフルオロアセトフェノンO−1,3−ジオキソラン−2−イルメチルオキシム(フルキソフェニム)、
4,6−ジクロロ−2−フェニルピリミジン(フェンクロリム)、
ベンジル2−クロロ−4−トリフルオロメチル−1,3−チアゾール−5−カルボキシレート(フルラゾール)、
2−ジクロロメチル−2−メチル−1,3−ジオキソラン(MG−191)。
配列番号1:Blepharisma japonicum HPPDをコードする核酸配列
配列番号2:1個のアラニンおよび6個のヒスチジンアミノ酸をコードする核酸を含有する、E. coliのために最適化された、Blepharisma japonicum HPPDをコードする核酸配列
配列番号3:5’末端に最適化トランジットペプチドおよびHISタグをコードする核酸配列を含有する、Nicotiana tabaccumのために最適化されたBlepharisma japonicum HPPDをコードする核酸配列
配列番号4:配列番号1から得られたBlepharisma japonicum HPPDのアミノ酸配列
配列番号5:配列番号2によってコードされるタンパク質
配列番号6:OTP(最適化トランジットペプチド(国際公開公報第2009/144079号))と融合されたBlepharisma japonicum HPPDのアミノ酸配列(配列番号4)
配列番号7:配列番号3によってコードされるタンパク質
配列番号8:Arabidopsis thaliana HPPDをコードする核酸配列
配列番号9:Arabidopsis thaliana HPPDのアミノ酸配列
配列番号10:配列番号8によってコードされるタンパク質+最初のアミノ酸メチオニンのすぐ下流の追加的なアラニンおよびそれに続く6個のヒスチジンアミノ酸
配列番号11:配列番号9で示されるタンパク質+そのタンパク質のN末端に位置するOTP配列
配列番号12:配列番号10で示されるタンパク質+そのタンパク質のN末端に直接位置するOTP配列
配列番号13:プライマー配列Xho−OTP−for
配列番号14:プライマー配列NcoI−OTP−rev
配列番号15:双子葉植物のために最適化されたBlepharisma japonicum HPPDをコードする核酸配列
配列番号16:Zea mays植物のために最適化されたBlepharisma japonicum HPPDをコードする核酸配列
配列番号17:Brassica napus植物のために最適化されたBlepharisma japonicum HPPDをコードする核酸配列
配列番号18:Beta vulgaris植物のために最適化されたBlepharisma japonicum HPPDをコードする核酸配列
配列番号19:Gossypium hirsutum植物のために最適化されたBlepharisma japonicum HPPDをコードする核酸配列
配列番号20:Glycine max植物のために最適化されたBlepharisma japonicum HPPDをコードする核酸配列
配列番号21:Hordeum vulgare植物のために最適化されたBlepharisma japonicum HPPDをコードする核酸配列
配列番号22:Oryza sativa植物のために最適化されたBlepharisma japonicum HPPDをコードする核酸配列
配列番号23:Triticum aestivum植物のために最適化されたBlepharisma japonicum HPPDをコードする核酸配列
本発明の様々な局面は、以下の実験実施例の助けを借りると、よりよく理解される。下のこれらの実施例に記載される全ての方法または操作は、例として示され、同じまたは類似の結果を得るために利用可能な種々の方法から選ばれたものに対応する。この選ばれたものは、結果の質に影響を及ぼさず、その結果として、同一または類似の結果を得るために技術者は任意の適切な方法を使用することができる。DNAフラグメントを操作するための方法の大部分は、Greene Publishing Associates and Wiley Interscience (1989)出版の"Current Protocols in Molecular Biology" Volumes 1 and 2, Ausubel F.M. et al.またはMolecular Cloning, T. Maniatis, E.F. Fritsch, J. Sambrook, 1982、またはSambrook J. and Russell D., 2001, Molecular Cloning: a laboratory manual (Third edition)に記載されている。
配列番号5のBlepharisma japonicum HPPD(FMP37eと名付ける)および配列番号10によって確認されるArabidopsis thaliana HPPDの調製
最初にArabidopsis thaliana At HPPDコード配列(1335bp;Genebank AF047834;国際公開公報第96/38567号)を発現ベクターpQE−30(QIAGEN, Hilden, Germany)の制限部位BamHIとHindIIIの間にクローニングした。得られたベクターを「pQE30−AtHPPD」と呼んだ。
細胞の溶解
細菌細胞壁を形成するペプチドグリカンにおけるN−アセチルムラミン酸とN−アセチル−D−グルコサミン残基の間の1,4−β−結合を切断する酵素であるリゾチームを使用して細胞を溶解させた。次に、細菌細胞の内圧によって細胞膜は破壊された。加えて、溶解緩衝液は、タンパク質を損傷せずに全ての形態のDNAおよびRNAを加水分解することによって細胞溶解液の粘度を大きく減少させるエンドヌクレアーゼであるBenzonase(登録商標)ヌクレアーゼを含有した。ネイティブな条件下の溶解を氷上で実施した。His6タグ付きタンパク質を精製するために、QIAexpress(登録商標)Ni-NTA Fast Start Kitをユーザーマニュアルの説明にしたがって使用した。
溶解反応物の遠心分離後に得られた透明細胞溶解液(10mL)を、QIAexpress(登録商標)Ni-NTA Fast Startキット(Qiagen, Hilden, Germany)からのNi-NTA Fast Startカラムにロードし、説明マニュアルにしたがって精製を実施した。His6タグ付きタンパク質を溶離緩衝液2.5mLで溶離させた。
Ni-NTA Fast Startカラムから2.5mLの溶離緩衝液で溶離したHPPD溶液を、ユーザーマニュアルの説明にしたがってSephadex G-25 PD-10カラム(GE Healthcare, Freiburg, Germany)に適用した。全試料がゲルベッドに入った後に、3.5mLの保存緩衝液で溶離を行った。脱塩カラムから溶離したHPPD溶液を1mLの分割量で−80℃で凍結させた。
タンパク質濃度は、標準Bradfordアッセイを使用して決定した(Bradford, (1976), Anal Biochem 72: 248-254)。
約10μgのタンパク質がロードされたゲルNuPAGE(登録商標)Novex 4〜12%ビス−トリスゲル(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)を使用したSDS−PAGEタンパク質ゲル電気泳動によって、溶離したタンパク質の完全性をチェックした。10μLのLaemmli試料緩衝液を1〜10μLのタンパク質溶液に添加し、その混合物を90℃で10分間インキュベーションした。短い遠心ステップの後に、NuPAGE(登録商標)MOPS SDS泳動用緩衝液(20×溶液からddH2Oで希釈)を満たしたXCell SureLock(商標)Novex Mini-Cellゲルチャンバー中で予め固定しておいたSDSゲルのスロットに混合物全体をロードした。次に、ゲルチャンバーに150ボルトの電圧を1時間印加した。タンパク質のバンドを染色するために、ゲルをCoomassie Brilliant Blue R-250染色溶液中に浸した。ポリアクリルアミドゲルの脱染のために、タンパク質のバンドが白いゲル上に青く見えるまでそれをCoomassie Brilliant Blue R-250脱染溶液中に浸した。
HPPD阻害剤に対するHPPD酵素「配列番号5」および「配列番号10」の耐性の動態的特徴づけおよび評価
標準的な分光光度アッセイ(国際公開公報第2009/144079号に広く記載されている方法)によってHPPD活性をチェックした。
異なるHPPD酵素調製物のKm、Vmax、およびkcat値ならびに異なるHPPD阻害剤のKi、K1=Kon、およびK−1=Koffを、HPPD活性測定のためのHPLCアッセイを使用して決定した。アッセイ混合物は、体積1mlの150mMトリス−HCl緩衝液(pH7.8)中に10mMアスコルビン酸ナトリウム、650ユニットのウシカタラーゼ(Sigma C30(Sigma-Aldrich, Munich,Germany)、34mgタンパク質/ml、23,000ユニット/mg)、ならびに適量のHPP、精製HPPD酵素およびHPPD阻害剤を含有した。Km、Vmax、およびkcat値の決定のために、アッセイ混合物中のHPP濃度は、10から400μMの間を変動した。Ki、K1=Kon、およびK−1=Koff値の決定のために、2mM HPPを使用した。アッセイ混合物にHPPD酵素を添加することによって全てのアッセイを開始し、0から240秒の一連の時間でに、20μlの10%過塩素酸の入った反応アッセイチューブに200μlの反応混合物を添加することによって停止した。沈殿したタンパク質を10,000gで5分間遠心分離することによってペレットにした。上清100μlを、10%メタノール、0.1%トリフルオロ酢酸(緩衝液A)で平衡化した250×4mm Knauer(Berlin, Germany)Eurospher 100-5 C18-カラムにロードした。同じく1.5ml/minで緩衝液Aを用いた4分間の洗浄に続く95%メタノールを用いた3分間の洗浄および緩衝液Aを用いたさらなる2分間の洗浄を用いて、カラムを溶離させた。HGA(ホモゲンチジン酸)およびHPP(ヒドロキシフェニルピルビン酸)の溶離を292nmでモニターした。HGAは約5分で溶離し、HPPはその後溶離する。HGA濃度に対するHGAピークの292nmの吸光度を較正するために、標準セットの濃度のHGAを使用して標準曲線を提供した。KmおよびVmax値の決定のために、形成したHGAを時間に対してプロットしたものから、異なる基質濃度でのHPPD反応の初速度を決定し、ID Business Solutions Ltd.(www.idbs.com)XLfitソフトウェアスイートを使用してそれを単一反応物酵素のためのMichaelis-Mentenの式にあてはめた。Ki、K1=Kon、およびK−1=Koff値の決定のために、異なる阻害剤濃度でのHPPD反応の時間経過を、ID Business Solutions Ltd. XLfitソフトウェアスイートを使用して強結合阻害剤についてのメカニズムA競合阻害のための式にあてはめた(Cha, S. (1975) Tight-binding inhibitors - I. Kinetic behaviour. Biochemical Pharmacology 24, 2177-2185)。
下記表1において、「Km」(Michaelis-Menten定数)は、酵素を特徴づけるために使用される速度パラメーターを意味し、それは、最大反応速度の半値を可能にする基質濃度として定義される。Kmは、さらに、反応速度がその最大値の半値(Vmax/2)に達する基質濃度として定義され、その際、Vmaxは、反応の最大速度の意味を有する。Kon=K1は、酵素−基質結合の結合速度定数に等しく、Koff=K−1は、酵素−阻害剤複合体の解離速度定数に等しい。Kiは、阻害定数を定義する。
これに関連して、pI50値は、酵素活性を50%阻害するために必要な阻害剤濃度(モル濃度)のlog値を意味する。
A)キメラ遺伝子の構築
OTPをコードする配列を含有するベクターpRP−RD224(国際公開公報第2009/144079号に広く記載されている)を使用して、制限酵素XhoIの認識部位に対応する核酸配列の上流および制限酵素NcoIの認識部位に対応する核酸配列の下流にPCR介在性結合させた。得られたPCR産物を、ユーザーマニュアルの説明にしたがってベクターpCR(登録商標)-Blunt II-TOPO(登録商標)(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)にクローニングした。結果として生じたベクターを「pCR−TOPO−OTP」と呼んだ。標準的なDNA配列決定により正しい配列が挿入したことを確認した。OTPに対応するDNAを制限酵素NcoIおよびXhoIで消化し、適切なゲル電気泳動によって分離し、NcoIおよびXhoI制限酵素で予めそれ相応に消化しておいたプラスミドpRT100(Toepfer, (1987), Nucleic Acids Res 15:5890)にクローニングした。プラスミドpRT100は、CaMV35SプロモーターおよびCaMV35Sターミネーターを含有している。続いて、結果として生じたベクターを制限酵素NcoIおよびXbaIで消化した。配列番号2に対応するDNAフラグメントを得るために、ベクターpSE420(RI)NX−FMP37e(図1参照)を制限酵素NcoIおよびXbaIに供した。制限酵素HindIIIを採用することによって、結果として生じたベクターを消化し、CaMV35S::OTP::FMP37e::CaMV35−termカセット(図2参照)を、同じ酵素で予め消化して脱リン酸しておいたバイナリーベクターpBin19(Bevan (1984), Nucleic Acids Res. 12:8711-8721.)にサブクローニングした。結果として生じたベクターを「FMP37ebv」と呼んだ。
HPPD阻害剤テンボトリオンをさらに補充された培地に、配列番号11(Arabidopsis thaliana)または配列番号7(Blepharisma japonicum)を含むHPPDをコードする核酸配列を用いてトランスフォーメーションされた細胞から再生した苗条カルスを移植し、6〜12週間根の成長を誘導した。配列番号11によって定義されたHPPD(Arabidopsis thaliana)を含有するイベントのどれも、またトランスフォーメーションされたカルスのどれも、上に示された条件下で根の成長が観察されなかった。これとは逆に同一条件下で、配列番号7によって定義されるHPPDを含有するカルスは、明らかに多数の健康な根を発生した(下記の表5参照)。
HPPD配列番号11(Arabidopsis thaliana)または配列番号7(Blepharisma japonicum)を含有する植物から葉ディスクを切り取り、続いてBAP(1mg/mL;ベンジルアミノプリン)、カルベニシリン(250mg/mL)、セフォタキシン(250mg/mL)を補充され、さらに、以下にリストされたHPPD阻害剤の一つを記載濃度(テンボトリオン(10−6M)、ジケトニトリル(5.10−6M)、メソトリオン(10−6M)およびビシクロピロン(10−6M))で含むMS培地上で、陽性対照としての非HPPD阻害剤を含有する培地と共に標準的な培養条件下で6週間再生させた。実験の終わりに、再生レベルを以下のように評価した:
「−」は、上記阻害剤を補充された培地上で葉ディスクが野生型タバコ植物からの葉ディスクと同じに見えたことを意味する。
「++++」は、阻害剤を有さない培地上で葉ディスクが野生型タバコ植物からの葉ディスクのように見えたことを意味する。
「+」、「++」、および「+++」は、再生した葉ディスクが、阻害剤の存在によって大きく(+)、中程度に(++)および小さく(+++)影響されたことを示す。
実験結果を表6に要約する。
Arabidopsis HPPD酵素またはFMP37 HPPD酵素のいずれかを発現しているトランスジェニック植物系統の調製。除草剤耐性についての温室試験
テンボトリオン、イソキサフルトールおよびビシクロピロンの応答
上記のHPPDをコードするArabidopsis由来遺伝子またはFMP37 HPPDをコードするBlepharisma japonicum由来遺伝子FMP37eのいずれかを含有するT0タバコ植物(実施例3)を温室(28/20℃)に移し、さらに生育させ、種子を産生させた。それらの種子を収穫し、土壌に蒔き(砂およびオスモコートProと混合したED73)、温室中で発芽させた(28/20℃)。3〜4週間後に、上記土壌が入った単一の鉢に小植物を移植した。2週間後に、直径4〜6cmのサイズの植物に
− 硫酸アンモニウムおよび菜種油(raps oil)メチルエステルを補充されたWP20(水和剤20%)製剤から調製したテンボトリオンを100g AI/haで、または
− 硫酸アンモニウムおよび菜種油メチルエステルを補充されたWP20製剤から調製したイソキサフルトールを100g AI/haで、または
− 硫酸アンモニウムおよび菜種油メチルエステルを補充されたWP20製剤から調製したビシクロピロンを100g AI/haで、または
− 硫酸アンモニウムおよび菜種油メチルエステルを補充された、活性成分(AI)を有さないWP20製剤から製造した「ブラインド製剤」
のいずれかをスプレー散布し、次に十分な光条件(20000Lux)の成長チャンバーに移した。
野生型タバコ植物およびHPPDをコードするBlepharisma japonicum FMP37e由来の遺伝子を有するT1タバコ植物の種子を、50g/Lカナマイシンを補充されたMS培地(Murashige and Skoog 1964)上に播種した。4週間後に、発根した緑色小植物を土壌に移植し、上記温室中で3週間成長させ、次に、ビシクロピロン(100g AI/ha)、硫酸アンモニウムおよび菜種油メチルエステルを含有する混合物をスプレー散布した。処理の7日後に除草剤に応答して発生した表現型に基づき、植物を2種類に分類した。クラスIを、除草剤処理に応答して全く被害を示さなかったか、または軽度の被害を示した植物(被害:0〜30%)と定義し、クラスIIを、強い被害から、同じ処理を受けた野生型植物で見られたものと類似の被害を示す植物(被害:31〜100%)と定義した。この場合、少なくとも一つのT−DNAを含有する植物だけを除草処理に供した。一般に、一つだけのT−DNA挿入物を含有する植物であっても、すでに露地供与量のHPPD阻害剤型除草剤ビシクロピロンに対して有意で十分なレベルの耐性を示したことが分かる。
FMP37t(配列番号3)、FMP37t−h(配列番号15)のpBin19へのクローニング
HPPDタンパク質FMP37をコードする、双子葉植物での発現のために最適化されたコドン使用頻度を有する遺伝子を設計し、FMP37t−h(配列番号15)と名付け、OTPをコードする追加的な配列およびその5’末端にHISタグをコードする追加的な配列を有する同遺伝子をFMP37t(配列番号3)と呼んだ。FMP37t−h遺伝子に対応する配列を、制限酵素NcoIおよびXbaIを使用して、CaMV35Sプロモーターおよびターミネーターを含有する前記ベクターpRT100−OTPにクローニングした。結果として生じたベクターをpRT100−OTP−FMP37t−hと呼んだ。制限酵素XhoIおよびXbaIを使用して、FMP37tに対応する配列を前記ベクターpRT100にクローニングし、結果として生じたベクターをpRT100−OTP−FMP37tと呼んだ。PromCaMV35S−OTP−FMP37t−h−TerCaMV35SおよびPromCaMV35S−OTP−HIS6−FMP37t−TerCaMV35Sに対応するフラグメントを、制限酵素SbfIを使用してpBIN19ベクター(上記)にサブクローニングした。バイナリーベクターをそれぞれpBin19−FMP37t−h(図3C)およびpBin19−FMP37t(図3B)と呼んだが、これは、例えば上記タバコ植物などの双子葉植物をトランスフォーメーションするために使用することができる。次に、十分に成長したトランスフォーマント植物を、テンボトリオンなどのHPPD阻害剤型除草剤に対するそれらの耐性について試験する。除草処理に対して観察された病徴の発生を評価し、同条件下での野生型植物の応答と比較する。
一例として、T−DNA PromCaMV35S−OTP−HIS6−FMP37t−TerCaMV35Sを含有する発根植物を標準的な成長条件下の温室に移す。2週間の順化期間の後に、T0植物を、硫酸アンモニウムおよび菜種油メチルエステルを補充されたWP20(水和剤20%)製剤から調製された、100gテンボトリオン/haを含有する混合物で処理する。処理の2週間後に、除草剤の施用による病徴を評価する。植物を4種類に分類する。「0」と評価された、処理された植物は、未処理タバコ植物のように見える。「1」と評価された植物は、除草剤の施用が原因で一過性の軽度ブリーチング表現型を示す。「2」と評価された植物は、永続的な軽度〜重度ブリーチング病徴を示す。最後に、「3」と評価された植物は、同じ処理を受けた野生型タバコ植物のように見える。以下の表9に結果を要約する。
FMP37e(配列番号2)、FMP37t(配列番号3)、FMP37m−h(配列番号16)
a − pHoe6/Ac中のFMP37e:E. coliのために最適化されたコドン使用頻度を有し、その5’末端にOTPをコードする配列およびHisタグをコードする配列を有する遺伝子
CaMV35Sプロモーターのコントロール下でE. coliに発現するために最適化された、HPPD FMP37をコードする遺伝子を含有するベクターpRT100−FMP37eを制限酵素HindIIIで消化した。CaMV35S::OTP::FMP37e::CaMV35S−termカセットを、さらに、予め同制限酵素で消化し、脱リン酸しておいたバイナリーベクターpHoe6/Ac(米国特許第6,316,694号)にクローニングした。結果として生じたベクターをpHoe6/Ac/FMP37eと呼んだ。
pRT100中のFMP37t。Nicotiana tobaccumでの発現のために最適化され、かつ5’末端に最適化トランジットペプチドおよびHISタグをコードする核酸配列を含有する、タンパク質FMP37をコードする遺伝子の一種を取り寄せ、FMP37tと呼んだ。この配列の上流に制限酵素XhoIのための認識配列および下流に制限酵素XbaIのための認識配列を付加した。OTPおよびFMP37tに対応するDNAを制限酵素XhoIおよびXbaIで消化し、適切なゲル電気泳動により分離し、予めXhoIおよびNcoI制限酵素で消化しておいたベクターpRT100(Toepfer,(1987), Nucleic Acid Res 15:5890)にクローニングした。プラスミドpRT100は、CaMV35SプロモーターおよびCaMV35Sターミネーターを含有する。結果として生じたベクターをpRT100−FMP37tと呼び、それを制限酵素HindIIIで消化し、CAMV35S::OTP::FMP37t::CaMV35S−termカセットに対応するDNAを予め制限酵素処理しておいたベクターpHoe6/Ac(米国特許第6.316.694号)にクローニングするためにベクターの残りからそれを分離した。結果として生じたベクターをpHoe6/Ac/FMP37tと呼んだ(図3)。
pRT100−OTP(NcoI−XbaI)中のFMP37mの次にHindIII
FMP37をコードする、単子葉植物での発現のために最適化された遺伝子のFMP37mと呼ばれる変異体を取り寄せ、開始コドンの上流にNcoI制限部位を付加し、一方で停止コドンの下流に制限酵素XbaIのための認識配列を付加した。FMP37mに対応するDNA配列を制限酵素NcoIおよびXbaIで消化し、次にゲル電気泳動によって分離させ、最終的にゲルから単離した。単離されたDNAフラグメントを、同様に予め同じ制限酵素で消化しておいたベクターpRT100−OTP(上述)と混合した。結果として生じた、発現カセットCaMV35S::OTP::FMP37m::CaMV35Stermを含有するベクターをpRT100−OTP−FMP37mと呼び、制限酵素HindIIIを使用してそれを単離し、次にさらに、予め開いて脱リン酸しておいたベクターpHOE6/Acにクローニングした。ベクターpHOE6/Acは、PAT(ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ)酵素をコードする遺伝子を含有し、除草剤グルホシネートに対する耐性を付与する(米国特許第6,316,694号)。結果として生じたプラスミドをpHoe/Ac/FMP37mと呼んだ(図3F)。
プラスミドpHoe6/Ac(米国特許第6,316,694号)、pHoe6/Ac/FMP37e、pHoe6/Ac/FMP37tおよびpHoe6/Ac/FMP37mを使用してトウモロコシ培養物をトランスフォーメーションした。トウモロコシの培養、プロトプラストの単離、トランスフォーメーションおよび稔性トランスジェニックトウモロコシ植物の再生は、米国特許第6284945号、"Zea mays(L.) with capability of long term、highly efficient plant regeneration including fertile transgenic maize having a heterologous gene、and their preparation"にしたがって行った。トランスフォーメーションされたカルスは、ホスフィノトリシンを含有する培地で選択した。次に、再生した発根植物を土壌に移植し、温室中で標準条件下(28/20℃)で成長および種子を産生させた。種子産生まで成植物を成長させ、さらなる播種のために種子を収集し、十分に発達した植物をそれぞれのHPPD阻害剤型除草剤で処理する。
イネ植物のトランスフォーメーション用のバイナリーベクターは、例えば、FMP37eの発現を推進するCaMV35プロモーターを有し、E coli細菌での発現のために最適化されたコドン使用頻度を有するように構築し、その5’末端にHisタグをコードする配列およびさらに上流にOTPをコードする配列、およびそれに続いてCaMV35Sターミネーターを付加した。追加的に、トランスフォーメーションベクターは、また、トランスフォーメーション工程の間にグルホシネートに基づく選択を行うために、遺伝子がCaVM35Sプロモーターに続いてCaMV35Sターミネーターによって推進されるPAT遺伝子カセットを含有する(図3I参照)。そのバイナリーベクターをpTMV370と呼んだ。類似であるが、HPPD酵素をコードするArabidopsis遺伝子を発現している発現カセットを含むバイナリーベクターを同様に構築した。
イネのトランスフォーメーションは、当技術分野で周知の方法を使用して達成する。簡潔には、未熟胚を使用して復旧系統6G4317からイネのAgrobacterium tumefaciens介在性トランスフォーメーションを行った。簡潔には、ドナー植物からの円錐花序を受粉の8〜12日後に採集した。未熟種子の外花穎を除去した。その後、NaOClベースの溶液およびツイーンを使用して種子を滅菌した。種子をアセチルサリチル酸で予備誘導した。次に、Agrobacterium tumefaciens細胞を、暗条件でアセトシリンゴンの存在下で予備誘導した種子と共に24℃で4日間共培養した。その後、胚からの子葉鞘を除去および洗浄し、次にホスフィノトリシンを補充した培地上に16時間の光周期リズムで28℃下で3週間置いた。次に、成長中のカルスを胚から切り取り、トリアシリン(triacillin)、ホスフィノトリシン、L−プロリンおよび硫酸銅(II)を含有する新鮮培地に移植した。各カルス系統について、そしてテンボトリオン濃度によって異なるカルス片からランダムに単離した3個の苗条を、テンボトリオンを有するMS/2に移植した。一般則として、再生培地からMS/2への苗条の移植は、カルスが再生培地上に置かれてから9週間後に行った。培養物を26.5℃でインキュベーションし(16時間の光周期)、病徴の評価を2週間後に行った。
a)ブリーチングなし
b)中程度のブリーチング
c)完全なブリーチング
T0発根小植物(ホスフィノトリシン単独またはテンボトリオンを補充されたホスフィノトリシンのいずれかで選択)を温室中の土壌に移植した。順化期間の後に、十分に成長した植物を異なるHPPD阻害剤型除草剤で処理した。一例として、硫酸アンモニウムおよび菜種油メチルエステルを補充されたWP20型製剤のテンボトリオンをT0植物に100g AI/haスプレー散布した。スプレー施用の7日後に、除草剤の施用が原因の病徴を評価し、同じ処理を受けた野生型植物で観察された病徴と比較した。処理の7日後に除草剤に応答して発生した表現型に基づき植物を3種類に分類した。クラスIは、被害を示さなかった植物として定義し、クラスIIは、除草剤処理に応答して一時的な軽い被害を示した植物として定義し(被害:10〜40%)、クラスIIIは、強い被害〜同じ処理を受けた野生型植物で見られたものと類似の被害を示している植物として定義した(被害:41〜100%)。一般に、一つだけのT−DNA挿入物を含有する植物であっても、すでに、HPPD阻害剤型除草剤テンボトリオンの露地供与量に対して顕著で十分なレベルの耐性を示したことが分かることができる。
ダイズのトランスフォーメーション用のバイナリーベクターを、例えば、双子葉植物に発現させるためにコドン使用頻度が最適化された遺伝子FMP37t−h(配列番号15)の発現を推進するCaMV35プロモーターを有するように構築し、その5’末端にOTPをコードする配列、およびさらに上流に植物でのmRNAの安定性を改善するための配列TEV(タバコエッチウイルス)に続いてCaMV35Sターミネーターを付加した。遺伝子FMP37t−hのヌクレオチド配列を配列番号15に示す。追加的に、トランスフォーメーションベクターは、また、トランスフォーメーション工程の間にグルホシネートに基づく選択のために遺伝子がCaVM35Sプロモーターに続いてCaMV35Sターミネーターによって推進されるPAT遺伝子カセット、およびトランスフォーメーションされた植物に除草剤グリフォセートに対する耐性を付与するために遺伝子がArabidopsis由来ヒストンプロモーターによって推進される2mEPSPS遺伝子カセットを含有する(図3H)参照。そのバイナリーベクターをpFCO112と呼んだ。
ダイズのトランスフォーメーションは、Pazら(2006, Plant cell Rep. 25:206)によって記載されたAgrobacterium tumefaciens介在性トランスフォーメーション由来ダイズ半切種子外植体を使用して説明された方法などの、当技術分野で周知の方法を使用して達成される。トランスフォーマントは、選択マーカーとしてイソキサフルトールを使用して確認した。緑色苗条の出現を観察し、除草剤イソキサフルトール耐性の指標として記述した。全体で、被験トランスジェニック苗条の1.5%は、イソキサフルトールで処理されていない野生型ダイズ苗条に匹敵する正常な緑化を示したが、一方で同量のイソキサフルトールで処理された野生型ダイズ苗条は完全にブリーチングした。これは、FMP37タンパク質の存在がイソキサフルトールにようにHPPD阻害剤型除草剤に対する耐性を可能にすることを示している。
ワタのトランスフォーメーション用のバイナリーベクターは、例えば、双子葉植物での発現用に最適化されたコドン使用頻度を有する遺伝子FMP37t−h(配列番号15)の発現を推進するCaMV35プロモーターを用いて構築し、その5’末端にOTPをコードする配列およびさらに上流に植物でのmRNAの安定性を改善するための配列TEV(タバコエッチウイルス)、それに続いてCaMV35Sターミネーターを付加した。遺伝子FMP37t−hのヌクレオチド配列を配列番号15に示す。追加的に、トランスフォーメーションベクターは、また、トランスフォーメーション工程の間にグルホシネートに基づく選択を行うために、その遺伝子がCaVM35Sプロモーターに続いてCaMV35Sターミネーターによって推進されるPAT遺伝子カセットおよびトランスフォーメーションされた植物に除草剤グリフォセートに対する耐性を付与するためのArabidopsis由来ヒストンプロモーターによってその遺伝子が推進される2mEPSPS遺伝子カセットを含有する(図3J参照)。そのバイナリーベクターをpTSIH21と呼んだ。
ワタのトランスフォーメーションを、当技術分野において周知の方法、特に好ましくはPCT特許公報である国際公開公報第00/71733号に記載された方法を使用して達成する。
双子葉植物のトランスフォーメーション用のバイナリーベクターを、例えば、双子葉植物での発現のために最適化されたコドン使用頻度を有する遺伝子FMP37t−h(配列番号15)の発現を推進するCaMV35プロモーターを用いて構築し、その5’末端にOTPをコードする配列に続いてCaMV35Sターミネーターを付加し」た。遺伝子FMP37t−hのヌクレオチド配列を配列番号15に示す。追加的に、トランスフォーメーションベクターは、また、その遺伝子を発現している植物にグルホシネート耐性を付与するために、CaVM35Sプロモーターに続いてCaMV35Sターミネーターによってその遺伝子が推進されるPAT遺伝子カセット、トランスフォーメーションされた植物に除草剤グリフォセートに対する耐性を付与するためにArabidopsis由来ヒストンプロモーターによってその遺伝子が推進される二重突然変異体(Thr102IleおよびPro106Ser)EPSPSをコードする2mEPSPS遺伝子カセット、およびこの遺伝子を発現している植物にスルホニル尿素またはイミダゾリノンのクラスの除草剤に対する耐性を付与するCaMV35Sプロモーターによって推進される耐性ALS酵素(アセト乳酸シンターゼ、Pro197Ala、Trp574Leu)をコードするArabidopsis thaliana 2mAHAS遺伝子カセットを含有する(図3G参照)。遺伝子カセットを、最終的にベクターpHoe6/Ac(米国特許第6,316,694号)にクローニングし、最終ベクターをpHoe6/FMP37t−h/PAT/EPSPS/AHASと呼び、Agrobacterium tumefaciens介在性の現況技術の方法により双子葉植物をトランスフォーメーションするために使用する。T0植物を土壌に移植し、順化期間の後に、十分に成長した植物にHPPD阻害剤クラスの除草剤、次にグリフォセート、次にグルホシネート、最終的に例えばスルホニル尿素のクラスの除草剤を連続的にスプレー散布する。
タバコのトランスフォーメーション用のバイナリーベクターを、例えば、双子葉植物での発現用に最適化されたコドン使用頻度を有する遺伝子FMP37t−h(配列番号15)の発現を推進するCaMV35プロモーターを用いた構築し、その5’末端にOTPをコードする配列、およびさらに上流に植物中のmRNAの安定性を改善するための配列TEV(タバコエッチウイルス)、続いてCaMV35Sターミネーターを付加した。遺伝子FMP37t−hのヌクレオチド配列を配列番号15に示す。追加的に、トランスフォーメーションベクターは、また、トランスフォーメーション工程の間のグルホシネートに基づく選択のためにその遺伝子がCaVM35Sプロモーターに続くCaMV35Sターミネーターによって推進されるPAT遺伝子カセットおよびトランスフォーメーションされた植物に除草剤グリフォセートに対する耐性を付与するためにその遺伝子がArabidopsis由来ヒストンプロモーターによって推進される2mEPSPS遺伝子カセットを含有する(図3H参照)。バイナリーベクターをpFCO112と呼んだ。上記ベクターを使用して、実施例3にしたがってNicotiana tobacum植物から得られた葉ディスクをトランスフォーメーションした。トランスジェニックタバコ植物を温室に移し、1121g AI/haの量のグリフォセートで処理した。そのような耐性タバコ植物から種子を産生させ収穫した。これらの種子を土壌に蒔き、温室内で発芽させた。3〜4週間後に、1イベントあたり50個の小植物を個別の鉢に移植した。2週間後に大きさ4〜6cmの植物に:
− グルホシネート−アンモニウム 1000g AI/ha、
− グリフォセート 1121g AI/ha
− テンボトリオン 100g AI/ha、または
− テンボトリオン+グリフォセート 100g AI/ha+1121g AI/ha
のいずれかをスプレー散布した。
Claims (16)
- 植物で発現可能なプロモーターに作動可能に連結されるコード配列を含むキメラ遺伝子であって、該コード配列が、ブレファリスマ(Blepharisma)ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ(HPPD)タンパク質、またはブレファリスマ(Blepharisma)HPPDタンパク質と少なくとも75%配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸配列を含むことを特徴とするキメラ遺伝子。
- HPPDタンパク質が、ブレファリスマ ヤポニクム(Blepharisma japonicum)HPPDタンパク質またはブレファリスマ ヤポニクム(Blepharisma japonicum)HPPDタンパク質と少なくとも75%の配列同一性を有するタンパク質であることを特徴とする、請求項1記載のキメラ遺伝子。
- 該タンパク質をコードするDNAが、配列番号1で示されるDNAとハイブリダイゼーションする少なくとも20個のヌクレオチドのプライマーまたはプローブを使用することによってブレファリスマ(Blepharisma)DNAから得ることができる、請求項1または2記載のキメラ遺伝子。
- 配列番号4のアミノ酸位置2〜アミノ酸位置382のアミノ酸配列を含むHPPDタンパク質または配列番号4のアミノ酸位置2〜アミノ酸位置382のアミノ酸配列と少なくとも75%の配列同一性を有するタンパク質をコードすることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか記載のキメラ遺伝子。
- HPPDタンパク質配列をコードし、配列番号3のヌクレオチド位置400〜ヌクレオチド位置1542のヌクレオチド配列、またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で該配列とハイブリダイゼーションするDNAを含むことを特徴とする、請求項1〜4のいずれか記載のキメラ遺伝子。
- トランジットペプチド/HPPD融合タンパク質が該キメラ遺伝子によってコードされるように、HPPDコード配列の下流に、植物において活性の該トランジットペプチドをコードする核酸配列を含むことを特徴とする、請求項1〜5記載のキメラ遺伝子。
- 請求項1〜6のいずれか一項記載の少なくとも一つのキメラ遺伝子を含む、ベクター。
- 請求項1〜7のいずれか一項記載のキメラ遺伝子を含むことを特徴とする、植物細胞、植物の部分、植物、または種子。
- PDH酵素をコードするキメラ遺伝子をさらに含む、請求項8記載の植物細胞、植物の部分、植物または種子。
- さらに、成長レギュレーター、好ましくは2,4−Dもしくはジカンバ、ならびに/またはアセト乳酸シンターゼ(ALS)、EPSPシンターゼ(EPSPS)および/もしくはグルタミンシンターゼ(GS)を阻害する除草剤に対する耐性を付与する一つまたは複数のキメラ遺伝子を含む、請求項8または9記載の植物細胞、植物の部分、植物または種子。
- HPPD阻害剤型除草剤に対して耐性な植物を得るための方法であって、請求項1〜6のいずれか一項記載のキメラ遺伝子が、該植物に導入されることを特徴とする、方法。
- 請求項8、9または10記載の植物または種子を含有するか、またはそれを用いて栽培されるべき区域または圃場中の雑草を防除するための方法であって、請求項8、9または10記載の種子または植物に顕著に影響せずに、該雑草に有毒な供与量のHPPD阻害剤型除草剤を該区域または圃場に施用することを含む、方法。
- HPPD阻害剤が、イソキサフルトール、テンボトリオン、メソトリオン、スルコトリオン、ピラスルホトール、トプラメゾン、2−シアノ−3−シクロプロピル−1−(2−SO2CH3−4−CF3フェニル)プロパン−1,3−ジオンおよび2−シアノ−3−シクロプロピル−1−(2−SO2CH3−4−2,3Cl2フェニル)プロパン−1,3−ジオン、ビシクロピロン、ベンゾビシクロン、テフリルトリオン、ジケトニトリル、およびピラゾキシフェンの群より選択されることを特徴とする、請求項12記載の、雑草を防除するための方法。
- 請求項8、9または10記載の植物を成長させること、場合によりHPPD阻害剤型除草剤で該植物を処理すること、穀粒を収穫すること、および該穀粒を粉砕して粗挽き粉を製造し、場合により油を抽出することを含む、油または粗挽き粉を得るための方法。
- 植物をHPPD阻害剤型除草剤に耐性にするための、ブレファリスマ(Blepharisma)HPPDまたはブレファリスマ(Blepharisma)HPPDと少なくとも75%の配列同一性を有するHPPDの使用。
- HPPD阻害剤型除草剤が、イソキサフルトール、テンボトリオン、メソトリオン、スルコトリオン、ピラスルホトール、トプラメゾン、2−シアノ−3−シクロプロピル−1−(2−SO2CH3−4−CF3フェニル)プロパン−1,3−ジオンおよび2−シアノ−3−シクロプロピル−1−(2−SO2CH3−4−2,3Cl2フェニル)プロパン−1,3−ジオン、ビシクロピロン、ベンゾビシクロン、テフリルトリオン、ジケトニトリル、およびピラゾキシフェンからなる群より選択される、請求項15記載の使用。
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