JPH06319592A - ラセミ性カルボン酸化合物の酵素分割方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ラセミ性カルボン酸化合物の酵素的分割方法
であって、この方法は、ラセミ性カルボン酸エステルを
加水分解酵素で処理する工程、こうして得られたエナン
チオマー性化合物及び非荷電のエナンチオマー性エステ
ルをイオン排除膜を通して生成混合物中へ移動される工
程を含んでなる。 【効果】 カルボキシ基含有のラセミ混合物が効率よく
特定の異性体に分割できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は一般的に非荷電の(uncha
rged）ペプチドは透過するが、荷電した（charged）分
子は透過しない膜を用いるペプチドの酵素合成及び分離
方法；並びに、更に詳細にはＬ，Ｌ−ジペプチドの同時
合成及びそのＬ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニン
メチルエステル（アスパルテーム）の製造に対する応用
に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】Ｌ，Ｌ−ペプチドを生成させるための２
つのＬ−アミノ酸の立体特異的カップリングに対する縮
合触媒としての蛋白質分解酵素の使用は蛋白質化学の初
期から公知である。１９０９年の初期の頃にモール（Mo
hr)及びストローシェイン（Strohschein）は蛋白質分解
酵素パパインの存在下でのＢｚ−Ｌｅｕ−ＯＨ及びＨ−
Ｌｅｕ−ＮＨ_２の反応による水に不溶性のジペプチドＢ
ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＮＨ_２の生成を記載した。Ｅ．モ
ール及びＦ．ストローシェイン、Ｄｅｒ ４２、２５２
１（１９０９）。モール及びストローシェインタイプの
反応は用いるパパインまたは他の酵素により開裂し易い
ペプチド結合を形成するアミノ酸間のみで可能である。
事実、アミノ酸反応体及びペプチド生成物間の縮合反応
の平衡は反応するアミノ酸の方向に大きく移動する。そ
れにもかかわらず、例えばジペプチド生成物の可溶性が
小さく、そして反応相から析出する場合、縮合反応体は
質量作用により反応が完了する方向に移動させ得る。あ
るペプチドの商業上の重要性及び酵素が温和な条件下で
ペプチド生成を触媒することが知られていることによ
り、ペプチド、殊に簡単なジペプチドの酵素的合成に対
して多くの研究がなされている。Ｋ．オヤマ（Oyama)
及びＫ．キハラ（Kihara）、化学総説３５、１９５（１
９８３）；Ｋ．オヤマ及びＫ．キハラ、Chem Tech． １
４，１００（１９８４）。

【０００３】以後 ′３１１法と称する米国特許第４,１
６５,３１１号に記載されるペプチド誘導体アスパルテ
ームの酵素合成方法はサーモリシン触媒されたＮ−カー
ボベンゾキシ−Ｌ−アスパラギン酸とＤ，Ｌ−フエニル
アラニンメチルエステルとの縮合及び反応をペプチド生
成物側に移動するための中間複合体であるＮ−カーボベ
ンゾキシ−アスパルテームのＤ−フエニルアラニンメチ
ルエステル塩の沈殿を含む。更にこの中間複合体の処理
によりラセミ化後に再循環し得るＤ−フエニルアラニン
メチルエステル及びＮ−カーボベンゾキシ保護基の除去
によりアスパルテームに転化し得るＮ−カーボベンゾキ
シ−アスパルテーム誘導体が回収される。′３１１法は
面倒であり、そして酵素の回収を複雑にするバッチベー
スで行わなければならない。次のものも参照；Ｋ．オヤ
マ、Ｓ．イリノ（Irino)、 Ｔ．ハラダ（Harada）及び
Ｎ．ハギ（Hagi）、Ann. N.Y. Acad. Sci. ４３４，９
５（１９８５）。ウィリー・クルマン（Willi Kullman
n）、酵素的ペプチド合成（Enzymatic Peptide Synthes
is）（１９８７）。

【０００４】Ｎ−カーボベンゾキシ保護基はサーモリシ
ンの活性部位により与えられる構造的必要性を満たし、
そしてこれにより反応の収率を増加させる中間複合体の
不溶性に寄与することにより ′３１１法において本質
的な役割を果す。Ｎ−カーボベンゾキシ保護基のアスパ
ルテーム誘導体からの除去はメチルエステル官能基の開
裂を保護するために温和な条件下、例えば接触水添下で
行わなければならない。接触水添は大規模での不便な水
素の取扱いを含む。

【０００５】また酵素的縮合反応を完了させるアプロー
チが化学文献にも記載されている。例えば、反応媒質と
しての有機溶媒の使用はペプチド生成物の収率を増大さ
せるに有効であるが；付随する酵素の安定性の減少が大
規模でのその実施を阻止することが見い出された。Ｋ．
オヤマ、Ｓ．ニシムラ（Nshishimura）、Ｙ．ノナカ（N
onaka）、Ｋ．キムラ及びＴ．ハシモト（Hashimoto)、ジ
ャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（J. Or
g. Chem．）４６、５２４１（１９８１）；Ｈ．オーシ
マ（Ooshima）、Ｈ．モリ（Mori）及びＹ．ハラノ(Hara
no）、バイオテクノロジー・レターズ(Biotechnology L
etters)７、７８９(１９８５)；Ｋ．ナカニシ（Nakanis
hi）、Ｔ．カミクボ（Kamikubo)及びＲ．マツノ（Matsu
no）、バイオテクノロジー（Biotechnology）３，４５
９（１９８５）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従来のペプチドの酵素
合成法の実施における上記の困難さ、殊に中間複合体の
沈殿の必要性及び危険な試薬の取扱いの観点から、これ
らの困難さを回避し、そして酵素触媒の急速な失活なし
に有効な収量を安全に与える改善された方法を提供する
ことが望ましい。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は第一の反応体と
第二の反応体を結合させて膜を移動し得る化合物を生成
させ；移動可能な化合物を反応体を移動させない膜を通
して移動し；そして移動された化合物を膜を通つて再移
動し得ない状態に不可逆的に転化することからなる、化
合物の合成及び精製方法を与える。

【０００８】また本発明はプロトン化されたアミノ基
（アンモニウム）を含む第一の化合物及び遊離カルボキ
シレート基を含む第二の化合物を水性混合物中の縮合酵
素を用いて結合して非荷電の（または非イオン化され
た）結合された化合物を生成させ；非荷電の結合された
化合物を選択的に非荷電の結合された化合物を膜の生成
物側に移動させる膜を通して拡散により水性混合物から
連続的に除去する工程からなる、化合物の酵素合成及び
精製法を与える。好ましくは、移動された結合された化
合物は膜を通つて逆拡散しないように荷電した（または
イオン化した）分子に転化されたペプチドまたはその誘
導体である。かくて、結合された化合物生成物の生成は
反応混合物中で有利であり、その理由はこのものが常に
除去されるからである。

【０００９】また本発明はα−カルボキシレート基を含
むＮ−アシル−β−置換された−Ｌ−アスパラギン酸を
縮合酵素を含む水性反応混合物中でα−アンモニウム基
を含むフエニルアラニン低級アルキルエステルと縮合さ
せ、非荷電のペプチドであるＮ−アシル−Ｌ−アスパル
チル−（β−置換された）−Ｌ−フエニルアラニン低級
アルキルエステル（即ち炭素１〜６個）を生成させ；そ
して非荷電の該ペプチドを透過選択性（permselective)
膜を通して水性反応混合物から生成混合物中に移動す
る工程からなる、ペプチドの酵素的合成方法を与える。

【００１０】また本発明は水性の出発反応混合物中の第
一及び第二のアミノ酸を縮合して非荷電の化合物を生成
させ；非荷電の化合物を実質量のアミノ酸化合物を移動
させない膜を通して第二の水性反応混合物中に移動し；
そして移動した非荷電の化合物を膜を通つて出発反応混
合物に再移動し得ない状態に転化する工程からなる、ペ
プチドの酵素的合成方法を与える。膜を通つて再移動し
ない状態に転化された移動した化合物は第二の反応混合
物から除去し得る。また、非荷電の化合物と共に第二の
反応混合物中に膜を共透過する第一及び第二のアミノ酸
化合物を第二の反応混合物から分離し、そして随時出発
反応混合物に戻すことができる。

【００１１】また本発明は加水分解酵素を含む水性反応
混合物中でＤ，Ｌ−アミノ酸化合物を加水分解して水性
反応混合物中に荷電したＬ−アミノ酸化合物及び非荷電
のＤ−アミノ酸化合物を生成させ；そして非荷電のＤ−
アミノ酸化合物をイオン排除膜を通して水性反応混合物
から生成混合物中へ移動し、かくてエナンチオマー分割
を行う工程からなる、アミノ酸化合物の酵素的分割方法
を与える。生成混合物中の非荷電のＤ−アミノ酸化合物
を蓄積し、そして常法により回収することができる。ア
ミノ酸化合物の酵素的分割方法を上記の他の方法と組み
合わせることができる。

【００１２】ペプチド生成物の同時の合成及び精製を与
えるペプチドの酵素的合成方法を与えることが本発明の
目的である。

【００１３】ペプチド及びその誘導体、殊にアスパルテ
ームの安全で、経済的で、且つ効率的な合成及び精製方
法を与えることが本発明の他の目的である。

【００１４】効率的な酵素の使用及び連続ベースの合成
を行わせる方法を与えるペプチドの経済的な酵素的合成
方法を与えることが本発明の他の目的である。

【００１５】また殊にＤ，Ｌ−フエニルアラニン及びＮ
−保護されたβ−置換されたＬ−アスパラギン酸を用い
る実質的に定量的収率でのアスパルテーム及びその誘導
体の酵素的合成に適応される方法を与えることが本発明
の他の目的である。

【００１６】

【具体的な態様】本明細書に開示される本発明は非荷電
のペプチドを反応混合物から生成混合物中に選択的に移
動する膜を用いて非荷電のペプチド中間体またはその誘
導体を分離することにより水性反応混合物中にてペプチ
ドの酵素的合成を完了させる方法を与える。膜は実質的
に反応体（荷電した分子）を透過しないため、反応混合
物からのペプチド中間体の除去により平衡時でのペプチ
ド濃度が減少し、これにより反応は質量作用によつて反
応が完了される方向に移行される。

【００１７】本発明の実施に最も有用な膜は酵素、反応
体及び生成物に対して実質的に不浸透性である細孔性担
体物質、好ましくは高分子シートに包含された非極性液
体からなる固定化液体膜（ＩＬＭ)である。ポリプロピ
レンの如き疎水性重合体が好適な担体物質である。ＩＬ
Ｍモジュール（module）はポリプロピレン中空繊維を用
いて製造し得る。セラニーズ社（Calanese Corporatio
n）、１２１１アベニュー（Avenue）、アメリカス（Ame
ricas）、ニューヨーク、Ｎ．Ｙ．１００３６の商標で
あり、そしセラニーズ・ファイバーズ、マーケティング
社（Calanese Fibers Marketing Corporation）、シャ
ルロッテ（Charlotte）、Ｎ．Ｃ．により販売されるセ
ルガード（Celgard）が市販のポリプロピレンの中空繊
維の例である。本分野で公知であるポッティング化合物
及びポリ塩化ビニルパイプまたはチューブ類を場合によ
つてはＩＬＭモジュラスの製造に使用し得る。細孔性担
体物質を製造する際の他の重合体にはフツ素化された炭
化水素重合体に対するＥ．Ｉ．デュポン・デ・ネムアズ
（Du Pont de Nemours）& Co. の商標であるＴＥＦＬＯ
Ｎがある。代表的な細孔性担体にはＷ．Ｃ．ゴア＆アソ
シエーツ社（Gore & Associates Inc.) の商標であるＧ
ＯＲＥ−ＴＥＸがある。

【００１８】細孔は担体物質を通過し、そして固定化さ
れる液体が毛管現象によりその中に保持され、そして例
えば膜を通しての圧力差または他の通常の条件に付され
た場合にこのものから漏れ出ない大きさであるべきであ
る。上記の制限は膜を通しての非荷電のペプチド生成物
の移動の速度 ［フラックス（Flux）］を最大にするた
めに固定化液体及び反応混合物間の接触面積を最大にす
る際に有利である。好適な細孔径は特定の固定化液体、
用いる反応体、生成される生成物の特性などの因子に依
存して変わり；そして更に好適な細孔径は本分野に精通
せる者により経験的に求め得ることが認められる。有用
な細孔径の選択に関する議論が米国特許第４,１７４,３
７４号に見い出される。固定化液体膜の使用及び調製は
次の文献に記載される：Ｓ．Ｌ．マトソン（Matson）、
Ｊ．Ａ．クイン（Quinn）、カップリング・セパレーシ
ョン・アンド・エンリッチメント・トゥー・ケミカル・
コンバーション・イン・ア・メンブレン・リアクター(C
oupling Separation and Enrichment to Chemical Conv
ersionin a Membrane Reactor）、ＡＩＣＨＥ年会、ニ
ューオーリンズ、ルイジアナ（１９８１年１１月８〜１
２日）に提出した論文、並びにＳ．Ｌ．マトソン及び
Ｊ．Ａ．クイン、メンブレン・リアクターズ・イン・バ
イオプロセッシング（Membrane Reactors in Bioproces
sing）、Ann. N.Y.Acid. Sci. ４６９、１５２（１９８
６）。

【００１９】毛管現象により細孔性担体中に保持される
固定化液体は水と非混和性であり、そして膜を通つて適
当な速度、即ち良好な移動特性／高フラックスで移動
（拡散）しなければならない非荷電のペプチド生成物に
対しては良好な溶媒であるべきであり；一方、膜の反応
側及び生成物側の両方に対して荷電するか、またはイオ
ン化した分子は殆んどの部分でいずれかの方向において
も膜を通つて移動せず、即ち良好な選択性／イオン排除
性がある。

【００２０】本発明によるペプチドの酵素的合成に用い
るための担体物質及び固定化液体の最良の組合せの選択
は一部分用いる特定の反応体の特性、望まれる生成物及
び系中の溶媒に依存する。

【００２１】本発明の実施に対して一般的に好ましい固
定化液体には水と非混和性の有機溶媒例えば分枝鎖状及
び非分枝鎖状の炭素原子６〜２０個のアルコール、例え
ばｎ−デカノール、ｎ−ドデカノール、ｎ−ヘキサデカ
ノール及びその混合物が含まれる。また好適なものには
水と非混和性の有機溶媒の混合物がある。かかる溶媒に
はＮ，Ｎ−ジエチルードデカンアミド、ドデカン及び２
−ウンデカノンが含まれるが、このものに限定されるも
のではない。

【００２２】本発明の実施に有用な他のタイプの膜はポ
リ塩化ビニルなどの如き有機重合体製の疎水性固体フイ
ルムからなる。これらの重合体膜の製造は文献例えば
Ｏ．Ｊ．スウィーティング（Sweeting）、編集者、サイ
エンス・アンド・テクノロジー・オブ・ポリマー・フィ
ルムズ（Science and Technology of Polymer Film
s）、インターサイエンス（Inter science）、ニューヨ
ーク（１９６８）に十分に記載され、一方気体及び液体
の分離に対するかかる膜の広い用途はＳ．Ｔ．フワング
（Hwang）及びＫ．カンマーマイヤー（Kammermeyer）、
メンブレンズ・イン・セパレーションズ、テクニークス
・オブ・ケミストリー（Membraners in Separations, T
echniques of Chemistry）、第VII巻、［Ａ．ワイスバ
ーガー（Weissberger）、編集者］ジョーン・ウィリー
＆サンズ社（John Wiley & Sons, Inc.）、ニューヨー
ク（１９７５）に記載される。

【００２３】本発明の好適な具体例はＩＬＭ膜の片側と
接触して循環する水性反応混合物または相及び膜の反対
の表面で対向して循環する生成物水相または混合物を与
える膜反応器／分離器系を用いる。Ｓ．Ｌ．マトソン及
びＪ．Ａ．クイン、Ann. N.Y. Acad. Sci. ４６９，１
５２（１９８６）。反応及び生成物相のpH値及び温度を
約４.０乃至９.０間のpH値でのその膜を通つての移動を
最小にする状態に反応体を保つ値で保持する。反応相か
らの生成物相への非荷電のペプチド中間体の移動は反応
相中での中性または非荷電のペプチド濃度の増加により
生じる膜を通しての濃度勾配により起きる。膜を通して
の移動活性またはフラックスは生成物相における移動さ
れたペプチドの逆拡散し得ない種への同時で、不可逆的
な転化によりかなり増大し得る。例えば、後者の転化は
逆拡散することができず、かくて結合反応の完了を達成
させる起動力を補足する極性ペプチドを生じさせ得る。
本発明の実施に適応できた膜反応器／分離器の例は米国
特許第４,１８７,０８６号に見い出された。

【００２４】本発明の実施に適応できた入手可能な他の
膜反応器／分離器配置は英国特許出願第２,０４７,５６
４Ａ号に記載される中空繊維モジュラス、並びに通常の
板及び本分野で十分公知のフレームータイプのフィルタ
ー装置を含む。

【００２５】非荷電のペプチドの選択的移動に加えて、
膜は各々の相の成分の望ましくない混合及び反応を防止
する反応相及び生成物相間の障壁を与える。

【００２６】本発明により配置される好適な膜反応器／
分離器において、反応体間の化学平衡は非荷電のペプチ
ドの透過しない種への不可逆的転化を膜の生成物側で行
うことにより膜を通して実際に「引張られる」。このタ
イプの膜反応器／分離器は次の一般的タイプの結合され
た２つの酵素（Ｅ^１及びＥ^２）工程を用いる：

【００２７】

【化１】

【００２８】荷電した反応体Ａ及びＢはペプチド生成用
酵素Ｅ^１を用いて縮合し、膜を通つて生成物側に選択的
に移動する非荷電の中間体ペプチドＣを生成させるアミ
ノ酸及び／または小さいペプチドである。所望の反応に
おいて関与しない反応体中の反応性官能基は必要に応じ
て望ましくない副反応及び／または生成物の変性を防止
するか、または保護し得ることが理解される。膜の生成
物側において非荷電のペプチドＣを膜を通つて逆拡散し
得ない荷電したペプチドＤに転化し、これにより反応混
合物における化学平衡をよりＣの生成する方向にシフト
させる。

【００２９】この概念をサーモリシンの存在下にて約pH
５.５でのＤ，Ｌ−フエニルアラニンメチルエステルと
（Ｎ−及びβ−保護された）Ｎ−ホルミル−β−ベンジ
ル−Ｌ−アスパラギン酸との酵素的縮合の特異な場合に
対して第１図に説明する。

【００３０】第１図において示される反応式において、
反応体Ａ⁺はＤ，Ｌ−フエニルアラニンメチルエステル
であり、そしてＢ^-はＮ−ホルミル−β−ベンジル−Ｌ
−アスパラギン酸である。反応体を非荷電のペプチドＣ
を生成させる酵素Ｅ^１サーモリシンにより膜の反応側で
縮合する。反応体をその荷電した状態に保持し、かくて
その非荷電のペプチドＣと一緒に膜を通つての拡散を最
小にするようにｐＨ値を選択する。

【００３１】縮合反応に対する化学平衡は反応体Ａ⁺及
びＢ^-種に多大に有利であるが、膜を通しての生成物側
への非荷電のペプチド生成物Ｃの拡散は膜の反応側での
化学平衡を保持するためにＣの一定の生成を必要とす
る。

【００３２】膜上の生成物側で、エステラーゼ酵素Ｅ^２
は膜を通つて拡散された非荷電のペプチドＣを反応側に
逆拡散し得ない荷電したペプチドＤに迅速且つ不可逆的
に転化する。かくて反応側での化学平衡は膜を通し、そ
して非荷電の生成物Ｃの生成の方向に効率的に「移動さ
れる」。その後、ペプチドＤを酸加水分解によりアスパ
ルテームに転化し、このものからホルミル及びベンジル
保護基を除去し、続いてメタノールでＣ−末端エステル
化を行う。

【００３３】上記の方法は第２図に示される通り、pH値
及び温度の制御された条件下で操作される向流膜反応器
／分離器１０において実施することができ、従つて約
４.０〜９.０のpH範囲で活性であるプロテアーゼの触媒
作用下でプロトン化された遊離のα−アミノ基（電子陽
性種）を有する反応体例えばＤ，Ｌ−フエニルアラニン
メチルエステルと縮合される遊離のα−カルボキシレー
ト基（電子陰性種）を有するＮ−アシル−β−置換され
たＬ−アスパラギン酸例えばＮ−ホルミル−β−ベンジ
ル−Ｌ−アスパラギン酸からなる混合物からイオン化さ
れた基をもたない（電子中性種）十分に保護されたＬ−
アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニンジペプチドが生成
される。膜の反応側で、反応混合物をポンプ１４を用い
て反応器タンク１２から供給入口導管１６を通り、分離
器２０を通つて反応器タンク１２に戻る供給出口導管２
０に循環させる。膜の生成物側で膜を通して移動された
十分に保護された非荷電のペプチド例えばＮ−ホルミル
−β−ベンジル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラ
ニンメチルエステルを含む生成混合物またはスウィープ
（sweep）をポンプ２４を用いて反応器タンク２２から
生成物スウィープ入口導管２６を通り、分離器１８の生
成物側を通つて生成物スウィープ出口導管３０に循環さ
せる。この生成混合物は第二の酵素Ｅ^２エステラーゼま
たは非荷電のペプチドにより生成される少なくとも１つ
の保護された基を開裂し、かくて膜を通して逆拡散によ
りスウィープ流から逃がれ得ない電子荷電された種を生
成し得る他の適当な試薬を含む。エステラーゼを用いる
場合、好適なエステラーゼは蛋白質分解活性及び約６.
０〜９.０の範囲の好適なｐＨ範囲を有する。アミノア
シラーゼＩ、α−キモトリプシン及びサブチリシンＡが
本発明に有用と考えられるエステラーゼの例である。

【００３４】荷電した生成物は定期的に放電し、そして
／またはイオン交換樹脂の如き通常の方法により連続的
に生成物相から除去することができ、そして残留した流
出液を系を通して再循環させることができる。生じたイ
オン交換樹脂に結合した生成物を常法を用いて脱着し、
そして回収することができる。

【００３５】適当な脱保護試薬の選択はＮ−保護された
Ｌ−アスパラギン酸の如き反応体に使用される保護基の
化学特性により決められ、そして上記のように保護基の
選択は縮合酵素の活性部位により与えられる構造的制約
によつても決められる。

【００３６】一般に、本発明の実施に有用な酵素はしば
しばプロテアーゼと呼ばれる２つのグループに分割し得
る蛋白質分解酵素である。より普通に使用されうものは
内部結合のみを開裂するエンドペプチダーゼ及び末端結
合のみを開裂するエキソペプチダーゼである。有用な酵
素にはセリンプロテイナーゼ、（ＥＣ ３．４．２１）
例えばキモトリプシン、トリプシン、サブチリシンＢＮ
Ｐ′ 及びアクロモバクター（Achromobacter）プロテア
ーゼ；チオールプロティナーゼ（ＥＣ ３．４．２２）
例えばパパイン；カルボキシルプロティナーゼ（ＥＣ
３．４．２３）例えばペプシン；並びにメタロプロティ
ナーゼ（ＥＣ ３．４．２４）例えばサーモリジン、プ
ロリシン、タシナセン（Tasynasen）Ｎ［St. ケスピト
スス（caespitosus）及びディスパーゼ（Dispase）が含
まれる。本分野の実施者に十分公知の方法に従う不溶性
担体への酵素の結合は本発明の実施に組入れることがで
き；そして酵素を結合させることは本質的な工程ではな
いが、このことはある用途において望ましいものであり
得る。本発明の実施に潜在的に有用な多くのプロテアー
ゼの中で、その顕著な熱安定性、広い入手性、低い経費
及び約５.０〜９.０間の広い使用pH範囲のために最も好
ましい縮合酸素はサーモリシン［Ｅ．Ｃ．３．４．２
４］である。他の好適なプロテアーゼにはペプシン及び
ペニシロペプシン［Ｔ．ホフマン（Hofmunn）及びＲ．
ショウ（Shaw）、Biochim. Bio phys. Acta ９２、５４
３（１９６４）］並びにペニシリウム・デュポンティ
（Penicillium duponti からの熱安定性プロテアーゼ
［Ｓ．エミ（Emi）、Ｄ．Ｖ．マイヤーズ（Myers）及び
Ｇ．Ａ．イアコブッチ（Iacobucci）、バイオケミスト
リー（Biochemistry）１５，８４２（１９７６）が含ま
れる。これらのものはpH約５.５で機能し、かかるｐＨ
値で良好な安定性を示し、そしてその活性を保持するた
めにＺｎ⁺⁺ 及びＣａ⁺⁺イオンの存在を必要としないこ
とが予期された。

【００３７】エナンチオマー選択性の実現、即ち上記の
場合におけるペプチドＣのＬ，Ｌ異性体のみの製造は選
ばれる酵素、膜の最適の機能性、担体物質の化学的性質
及び水性反応相のｐＨ値に直接関係する。

【００３８】上記の特殊な方法を実施する際の１つの好
適な膜はその中に固定化されたｎ−ヘキサデカノール及
びｎ−ドデカンの混合物を含む細孔性ポリプロピレン担
体物質である。この膜は「タイプ１中空繊維選択性透析
膜」なる商標／呼称下でベンド・リサーチ社（Bend Res
earch Inc.）、６４５５０ リサーチ・ロード、ベン
ド、オレゴン９７７０１、ＵＳＡから入手され、そして
実施例１〜４の反応に関して好ましい。他の好適な膜は
セルガード（Celgard）タイプ ２４００ ポリプロピレ
ン中空繊維［セルガードはセラニーズ社（Celanese Cor
poration）、１２１１アベニュー、アメリカス、ニュー
ヨーク、Ｎ．Ｙ．１００３６の登録商標である］を利用
する。セルガードは細孔性シートの細孔中に毛管現象に
より固定化された水に非混和性の有機液体としてのドデ
カン中の３０％v/v Ｎ，Ｎ−ジエチルードデカンアミド
の混合物を含む細孔性担体物質としてセラニーズ・ファ
イバーズ・マーケッティング社（Celanese Fibers Mark
eting Corporation）（シカルロッテ、ＮＣ）から得る
ことができる。この膜はベント・リサーチ社、６４５５
０ リサーチ・ロード、ベンド、オレゴン ９７７０１、
ＵＳＡから「タイプ２中空繊維選択性透析膜」なる商標
／呼称下で得られ、そして実施例５〜９の反応に関して
好ましい。０.０２５〜０.０５０μｍの細孔径及び２５
μｍ の壁の厚さを有するセルガード タイプ ２４００
ポリプロピレン 中空繊維をベント・リサーチ社のタイ
プ ２ 中空繊維選択性透析膜において用いた。約５.５
のpH値で操作する場合、これらの膜は例えば第１図の方
法を実施する際に高い選択性を示し、その際に非荷電の
ペプチド種に好適の約５００：１（ｗ／ｗ）の範囲の選
択性が測定された。即ち、移動された荷電した反応体
（Ａ⁺またはＢ^-）各々１mgに対して５００mgの非荷電の
ペプチド（Ｃ）が膜を通して移動される。

【００３９】上記のように、本発明の用途に対して所望
の生成物の生成を阻止し、そして／またはその収率を減
少し得る望ましくない副反応を防止し、そして中間体ペ
プチド中の電子荷電を抑制するために反応体及び生成物
上の種々の官能基をブロックするか、または保護するこ
とが必要であるか、または望ましい。下の表１は本発明
の実施に関連して有用である一連の保護基の選択された
組合せ及び脱保護条件を示す。

【００４０】

【表１】

【００４１】選ばれた縮合酵素のエナンチオマー選択性
及び膜によつて行われる機能的な選別の結果として、Ｎ
−ホルミル−Ｌ−アスパルチル−β−ベンジルエステル
及びＤ，Ｌ−フエニルアラニンメチルエステルを用いる
本発明の実施によりラセミ性フエニルアラニンメチルエ
ステル反応体の９９.８％のエナンチオマー分割が達成
でき、その際にＬ−エナンチオマーがＮ−ホルミル−Ｌ
−アスパルチル（β−ベンジル）−Ｌ−フエニルアラニ
ンメチルエステル、アスパルテーム誘導体として反応相
中に残留する未反応のＤ−エナンチオマーと共の出現し
た。

【００４２】反応相中に残留するＤ−フエニルアラニン
メチルエステルをこのものから回収し、Ｄ，Ｌ−段階に
再ラセミ化し、そして原料中に再循環し得る。このこと
はラセミ性アミノ酸反応体を用いる多くの方法、例えば
上記の ′３１１方法に一般に有利である。

【００４３】本発明の経済的利点は少なくとも部分的に
はより高価な予備分割されたＬ−エナンチオマーよりは
むしろラセミ体原料反応体の使用から誘導される。この
利点は（ａ）縮合酵素のエナンチオ選択性；及び（ｂ）
非荷電種に対する膜の高選択性によるＤ，Ｌ−フエニル
アラニンメチルエステルのその場での光学分割により可
能となる。

【００４４】ラセミ性フエニルアラニンの低経費の好適
な合成方法はしばしばグレース（Grace）法と呼ばれる
５−ベンザルヒダントインを介するベンズアルデヒドの
使用、または塩化ベンジルのフエニルピルビン酸への接
触カルボニル化をベースにするものであり、この方法は
相模化学研究センター、東京、日本により開発された
（しばしば東洋曹達工業株式会社、山口、日本の東洋曹
達法として称される）。本発明の実施例は必ずしもペプ
チド甘味料例えばアスパルテームまたはその同族体及び
誘導体の合成に限定されるものではないことは本発明に
精通せる者によつて認められよう。また本発明は適当な
速度で透過選択性膜を通つて拡散し得る他の有用なペプ
チド、ジー、トリー、テトラー及びペンタペプチド、ま
たはより複雑なペプチドの合成に使用し得る。例えば、
サーモリシンの結合特異性を考慮し、そして生成物中で
のただ１つのサーモリシンに感度を有する結合の存在を
仮定すると（下記式の矢印で示す）、次式によりメト
（met）−エンケファリン（１）を合成することができ
た：

【００４５】

【化２】

【００４６】α−キモトリプシン及びパパインを用いる
メトーエンケフアリンの段階的全酵素合成の可能性は文
献に記載されている。Ｗ．クルマン（Kullmann）、J. B
iol.Chem. ２５５、８２３４（１９８０）参照。

【００４７】本発明の他の潜在的に有用な用途は次式に
よるグラミンディンＳ（２）の酵素的合成においてであ
る：

【００４８】

【化３】

【００４９】本発明で用途が見い出され、そして文献に
記載されるペプチド生成物の酵素的合成の種々の他の例
にはアンジオテンシン、サブスタンスＰ，エレドイシ
ン、ケルレイン及びロイーエンケファリンの合成があ
る。

【００５０】本分野に精通せる者は本発明がペプチド以
外の他の系に対する用途も見い出し得ることを認めるで
あろう。

【００５１】例えば、プロキラルなジカルボン酸ジエス
テルのキラルなモノエステルへの不斉分割に対するブタ
肝エステラーゼ［ＥＣ ３．１．１．１］のようなエス
テル加水分解酵素の使用が十分公知である［Ｃ．Ｊ．シ
ー（Sih) ら、Ann. N.Y. Acid. Sci. ４７１、２３９
（１９８６）］。膜を通してのキラルなエステルの選択
的移動及び反応相中での非反応性のエナンチオマー性酸
の保持を通してのラセミ性カルボン酸化合物の分割に対
して、本発明に記載される方法で同じ酵素を使用し得
る。

【００５２】更に本発明を説明するために次の詳細な実
施例を示す。

【００５３】

【実施例】 実施例１ アスパルテーム誘導体を本発明に従つて次の通りに製造
した：水１００ml中にＮ−ホルミル−Ｌ−アスパルチル
−β−ベンジルエステル ５.０２g（２０ミリモル）、
Ｌ−フエニルアラニンメチルエステル ４.３１g（２０
ミリモル）を含み、pH５.５に調整した溶液に全体で８
×１０^５の蛋白質分解単位を表わすサーモリシン酵素
［ダイワ化学社（Diwa Chem. Co.）、大阪、日本］５０
０mgを加えた。

【００５４】生じた透明な反応混合物を４０℃で１５時
間培養し、その際に不溶性ジペプチドＮ−ホルミル−β
−ベンジル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニン
メチルエステルの存在が明らかになつた。次に生じた混
合物を２００ml入りの容器中に置き、１平方フィートの
膜面積を与えるベンド・リサーチ社「タイプ１中空繊維
選択性透析膜」のこの場合はチューブ側である反応側に
接続した。膜の生成物側 ［分離器のシェル（Shell)
側］をアスペルギルス種（Aspergillus Sp.）（シグマ
Ａ２１５６）からの酵素アシラーゼＩ（ＥＣ ３．５．
１．１４）５００mgをｐＨ ７.５で含む水性（生成物）
混合物（全容量＝２００ml）の原料に接続した。通常は
アミノアシラーゼとして記載されるこの酵素がＮ−アセ
チル−及びＮ−ホルミル−β−ベンジルアスパルテーム
の両方に対してＣ−末端エステラーゼとして機能するこ
とが見い出された。

【００５５】反応及び生成混合物をしごきポンプを用い
て室温で中空繊維分離器を通して６００ml／分の速度で
向流的に循環させた。この装置の配置は第２図に示され
るものと似ている。両方の反応（縮合及びエステル加水
分解）はプロトゲン性（protogenic）であるため、反応
及び生成混合物の両方におけるpH値は反応が進行するに
従つて低下する。ｐＨスタットを用いて反応及び生成混
合物の両方におけるpH値を一定に保持する。

【００５６】Ｎ−ホルミル−β−ベンジル−Ｌ−アスパ
ルチルーＬ−フエニルアラニンの生成はＨＰＬＣにより
監視する。アミノ酸、十分に保護された生成ジペプチド
及びジペプチドの検出のために２５４nm に設定したＬ
ＤＣスペクトロモニターII検出器を備えた Tracor Mode
l ９９５装置でクロマトグラフ分析を行つた。用いたカ
ラムは Millipore Waters RCM−100 Radial Compressio
n Module 中に入れたNOVA-PAK C₁₈ Radial-Pakカートリ
ッジ、８mm ×１０cm であつた。

【００５７】十分に保護されたジペプチドの検出に用い
る移動相は４５％メタノール（ＨＰＬＣ級）５％テトラ
ヒドロフラン（ＨＰＬＣ級）；及び１％ ＫＨ₂ＰＯ_４
緩衝液５０％のｖ／ｖ混合物であつた。生成ジペプチド
の検出のために、移動相は４０％メタノール及び６０％
の１％ＫＨ₂ＰＯ₄緩衝液のｖ／ｖ混合物からなつていた
（テーリングを最小にするために１l当り１mlのトリエ
チルアミンを加え、そして８０％リン酸を用いてpH値を
４.３以下に調整した）。流速を１ml／分で保持した。

【００５８】Ｎ−ホルミル−β−ベンジル−Ｌ−アスパ
ルチル−Ｌ−フエニルアラニンの生成に関するＨＰＬＣ
データを下の第II表に要約し、そして時間の関数として
生成物溶液中に蓄積された生成ジペプチドの全量（mg）
として表わす。

【００５９】pH ５.５での水中のその飽和点に対応する
平衡時の非荷電のジペプチド濃度の値は２５℃で約０.
０５％であることが見い出された。膜１平方フィート当
り、１時間当りに移動する非荷電のジペプチドの量は約
２００mgであることが見い出され、このことは平衡の維
持に不溶性ジペプチドの溶解及び／または新たなジペプ
チド合成を必要とすることを示す。反応混合物中の不溶
性の非荷電相ジペプチドの殆んど完全な溶解は約５時間
後の反応が停止し時点で観察された。第II表のデータの
プロットを第３図に示す。直線的関数は膜を通つてのペ
プチドの移動が定常状態で進んでいることを示す。約２
００mg／ft²／時間（第II表）の生成ジペプチドの生成
の観察された速度は理論的理由から予期されたように、
水中にて０.０５％で測定された膜を通しての非荷電の
ジペプチドのフラックス（１９０mg／ft²／時間）と類
似していることが確認された。

【００６０】この点で、系を非荷電のジペプチドにおい
て飽和に保つために各々約１２０mg／時間の速度で２つ
のアミノ酸反応体の反応混合物に添加を続けた場合に上
記の系は定常状態を続けることが予期される。

【００６１】膜の選択性を十分に実現するために第二の
酵素と接触させる前に第一の膜と直列に第二の膜を挿入
することが必要であり、その理由は単一の膜を通しての
選択性は反応溶液中の高いアミノ酸濃度のために低いか
らである。

【００６２】生成物溶液（２００ml）を回収し、pH ２.
５に調整し、そして４℃で一夜冷却した。捕集した沈殿
を回収し、そしてＭｅＯＨ：Ｈ₂Ｏから再結晶してアス
ペルギルスエステラーゼを用いるＮ−ホルミル−β−ベ
ンジル−アスパルテームのバッチ式加水分解により調製
される確認された試料（ＩＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ）、
［α］²⁵ _D ＝ −５.３゜（ｃ＝１.３；ＥｔＯＨ）と同
様のＮ−ホルミル−β−ベンジル−Ｌ−アスパルチル−
Ｌ−フエニルアラニン ［α］²⁵ _D ＝ −５.６°（ｃ＝
１.２；ＥｔＯＨ）３０７mg が得られた。

【００６３】 実施例２ Ｌ−エナンチオマーの代りにＤ，Ｌ−フエニルアラニン
メチルエステル８.６３gを用いる以外は実施例１と同様
の実験を行つた。結果を第III表に要約する。生成物溶
液２００mlから非荷電のペプチドを単離し、Ｎ−ホルミ
ル−β−ベンジル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルア
ラニンの確認された試料（ＩＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ）とす
べてに関して同様の生成物、［α］²⁵ _D ＝−６.４°
（ｃ＝１.４；ＥｔＯＨ）３１０mg を得た。

【００６４】 第III表 時間（分） 量ペプチド／生成物溶液（mg） ３０ １６６ ６０ ２５８ １２０ ４７５ １８０ ６８６ ２４０ ９９６ ３００ １０７３ 第III表に要約したデータのプロット（第３図）は反応
器をＤ，Ｌ−フエニルアラニンメチルエステルを用いて
操作した場合に定常状態工程の存在を再び示した。実施
例１に記載と同様のＬ，Ｌ−ジペプチドのみの生成によ
りサーモリシンの立体特異性が示された。チューブ相に
保持されたＤ−フエニルアラニンメチルエステル（反応
混合物）はペプチド生成の全体的な動力学を示さなかつ
た。

【００６５】実施例３ 実施例１に従つて調製したＮ−ホルミル−β−ベンジル
−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニン１.０g、水
４.０ml、テトラヒドロフラン４.０ml及び濃塩酸（１２
Ｎ）１.０mlの混合物を還流下で９時間加熱した。次に
混合物を冷却し、そしてpH値を５０％ＮａＯＨ溶液で
４.０に調整した。次にテトラヒドロフランを＜３５℃
及び２０mmHg で蒸発により除去した。５℃で１時間貯
蔵して結晶化を完了させ、次に試料を濾過し、氷水１ml
で洗浄し、そして真空中で乾燥して白色の固体３６７mg
を生成させた。この物質はＨＰＬＣ及びＩＲと比較して
確認された試料であるアスパルチルフエニルアラニンと
同様であつた。

【００６６】［α］²⁵ _D ＝ ＋１２°（ｃ＝０.５；５０
％ＭｅＯＨ中の０.１Ｎ ＨＣｌ）。 Ｇ．Ｌ．バックマン(Bachman）及びＢ．Ｄ．バインヤー
ド(Vineyard)、米国特許第４,１７３,５６２号 実施例
１に記載と同様にメタノール及び塩酸での処理によりア
スパルチルフエニルアラニンをアスパルテーム転化し
た。

【００６７】実施例４ 反応体としてＮ−カーボベンゾキシ−Ｌ−アスパラギン
酸β−メチルエステル５.６５g（２０.１ミリモル）及
びＬ−フエニルアラニンメチルエステル４.３８g（２
０.３ミリモル）を用いる以外は実施例１と同様の実験
を行つた。アミノ酸を水１００mlに溶解し、溶液のpH値
を５.５に調整し、そしてサーモリシンダイワ５００mg
（８×１０^５蛋白質分解単位）を加えた。溶液を４０℃
で１５時間予備培養し、その際に実質量のＮ−ＣＢＺ−
（β−メチルエステル）−Ｌ−ａｓｐ−Ｌ−フエニルア
ラニンメチルエステルが沈殿した。懸濁液を１ ft² の
膜表面を含む「タイプ １ 中空繊維選択性透析膜」（ベ
ント・リサーチ社）のチューブ側に接続し、そしてpH７
でアシラーゼＩ（シグマ）５００mgを含む水２００mlの
シエル側相に対して機械を室温で５時間運転した。シエ
ル相におけるペプチド生成物の蓄積をＨＰＬＣで監視
し、そして結果を第IV表及び第４図に示す。

【００６８】５時間運転後に反応を停止し、シエル側相
（２００ml）を回収し、pH２.５に調整し、そして４℃
で一夜貯蔵した。沈殿した生成物を捕集し、そしてＣＨ
₃ＯＨ：Ｈ₂Ｏから再結晶して化学的結合及びアシラーゼ
Ｉを用いる部分的エステル分解により調製されたＮ−Ｃ
ＢＺ−イソ−ＡＰＭ、［α］²⁵ _D ＝ ＋５.５°（ｃ＝
１.１、ＥｔＯＨ）の確認試料と同様の（¹³Ｃ−ＮＭ
Ｒ）Ｎ−ＣＢＺ−（β−メチルエステル）−Ｌ−ａｓｐ
−Ｌ−フエニルアラニン（Ｎ−ＣＢＺ−イソ−ＡＰＭ）
［α］²⁵ _D ＝ ＋６.０°（Ｃ＝１.１、ＥｔＯＨ）４０
５mg（回収率８６％）が得られた。

【００６９】 第IV表 時間（分） 量ペプチド／生成物溶液（mg） ３０ １７７ ６０ ２１４ １２０ ３３３ １８０ ３８１ ２４０ ４５９ ３００ ４７０ 前記の実施例１及び２の実験において観察されたよう
に、第４図のプロットはＮ−ＣＢＺ−イソ−ＡＰＭの蓄
積が約２００mg／時間の定常速度で進んでいることを示
す。

【００７０】Ｎ−ＣＢＺのＡＰＭへの転化は実施例３に
記載の条件下で実施し得る。

【００７１】実施例５ アスパルテーム誘導体、Ｎ−ホルミル−（β−メチル）
−ａｓｐ−ｐｈｅを本発明に従つて次のように製造し
た：pH７.０に調整した、水１００ml中にＮ−ホルミル
−（β−メチル）−Ｌ−アスパラアギン酸６.００g（３
５ミリモル）、Ｌ−フエニルアラニンメチルエステル１
０.００g（４８ミリモル）を含む溶液に全体で１．２×
１０^６蛋白質分解単位を表わすサーモリシン酵素（ダイ
ワ化学社、大阪、日本）７７０mgを加えた。生じた透明
な溶液を４０℃で１時間培養し、その際にＨＰＬＣ分析
はＮ−ホルミル−（β−メチル）−ａｓｐ−ｐｈｅ−Ｏ
Ｍｅ４３３.８mgの存在を示した。溶液を２５℃に冷却
し、pH値を５.０に調整し、そして溶液をドデカン中の
３０％ｖ／ｖＮ，Ｎ−ジエチル−ドデカンアミドからな
るＩＬＭの０.５ ft^２（４５０cm^２）を与える中空繊維
分離器（「タイプ ２中空繊維選択性透析膜」、ベンド
・リサーチ社）のチューブ側に接続された２００ml入り
の容器中に置いた。分離器のシエル側をpH７.５で、ア
スペルギルス種（アミノアシラーゼ ＡＭＡＮＯ、名古
屋、日本）からの酵素アシラーゼＩ（ＥＣ３．５．１．
１４）５００mgを含む生成物容器に接続した。

【００７２】２つの相を第２図に示す配置の２台のしご
きポンプを用いて５０ml／分（チューブ相）及び５００
ml／分（シエル相）の速度で２５℃で向流させて循環し
た。pHスタットを用いて両相のpHを一定に保つた。

【００７３】Ｎ−ホルミル−（β−メチル）−ａｓｐ−
ｐｈｅの生成は２５４nm に設定したＬＤＣスペクトロ
モニターII検出器を備えた Tracor Model−９９５装置
を用いてＨＰＬＣにより監視した。用いたカラムは Mil
lipore Waters RCM-100 Radical Compression Module
中に設置されたNOVA-PAK Ｃ１８ Radial-Pak カートリ
ッジ、８mm × 100 mm であつた。

【００７４】分析に用いた移動相は次のものであつた： （ａ）Ｎ−ホルミル-（β-メチル）-ａｓｐ−ｐｈｅ−
ＯＭｅ に対して：０.１％ ＫＨ₂ＰＯ_４緩衝液 pH４.６
中の４０％ｖ／ｖメタノール； （ｂ）Ｎ−ホルミル−（β−メチル）−ａｓｐ−ｐｈｅ
に対して：０.１％ＫＨ₂ＰＯ_４pH ４.６中の２０％ｖ
／ｖメタノール；用いた流速は両分析に対して１ml／分
であつた。

【００７５】Ｎ−ホルミル−（β−メチル）−ａｓｐ−
ｐｈｅ（生成物ジペプチド）の生成に関連したデータを
下の第V表に示し、そして時間の関数としてシエル相２
００ｍｌ中に蓄積された全量（mg）として表わす。

【００７６】 第V表のデータのプロットを第５図に示す。

【００７７】運転の最終時でのＨＰＬＣ分析によりチュ
ーブ相中にＮ−ホルミル−（β−メチル）−ａｓｐ−ｐ
ｈｅ−ＯＭｅ ２８３mgの存在が示された。これらの値
により反応器の運転中に合成されたペプチドの量が計算
できた。

【００７８】Ｐｔｒ＝シエル相中に移動されたペプチド
＝

【００７９】

【数１】

【００８０】Ｐｏ＝チューブ相中の初期ペプチド＝４３
３．８ｍｇ Ｐ_T ＝運転の最終時にチューブ相中に残留するペプチド
＝２７３ｍｇ； Ｐｔｒ＝（Ｐｏ−Ｐ_T）＋Ｐｓｙｎ； Ｐｓｙｎ＝Ｐｔｒ−（Ｐｏ−Ｐ_T）＝２６６．６ｍｇ；
及び

【００８１】

【数２】

【００８２】５３.５mg／時間・１００mlのＶsyn はサ
ーモリシンの存在下でのＮ−ホルミル−（β−メチル）
−Ｌ−アスパラギン酸及びＬ−フエニルアラニンメチル
エステルに関して行われた平衡実験における前方速度に
対して測定された合成の速度（５００mg／時間−ｌ）と
一致した。

【００８３】生成物溶液（２００ml）を回収し、１Ｎ
ＨＣｌ でpH２に調整し、そしてＥｔＯＡｃ ２００mlで
２回抽出した。蒸発させた際に一緒にした抽出液から白
色の残渣が残り、このものをＥｔＯＡｃ／ヘキサンから
再結晶した後にアスペルギルス・エステラーゼを用いる
合成Ｎ−ホルミル−（β−メチル）−Ｌ−ａｓｐ−Ｌ−
ｐｈｅ−ＯＭｅ のバッチ式加水分解により調製される
確認された試料、［α］²⁵ _D ＝ ＋０.８０°（ｃ、０.
２９；ＭｅＯＨ）と同様の（ＩＲ、¹³Ｃ−ＮＭＲ）Ｎ−
ホルミル−（β−メチル）−Ｌ−ａｓｐ−Ｌ−ｐｈｅ、
［α］²⁵ _D ＝＋０.７０°（ｃ、０.２０；ＭｅＯＨ）１
００mgが得られた。

【００８４】実施例６ 実施例５に記載の実験を液体膜（ドデカン中の３０％ｖ
／ｖＮ，Ｎ−ジエチル−ドデカンアミド）１ ft^２を含
むタイプ２中空繊維透析膜（ベンド・リサーチ社）にお
いてスケールアップした。チューブ相はpH７.０に調整
された、水４００ml中にＬ−ｐｈｅ−ＯＭｅ 40g、Ｎ−
ホルミル−（β−メチル）−Ｌ−ａｓｐ２４g及びサー
モリシン・ダイワ ３.０８g（全体で５×１０^６蛋白質
分解単位）を含んでいた。４０℃で１時間の培養期間
後、１.０６８g（２.７ｇ／ｌ）の量のＮ−ホルミル
（β−メチル）−Ｌ−ａｓｐ−Ｌ−ｐｈｅ−ＯＭｅが存
在することが見い出された。溶液を２５℃に冷却し、１
Ｎ ＨＣｌでpH５.０に調整し、そして中空繊維反応器の
チューブ側に接続した。シエル相はアミノアシラーゼＩ
［アマノ（Amano）］２ｇを含むpH７.５の水４００mlか
らなつていた。２つの相を実施例５に記載のように２５
℃で５時間向流で循環した。結果を第VI表及び第６図に
要約する。

【００８５】 運転の最終時にチューブ相に残つたＮ−ホルミル−（β
−メチル）−ａｓｐ−ｐｈｅ−ＯＭｅの量は５８６mgで
あつた。

【００８６】最初の３０分間中に観察された最高の移動
値（４０４mg／時間）は予備培養期間中に生成される高
い初期ペプチド濃度の結果である。ペプチドの移動によ
り生じる平衡からのずれにより更にペプチドの合成が始
まり、かくて２００mg／時間の予想値で最初の１時間の
運転後の定常状態が達成された（第６図）。

【００８７】実施例７ Ｌ−エナンチオマーの代りにＤ，Ｌ−フエニルアラニン
メチルエステル１０.００gを用いる以外は実施例５と同
様の実験を行つた。第VII表及び第７図に与えられる結
果はサーモリシンのエナンチオ選択性及び前記の実施例
１及び２の結果から予期されるように、Ｎ−ホルミル−
（β−メチル）−Ｌ−ａｓｐ−Ｌ−ｐｈｅの生成の観察
された速度がＬ−ｐｈｅ−ＯＭｅで見られるもの（実施
例５、第V表）の１／２であることを示す。

【００８８】 実施例８ Ｄ，Ｌ−フエニルアラニンメチルエステルの膜を用いる
酵素的分割を本発明に従つて次のように利用した：pH
７.５の水１００ml中のＤ，Ｌ−フエニルアラニンメチ
ルエステル１.０g（５.６ミリモル）の溶液にアミノア
シラーゼＩ（アマノ製薬会社、名古屋、日本）５００mg
を加えた。混合物を２５℃で３０分間反応させ、その終
了時にＨＰＬＣ分析によりＬ−ｐｈｅ ２６６mg（１.６
ミリモル）及びＤ，Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ ７１２mg（４
ミリモル）の存在が観察された。この溶液をその中にド
デカン液体フイルム中の３０％ｖ／ｖ Ｎ，Ｎ−ジエチ
ル−ドデカンアミド０.５ ft^２を含む中空繊維セルガー
ド担持させたＩＬＭ分離器（「タイプ２中空繊維選択性
透析膜」、ベンド・リサーチ社）のチューブ（反応）側
に供給した。膜の生成物側（分離器のシエル側）を希Ｈ
ＣｌでpH２.０に調整した水２００mlで満たした。２つ
の相をしごきポンプを用いて向流で分離器を通して２０
０ml／分の速度で循環させた（第２図）。１時間当り約
１gのＤ，Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＭｅの速度でＤ，Ｌ−Ｐｈｅ
−ＯＭｅをチューブ相に連続的に加えて分離を進めた。
pH７.５の水中の全体で３０mlのＤ，Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＭ
ｅ（２.１g、；１１.７ミリモル）の７％溶液を２時間
の期間中に加えた。pHスタットを用いて両相のpH値を一
定に保つた。

【００８９】３０分毎に試料を両相から採取して分割の
過程をＨＰＬＣにより追跡した。ＨＰＬＣ装置及び方法
は実施例５に記載のものである。この場合に用いた移動
相は０.１％ＫＨ₂ＰＯ_４緩衝液pH４.６中の２０％ｖ／
ｖメタノール；流速１ml／分であつた。第VII表で与え
られ、そして第８図にプロットされた結果はチューブ相
中でのＬ−Ｐｈｅ及びシエル相中でのＤ−Ｐｈｅ−ＯＭ
ｅの蓄積を示す。実験の終了時に次のように両相を回収
し、そして処理した： （ａ）チューブ相：内容物（１３０ml）を１Ｎ ＮａＯ
ＨでpH８.５に調整し、次にＥｔＯＡｃ ２×５０mlで抽
出した。次に水相を１Ｎ ＨＣｌでpH４.０に調整し、そ
して溶液を２.５×２０cm Dowex ５０（ＮＨ₄）カラム
に通した。水２００mlで洗浄後、生成物を１０％ＮＨ₄
ＯＨ ２００mlで溶出した。溶出液を真空中で５０mlに
濃縮し、そして溶液を凍結乾燥した。収量：２４９mg、
白色固体、Ｌ−フエニルアラニン、［α］²⁵ _D ＝ −２
９.２°（ｃ、２；Ｈ₂Ｏ）、文献（アルドリッチ）
［α］²⁵ _D ＝ −３５.０°（ｃ、２；Ｈ₂Ｏ）、光学的
純度９２％。

【００９０】（ｂ）シエル相：（２００ml）を希釈Ｎａ
ＯＨでpH８.５に調整し、そしてＥｔＯＡｃ ２×５０ml
で抽出した。有機抽出液を無水Ｎａ₂ＳＯ_４上で乾燥
し、乾固するまで蒸発させ、１Ｎ ＨＣｌでpH３.０に酸
性にした水５０mlに溶解し、次に凍結乾燥し、Ｄ−Ｐｈ
ｅ−ＯＭｅ ＨＣｌ ９８９mg（４.６ミリモル）、白色
固体、［α］²⁵ _D ＝ −２１.０°（ｃ、２；ＥｔＯ
Ｈ)、文献(アルドリッチ)［α］²⁵ _D ＝ −３２.４°
（ｃ、２；ＥｔＯＨ)、光学的純度８３％を得た。

【００９１】この膜上のＰｈｅ−ＯＨｅ（水、pH８、２
５℃）に対して見い出された３２mg／cm²・分の透過選
択性値をベースに、４５０cm^２(０.５ft^２)の膜面積に
対して予期されたフラックスは８８０mg／時間であつ
た。第VIII表は最初の時間の最終時にシエル相中に移動
したＰｈｅ−ＯＭｅの量は８６０mgであり、このことは
移動が膜限定条件下で行われたことを示唆することを示
す。

【００９２】 第VIII表 D,L-Phe-OMe チューブ相 シエル相 添加量（g) L-Phe(mg) D,L-Phe-OMe(mg) D-Phe-OMe(mg） 1.0 266 712 0 ( 0 min) 1.7 473 617 537 (30 min) 2.4 615 531 860 (60 min) 3.1 743 628 1154 (90 min) サブチリシンＡ（セリンタイプ アルカリ性プロテアー
ゼ）により触媒されたメチルエステル官能基のエナンチ
オ選択性加水分解を通してのＤ，Ｌ-Ｐｈｅ−ＯＭｅの
バッチ式分割が最近開示された［スイーテイン・チエ
ン、クングーツング・ワング及びチーフェイ・ウォング
（Shui-Tein Chem、 Kung-Tsung Wang andChi-Huey Won
g）、J. Chem. Soc. Chem. Commun. １９８６，１５１
４］。ラセミ性カルボン酸化合物の膜分割に対して加水
分解酵素が必要とされた。アミノアシラーゼＩ、α−キ
モトリプシン及びサブチリシンＡの如きエステラーゼで
ある加水分解酵素をＤ，Ｌ−フエニルアラニンメチルエ
ステルの如き、Ｄ，Ｌ−アミノ酸化合物を分割するため
に利用することができた。アミノアシラーゼＩは強い蛋
白質分解活性を有するサブチリシンＡ及びα-キモトリ
プシンの如き他のエステル分解酵素よりペプチドの脱メ
チル化に対して一般に好ましい。

【００９３】Ｄ，Ｌ−フエニルアラニンメチルエステル
の上記の分割を本発明に記載されるペプチドを生成させ
るために利用した場合、生じたＬ−フエニルアラニンを
本分野で公知の標準的メチル化によりメチル化した。

【００９４】この実施例は他のラセミ性カルボン酸の分
割に採用し得る。例えば、加水分解酵素を含む水性反応
混合物中のラセミ性カルボン酸エステル化合物を加水分
解して水性反応混合物中に荷電したエナンチオマー性化
合物及び非荷電のエナンチオマーエステル化合物を生成
させることができた。次に非荷電のエステル化合物をベ
ント・リサーチ社製のタイプ１またはタイプ２中空繊維
選択性透析膜を含む本発明のイオン排除膜を通して水性
反応混合物から移動した。実施例８の如き実施例の１つ
のタイプにおいて、ラセミ性カルボン酸エステル化合物
は、Ｄ，Ｌ−アミノ酸エステル化合物であり；荷電した
エナンチオマー性化合物はＬ−アミノ酸化合物であり、
そして非荷電のエナンチオマー性エステルはＤ−アミノ
酸エステル化合物であつた。酵素及び反応条件の選択は
本発明の分野に精通せる者の理解及び知識の範囲内であ
ることが認められよう。

【００９５】連続またはバッチ式処理装置は反応体の所
望のエナンチオマーを製造し、そして反応混合物に加え
得るこの実施例により与えられる。

【００９６】実施例９ 本発明によるＮ−ホルミル−(β−メチル)−Ｌ−ａｓｐ
−Ｌ−ｐｈｅの合成を次のように固定化されたアミノア
シラーゼＩ及び透過性生成物の除去に対するイオン交換
樹脂を用いて行つた：pH７.０に調整した脱イオン水１
００l中のＬ−フエニルアラニンメチルエステル１０.０
g（４８ミリモル）及びＮ−ホルミル−（β−メチル）
−Ｌ−アスパラギン酸６.０g（３５ミリモル）の溶液に
全体で１.２×１０^６蛋白質分解単位を表わすサーモリ
シン（ダイワ化学会社、大阪、日本）７７０mgを加え
た。生じた溶液を４０℃で１時間培養し、その際にＨＰ
ＣＬ分析はＮ−ホルミル−（β−メチル）−ａｓｐ−ｐ
ｈｅ−ＯＭｅ ３８３mgの存在を示した。溶液を２５℃
に冷却し、pH値を５.０に調整し、そして溶液をドデカ
ン中の３０％Ｎ，Ｎ−ジエチル−ドデカンアミドからな
る疎水性液体膜９００cm^２（１ft^２）を含む中空繊維分
離器４４（「タイプ２中空繊維選択性透析膜」、ベンド
・リサーチ社）のチューブ側４６に接続された２００ml
入りの容器４０中に置いた。分離器４８のシエル側を第
９図に示す一連の結合用容器からなる閉鎖された回路と
して配置した。分離器４４に戻つた溶液をジペプチドＮ
−ホルミル−（β−メチル）−ａｓｐ−ｐｈｅ−ＯＭｅ
と共透過するＬ−ｐｈｅ−ＯＭｅをプロトン化するため
にpH４.０に調整した。Dowex ５０（Ｎａ⁺）５０のカ
ラムを通して循環させて正に荷電したＬ−ｐｈｅ−ＯＭ
ｅを除去し、溶液中に非荷電のジペプチドを残した。溶
離液をpH７.０に調整し、そしてＤＥＡＥ−Sephadex５
２上に固定化されたアミノアシラーゼＩの作用に付した
［Ｔ．トサ（Tosa）、Ｔ．モリ（Mori）及びＩ．シバタ
（Chibata）、Agr. Biol. Chem. ３３、１０５３（１９
６９）］。生じたジペプチドＮ−ホルミル−（β−メチ
ル）−ａｓｐ−ｐｈｅをこのpH値で負に荷電し、そして
続いてDowex １（Ｃｌ^-）樹脂５４により捕捉した。溶
離液をpH４.０に調整する前に膜分離器に戻し、かくて
ループを閉鎖した。

【００９７】チューブ４６（１００ml）及びシエル４８
（５００ml）相を５０ml／分（チューブ相）及び１２０
ml／min （シエル相）の速度で膜分離器を向流で通して
２５℃で循環させた。

【００９８】定期的なシエル相のサンプリングを第二の
酵素（Ｅ_２）からの溶出液上で行い、（第９図、サンプ
リングポート５６、Dowex １（Ｃｌ^-）カラム５４に入
る前）そして試料を実施例５に記載される方法に従つて
ＨＰＬＣにより監視した。予期されたように、回路のこ
の時点で（第９図）Ｅ_２によるＬ−ｐｈｅ−ＯＭｅの酵
素的加水分解から生じさせることができたＬ−ｐｈｅ
（実施例８参照）が検出されず；Ｎ−ホルミル−（β−
メチル）−ａｓｐ−ｐｈｅの循環した定常状態量（平均
濃度：５４mg／l）が観察され、このことは膜を通つて
のジペプチド−Ｎ−ホルミル−（β−メチル）−ＡＰＭ
の連続的移動及び続いてのそのＥ_２による加水分解を反
映した。Dowex−１樹脂による荷電したペプチドの効率
的捕捉は運転を通しての点Ａで観察されたこのものの低
い濃度により示される。上で議論された結果から予想で
きるように、シエル相中のDowex−１ペプチドを存在さ
せずに同様の平行実験を行つた。再び、循環するシエル
相中にＬ−ｐｈｅは見い出されなかつた。両方の実験の
比較を第１０図及び第IX表に示す。

【００９９】 第IX表 mgＮ−ホルミル−（β−メチル）−ａｓｈ−ｐｈｅ／シエル相 時間（分） 実施例1．Dowex １存在 実施例2. Dowex １無し 30 31.6 30.2 60 -- 37.8 120 26.0 71.8 180 35.4 83.1 240 45.6 -- 300 51.2 -- この実施例に記載されるようにイオン交換樹脂を用いて
生成混合物中にイオン排除膜を共透過するフエニルアラ
ニン低級アルキルエステルを分離することに加えて、生
成混合物中にイオン排除膜を共透過するアスパルギン酸
をかかる樹脂を用いて分離することができた。生成混合
物から膜を通して逆拡散し得ない種または生成物をかか
るイオン交換樹脂を用いて除去することができた。ま
た、イオン交換樹脂分離と当価である電気泳動、電気透
析及び膜分離を含むが、これに限定されない本分野に公
知の他の分離方法を本発明に利用できる。

【０１００】縮合酵素を固定化することによりチューブ
相中での酵素反応を望ましい酵素反応の平衡を含む反応
体、生成物（複数）及び酵素を考慮して酵素反応の最適
の効率に好ましい初期反応混合物pHで行うことができ
る。場合によつては、非荷電の生成物を膜を通してチュ
ーブ相からシエル相に移動する際に第二の反応混合物pH
が膜効率を最大にするようにチューブ相中の最初の反応
混合物pHを膜と接触させる前に第二の反応混合物pHに再
調整することができる。第９図はチューブ相中の最初の
反応混合物pHを第二の反応混合物pHに調整することを示
していない。

【０１０１】同様に、シエル相中のエステラーゼを固定
化することができ、そしてシエル相中の生成混合物のpH
値を調整し、且つ最も効率的な処理を行う必要がある場
合に再調整することができる。実施例８及び上の実施例
は本発明を用いる効率的な連続的またはバッチ式処理に
対する追加の方法を与える。連続的処理において、所望
の反応体のエナンチオマー及びいずれかの共透過化合物
をチューブ相または反応混合物に戻すことができる。

【０１０２】

【発明の効果】本発明はアスパルテーム並びに薬理学的
に活性であるペプチドを含む他のペプチドを製造するた
めに使用し得る。

【図面の簡単な説明】

【図１】は本発明によるアスパルテームの酵素的合成の
説明図である。

【図２】本発明の方法を実施する際の装置の説明図であ
る。

【図３】実施例１及び２において時間に対して生じた生
成物（アスパルテーム誘導体）の量を示す図である。

【図４】実施例４において時間に対して生じた生成物
（アスパルテーム誘導体）の量を示す図である。

【図５】実施例５において時間に対して生じた生成物
（アスパルテーム誘導体）の量を示す図である。

【図６】実施例６において時間に対して生じた生成物
（アスパルテーム誘導体）の量を示す図である。

【図７】実施例７において時間に対して生じた生成物
（アスパルテーム誘導体）の量を示す図である。

【図８】実施例８において時間に対して生じた生成物
（アスパルテーム誘導体）の量を示す図である。

【図９】実施例９に記載される生成物側に対する容器を
説明する本発明を実施する際の装置の説明図である。

【図１０】実施例９においてイオン交換樹脂を用い、そ
して用いずに時間に対して生じた生成物（アスパルテー
ム誘導体）の量を示す図である。

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 加水分解酵素を含む水性反応混合物中
   で、ラセミ性カルボンエステル化合物を加水分解して水
   性反応混合物中に変性したエナンチオマー性化合物及び
   非荷電のエナンチオマー性エステル化合物を生成させ；
   そして非荷電のエナンチオマー性エステル化合物をイオ
   ン排除膜を通して生成物混合物中に水性反応混合物から
   移動する工程を含んでなるラセミ性カルボン酸化合物の
   酵素分割方法。
2. 【請求項２】 ラセミ性カルボン酸エステル化合物が
   Ｄ，Ｌ−アミノ酸エステル化合物であり；荷電したエナ
   ンチオマー性化合物がＬ−アミノ酸化合物であり；そし
   て非荷電のエナンチオマー性化合物がＤ−アミノ酸エス
   テル化合物である請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 生成混合物中の非荷電のＤ−アミノ酸エ
   ステル化合物を膜を通つて逆拡散し得ない種に転化する
   工程をさらに包含する請求項２記載の方法。
4. 【請求項４】 転化の工程が生成混合物のpH値を約２.
   ０のpH値に調整することからなる請求項３記載の方法。
5. 【請求項５】 加水分解酵素がアミノアシラーゼＩ、α
   −キモトリプシン及びサブチリシンＡよりなる群から選
   ばれる請求項３記載の方法。
6. 【請求項６】 加水分解酵素を固定化する請求項３記載
   の方法。
7. 【請求項７】 膜が毛管現象により細孔性シート中の細
   孔中に固定化された水と混和しない有機液体からなり、
   その際に有機液体が非荷電のペプチドに対する溶媒であ
   る請求項３記載の方法。
8. 【請求項８】 細孔性シートをポリテトラフルオロエチ
   レン及びポリプロピレンよりなる群から選ばれた物質か
   ら製造し、そして溶媒がｎ−１−デカノール、ｎ−ヘキ
   サデカノール、ｎ−ドデカノール、Ｎ，Ｎ−ジエチル−
   ドデカンアミド、ドデカン、２−ウンデカノン及びその
   混合物よりなる群から選ばれる少なくとも１つの化合物
   である請求項７記載の方法。
9. 【請求項９】 細孔性シートがポリプロピレン中空繊維
   を含んでなり、そして溶媒がＮ，Ｎ−ジエチル−ドデカ
   ンアミド及びドデカンを含んでなる請求項７記載の方
   法。
10. 【請求項１０】 膜がベンド、タイプ２中空繊維選択性
    透析膜である請求項７記載の方法。
11. 【請求項１１】 Ｄ，Ｌ−アミノ酸エステル化合物がα
    −アンモニウム基を有するＤ，Ｌ−フエニルアラニン低
    級アルキルエステルである請求項３記載の方法。
12. 【請求項１２】 Ｄ，Ｌ−フエニルアラニン低級アルキ
    ルエステルがＤ，Ｌ−フエニルアラニンメチルエステル
    である請求項１１記載の方法。
13. 【請求項１３】 荷電したＬ−アミノ酸化合物を水性の
    出発反応混合物中で第二のアミノ酸化合物と酵素的に縮
    合させて非荷電の化合物を生成させ；非荷電の化合物を
    実質量のアミノ酸化合物を移動し得ない膜を通して第二
    の水性反応混合物中に移動し；そして移動した非荷電の
    化合物を膜を通つて出発反応混合物に再移動し得ない状
    態に転化する工程をさらに包含する請求項３記載の方
    法。
14. 【請求項１４】 膜を通つて第二の水性反応混合物中に
    共透過するアミノ酸化合物を分離する工程をさらに包含
    する請求項１３記載の方法。