JPH04502558A - ペプチドの合成および分離の酵素膜方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ペプチドの合成および分離の酵素膜方法関係する出願に対する相互参照 これは、１９８６年８月１８日提出の米国特許出願第０６／８９７゜６７９号お よび１９８７年７月２８日提出の米国特許出願第０７１０７８．５０４号の一部 継続出願である。

説明 技術分野 本発明は、非帯電のペプチドに対して透過性であるが、帯電した分子に対して不 透過性である膜を使用するペプチドの合成および分離の酵素的方法に関し、そし て、さらに詳しくは、ペプチド、Ｌ、Ｌ−ペプチドの同時の合成および精製、お よびＬ−アスパルチル−し−フェニルアラニンメチルエステル（アスバルテイム ）の調製へのその適用に関する。

背景の技術 ２つのし一アミノ酸の立体特異的カップリングしてり、Ｌ−ペプチドを生成する 縮合触媒としてタンパク質分解酵素を使用することは知られている。なぜなら、 １９３８年程度に早期に、バーブマン（Ｂ　ｅ　ｒ　ｇｍａｎｎ）およびフレン ケルーコンラット（Ｆｒａｅｎｋｅ　１−Ｃｏｂｒａｔ）は、タンパク質分解性 酵素のパパインの存在下にＢｚ−Ｌｅｕ−ＯＨおよびＨ−Ｌｅｕ−ＮＨＰｈを反 応させることによって、水不溶性ジペプチドＢｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ　ＮＨＰｈを 形成することを記載したからである。Ｍ、バーブマン（Ｂｅｒｇｍａｎｎ）およ びＨ，フレンヶルーコンラット（Ｆｒａｅｎｋｅｌ−Ｃｏｂｒａｔ）、ジャーナ ル・オン・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、１２ ４．１　（１９３８）。この反応は、パパインまたは他の使用する酵素による切 り放しに対して感受性であるペプチド結合を形成する、アミノ酸の間においての み、可能である。事実、アミノ酸反応成分とペプチド生成物との間の縮合反応の 平衡は、反応するアミノ酸に向かって大きく変位する。それにもかかわらず、縮 合反応は、例えば、ペプチド生成物が溶解性に劣り、そして反応相の中から外に 沈澱する場合、完結に推進することができる。

ある種のペプチドの商業的重要性および酵素は温和な条件下にペプチドの形成を 触媒することが知られているという事実のために、ペプチド、とくに簡単なジペ プチドの酵素的合成について実施された、多数の研究が存在する。Ｋ、オーヤマ およびに、キハラ、カガク・ソウセラ（Ｋａｇａｋｕ　５ｏｓｅｔｕ）、３５． １９５　（１９８２）；に、オーヤマおよびに、キハラ、ケムテク（ＣｈｅｍＴ ｅｃｈ）　、１４．１００（１９８４）。

米国特許第４，１６５，３１１号に記載されている、ペプチド誘導体のアスパル テイムの酵素的合成の方法、以後゛　３１１方法と呼ぶ、は、Ｎ−カルボキシベ ンゾキシ−Ｌ−アスパラギン酸とり、Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルとの サーモリシン触媒縮合、および中間体の錯体、Ｎ−カルボキシベンゾキシーアス パルテイムのＤ−フェニルアラニンメチルエステル塩を沈澱させて、ペプチド生 成物側に反応を推進させることを包含する。この中間体の錯体をさらに処理する と、Ｄ−フェニルアラニンメチルエステルおよびＮ−カルポキシベンゾキシーア スバルテイム誘導体を回収することができ、モしてＤ−フェニルアラニンメチル エステルはラセミ化のために再循環することができ、モしてＮ−カルボキシベン ゾキシーアスパルティム誘導体はＮ−カルボキシベンゾキシ−保護基の排除によ りアスパルティムに転化することができる。゛　３１１方法はバッチ式に実施し な（てはならなず、このバッチ式は面倒でありそして酵素の回収を複雑にする。

また、参照、Ｋ、オーヤマ、Ｓ、イリノ、Ｔ、ハラダおよびＮ、ハギ、アナル・ オン・ニューヨーク・アカデミ−・オン・サイエンシズ（Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａｃ ａｄ、Ｓｃｉ、）ｓ　４３４．９５　（１９８５）。

Ｎ−カルボキシベンゾキシ保護基は、次によって°　３１１方法において本質的 な役割を演する：サーモリシンの活性により付与された構造的要件を満足する： および、中間体の錯体の不溶性に寄与し、これにより反応の収率を増加する。ア スパルテイム誘導体からのＮ−カルボキシベンゾキシ−保護基の排除は、温和な 条件下に、例えば、触媒水素化下に、実施してメチルエステル官能の切り放しを 防止しなくてはならない。触媒水素化は、大規模で水素ガスを取り扱うという不 便を包含する。

酵素的縮合反応を完結に推進するための別のアプローチは、また、化学文献に記 載されてきている。例えば、反応媒質として有機溶媒を使用することはペプチド 生成物の収率を増加するために有効であることが発見された：しかし、酵素安定 性の同時の減少は大規模のその実施を妨げる。Ｋ、オーヤマ、Ｓ、ニジムラ、Ｙ 、ノナ力、Ｋ、キハラおよびＴ。

ハシモト、ジャーナル・オン・オーガニック・ケミストリー（Ｊ、　Ｏｒｇ、Ｃ ｈｅｍ、）　、４６．５２４１　（１９８１）；Ｈ，オーンマ、Ｈ。

モリおよびＹ、ハラノ、バイオテクノロジー・レターズ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）、３．４５９　（１９８５）。

ペプチドの酵素的合成のための先行技術の方法の実施における前述の困難、とく に、中間体の錯体の沈澱および危険な試薬の取り扱いの要件にかんがみて、これ らの困難を回避しかつ、酵素触媒の迅速な不活性化なしに、有効な収率を安全に 提供する、改良された方法を提供することは望ましいであろう。

発明の開示 本発明は、ペプチド生成物の同時の合成および精製を提供する、ペプチドの酵素 的合成法を提供する。

本発明は、ペプチドおよびそれらの誘導体、とくにアスパルティムの安全な、経 済的および効率よい合成および精製の方法を提供する。

本発明の他の利点は、酵素の効率よい使用を提供する、ペプチドの酵素的合成の 経済的方法、および連続的基礎で合成を実施する手段を提供することである。

本発明の他の利点は、アスパルテイムおよびり、　Ｌ−フェニルアラニンおよび Ｎ−保護されたーβ−置換−Ｌ−アスパルテートとのその誘導体を、実質的に定 量的収率で酵素的に合成するために、とくに適合させる方法を提供することであ る。

本発明は、第１反応成分を第２反応成分とカップリングさせて、膜移送可畦な、 非帯電の化合物を生成させ：反応成分を移送しない膜を横切って移送可能な化合 物を移送し；そして移送された化合物が膜を横切って逆拡散するのを防止する、 工程からなる、化合物の合成および精製の方法を提供する。

本発明は、また、プロトン化されたアミノ基（アンモニウム）を含む、第１化合 物、および遊離カルボキシレート基を含む、第２化合物を、縮合酵素を使用して 、水性混合物中でカップリングして、非帯電の（非イオン化）カップリングされ た化合物を生成し：非帯電のカップリングした化合物を選択的に膜の生成物側に 移送する膜を横切る拡散により、非帯電のカップリングした化合物を水性混合物 から連続的に取り出す、工程からなる、化合物を酵素的に合成および精製する方 法を提供する。好ましくは、移送されたカップリングされた化合物は、帯電した （またはイオン化した）分子に転化されるペプチドまたはその誘導体であるので 、それは膜を横切って逆拡散しない。こうして、カップリングした化合物の生成 物の形成は反応混合物中で推進される。なぜなら、それはそれから一定に取り出 されるからである。

本発明は、また、第１および第２のアミノ酸化合物を水性初期反応混合物中で縮 合して、非帯電の化合物を形成し；実質的な量のアミノ酸化合物を移送しない膜 を横切って、非帯電の化合物を水性第２反応混合物の中に移送し：そして膜を横 切って初期の反応混合物に再移送することができない形態に、移送された非帯電 の化合物を転化する、工程からなる、ペプチドの酵素的合成の方法を提供する。

膜を横切って再移送することができない、移送された化合物は、第２反応混合物 から取り出すことができる。また、膜を非帯電の化合物とともに同時に透過する 、少量の第１および第２のアミノ酸化合物は、第２反応混合物から分離し、そし て必要に応じて初期の反応混合物に戻すことができる。

本発明は、また、α−カルボキシレート基を含むＮ−アシル−β−置換−Ｌ−ア スパラギン酸をα−アンモニウム基を含むフェニルアラニン低級アルキルエステ ルと、縮合酵素を含む水性反応混合物中で、縮合して、Ｎ−アシル−し−アスパ ルチル−（β−置換）−Ｌ−フェニルアラニン低級アルキルエステル（例えば、 １〜６個の炭素原子）、非帯電のペプチド、を形成し：そして非帯電のペプチド を水性反応混合物から生成物の混合物に、透過選択的膜を横切って、移送する、 工程からなる、アスパルチルムおよびその類似体を酵素的に合成する方法を提供 する。

１つの実施態様において、ｐＨ５またはそれ以上において実施するタンパク質合 成のために、好ましいアシル基はホルミルであり、好ましいベータ置換基はメチ ルであり、好ましい低級アルキルエステルはイソプロピルであり、そして好まし い縮合酵素はサーモリシンである。他の実施態様において、ｐＨ４またはそれ以 上において実施するタンパク質合成のために、好ましいアシル基はカルボキシベ ンゾキシであり、好ましいベータ置換基は水素（β−ＣＯＯＨ）であり、好まし い低級アルキルエステルはメチルであり、そして好ましい縮合酵素はペプシンで ある。他の実施態様において、後者の場合において、透過性アスパルティム中間 体はＮ−ＣＢＺ−ａｓｐ−ｐｈｅ−ＯＭｅであり、ここでアスパラギン酸の遊離 β−カルボキシレートの帯電を保護により抑制してペプチドを透過性とされてい る。

本発明は、また、キラル炭素原子に結合した少なくとも１つの加水分解可能な官 能基を有する、非帯電のり、Ｌ−アルファアミノ酸誘導体を、水性反応混合物中 で、感受性官能基を加水分解することができるヒドラーゼ酵素の存在下に、加水 分解して、帯電したし一アミノ酸化合物および非帯電のＤ−アミノ酸誘導体を形 成し、そして非帯電のＤ−アミノ酸誘導体を水性反応混合物から、イオン拒絶膜 を横切って、反応混合物に移送する、工程からなる、ラセミ体のアルファアミノ 酸化合物を酵素的に分割する方法を提供する。生成物混合物中の非帯電のＤ−ア ミノ酸誘導体を、膜を横切って逆拡散することができるない種に転化することが できる。ラセミ体のアルファアミノ酸化合物を分割する方法は、前述のペプチド 合成方法と組み合わせて実施することができる。ラセミ体のアルファアミノ酸誘 導体の１例は、ＤＬ−フェニルアラニンメチルエステルである。ヒドラーゼ酵素 の１例はエステラーゼのアミノアシラーゼＩである。

本発明は、また、Ｃ−末端のカルボキシレート基を有する保護されたペプチド第 １反応成分を、Ｎ−末端のアンモニウム基を有する保護されたペプチド第２反応 成分と、縮合酵素の存在下に水性反応相中で、Ｃ−末端のカルボキシレート基お よびＮ−末端のアンモニウム基が縮合して保護された非帯電のペプチド生成物を 形成する条件下に、反応させ：保護された非帯電のペプチド生成物を、水不混和 性疎水性相を横切って、水性生成物相の中に移送し：そして保護された非帯電の ペプチド生成物が水性生成物相中で、水不混和性疎水性相を横切って、逆拡散す るのを防止する、工程からなる、ペプチドの酵素的合成の方法を提供する。

本発明は、また、アルファカルボキシレート基を有する、保護されたＮ−アシル アミノ酸第１反応成分を、Ｎ−末端アンモニウム基を有する、保護されたペプチ ド第２反応成分と、縮合酵素の存在下に水性反応相中で、アルファカルボキシレ ート基とＮ−末端アンモニウム基が縮合して保護された非帯電のペプチド生成物 を形成する条件下に、反応させ；保護された非帯電のペプチド生成物を水不混和 性疎水性相を通して水性生成物相の中に移送し：そして保護された非帯電のペプ チド生成物が水不混和性疎水性相を横切って逆拡散するのを防止する、工程から なる、ペプチドの酵素的合成方法を提供する。

本発明は、また、Ｃ−末端カルボキシレート基を有する、保護されたペプチド第 １反応成分を、アルファアンモニウム基を有する、保護されたアミノ酸第２反応 成分と、縮合酵素の存在下に水性反応相中で、Ｃ−末端カルボキシレート基およ びアルファアンモニウム基が縮合して保護された非帯電のペプチド生成物を形成 する条件下に、反応させ；保護された非帯電のペプチド生成物を水不混和性疎水 性相を横切って水性生成物相の中に移送させ；そして保護された非帯電のペプチ ド生成物が水不混和性疎水性相を横切って逆拡散するのを防止する、工程からな る、ペプチドの酵素的合成方法を提供する。

本発明は、また、アルファカルボキシレート基を有する、保護されたＮ−アシル アミノ酸第１反応成分を、アルファアンモニウム基を有する、保護されたアミノ 酸第２反応成分と、縮合酵素の存在下に水性反応相中で、アルファカルボキシレ ート基とアルファアンモニウム基が縮合して保護された非帯電のアミノ酸生成物 を形成する条件下に、反応させ：保護された非帯電のアミノ酸生成物を水不混和 性疎水性相を通して水性生成物相の中に移送し；そして保護された非帯電のアミ ノ酸生成物が水不混和性疎水性相を横切って逆拡散するのを防止する、工程から なる、ペプチドの酵素的合成方法を提供する。

本発明のペプチドは複数のアミノ酸残基からなる。本発明のペプチドはジペプチ ドを包含するが、これらに限定されない。本発明のペプチドは３〜８つのアミノ 酸残基からなるペプチドを包含するが、これらに限定されない。保護されたＮ− アシルアミノ酸第１反応成分の１つの例は、Ｎ−ホルミル−（β−メチル）−ア スパラギン酸である。保護されたアミノ酸第２反応成分の例は、Ｌ−フェニルア ラニンメチルエステルおよびＬ−フェニルアラニンイソプロピルエステルである 。縮合酵素の１つの例はサーモリシンである。保護されたペプチドの第１反応成 分の他の例はＮ−ホルミル−（０−Ｂｚ　Ｉ）−ｔｙｒ−ｇｌｙ−ＯＨである。

保護されたペプチド第２反応成分の他の例はＨ−ｇｌｙ−ｐｈｅ−１ｅｕ−ＯＭ ｅである。縮合酵素の他の例はパパインである。保護されたペプチド第１反応成 分の他の例はＮ−ホルミル−（β−メチル）−ａｓｐ−ｐ　ｈ　ｅ−ＯＨである 。保護されたアミノ酸第２反応成分の他の例はＨ−ｔｒｐ−ＯＭｅである。縮合 酵素の他の例はペプシンである。

本発明の他の実施態様において、アルファカルボキシレート基を有するＮ−カル ボキシベンゾキシ−アスパラギン酸は第１反応成分であり、モしてα−アンモニ ウム基を有するし一フェニルアラニンメチルエステルは第２反応成分である。第 １反応成分のアルファカルボキシレート基および東２反応成分のα−アンモニウ ム基はペプシンの存在下に縮合して、保護された非帯電のペプチド生成物を形成 する。この生成物は水不混和性疎水性相を横切って移送し、そしてそれを横切っ て逆拡散するのを防止する。

本発明は、また、アルファカルボキシレート基を有するＮ−アシル−（β−置換 ）アスパラギン酸第１反応成分をアルファアンモニウム基を有する３〜６１［！ １の炭素原子を有する第２アルコールから誘導された、Ｌ−フェニルアラニン低 級アルキルエステルと、縮合酵素の存在下に水性反応相中で、アルファカルボキ シレート基およびアルファアンモニウム基が縮合して保護された非帯電のペプチ ド生成物を形成する条件下に、反応させ；保護された非帯電のペプチド生成物を 水不混和性疎水性相を横切って水性生成物相の中に移送させ：そして保護された 非帯電のアミノ酸生成物が水不混和性疎水性相を横切って逆拡散するのを防止す る、工程からなる、ペプチドの酵素的合成方法を提供する。水性反応相は約り０ ℃〜約６５℃の温度範囲に維持することができる。Ｎ−アシル−（β−置換）ア スパラギン酸第１反応成分の１つの例はＮ−ホルミル−（β−メチル）−アスパ ラギン酸である。Ｌ−フェニルアラニン低級アルキルエステル第２反応成分の他 の例はＬ−フェニルアラニンイソプロピルエステルである。縮合酵素の１つの例 はサーモリシンであり、ここで水性反応相の温度は約５０℃である。

本発明の他の実施態様において、ポリマー物質からなる複数の微孔質中空繊維か らなるＩＬＭモジュールを利用する。これらの中空繊維は、微孔質壁内の毛管に より固定化された、水不混和性有機液体を支持することができる。この水不混和 性有機液体は疎水性相を構成し、この疎水性相は水性反応相を水性生成物相から 分離するイオン拒絶膜として機能する。水性反応相、また、「管相Ｊと呼ぶ、は 、中空繊維の内腔内に位置する。水性生成物相、また、「シェル相」と呼ぶ、は 、中空繊維の間のモジュールの中に存在するシェル空間の中に位置する。こうし て、２つの水性相の各々と油／水界面がつくられる。このＩＬＭモジュールの概 略的表示は第２図、第９図、第２５図および第２６図に示されている。

好ましいＩＬＭの立体配置において、中空繊維の末端は樹脂物質で密封または注 封して、内腔を通して循環する水溶液はシェル空間を通して循環する水溶液と混 合しないようにする。微孔質ポリプロピレンから作られた中空繊維は好ましい材 料を例示する。この実施態様はシェル相を水性生成物相としてそして管相を水性 反応相として記載するが、シェル相は水性反応相であり、そして管相は水性生成 物相であることができる。

あるいは、水不混和性疎水性相は親水性物質からなる中空繊維の壁により定めら れた内腔内に位置する有機液体からなる。親水性物質の１例はセルロースである 。本発明の１つの実施態様において、油／水界面は、第１７図、第２７図および 第２８図に示されているように配置された親水性中空繊維からなる、２つの膜の モジュールを利用することによってつくることができる。好ましい膜のモジュー ルの立体配置において、中空繊維の末端は樹脂物質で密封または注封して、内腔 を通して循環する水溶液はシェル空間を通して循環する水溶液（相）と混合しな いようにする。各モジュールは複数の親水性中空繊維からなる。親水性中空繊維 の内腔を水不混和性有機液体で充填する。接続手段を有する２つの膜モジュール 、例えば、循環する有機液体の共通のループは膜コンタクタ−からなる。親水性 中空繊維の内腔内に位置する水不混和性有機液体は、各膜モジュールの水不混和 性親水性相からなり、そして親水性中空繊維の壁の外側に位置する２つの隔離さ れた水性相は、水性反応相および水性生成物相からなる。水不混和性疎水性相は 、第１膜モジユールにおける水性反応相を第２膜モジユールにおける水性生成物 相と分離するイオン拒絶膜として機能する。

膜コンタクタ−は、保護された非帯電のペプチド生成物を水性相から水不混和性 疎水性相の中に移す第１膜モジュール：保護された非帯電のペプチド生成物を水 不混和性疎水性相から水性生成物相の中に移す第２膜モジュール：および第１膜 モジユールにおける水不混和性疎水性相と第２膜モジユールにおける水不混和性 疎水性相との間を接続する手段；からなる。第１膜モジユールにおける水性反応 相は中空繊維の外側に位置し、そして水性反応相と水不混和性疎水性相との間に 油／水界面をつくる中空繊維の壁をぬらし；そして第２膜モジユールにおける水 性生成物相は中空繊維の外側に位置し、そして水性反応相と水不混和性疎水性相 との間に油／水界面をつくる中空繊維の壁をぬらす。油／水界面における液体の 循環は向流である。水性生成物相は、複数の膜コンタクタ−を通して反復して処 理することができる。

水不混和性疎水性相を横切って保護された非帯電のペプチド生成物が逆拡散する のを防止する工程の１つの例は、保護された非帯電のペプチド生成物を帯電した 種に転化することからなる。この転化は化学的または酵素的であることができる 。化学的手段は保護官能基のｐＨ依存性イオン化、カルボン酸官能の消散から生 ずるおよび／または遊離アミノ酸基から生ずるイオン化を包含する。酵素的転化 の１例は、エステル分解活性を有するプロテアーゼを利用するエステル官能の加 水分解である。

エステル分解活性を有するプロテアーゼ酵素の１例はアミノアシラーゼ■である 。エステル分解活性を有する酵素は、水性生成物相中で膜に対して循環すること ができる。エステル分解活性を有する酵素は水不溶性支持体上に固定化し、そし て水性生成物相を酵素の上に循環することができる。

本発明は、また、Ｎ−ホルミル−（β−ベンジル）−Ｌ−アスパルチル−し−フ ェニルアラニンベンジルエステル、Ｎ−ホルミル−（β−ベンジル）−Ｌ−アス パルチル−し−フェニルアラニン、Ｎ−カルボキシベンゾキシ−（β−メチル） −Ｌ−アスパルチル−し−フェニルアラニンメチルエステル、Ｎ−カルボキシベ ンゾキシ−（β−メチル）−Ｌ−アスパルチル−し−フェニルアラニン、Ｎ−ホ ルミル−（β−メチル）−アスパルチル−フェニルアラニンメチルエステル、Ｎ −ホルミル−（β−メチル）−アスパルチル−フェニルアラニン、Ｎ−ホルミル −（β−メチル）−Ｌ−アスパルチル−し−フェニルアラニン、Ｎ−ホルミル− （β−メチル）−アスパルチル−フェニルアラニル−トリプトファンメチルエス テル、Ｎ−ホルミル（β−メチル）−アスパルチル−フェニルアラニル−トリプ トファン、Ｎ−カルボキシベンゾキシ−フェニルアラニル−グリシル−グリシル −フェニルアラニンメチルエステル、Ｎ−カルボキシベンゾキシーフェニルーア ラニルーグリシルーグリシルーフェニルアラニン、Ｎ−ホルミル−（０−ベンジ ル−チロシル）−グリシル−グリシル−フェニルアラニル−ロイシンメチルエス テル、Ｎ−ホルミル−（０−ベンジル−チロシル）−グリシル−グリシル−フェ ニルアラニル−ロイシン、Ｎ−ホルミル−（β−メチル）−アスパルチル−フェ ニルアラニンイソプロピルエステルから成る群より選択されるペプチド化合物か らなる。

本発明は、Ｃ−末端カルボキシレート基を有する保護されたペプチドおよびアル ファカルボキシレート基を有する保護されたＮ−アシルアミノ酸から成る群より 選択される第１化合物を、Ｎ−末端アンモニウム基を有する保護されたペプチド およびアルファアンモニウム基を有する保護されたアミノ酸から成る群より選択 される第２化合物と、縮合酵素の存在下に水性反応相中で、カルボキシレート基 およびアンモニウム基が縮合して保護された非帯電のペプチド生成物を形成する 条件下に、反応させ：保護された非帯電のペプチド生成物を、水不混和性疎水性 相を横切って、水性生成物相の中に移し；そして保護された非帯電のペプチド生 成物を前記水性生成物相から分離して、その生成物が前記水不混和性疎水性相を 横切って逆拡散するのを防止する；工程からなる、ペプチドの酵素的合成方法を 提供する。

本発明は、また、アルファカルボキシレート基を有するＮ−アシル−（β−置換 ）アスパラギン酸第１反応成分をアルファアンモニウム基を有するし一フェニル アラニン低級アルキルエステル第２反応成分と、縮合酵素の存在下に水性反応相 中で、アルファカルボキシレート基およびアルファアンモニウム基が縮合して保 護された非帯電のペプチド生成物を形成する条件下に、反応させ；保護された非 帯電のペプチド生成物を、水不混和性疎水性相を横切って、水性生成物相の中に 移し；そして保護された非帯電のペプチド生成物を前記水性生成物相から分離し て、その生成物が前記水不混和性疎水性相を横切って逆拡散するのを防止する； 工程からなる、ペプチドの酵素的合成方法を提供する。保護された非帯電のペプ チド生成物を水性生成物相から分離する工程は、捕捉手段、例えば、逆浸透また は特定の分子錯体を利用して実施することができる。

ゼロ５イトおよび／またはシクロデキストリンからなる特別の空洞を利用するこ とができる。分離の工程は、また、溶媒抽出、マトリックス上の吸着を利用する か、あるいは試薬で沈澱させることによって、実施することができる。水性生成 物相は約り０℃〜約６５℃の範囲の温度に維持することができる。フェニルアラ ニン試薬の例は、３〜６個の炭素原子を有する第２アルコールから誘導された低 級アルキルエステルである。

縮合酵素の１例はサーモリシンであり、ここで水性反応相の温度は約５０℃であ る。アスパラギン酸Ｎ−アシル−（β−置換）第１反応成分の１例はＮ−ホルミ ル−（β−メチル）−ａｓｐ−ＯＨである。フェニルアラニン低級アルキルエス テル第２反応成分の１例はＬ−フェニルアラニンイソプロピルエステルである。

一般に、本発明によるペプチド合成に利用することができるアミノ酸は、遺伝コ ードによりタンパク質構成ブロックとして認識される２０の自然アミノ酸のし一 対車体、＋ペプチド合成分野において普通に使用される標準の手順により入手可 能である、それらの種々の保護された誘導体からなる。好ましい保護基は、任意 の特定のタンパク質合成のための、縮合酵素、疎水性相の性質、ｐＨ１温度およ び溶媒の性質の選択に従い変化するであろう。

図面の簡単な説明 前述および他の目的および利点は、添付図面に関する次の詳細な説明から明らか なように、本発明により達成される。

第１図は、本発明によるアスパルテイムの酵素的合成の概略的例示である。

第２図は、本発明の方法を実施するための装置の概略的表示である。

第３図は、実施例１および２においてオーバータイムで形成した生成物（アスパ ルテイム誘導体）の量を例示するグラフである。

第４図は、実施例４においてオーバータイム（ｎｖｅｒ　ｔ　ｉｍｅ）で形成し た生成物（アスバルテイム誘導体）の量を例示するグラフである。

第５図は、実施例５においてオーバータイムで形成した生成物（アスバルテイム 誘導体）の量を例示するグラフである。

第６図は、実施例６においてオーバータイムで形成した生成物（アスパルテイム 誘導体）の量を例示するグラフである。

第７図は、実施例７においてオーバータイムで形成した生成物（アスバルテイム 誘導体）の量を例示するグラフである。

第８図は、実施例８に記載するＤＬ−ｐｈｅ−ＯＭｅの酵素的分割を例示するグ ラフである。

第９図は、実施例９に記載するように生成物側の容器を例示する、本発明を実施 するための装置の概略的表示である。

第１０図は、イオン交換樹脂を利用しておよび利用しないで、実施例９において オーバータイムで形成した生成物（アスパルテイム誘導体）の量を例示するグラ フである。

第１１図は、Ｎ−ホルミル−（β−メチル）　−ａ　ｒｐ−ｐｈｅ−ｔ　ｒｐ− ＯＨオーバータイムのペプシン触媒タンパク質合成を記載する。

第１４図は、Ｎ−ＣＢＺ−ｐｈｅ−ｇａｙ−ｇａｙ−ｐｈｅ−ＯＨオーバータイ ムのパパイン触媒タンパク質合成である。

第１５図は、Ｎ−ＣＢＺ−ｐｈｅ−ｇｌｙ−ｇａｙ−ｒ）ｈｅ−ＯＭｅの合成速 度を記載する。

第１６図は、Ｎ−ホルミル−（０−Ｂｚｌ）−ｔｙｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｐｈｅ −］　ｅｕ−ＯＨのパパイン触媒タンパク質合成を記載する。

第１７図は、膜コンタクタ−の１つの側で生成物を捕捉するためにＲＯを使用す る方法を記載する。

第１８図は、長時間の実験の間におけるサーモリシン反応器内のＣの濃度を記載 する。

第１９図は、Ｎ−ホルミル−（β−メチル）−ａｓｐ−＝ｐｈｅ−ＯＨのサーモ リシン触媒タンパク質合成を記載する。

第２０図は、Ｎ−ホルミル−（β−メチル）−ａｓｐ−ｐｈｅ−０−〈の合成の 反応速度論を記載する。

第２１ｒｇ！：Ｊは、Ｎ、　Ｎ−ジエチルドデカンアミドを包含するＩＬＭを横 切るＮ−ホルミル−（β−メチル）−ａｓｐ−ｐｈｅ−０−＜の透過速度への酵 素アミノアシラーゼの効果を記載する。

第２２図は、ＩＬＭモジュールにおけるＮ−ホルミル−（β−メチル）−ａｓｐ −ｐｈｅ−０−＜のサーモリシン触媒タンパク質合成を記載する。

第２３図は、膜コンタクタ−におけるＮ−ホルミル−（β−メチル）−Ｌ−ａ　 ｓ　ｐ−Ｌ−ｐ　ｈ　ｅ　−０−＜の合成を記載する。

第２４図は、ＩＬＭモジュールにおけるペプシン触媒タンパク質合成を記載する 。

第２５図は、ＩＬＭモジュールにおける中空繊維の断面の部分的図面（拡大）で ある。

第２６図は、ＩＬＭモジュールにおける中空繊維の断面の部分的概略的図面（拡 大）である。

第２７図は、膜コンタクタ−における中空繊維の断面の部分的概略的図面（拡大 ）である。

第２８図は、膜コンタクタ−の部分的概略的図面（拡大）である。

第２９図は、Ｄ−、Ｌ−フェニルアラニンイソプロピルエステルの統合された酵 素的分割およびＤ−フェニルアラニンイソプロピルエステルのラセミ化および再 循環のための装置の概略的表示である。

本発明を実施するための最良の方法 ここに記載する本発明は、非帯電のペプチド中間体、またはその誘導体を反応混 合物から、非帯電のペプチドを反応混合物の中から外に生成物混合物の中に選択 的に移送する膜により、分離することによって、ペプチドの酵素的合成を水性反 応混合物中で平衡において完結に推進する手順を提供する。膜は反応成分（帯電 した分子）に対して実質的に不透過性であるので、反応混合物からのペプチド中 間体の除去は、反応を質量作用により完結に向かわせる平衡において、ペプチド 濃度を減少させる。

本発明の実施において最も有用な膜は固定化された液体膜（ＩＬＭ）であり、こ のＩＬＭは酵素、反応成分および他の帯電した生成物に対して実質的に不透過性 である油−水界面を提供する微孔質支持体物質の中に埋め込まれている非極性液 体である。親水性ポリマー、例えば、ポリプロピレンは好ましい支持体物質であ る。ＩＬＭモジュールはポリプロピレンの中空繊維を利用して製造することがで きる。セルガード（ＣｅＩｇａｒｄ）、セラニーズ・コーポレーション（Ｃｅｌ ａｎｅｓｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、米国ニューヨーク化１００３６＝、− ヨーク１２１１アベニユー、の登録商標およびセラニーズ・ファイバーズ・マー ケッティングーＤ−ポレーション（Ｃｅｌａｎｅｓｅ　ＦｉｂｅｒｓＭａｒｋｅ ｔｉｎｇ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ノースカロライナ州チャーロツテ、によ り販売されている、は、商業的に入手可能なポリプロピレンからなる中空繊維の １例である。この分野において知られている注封材料およびポリ塩化ビニルの管 またはチューブはＩＬＭモジュールの製作に必要に応じて利用することができる 。微孔質支持体材料を製作するための他のポリマーは、テフロン（ＴＥＦＬＯＮ ）　、フッ化炭化水素ポリマーについてのイー・アイ・デュポン社商標、である 。典型的な微孔質支持体は、ボアーテックス（ＧＯＲＥ−ＴＥＸ）　、Ｗ、Ｃ。

ボア・アンド・アソシエーツ・インコーホレーテッド（Ｇｏｒｅ　＆Ａｓ５ｏｃ ｉａｔｅｓ、Ｉｎｃ、）、の商標、である。第２５図は、■ＬＭモジュールにお ける中空繊維の断面の部分的図面（拡大）である。

拡大した部分的図面は、微孔質壁内の毛管により水不混和性有機液体を支持する ことができる、微孔質ポリマー材料１０５から作られた、内腔（孔）１０２を有 する疎水性中空繊維１０１を示す。毛管１０４は微孔質ポリマー材料１０５の中 に示されている：しかしながら、微孔質ポリマー材料１０５は、実際に、内腔か ら中空繊維１０１の外部へ延びる多数のこのような毛管１０４を包含する。内腔 １０２は、管相（例えば、水性反応相）からなる。中空繊維の間の空間１０３は シェル相（例えば、水性生成物相）からなる。

第２６図は、ＩＬＭモジュール１１５の部分的概略的図面（拡大）である。拡大 した部分的図面は、疎水性中空繊維１０１を示す。各中空繊維の末端は樹脂材料 （注封材料）の中に注封されているので、第１壁１０６において開口１０７およ び内腔１０２を通して循環しそして第３壁において開口１１１を通して戻る管相 は、第２壁１０８において開口１０９および空間１０３を通して循環しそして第 ４壁１１２において開口１１３を通して戻るシェル相と混合しない。ＩＬＭモジ ュール１１５は実際に多数の親水性中空繊維１０１からなるが、３本のみがこの 図面に示されている。

微孔は支持体材料を通過し、そして固定化された液体がその中に毛管により保持 されそして、例えば、膜または他の通常の反応条件を横切る圧力差に暴露される とき、液体がそれから逃げないような大きさを有する。上の制限に従うことは、 固定化された液体と反応混合物との間の接触面積を最大にして、膜を横切る非帯 電のペプチド生成物の移送（束）の速度を最大するために有利である。理解され るように、好ましい孔大きさは、特定の固定化された液体、使用する反応成分、 生成した生成物などの因子に依存して変化するであろう；そして、さらに、最適 な孔大きさは当業者により実験的に決定することができる。孔大きさの有用な説 明は米国特許第４，１７４．３７４号、その開示をここに引用によって加える、 に記載されている。固定化された液体の膜の使用および調製は、次の参考文献に 記載されている、それらの開示を、また、ここに引用によって加える：Ｓ、Ｌ、 ７トソン（Ｍａｔｏｓｏｎ）、Ｊ、Ａ、　フィン（Ｑｕｉｎｎ）、膜反応器にお ける化学的転化へのカップリング分離および濃縮（Ｃｏｕｐｌｉｎｇ　５ｅｐａ ｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　ｔｏ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ ｎｖｅｒｓｉｏｎｉｎ　ａ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｒｅａｃｔｏｒ）、ＡＩＣＨＥ 　アニュアル・ミーティングにおいて提出された論文、ルイジアナ州ニューオル レアンス（１１月８〜１２日、１９８１年）、およびＳ、Ｌ、マトソン（Ｍａｔ ｏｓｏｎ）およびＪ、Ａ、フィン（Ｑｕｉｎｎ）、パイイブロセシングにおける 膜反応器（Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｒｅａｃｔｏｒ　ｉｎ　Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉ ｎｇ）、アナル・オン・ニューヨーク・アカデミ−・オン・サイエンシズ（Ａｎ ｎ、　Ｎ、　Ｙ、　Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｊ、）、４６９．１５２　（１９８６）。

微孔質支持体中に毛管により保持された固定化された液体は、水不混和性であり 、そして合理的な速度で、すなわち、すぐれた移送特性／高い束で膜（拡散）を 横切って移送しなくてはならない、非帯電のペプチド生成物のためのすぐれた溶 媒である；しかしながら、膜の両者の反応側および生成物側における帯電したま たはイオン化した分子は、大部分について、両者の方向、すなわち、すぐれた選 択性。イオンの拒絶、において膜を横切って移送されない。

本発明によるペプチドの酵素的合成において使用するための支持体材料および固 定化された液体の最良の組み合わせの選択は、一部分、系において使用する特定 の反応成分の性質、所望の生成物および溶媒に依存するであろう。

本発明による実施のための一般に好ましい固定化された液体は、水不混和性有機 溶媒、例えば、６〜２０個の炭素の、分枝鎖状および直鎖状のアルコール、例え ば、ｎ−ドデカデカノール、イソ−ヘキサデカノールおよびそれらの混合物を包 含する。また、それらの混合物を包含する水不混和性有機溶媒は好ましい。この ような溶媒はＮ、　Ｎ−ジエチル−ドデカンアミド、ドデカンおよび２−ウンデ カンを包含するが、これらに限定されない。

本発明の実施において有用な他の型の膜は、有機ポリマー、例えば、ポリ塩化ビ ニルなどから作られた疎水性充実フィルムからなる。これらのポリマーの膜の調 製は、文献、例えば、次の文献によく記載されている：Ｏ，Ｊ、スウィーティン グ（Ｓｗｅｅｔｉｎｇ）編、ポリマーフィルムの科学および技術（Ｓｃｉｅｎｃ ｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｆｉｌｍｓ）、イ ンターサイエンス（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ニューヨーク（１９６８）、 しかしながら、ガスおよび液体の分離へのこのような膜の広範な応用は次の文献 に記載されている：Ｓ、Ｔ、フワング（Ｈｗａｎｇ）およびに、カンメルメイア −（Ｋａｍｍｅｒｍｅｙｅｒ）　、分離における膜、化学の技術（Ｍｅｍｂｒａ ｎｅｓ　ｉｎ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｏｆ　Ｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ）、Ｖｏｌ、Ｖｌｌｌ　［Ａ、ワイスバーガー（Ｗｅｉｓｓｂｅｒ ｇｅｒ）編、シコン・ウィリー・アンド・サンズ・インコーホレーテッド（Ｊｏ ｈｎ　Ｗｉ　ｅ　ｌｙ　＆　５ｏｎｓ、Ｉｎｃ、）、ニューヨーク（１９７５） 。

本発明の好ましい実施態様は膜反応器／セパレーター系を使用し、そしてこの系 はＩＬＭの１つの側と接触して循環する水性反応混合物または相、および膜の反 対側において向流して循環する生成物の水性相または混合物を提供する。Ｓ、　 Ｌ、マトソン（Ｍａｔｏｓｏｎ）およびＪ。

Ａ、フィン（Ｑ　ｕ　ｉｎ　ｎ）　１、アナル・オン・ニューヨーク・アカデミ −・オン・サイエンシズ（Ａｎｎ、　Ｎ、　Ｙ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ、　） 　、４６９．１５２　（１９８６）。反応相および生成物相のｐＨおよびａ［は 、ｐＨ約４〜９．０において膜を横切る完全に移送を最小にする形態に反応成分 を保持する値に、維持する。反応相から生成物相への非帯電のペプチド中間体の 移送は、反応相中の非帯電のペプチド濃度を増加することによってつくられた、 膜を横切る濃度勾配により推進される。膜を横切る移送活性または束は、生成物 相において移送されたペプチドを逆拡散することができない種へ、同時に不可逆 的に転化することによって、有意に増大することができる。例えば、後者転化は 、逆拡散することができない極性ペプチドを形成し、こうしてカップリング反応 の完結を達成するために必要な推進力を発生することができる。本発明の実施す るために適合することができる膜反応器／セパレーターの１例は、米国特許第４ ，１８７．０８６号に記載されている。

本発明の実施に適合することができる、入手可能な別の膜反応器／セパレーター の立体配置は、英国特許出願第２．０４７．５６４Ａ号に記載されている中空繊 維のモジュール、およびこの分野においてよく知られている普通の平板およびフ レーム型フィルター装置を包含する。

非帯電のペプチドの選択的移送に加えて、膜は反応相と生成物相との間のバリヤ ーを提供し、そしてこのバリヤーは各相の成分の望ましくない混合およびそれら の間の反応を防止する。

本発明に従い構成された好ましい膜反応器／セパレーターにおいて、反応成分の 間の化学的平衡は、移送された非帯電のペプチドの不可逆的転化を実施すること によって、膜を横切って、膜の生成物側において、膜不透過性種に、実際に「引 かれる」。この型の膜反応器／セパレーターは、一般の型のカップリングされた ２つの酵素（Ｅ’およびＥりを使帯電した反応成分ＡおよびＢは、酵素Ｅ１を形 成するペプチドの助けにより縮合して、膜を横切って生成物側に選択的に移送さ れる非帯電の中間体のペプチドＣを形成する、アミノ酸および／または小さいペ プチドである。所望の反応において沈澱しない反応成分中の反応性官能基は、必 要に応じて、保護またはブロッキングして望ましくない副反応および／または生 成物の電荷を防止することができる。膜の生成物側において、非帯電のペプチド Ｃは帯電した生成物りに転化され、この帯電した生成物りは膜を横切って逆拡散 することができず、反応混合物中で化学的平衡をよりＣの生成に向かってシフト させる。

この概念は、Ｄ−、Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルを（Ｎ−およびβ−保 護された）Ｎ−ホルミル−β−ベンジル−し−アスパルテートと、サーモリシン の存在下にｐＨ約５．５において、酵素的に縮合させる特定の場合について、第 １図に例示されている。　第１図に例示される反応の概要において、反応成分Ａ ”はＤ−、Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルであり、モしてＢ−はＮ−ホル ミル−β−ベンジル−し−アスパルテートである。反応成分は膜の反応側で酵素 Ｅｌサーモリシンにより縮合して、非帯電のペプチドＣを形成する。反応成分を それらの帯電した状態に維持し、こうして非帯電のペプチドＣと一緒に膜を横切 ってそれらが拡散するのを最小とするように、ｐＨを選択する。

縮合反応のための化学平衡はＡ゛およびＢ一種に太き（好適であるが、膜を横切 る生成物側への非帯電のペプチド生成物Ｃの拡散は、膜の反応側の化学的平衡を 維持するためにＣの一定の生成を必要とする。

１つの実施態様において、膜の生成物側で、エステラーゼ酵素Ｅ２は、膜を横切 って拡散した非帯電のペプチドＣを、反応側に逆拡散することができない帯電し たペプチドＤに急速にかつ不可逆的に転化する。こうして、反応側の化学的平衡 は、膜を横切ってかつ非帯電の生成物Ｃの生成に向かって効果的に「引かれる」 。その後、ペプチドＤは、ホルミルおよびベンジル保護基を除去する加水分解、 および引き続（メタノールを使用するＣ−末端のエステル化により、アスパルチ ルムに転化される。

他の実施態様において、エステラーゼを利用せず、そして非帯電の生成物Ｃを物 理学的手段により生成物の混合物から方向分離する。

前の方法は、第２図に示すように、ｐＨおよび温度のコントロールされた条件下 に操作する、自流の膜反応器／セパレーター１０において実施することができ、 こうして反応混合物は遊離α−カルボキシレート基を有するＮ−アシル−β−置 換アスパラギン酸、Ｎ−ホルミル−β−ベンジル−し−アスパルテート（電気陰 性種）からなり、この化合物は反応成分、例えば、保護された遊離α−アミノ基 を有する、Ｄ、　Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（電気陽性種）と、約４ ．０〜９．０のｐＨ範囲においてプロテアーゼ活性の触媒作用下に、縮合して、 イオン化された基もたない完全に保護されたし一アスパルチルーし一フェニルア ラニンジペプチドを生ずることができる。膜の生成物側において、反応混合物は ポンプ１４の促進された反応槽１２から、フィード−イン導管１６およびセパレ ーター１８を通して、反応槽１２へ戻るフィード−アウト２０へ循環する。膜の 生成物側で、膜を横切って移送された、完全に保護された非帯電のペプチド、例 えば、Ｎ−ホルミル−β−ベンジル−し−アスパルチル−し−フェニルアラニン メチルエステルを包含する、生成物の混合物またはスウィープは、ポンプ２４に より２４により促進された生成物の反応槽２２から、生成物スウィープインー導 管２６を通して、セパレーター１８の生成物側を通して、生成物スウイーブアウ トー導管３０へ循環する。生成物反応槽２２中のこの生成物混合物は、第２酵素 Ｅ！、エステラーゼ、または他の適当な試薬を含み、それらのエステラーゼまた は試薬は非帯電のペプチドが有する保護された基の少なくとも１つを切り放し、 こうして膜を通る逆拡散によりスウイーブ流れを逃がすことができない、電気帯 電した種を発生する。エステラーゼを利用する場合、好ましいエステラーゼは約 ６．０〜９．０の好ましいｐＨ範囲を有するであろう。アミノアシラーゼ１１α −キモトリプシンおよびスブチリシンＡは、本発明において有用であると考えら れるエステラーゼの例である。

水不混和性疎水性相を横切って逆拡散することができない帯電した種への転化は 、化学的または酵素的手段を利用して実施することができる。

化学的手段は、プロトトロピック官能基のｐＨ依存性イオン化、カルボン酸官能 基の消散から生ずるおよび／または遊離アミノ基のプロトン化またはエステル官 能の加水分解から生ずるイオン化を包含する。例えば、逆拡散することができな い帯電した生成物への非帯電の生成物の転化は、疎水性膜により分離された２つ の水性相の間の適当なｐＨ勾配により達成することができる。これは、疎水性相 がイオンに対して不透過性であり、こうして非イオン性溶質に関して平衡である 異なるｐＨの２つの水性相の存在を可能とするので、物理学的に可能である。例 えば、ｐＨ８において水性相中で電荷をもない、拡散可能な遊離アミンＲ−ＮＨ ２は、疎水性膜を横切ってｐＨ３における第２水性相の中に移送され、そしてプ ロトン化により不可逆的に捕捉されて、非拡散性塩Ｒ−ＮＨ３”ｗｏ影形成るこ とができる。同様に、ｐＨ２において電荷をもたない拡散可能な酸Ｒ−Ｃ００Ｈ は、ｐｌ（２において移送され、モしてｐ）］６において非拡散性カルボキシレ ートＲ−Ｃｏｏ−への解離を通して捕捉されることができる。ｐＨ勾配の利用は ペプチドおよびカルボキシル基およびアンモニウム基を有する他の同様な化合物 の合成および分離においてとくに有用である。

本発明を実施するが、異なる液体膜の立体配置を使用する同様な方法は第１７図 に図解されている。第１７図の液体膜の立体配置は、水不混和性疎水性相がより 高い反応温度、例えば、４０℃以上の温度の結果として漏れることがある条件下 に、好ましい。この油／水コンタクタ−において、有機膜は親水性セルロース繊 維の内側壁につ（られ、セルロース繊維の孔または内腔は所望の疎水性有機相で 充填され、そして繊維の外側に位置する大きい水性相を有しそして前記繊維の壁 をぬらす。モジュールの配置における前記繊維の束のバッキングは、油／水界面 により分離された２つの隔室をつくることができる。単一のコンタクタ−を構成 する２つの個々のモジュールに含有された２つの分離された水性相の間の前記油 相の循環は、第１７図に示されている。前述の反応相および生成物相を表す各水 性相は、透過性生成物を１つの水性相からエステラーゼ酵素を含有する第２水性 相へ移送させる。第１７図に示す一般の型の膜セパレーターは、この分野におい てよく知られている。米国特許第４．７５４，０８９号は、相移送触媒中のこの ような膜の利用を記載している。米国特許第４，７７８．６８８号は同様な膜を 記載している。

米国特許第４．５７２，８２４号、米国特許第４．５６３．３３７号および米国 特許第４．４４３．４１４号は、また、このような水コンタクタ−を記載してい る。同様な膜の他の例は、米国特許第４．　６６４．　８０８号に記載されてい る。多相非対称反応器系における種々の態様は、米国特許第４．７９５．７０４ 号に記載されている。

帯電した生成物は、普通の分離手段、例えば、イオン交換樹脂および逆浸透など を包含する他の技術により、周期的に排出および／または生成物相から連続的に 取り出すことができる。この分離はイオン交換による場合、イオン交換樹脂に結 合した生ずる生成物は、普通の手順を使用して、脱着しそして回収することがで きる。

逆浸透分離の場合において、帯電した生成物のみを含有する限外ろ過物を生ずる 、適切な限外ろ過膜を利用してエステラーゼ酵素を保持することがまず必要であ る。次いで、この限外ろ過物は逆浸透膜で′ａ！ｌ！し、そして帯電した生成物 を生ずる保持物から単離することができる。

あるいは、他の実施態様において、捕捉、例えば、逆浸透膜を利用して、非帯電 のペプチドが膜をを横切って逆拡散を防止することができる。

この場合において、第２酵素はこの方法を効率的に実施するために必要でないこ とがある。ジエイムス（Ｊ　ａｍｅ　ｓ）　、　Ｓ７、ジョンソン（Ｊｏｈｎｓ ｏｎ）　１．１ｒ、　、ｒ逆浸透（Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｏｓｍｏｓｉｓ）Ｊ、カー ク−オスｖ　−（Ｋ　ｉ　ｒ　ｋ　−Ｏｔ　ｈｍｅ　ｒ）の化学技術の百科辞典 （Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌ第３版、Ｖｏｗ、２０、ｐｐ、２３０−２４８、ジョン・ウィリー・アンド・ サンズ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｅｌｙ　＆　５ｏｎｓ）、ニューヨーク州ニューヨーク （１９８４）および米国特許第４．　６４３゜９０２号。

他の捕捉手段は、特定の錯体の形成を包含する。ゼロライトおよび／またはシク ロデキストリンを利用することができる。捕捉に加えて、溶媒の抽出、マトリッ クスへの吸着または試薬を使用する沈澱を、保護された非帯電のペプチド生成物 を水性生成物相から分離する工程のために利用することができる。実施例１４お よび１７に記載されているように、逆浸透と組み合わせて膜コンタクタ−を使用 すると、酵素反応器中のペプチド合成の反応速度論に影響を与えないで、タンパ ク質合成の平衡の所望の変位を引き起こされる。このアプローチは、タンパク質 合成を完結に推道する目的で、第２酵素を使用することに対する変法と、考えら れる。しかしながら、その有用性は、油／水相に向かう非帯電のペプチド中間体 相対的親和性により、実際に支配される。油相に向かう分配が高くなればなるほ ど、水性生成物相に向かうペプチドの透過性はより低くなり、油から水への移送 をこの方法の速度制限工程とする。この現象は実施例１６および第２１図に例示 されており、ここでペプチドＮ−ホルミル−（β−メチル）−ａｓｐ−ｐｈｅ− ０−＜の油相から水性生成物相への解放速度、Ｖｐｅｒｍと呼ぶ、は、水性相が そのペプチドをより親水性のＮ−ホルミル−（β−メチル）−ａｓｐ−ｐｈｅ− ＯＨに転化することができる酵素アミノアシラーゼを含有するとき、２倍増加す る。

適当な試薬の選択は、反応成分、例えば、Ｎ−保護されたーし一アスパラギン酸 に使用した保護基の化学的性質により決定され、そして上に示したように、保護 基の選択は、引き続いて、縮合系の活性部位により付与された構造的拘束により 支配される。

一般に、本発明の実施において有用な縮合酵素は、タンパク質分解酵素、時には プロテアーゼと呼ぶ、であり、２つの群に分割することができる。いっそう普通 に使用されているものは、内側の結合のみを切り放すエンドペプチダーゼ、およ び好ましくは末端の結合のみを切り放すエキソペプチダーゼである。有用な酵素 は、次のものを包含する：セリンブロイテイナーゼ（ＥＣ３，４，２２Ｌ例えば 、パパイン：カルボキシルブロイテイナーゼ（ＥＣ３，４，２３）、例えば、ペ ブンン；およびメタロプロイテイナーゼ（ＥＣ３，４，２４）、例えば、サーモ リシン、プロリシン、タシナセン（Ｔａｃｙｎａｓｅｎ）Ｎ　（Ｓｔ。

ｃａｅｓｐｉｔｏｓｕｓ）およびデイスベイス（Ｄｉｓｐａｓｅ）ｏ当業者によ く知られている手順に従い、不溶性支持体への酵素の結合は、本発明の実施に組 み込むことができる：そして酵素の結合は必須の工程ではないが、ある種の応用 において望ましいことがある。本発明の実施に潜在的に有用な多数のプロテアー ゼの間で、サーモリシン［ＥＣ３゜４．２４］は最も好ましい酵素である。なぜ なら、それは顕著な熱安定性、広い入手可能性、低いコストおよび約５．０〜９ ．０の間の広い有用性を有するからである。他の好ましいプロテアーゼは、次の ものを包含する：ペプシンおよびペニシリノペプシン［Ｔ、ホフマン（Ｈｏｆｍ ａｎｎ）およびＲ，シャク（Ｓｈａｗ）、バイオヒミカ・エト・バイオフィジカ ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ）、９２．５４３　（１ ９６４）］および、ペニシリウム・ヅボンチ（Ｐｅｎｔｃｉｌｌｉｕｍ　ｄｕｐ ｏｎｔｉ）からの熱安定性プロテアーゼ［Ｓ。

エミ（Ｅｍｉ）　、Ｄ、Ｖ、？イアース（Ｍｙｅｒｓ）およびＧ、　Ａ、イアコ ブッチ（Ｉａｃｏｂｕｃｃ　ｉ）　、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉ　 ｓ　ｔ　ｒｙ）、１５．８４２　（１９７６）］　、それらは約ｐＨ４゜５また はそれ以下において機能し、このようなｐＨにおいてすぐれた安定性を示し、そ してそれらの安定性の維持にＺｎ−およびＣａ４＋の存在を必要としない。

前述の場合において、ペプチドＣのり、　Ｌ−異性体のみの生成である、対掌体 の選択性の実施の実現は、選択した酵素、膜の最適な機能化、支持体材料の化学 的性質および水性反応相のｐＨに方向関係する。

前述の特定の方法を実施するために好ましい１つの膜は、その中に固定化された イソ−ヘキサデカノールおよびｎ−ドデカンの混合物を含む、微孔質ポリプロピ レン支持体材料である。この膜はベンド・リサーチ・インコーホレーテッド（Ｂ ｅｎｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、Ｉｎｃ、）、米国オレゴン州９７７０１ベンド、リ サーチロード６４５５０から商標／表示「１型中空繊維選択的透析膜（Ｔｙｐｅ 　Ｉ　Ｈｏｌｌｏｗ　５ｅＩｅｃｔｉｖｅ　Ｄｉａｌｙｓｉｓ　Ｍｅｍｂｒａｎ ｅ）Ｊで入手可能であり、そして実施例１〜４の反応とともに好ましい。他の好 ましい膜は、セルガード（Ｃｅｌｇａｒｄ）２４００型ポリプロピレン中空繊維 ［セルガード（Ｃｅ　］　ｇａｒｄ）はセラニーズ・コーポレーション（Ｃｅｌ ａｎｅｓｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、米国ニューヨーク州１００３６ニユー ヨーク、アベニュー１２１１の登録商標である。セルガード（Ｃｅ　ｌ　ｇａｒ ｄ）は、セラニーズ・ファイバー・マーケラティング・コーポレーション（Ｃｅ ｌａｎｅｓｅ　Ｍａｒｋｅｔｉｎｇ　Ｃａｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ノースカロラ イナ州チャルロツテ、から得ることができる］を、水不混和性有機液体ＩＬＭと してドデカン中の３０％Ｖ／ＶのＮ、　Ｎ−ジエチル−ドデカンアミドの混合物 を支持する微孔質材料として利用する。この膜は、ベンド・リサーチ・インコー ホレーテッド（Ｂｅｎｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、Ｉｎｃ、）、米国オレゴン州ベン ド、リサーチロード６４５５０、から商標／表示「２型中空繊維選択的透析膜（ Ｔｙｐｅ　Ｉ　Ｈｏｌｌｏｗ　５ｅｌｅｃｔｉｖｅ　Ｄｉａｌｙｓｉｓ　Ｍｅｍ ｂｒａｎｅ）Ｊで入手可能であり、そして実施例５〜９の反応とともに好ましい 。孔大きさ０．０２５〜０．０５０Ｉ１ｍおよび壁厚さ２５μｍのセルガード（ Ｃｅｌｇａｒｄ）２４００型は、ベンド・リサーチ・インコーホレーテッド（Ｂ ｅｎｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、Ｉｎｃ、　）の「２型中空繊維選択的透析膜（Ｔｙ ｐｅ　ｌ　ＨｏｌｌｏｗＳｅｌｅｃｔｉｖｅ　Ｄｉａｌｙｓｉｓ　Ｍｅｍｂｒａ ｎｅ）Ｊにおいて利用された。約５．５のｐＨにおいて操作するとき、これらの 膜は高い選択性を示し、例えば、第１図の方法を実施するとき、非帯電のペプチ ド種に好適な約５００　：　１　（ｗ／ｗ）の範囲の選択性が測定された。

すなわち、５００ｍｇの非帯電のペプチド（Ｃ）は、移送された帯電した反応成 分（Ａ″″またはＢ−）の各１ｍｇについて、膜を横切って移送された。

前述したように、本発明の応用のために、反応成分および生成物上の種々の官能 基を保護して、所望の生成物の生成を減少および／またはその収率を減少しつる 望ましくない副反応を防止し、そして中間体ペプチドＣ中の電荷を抑制すること が必要であるか、あるいは望ましいであろう。本発明の実施に関して有用な保護 基および脱プロトン条件の選択した１系列の組み合わせを下表１に記載する。

選択した縮合酵素の対掌体選択性および膜により発揮された機能的弁別の結果、 Ｎ−ホルミル−し−アスパルチル−β−ベンジルエステルおよびり、Ｌ−フェニ ルアラニンメチルエステルを使用する本発明の実施は、ラセミ体のフェニルアラ ニンメチルエステル反応成分の９９．８％の対掌体の分割を達成することができ 、Ｌ一対掌体はＮ−ホルミル−し−アスパルチル（β−ベンジル）−Ｌ−フェニ ルアラニンメチルエステル、アスバルテイム誘導体、として現れ、未反応のＤ一 対本体は反応相の中に残った。

反応相の中に残るＤ−フェニルアラニンメチルエステルはそれから回収し、Ｄ、 Ｌ一段階に再ラセミ化し、そしてフィードバックの中に再循環することができる 。ラセミ化はラセミ体のアミノ酸反応成分を使用する方法、例えば、前述の°　 ３１１方法に必要な工程である。

本発明の経済的利点は、少なくとも一部分、より高価な前辺て分割したし一対車 体よりむしろ、ラセミ体の供給反応成分の使用から推進される。この利点は、（ ａ）縮合酵素の対掌体選択性：および（ｂ）非帯電の種に好適な膜の高い選択性 ；のために、Ｄ、Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルのその場の光学的分割に より可能となる。

ラセミ体のフェニルアラニンの低いコストの合成のために好ましい方法は、時に はブレイス（Ｇ　ｒ　ａ　ｃ　ｅ）方法と呼ぶ５−ベンザルヒダントインを経る ベンズアルデヒド、あるいはサガミ・ケミカル・リサーチ・センター（Ｓａｇａ ｍｉ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ）、日本国、東京（ 時には東京ソーダ製造株式会社の東京ソーダ法と呼ぶ）により開発された手順の 利用に基づ（ものである。

理解されるように、本発明の実施はペプチドの甘味剤、例えば、アスパルチルム またはその類似体または誘導体の合成に必ずしも限定されない。本発明は、また 、他の有用なペプチド、ジー、トリー、テトラ−およびペンタペプチド、または より高い複雑性をもつペプチドの合成に使用することができ、これらは合理的な 速度で透過選択的膜を通して拡散することができる。例えば、サーモリシンの結 合特異性を考慮し、そして生成物中のただ１つのサーモリシン感受性結合の存在 （下の式中に矢印で示す）を仮定すると、次の反応の概要によりｍｅｔ−エンケ ファリン（１）を合成することができるであろう：［１−ｔｙｒ−ｇｌｙ−ｇｌ ｙ−ｐｈｅ−ｓｅｔ−ｏｈ　（１）α−キモトリプシンおよびパパインを使用す るｍｅｔ−エンケファリンの段階的合計の酵素的合成の可能性は、文献に記載さ れた。参照、Ｗ。

クルマン（Ｋｕ　ｌ　１ｍａｎｎ）　、ジャーナル・オン・バイオロジカル・ケ ミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　、２５５．８２４３　（１９８０） 。

本発明の他の潜在的に有用な応用は、次の反応の概要によるグラミシジン（Ｇｒ ａｍｉｃｉｄｉｎ）Ｓの酵素的合成においてである：２　Ｈ−ｖａｌ−ｏｒｎ（ ＣＢＺ）−１ｅｕ−Ｄ−ｐｈｅ−ｐｒｏ−ＯＨ１１サーモリシン　ｐ）１５．５ ｅｕ （ＣＢＺ）ｏｒｎ　Ｄ−ｐｈｅ Ｄ−ｐｈｅ　ｏｒｍ（ＣＢＺ） Ｉｅｕ ｌ　Ｐｄ／）ｌ。

Ｉｅｕ ｏｒｎ　Ｄ−ｐｈｅ ｖａｌ　ｐｒ。

Ｉｅｕ 本発明を応用することができそして文献に記載されている、有用なペプチド生成 物の酵素的合成の種々の他の実施例は、アンギオテンシン、サブスタンスＰ１ニ レトイシン１、エルレインおよびＩｅｕ−エンケファリンの合成である。

本発明によるタンパク質合成に適用可能なペプチド化合物の他の有用なりラスは 、β−ラクタム抗生物質である。このグループは、それらの化学的構造中のβ− ラクタム官能の存在により特徴づけられる、よく知られているペニシリンおよび セファロスポリンからなる。

β−ラクタム官能の高い反応性は、それらの抗生物質の化学的合成を困難とし、 モして親核物質の存在下の水溶液中のそれらの劣った安定性の原因である。酵素 β−ラクタマーゼは、ペニシリンおよびセファロスポリンのβ−ラクタマーゼ環 中のアミド結合の加水分解を特異的に触媒する。ナサン・シトリ（Ｎａｔｈａｎ 　Ｃ１ｔｒｉ）ｒペニシリナーゼおよび他のβ−ラクタマーゼ（Ｐｅｎｉｃｉｌ ｌｉｎａｓｅ　ａｎｄβ−Ｌａｃｔａｍａｓｅ）Ｊ、バウル（Ｐａｕｌ）Ｄ、ポ イエル（Ｂ。

ｙｅｒ）（編）、「酵素（Ｅｎｚｙｍｅ）Ｊ、Ｖｏｌ、ＩＶ、第３版、アカデミ ツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９７１゜ 微生物界、とくにグラム陰性バクテリアにおけるβ−ラクタマーゼの存在は、β −ラクタム抗生物質に対する防御メカニズムが考えられる。

ペニシリンを使用するこの酵素の円滑な誘導は、バシリルス・セレウス（Ｂａｃ ｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｕｓ）、バシリルス・リチェノフオルミス（Ｂａｃｉｌｌｕ ｓ　Ｉｉｃｈｅｎｏｆｏｒｍｉｓ）および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ ｏｌｉ）の抵抗性菌株の発酵により、β−ラクタマーゼ（ペニシリンβ−ラクタ ムアミドヒドラーゼ、ＥＣ３，５゜２．６）の生成が可能となった、Ｅ、Ｊ、バ ンダンメ（Ｖａｎｄａｍｍｅ）、「ペニシリンアシラーゼおよびβ−ラクタマー ゼ（Ｐｅｎｊｃｊｌｌｉｎ　ａｃｙｌａｓｓｅ　ａｎｄ　β−１ａ　ｃ　ｔ　ａ ｍａ　ｓ　ｅ）Ｊ、Ａ、　Ｈ，ローズ（Ｒｏｓｅ）（編者）、「微生物の酵素お よび生物変換（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｅｎｚｙｍｅｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｏｎｖ ｅｒｓｉｏｎｓ）Ｊ、９章、ｐｐ、５０４−５２２、アカデミツク・プレス（Ａ ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９８０゜β−ラクタマーゼは 、本発明の教示に従い、対応するペニシラン酸Ａからのペニシリンメチルエステ ルＢの合成のための逆ヒドラーゼとして使用することができ、非帯電のＢはＡの 上に疎水性膜を横切って選択的に移送され、そ藝で１らにエステラーゼの作用に より非透過性して極性ペニシリンＣが得られる。

Ａ（帯電した）　Ｂ（非帯電の） このアプローチは、それ自体全体の合成に適用することができる、ペニシラン酸 前駆体の合成を促進することができるであろう。Ｊ、Ｃ，シーハン（Ｓｈｅｅｈ ａｎ）およびに、Ｒ，ヘネリーーロウガン（Ｈｅｎｅｒｙ−Ｌｏｇａｎ）、ジャ ーナル・オン・アメリカン・ケミカル・ソサイアティ−（Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、 Ｓｏｃ、）　、８４．２９８３　（１９６２）。

当業者は理解するように、本発明は、また、ペプチド以外の化合物、例えば、ペ プチドに似た化合物およびその同等体に適用することができる。

例えば、プロキラルジカルボン酸ジエステルをキラルモノエステルに非対称的に 分割するために、エステルヒドラーゼ様ブタ肝臓エステラーゼ［ＥＣ３，１，１ ，１］を使用することは、よ（知られている［Ｃ。

Ｊ、シー（Ｓｉｈ）ら、アナル・オン・ニューヨーク・アカデミ−・オン・サイ エンシズ（Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、）　、４７１．２３９　（１ ９８６）］　、その教示を引用によってここに加える。同一の酵素を本発明にお いてキラルエステルの選択的移送について記載する方法で、使用して、膜を通し てキラルエステルを選択的に移送し、そして反応相中に非反応性対本体酸を保持 することができる。

本発明は次のようにして標準の生化学的方法を利用する：ｒＨ−ｖｌａ−Ｊは、 遊離の末端アミノ基を有するペプチドのＮ−末端アミノ酸残基であることを示す ；　ｒ−ｐｈｅ−ＯＨＪは、フェニルアラニンがＣ−末端遊離カルボキシ基を有 するペプチドのＣ−末端アミノ酸残基であることを示す。また、ｒＶ、、、Ｊは 合成の平均速度を示し、そしてｒｖ、、。

７」は透過の平均速度を示す。

次の実施例によって、本発明をさらに説明する。

実施例１ アスバルテイム誘導体を、次のようにして本発明に従い調製した：ｐ８５．５に 調節した１００ｍ１の水中の５．０２ｇ　（２０ミリモル）のＮ−ホルミル−Ｌ −アスパルチル−β−ベンジルエステル、４．３ｇ（２０ミリモル）のし−フェ ニルアラニンメチルエステルの溶液に、合計８Ｘ１０’タンパク質分解単位を表 す５００ｍｇのサーモリシン酵素（ダイワ化学株式会社、大阪）を添加した。

生ずる透明な反応混合物を４０℃において１５時間インキュベーションし、この とき不溶性ジペプチドＮ−ホルミル−β−ベンジル−し−アスパルチル−し−フ ェニルアラニン測定の存在は明らかとなった。次いで、生ずる混合物を、ベンド ・リサーチ・インコーホレーテッドの１平方フイートの膜面積を有する「１型中 空繊維選択的透析膜」の実験用中空繊維装置の反応側、この場合において管側、 に接続された、２００ｍ１の容器に入れた。膜の生成物側（セパレーターのシェ ル側）を、ｐＨ７，５ノアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉ　ｌ　１ｕｓ）種か らの５００ｍｇの酵素アシラーゼＩ　（ＥＣ３，５，１，１４）を含有する水性 （生成物）混合物（合計の体積＝２００ｍｌ）源に接続した。この酵素は、通常 アミノアシラーゼと記載され、両者のＮ−アセチル−およびＮ−ホルミルーβ− ペンジルアスパルテイムとして機能することが発見された。　反応および生成物 の混合物を室温において中空繊維のセパレーターを通して、嬬動ポンプの助けに より、６００ｍ１／分の速度で向流で循環させた。この装置の立体配置は第２図 に示すものに類似する。両者の反応および生成物の混合物中のｐＨはプロセスが 進行するにつれて低下するので、ｐＨスタット（ｓ　ｔ　ｓ　ｔ）を使用してｐ Ｈを一定に維持した。　Ｎ−ホルミル−β−ベンジル−し−アスパルチル−し− フェニルアラニンをＨＰＬＣによりモニターした。クロマトグラフィーの分析は 、タラコアー（Ｔｒａｃｏｒ）９９５型で２５４ｎｍにセットしたしＤＣスペク トロモニターＩＩ検出器と一緒に、アミノ酸、完全に保護された生成物ジペプチ ドおよびジペプチドの検出について実施した。使用したカラムは、ミリポアー・ ウォーターズ（Ｍｉ　］　］　１ｐｏｒｅ　Ｗａｔｅｒｓ）ラジアル・コンプレ ッション・モジュールの中に収容された、Ｎ０ＶＡ−ＰＡＫ　Ｃ，＠　Ｒａｄａ ｌ−Ｐａｋカートリッジ、８ｍｍＸ１０ｃｍ１であった。

完全に保護されたジペプチドの検出のために使用した移動相は、４５％のメタノ ール（ＨＰＬＣ等級）、５％のテトラヒドロフラン（ＨＰＬＣ等級）；および５ ０％の１％のＫ　Ｈ２Ｐ　Ｏ４緩衝液のＶ　／　Ｖ混合物であった。生成物のジ ペプチドの検出のために、移動相は４０％のメタノールおよび６０％の１％のＫ 　Ｈ２Ｐ　Ｏ４緩衝液（１ｍｌのトリエチルアミン／リットルの溶媒を添加して ティリングを最小し、そして８０％のリン酸を使用してｐＨを４．３に調節した ）から成っていた。流速は１ｍｌ／分に保持した。

Ｎ−ホルミル−β−ベンジル−し−アスパルチル−し−フェニルアラニンＨＰＬ Ｃのデータはを下表ＩＩに要約し、そして生成物溶液中に蓄積された生成物のジ ペプチドの合計量（ｍｇ）を時間関数として表す。

ｐＨ５，５において水中の飽和点に相当する平衡における非帯電のジペプチドの 濃度の値は、２５℃において約０．０５％であることが発見された。移送された 非帯電のジペプチドの量／膜の平方フィート／時間は約２００ｍｇであるするこ とが発見され、平衡の維持は新規な不溶性ジペプチドの溶解平衡および／または ジペプチドの合成を必要としたことを示す。反応混合物中の不溶性非帯電の相の ジペプチドのほとんど完全な溶解は、約５時間後、観測され、このとき反応は停 止した。表Ｉｆのデータのプロットは第３図に示す。直線の関数は、膜を横切る ペプチドの移送が定常状態で進行することを示す。２００ｍｇ／ｆ　ｔ”／時間 の生成物ジペプチドの観測された形成速度は、理論的グラウンドで予測したよう に、水中で０．０５％において測定した膜を横切る非帯電のジペプチドの束（１ ９０ｍｇ／ｆ　ｔ’／時間）に類似することが確証された。

この時点において、連続的添加を２つのアミノ酸反応成分の反応混合物について 、各約１２０ｍｇ／時間の速度で実施して、系を非帯電のジペプチドで飽和して 保持した場合、記載した系は定常状態を続けることが期待された。

膜の選択性を完全に実現するために、第２酵素との接触前に、第１膜と直列の第 ２膜のインターカレイション（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｏｎ）が必要であること がある。なぜなら、単一の膜を横切る選択性は反応溶液中の高いアミノ酸濃度の ためにより低いからである。

生成物溶液（２００ｍｌ）を回収し、ｐＨ２，５に調節し、そして４℃に一夜冷 却した。集めた沈澱を回収し、そしてＭｅＯＨ：Ｈ，０から再結晶化すると、３ ０７ｍｇのＮ−ホルミル−β−ベンジル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラ ニンが得られた。［α］　、”。＝−５，６６（Ｃ＝１．　２　；　Ｅ　ｔＯＨ ）　、Ｎ−ホルミル−β−ヘンシル−７７、／（／Ｌｚテイムでアスペルギルス 属（Ａｓｐｅｒｇｉ　Ｉ　１ｕｓ）エステラーゼのパッチ式加水分解により調製 した真性試料と同一である（ＩＲ，１３Ｃ−ＮＭＲ）、［α］　Ｄ２Ｂ’　＝− ５，３°　（ｃ＝１．２；ＥｔＯＨ）。

実施例２ 実施例１のそれに類似する賦形剤を実施したが、ただしＬ一対掌体の代わりに８ ．６３ｇのり、Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルを使用した。結果を表ＩＩ Ｉに要約する。２００ｍ１の生成物溶液から非帯電のペプチドを単離すると、３ １０ｍｇの生成物が得られた、［α］　、２８０＝−６，４°　（ｃ＝１．４； ＥｔＯＨ）、すヘテの面においてＮ−ホルミル−β−ベンジル−し−アスパルチ ル−し−フェニルアラニンの真性試料と同一である（ＩＲ，１３Ｃ−ＮＭＲ）。

表ＩＩに要約したデータのプロットが再び示すように、反応器をり。

Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルを使用して操作したとき、定常状態のプロ セスが存在した。サーモリシンの立体特異性は、実施例１に記載するのと同一の り、Ｌ−ジペプチドの独占的な形成により実証される。

管相（反応混合物）の中に保持されたＤ−フェニルアラニンメチルエステルは、 ペプチドの形成の全体の反応速度論を妨害しなかった。

実施例３ 実施例１に従い調製した、１．０ｇのＮ−ホルミル−β−ベンツルーＬ−アスパ ルチルーＬ−フェニルアラニン、４．０ｍｌの水、４．０ｍｌのテトラヒドロフ ラン、および１．０ｍｌの濃塩酸（１２Ｎ）の混合物を９時間還流加熱した。次 いで、この混合物を冷却し、そしてｐＨを５０％ＮａＯＨ溶液で４．０に調節し たつ次いで、テトラヒドロフランを〈３５℃および２０ｍｍＨｇにおける蒸発に より除去した。５℃において１時間貯蔵することによって結晶化を完結させ、次 いで試料を濾過し、１ｍｌの氷水で洗浄し、そして真空乾燥すると、３６７ｍｇ の白色固体が得られた。この物質はＨＰＬＣおよびＩＲの比較によりアスパルチ ルフェニルアラニンの真性試料と同一であった。［α］。２８’　＝＝　＋１２ °　（ｃ＝ｏ、５；５０％のＭｅＯＨ中のＯ，ＩＮ　ＨＣＩ）。

アスパルチルフェニルアラニンは、メタノールおよび塩酸で、次の文献に記載さ れているように、処理することによってアスバルテイムに転化した：Ｇ、Ｌ、バ チマン（Ｂ　ａ　ｃ　ｈｍａ　ｎ）およびＢ、　Ｄ、バインヤード（Ｖｉｎｅｙ ａｒｄ）、米国特許第４，１７３，５６２号、実施例＃１゜ 実施例１のそれに類似する実験を実施したが、ただし反応成分として５．６５ｇ 　（２０，１ミリモル）のＮ−カルボキシベンゾキシ−し−アスパラギン酸β− メチルエステルおよび４．３８ｇ　（２０，３ミリモル）のし−フェニルアラニ ンメチルエステルを使用した。アミノ酸を１００ｍ１の水中に溶解し、この溶液 のｐＨを５．５に調節し、そして５００ｍｇのサーモリシンダイワ（Ｄａ　ｉｗ ａ）（８Ｘ１０’のタンパク質分解単位）を添加した。この溶液を４０℃におい て１５時間前前辺インキュベーションし、このとき実質的な量のＮ−ＣＢＺ−（ β−メチルエステル）−Ｌ−ａｓｐ−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルが沈 澱した。

この警濁液を、ｌｆｔ”の膜表面を含有する「１型中空繊維選択的透析膜」　（ ベンド・リサーチ・インコーホレーテッド）の管側に接続し、そしてこの機械を 室温において５時間、ｐＨ７，５において５００ｍｇのアシラーゼＩ　［シグマ （Ｓ　ｉ　ｇｍａ）：］を含有する２００ｍ１の水のシェル側桁に対して操作し た。シェル相中のペプチド生成物の蓄積をＨＰＬＣによりモニターし、そして結 果を表ＩＶおよび第４図に再現する。

５時間の実験後、反応を停止し、シェル側桁（２００ｍｌ）を回収し、ｐＨ２， ５に調節し、そして４℃において一夜貯蔵した。沈澱した生成物を集め、そして ＣＨ，ＯＨ：Ｈ，Ｏから再結晶化すると、４０５ｍｇ（８６％の回収率）のＮ− ＣＢＺ−（β−メチルエステル）−Ｌ−ａｓｐ−Ｌ−フェニルアラニン（Ｎ−Ｃ ＢＺ−イソ−ＡＰＭ）が得られた、［αコ　、２８’　＝＋６゜　０°　（ｃ＝ １．　１　；ＥｔＯＨ）　、　Ｎ−ＣＢＺ　−イア−ＡＰＭ（７）真性試料と同 一テアッた（”Ｃ−ＮＭＲ）、［αコｂ２８″＝＋５．５″　（ｃ＝１．１：Ｅ ｔＯＨ）、化学的カップリングおよびアシラーゼＩを使用する部分的エステル分 解により調製した。

実施例１および２の実験において前述したように、第４図のプロットはＮ−ＣＢ Ｚ−イソ−ＡＰＭの蓄積が約２００ｍｇ／時間の定常状態で進行したことを示す 。

Ｎ−ＣＢＺ−イソ−ＡＰＭのＡＰＭへの転化は、実施例３に記載する条件下に実 施することができる。

実施例５ アスバルテイム誘導体、Ｎ−ホルミル−（β−メチル）−ａｓｐ−ｐｈｅ−ＯＨ を、次のようにして、本発明に従い調製した：ｐＨ７，０に調節した１００ｍ１ の水中に、６．ＯＯｇ　（３５ミリモル）　（７）Ｎ−ｔルミルー（β−メチル ）−Ｌ−アスパラギン酸、１０．００ｇ　（４８ミリモル）のし−フェニルアラ ニンメチルエステルを含有する溶液に、合計１．２Ｘ１０’タンパク質分解単位 を表す７７０ｍｇのサーモリシン酵素（ダイク・ケミカル・カンパニー、大阪） を添加した。生ずる透明な溶液を４０℃において１時間インキュベーションし、 このときＨＰＬＣ分析は４３３．’８ｍｇのＮ−ホルミル−β−ベンジル−ａｓ ｐ　ｐｈｅ−ＯＭｅの存在を示した。この溶液を２５℃に冷却し、ｐＨを５．０ に調節し、そしてドデカン中の３０％Ｖ／ＶのＮ、　Ｎ−ジエチル−ドデカンア ミドから作られた０、５ｆ　ｔ”　（４５０ｃｍ”）のＩＬＭを提供する、中空 繊維のセパレーター［「２型中空繊維選択的透析膜」、ベンド・リサーチ・イン コーホレーテッド］の管側に接続した２００ｍ１の容器に入れた。セパレーター のンエル側を、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種からのアシラー ゼＩ　（ＥＣ３，５，１，１４）　（アミノアシラーゼ　ＡＭＡＮＯ１名古屋） を含有する生成物の容器にｐＨ７゜５において接続した。

２つの相を、２５℃において５０ｍ１／分（管相）および５００ｍ１Ｚ分（シェ ル相）の速度で、２つの蛎動ポンプの助けにより、第２図に示す立体配置を使用 して循環した。両者の相のｐＨをｐＨスタットの使用により一定に維持した。

Ｎ−ホルミル−（β−メチル）−ａｓｐ−ｐｈｅ−ＯＨの形成は、ＨＰＬＣによ り、２５４ｎｍにセットしたＬＤＣスペクトロモニターＩＩ検出器と一緒にトラ コー（Ｔｒａｃｏｒ）９９５型を使用してモニターした。使用したカラムは、ミ リポア・ウォーターズＲＣＭ−１００ラジアル・コンプレッション・モジュール 内に収容された、Ｎ０ＶＡ−ＰＡＫ　Ｃ１８ラジアル−パック・カートリッジ、 ８ｍｍｘ１００ｍｍであった。

分析のために使用した移動相は、次の通りであった：（ａ、）Ｎ−ホルミル−（ β−メチル）−ａｓｐ−ｐｈｅ−ＯＭｅについて二０．１％ＫＨ！ＰＯ，緩衝液 ｐＨ４，６中の４０％ｖ／ｖのメタノール： （ｂ）Ｎ−ホルミル（β−メチル）　−ａ　ｓ　ｐ−ｐ　ｈ　ｅ　−ＯＨについ て二０．１％ＫＨ，ＰＯ４緩衝液ｐＨ４，６中の２０％ｖ　／　ｖのメタノール ；使用した流速は両者の分析について１ｍ１／分であった。

Ｎ−ホルミル−（β−メチル）　−ａ　ｓ　ｐ−ｐｈ　ｅ−ＯＨ（生成物のジペ プチド）の形成に関するデータは下表■に記載し、そして時間の関数として２０ ０ｍ１のシェル相の中に蓄積した合計量（ｍｇ）としてを表す。

表Ｖ 表Ｖのデータのプロットは第５図に示す。

この実験の終わりにおいて、ＨＰＬＣは管相中の２８３ｍｇのＮ−ホルミル−（ β−メチル）−ａｓｐ−ｐｈｅ−ＯＭｅの存在を示した。これらの値は、反応器 の操作の開に合成されたペプチドの量の計算を可能とした。

ｐ、、＝シェル相の中に移送されたペプチド＝４００Ｘ３３６／３２２＝４１７ ．４ｍｇ： Ｐ、＝管相中の初期のペプチド＝４３３．８ｍｇ：ＰＴ＝実験の終わりにおいて 管相の中に残留するペプチド＝２８３ｍｇ： ｐ、、＝　（ｐ、−Ｐｔ）＋ｐ、、、；Ｐａｙｓ＝Ｐ＋ｒ−（Ｐ、−Ｐｔ）２６ ６．６ｍｇ；そしてＶ−、、＝２６６．６１５＝５３．５ｍｇ／時間・１００ｍ １゜２６６．６１５＝５３．５ｍｇ／時間４００ｍ１のＶ１７．は、サーモリシ ンの存在下にＮ−ホルミル−（β−メチル）−Ｌ−アスパラギン酸およびＬ−フ ェニルアラニンメチルエステルを使用して実施した平衡の研究において、前進す る速度について測定した、合成速度（５００ｍｇ／時間・リットル）と一致する 。

生成物の溶液（２００ｍｌ）を回収し、ＩＮ　ＨＣＩでｐＨ２ｉ：調節し、そし て２００ｍ１のＥｔＯＡｃで２回抽出した。−緒にした抽出液は蒸発すると白色 残留物を残し、それはＥ　ｔ　ＯＡ　ｃ／ヘキサンから再結晶化すると、１００ ｍｇのＮ−ホルミル−（β−メチル）−Ｌ−ａｓｐ−Ｌ−ｐｈｅ−ＯＨが得られ た、［α］　ｏ”’　＝　＋　０．　７０°　（ｃ、　０゜２９　；ＭｅＯＨ） 　、合成のＮ−ホルミル−（β−メチル）−Ｌ−ａｓｐ−Ｌ　ｐｈｅ−ＯＭｅを アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉ　ｌ　Ｉｕｓ）のエステラーゼでバッチ式加 水分解することによって調製した真性試料と同一であった（ＩＲ，１３ｃｍＮＭ Ｒ）、［ｆｆｌ　ｏ”０＝＋０．　８０゜（ｃ＝１．２　；ＭｅＯＨ） 実施例６ 実施例５に記載する実験を、ｌｆｔ”の液体膜（ドデカン中の３０％Ｖ／ＶのＮ 、　Ｎ−ジエチル−ドデカンアミド）を含有する、２型中空繊維選択的透析膜（ ベンド・リサーチ・インコーホレーテッド）中で規模を大きくした。管相はｐＨ ７，０に調節した４００ｍ１の水中の４０ｇのＬ−ｐｈｅ−ＯＭｅ、２４ｇのＮ −ホルミル−（β−メチル）−Ｌ−ａｓｐおよび３．０８ｇのサーモリシン酵素 ワ（Ｄａｉｗａ）（合計５×１０６タンパク質分解単位）を含有した。４０℃に おいて１時間インキュベーションした後、１，０６８　（２，７ｇ／Ｉ）の量の Ｎ−ホルミルー（β−メチル）−Ｌ−ａｓｐ−Ｌ−ｐｈｅ−ＯＭｅが存在するこ とが発見された。この溶液を２５℃に冷却し、ＩＮ　ＨＣＩで調節し、そして中 空繊維のセパレーターの管側に接続した。シェル相を、２ｇのアミノアシラーゼ ！　（アマノ）を含有する４００ｍ１の水ｐＨ７，５から作った。２つの相を、 実施例５に記載するように、２５℃において５時間向流的に循環させた。結果を 表Ｖｌおよび第６図に要約する。

実験の終わりにおいて、管相の中に残留するＮ−ホルミル−（β−メチル）−ａ ｓｐ−ｐｈｅ−ＯＭｅの量は５８６ｍｇであった。

最初の３０分間観測された最高の移送値（４０４ｍｇ／時間）は、予備インキュ ベーションの間に生成した、高い初期のペプチド濃度の結果である。より多くの ペプチドの合成において設定したペプチドの移送により引き起こされる平衡を離 れて、こうして実験への最初の１時間後に定常状態の条件が２００ｍｇ／時間の 期待したレベルにおいて確立される（第６図）。

実施例７ 実施例５のそれに類似する実験を実施したが、ただしＬ一対車体の代わりに１０ ．００ｇのり、Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルを使用した。表ＶＩＩおよ び第７図に示す結果が明瞭に示すように、Ｎ−ホルミル−（β−メチル）−Ｌ− ａｓｐ−Ｌ−ｐｈｅ−ＯＨの形成の観測された速度は、サーモリシンの対本体選 択性および実施例１および２の前の結果から期待されるように、Ｌ−ｐｈｅ−Ｏ Ｍｅを使用して得られたもの（実施例５、表Ｖ）の半分であった。

３０　１０．６ ６０　２５．５ １２０　３３．２ １８０　５５．３ ２４０　５９．６ ３００　６９．１ 実施例１５ Ｄ、Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルの膜促進酵素的分割を、次のようにし て本発明に従い利用した：１００ｍ１の水ｐＨ７，５中の１゜０ｇ（５゜６ミリ モル）のり、Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルの溶液に、５００ｍｇのアミ ノアシラーゼ１　（アマノ製薬会社、名古屋）を添加した。この混合物を２５℃ において３０分間反応させ、その終わりにおいて２６６ｍｇのＬ−ｐｈｅ−ＯＨ （１，６ミリモル）および７１２ｍｇのり、Ｌ−ｐｈｅ−ＯＭｅ　（４ミリモル ）の存在がＨＰＬＣ分析により観測された。内部のドデカン液体フィルム中に０ ．５ｆｔ２の３０％Ｖ／ＶのＮ、　Ｎ−ジエチル−ドデカンアミドを含有する中 空繊維セルガーソ支持ＩＬＭセパレーター［「２型中空繊維選択的透析膜」、ベ ンド・リサーチ・インコーホレーテッド〕の管（反応）側に、上の溶液を供給し た。膜の生成物側（セパレーターのシェル側）に、希ＨＣＩでｐＨ２，０に調節 した２００ｍ１の水を充填した。２相をセパレーターを通して２００ｍ１／分の 速度で向流的に、嬬動ポンプの助けにより循環させた（第２図）。分離は管相へ のり、Ｌ−ｐｈｅ−ＯＭｅの連続的添加により進行し、この添加は約１ｇのり、 Ｌ−ｐｈｅ−ＯＭｅ／時間の速度で実施した。水ｐＨ７，５中のり、Ｌ−ｐｈｅ −ＯＭｅ　（２゜１ｇ：１１．７ミリモル）のり、Ｌ−ｐｈｅ−ＯＭｅの合計３ ０ｍ１の７％の溶液を２時間の期間で添加した。両者の相のｐＨはｐＨスタット の使用により一定に保持した。

分割の過程を、３０分毎に両者の相から採った試料について、ＨＰＬＣにより追 跡した。ＨＰ　Ｌ　Ｃの計器および手順は実施例５に記載されているものである 。この場合において使用した移動相は０．１％のＫＨ２ＰＯ４緩衝液ｐＨ４，６ 中の２０％ｖ／ｖのメタノールであった；１ｍ１Ｚ分の流速。表Ｖｌｌに示しそ して第８図にブロワＩ・された結果は、管相中のＬ−ｐｈｅ−ＯＨの蓄積および シェル相中のＤＬ−ｐｈｅ−ＯＭｅの蓄積を示した。実験の終わりにおいて、両 者の相を回収し、そして次のようにして仕上げた： （ａ）内容物（１３０ｍｌ）をＩＮ　ＮａＯＨでｐＨ８，５に調節し、次いで２ Ｘ５０ｍｌのＥｔＯＡＣで抽出した。次いで、水性相をＩＮ　）（ＣＩでｐＨ４ ，０に調節し、そしてこの溶液を２．５×２０ｃｍのドウウエックス（Ｄｏｗｅ ｘ）５０　（ＮＨ４）カラムに通過させた。２００ｍ１の水で洗浄した後、生成 物を２００ｍ１の１０％のＮＨ４ＯＨで溶離した。溶離液を５０ｍ１に真空濃縮 し、そしてこの溶液を凍結乾燥した。収率・２４９ｍｇ、白色固体、Ｌ−フェニ ルアラニン、［α］　Ｄ！！”　＝−２９，２°　（Ｃ１２；Ｈ２Ｏ）、文献［ アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）］　［］αコＤ！５°＝−３５０６　（ｃ、２ 　；Ｈ，０）　、光学的純度９２％。

（ｂ）シェル相：　（２００ｍｌ）を希ＮａＯＨでｐＨ８，５に調節し、モして ２Ｘ５０ｍｌのＥｔＯＡｃで抽出した。有機抽出液を硫酸ナトリウムで乾燥し、 蒸発乾固し、次いで凍結乾燥すると、９８９ｍｇ　（４，６ミリモル）のＤＬ− ｐｈｅ−ＯＭｅ−ＨＣＩ、白色固体カ得うれた、［（Ｚ］　、”’　＝−３２， ４°　（ｃ、２；ＥｔＯＨ）、文献［アルドリッチ（Ａ　］　ｄ　ｒ　ｉ　ｃｈ ）　］　［（２］　ｏ”＝−３５゜０’　（ｃ、２　：Ｈ２Ｏ）　、光学的純度 ８３％。

この膜でｐｈｅ−ＯＭｅ（水、ｐＨ８，２５℃）にライ”（見いだされた３２ｍ ｇ／ｃｍ”−分の透過性の値に基づいて、４５０ｃｍ”（０，５ｆｔ’）の膜面 積について期待される束は８８０ｍｇ／時間であった。

表ＶＩＩＩに示すように、最初の時間の終わりにおいてシェル相の中に移送され たｐｈｅ−ＯＭｅの量は８６０ｍｇであり、移送は膜制限条件下に操作した。

表Ｖｌｌ１ １．０　２６６　７１２　０（０分） １．７　４７３　６１７　５３７　（３０分）２．４　６１５　５３１　８６０ 　（６０分）３．１　７４３　６２８　１１５４　（９０分）スブチリシンＡ（ セリン型アルカリ性プロテアーゼ）により触媒されたメチルエステル官能の対本 体選択性加水分解によるり、Ｌ−ｐｈｅ−ＯＭｅのバッチ式分割は、最近開示さ れた［スイーティン・チェノ（Ｓｈｕｉ−Ｔｅｉｎ　Ｃｈｅｎ）、クングースン グ・ワンプ（Ｋｕｎｇ−Ｔｓｕｎｇ　Ｗａｎｇ）およびチーフエイ・ウォング（ Ｃｈｉ−ＨｕｅｙＷｏｎｇ）、ジャーナル・オン・ケミカル・ソサイアティー、 ケミカル・コミュニュケーソヨンズＤ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、Ｃｈｅｍ、Ｃｏｍｍ 、）　、１９８６．１５１４］。ラセミ体のカルボン酸エステル化合物の膜の分 割には、ヒドラーゼを必要とする。エステル分解α−キモトリプシンを有するプ ロテアーゼ、例えば、アミノアンラーゼ１１α−キモトリプシンおよびスブチリ シンＡであるヒドラーゼを使用して、Ｄ。

Ｌ−アミノ酸化合物、例えば、Ｄ、Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルを分割 することができる。また、本発明の膜促進プロセスは、好ましいアミノアシラー ゼＩの代わりにスブチリシンＡまたはα−キモトリプシンを使用することによっ て実施することができる。アミノアシラーゼ■は、エンドタンパク質分解α−キ モトリプシンを、また、有する他のエステル分解酵素、例えば、スブチリシンＡ およびα−キモトリプシンより、ペプチドの加水分解のために、一般に好ましい 。

Ｄ、Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルの前述の分割を利用して、本発明にお いて記載するようにペプチドを生成する場合、生成されるし一フェニルアラニン はこの分野において知られている標準の手順によりＬ−フェニルアラニンメチル エステルに転化される。

この実施例は他のラセミ体のカルボン酸エステルに適合させることができる。例 えば、加水分解酵素を含む水性反応混合物中のラセミ体のカルボン酸エステルを 加水分解して、水性反応混合物中で帯電した対車体化合物および非帯電の対掌体 エステル化合物を形成することができる。

次いで、非帯電の対車体のエステル化合物を水性反応混合物から、ベンド・リサ ーチ・インコーホレーテッドからの１型および型２の中空繊維選択的透析膜を包 含する、本発明のイオン拒絶膜を横切って移送する。

実施例、例えば、実施例８の１つの型において、ラセミ体のカルボン酸エステル 化合物はり、Ｌ−アミノ酸エステル化合物である；帯電した対掌体化合物はＬ− アミノ酸化合物であり、そして非帯電の対車体エステル化合物はＤ−アミノ酸エ ステル化合物である。理解されるように、酵素および反応条件の選択は本発明の 当業者の理解および知識の範囲内である。

連続的またはバッチ式の処理手段は本発明により提供され、ここで反応成分の所 望の対本体を生成しそして反応混合物に添加することができる。

実施例９ 本発明によるＮ−ホルミル−（β−メチル）　−Ｌ−ａｓｐ−Ｌ−ｐｈｅ−ＯＨ の合成は、次のようにして透過性生成物の除去のために、固定化されたアミノア シラーゼＩおよびイオン交換樹脂を利用することによって実施した：　ｐＨ７， ＯＪ：３１節した１００リツトルの脱イオン水中の１０．０ｇ　（４８ミリモル ）のし−フェニルアラニンメチルエステルおよび６．０ｇ（３５ミリモル）のＮ −ホルミル−（β−メチル）−Ｌ−アスパラギン酸の溶液に、合計１．２Ｘ１０ ’タンパク質分解単位を表す７７０ｍｇのサーモリシン（Ｅｌ）　（ダイワ化学 会社、大阪）を添加した。生ずる溶液を４０℃において１時間インキュベーショ ンし、このときＨＰＬＣ分析は３８０ｍｇのＮ−ホルミル−（β−メチル）　− ａｓｐ−ｐｈｅ−ＯＭｅの存在を示した。この溶液を２５℃に冷却し、ｐＨを５ ．　０１：３ｍ節し、そしてこの溶液を２００ｍ１の容器４ｏに入れ、この容器 ４０は９００ｃｍ”　（１ｆ　ｔりのドデカン中の３０％のＮ、　Ｎ−ジエチル −ドデカンアミドから作られた疎水性液体膜を含有する中空繊維のセパレーター ４４（ｒ２型中空繊維選択的透析膜」、ベンド・リサーチ・インコーボレーテッ ドコの管側４６に接続されていた。セパレーター４８のシェル側は、第９図に示 す１系列の接続する容器から作られた閉じた回路として配置した。セパレーター ４４へ戻る溶液をｐＨ４゜０に調節して、ジペプチドＮ−ホルミル−（β−メチ ル）−ａｓｐ−ｐｈｅ−ＯＭｅと同時に透過するＬ−ｐｈｅ−ＯＭｅをプロトン 化した。

ドウウエックス５０（Ｎａつを通る結晶は正に帯電したＬ−ｐｈｅ−ＯＭｅを除 去して、非帯電のペプチドを溶液の中に残した。流出液をｐＨ７，０に調節し、 そしてＤＥＡＥ−セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）５２上に固定化したアミ ノアシラーゼＩ　（Ｅ２）の作用に暴露した［Ｔ、トサ、Ｔ、モリおよび１．チ パタ、Ａｇｒ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

３３．１０５３　（１９６９）］。生ずるジペプチドのＮ−ホルミル−（β−メ チル）−ａｓｐ−ｐｈｅ−ＯＨはそのｐＨにおいて負に帯電し、引き続いてドウ ウエックス１　（ＣＰ）樹脂５４により捕捉した。カラムの流出液５７をｐＨ４ ，０前以て調節した膜セパレーターに戻し、こうしてループを閉じた。

管相４６　（１００ｍｇ）およびシェル相４ｇ　（５００ｍｇ）を２５℃におい て膜セパレーターを通して、５０ｍ１／分の速度（管相）および１２０ｍ１／分 （シェル相）の速度で向流的に循環させた。

シェル相の周期的に試料採取を第２酵素（Ｅ２）からの流出液について実施しく 第９図、試料採取０５６、ドウウエックス１（Ｃ１つカラム５４の前）そして実 施例５に記載する手順に従いＨＰＬＣによりモニターした。期待するように、回 路のこの点において（第９図）、ＥｔによるＬ−ｐｈｅ−ＯＭｅの酵素的から生 じうるＬ−ｐｈｅ−ＯＨ（参照、実施例８）は抽出されなかった：循環する定常 状態のレベルのみのＮ−ホルミル−（β−メチル）−ａｓｐ−ｐｈｅ−ＯＨ（平 均濃度：５４ｍｇ／ｌ）が観測され、膜を横切るジペプチドのＮ−ホルミル−（ β−メチル）−ＡＰＭの連続的移送およびその引き続＜Ｅｘによる加水分解を反 映した。ドウウエックス１樹脂により帯電したジペプチドの効率よい捕捉は、こ の実験を通じたカラムの流出液５７において観測されるその低い濃度により示さ れる。

ドウウエックス１の不存在下に実施した同様な平行実験は、前述の結果から予測 することができるように、シェル相中のＮ−ホルミル−（β−メチル）−ａｓｐ −１ｐｈｅ−ＯＨの急速な蓄積を示した。再び、Ｌ−ｐ　ｈ　ｅ−ＯＨは循環す るシェル相の中に見いだされなかった。両者の実験の比較は第１０図および表Ｉ Ｘにおいて見られる。

３０　３１．６　３０．２ ６０’＝−３７，８ １２０’　２６．０　７１．８ １８Ｃ１３５，４８３，１ ２４０４５，６−− ３００　５１．２’　−− この実施例に記載するようにイオン交換樹脂を利用する、イオン拒絶膜を同時に 透過して生成物の混合物の中に入るフェニルアラニン低級アルキルエステルに加 えて、イオン拒絶膜を同時に透過して生成物の混合物の中に入るアスパラギン酸 はこのような樹脂を利用して分離することができる。生成物の混合物から膜を横 切って槽拡散することができない種または生成惣は、このようなイオン♀換樹脂 を利用して除去することができる。また、この分野において知られてい、る他の 分離方法は、電気泳動、電気透析およびイオン交換樹脂の分離の同等の方法であ る膜の分離を包含するが、これらに限定されず、本発明において利用することが できる。

縮合酵素を固定化すると、酵素反応の所望の平衡を包含する反応成分、生成物お よび酵素を考慮する、酵素反応の最適な効率のために好ましい初期の反応混合物 のｐＨにおいて、管相中の酵素反応を実施することができる。必要に応じて、管 相中の初期の反応混合物のｐＨは膜との接触前に第２反応混合物に対して再調節 することができ、こうして第２反応混合物のｐＨは、管相から膜を横切ってシェ ル相の中にへ非帯電の生成物を移送するときの膜の効率を最大とするであろう。

第９図は、管相中の初期反応混合物のｐＨを第２反応混合物のｐＨにに調節する ことを示さない。

同様に、シェル相中のエステラーゼを固定化し、そしてシェル相中の生成物の混 合物のｐＨを調節しそして必要に応じて再ｇＲ１ｆＪシて最も効率よい処理を実 施することができる。実施例８および９は、本発明を利用する効率よい連続的ま たはバッチ式処理のための追加の手段を掛供する。

連続的処理において、反応成分および存在する場合同時に透過する化合物の所望 の対車体は管相または反応混合物に戻すことができる。

実施例１０ 実施例５において合成したジペプチドのＮ−ホルミル−（β−メチル）−ａｓｐ −ｐｈｅ−ＯＨをＬ−ｔｒｐ−ＯＭｅと、ペプシンの存在下に反応させて、保護 されたトリペプチドのＮ−ホルミル−（β−メチル）−ａｒｐ−ｐｈｅ−ｔ　ｒ ｐ−ＯＭｅを形成する。透過後、保護されたトリペプチドを酵素のアミノアシラ ーゼにより不可逆的に加水分解して、Ｎ−ホルミル−（β−メチル）−ａｒ、ｐ −ｐｈｅ−ｔｒｐ−ＯＨを形成する。

２５０ｍ１の０１モルののクエン酸塩緩衝液ｐＨ４，５中の２０４　ｇ□（８ミ リモル）のＬ”ｔｒｐ−ＯＭｅおよび０．４８４ｇのペブシンノ溶液に、２５ｍ １の無水Ｍ＋ＯＨの中に溶解した０、６４２ｇ　（２゜１ミリモル）あＮ−ホル ミル−（β−メチル）−ａｓｐ−ｐｈｅ−ＯＨを添加し、そして生′する透明な １０％のＭｅＯＨ溶液を室温において１時間インキユベーシーンした。この時点 におけるＨＰＬＣ分析は、１４４ｍｇ／ｌのトリペプチドのＮ−ホルミル−（β −メチツリーａｒｐ−ｐ　’ｈ　ｅ’−’ｔ　ｒ　ｐ　−ＯＭ　ｅの存在を示し た。次いで、この溶液を実験の中空繊維のセパレーター（ベンド・リサーチ・イ ンコーホレーテッド）の管側に接続し、それは０．５ｆ　ｔ”　（４５０ｃｍ” ）のドデカン中の５０％のＮ、Ｎ−ジエチルドデカンアミドから作られたＩＬＭ を提供した。

セパレーターのシェル側を、２５０ｍ］の１０％のＭｅＯＨ，ｐＨ６゜０中に溶 解した０、１６０ｇの酵素アミノアシラーゼＡＭＡＮＯ＜アマノ製薬会社、８古 ！りを含有する生成物の容器に接続した。２つの相を２５℃において５０ｍ１／ 分（管側）および２５０ｍ１／分（シェル相）の速度で、２台の螺動ポンプの助 けにより（第２図）、向流的に循環させた。実験を通じてｐＨスタットを使用し て、Ｑ、５Ｎ　ＮａＯＨを滴定剤として使用して、シェル相をｐＨ６，０の一定 値に保持した。

実験を通じて、反応容器（管側）中のＮ−ホルミル−（β−メチル）−ａｌｐ− ｐｈｅ−ＯＨの濃度は、この反応成分を０．５ミリモル／時間（５時間で０．８ ｇ）の速度で連続的に添加して、ｐＨ４，５におけるその透過速度を補償して、 実験の間にタンパク質合成のペプシン触媒の速度を一定維持することによって、 はぼ一定に保持する。

中間体のＮ−ホルミル−（β−メチル）−ａｒｐ−ｐｈｅ−ｔ　ｒｐ−ＯＭｅお よびその加水分解生成物の形成は、ＨＰＬＣにより、ＴＲＡＣＯＲ９９５イソク ロマトグラフのポンプを２５４ｎｍにセットしたしＤＣスペクトロ・モニター１ １　（１，２０２）検出器と一緒に使用して、モニターした。使用したカラムは 、ミリポア・ウォーターズＲＣＭ−１００ラジアル・コンブレッジタン・モジュ ール内に収容された、Ｎ０ＶＡ　−Ｐ　Ａ　Ｋ　ＣＩｓ　カートリッジ（８ｍｍ 内径Ｘ１０ｃｍ）であった。

分析に使用した移動相は、次の通りであった：含有する４０％のＣＨ，ＣＮおよ び６０％の１１％のＫＨ！ＰＯ４緩衝のｖ／ｖ混合物を利用した。保持時間は１ ２．６分（１ｍｌ／分、流速）であった。

有する３０％のＣＨ３ＣＮおよび７０％の０．１％のＫ　Ｈ！Ｐ　Ｏａ緩衝のｖ ／ｖ混合物を利用した。保持時間は１０．２分（１ｍｌ／分、流速）であった。

トリペプチドのＮ−ホルミル−（β−メチル）−ａｒｐ−ｐｈｅ−ｔ　ｒｐ−Ｏ Ｈの形成に関するデータを下表Ｘに再生し、そして蓄積したトリペプチドのｍｇ ／ｌリットルのシェル相を時間の関数として表す。

データのプロットを第１１図に示す。

表Ｘ ０３９．６０．０ ３００　５０．４　４２．８ ＋Δ＝１０．８ｍｇ　＋Δ＝４２．８ 合成されたペプチド：１０．８＋４２．８＝５３．６ｍｇ毎時の平均した速度は ５３．６１５＝１０．７ｍｇ／］・時間であり、これはペプシン触媒のバッチ式 タンパク質合成の平均速度と同一の桁の大きさの値である（第１２図）。

生成物の同定は、次のようにして、化学的合成により調製したＮ−ホルミル−（ β−メチル）−ａｒｐ−ｐｈｅ−ｔ　ｒｐ−ＯＨの真性試料に対して、上のＨＰ ＬＣ系における保持時間を比較することによって実施した： Ｌ　−ｔ　ｒ　ｐ−ＯＭｅ　（アルドリッヒ）および０．２３ｍ１　（１，７ミ リモル）の（Ｅ　ｔ）　ｓＮの溶液に、実施例５に示すように調製した、５０Ｑ ｍｇ　（１，６ミリモル）のＮ−ホルミル−（β−メチル）−ａｓｐ−ｐｈｅ− ＯＨに添加した。この溶液を水浴の中に浸漬し、そして３５０ｍｇのジシクロヘ キシルカーボンイミド（アルドリッヒ）＋２７５ｍｇのＮ−ヒドロキシ−５−ノ ルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド（アルドリッヒ）を冷たいジオキサン 溶液に添加した。水浴中で１５分間撹拌した後、この溶液を室温において一夜放 置した。次の朝、沈澱したジシクロヘキシル尿素を濾過し、ジオキサンを蒸発さ せ、そして残留物を２００ｍ１のＥｔＯＡＣ中に溶解し、２００ｍ１の４％のク エン酸、５％のＮａＨＣＯｓｓ水で洗浄し、そして無水Ｎ　ａ　２　Ｓ　Ｏａで 乾燥した。溶媒を除去すると、無色の残留物が得られ、それをＥｔＯＡｃ／ヘキ サンから結晶化すると、６３０ｍｇ　（７８％の収率）のＮ−ホルミル−（β− メチル）−ａｒｐ−ｐｈｅ−ｔ　ｒｐ−ＯＭｅが得られた、融点１５３−１５４ ℃。［αＦ　。”’　＝−３５，４°　（ｃ＝０．８、ＭｅＯＨ）。

分析：　ＣｚｔＨｎＮａＯフについての計算値：Ｃ，６２，２２；Ｈ２Ｓ、５６ ：Ｎ１１０．７４゜実測値：Ｃ１６１，９５；Ｈ２Ｓ、８５；Ｎ、１０．７２゜ 　”Ｃ−ＮＭＲスペクトルはこの構造を確証した。

Ｂ、Ｎ−ホルミル−（β−メチル）’　−ａ　ｒｐ−ｐｈｅ−ｔ　ｒｐ”ＯＨ。

Ｉｇ（１，９ミリモル）のＮ−ホルミル−（β−メチル）−ａｒｐ−ｐｈｅ−ｔ ｒｐ−ＯＭｅを１５０ｍ１のＭ　ｅ　ＯＨ中に溶解し、そしてこの溶液をｐＨ６ ，０に調節した１３５０ｍｌの水中の２０３ｍｇのアミノアシラーゼＡＭＡＮＯ の溶液に添加した。この溶液を室温において、ｐＨスタットおよび滴定剤として ０．２Ｎ　ＮａＯＨを使用して、ｐＨ６゜０に６時間保持した。Ｃ−末端のメチ ルエステルの加水分解の過程を、前述の条件下にＨＰＬＣによりモニターした。

形成したｈｂｍａｒｐ−ｐｈｅ−ｔ　ｒｐ−ＯＨをｐＨ２においてＥｔＯＡｃで 抽出した。溶媒を蒸発すると、透明な残留物が得られ、これをＥｔＯＡｃ／ヘキ サンから結晶化して、４７５ｇ　（４９％）の白色結晶質固体が得られた、融点 １５５−１５８℃、［αコ、”’　＝−３０，２゜（ｃ、１．１９　；ＭｅＯＨ ）、分析。Ｃ！＠Ｈ！？ＮａＯ？についての計算値：Ｃ，６１，５３；Ｈ，５， ３６；Ｎ、１１．０４゜実測値：Ｃ，６０，３１；Ｈ，５，６２；Ｎ、１０．６ ６゜ＩＩＣ−ＮＭＲスペクトルはこの構造を確証した。

前述のＨＰＬＣ条件下に、ペプチドＮ−ホルミル−（β−メチル）−ａｒｐ−ｐ ｈｅ−ｔ　ｒｐ−ＯＨは１０．２分の保持時間を有し、これはペプシン触媒反応 において形成した生成物と同一であった（単独または混合物で）。

実施例１１ 実施例１０において観測したＮ−ホルミル−（β−メチル）−ａｒｐ−ｐｈｅ− ｔ　ｒｐ−ＯＨの蓄積速度（Ｖ□２．）はペプシンタンパク質合成速度（Ｖ、、 、）によってのみ決定されるという独立の証拠は、次の実験においてを与えられ た。

Ａ、Ｎ−ホルミル−（β−メチル）−ａｒｐ−ｈｅ−ｔｒｐ−ＯＭｅのバッチ式 タンパク質合成。■、２．およびＶｐａ’ｒｍの比較。１．　０２ｇのＬ　−ｔ 　ｒ　ｐ−ＯＭｅ　（４ミリモル）および２４２ｍｇのペプシンを１２５ｍ１の ０．１モルのクエン酸塩緩衝液ｐＨ４，５中に溶解し、そしてこれに１２ｍ１の メタノール中に溶解した３２４ｍｇ　（１ミリモル）のＮ−ホルミル−（β−メ チル）−ａｓｐ−ｐｈｅ−ＯＨを添加した。

生ずる１０％のＭｅＯＨ溶液を室温において３時間インキュベーションし、モし てＮ−ホルミル−（β−メチル）−ａｒｐ−ｐｈｅ−ｔｒｐ−ＯＭｅの合成速度 を、実施例１０に記載するように、ＨＰＬＣにより追跡した。３時間反応させた 後、この溶液をドデカン中の５０％のＮ、　Ｎ−ジエチルドデカンアミドの０． ５ｆｔ”のＩＬＭをもつ中空繊維のセパレーター中で、１５０ｍ１の０．１モル のクエン酸塩緩衝液ｐ）１５．。

Ｏ中の１０％のＭｅＯＨに対して、循環させた。Ｎ−ホルミル−（β−メチル） 　−ａ　ｒ　ｐ−ｐ　ｈ　ｅ　−ｔ　ｒ　ｐ−ＯＭｅの透過の過程を、前述した ように、ＨＰＬＣにより追跡した。表ＸＩおよび第１２図に示すデータが示すよ うに、中間体のトリペプチドメチルエステルの透過速度は、移送なしのバッチ式 プロセスにおいて測定した、ペプシンにより触媒されるタンパク質合成速度に密 接に従う。

９０　４８、０ ドデカン中のＩＬＭ５０％Ｎ、　Ｎ−ジエチルドデカンアミドを横切る透過を開 始する ４５　１８、４ ６０　２２、１ ９０　２５、８ １２０　２９、５ 実施例１０に記載する実験に対して確証実験をアミノアシラーゼの不存在下に実 施し、その間にトリペプチドメチルエステル中間体の同期合成下にＶｔ＠ＩＮを 測定した。

２．０４ｇのＬ−ｔ　ｒｐ−ＯＭｅ　（８ミリモル）および４８４ｍｇのペプシ ンを２２５ｍ１の０１１モルのクエン酸塩緩衝液ｐＨ４，５中に溶解し、そして これに２５ｍ１のＭ　ｅ　ＯＨ中に溶解した６４２ｍｇ　（２ミリモル）のＮ− ホルミル＝（β〜メチル）　−ａ　ｓ　ｐ−ｐ　ｈ　ｅ−ＯＨを添加した。この 溶液を室温において一夜放置し、その後ＨＰＬＣ分析は平衡において１６７．４ ｍｇ／ｌのＮ−ホルミル−（β−メチル）　−ａｒｐ−ｐｈｅ−ｔ　ｒｐ−ＯＭ ｅの存在を示した。この溶液をドデカン中の５０％ｖ／ｖのＮ、Ｎ−ジエチルド デカンアミドのｌｆｔ’のＥＬＭを含有するセルガード繊維をもつ中空繊維のセ パレーターの管側を通して、０．１モルのクエン酸塩緩衝液ｐＨ５，０中の２５ ０ｍ１の１０％のＭｅＯＨのシェル相に対して向流的に循環させた。中間体のト リペプチドメチルエステルのシェル相の中への透過を、実施例１０に記載するよ うに、ＨＰＬＣにより追跡した。対応するデータを表Ｘ■■に表し、そして第１ ３図にプロットする。

０　１６７、４　０．０ １５　２０４、９　ｇ、　６ ３０　１９２、４　２２．３ ４５　１８３、０　２９．８ ６０　２０４、２　３７．６ １２０　１ｇ２．６　５９．１ １８０　１７７、３　７３．１ ２４０　１４２、８　８５．４ ３００　１９２、４　町」 ＋　△冨２５．Ｏｍｇ　＋Δ＝９１．４　ｍｇ合成された合計のペプチド：２５ ．０＋９１．４＝１１６．４ｍｇ時間当たりの速度：１１６．４１５＝２３．３ ｍｇ／Ｉ　一時間。

第１２図および第１３図に示すＮ−ホルミル−（β−メチル）　−ａｒｐ−ｐｈ ｅ−ｔ　ｒｐ−ＯＭｅの透過Ｖ、、、、の初期速度の比較から明らかなように、 両者の速度が約４０ｍｇ／Ｉ・時間・ｆｔ”において類似するので、アミノアシ ラーゼはＩＬＭを横切るペプチドの移送の反応速度論において役割を演じない。

結局、実施例１０および１１の透過実験における速度決定段階はペプシンのタン パク質合成の速度であるが、アミノアシラーゼの役割は中間体のペプチドを反応 相から生成物相へ定量的に移送することによって、平衡の変位を単に保証する。

他方において、ＩＬＭを通す中間体のペプチドの透過性に影響を与える物理学的 因子は、相対的可溶性油／水界相（分配係数）に似て、連続的操作の間に反応器 中のペプチド中間体の定常状態の濃度を決定するで１１２ｍｌｃ７）Ｍｃｒ　Ｉ ｖａｉｎｅ緩衝液ｐＨ６、Ｏ中の１０８４ｍｇ（４ミリモル）の溶液に、２０ｍ １の同一緩衝液中の２０ｍｇの＋０゜５ｍｌの２−メルカプトエタノールの溶液 を添加した。１５ｍ１のメタノール中に溶解した３５６ｍｇ　（１ミリモル）の Ｎ−ＣＢＺ−ｐｈｅ−ｇｌ　ｙ−ｏＨを添加した後、生ずる溶液（１０％のＭｅ ＯＨ，緩衝液ｐ）１６．０）を室温において１時間インキュベーションした。こ の時点におけるＨＰＬＣ分析は、７８．３ｍｇ／ＩのＮ−ＣＢＺ−ｐｈｅ−ｇｌ の５０％Ｖ／ＶのＮ、　Ｎ−ジエチルドデカンアミドの鉤　５ｆｔ２のＩＬＭを 含有する、セルガード中空繊維から作られた中空繊維のセパレーターの管側を通 して循環させた。シェル相（１５０ｍｌ、１０％のＭｅＯＨ，ｐＨ６，０）は緩 衝化させず、そして溶解した８０ｍｇのアミノアシラーゼＡＭＡＮＯを含有した 。それを室温においてセパレーターを通して向流的に循環させ、モしてｐＨスタ ットの助けにより、滴定剤として０，５Ｎ　ＮａＯＨを使用してｐＨを一定に保 持した。反応相（管）中のＮ−ＣＢＺ−ｐｈｅ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−１）ｈｅ−Ｏ Ｍｅの合成および生成物相（シェル）中のＮ−ＣＢＺ−ｐｈｅ−ｇｌＹ　ｇｌｙ 　ｐｈｅ−ＯＨの蓄積を、４１０ＬＣポンプ、２１０ｎｍにセットしたＬＣ２３ ５ダイオード・アレー検出器およびデータの分析のためのＬＣＩ−１００ラボラ トリ−・コンピユーテイング・インチグレーターからなるパーキン−エルマー・ システム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｓｙｓｔｅｍ）を使用して、ＨＰＬＣに より追跡した。選択した分析カラムは、ミリボア・ウォーターズＲＣＭ−１００ ラジアル・コンプレッション・ユニット内に収容された、Ｎ　ＯＶ　Ａ　−Ｐ　 Ａ　Ｋ　Ｃ１ｇ　カートリッジ（８ｍｍｘｌＱｃｍ、４μ）であった。移動相は ｐＨ４，２に調節した、１１％のトリエチルアミンを含有する５０％のＣＨ３Ｃ Ｎおよび５０％の０．１％のＫ　Ｈ！　Ｐ　Ｏ４緩衝液のｖ／ｖ混合物であった 。Ｎ−ＣＢＺ−ｐｈｅ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｐｈｅ−ＯＭｅおよびＮ−ＣＢＺ−ｐ ｈｅ−ｇｌ　ｙ−ｇ　ｌ　ｙ−ｐ　ｈ　ｅ−ＯＨの保持時間は、それぞれ、７． ０５分および４．１６分であった。

Ｈ−ｇａｙ−ｐｈｅ−ＯＭｅのｐＨ６，０における透過損失のために補償する努 力において、この反応成分を５時間の実験の間に反応相に、０．５ミリモル／時 間の速度で連続的に添加した（合計６８０ｍｇ）。

この実験の結果を表ＸＩＩＩおよび第１４図に詳細に示す。

表Ｘ１ｌ１ ０　７ｇ、　３　０．０ ３０　６４、３　１９．０ ６０　６９．０　４１．１ １２０　１３３、０　７２．８ １８０　１７４、４　１０７．６ ２４０　１２０、２ ３００　２５２、２　１３２．９ ＋Δ＝１７３．９　ｍｇ　＋Δ＝１３２．９　ｍｇ合成したペプチド＋３０６． ８ｍｇ 時間当たりの速度：３０６．８１５＝６１．４ｍｇ／］・時間この値はバッチ式 パパイン触媒タンパク質合成（第１５図）において見いだされた値Ｖ、、い＝７ ５ｍｇ／ｌ・時間に相当し、再び生成物の蓄積速度が反応相中のタンパク質合成 速度を反映することを証明する。これは第１４図において非常に明らかであり、 ここでＶｖ、ｒ、ｗ＝Ｖａｒ＊＝４０ｍｇ／ｌ／時間。

シェル相の中に蓄積された生成物の同定は、次のようにしてＮ−ＣＢＺ−ｐｈｅ −ｇｌｙ−ｇａｙ−ｐｈｅ−ＯＨの真性試料に対するＨ　Ｐ　ＬＣの比較により 実施した： Ａ、　Ｎ−ＣＢＺ−ｐｈ　ｅ−ｇ　］　ｙ−ｇ　ｌ　ｙ−ｐｈ　ｅ−ＯＭｅ、　 ５０ｍ１中の５００ｍｇ　（１，８ミリモル）のＨ−ｇａｙ−ｐｈｅ−ＯＭｅ　 −ＨＣｌの溶液に０．　４ｍｌ　（１，９ミリモル）の（Ｅｔ）ｓＮを添加し、 この溶液を水浴中に浸漬し、次いで６４０ｍｇ　（１，８ミリモル）のＮ−ＣＢ Ｚ−ｐｈｅ−ｇｌｙ−ＯＨ，２８０ｍｇのジシクロへキシルカーポジイミドおよ び２２０ｍｇのＮ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２゜３−ジカルボキシイミ ドを添加した。

この混合物を室温において一夜反応させ、次いで沈澱したジヘキシル尿素を濾過 し、ジオキサンを蒸発により除去すると、無色の残留物が得られた。粗生成物を ２００ｍ１のＥｔＯＡｃ中に溶解し、２００ｍ１の各５％のクエン酸、５％のＮ ａＨＣＯ３で洗浄し、次いで無水Ｎａ２ｓＯ４で乾燥した。溶媒を除去すると、 ７２０ｍｇの透明なガラス状残留物が得られ、これをＥｔＯＡｃ／ヘキサンから 結晶化すると、６００ｍｇ（５８％）のＮ−ＣＢＺ−ｐｈｅ−ｇｌｙ−ｇａｙ− ｐｈｅ−ＯＭｅが得られた、白色結晶、融点８５−８６℃、［α］。２２°＝０ ．０°　（ｃ。

１．０、ＭｅＯＨ）、分析：　Ｃｓ＋ＨｓａＮａＯｔについての計算値二〇、６ ４．７９　：Ｈ，５，９６；Ｎ、９．７５゜実測値；Ｃ１６４，２３；Ｈ。

６．０５　；Ｎ、９．６６゜＋３Ｃ−ＮＭＲスペクトルはこの構造を確証した。

Ｂ、Ｎ−ＣＢＺ−ｐｈｅ−ｇ　ｌ　ｙ−ｇ　ｌ　ｙ−ｐｈｅ−ＯＨ，９０ｍ１の 脱イオン水ｐＨ６，０中の１００ｍｇのアミノアシラーゼＡＭＡＮＯの溶液に、 ２０ｍ１のメタノール中の４００ｍｇ　（０，７ミリモル）のＮ−ＣＢＺ−ｐｈ ｅ−ｇｌｙ　ｇｌｙ−ｐｈｅ−ＯＭｅの溶液を添加した。このミルク状混合物を 室温において急速に撹拌し、そしてほとんど直ちに透明になり始めた。この混合 物を１時間反応させ、ｐＨスタットおよび滴定剤として０．１Ｎ　ＮａＯＨを使 用して一定のｐＨ６，０を保持した。この時点において、ＨＰＬＣ分析はエステ ルの加水分解が完結したことを示した。反応混合物を濾過し、濾液からメタノー ルを真空除去し、ｐＨ２，０に酸性化し、モしてＥｔＯＡｃ　（３Ｘ２００ｍｌ ）で抽出した。有機抽出液を無水Ｎａ　２　Ｓ　Ｏ４で乾熾し、そして溶媒を蒸 発すると、３００ｍｇの透明な残留物が得られた。Ｅ　ｔ　ＯＡ　ｃ／ヘキサン から結晶化すると、２２０ｍｇ　（６０％）のＮ−ＣＢＺ−ｐｈ　ｅ−ｇ　］］ Ｙ−ｇｌｙ−ｐｈｅ−Ｏが得られた、白色結晶。融点１３４−１３６℃；　［ａ ｌＨ＝＋６．８’　（ｃ、１．７４；ＭｅＯＨ）。分析：　Ｃ３゜ＨｓｔＮ、Ｏ ，について計算値：Ｃ，６４，２７；Ｈ，５，７５；Ｎ、９．９９゜実測値；Ｃ １６３，８３：Ｈ，５，８０；Ｎ、９．８８゜ｌ”ｃ−ＮＭＲおよび’Ｈ−ＮＭ Ｒスペクトルはこの構造を確証した。

前述の条件下にのＨＰＬＣ分析は、単独でまたはパパイン触媒タンパク質合成の 生成物と混合した、４．１６分の保持時間のただ１つの化合物の存在を示した。

実施例１３ ペンタペプチド［］］ｅｕ］’−エンケファリの誘導体のパパイン触媒タンパク 質合成。０．５ｍｌの２−メルカプトエタノールを含有する、１６０ｍ１のＭｃ Ｉ］ｖａｉｎ緩衝液ｐＨ６，０中の２１ｍｇのパパインの溶液に、４Ｑｍｌのメ タノール中の３６３ｍｇ　（１ミリモル）のＮ−ホルミル−（０−Ｂｚｌ）−ｔ ｙｒ−ｇｌｙ−０）１および３６１ｍｇ（１ミリモル）のｇａｙ−ｐｈｅ−１ｅ ｕ−ＯＭｅ中の溶液を添加した。

室温において短時間（１５分）後、ＨＰＬＣ分析は既に形成した３、２ｍｇ／］ のＮ−ホルミル−（０−Ｂｚ　ｌ）−ｔｙｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｐｈｅ−１ｅｕ −ＯＭｅの存在を示した。次いで、この溶液（生成物相）を、５０％ｖ／ｖのＮ 、　Ｎ−ジエチルドデカンアミドの１ｆｔ２のＩＬＭを含有するセルガード繊維 を装備した、中空繊維のセパレーター（ベンド・リサーチ・インコーホレーテッ ド）のシェル側に接続した。生成物相は、セパレーターの管側に接続した、ｐＨ ６，０に調節した、２００ｍ１の２０％のＭｅＯＨ中の１５８ｍｇのアミノアシ ラーゼＡＭＡＮＯの溶液であった。２つの相を、２５℃において２台の螺動ポン プの助けにより、向流的に循環させた。生成物相（管側）は、ｐＨスタットの助 けにより、滴定剤としてＱ、５Ｎ　ＮａＯＨを使用して、実験を通じてｐＨ６， ０に保持した。

実験を通じて、反応相中の反応成分Ｈ−ｇｌｙ−ｐｈｅ−１ｅｕ−ＯＭｅの濃度 は、１２ｍ１のメタノール中に溶解した追加の１．２８４ｇ（４ミリモル）を１ ミリモル／時間の速度で添加して透過損失を補償することによって、はぼ一定に 保持した。中間体Ｎ−ホルミル−（０−Ｂｚｌ）−ｔｙｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙ　Ｉ ）ｈｅ−１ｅｕ−ＯＭｅおよびその加水分解生成物Ｎ−ホルミル−（０−Ｂｚ　 ｌ）−ｔｙｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｐｈｅ−］　ｅｕ−ＯＨの形成を、実施例１２ に記載する計器を使用して、ＨＰＬＣによりモニターした。使用した溶媒系は次 の通りであった： （Ｅｔ）ｓＮを含有する６０％のＣＨｓＣＮおよび４０％の０．１％のＫＨ２Ｐ Ｏ４緩衝液のＶ　／　Ｖ混合物。保持時間は５．０１分であった。

ｓＮを含有する３０％のＣＨ３ＣＮおよび７０％の０．１％のＫＨ，ＰＯ４緩衝 液。保持時間は７．０７分であった。

生成物相中の加水分解したペンタペプチドの蓄積を示すデータは、表ＸＩＶに示 し、そして第１６図にプロットする。

０　３、２　０．０ ３０　５、４　３０．７ ６０　０、７　３９．０ １２０　１、０　１０１．４ １８００・９　１３６．９ ２４０　１、０　１７４．４ ３００　１、２　２２７．０ 前の実施例において経験したように、ペンタペプチドの形成の平均の時間当たり の速度（第１６図、Ｖ、ｅ、、＝４５ｍｇ／リットル時間）は、ｐＨ５，０にお いてパパインを使用するＮ−ホルミル−（０−Ｂｚｌ）−ｔ　ｙ　ｒ−ｇ　Ｉ　 ｙ−ＯＨおよびＨ−ｇｌｙ−ｐｈｅ−１ｅｕ−ＯＭｅの平行のバッチ式インキュ ベーションにおいて測定された、Ｎ−ホルミル−（０−Ｂｚ　ｌ）−ｔｙｒ−ｇ ｌｙ−ｇｌｙ−ｐｈｅ−１ｅｕ−ＯＭｅの速度と一致し、モしてＶ、ｙ−３４， ２ｍｇ／］／時間であることが発見された。

生成物相（２００ｍｌ）をｐＨ２に調節し、そして各２００ｍ１のＥｔＯＡｃで ２回抽出した。有機抽出液を蒸発乾固し、そしてＮ−ホルモ／ｌ／−（０−Ｂｚ ｌ）−ｔｙｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｐｈｅ−１ｅｕ−ＯＨおよびＮ−ホルミル−（ ０−Ｂｚｌ）　−ｔｙｒ−ｇｌｙ−ＯＨを含有する（ＨＰＬＣ）残留物を１０ｍ １のＥｔＯＡｃの中に再溶解し、そして４００ｍ１の０．０１モルのリン酸塩緩 衝液ｐＨ５，４の静止相を既に充填した、イト・マルチレイヤー・コイル・セパ レーター・エキストラクター（Ｉｔｏ　Ｍｕｌｉｔｉｌａｙｅｒ　Ｃｏ１１　５ ｅｐａｒａｔｏｒ−Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ）の中に導入した。向流分布により分離 は０゜０１モルのリン酸塩緩衝液ｐＨ５，４で飽和した４００ｍ１のＥｔＯＡＣ を使用して実施した；２０の分画の各２０ｍ１のＥｔＯＡＣ相を集めた。ＨＰＬ Ｃ分析は、分画３〜１０中のペンタペプチドおよび分画１６〜１８中のジペプチ ドの存在を示した。プールした３〜１０の分画中のＮ−ホルミル−（０−Ｂｚ　 ］）−［１ｅｕ］　’−ｘンケ７．リンノ存在は、５０℃においてＩＮ　ＨＣＩ を使用して脱プロトンしてホルミル基を除去し、次いでＰｄ／木炭の存在下に水 素化してベンジル基を除去することによって確証した。生成物は、合成の［Ｉｅ ｕ］’−エンケファリンの酢酸塩の真性試料［シグマ・ケミカル・カタログ（Ｓ 　ｉ　ｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃａｔａｌｏｇ）、１９８８、カタログ番号Ｌ −９１３３、ｐ、２８０１との）（ＰＬＯの比較により、Ｈ−ｔｙｒ−ｇｌｙ− ｇｌｙ−ｐｈｅ−１ｅｕ−ＯＨと同一であることが発見された。

実施例１４ 疎水性液体を支持するためにセルロースの中空繊維のコンタクタ−の使用−タン パク質合成への応用。実施例５に記載するサーモリシン触媒タンパク質合成を、 膜コンタクタ−の実施態様において等しい成功をもって実施し、この実施態様は 疎水性液体を充填した内腔および水の中に埋め込まれた壁を有する、詰められた セルロースの中空繊維からなっていた。直列の２つの膜のモジュールの間の管相 の強制された向流的循環は、水性反応相と水性相との間の非帯電の有機分子を移 送することができる、高い表面のコンタクタ−を提供する。この配置は、本発明 によるタンパク質合成の実施のために有用であり、第１７図にスケッチされてい る。

水性反応相６３の第１ポンプ６４によるサーモリシン反応器６１から第１膜モジ ユール６７への循環により、透過性中間体Ｎ−ホルミル−（β−メチル）−ａｓ ｐ−ｐｈｅ−ＯＭｅを疎水性相（油）の溜６５の中に降下する油ライン８１を経 て移送させることができる。この濃縮された油は、疎水性相の溜から移送ライン ８２を経て第２ポンプ６６によりポンプライン８３を経て、第２膜モジユール６ ８の中に循環され、ここで中間体のジペプチドエステルは拡散して生成物の溜６ ９中の水性生成物相８０の中に入る。中間体のジペプチドのエステルは膜セパレ ーター、例えば、逆浸透膜ＲＯ６２に第３ポンプ７０により循環される。中間体 のジペプチドエステルは、保持液（ｒｅｎｔｅｎｔａｔｅ）７７中の逆浸透膜Ｒ Ｏ６２により不可逆的に捕捉される。ＰＯ６２からの濾液７８は生成物の溜６９ へ戻される。ＰＯ６２からの保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）７７は生成物の溜６ ９へ再循環される。ＲＯユニットを去る純粋な水７１は第２膜モジユール６８へ 戻されるが、第２膜モジユール６８を去る使用済み油はライン７２を経て第１膜 モジユール６７の中に再循環され、ここでそれは反応容器６１中のタンパク質合 成により生成された新鮮な中間体を再負荷される。油のループ８４（水不混和性 疎水性相）は疎水性相の溜６５およびライン８２、ポンプ６６、油ライン８３、 ライン７２および第１コンタクタ−６７からなるライン８１、第２コンタクタ− ６８、ＰＯ６２、水性反応相６３、水性生成物相８０および油ループ８４からな り、こうしてサイクルを閉じる。このプロセスはブリードドリーム７６を利用す る第２膜フンタクター７５（図示しないが、７４と同一である）を利用すること によって濃縮することができる。一般に、複数の膜コンタクタ−を反復して利用 して、生成物の回収を増大することができる。

第２７図は、膜フンタフタ−中の中空繊維の断面の部分的概略的図面（拡大）で ある。部分的図面は、第１膜モジユールにおける親水性中空繊維１２１および第 ２膜モジユール中の親水性中空繊維１４１を示す。

第１膜モジユールにおいて、親水性中空繊維１２１は、内腔（孔）１２２および 親水性ポリマー材料１２５を有することが示されている。内腔１２２は、管相（ 例えば、疎水性相）からなる水不混和性有機液体が充填されている。親水性中空 繊維１２１の間の空間１２３はシェル相（例えば、水性反応相）からなる。同様 に、第２膜モジユールにおいて、親水性中空繊維１４１は、内腔（孔）１４２お よび親水性ポリマー材料１４５を有することが示されている。内腔１４２は、管 相（例えば、疎水性相）からなる水不混和性有機液体が充填されている。親水性 中空繊維１４１の間の空間１４３はシェル相（例えば、水性反応相）からなる。

第２８図は、第１膜モジユール１３１、第２膜モジユール１５１および接続手段 （管）１３０からなる膜コンタクタ−１６０の部分的概略的図面（拡大）である 。第１膜モジユール１３１において、親水性中空繊維１２１は樹脂材料（注封材 料）で注封されている。水性反応相は空間１２３を通して、第１壁１２８上の開 口１２９を通して循環し、そして第３！１１３４上の開口１３５を通して戻る。

水性反応相は水不混和性液体と混合しない。水不混和性液体は内腔１２１を通し て、第２壁１２６上の開口１２７を通して接続管１３０を通して第２膜モジユー ル１５１へ循環し、そして第４壁１３２上の開口１３３を通して戻る。同様に、 第２膜１５１において、親水性中空繊維１４１は樹脂材料（注封材料）で注封さ れている。水性反応相は空間１４３を通して、第１壁１４８上の開口１４９を通 して循環し、そして第３壁１５３上の開口１５４を通して戻る。水性反応相は水 不混和性液体と混合しない。水不混和性液体は内腔１４２を通して第４壁１４６ 上の開口１４７を通して接続管１３０を通して循環し、そして第２壁１４０上の 開口１５２を通して第１膜モジユール１３１へ戻る。膜フンタフタ−１６０の第 １および第２の膜モジュール１３１および１５１の各々は、それぞれ、多数の親 水性中空繊維１２１および１４１からなるが、わずかに３つが各々のこのような 膜モジュールにおいて示されている。

膜コンタクタ−を記載した逆浸透と組み合わせて使用すると、サーモリシンリア クターにおけるペプチド合成の反応速度論に影響を与えないで、タンパク質合成 の平衡の所望の変位が引き起こされるであろう。このアプローチは、タンパク質 合成を完結に推進する目的で、第２酵素を使用するかわりの変法として考えられ る。この膜の配置を使用して、実験を実施し、ここでサーモリシンはＮ−ホルミ ル−（β−メチル）−Ｈ−ｐｈｅ−ＯＭｅ　（Ａ）およびａｓｐ−ＯＨ（Ｂ）の カップリングを触媒し、そして生ずるペプチドＮ−ホルミル−（β−メチル）− ａｓｐ−ｐｈｅ−ＯＭｅ　（Ｃ）をＲＯ保持液の中に連続的に捕捉した（第１７ 図）。この実験において使用した条件は次の通りであった：Ａ１サーモリシンリ アクター。３００ｍ１、ｐＨ５，０，５０℃、［Ｂ］＝１０ミリモル（ｍＭ）、 ［Ａ］　＝６２７ｍＭ、［サーモリシン］　＝２１ｇ／Ｌ　［ＣａＣ１ｚ］　＝ １０ｍＭ０これらの条件下のＣの合成の初期速度は、Ｖ、、、＝１３ｇ／１時間 （３７，５ｍＭ／時間）であった。

Ｂ１膜リアクター。０．８ｆｔ”、２−ウンデカンを負荷した。

Ｃ，２ｆｔ”のＴＷ−３０らせんに巻いたモジュール。フィルムチク・コーボレ ーシｇ：ｚ（ＦｉｌｍＴｅｃ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ミネソタ州ミネトン カ、（米国特許第４．２７７．３４４号に記載されているようなポリアミド型の 膜）。

Ｄ、生成物の溜。７００ｍ１．ｐＨ５，０，５０℃。

この実験の第１段階の操作から得られる結果を第１８図に示し、これはサーモリ シンリアクター中のＣの濃度を時間の関数としてプロットする。データは膜コン タクタ−によりリアクターからのＣの連続的取り出し、およびウンデカンの流れ の停止およびもとの反応成分濃度を回復するために十分なＡおよびＢの同時の添 加のときの、化学的平衡の回復を明瞭に示す。この系は１５時間実施し、このと き生成物の溜中のＡおよびＣの濃度は、それぞれ、４０ｍＭおよび１５ｍＭであ うた。（Ａ　：　Ｃのモル比＝３　：　１）。この溶液をＲＯおよび蒸発の組み 合わせを使用して約１０倍に濃縮した。次いで、溶液ｐＨ４，０中に５．０ｇの Ａおよび３．５ｇのＣを含有する濃縮物（１００ｍｌ）を膜コンタクター系の供 給物の溜の中に入れ、そしてほぼ５０％のＣが供給溶液から除去されてしまうま で、この系は生成物の溜の中に入れられた１００ｍ１の水ｐＨ４，０に対して２ ５℃において操作した。約０．６ｇのＡおよび１゜８ｇのＣ（Ａ：Ｃのモル比＝ ２：３）を含有する、この第２段階からの生成物を２５ｍ１のに蒸発させ、そし て冷却すると、１．　６４ｇ　（８１％）の純粋なＣが得られた、白色結晶、融 点１０５−１０７℃。［α］ｏ”’　＝−３２，３’　（ｃ、０．６５　；Ｍｅ ＯＨ）ｅ　Ｎ−１ルミルー　（ｌｔ−メチル）　−ａ　ｓ　ｐ−ｐｈ　ｅ−ＯＭ ｅの真性試料は融点１０８−１０９℃を有した；　［ａ］　ｏ”ｅ＝−３３，９ ″　（ｃ、０．５９　；ＭｅＯＨ）。

旋光度に基づいて、回収されたジペプチドＣの純度は９５％であった。

実施例１５ この実施例は、Ｎ、　Ｎ−ジエチルドデカンアミドを含むＩＬＭを横切る、ジペ プチドＮ−ホルミル−（β−メチル）−ａｓｐ−ｐｈｅ−０−くのサーモリシン 触媒タンパク質合成、および酸性ジペプチドＮ−ホルミル−（β−メチル）−ａ ｓｐ−ｐｈｅ−ＯＨへのその同期の加水分解を記載する。記号「−＜」をここに おいて利用してイソプロピルを示す。

２００ｍ１の水ＤＨ５，０中の１３．０９ｇ　（５４ミリモル）のＬ−ｐｈｅ− ０−＜−ＨＣｌおよび６．６４ｇ　（３８ミリモル）のＮ−ホルミル−（β−メ チル）−ａｓｐ−ＯＨの溶液に、３８５ｍｇのサーモリシン（Ｔｈ　ｅ　ｒｍａ 　ｓ　ｅ、ダイブ、４０．０ＯＯＰＵ／ｇ）および１５０ｍｇのＣａＣｌ２を添 加した。この溶液を２５℃において１時間インキュベーションし、このときそれ はＨＰＬＣにより１４８ｍｇ／］のジペプチドＮ−ホルミル−（β−メチル）− ａｓｐ−ｐｈｅ−０−＜を含有することがわかった。次いで、この溶液を実験の 中空繊維のセパレーター（ベンド・リサーチ・インコーホレーテッド）のシェル 側に接続し、このセパレーターはＮ、Ｎ−ジエチルドデカンアミドのＩＬＭのｌ ｆｔ”（９００ａｍ２）の表面を提供した。セパレーターの管側は、２００ｍ１ の水ｐＨ６，０中に溶解した０、１６２ｇの酵素アミノアンラーゼ（ＡＭＡＮＯ 製薬会社、名古屋）の溶液を含有する生成物の容器に接続した。２つの相を、２ ５℃において１００ｍ１／分（管側）および２５０ｍ１／分（シェル相）の速度 で、２台の螺動ポンプの助けにより、向流的に循環させた。生成物（管）相は、 ｐＨスタットおよび滴定剤としてＱ、５Ｎ　ＮａＯＨを使用して、ｐＨ６，０の 一定に保持した。

中間体および生成物のペプチドの形成は、４１０ＬＣポンプ、２１０ｎｍにセッ トしたＬＣ２３５ダイオード・アレー検出器およびデータの分析のためのＬＣＩ −１００ラボラトリ−・コンピユーテイング・インチグレーターからなるパーキ ン−エルマー・システム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｓｙｓｔｅｍ）を使用し て、ＨＰＬＣによりモニターした。

選択した分析カラムは、ミリポア・ウォーターズＲＣＭ−１００ラジアル・コン プレッション・ユニット内に収容された、ＮＯＶＡ−ＰＡＫｃｏｇ　カートリッ ジ（８ｍｍｘｌＯｃｍ、４μ）であった。Ｎ−ホルミル−（β−メチル）−ａｓ ｐ−ｐｈｅ−０−＜の移動相は、ｐＨ４，２に調節した、０．１％のトリエチル アミンを含有する５０％のＣＨ３ＣＮおよび５０％の０．１％のＫＨ２ＰＯ４緩 衝液のｖ／ｖ混合物であった。

流速は１ｍｌ／分であつた。保持時間は５．６５分であうた。Ｎ−ホルミル−（ β−メチル）−ａｓｐ−ｐｈｅ−ＯＨの移動相は、ｐＨ４，２に調節した、０． １％のトリエチルアミンを含有する３０％のＣＨ３ＣＮおよび７０％の０．　１ ％のＫ　Ｈ２Ｐ　Ｏ４緩衝液のＶ／Ｖ混合物であった。

流速は１ｍｌ／分であった。保持時間は３．５２分であった。

この実験の結果を表Ｘｖおよび第１９図に示す。

表Ｘｖ ０　１４８．９　０ ３０　４１、１　７５．８ ６０　２２８、９　１１５．７ １２０　１７２、８　１６３．３ １８０　２４６、２　１９９．１ ２４０　１７２、８　２６２．１ ３００　殴コ　沖Ｉ ＋△＝４３．８　ｍｇ　＋△−３１４，８ｍｇ合成されたジペプチド：３５８． ６ｍｇ／］。

時間当たりの速度＝３５８．６＝７２ｍｇ／ｌ／時間この全体の時間当たりの速 度は、第１時間において酵素的合成した１５０ｍｇ／リットル時間の初期の透過 速度（第１９図）と、およびｐＨ。

温度および試薬濃度の同一条件下に実施した、バッチ式インキュベーションにつ いて独立に測定した２２０ｍｇ／ｌ／時間の初期合成速度（第２０図）と一致す る。

２００ｍ１の生成物相（６３ｍｇ）の中に存在するジペプチド酸Ｎ−ホルミルー （β−メチル）−ａｓｐ−ｐｈｅ−ＯＨは、溶液を真空中で５０ｍ１に濃縮し、 アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）ＰＭ−１０膜（分子量のカットオフ＝１０にダルトン ）を使用する限外ろ過による酵素の除去、ｐＨ２，０への限外ろ過による酸性化 、およびＥｔＯＡｃ　（３Ｘ５０ｍｌ）を使用する抽出により単離した。有機抽 出液を蒸発乾固し、残留物を２ｍｌの水ｐＨ６，０中に溶解し、そしてジペプチ ドをｐＨ２，０への酸性化により結晶化した。収量：　１１ｍｇ　（１７％）、 次の手順に従い調製したＮ−ホルミル−（β−メチル）−ａｓｐ−ｐｈｅ−ＯＨ の真性試料とＨＰＬＣ比較により同一である。

Ａ、Ｎ−ホルミル−（β−メチル）−ａｓｐ−ｐｈｅ−ＯＭｅの合成。

３００ｍ１のジオキサン中に溶解した２１．０ｇ　（９７，３ミリモル）のＬ− ｐｈｅ−ＯＭｅ−ＨＣＩに、１４．９ｍｌ　（１０７ミリモル）の（Ｅｔ）ｓＮ を添加した。この混合物に、１６．０ｇ　（９８ミリモル）のＮ−ホルミル−（ β−メチル）−ａｓｐ−ＯＨを添加し、この溶液を０℃に冷却し、そして２０． ０ｇ　（９７ミリモル）のジシクロへキシルカーポジイミドを添加し、次いで１ ６．０ｇのＮ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドを 添加した。室温において一夜撹拌した後、沈澱したジヘキシル尿素を濾過し、そ して濾液を蒸発により濃縮すると、シロップが得られた。それを５００ｍ１のＥ ｔＯＡｃ中に溶解し、そして順次に５％のクエン酸、５％のＮ　ａ　ＨＣＯｓ、 水で洗浄し、そして無水Ｎ　ａ　２Ｓ　０４で乾燥した。溶媒を除去すると、白 色固体が得られ、これをＥ　ｔ　ＯＡ　ｃ／ヘキサンから再結晶化すると、１７ ．０ｇ　（５３％）のＮ−ホルミル−（β−メチル）　−ａ　ｓ　ｐ−ｐｈ　ｅ −ＯＭｅが得られた、融点１０８−１０９℃。

［ａｌ　ｏ”　＝＋３６．９°　（ｃ＝０．６、ＭｅＯＨ）。

’ＨＮＭＲ（ＣＤｓＯＤ）：　７．６δ（ｓ）ホルミル；６．８δ（ｓ）フェニ ル；　４．　Ｏ−４，４δ（Ｍ）２ＣＨ；　３．３　（ｓ）２ＣＨｓ　（６プロ トン、積み重ね）　；２．３−２．８δ（Ｍ）２ＣＨｚ　（４プロトン）。

ｔ）：４７．５９．５３．５４ｐｐｍ（−ＣＨ，ｄ）；５２．０９．５２．２８ ｐｐｍ　（ＣＨｓ＋、　Ｑ）　：１２７．０訳１２８．５１．１２９．１９ｐｐ ｍ１７２、０９ｐｐｍ　（−Ｃ−０−（ＮＨ）　、ｓ）。

Ｉ 分析：ＣＨＨ２゜Ｏ，Ｎ２についての計算値：Ｃ，５７，１７：Ｈ，５，９５； Ｎ、８．３３゜実測値：Ｃ，５７，２９：Ｈ，６，０２；Ｎ、８．３２゜Ｂ、Ｎ −ホルミル−（β−メチル）−ａｓ　−ｐｈｅ−ＯＨの合成。

５ＱｍｌのＭｅＯＨ中の２．　０ｇ　（５，９ミリモル）のＮ−ホルミル−（β −メチル）−ａｓｐ−ｐｈｅ−ＯＭｅの溶液を、磁気的撹拌機を装備したビーカ ーの中に入れた、４５０ｍ１の０．０５％のＫ　ＨｚＰＯ，緩ｆｆｉ液ｐＨ７， ５中の０．２ｇ（Ｄ７ミ）７シラ−ｔ’ＡＭＡＮ。

の溶液を添加した。この溶液を室温において一夜撹拌し、モしてｐＨスタットの 助けにより滴定剤としてＩＮ　ＮａＯＨを使用して、ｐＨを７．５に一定に保持 した。未反応の出発物質の濾過後、この溶液をＥｔＯＡｃ　（２Ｘ１００ｍｌ） で洗浄し、次いでｐＨ２，０に調節し、そして加水分解したジペプチドはＥｔＯ Ａｃ　（３ｘ２００ｍｌ）で抽出した。−緒にした抽出液を無水Ｎ　ａ　２　Ｓ 　Ｏ４で乾燥し、そして蒸発乾固した。Ｎ−ホルミル−（β−メチル）−ａｓｐ −ｐｈｅ−ＯＨの収量は１．３ｇ　（６８％）であった、融点１８５−１８６℃ ［α］Ｄ２ｓ″＝−１４，３°　（ｃ＝１．０　＋ＭｅＯＨ）。

１３ｃｍＮＭＲ（ＣＤｓＯＤ）：　３７．３７．３８．７６ｐｐｍ　（−ＣＨ２ ＋。

ｔ）　：５０．２１、５５．６８ｐｐ璽　（−ＣＨ−、ｄ）　：５２．２１、　 ｐｐ曹（ＣＨｓ−、Ｑ）　：１２８．３１．１２９．３１．１２９．９０，１３ ０゜９０ｐｐｍ（フェニル、ｄ）；　１３８．６３ｐｐｍ　（フェニル、Ｓ）； １６３゜；Ｎ、８．６９゜実測値：Ｃ，５５−２２：Ｈ，５，７１＋Ｎ、８．５ １゜実施例１に の実施例は、同期のタンパク質合成の間の中間体のペプチドの透過Ｖ　ｐｅａｓ への加水分解酵素により引き起こされた速度の効果を示す。測定された速度の増 加は、疎水性膜に向かう高い分配係数を示す、高度ζ：疎水性ペプチドについて 重要である。アミノアシラーゼにより触媒される化学的転化、すなわち、Ｃ−末 端イソプロビルエステルの遊離カルボキシレートへの転化、は、油／水界面にお いて起こり、そして境界を横切るジペプチドの移送を積極的に促進する。アミノ アシラーゼを使用する油表面の向流スウイーピン（ｓｗｅｅｐｉｎｇ）により引 き起こされる中間体ペプチドの透過の増加は、非透過性生成物への化学的転化か ら生ずる平衡の変位への追加の効果である。

２００ｍ１の水ｐＨ５，０中の１３．７ｇ（５°６ミリモル）のＬ−ｐ）１ｅ− Ｑ−＜−ＨＣｌおよび６．６ｇ　（３８ミリモル）のＮ−ホルミル−（Ｔｈ　ｅ 　ｒｍｏ　ａ　ｓ　ｅ）ダイワ（Ｄａ　ｉｗａ）（４０，ＯＯＯＰＵ／ｇ）およ び１５０ｍｇのＣａＣｌｔを添加した。この溶液を２５℃におし）で１時間イン キュベーションし、この時点においてそれはＨＰＬＣｉ二より３４７．０ｍｇ／ ］のジペプチドＮ−ホルミル−（β−メチル）　−ａｓｐ−ｐｈｅ−０−＜を含 有することがわかった。この溶液を２５℃において、Ｎ、　Ｎ−ジエチルドデカ ンアミドの０．５ｆｔ”のＩＬＭを含有する、中空繊維のセパレーターのシェル 側を通して、管側を通る向流的に循環する２００ｍ１の水ｐＨ６，０に対して結 晶化させた。ＩＬＭを横切る透過速度を、実施例１５に記載されている詳細に従 い、ジペプチド−〇−くおよびＬ−ｐｈ６−ｏ−＜のためにＨＰＬＣにより測定 した。

２時間後、結晶化を中断し、生成物（管）相を取り出し、そして１６０ｍｇのア ミノアシラーゼＡＭＡＮＯを含有する２００ｍ１の水ｐＨ６゜０の溶液で置換し た。両者の水性相の向流的循環を再開し、そしてジペプチドＮ−ホルミル−（β −メチル）−ａｓｐ−ｐｈｅ−ＯＨの透過速度ｖ、＠Ｉｌｌを、再びＬ−ｐｈｅ −ＯＨおよびＬ−ｐｈｅ−０−＜と−緒にＨＰＬＣにより測定した。結果を表Ｘ ＶＩおよび第２１図に示す。

第２１図が示すように、アミノアシラーゼの存在下のペプチドの透過（Ｖｅ−１ −＝４４０ｍｇ／ｌ／時間）は水中における（Ｖｅ−＋＋−＝　１９０ｍｇ／ｌ ／時間）より２．３倍速い。可溶性酵素とのＩＬＭの直接接触により引き起こさ れるこの速度の効果は、同一酵素を固定化された形態で使用場合、失われないで あろう。

データが、また、示すように、部ＩＩに示す「酵素のスウィービング」条件下に おいてのみ、タンパク賀合成プロセスは同期となる、すなわち、ジペプチドのＶ □、−（４４０ｍｇ／リットル時間）は、ｐＨ，温度および反応成分の濃度の同 一条件下にパッチ式インキュベーション期間の間に測定したＶ１７．値（３４０ ｍｇ／リットル時間）に到達する。

また、表ＸＶＩに示すように、アミノアシラーゼにより発揮された速度の効果は ジペプチドのイソプロピルエステルの加水分解から生ずる。

Ｌ−ｐｈｅ　−０−＜、アミノアシラーゼのための劣った基質、の透過速度は、 主成物相中の酵素の存在に対して不感受性である。

実施例１７ この実施例１７は、高温で本発明の方法を実施する効果および２０℃〜６５℃の 範囲のより高い温度における低級アルキルエステル反応成分［Ｂ’　］の有効性 を示し、ここでアルキル基を選択して、その反応成分、例えば、３〜６個の炭素 原子を有する第２アルコールから誘導体されたエステルの安定性を増大する。

実施例１５に記載するジペプチドＮ−ホルミル−（β−メチル）　−ａｓｐ−ｐ ｈｅ　−０−＜　（Ｃ’　）のサーモリシン触媒タンパク質合成は、実施例１５ において使用したＩＬＭモジュールの代わりに、実施例１４に記載するセルロー ス中空繊維のコンタクタ−を利用して、５０℃において首尾よ（実施された。

この実験において使用した構成は第１７図に概略的に示されており、モしてＮ− ホルミル−（β−メチル）　−ａｓｐ　−ＯＨ（Ｂ’　）　、Ｌ−ｐｈｅ−０− ＜　（Ａ’　）および生ずるジペプチドＣ゛の間の縮合平衡は次の通りであった ： Ａ１サーモリシンリアクター。５００ｍ１、ｐＨ５，０，５０℃、４２ｇ／Ｉの サーモリシン、１０ｍＭのＣａＣｈ、２３０ｍＭのＢ′、４５ＱｍＭのＡｏを含 有する。

Ｂ１膜コンタクタ−０各膜コンタクタ−のモジュールにおける領　４ｆｔ２の膜 の面積、循環する有機油として７５ｍ１のＮ、　Ｎ−ジエチルドデカンアミドを 使用する。

Ｃ５ＲＯ膜。実施例１４に前に記載した２ｆｔ”のＴＷ−３０螺旋に巻いたモジ ュール。

Ｄ１生成物の溜。ＲＯ膜、膜コンタクタ−および溜を通して循環する、７５０ｍ １の水、ｐＨ５，０，５０℃。

時間の関数として溜中の生成物Ｃ′の蓄積を第２３図に示す。データが示すよう に、サーモリシン推進される平衡中のＣｏの濃度を１５ｍＭにＡｏの添加のとき 維持して［Ａ′］を一定に維持したが、生成物の溜中の［Ｃ°］は絶えず増加し 、このときジペプチドをＲＯ膜により捕捉し、こうして化学的平衡 Ａ’　＋Ｂ’　＊Ｃ’ を変位するために必要な一定の推進力を提供する。

１５時間の操作後、リアクターを停止し、そして生成物の溶液（２０ｍＭのＣｏ 、１６０ｍＭのＡ’）を集め、ｐＨ２に調節し、蒸発により１０×に濃縮し、そ して冷却して、３．９ｇ　（７０％の収率）のＮ−ホルミル−（β−メチル）− ａｓｐ−ｐｈｅ−０−＜が得られた、白色結晶、融点６８−６９℃［α］　Ｄ” ’＝−２２．７°（Ｃ，３，６：ＭｅＯＨ）。

分立：　Ｃ＋ａＨｚａＯｓＮｔ：についての計算値：Ｃ，５９，３７；Ｈ，６， ５９：Ｎ、７．６９゜実測値：Ｃ，５９，３１；Ｈ，６，６６；Ｎ、７．６５゜ Ｍｌｔ：　（ＨＰＬＣ）：　Ｃ＋ｓ−逆相カラムのクロマトグラフィーにより精 製後、純粋なジペプチドは融点１０１−１０２℃、［αコＤ２１１°＝−３２． ６°　（ｃ、０．９；ＭｅＯＨ）を有し、そしてジオキサン中のＮ−ホルミル− （β−メチル）−ａｓｐ−ＯＨおよびＬ−ｐｈｅ−０−＜のＤＣＣカップリング により調製した、Ｎ−ホルミル−（β−メチル）−ａｓｐ−ｐｈｅ−０−＜、融 点１００−１０１℃、［αコル２８０　＝−３１，３６（ｃ、３．０　；ＭｅＯ Ｈ）の真性試料とすべての面（ＩＲ，’ＩＣ−ＮＭＲ）において同一であった。

Ｌ−ｐｈｅ−０−＜の化学的安定性は、水ｐＨ５，０中の５０℃において測定し て、Ｌ−ｐｈｅ−ＯＭｅより７倍高く、これは本発明の実施のための重要な利点 である。より低い温度において処理するより、約５０℃において操作することか ら誘導体される経済的利益は、次の通りである；ａ）温度を増加するとき生ずる 、ペプチドの形成に向かう化学的平衡のシフト；およびｂ）温度を増加するとき ともなう、疎水性膜を横切るペプチドの透過性の増加。

高温における本発明の方法の有効な方法は、少なくとも一部分低級アルキルエス テル反応成分［Ｂ゛］の安定性、および望ましくない副反応、例えば、エステル の対応する酸への加水分解、を最小するか、あるいは回避することに依存する。

Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルを使用するとき、この実施例に記載する方 法を効率よ〈実施することは不可能である。なぜなら、５０℃における記載した 条件下に、そのエステルは非常には安定でない、すなわち、それはゆっ（り加水 分解してＬ−フェニルアラニンなるからである。安定なイソプロピルエステルは ５０℃において急速に反応して、有効な収量の所望のペプチド生成物を生成し、 そして望ましくない副反応を回避するか、あるいは最小にする。

分枝鎖の脂肪族アルコール、例えば、２−ブタノールおよび３−メチル−２−ブ タノールとの他のし一フェニルアラニンエステルは、また、高い熱安定性を有す ること、およびｐＨ５，０および５０℃における水中のエステル加水分解による Ｌ−ｐｈｅ−ＯＨの形成を最小することが期待される。

実施例１８ Ｎ−ＣＢＺ−ａ　ｓ　ｐ−ｐ　ｈ　ｅ−ＯＭｅのペプシン触媒タンパク質合成４ ００ｍ１の水ｐＨ４，０中の８５．４６ｇ　（３２０ミリモル）のＮ−ＣＢＺ− Ｌ−ａ　Ｓ　Ｄ−ＯＨおよび１９．４５ｇ　（９０ミリモル）のＬ−ｐｈｅ−Ｏ Ｍｅ−ＨＣＩの溶液に、１００ｍ１の水ｐＨ４，０中に溶解した９、６３ｇの結 晶質ペプシン（シグマ）を添加した。生ずる溶液（５００ｍｌ）を３８℃におい て４８時間インキュベーションし、その終わりにおいて、それは３２０８ｍｇ／ ］　（７，５ミリモル）のＮ−ＣＢＺ−ａｓｐ−ｐｈｅ−ＯＭｅを含有すること 力用ＰＬＣにより示された。ＨＰＬＣ分析は、４１０ＬＣポンプ、２１０ｎｍに セットしたＬＣ２３５ダイオード・アレー検出器およびデータの分析のためのＬ ＣＩ−１００ラボラトリ−・コンピユーテイング・インチグレーターからなるパ ーキン−エルマー・システム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｓｙｓｔｅｍ）で実 施した。選択した分析カラムは、ミリポア・ウォーターズＲＣＭ−１００ラジア ル・コンプレッション・ユニット内に収容された、Ｎ０ＶＡ−ＰＡＫ　ｃｐｓ　 カートリッジ（８ｍｍＸ１０ｃｃ、４μの孔）であった。移動相は、ｐＨ４，２ に調節した、０．１％Ｖ／Ｖのトリエチルアミンを含有する４０％のＣＨ３０Ｎ および６０％の０．　１％のＫＨ２ＰＯ，緩衝液のｖ　／　ｙ混合物であった。

流速は１ｍ１／分であった。

これらの条件下に、Ｎ−ＣＢＺ−ａ　ｓ　ｐ−ｐ　ｈ　ｅ−ＯＭｅは７．７８分 の保持時間を有した。

上の反応混合物（５００ｍｌ）を３８℃に保持したジャケット付き容器に入れ、 そしてドデカン中の５０％Ｖ／Ｖのイソデカノール［ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ ）コの１　ｆ　ｔ”　（９００ｃｒｎりのＩＬＭを含有する、セルガード繊維か ら作られた中空繊維のセパレーターのシェル側を通して循環させた。生成物相（ ５００ｍｌ）は蒸留水ｐＨ７，０であり、これはこのモジュールの管側を通して 向流的に循環させ、その間ｐＨスタットユニットの助けにより滴定剤として０． ５Ｎ　ＮａＯＨを使用してｐＨを７．０に一定に保持した。

ｔｃｐ（シェル）中のＮ−ＣＢＺ−ａ　ｓ　ｐ−ｐｈ　ｅ−ＯＭｅの合成および 生成物相中の同一のジペプチドの蓄Ｗ（イオン化β−カルボキシレートとしてｐ Ｈ７，０において捕捉された）は、前述したように、ＨＰＬＣにより測定された 。５時間実験した後、２相の循環を中断し、生成物の溶液を取り出し、そして５ ００ｍ１の新鮮な水ｐＨ７，０溶液と置換した。３８℃において２４時間第２の インキュベージコンを実施した後、反応混合物は４１７０ｍｇ／］のＮ−ＣＢＺ −ａｓｐ−ｐｈｅ−ＯＭｅを含有した（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）。向流的循環を再開し、 そしてペプチドの透過をさらに５時間モニターした。

この実験の結果を表ＸＩＩおよび第２４図に示す。表ＸＶＩＩから明らかなよう に、活性なタンパク質合成は酵素の反応相中で起こったが、新しく合成されたペ プチドは膜を横切って移送されていた。生成物相の中に蓄積した合計のＮ−ＣＢ Ｚ−ａｓｐ−ｐｈｅ−ＯＭｅの計算（１０時間で５４２ｍｇ）は、５４ｍｇ／リ ットル時間の平均の透過速度を示し、これは部■およびＩＩについて第２４図に 示す個々のＶｌ、ｅｒ＠速度と一致する。

単離されたペプチド生成物、２２０ｍｇ、融点１２０−１２５℃、［α］　ｏ” ０＝−１２，０″　（ｃ、１．０、ＭｅＯＨ）は、真性試料とノクロマトグラフ ィ−（ＨＰＬＣＳＴＬＣ）およびＩＨ−ＮＭＲの比較によりＮ−ＣＢＺ−ａＳｐ −１）ｈｅ−ＯＭｅと同定され、この真性試料はアスパルテイムをベンジルオキ シカルボニルクロライドでショツテン−バラ７：／　（Ｓｃｈｏ　ｔ　ｔｅｎ− Ｂａｕｍａｎｎ）アシル化（水、ｐＨ７゜５）して、結晶を生成することによっ て調製した、融点１２２−１２４℃（ＥｔＯＡＣ／ヘキサンから）、［α］ｂ２ ２°＝−１３，０°　（Ｃ１領　８、ＭｅＯＨ）、文献［Ｄ、　Ｄ、ペトコフ（ Ｐｅｔｋｏｖ）および１、Ｂ、ストイネバ（Ｓｔｏｊｎｅｖａ）、テトラヘドロ ン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、）、２５．３７５４　（１ ９８４）］は、融点１２０−１２４℃、［ａ］　ｏ”’　＝　１４．４’　Ｃｃ ｓ　１゜Ｑ；ＭｅＯＨ）を報告した。

表ＸＶ１１ 部！ ０　３２０８、０　− １　２７２６、８　４２．５ ２　２８ｇ？、　２　９９．５ ５　２８ｇ７．２　２４３．８ 部■ 本発明の特定の実施態様を示しかつ詳細に記載して本発明の原理の応用を例示し たが、理解されるように、本発明はこのような原理から逸脱しないで他の方法で 具体化することができる。

Ｄ、Ｌ−ｐｈｅ　−０−＜の酵素的分割およびラセミ化およびＤ−ｐｈｅ−Ｏ− 〈の再循環組み合わせる統合された方法実施例８は、中空繊維のモジュールの中 に配置された３０％のＮ、　Ｎ−ジエチルドデカンアミド／７０％のドデカンの 有機相を有するＳＬＭを利用して、水ｐＨ７，５中でＰｈｅ−Ｌ−エステルの立 体特異的加水分解により、Ｄ、Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＭｅからＬ−Ｐｈｅ−ＯＨを調製 することを実証する。形成したＤ−Ｐｈｅ−ＯｍｅをＬ−Ｐｈｅ−ＯＨから選択 的膜の透過により調製するとき、対車体の分割が達成され、後者の対掌体はカル ボキシレートアニオンとして反応媒質の中に残留する：Ｄ　＋、　Ｌ−Ｐｈｅ− Ｏｍｅ　＋ＯＨＳＬＭを横切るＤ−Ｐｈｅ−Ｏｍｅの測定した束は０．５ｇ／ｆ ｔ”７時間であり、試験条件下の分割のための系の制限速度を表す。

この方法により分離ｅｄＬ−Ｐｈｅ〜ＯＨは、イソプロパツールおよびＨＣＩを 使用する普通のエステル化手順により、対応するイソプロピルエステルに転化す ることができる。生ずるＬ−Ｐｈｅ−０−＜は、実施例１５および１７に記載す る、ジペプチドＮ−ホルミル−（ベーターメチル）−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−）−＜の 合成のための好ましい出発物質である。

全体の普通のり、　Ｌ−Ｐｈｅ−Ｏｍｅ　Ｌ−Ｐｈｅ　＜の経済性は、メチルエ ステル官能を破壊しない、副生物Ｄ−Ｐｈｅ−Ｏｍｅの急速および効率よいラセ ミ化により改良されるであろう。米国特許第４゜７１３．４７０号（１９８７年 １２月１５日）ニスタウファー・ケミカル・カンバー−−（Ｓｔａｕｆｆｅｒ　 Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）：ｌに記載されているうセミ化方法は、Ｄ−Ｐｈｅ −Ｏｍｅを還流するトルエン（１１０℃）中で１時間サリシルアルデヒド触媒の 存在下にこのようなラセミ化において加熱することを包含する。

次の実験は、トルエン／水の２相系の界面における酵素的分割を実証する。

２００ｍ１のトルエン中の８．０ｇのり、Ｌ−Ｐｈｅ−Ｏｍｅの溶液を、ｐＨ８ ，５に調節した、２００ｍ１の水性１．５ｍＭのＣｏＣ］　２中の２ｇのアミノ アシラーゼ（粗製の可溶性固体）の溶液を含有する５００ｍ１のビーカーに添加 した。生ずる２相を磁気的撹拌によりよく混合し、そして反応が進行するとき、 水相のｐＨはｐＨスタットおよび滴定剤として０．２Ｎ　ＮａＯＨを使用して８ ．５に維持した。３０分間混合した後、そのｐＨの維持に要求されるＮａＯＨの 添加はかなり減少した。水相のＨＰＬＣ分析は３．２ｇのＬ−Ｐｈｅ−ＯＨの存 在を示し、反応がほぼ完結したことを確証した。さらに３０分間撹拌した後、２ 相を回収し、そして別々に分析した。

Ａ１水性層（２１５ｍｌ）をアミコン（Ａｍｉ　ｃｏｎ）ＹＭ５膜（５にダルト ンのカットオフ）を装備する透析濾過セルの中に入れ、３体積（６５０ｍｌ）の １．５ｍＭのＣｏＣ１ｘ、ｐＨ８，５溶液で透析濾過し、そして最後に２００ｍ １に濃縮した。−緒にした濾液（６５０ｍｌ）を希ＨＣＩでｐＨ５，０に調節し 、５０ｍ１に真空濃縮し、そして４℃に冷却すると、２．２ｇのＬ−Ｐｈｅ−Ｏ Ｈが得られた、［α］。”　＝−２８，６°　（ｃ、２　；Ｈ，Ｏ）。

光学的純度：Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ−ＨＣＩ標準、［α］　０２５°＝−３２，４ ”　（ｃ、２；ＥｔＯＨ）を参照して１００％。

極性測定結果が示すように、この手順によりり、Ｌ−Ｐｈｅ−Ｏｍｅを約４０　 ｇ／　１時間の速度で供給することによって、有効な対車体分割を達成して、Ｌ −Ｐｈｅ−０）（を２０ｇ／］時間で生成することができる。顕著には、この生 産性は、バチルス・ラクトフェルメンツム（Ｂａｃｉ］Ｉｕｓ　］ａｃｔｏｆｅ ｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＪ３４３７を使用するバッチ式発酵について文献に記録され ているものより５０倍高く、ここでＬ−Ｐｈｅ−ＯＨの培地の飽和（３０ｇ／ｌ 、２５℃）は７２時間の培養時間、または０．４ｇ／］の平均の生産性を必要と した［１．　シｏ（Ｓｈｉｌｏ）、「Ｌ−フェールアラニンの発酵（Ｌ−Ｐｈｅ ｎｙｌａｌａｎｉｎｅ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）Ｊ、Ｋ、　アイダ（Ａ　４ 　ｄａ）、Ｌ　チバタ（Ｃｈｊｂａｔａ）、Ｋ、ナカヤｖ（Ｎａｋａｙａｍａ） 　、Ｋ、　タキナミ（Ｔａｋｉｎａｍｉ）およびＨ，ヤマダ（Ｙａｍａｄａ）（ ｍ）、「アミノ酸の製造のバイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　 ｏｆ　Ａｍ１ｎｏ　Ａｃ１ｄ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）」、講談社、東京、１９ ８６年、ｐｐ、１８８−２０６］。

実施例２０　酵素活性 次の実験は、アミノアシラーゼ、スブチリシンおよびアルファーキモトリプシン の酵素的分割プロセスについての有効性を、フェニルアラニンのメチルエステル およびイソプロピルエステルのし−およびＤ一対掌体の加水分解についてのそれ らの速度の比により比較した（Ｌ／Ｄ反応速度論の等級）。各酵素による各エス テルの加水分解のための速度定数を、前述の方法および普通の実施に従い、ｐＨ ，Ｓ／Ｅ比および１度の同一の条件下に測定した。それらの測定の結果を下表Ｘ ＶＩＩＩに要約する。

表ＸＶＩＩＩ フェニルアラニンエステルについての、０．１モルのリン酸塩緩衝液ｐＨ８，０ 、Ｓ／Ｅ＝１０．２５℃においてＬ／Ｄ反応速度論の比アミノアシラーゼ（アマ ノ）　４７＊　Ｏ（加水分解なし） スブチリシン、カールスバーグ （シグマ＞　５５＊　００ アルフアーキモトリプシン （シグマ）　８２５＊　００ ：文献の値、ダホド（Ｄａｈｏｄ）およびエンピー（Ｅｍｐ　ｉ　ｅ）　、ｓｐ ｒａ０ アルファーキモトリプシンはり、Ｌ−Ｐｈｅ−Ｏｍｅの分割のために好ましい酵 素であろう。

驚くべきことには、両者のスブチリンンおよびアルファーキモトリプシンはＬ− Ｐｈｅ−０＜を非常に急速に加水分解することができるが、Ｄ−Ｐｈｅ−０＜の 加水分解を触媒することができない。アミノアシラーゼはＤ−またはＬ−フェニ ルアラニンイソプロピルエステルのいずれをも触媒しなかった。スブチリシンお よびアルファーキモトリプシンにより示されたＬ−Ｐｈｅ−０＜に向かう区別は 、この実施例に記載する統合された分割プロセスにおいて高度に有利である。

統合された分割プロセスは、酵素およびラセミ化の触媒の両者の回収および再使 用を、それらの活性へのトルエンの悪影響なしに、可能とするので、バッチ式ま たは連続的操作として有利に実施することができる。

実施例１４および１７に記載されている型のセルロースの中空繊維のコンタクタ −を使用することができるので、トルエン相は繊維の内腔内を向流的に循環して 繊維の壁を埋め込む水性酵素相に入る。コンタクタ−を去るトルエン相はＤ−Ｐ ｈｅ−０＜を運び、これは、固定化されたサリシルアルデヒド触媒の存在下にラ セミ化した後、Ｄ、Ｌ−Ｐｈｅ−０くとしてコンタクタ−の中に再循環されるで あろう。コンタクタ−の中に存在する高い界面表面は、生成物／水相の中へのＬ −Ｐｈｅ−ＯＨの酵素的移送を促進する。コンタクタ−を去ると、生成物／水相 は、限外ろ過装置（Ｕ　Ｆ）の下流で作動する、逆浸透（ＲＯ）ユニットの中に 連続的に放出され、限外ろ過装置（ＵＦ）は酵素を保持するが、Ｌ−Ｐｈｅ−Ｏ Ｈの自由の流れを許す。

第２９図は前述の連続的プロセスを概略的に示す。Ｌ−Ｐｈｅ　−ＯＨについて 上で測定した２０ｇ／１時間の移送速度は中空繊維のコンタクタ−において達成 することができ、このコンタクタ−は約１ｆｔ２の界面面積／１の反応混合物、 および約２Ｑｇ／ｆｔ２または３８６　１ｂ／ｆｔ”・年の透過性を提供する。

ＦＩＧ、２ 薯 菖 垣 ＭＧ／２００ＭＬ（ＳＷＥＥＰＰＨＡＳＥ）ＭＧ／２００ＭＬ　（ＳＷＥＥＰ　 ＰＨＡＳＥ）ＭＧＰＥＰτｔＤＥ／２００ＭＬ（ＳＷＥＥＰ　ＰＨＡＳＥ）ＭＧ 　ＰＥＰＴＩＤＥ／　１００ＭＬ　（ＴｔＪＢＥ　Ｐ）（ＡＳＥ）ＭＧ　ＰＥＰ ＴＩＤＥ／４００　ＭＬＳＨＥＬＬ　ＰＨＡＳＥＭＧ　ＤＩＰＥＰＴＩＤＥ／２ ００ＭＬＳＨＥＬＬＰＨＡＳＥＦＩＧ、９ ｍｇ／Ｌ　Ｎ−ｆｏｒｍｙｌ−（＃ｍｅｔｈｙｌ）　−ａｓｐ−ｐｈｅ−ｔｒｐ −ＯＨ（Ｓｈｅｌｌ　ｐｈａｓｅ） ｍ９／Ｌ Ｎ−ｆｏｒｍｙｌ−（β−ｍｅｔｈｙｌ）　−ａｓｐ−ｐｈｅ−ｔｒｐ−ＯＭｅ Ｎ−ｆｏｒｍｙｌ−（Ｂ−Ｍｅ）　−ａｓｐ−ｐｈｅ−ｔｒｐ−ＯＭｅｍｇ／Ｌ ｍｇ／Ｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ　ｉｎ　ｐｒｏｄｕｃｔ　５ｏｌｕｔｉｏｎＦＩＧ、２６ ＦＩＧ、２７ ＦＩＧ、２Ｂ 国際調査報告 ｓＡ　３６６１Ｂ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｃ−末端カルボキシレート基を有する保護されたペプチドおよびアルファカ ルボキシレート基を有する保護されたＮ−アシルアミノ酸から成る群より選択さ れる第１化合物を、Ｎ−末端アンモニウム基を有する保護されたペプチドおよび アルファアンモニウム基を有する保護されたアミノ酸から成る群より選択される 第２化合物と、縮合酵素の存在下に水性反応相中で、前記カルボキシレート基お よび前記アンモニウム基が縮合して保護された非帯電のペプチド生成物を形成す る条件下に、反応させ、 前記保護された非帯電のペプチド生成物を、水不混和性疎水性相を横切って、水 性生成物相の中に移し、そして前記保護された非帯電のペプチド生成物を前記水 性生成物相から分離して、その生成物が前記水不混和性疎水性相を横切って逆拡 散するのを防止する、 工程からなる、ペプチドの酵素的合成方法。 ２、保障された非帯電のペプチド生成物を水性生成物相から逆浸透により分離す る、上記第１項記載の方法。 ３、第２化合物は３〜６個の炭素原子を有する第２アルコールから誘導されたＬ −フェニルアラニンの低級アルキルエスデルである、上記第１項記載の方法。 ４、縮合酵素はサーモリシンであり、そして水性反応相の温度は約５０℃である 、上記第３項記載の方法。 ５、第１化合物はＮ−ホルミルー（ベーターメチル）−ａｓｐ−ＯＨであり、そ して第２化合物はＬ−フェニルアラニンイソプロピルエステルである、上記第４ 項記載の方法。 ６、水不混和性疎水性相は、水性相の各々と油／水界面をつくる水性生成物相か ら水性反応相を分離する、イオン拒絶膜として機能する、上記第１項記載の方法 。 ７、水不混和性疎水性相は、微孔質支持体中の孔中の毛管により固定化された有 機液体である、上記第６項記載の方法。 ８、微孔質支持体はポリプロピレンの中空繊維からなる、上記第７項記載の方法 。 ９、水不混和性疎水性相は、親水性物質からなる中空繊維の壁により定められた 内腔内に位置する有機液体からなる、上記第６項記載の方法。 １０、親水性物質はセルロースである、上記第９項記載の方法。 １１、複数の中空繊維は膜のモジュールからなり、そして水不混和性疎水性相は 中空繊維の内腔内に位置する、上記第９項記載の方法。 １２、複数の中空繊維は膜のモジュールからなる、上記第９項記載の方法。 １３、複数の膜モジュールからなる膜コンダクターからさらになり、前記膜モジ ュールは、 保障された非帯電のペプチド生成物を水性相から水不混和性疎水性相の中に移す 第１膜モジュール、 保護された非帯電のペプチド生成物を水不混和性疎水性相から水性生成物相の中 に移す第２膜モジュール、および第１膜モジュールにおける水不混和性疎水性相 と第２膜モジュールにおける水不混和性疎水性相との間を接続する手段、からな る、上記第１２項記載の方法。 １４、第１膜モジュールにおける水性反応相は中空繊維の外側に位置し、そして 水性反応相と水不混和性疎水性相との間に油／水界面をつくる中空繊維の壁をぬ らし、そして第２膜モジュールにおける水性生成物相は中空繊維の外側に位置し 、そして水性反応相と水不混和性疎水性相との間に油／水界面をつくる中空繊維 の壁をぬらす、上記第１３項記載の方法。 １５、油／水界面における液状の循環は向流である、上記第１４項記載の方法。 １６、複数の膜コンタクターを通して水性生成物相を処理する工程からさらにな る、上記第１４項記載の方法。 １７、ペプチドの生成物は３〜８つのアミノ酸残基からなる、上記第１項記載の 方法。 １８、第２化合物はＬ−フェニルアラニンイソプロピルエステおよびＬ−フェニ ルアラニンメチルエステルから成る群より選択される、上記第１項記載の方法。 １９、縮合酵素はサーモリシンである、上記第２項記載の方法。 ２０、第１化合物はＮ−ホルミル−（Ｏ−Ｂｚｌ）−ｔｒｙ−ｇｌｙ−ＯＨであ り、そして第２化合物はＨ−ｇｌｙ−ｐｈｅ−ｌｅｕ−ＯＨである、上記第１項 記載の方法。 ２１、縮合酵素はパパインである、上記第２０項記載の方法。 ２２、第１化合物はＮ−ホルミル−（ベーターメチル）−ａｓｐ−ｐｈｅ−ＯＨ であり、そして保護されたアミノ酸第２化合物はＨ−ｔｒｐ−ＯＭｅであり、そ して縮合酵素はペプシンである、上記第１項記載の方法。 ２３、Ｎ−ホルミル−（ベーターベンジル）−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニル アラニンベンジルエステル、Ｎ−ホルミル−（ベーターベンジル）−Ｌ−アスバ ルチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−カルボキシベンゾキシー（ベーターメチル ）−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル、Ｎ−カルボキシ ベンゾキシ−（ベーターメチル）−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン、 Ｎ−ホルミル−（ベーターメチル）−アスパルチル−フェニルアラニンメチルエ ステル、Ｎ−ホルミル−（ベーターメチル）−アスバルチル−フェニルアラニン 、Ｎ−ホルミル−（ベーターメチル）−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニ ン、Ｎ−ホルミル−（ベーターメチル）−アスパルチル−フェニルアラニル−ト リプトファンメチルエステル、Ｎ−ホルミル（ベーターメチル）−アスパルチル −フェニルアラニル−トリプトファン、Ｎ−カルボキシベンゾキシ−フェニルア ラニル−グリシル−グリシル−フェニルアラニンメチルエステル、Ｎ−カルボキ シベンゾキシ−フェニル−アラニル−グリシル−グリシル−フェニルアラニン、 Ｎ−ホルミル−（Ｏ−ベンジル−チロシル）−グリシル−グリシル−フェニルア ラニル−ロイシンメチルエステル、Ｎ−ホルミル−（Ｏ−ベンジル−チロシル） −グリシル−グリシル−フェニルアラニル−ロイシン、Ｎ−ホルミル−（ベータ ーメチル）−アスパルチル−フェニルアラニンイソプロピルエステルから成る群 より選択されるペプチド化合物。 ２４、工程： （ａ）Ｄ−，Ｌ−フェニルアラニンイソプロピルエステルの混合物を、Ｌ−エス テルを選択的に加水分解する酵素で、水性相の中において処理し、 （ｂ）Ｄ−エステルを有機相の中に抽出し、（ｃ）抽出したＤ−エステルをラセ ミ化し、そして（ｄ）ラセミ体を工程（ａ）に戻す、 からなる、Ｄ−，Ｌ−フェニルアラニンイソプロピルエステルを酵素的に分割し 、Ｄ−，フェニルアラニンイソプロピルエステルをラセミ化しそして再循環する 統合された方法。