NO172064B - Fremgangsmaate for enzymatisk syntese av peptider og fremgangsmaate for enzymatisk separering av racemiske karboksylsyreforbindelser - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for enzymatisk syntese av peptider, og det særegne ved denne fremgangsmåte er trinnene med: en N-acyl-p-substituert-L-aspartinsyre med en a-karboksylatgruppe kondenseres med en fenylalanin-lavere alkylester med en alfa-ammoniumgruppe, i en vandig reaksjonsblanding inkluderende et kondensasjonsenzym og danner derved N-acyl-L-aspartyl- ((3-substituert) -L-fenylalanin (lavere alkylester) i form av et uladet peptid,

dette uladede peptid transporteres fra den vandige reaksjonsblanding gjennom en ibneavstøtningsmembran inn i en produktblanding ved osmose, idet membranen foretrukket omfatter en vannublandbar organisk væske immobilisert i porene av en mikroporøs membran, og

det uladede peptid i produktblandingen omdannes til en ladet forbindelsesform som ikke kan tilbakediffundere gjennom membranen til den initiale reaksjonsblanding,

idet omdannelsen av det uladede peptid foretrukket skjer ved enzymatisk spaltning.

Oppfinnelsen vedrører videre separering av racemiske karboksylsyreforbindelser, og det særegne ved denne fremgangsmåte er at den omfatter trinnene med: hydrolysering av en racemisk karboksylsyreester-forbindelse i en vandig reaksjonsblanding som inkluderer et hydrolyserende enzym for å danne en ladet enantiomer forbindelse og en uladet enantiomer esterforbindelse i den vandige reaksjonsblanding, og

transportering av den uladede enantiomere ester-forbindelse fra den vandige reaksjonsblanding gjennom en ioneavstøtende membran inn i en produktblanding.

Disse og andre trekk ved oppfinnelsen fremgår av patent-kravene.

Anvendelse av proteolytiske enzymer som kondensasjons-katalysatorer for den stereospesifikke kobling av to L-amino-syrer til å gi L,L-peptider er kjent siden de

tidligere dager for protein-kjemien. Så tidlig som 1909

beskrev Mohr og Strohschein dannelse av det vannuoppløse-

lige dipeptid Bz-Leu-Leu-NH^ ved å omsette Bz-Leu-OH og H-Leu-Nr^ i nærvær av det proteinnedbrytende enzym

papain. E. Mohr og F. Strohschein, Ber 42, 2521 (1909).

Mohr og Strohschein-type-reaksjonen er mulig bare mellom diamino-syrer som danner peptid-bindinger som er utsatt

for spaltning med papain eller annet- anvendt enzym. Kondensasjonsreaksjonens likevekt mellom amino-syre-reaksjonskomponentene og peptidproduktet er kraftig forskjøvet mot de reagerende amino-syrer. Likevel kan

kondensasjonsreaksjonen drives til fullføring ved hjelp av massevirkning hvis -f.eks. dipeptid-produktet er dårlig oppløselig og felles ut av reaksjonsfasen.

På grunn av den kommersielle betydning av visse peptider

og det faktum at enzymer er kjent å katalysere peptid-

dannelse under milde betingelser har det vært foretatt mye forskning på den enzymatiske syntese av peptider og særlig enkle dipeptider. K. Oyama og K. Kihara, Kagaku Sosetsu 35, 195 (1982); K. Oyama og K. Kihara, ChemTech.

14, 100 (1984).

Fremgangsmåten for enzymatisk syntese av peptid-derivatet aspartam, beskrevet i US patentskrift nr. 4.165.311, i det følgende benevnt 311-prosessen, innbefatter den termolysin-katalyserte kondensasjon av N-karbobenzoksy-L-aspartin-syre med D,L-fenylalanin-metyl-ester og

utfelling av et mellomprodukt-kompleks, D-fenylalanin-metyl-ester-salt av N-karbobenzoksy-aspartam, for å drive reaksjonen til peptid-produktsiden. Videre behandling av dette mellomprodukt-kompleks tillater utvinning av D-fenylalanin-metyl-ester som kan resirkuleres etter racemisering, og av N-karbobenzoksy-aspartam-derivatet som kan omdannes til aspartam ved fjernelse av den N-karbobenzoksy-beskyttende gruppe. 311-prosessen må utøves på porsjonsbasis som er omstendelig og kompliserer gjenvinningen av enzym. Se også K. Oyama, S Irino, T. Harada og N. Hagi, Ann. N.Y. Acad. Sei. 434, 95 (1985). Willi Kullmann, Enzymatic Peptide Synthesis (1987).

Den N-karbobenzoksy-beskyttende gruppe spiller en vesentlig rolle i 311-prosessen: ved å oppfylle det strukturelle krav som settes av det aktive punkt i termolysin, og ved å bidra til uoppløseligheten av mellomprodukt-komplekset slik at utbyttet ved reaksjonen øker. Fjernelse av den N-karbobenzoksy-beskyttende gruppe fra aspartam-derivatet må gjennomføres under milde betingelser, f.eks.

katalytisk hydrogenering, for å forhindre spaltning av metylester-funksjonen. Katalytisk hydrogenering innbefatter ulempen ved å håndtere hydrogengass i stor skala.

Alternative forsøk på å drive enzymatiske kondensasjons-reaksjoner til fullstendighet er også beskrevet i den kjemiske litteratur. F.eks. er bruken av organiske løsningsmidler som reaksjonsmedier blitt funnet å være effektive for å øke peptid-produktutbyttene selv om den samtidige nedsettelse av enzymstabiliteten har forhindret dets bruk i stor målestokk, K. Oyama, S. Nishimura, Y. Nonaka, K. Hihara og T. Hashimoto, J. Org. Chem. 46, 5241

(1981); H. Ooshima, H. Mori og Y. Harano, Biotechnology Letters 7, 789 (1985) og K. Nakanishi, T. Kamikubo og

R. Matsuno, Biotechnology 3, 459 (1985).

På bakgrunn av de ovennevnte vanskeligheter ved utøvelse av tidligere kjente metoder for enzymatisk syntese av peptider, særlig kravene til utfelling av et mellomprodukt-kompleks og håndtering av farlige reagenser har det vært ønskelig å tilveiebringe en forbedret fremgangsmåte som unngår disse vanskeligheter og som sikkert tilveiebringer effektive utbytter uten hurtig deaktivering av enzym-katalysatorene.

Den foreliggende oppfinnelse oppfyller disse formål.

De foregående og andre formål og fordeler oppnås ved oppfinnelsen som det fremgår av den etterfølgende detaljerte beskrivelse sett i sammenheng med de vedføyde tegninger hvori: Figur 1 er et skjematisk illustrasjon av den enzymatiske syntese av aspartam i samsvar med den foreliggende oppfinnelse. Figur 2 er et skjematisk riss av et apparat for utøvelse av fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse. Figur 3 er en grafisk fremstilling som illustrerer mengden av produkt (aspartam-derivat) funnet over tid i eksemplene 1 og 2. Figur 4 er et grafisk fremstilling som illustrerer mengden av produkt (aspartam-derivat) dannet over tid i eksempel 4. Figur 5 er en grafisk fremstilling som illustrerer mengden av produkt (aspartam-derivat) dannet over tid i eksempel 5. Figur 6 er en grafisk fremstiling som illustrerer mengden av produkt (aspartam-derivat) dannet over tid i eksempel 6. Figur 7 er en grafisk fremstiling som illustrerer mengden av produkt (aspartam-derivat) dannet over tid i

eksempel 7.

Figur 8 er en grafisk fremstilling som illustrerer mengden av produkt (aspartam-derivat) dannet over tid i eksempel 8. Figur 9 er en skjematisk fremstilling av et apparat for utøvelse av den foreliggende oppfinnelse og illustrerer beholderne på produktsiden som beskrevet i eksempel 9. Figur 10 er en grafisk fremstilling som illustrerer mengden av produkt (aspartam-derivat) dannet over tid i eksempel 9 med og uten anvendelse av en ione-bytterharpiks.

Oppfinnelsen omhandlet heri tilveiebringer en prosedyre for å drive den enzymatiske syntese av peptider i en vandig reaksjonsblanding til fullstendighet ved å

separere det uladede peptid-mellomprodukt, eller derivat derav, fra reaksjonsblandingen ved hjelp av en membran som selektivt transporterer det uladede peptid ut av reaksjonsblandingen inn i en produktblanding. På grunn av at membranen er hovedsakelig impermeabel overfor reaksjonskomponenter (ladede molekyler) bevirker fjernelse av peptid-mellomproduktet fra reaksjonsblandingen en nedsettelse av peptidkonsentrasjonen ved likevekt som forskyver reaksjonen mot fullstendighet ved massevirkning.

De membraner som er mest egnet ved utøvelse av den foreliggende oppfinnelse er "Immobilized Liquid Membranes" (ILM) omfattende en ikke-polar væske innleiret

i et mikroporøst bærermaterial, foretrukket et polymert ark som er hovedsakelig ugjennomtrengelig for enzymene, reaksjonskomponentene og produktene. Hydrofobe polymerer som f.eks. polypropylen er foretrukne bærer-materialer. ILM-moduler kan fremstilles under anvendelse

av polypropylen-hulfibre. "Celgard" er et eksempel på kommersielt tilgjengelige hulfibre av polypropylen. Innleirings-forbindelser kjent på området og polyvinylklorid-rør eller slanger kan eventuelt anvendes ved fremstilling av en ILM-modul. En ytterligere polymer for fremstilling av det mikroporøse bærermaterial er "TEFLON" som et eksempel på

fluorerte hydrokarbon-polymerer.

Mikroporene passerer gjennom bærermaterialet og kan gis en størrelse slik at en immobilisert"væske vil bli fastholdt deri ved kapillaritetskrefter og vil ikke unnslippe derfra når materialet utsettes f.eks. for trykkdifferensialer over membranet eller andre vanlige reaksjonsbetingelser. Ut fra de ovennevnte begrensninger er det fordelaktig å maksimalisere kontaktområdet mellom den immobiliserte væske og reaksjonsblandingen for å maksimalisere overføringstakten (fluks) av det uladede peptidprodukt gjennom membranen. Det vil være klart at det foretrukne porestørrelse vil variere i avhengighet av egenskapene av den spesielle immobiliserte væske, anvendte reaksjonskomponenter, produkter som fremstilles og lignende faktorer, og videre at den optimale pore-størrelse kan bestemmes empirisk av fagkyndige på området. En nyttige drøftelse av porestørrelses-seleksjon finnes i US patentskrift nr. 4.174.374. Bruken og fremstillingen av immobiliserte væskemembraner er beskrevet i følgende henvisninger, S.L.. Matson, J.A. Quinn, Coupling Separation and Enrichment to Chemical Conversion in a Membrane Reactor, et arbeid fremlagt ved AICHE Annual Meeting, New Orleans, Louisiana (November 8-12, 1981) og S.L. Matson og J.A. Quinn, Membrane Reactors in Bioprocessing, Ann. N.Y. Acad. Sei. 469, 152 (1986).

Den immobiliserte væske som fastholdes i den mikroporøse bærer ved kapillaritetskrefter bør være vann-ublandbar og et godt løsningsmiddel for det uladede peptidprodukt som skal transporteres gjennom membranen (diffuseres)

med en rimelig takt, dvs. gode transportegenskaper/høy fluks, mens ladede eller ioniserte molekyler på både reaksjonssiden og produktsiden av membranen for det meste ikke transporteres gjennom membranen i noen retning, dvs. god selektivitet/ionavstøtning.

Seleksjon av den beste kombinasjon av bærermaterial og immobilisert væske for bruk ved en enzymatisk syntese av et peptid i samsvar med den foreliggende oppfinnelse vil delvis avhenge av arten av de spesielle reaksjonskomponenter som anvendes, ønskede produkter og løsnings-midler i systemet.

De generelt foretrukne immobilsierte væsker for utøvelse av den foreliggende oppfinnelse inkluderer vann-ublandbare organiske løsningsmidler, som f.eks. forgrenede og uforgrenede alkoholer med 6 til 12 karbonatomer, f.eks. n-dekanol, n-dodekanol, n-heksadekanol og blandinger derav. Også foretrukket er blandinger av vannublandbare organiske løsningsmidler inklusive blandinger derav. Slike løsningsmidler inkluderer, men er ikke begrenset til N,N-dietyldodekanamid, dodekan og 2-undekanon.

En ytterligere type av membran egnet ved utøvelse av den foreliggende oppfinnelse omfatter hydrofobe faste filmer fremstilt av organiske polymerer som f.eks. polyvinyl-klorid eller lignende. Fremstillingen av disse polymer-membraner er godt beskrevet i litteraturen, f.eks.

O.J. Sweeting, utgiver, Science and Technology of

Polymer Films, Interscience, New York (1968), mens utstrakt bruk av disse membraner ved separering av gasser og væsker er drøftet i S.T. Hwang og K. Kammermeyer, Membranes in Separations, Techniques of Chemistry, Vol. VII, (A. Weissberger, utgiver) John Wiley & Sons, Inc., New York (1975) .

En foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen anvender en membran-reaktor/separator-system som tilveiebringer en vandig reaksjonsblanding eller fase som sirkulerer i kontakt med en side av en ILM-membran og en vandig produkt-fase eller blanding som sirkulerer i motstrøm ved den motsatte siden av membranen. S.L. Matson og J.A. Quinn, Ann. N.Y. Acad. Sei. 469, 152 (1986). pH og temperaturen ved reaksjonen og produktfåsene opprettholdes ved en verdi som holder reaksjonskomponentene i en form som nedsetter deres transport gjennom membranen ved pH mellom 4,0 og 9,0 til et minimum. Transport av det uladede peptid-mellomprodukt fra reaksjonsfasen til produktfasen drives av konsentrasjonsgradienten over membranen etablert ved å øke nøytral- eller uladet peptidkonsentrasjon i reaksjonsfasen . Transport-aktiviteten eller fluksen gjennom membranen kan vesentlig forbedres ved den samtidig, irreversible omdannelse av det transporterte peptid i produktfasen, til en species som ikke kan diffundere tilbake. F.eks. kan den sist-nevnte omdannelse resultere i dannelse av et polart peptid som ikke kan diffundere tilbake og således supplere drivkraften for å oppnå fullstendiggjøring av koblingsreaksjonen. Et eksempel på en membranreaktor/separator som kan tilpasses for utøvelse av den foreliggende oppfinnelse finnes i US patentskrift nr. 4.187.086.

Tilgjengelige alternative membranreaktor/separator-konfigurasjoner som kan tilpasses utøvelse av den foreliggende oppfinnelse inkluderer hulfibermodulene beskrevet i UK patentansøkning nr. 2.047.564 A, og konvensjonelle plater- og ramme-type filterinnretninger som er vel kjent på området.

I tillegg til selektiv transport av det uladede peptid tilveiebringer membranen en barriere mellom reaksjonsfasen og produktfasen som forhindrer uønsket blanding av og reaksjoner mellom komponentene i hver fase.

Ved en foretrukket membranreaktor/separator i samsvar med den foreliggende oppfinnelse blir den kjemiske likevekt mellom reaksjonskomponentene faktisk "forskjøvet" gjennom membranen ved å gjennomføre en irreversibel omdannelse av det transporterte uladede peptid, til en membran-impermeabel species, på produktsiden av membranen. Denne type av membranreaktor/ separator anvender en koblet to-enzym (E 1 og E 2) prosess av den generelle type:

De ladede reaksjonskomponenter A og B er aminosyrer og/eller små peptider som kondenseres ved hjelp av det peptiddannende enzym E"<*>" til å danne det uladede mellomproduktpeptid C som transporteres selektivt gjennom membranen til produktsiden. Det er klart at de reaktive funksjonelle grupper i reaksjonskomponentene som ikke deltar i den ønskede reaksjon kan beskyttes eller blokkeres om nødvendig for å forhindre uønskede bireaksjoner og/eller endringer i produktene. På produktsiden av membransiden blir det uladede peptid C omdannet til det ladede peptid D som ikke kan diffundere tilbake gjennom membranen slik at den kjemiske likevekt i reaksjonsblandingen bringes til å forskyves i retning av produksjon av mer C.

Dette konsept illustreres i fig. 1 for det spesielle tilfelle av enzymatisk kondenserng av D,L-fenylalanin-metyl-ester med (N- og -beskyttet) N-formyl-g-benzyl-L-aspartat, i nærvær av termolysin ved omtrent pH 5,5.

I reaksjonsskjemaet illustrert i fig. 1 er reaksjonskomponenten A<+> D, L-f enylalanin-metyl-ester og B_ er N-formyl-3-benzyl-L-aspartat. Reaksjonskomponentene kondenseres på reaksjonstiden av membranen ved hjelp av enzymet E"<*>" termolysin som danner det uladede peptid C. pH velges slik at reaksjonskomponentene opprettholdes i deres ladede tilstand og nedsetter således deres diffusjon gjennom membranen sammen med det uladede peptid C til et minimum.

Selv om den kjemiske likevekt for kondensasjonsreaksjonen stort sett begunstiger reaksjonskomponent A<+ >og B species, krever diffusjon av det uladede peptidprodukt C gjennom membranen til produktsiden konstant produksjon av C for å opprettholde den kjemiske likevekt på reaksjonssiden av membranen.

På produktsiden av membranen omdanner et esteraseenzym E 2 hurtig og irreversibelt det uladede peptid C som har diffundert gjennom membranen til ladet peptid D som ikke kan diffundere tilbake til reaksjonssiden. Den kjemiske likevekt på reaksjonssiden blir således effektivt

"trukket" gjennom membranen og mot produksjon av uladet produkt C. Deretter omdannes peptidet D til aspartam ved hjelp av sur hydrolyse, som fjerner formyl- og benzyl-beskyttende grupper, etterfulgt av C-terminal ende-forestring med metanol.

Den ovenstående metode kan gjennomføres i en motstrøms-membranreaktor/separator 10, som vist i fig. 2, ved å arbeide under kontrollerte betingelser med hensyn til pH og temperatur, slik at en reaksjonsblanding omfattende ert N-acyl-g-substituert-L-aspartin-syre, f.eks. N-formyl-3-benzyl-L-aspartat, med en fri a-karboksylat-gruppe

(elektronegativ species) som får kondensere med en reaksjonskomponent, f.eks. D,L-fenylalanin-metyl-ester,

med en protonert fri a-amino-gruppe (elektropositiv species) under den katalytiske innvirkning av protease

aktive i pH-området omtrent 4,0 til 9,0 , til å gi et fullstendig beskyttet L-aspartyl-L-fenylalanin-dipeptid som ikke bærer noen ioniserte grupper (elektronoytral species). På reaksjonssiden av membranen sirkuleres reaksjonsblandingen fra reaktortanken 12 ved hjelp av pumpen 14, gjennom innførselsledningen 16 gjennom separatoren 18 til utførselsledningen 20 som returnerer til reaktortanken 12. På produktsiden av membranen blir en produktblanding eller opptaksblanding som inkluderer fullt beskyttet uladet peptid, f.eks. N-formyl-ø-benzyl-L-aspartyl-L-fenylalanin-metyl-ester som er transportert gjennom membranen, sirkulert fra produktreaktortanken 22, ved hjelp av pumpen 24, gjennom produkttilførsels-ledningen 26, gjennom produktsiden av separatoren 18,

til produkt-utførselsledningen 30. Denne produktblanding inkluderer et annet enzym E 2 i form av en esterase, eller annen passende reagens, som kan spalte i det minste en av de beskyttede grupper som bæres av det uladede peptid slik at det utvikles en elektroladet species som ikke kan unnslippe opptaksstrømmen ved å diffundere tilbake gjennom membranen. Hvis en esterase anvendes vil en foretrukket esterase ha en proteolytisk aktivitet og et foretrukket pH-område på fra omtrent 6,0 til 9,0. Aminoacylace I, a-chymotrypsin og subtilisin A er eksempler på esteraser som er ansett som nyttige ved den foreliggende oppfinnelse.

Det ladede produkt kan periodisk tømmes ut og/eller kontinuerlig fjernes fra produktfasen ved konvensjonelle midler som f.eks. ionebytterharpikser, og den resterende utstrømning kan resirkuleres gjennom systemet. Det resulterende produkt bundet til ionebytterharpiksen kan desorberes og utvinnes under anvendelse av konvensjonelle prosedyrer.

Seleksjonen av passende avbeskyttelsesreagenser bestemmes ved den kjemiske art av de beskyttende grupper anvendt på reaksjonskomponentene, som f.eks. N-beskyttet-L-aspartinsyre, og som indikert i det foregående blir valget av beskyttende grupper i sin tur diktert av strukturmessige begrensninger som pålegges ved det aktive punkt av det kondenserende enzym.

Generelt er enzymene brukbare ved utøvelsen av den foreliggende oppfinnelse proteolytiske enzymer, enkelte ganger benevnt proteaser, som kan deles i to grupper.

Den mest vanlige anvendte er endopeptidaser, som bare spalter indre bindinger, so eksopeptidaser, som bare spalter terminale endebindinger. Brukbare enzymer inkluderer serinproteinaser (EC 3.4.21) som chymotrypsin, trypsin, subtilisin BNP' og Achromobacter protease, videre tiol proteinaser (EC 3.4.22), som f.eks. papain, karboksyl-proteinaser (EC 3.4.23) som pepsin, og metallo-proteinaser (EC 3.4.24) som f.eks. termolysin, prolisin, Tacynasen N (St. caespitosus) og Dispase. Binding av enzymene til uoppløselige bærere, ved å følge prosedyrer som er vel kjent for fagkyndige på området, kan innlemmes ved utøvelsen av oppfinnelsen, og selv om binding av enzymene ikke er noe vesentlig trinn, kan den være ønskelig for visse anvendelser. Blant de mange proteaser som er potensielt nyttige ved utøvelse av oppfinnelsen er termolysin (EC 3.4.24) det kondenserende enzym som er mest foretrukket på grunn av dets bemerkelsesverdige termostabilitet, lette tilgjengelighet, lave pris og brede brukbare pH-områder mellom omtrent 5,0 og 9,0. Andre foretrukne proteaser inkluderer pepsin og penicillo-pepsin (T- Hofmann og R. Shaw, Biochim. Biophys. Acta.

92 543 (1964)) og termostabil protease fra penicillium duponti (S. Emi, D.V. Myers og G.A. Iacobucci, Bio-chemistry 15, 842 (1976)). Disse ville forventes å

virke ved pH omtrent 5,5, fremvise god stabilitet ved slike pH-verdier og ikke kreve nærvær av Zn<++> og Ca<++->ioner for å opprettholde deres aktivitet.

Den praktiske etablering av enantiomerisk selektivitet, som i det tilfelle som er beskrevet i det foregående, er fremstilling av bare L,L-isomeren av peptidet C, er direkte forbundet med det valgte enzym, optimal virke-måte for membranen, kjemisk art av bærermaterialet og pH i den vandige reaksjonsfase.

En foretrukket membran for utøvelse av den ovenfor beskrevne spesifikke metode er et mikroporøs poly-propylenbærermaterial som inkluderer en blanding av n-heksadekanol og n-dodekan immobilisert deri. Denne membran kan fås under handelsnavnet

"Type 1 Hollow Fiber Selective Dialysis Mebrane" og foretrekkes med reaksjonene i eksemplene 1 til 4. En annen foretrukket membran anvender "Celgard "

Type 2400 polypropylen hulfiber som er et

mikroporøst bærermaterial som inkluderer en blanding av 30% volum/volum N,N-dietyl-dodekanamid i dodekan som vann-uoppløselig organisk væske som immobiliseres ved kapillaritet i porene av et mikroporøst ark av "Celgard". Denne membran angis som "Type 2 Hollow Fiber Selective Dialysis

Membrane" og foretrekkes ved reaksjonene i eksemplene 5-9. "Celgard" type 2400 polypropylen hulfibre med porestørrelse 0,025 til 0,050 } im og en veggtykkelse på

25 ^im ble anvendt i "Type 2 Hollow Fiber

Selective Dialysis Membrane". Når man

arbeidet ved pH på omtrent 5,5 fremviste disse membraner en høy selektivitet, f.eks. når man gjennomførte prosessen i fig. 1, med selektiviteter i området omtrent 500:1 (vekt/vekt) i favør av det uladede peptidspecies er blitt målt. Det vil si 500 mg av det uladede peptid ( C) transporteres gjennom membranen for hvert mg ladet reaksjonskomponent (A<+> eller B~) som transporteres.

Som nevnt i det foregående, for anvendelse av den foreliggende oppfinnelse, vil det være nødvendig eller ønskelig å blokkere eller beskytte forskjellige funksjonelle grupper på reaksjonskomponentene og produktene for å forhindre uønskede bireaksjoner som kunne forhindre produksjon av det ønskede produkt og/eller redusere dets utbytte og undertrykke elektro-ladninger i mellomproduktpeptid. Tabell I angir en serie av valgte kombinasjoner av beskyttende grupper og avbeskyttelsesbetingelser nyttige i forbindelse med utøvelse av den foreliggende oppfinnelse.

Som et resultat av enantio-se-lektiviteten av utvalgte kondensasjonsenzymer og den funksjonelle diskriminering som utøves av membranen, kan det ved utøvelse av oppfinnelsen under anvendelse av N-formyl-L-aspartyl-g-benzyl-ester og D,L-fenylalanin-metyl-ester oppnås en 99,8% enantiomerisk oppløsning av den racemiske fenylalanin-metyl-ester-reaksjonskomponent, idet L-enantiomeren som forekommer som N-formyl-L-aspartyl(g-benzyl)-L-fenylalanin-metyl-ester, et aspartam-derivat, sammen med den ureagerte D-enantiomer er tilbake i reaksjonsfasen.

D-fenylanalin-metyl-esteren som er tilbake i reaksjonsfasen kan utvinnes derfra, racemiseres tilbake til D,L-trinnet, og resirkuleres i tilførselen. Dette er

en fordel som er felles for mange prosesser som anvender racemisk aminosyre-reaksjonskomponenter, f.eks. 311-prosessen beskrevet i det foregående.

De økonomiske fordeler ved oppfinnelsen avledes i det minste delvis fra bruken av en racemat-tilførsels-reaksjonsblanding snarere enn en dyrere forhåndsoppløst L-enantiomer. Denne fordel gjøres mulig ved in situ optisk separering av D,L-fenylalanin-metyl-esteren på grunn av (a) enantioselektiviteten av det kondenserende enzym og (b) den•høye selektivitet av membranen til gunst for den uladede species. Foretrukne metoder for billig syntese av racemisk fenylalanin er dem som er basert på utnyttelse av benzaldehyd via 5-benzalhydantoin enkelte ganger benevnt Grace-prosessen, eller den katalytiske karbonylering av ' benzylklorid til fenylpyro druesyre, en prosedyre som er utviklet av Sagami Chemical Research Center, Tokyo, Japan (enkelte ganger referert til som Toyo Soda-prosessen utviklet av Toyo Soda manufacturing Co., Ltd., Yamaguchi, Japan).

Eksempel 1.

Et aspartam-derivat ble fremstilt i samsvar med den foreliggende oppfinnelse som følger: Til en oppløsning inneholdende 5,02 g (20 mmol) N-formyl-L-aspartyl-B-benzylester, 4,31 g (20 mmol) L-fenylalaninmetylester i 100 ml vann, innstilt til pH 5,5, ble tilsatt 500 mg termolysinenzym (Daiwa Chem. Co., Osaka, Japan) representerende totalt 8 x 10 5 proteolytiske enheter.

Den resulterende klare reaksjonsblanding ble inkubert i 15 timer ved 40°C hvor nærværet av uoppløselig dipeptid-N-formyl-3-benzyl-L-aspartyl-L-fenylalanin-metyl-ester viste seg. Den resulterende blanding ble så anbragt i en 200 ml beholder, forbundet til reaksjonssiden, i dette tilfelle rørsiden av en eksperimentell hulfiberseparator av en Bend Research, Inc. "Type 1 Hollow Fiber Selective Dialysis Membrane" som ga omtrent 9 dm 2 areal. Produktsiden av membranen (kappesiden av separatoren) var forbundet til en kilde (produkt) blanding (totalt volum 200 ml) inneholdende 500 mg av enzymet Acylase I (EC 3.5.1.14) fra Aspergillus Sp.

(Sigma A 2156) ved pH 7,5. Dette enzym, vanlig beskrevet som en aminoacylase, ble funnet å virke som en C-terminal endeesterase, på både N-acetyl- og N-formyl-B-benzyl-aspartam.

Reaksjonskomponent- og produkt-blandinger ble sirkulert ved romtemperatur gjennom hulfiberseparatoren i med-strøm med takt 600 ml/min., ved hjelp av peristaltiske pumper. Konfigurasjonen av dette apprat ligner det som er illustrert i fig. 2. Ettersom begge reaksjoner (kondensasjon og ester-hydrolyse) er protogeniske faller pH i både reaksjonskomponent- og produkt-blandingene ettersom prosessen går fremover. Konstant pH, både i reaksjonskomponent- og produkt-blandingene, ble opprett-holdt ved bruk av pH-stater.

Dannelsen av N-formyl-3-benzyl-L-aspartyl-L-fenylalanin ble overvåket ved hjelp av HPLC. Kromatografisk analyse ble gjennomført på en Tracor modell 995 instrument sammen med en LDC spektromonitor II detektor innstlt ved 254 nm for deteksjon av amino-syrene, fullstendig beskyttet produkt-dipeptid og dipeptid. Kolonnen som ble anvendt var en NOVA-PAK C^g Radial-Pak-patron, 8 mm x 10 cm, som var rommet i en Millipore Waters RCM-100 Radial Compression Module.

Den mobile fase anvendt for deteksjonen av det fullstendig beskyttede dipeptid var en volum/volum blanding av 45% metanol (HPLC renhet) 5% tetrahydrofuran

(HPLC renhet) og 50% av en 1% KH2P04 buffer-oppløsning. For deteksjonen av produkt-dipeptidet besto den mobile fase av en volum/volum blanding av 40% metanol og 60%

av en 1% KH2P0^ buffer-oppløsning (1 ml trietylamin pr. liter løsningsmiddel ble tilsatt for å nedsette etterslep til et minimum og pH ble innstilt ned til 4,3 under anvendelse av 80% fosforsyre). Strømningstakten ble holdt ved 1 ml/min.

Data for HPLC vedrørende dannelse av N-formyl- -benzyl-L-aspartyl-L-fenylalanin er oppsummert i tabell II i det følgende og er uttrykt som total mengde (mg) produkt-dipeptid akkumulert i produktoppløsningen som en funksjon av tiden.

Verdien av den uladede dipeptid-konsentrasjon med likevekt som tilsvarer dets metningspunkt i vann ved pH 5,5 ble funnet å være omtrent 0,05% ved 25°C. Mengden av uladet

2

dipeptid som transporteres pr. dm membran pr. time ble funnet å være omtrent 18 mg, og indikerte opprettholdelse av vedlikeholdelse av likevekten krevet oppløsning av uoppløselig dipeptid og/eller dipeptid-syntese på nytt. Nesten fullstendig oppløsning av uoppløselig uladet dipeptidfase i reaksjonsblandingen ble iakttatt etter omtrent 5 timer, og da ble reaksjonen stanset. En avsetning av data i tabell II er vist i fig. 3. Den lineære funksjon indikerer at overføring av peptid gjennom membranen foregår i stabil tilstand. Den iakttatte dannelseshastighet av produkt-dipeptid på omtrent 18 mg/dm 2/time (Tabell II) ble bekreftet tilsvarende fluks av uladet dipeptid gjennom membranen (17 mg/dm 2/time) målt ved 0,05% i vann som forventet på teoretisk basis.

Ved dette punkt ville det beskrevne system forventes å fortsette i stabil tilstand hvis kontinuerlig tilsetning ble foretatt til reaksjonsblandingen av de to aminosyre-reaksjonskomponenter, i en takt på omtrent 120 mg/time hver, for å holde systemet mettet på uladet dipeptid.

Fo fullt ut å realisere membranens selektivitet kan innsetting av en annen membran i serie med den første membran før kontakten med det annet enzym være nødvendig på grunn av at selektiviteten gjennom en enkelt membran er lavere på grunn av den høye aminosyre-konsentrasjonen i reaksjonsblandingen.

Produktoppløsningen (200 ml) ble gjenvunnet, innstilt til pH 2,5 og avkjølt ved 4°C over natten. Det samlede bunnfall ble isolert og omkrystallisert fra MeOH:K20 til å gi 307 mg N-formyl-3-benzyl-L-aspartyl-L-fenyl-npO

alanin [a]D = -5,6° (C=l,2; EtOH), identisk ved (IR, 13C-NMR) med en autentisk prøve fremstilt ved porsjonshydrolyse av N-formyl-3-benzyl-aspartam med Aspergillus esterase, [a]D 0 c = -5,3 (C=l,3; EtOH).

Eksempel 2

Et forsøk lignende forsøket i eksempel 1 ble gjennomført med unntagelse av bruk av 8,63 g D,L-fenylalanin-metyl-ester i stedet for L-enantiomeren. Resultatene er oppsummert i tabell III. Isolering av det uladede peptid fra 200 ml av produktoppløsning ga 310 mg produkt [a]p = -6,4 (C=l,4, EtOH), identisk i alle henseender (IR, 13C-NMR) med en autentisk prøve av N-formyl-ø-benzyl-L-aspartyl-L-fenylalanin.

En avsetning av data oppsummert i tabell III (fig. 3) viste på nytt nærværet av en stabil tilstandsprosess når reaktoren ble drevet med D,L-fenylalanin-metyl-ester. Stereospesifisiteten av termolysin påvises ved den utelukkende dannelse av det samme L,L-dipeptid som beskrevet i eksempel 1. D-fenylalanin-metyl-esteren tilbakeholdt i rørfasen (reaksjonsblandingen) inhiberte ikke de totale kinetiske forhold ved peptiddannelsen.

Eksempel 3

En blanding av 1,0 g N-formyl-3-benzyl-L-aspartyl-L-fenylalanin, fremstilt i samsvar med eksempel 1,4,0 ml vann, 4,0 ml tetrahydrofuran og 1,0 ml kons. saltsyre (12N) ble oppvarmet under tilbakeløp i 9 timer. Blandingen ble så avkjølt og pH innstilt til 4,0 med 50% NaOH-oppløsning. Tetrahydrofuran ble så fjernet ved inndamping ved mindre enn 3 5°C og 20 mm Hg. Krystallisasjon ble fullført ved <35°C og 20 mm Hg. Krystallisasjon ble fullført ved lagring ved 5° i 1 time, prøven ble så filtrert, vasket med 1 ml isblandet vann og tørket under vakuum til å gi 367 mg av hvitt faststoff. Dette material var identisk med en autentisk prøve av aspartyl-fenylalanin ved hjelp av HPLC og IR sammenligning. [a]2^°= + 12° (c = 0.5; 0.1 N HC1 i 50% MeOH).

Aspartyl-fenylalanin ble omdannet til aspartam ved behandling med metanol og saltsyre, som beskrevet i G.L. Bachman og B.D. Vineyard, US patentskrift

nr. 4.173.562, eksempel nr. 1.

Eksempel 4

Et forsøk tilsvarende forsøket i eksempel 1 ble gjennomført, med unntagelse av bruken av 5,65 g (20,1 mmol) N-karbobenzoksy-L-aspartin-syre-g-metyl-ester og 4,38 g (20,3 mmol) L-fenylalaninmetylester som reaksjonskomponenter. Aminosyrene ble oppløst i 100 ml vann, pH i oppløsningen innstilt til 5,5, og 500 mg termolysin Daiwa (8 x 10^ protelytiske enheter) ble tilsatt. Oppløsningen ble forinkubert i 15 timer ved 40°C hvor en større mengde N-CBZ-(3-metyl-ester)-L-asp-L-fenylalanin-metyl-ester ble utfelt. Suspensjonen ble forbundet til rørsiden av en "type 1 Hollow Fiber Selective Dialysis Membrane" (Bend Research Inc.) inneholdende omtrent 10 dm 2 membranoverflate, og maskinen ble drevet ved romtemperatur i 5 timer mot en kappesidefase av 200 ml vann inneholdende 500 mg acylase I (Sigma) ved pH 7,5. Akkumulering av peptidprodukt i kappefasen ble overvåket ved hjelp av HPLC

og resultatene er gjengitt i tabell IV og fig. 4.

Etter 5 timers kjøring ble reaksjonen stanset, kappe-sidefasen (200 ml) ble isolert, innstilt til pH 2,5 og lagret over natten ved 4°C. Det utfelte produkt ble samlet og omkrystallisert fra CH^OHtP^O og ga 405 mg (86% gjenvinning) N-CBZ-(g-metyl-ester)-L-asp-L-fenylalanin (N-CBZ-iso-APM) [a]^<5>= +6,0° (C = 1,1, EtOH), identisk ( 13C-NMR) ned en autentisk prøve av N-CBZ-iso-APM, [a]p = +5,5° (C = 1,1, EtOH), fremstil ved kjemisk kobling og delvis esterolyse med acylase I.

Som iakttatt tidligere i forsøkene i eksemplene 1 og 2 indikerer avsetningen i fig. 4 at akkumulering av N-CBZ-iso-APM foregår i en stabil takt på omtrent

200 mg/time.

Omdannelsen av N-CBZ-iso-APM til AMP kan gjennomføres under betingelsene beskrevet i eksempel 3.

Eksempel 5

Aspartam-derivatet, N-formyl-(3-metyl)-asp-phe ble fremstilt i samsvar med den foreliggende oppfinnelse som følger: Til en oppløsning inneholdende 6,00 g (35 mmol) N-formul-(g-metyl)-L-aspartin-syre, 10,00 g (48 mmol) L-fenylalanin-metyl-ester i 100 ml vann, innstilt til pH 7,0, ble tilsatt 770 mg termolysin-enzym (Daiwa

Chemical Co., Osaka, Japan) representerende totalt

1,2 x 10 proteolytiske enheter. Den resulterende klare oppløsning ble inkubert i en time ved 40°C når HPLC-analyse indikerte nærvær av 433,8 mg N-formyl- ((3-metyl)-asp-phe-OMe. Oppløsningen ble avkjølt til 25°C, pH innstilt til 5,0, og oppløsningen anbragt i en 200 ml beholder forbundet til rørsiden av hulfiber-separatorer ("Type 2

Hollow Fiber Selective Dialysis Membrane", Bend Research

2

Inc.) som tilveiebragte omtrent 4,5 dm av en ILM

fremstilt av 30% volum/volum N,N-dietyl-dodekanamid i dodekan. Kappesiden av separatoren ble forbundet til produktbeholderen inneholdende 500 mg av enzymet ancyle I (EC 3.5.1.14) fra Aspergillus Sp. (Aminoacylase AMANO, Nagoya, Japan), ved pH 7,5.

De to faser ble sirkulert ved 25°C i motstrøm med takt

50 ml/min. (rørfasen) og 500 ml/min. (kappefasen) ved hjelp av to pertistaltiske pumper under anvendelse av konfigurasjonen illustrert i fig. 2. Konstant pH i begge faser ble sikret ved bruk av pH-stater.

Dannelse av N-formyl-( -metyl)-asp-phe ble overvåket

ved hjelp av HPLC under anvendelse av et Tracor Model 995 instrument sammen med en LDC-spektromonitor II

detektor innstilt ved 254 nm. Den anvendte kolonne var en NOVA-PAK C18 radial-Pak patron, 8 mm x 100 mm, inne-sluttet i en Millipore Waters RCM-100 Radial Compression Module.

De mobile faser anvendt for analysen var:

(a) for N-formyl-(8-metyl)-asp-phe-OMe: 40% volum/volum metanol i 0., 1% KH2P04 buffer pH 4,6; (b) for N-formyl-(g-metyl)-asp-phe: 20% volum/volum

metanol i 0,1% KH2P0^ pH 4,6. De anvendte strømnings-takter var 1 ml/min. for begge analyser.

Data vedrørende dannelse av N-formyl-(8-metyl)-asp-phe produkt dipeptid) er gjengitt i følgende V og er uttrykt som total mengde (mg) akkumulert i 200 ml kappefase som en funksjon av tiden.

En avsetning av data i tabell V er vist i fig. 5.

Ved slutten av forsøket indikerte HPLC-analyse nærvær av 283 mg N-formyl-( g-metyl)-asp-phe-OMe i rørfasen. Disse verdier tillot beregning av mengden peptid syntetisert under driften av reaktoren.

3 36 P = peptid overført i kappefasen = 400 " = 417,4 mg Pq = initialt peptid i rørfasen = 433,8 mg

P = peptid tilbake i rørfasen ved slutten av forsøket

273 mg.

V på 53,5 mg/time 100 ml faller sammen med syntese-syn * 3 J

takten (500 mg/time L) målt for syntesehastigheten i likevektsundersøkelser foretatt med N-formyl-( -metyl)-L-aspartin-syre og L-fenylalanin-metyl-ester i nærvær av termolysin.

Produktoppløsningen (200 ml) ble isolert, innstilt til pH 2 med 1 N HC1 og ekstrahert to ganger med 200 ml EtOAc. De kombinerte ekstrakter etterlot en hvit rest ved avdamping og denne ga etter omkrystallisering fra EtOAc^heksan 100 mg N-formyl-(8-metyl)-L-asp-L-phe, [a]^<5> = + 0,70 ° (c, 0,29, MeOH), identisk (IR, <13>C-NMR) med en autentisk prøve fremstilt ved porsjonsvis hydrolyse av syntetisk N-formyl-(8-metyl)-L-asp-L-phe-OMe med Aspergillus esterase,

[a]p<5> = +0,80° (c, 0,29, MeOH).

Eksempel 6

Forsøket beskrevet i eksempel 5 ble oppskalert i en type 2 Hollow Fiber Dialysis Membrane (Bend Research Ind.) inneholdende 9 dm <2>flytende membran (30% volum/ volum N,N-dietyl-dodekantamid i dodekan). Rørfasen inneholdt 40 g L-phe-OMe, 24 g N-formyl-(8-metyl)-L-asp og 3,08 g termolysin Daiwa (et totalt 5 x 10 proteolytiske enheter) i 400 ml vann, innstilt til pH 7,0. Etter en inkubasjonsperiode på 1 time ved 40°C ble det funnet å være tilstede en mengde på 1,068 g (2,7 g/L) N-formyl-(8-metyl)-L-asp-L-phe-OMe. Oppløsningen ble avkjølt ved 25°C, innstilt til pH 5,0 med 1 N HC1 og forbundet til rørsiden av hulfiberseparatoren. Kappefasen besto av 400 ml vann, pH 7,5, inneholdende 2 g aminoacylace I (Amano). De to faser ble sirkulert i motstrøm ved 25°C i 5 timer, som beskrevet eksempel 5. Resultatene er oppsummert i tabell VI og fig. 6.

Ved slutten av forsøket var mengden av N-formyl-(8-metyl)-asp-phe-OMe tilbake i rørfasen 586 mg.

Den høyeste transportverdi som ble iakttatt (404 mg/time) under de første 30 min. er resultatet av den høye initiale peptidkonsentrasjon som frembringes under forinkubasjonsperioden. Avvik fra likevekt bevirket ved transport av peptid førte til syntese av mer peptid slik at det ble etablert en stabil tilstand etter den første time av forsøket, på et forventet nivå på 200 mg/ time (fig . 6) .

Eksempel 7

Et forsøk i likhet med eksempel 5 ble gjennomført, med unntagelse av bruken av 10,00 g D,L-fenylalanin-metyl-ester i stedet for L-enantiomeren. Resultatene,

fremlagt i tabell VII og fig. 7, viser klart at den iakttatte dannelsestakt av N-formyl-(8-metyl)-L-asp-L-phe var halvparten av den som sees med L-phe-OMe (eksempel 5, tabell V) som forventet fra enantioselektiviteten av termolysin og de tidligere resultater i eksempler 1 og 2.

Eksempel 8

Membran-assistert enzymatisk oppløsning av D,L-fenylalanin-metyl-ester ble anvendt i samsvar med den foreliggende oppfinnelse på følgende måte: Til en oppløsning av 1,0 g (5,6 mmol) D,L-fenylalanin-metyl-ester i 100 ml vann, pH 7,5, ble tilsatt 500 mg amino-acylase I (Amano Pharmaceutical Co., Nagoya, Japan). Blandingen fikk reagere ved 25°C i 30 min. og ved slutten av denne periode ble det iakttatt nærvær av 266 mg L-phe (1,6 mmol) og 712 mg D,L-Phe-PMe (4 mmol) ved hjelp av HPLC-analyse. Denne oppløsning ble innført i rørsiden (reaksjonssiden) av en "Celgard" hulfiber-understøttet ILM-separator ("Type 2 Hollow Fiber Selective Dialysis Membrane", Bend Research Inc.) inneholdende 4,5 dm 2 av en 30% volum/volum N,N-dietyl-dodekanamid i dodekan-væskefilm i membranen. Produktsiden av membranen (kappesiden av separatoren) ble fylt med 200 ml vann innstilt til pH 2,0 med fortynnet HC1. De to faser ble sirkulert gjennom separatoren i motstrøm i en takt på 200 ml/min., ved hjelp av peristaltiske pumper (fig. 2). Separeringen foregikk ved den kontinuerlige tilsetning av D,L-Phe-0Me til rørfasen, foretatt i en takt på omtrent 1 g D,L-Phe-0Me pr. time. Totalt 30 ml av en 7% oppløsning av D,L-Phe-0Me (2,1 g, 11,7 mmol) i vann ved pH 7,5 ble tilsatt i løpet av en periode på 2 timer. pH i begge faser ble holdt konstant ved bruk av pH-stater.

Forløpet av oppløsningen ble fulgt ved HPLC, på prøver tatt fra begge faser hver 30 min. HPLC-instrumentering og prosedyrer er dem som beskrevet i eksempel 5. Den mobile fase anvendt i dette tilfelle var 20% volum/volum metanol i 0,1% KK^ PO^ buffer pH 4,6, med en strømnings-takt på 1 ml/min. Resultatene, fremlagt i tabell VII og avsatt i fig. 8, viste akkumulering av L-Phe i rør-fasen og av D-Phe-OMe i kappefasen. Ved slutten av forsøket ble begge fase isolert og opparbeidet som følger: (a) Rørfase: Innholdet (130 ml) ble innstilt til pH 8,5 med IN NaOH og deretter ekstrahert med 2 x 50 ml EtOAc. Den vandige fase ble så innstilt til pH 4,0 med IN HC1 og oppløsningen ført gjennom en 2,5 x 20 cm "Dowex" 50 (NH^) kolonne. Etter vasking med 200 ml vann, ble produktet eluert med 200 ml 10% NH^OH. Eluatet ble konsentrert i 50 ml under vakuum og oppløsningen frysetørket. Utbytte: 249 mg,

hvitt faststoff.

L-fenylalanin, [a] = -29,2° (c, 2, HO), lit.

(Aldrich) [aJD 25 = D-35,0 (c, 2, H20) optisk renhet 92%.

(b) Kappe- fase: (200 ml) ble innstilt til pH 8,5

med fortynnet NaOH og ekstrahert med 2 x 50 ml EtOAc.

Den organiske ekstrakt ble tørket over vannfritt. Na2S04, inndampet til tørrhet, oppløst i 50 ml vann surgjort til pH 3,0 med IN HC1 og deretter fryse-tørket, og ga 989 mg (4,6 mmol) D-Phe-OMe HC1, hvitt fastst<off,> [a]<25>° = _2i.o° (c, 2; EtOH), lit.

(Aldrich) [a] 5D °= -32.4° (c, 2; EtOH), optisk renhet 83%.

Basert på permeabilitetsverdien på o 32 mg/cm 2 ■min. funnet for Phe-OMe (vann, pH 8, 25°C) på denne membran var den forventede fluks for et membranareal på 4,5 dm 2880 mg/ time. Tabell VIII viser at mengden av Phe-OMe overført i kappefasen ved slutten av den første time var 860 mg, som antyder at transporten ble gjennomført under membran-grensebetingelser.

Porsjonsoppløsning av D,L-Phe-OMe ved enantioselektiv hydrolyse av metyl-esterfunksjonen katalysert av subtilisin A (en alkalisk protease av serin-typen) er nylig blitt vist (Shui-Tein Chen, Kung-Tsung Wang og Chi-Huey Wong, J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1986 1514).

En hydrolyse er nødvendig for membranoppløsning av racemiske karboksylsyrer. En hydrolase som er en esterase som f.eks. aminoacylase I, a-chymotrypsin og subtilisin A kan anvendes for oppløsning av en D,L-amino-syreforbindelse som D,L-fenylalanin-metyl-ester. Amino-acylase I foretrekkes generelt for demetylering av peptider fremfor andre esterolytiske enzymer som subtilisin A og a-chymotrypsin med sterke proteolytiske virkninger.

Hvis den ovenfor beskrevne oppløsning av D,L-fenylalanin-metyl-esteren anvendes for fremstilling av et peptid som beskrevet med den foreliggende oppfinnelse, blir L-fenylalaninet som fremstilles metylert ved hjelp av standard metyleringsmidler kjent på området.

Dette eksepel kan tilpasses for oppløsning av andre racemiske karboksylsyrer. F.eks. kan en racemisk karboksylsyre-ester-forbindelse i en vandige reaksjonsblanding som inkluderer et hydrolyserende enzym hydrolyseres til å danne en ladet enantiomer forbindelse og en uladet enantiomer esterforbindelse i den vandige reaksjonsblanding. Den uladede enantiomere ester-forbindelse blir så transportert fra den vandige reaksjonsblanding tvers gjennom en ione-avstøtende membran i samsvar med den foreliggende oppfinnelse inkluderende Type 1 eller Type 2 "Hollow Fiber Selective Dialysis Membranes" fra Bend Research, Inc. I en type av eksempel som f.eks. eks. 8 er den racemiske karboksyl-syreesterforbindelse en D,L-aminosyre-ester-forbindelse, den ladede enantiomere forbindelse er en L-amino-syre-forbindelse og den uladede enantiomere esterforbindelse er en deaminosyre-ester-forbindelse. Det sees at seleksjon av enzymer og reaksjonsbetingelser er innenfor forståelse og kunnskap for personer med kyndigheter på området tilsvarende den foreliggende oppfinnelse.

Kontinuerlige eller porsjonsvise prosessmidler tilveiebringes ved dette eksempel ved at den ønskede enantiomer av reaksjonskomponenten kan fremstilles og tilsettes reaksjonsblandingen.

Eksempel 9

Syntese av N-formyl-(g-metyl)-L-asp-L-phe i samsvar med den foreliggende oppfinnelse ble gjennomført under anvendelse av immobilisert amino-acylase I og ionebytterharpikser for å fjerne permeable produkter på følgende måte: Til en oppløsning av 10,0 g (48 mmol) L-fenylalanin-metyl-ester og 6,0 g (35 mmol) N-formyl-(B-metyl)-L-aspartinsyre i 100 1 avionisert vann, innstilt til pH 7, ble tilsatt 770 mg termolysin (Daiwa Chemical Comapny, Osaka, Japan) som representerte totalt 1,2 x 10 proteolytiske enheter. Den resulterende oppløsning ble inkubert i 1 time ved 40°C og HPLC-analyse indikerte da nærvær av 383 mg N-formyl-(g-metyl)-asp-phe-OMe. Oppløsningen ble avkjølt til 25°C, pPT innstilt til 5,0, og oppløsningen ble anbragt i en 200 ml beholder 40 forbundet til rør-siden 46 av en hulfiberseparator 44 ("Type 2 Hollow Fiber Selective Dialysis Membrane", Bend Research, Inc.)

2

inneholdende 900 cm av en hydrofob væskemembran fremstilt av 30% N,N-dietyl-dodekanamid i dodekan. Kappesiden av separatoren 48 ble anordnet som en lukket krets fremstilt av en rekke forbundne beholdere illustrert i fig. 9. Oppløsningen som returnerte til separatoren 44 ble innstilt til pH 4,0 for å protonere L-phe-OMe som trengte gjennom sammen med dipeptidet N-formyl-( B-metyl)-asp-phe-OMe. Sirkulasjon gjennom en kolonne av "Dowex" 50 (Na<+>) 50 fjernet positivt ladet L-phe-OMe og etterlot det uladede dipeptid i oppløsning. Utstrømningen ble innstilt til pH 7,0 og utsatt for innvirkning av aminoacylasen I, immobilisert over DEAE-Sephadex 52 (T. Tosa, T. Mori og I Chibata, Agr. Biol. Chem. 33, 1053 (1969)). Det resulterende dipeptid N-formyl-( g-metyl)-asp-phe var negativt ladet ved denne pH og ble deretter innfanget av Dowex 1 (C1-) harpiksen 54. Utstrømningen ble returnert til membranseparatoren før innstilling til pH 4,0 og lukket således kretsløpet.

Røret 46 (100 ml) og kappen 48 (500 ml) fasene ble sirkulert ved 25°C i motstrøm gjennom membranseparatoren med hastigheter 50 ml/min. (rørfase) og 120 ml/min.

(kappefase).

Periodisk prøvetagning av kappefasen ble foretatt på utstrømningen fra det annet enzym (E2), (fig. 9, prøve-åpning 56, før den gikk inn i "Dowex" 1 (Cl-)-kolonnen 54) og prøvene ble overvåket ved hjelp av HPLC ved å følge prosedyrene beskrevet i eksempel 5. Som forventet, ved dette punkt av kretsløpet (fig. 9) ble ikke noe L-phe som kunne resultere fra den enzymatiske hydrolyse av

L-phe-OMe av E2 (se eks. 8) detektert. Bare et sirkulerende stabilt nivå av N-formyl-(8-metyl)-asp-phe (gjennom-snittskonsentrasjon 54 mg/L) ble iaktatt og reflekterte den kontinuerlige overføring av dipeptidet N-formyl-(6-metyl-APM gjennom membranen og dets etterfølgende hydrolyse av E2 . Den effektive innfanging av det ladede bipeptid ved hjelp av "Dowex" 1. harpiks indikeres ved den lave konsentrasjon av dipeptidet iakttatt ved punkt A under hele forsøket. Et lignende parallellforsøk gjennomført i fravær av "Dowex" 1 resulterte i peptid i kappefasen, som kunne forventes fra resultatene drøftet i det foregående. Heller ikke her ble noe L-phe funnet i den sirkulerende kappefase. En sammenligning av begge forsøk sees i fig. 10 og tabell IX.

I tillegg til å separere fenylalanin lavere alkyl-ester

som også trenger gjennom den ioneavstøtende membran inn i produktblandingen under anvendelse av ionebytterharpikser som beskrevet i dette eksempel, kan aspartin-syre som også trenger gjennom den ioneavstøtende membran inn i produktblandingen separeres under anvendelse av slike harpikser. Species eller produkt som ikke kan diffundere tilbake gjennom membranen fra produktblandingen kan fjernes under anvendelse av slike ionebytterharpikser. Andre separasjonsmetoder kjent på området inklusive, men ikke begrenset til elektroforese, elektrodialyse og membranseparasjoner som er ekvivalenter ved ionebytter-harpiksseparasjoner kan også anvendes, ved den foreliggende oppfinnelse.

Immobilisering av det kondenserende enzym tillater at den enzymatiske reaksjon i rørfasen kan gjennomføres ved en initial pH i reaksjonsblandingen foretrukekt for optimal effektivitet av den enzymatiske reaksjon i betraktning av reaksjonskomponentene, produkter og enzym inklusive den ønskede likevekt av den enzymatiske reaksjon. Eventuelt kan den initiale pH i reaksjonsblandingen i rørfasen innstilles på nytt til en pH i den annen reaksjonsblanding før denne bringes i kontakt med membranen slik at pH i den annen reaksjonsblanding vil maksimalisere membranvirkningsgraden ved å transportere det uladede produkt fra rørfasen gjennom membranen inn i kappefasen. Fig . 9 viser ikke innstilling av pH i den initiale reaksjonsblanding i rørfasen til en pH i den annen reaksjonsfase.

Tilsvarende kan esterasen i kappefasen immobiliseres og

pH i produktblandingen i kappefasen kan innstilles og innstilles på nytt etter behov for å gjennomføre den mest effektive prosessgjennomføring. Eksempel 8 og det foregående eksempel tilveiebringer ytterligere midler for effektiv kontinuerlig eller porsjonsvis prosessgjennomføring

under anvendelse av den foreliggende oppfinnelse. Ved kontinuerlig prosessføring kan den ønskede enantiomer av reaksjonskomponenter og hvilke som helst forbindelser som trenger gjennom sammen med disse returneres til rørfasen eller reaksjonsblandingen.

Claims (8)

1. Fremgangsmåte for enzymatisk syntese av peptider, karakterisert ved trinnene med: en N-acyl-B-substituert-L-aspartinsyre med en cc-karboksylatgruppe kondenseres med en fenylalanin-lavere alkylester med en alfa-ammoniumgruppe, i en vandig reaksjonsblanding inkluderende et kondensasjonsenzym og danner derved N-acyl-L-aspartyl-(.B-substituert)-L-fenylalanin (lavere alkylester) i form av et uladet peptid, dette uladede peptid transporteres fra den vandige reaksjonsblanding gjennom en ioneavstøtningsmembran inn i en produktblanding ved osmose, idet membranen foretrukket omfatter en vannublandbar organisk væske immobilisert i porene av en mikroporøs membran, og det uladede peptid i produktblandingen omdannes til en ladet forbindelsesform som ikke kan tilbakediffundere gjennom membranen til den initiale reaksjonsblanding, idet omdannelsen av det uladede peptid foretrukket skjer ved enzymatisk spaltning.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at kondensasjonsenzymet er en peptiddannende protease som er aktiv ved pH-området omtrent 4,0 til 9,0.

3. Fremgangmsåte ^som angitt i krav 1, karakterisert ved at det uladede peptid omdannes til et ladet species ved spaltning med et esteraseenzym aktivt i et pH-område fra omtrent 6,0 til 9,0, og valgt fra gruppen bestående av aminoacylase I, a-chymotrypsin og subtilisin A.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at membranen omfatter en vannublandbar organisk væske som er immobilisert ved kapillarvirkning i porene av et mikroporøst ark, idet den organiske væske er et oppløsningsmiddel for det uladede peptid, det mikroporøse ark er fremstilt av et material valgt fra en gruppe bestående av polytetrafluoretylen og polypropylen og at løsningsmidlet omfatter minst en forbindelse valgt fra gruppen bestående av n-l-dekanol,.n-heksadekanol, n-dodekanol, N,N-dietyldodekanamid, dodekan, 2-undekan og blandinger derav.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at D,L-fenylalanin-metyl-ester kondenseres med N-acyl-B-substituert-L-aspartinsyre med en a-karboksylat-gruppe.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved at N-acyl-gruppen er valgt fra gruppen bestående av ØCH2OCO-, -CH=0 og ØCH2CO-, og B-substituenten er valgt fra gruppen bestående av ØCH2O-, ter-BuO-, CH3O-, NH2-.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved det ytterligere trinn med å separere N-acyl-^-substituert-L-aspartinsyre som også trenger gjennom den ioneavstøtende membran inn i produktblandingen og/eller fenylalanin-lavere-alkylester som også trenger gjennom den ioneavstøtende membran inn i produktblandingen .

8. Fremgangsmåte for enzymatisk separering av racemiske karboksylsyreforbindelser, karakterisert ved at den omfatter trinnene med: hydrolysering av en racemisk karboksylsyreester-forbindelse i en vandig reaksjonsblanding som inkluderer et hydrolyserende enzym for å danne en ladet enantiomer forbindelse og en uladet enantiomer esterforbindelse i den vandige reaksjonsblanding, og transportering av den uladede enantiomere ester-forbindelse fra den vandige reaksjonsblanding gjennom en ioneavstøtende membran inn i en produktblanding.