JP2520155B2

JP2520155B2 - 生体触媒を用いる反応方法およびその反応装置

Info

Publication number: JP2520155B2
Application number: JP63194010A
Authority: JP
Inventors: 哲也土佐; 勝瀬沼; 信行坂田; 紀之西村; 正勝古井
Original assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Current assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Priority date: 1988-08-03
Filing date: 1988-08-03
Publication date: 1996-07-31
Anticipated expiration: 2011-07-31
Also published as: JPH0242992A

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、酵素や微生物菌体のような生体触媒を基質
と反応させて種々の有用物質を製造する方法において、
該触媒反応を効率良く行う方法および該方法に用いるた
めの装置に関するものである。さらに詳しくは、本発明
は、限外濾過膜を併置した反応部と、生成物の分離機能
を備えた晶析部とで構成される反応装置を用い、反応混
合物を該装置に循環させて生成物を析出させ、分離する
ことにより、高い基質濃度の反応混合物から生成物を蓄
積させ、効率よく生体触媒反応を行う方法およびそのた
めの装置に関するものである。

［従来技術と解決すべき課題］酵素や微生物を触媒とする反応は、その高い基質特異
性により、常温、常圧の緩和な条件下で効率良く進むこ
とから、これらの生体触媒を用いて種々の有用物質を製
造する試みがなされている。これらの生体触媒を用いる
反応は通常、水溶液または水性懸濁液中で行なわれる
が、これら生体触媒は、高温等の苛酷な条件下では極め
て容易に失活してしまうので、反応後、生成物を懸濁状
の反応混合物から分離し、さらに生体触媒をその活性を
維持したままで回収して再利用することは極めて困難で
ある。従って、たとえ充分な活性が残っていても反応液
と一緒に捨てなければならず、極めて不経済であった。

近年、上記問題の解決策として、固定化生体触媒の利
用が高まっている。固定化生体触媒とは、生体触媒を、
適当な固体担体に吸着させるか、もしくは固体担体に包
括せしめてなる不溶性の触媒である。この固定化生体触
媒を用いた物質生産プロセスの利点として、生体触媒が
安定化されており、反応の連続操作が可能であること、
生成物と生体触媒との分離が容易であり、澄明な反応液
が得られること、生体触媒の反復利用が可能であること
等を挙げ得るが、他方、欠点として、固定化時に生体触
媒の一部変性および失活を免れ得ず活性が低下している
こと、また、このような生体触媒反応の反応性は基質濃
度に依存しているが、基質濃度を高くすると生成物が飽
和溶解度以上に生成し、触媒内部や表面に析出して反応
を円滑に行えなくなるという点が指摘される。即ち、多
くの固定化生体触媒反応では、蓄積できる生成物の濃度
は、それ自身の反応温度における飽和溶解度によって決
まるために、一般には飽和溶解度以上の生成物を得るこ
とができなかったのである。

このような状況下、固定化生体触媒反応での生産効率
を向上する手段として、基質や生成物等の低分子量物質
は透過させるが、生体触媒等の高分子量物質を透過させ
ないような膜を用いて生体触媒を隔離することにより、
全体として固定化生体触媒作用を発揮させ、生体触媒の
固定化操作に伴う活性の低下を防ぐ方法が提案されてい
る。しかしながら、この方法では、活性は充分に発現さ
れ得るが、安定性は従来の吸着法や包括法で調製された
固定化生体触媒の安定性に比べて低く、失活し易いため
に、回収再利用には不適当である。他方、本出願人は、
固定化生体触媒を用いる反応において、反応の進行と同
時に生成物の分離、精製を行うことにより、反応液中の
生成物濃度を高める方法を開示した（特開昭61−5789
号）。この方法によって、生成物の高濃度化は達成され
たが、固定化に伴う活性の低下という問題点は未解決の
ままであった。従って、本発明者らは、より効率のよい
生体触媒による反応方法を開発することを目的として鋭
意、研究を重ねてきた。

［課題を解決するための手段］本発明は、上記の様々な課題を解決するものであっ
て、生体触媒の活性を高く維持しつつ、固定化生体触媒
の機能を充分に発揮させ、高濃度の生成物を蓄積させて
効率よく反応させる方法および該方法に用いるための装
置を提供するものである。本発明方法は、生体触媒を透
過させない限外濾過膜（以下、UF膜と称する）を併置す
る反応部と、生成物の析出、分離機能を備えた晶析部と
からなる反応装置を用いることによって達成された。

即ち、本発明は、基質と生体触媒とを反応させて有用
物質を製造する方法において、反応混合物をUF膜に通し
て生成物に富む濾液を分離し、該濾液から生成物を析
出、蓄積させることを特徴とする方法、並びに該方法に
用いるための装置を提供するものである。

本発明方法は、たとえば、攪拌下、反応部の反応槽内
で基質と生体触媒とを反応させながら、これら出発物質
と生成物とを含有する反応混合物を循環させてUF膜に接
触させ、生成物に富む濾液を分離し、該濾液を、生成物
の溶解度が反応部での飽和溶解度よりも低くなるように
温度設定された晶析槽に送って析出させ、得られた生成
物を分離し、蓄積させた後、母液を再び反応部に戻して
再使用することで実施される。

本発明装置の反応槽に併置されるUF膜としては、生体
触媒である微生物細胞や酵素タンパク質の透過を妨げ、
低分子量の基質や生成物のみを透過させる適当な孔径の
細孔膜である限り、その種類に制限なく、平膜、中空糸
（ホローファイバー）膜等から任意に選択することがで
きる。しかしながら、分画分子量が約5,000〜50,000で
あって、単位体積当たりの透過面積が約２ないし30m²と
大きいホローファイバー型式の膜が好ましい。

反応槽としては、基質と生体触媒間の外部拡散抵抗を
除去するための機能を備えたものであればいずれの型式
のものであってもよく、適当な攪拌機の付いた攪拌槽
や、液流動用ポンプの付いた塔型式のものを用いること
ができる。

また、晶析槽としては、熱交換機能、固−液分離機
能、攪拌機能を有するものであれば、いかなる型式のも
のを選択してもよい。

上記の如く、本発明方法では、反応槽〜UF膜、および
UF膜〜晶析槽〜反応槽間に、反応液を循環させる。従っ
て、本発明装置は、これらの各部位を送液ラインで連結
すると共に、液を循環させるための循環ポンプを適宜配
設して構成されている。

本発明方法は、通常の生体触媒による反応に広く適用
可能である。そのような反応には、たとえば、トランス
アミナーゼのような酵素を粗酵素のまま、または精製酵
素として用いることができ、あるいは、トランスアミナ
ーゼ活性を有するパラコッカス・デニトリフィカンス
（Paracoccus denitrificans）IFO12442やエッシェリヒ
ア・コリ（Escherichia coli）PA501株（特願昭62−313
505号）の如き微生物細胞の培養液をそのまま、あるい
は濃縮精製した濃縮菌体として用いることもできる。こ
のような生体触媒は市販されているか、または調製可能
であるが、微生物細胞を用いるときには、反応液中に培
養液由来の來雑物が混入することを避けると共に、取り
扱いを容易にするために、培養液を1/5〜1/50程度に濃
縮精製したものを用いることが好ましい。

また、基質は、目的物質に対応するものが選択される
が、それが水溶性の場合には、適当に高濃度の水溶液と
して用い、難溶性であれば、懸濁液として用いる。反応
槽への添加は、最初に一括して加えるか、あるいは反応
中に数回に分けて加えるいずれの方法でもよい。生体触
媒反応が基質で阻害される場合には後者の方法が好まし
い。

本発明方法では、上記の如く、反応槽内の反応混合物
を循環させてUF膜に接触させ、生成物に富む濾液と生体
触媒を含有する反応液とを分離する。後者はそのまま反
応槽に戻されるが、前者の濾液を晶析槽に導き、該槽内
で生成物を析出させて分離した後、反応母液を反応槽に
戻す。この一連の反応機構を通して循環される反応液の
流速は、反応槽〜UF膜間では生体触媒がUF膜内に貯溜さ
れない程度であればよく、UF膜〜晶析槽〜反応槽間で
は、反応効率の観点から、UF膜の濾液中に基質が若干残
存している状態が得られる程度の流速とするのが好まし
い。

反応槽の温度は生体触媒の活性と安定性を維持するた
めに、通常、０〜60℃の範囲とするが、20〜45℃に設定
することが好ましい。

晶析槽の温度は、反応温度における生成物の飽和溶解
度よりも低い飽和溶解度を与える温度に設定することが
必要である。即ち、溶解度が温度上昇に伴って上昇する
物質の場合には、晶析槽の温度を反応槽の温度よりも低
くし、その逆の場合には高くすればよい。

次に、上記本発明方法の１実施態様を、図面に従って
説明する。

第１図は本発明の反応装置の該略ブロック図である。
反応槽（１）にはホローファイバー型のUF膜（２）が、
晶析槽（３）には濾過器（４）がそれぞれ併設されてお
り、これらの間にはポンプ（５）、（６）および（７）
が配設され、反応槽（１）からUF膜（２）には反応混合
物が、UF膜（２）から晶析槽（３）にはUF膜濾液が、そ
して濾過器（４）から反応槽（１）間には生成物分離後
の母液が夫々送液ライン（10）、（10′）、（10″）を
通って循環するように構成されている。反応槽（１）お
よび晶析槽（３）にはそれぞれ、攪拌機（８）および
（９）が設けられている。晶析槽（３）に併置される濾
過器（４）の形状および設置方法は特に限定されるもの
でなく、第１図に示すように、晶析槽（４）にオーバー
フロー管を付け、その管の出口に設置してもよいが、晶
析槽（３）の断面全域に吸引式の平板式濾過板を設置し
たり、あるいは、円筒式濾過板を晶析槽（３）内に浸漬
して設ける方法（第２図参照）でもよい。

本発明装置を用いて生体触媒反応を行うには、まず、
反応槽（１）に基質溶液または基質懸濁液と生体触媒を
入れ、反応混合物を攪拌機（８）で攪拌する。同時に、
反応混合物を、ポンプ（５）により送液ライン（10）を
経てUF膜（２）に導く。UF膜（２）がホローファイバー
膜であれば、循環液を膜の内、外いずれに導いてもよ
い。次いで、UF膜（２）を透過した濾液をポンプ（６）
によって抜き出し、送液ライン（10′）を経て晶析槽
（３）に送り込むと、反応生成物の溶解度が反応槽
（１）内におけるよりも低くなるように温度設定された
晶析槽（３）内で生成物は過飽和となり、析出する。生
成物が析出し、反応槽（１）内よりも低濃度で飽和され
たUF膜（２）濾液はオーバーフローして濾過機（４）に
入り、生成物が分離される。析出した生成物を晶析部に
残し、母液をポンプ（７）により送液ライン（10″）を
経て反応槽（１）に戻すと、該液は未飽和の基質を溶解
し、再度反応に供せられる。

基質が消耗されるまでこの操作を繰り返して行うと、
晶析部には懸濁状の生成物のみが蓄積されることにな
る。

第２図は他の実施例を示す図であって、第１図の反応
装置において、反応槽（１）が除かれている。この場合
には、基質を晶析槽（３）内に入れ、生体触媒をUF膜
（２）の空間の置いて、反応混合物を晶析槽（３）から
UF膜（２）に循環させて反応させる。この装置では、晶
析部［晶析槽（３）と濾過器（４）］の実効容積に対す
る反応部［UF膜（２）］の実効容積の比が小さいので、
反応液への生成物量の損失を少なくすることができる。

［実施例］以下に実施例および実験例を挙げ、本発明をさらに詳
しく説明する。

実施例１トランスアミナーゼ活性を有するDNA組換え
エッシェリヒア・コリPA501株によるフェニルピルビン
酸とＬ−アスパラギン酸からのＬ−フェニルアラニンの
生産（１）装置ホローファイバー型UF膜（旭化成、SIP1013、透過面
積0.2m²、分画分子量6000）の併置した反応槽（実効容
積0.55）と実効容積0.45の外浴付き晶析槽および円
筒型平板濾過器（直径8cmφガラスフィルター）を第１
図の様式で連結したものを用いる。

（２）生体触媒微生物細胞を次の如く調製した。

まず、グルコース0.2％、ラクトース１％、コーンス
チープリカー２％、ミーストN2％、グルタミン酸ナトリ
ウム0.5％、（NH₄）₂SO₄0.1％、K₂HPO₄0.7％、KH₂PO₄0.
3％、MgSO₄・7H₂O0.025％、カラリン0.03％を含む培地1
0（pH7.0）にDNA組換えエッシェリヒア・コリPA501株
（宿主：エッシェリヒア・コリHB101株；ベクター:pUC1
8;挿入DNA:パラコッカス・デニトリフィカンスのゲノム
DNAの一部）の前培養液0.1を植菌し、37℃で22h通気
攪拌培養した。

培養液を遠心分離して1/37に濃縮し、濃縮微生物細胞
を調製した。

（３）操作濃縮微生物細胞5g、フェニルピルビン酸ナトリウム
（１水塩）0.2mol、Ｌ−アスパラギン酸アンモニウム1.
625molを反応槽に充填し全量を0.97（pH8.0）とし
た。

反応槽の温度を30℃に設定し、攪拌を行うと同時に槽
内の基質と微生物細胞をUF膜の外側（シェル側）を循環
させた。

同時に、UF膜から濾液を0.5/hの流速で抜き出し、
５℃に設定した晶析槽に送り、晶析槽からのオーバフロ
ー液は濾過器を通して反応槽に戻した。

反応開始0.5時間後に反応槽に0.02molのフェニルピル
ビン酸ナトリウムを加え、以後0.5時間間隔で同量のフ
ェニルピルビン酸ナトリウムを加えて行き、7.5時間で
総量0.5molを仕込んだ。

24時間で反応を停止したところ、反応液中のフェニル
ピルビン酸は完全に消失し、0.486molのＬ−フェニルア
ラニンが生成していた。

生成したＬ−フェニルアラニンのうち57％は固相に、
残りの43％が液相に存在していた。

この固相のＬ−フェニルアラニンを濾別し、その時得
られた母液と洗滌液（0.985）に新たに濃縮微生物細
胞5gとフェニルピルビン酸ナトリウムを加え（初回0.05
mol、以後は0.5時間毎に0.02mol、総仕込量0.25mol）、
pHを8.0として24時間反応させ、１回目の反応と同様
に、蓄積したＬ−フェニルアラニンの結晶を濾別した。
この操作を合計３回行った（フェニルピルビン酸の総仕
込量1.25mol）ところ、生成したＬ−フェニルアラニン
は1.185mol（転換率94.5％）となり、このうち76.5％が
結晶として回収できた。

実施例２トランスアミナーゼ活性を有するパラコッカ
ス・デニトリフィカンスIFO12442によるフェニルピルビ
ン酸とＬ−アスパラギン酸からのＬ−フェニルアラニン
の生産（１）装置ホローファイバー型UF膜（アミコン社、HIP10−８、
透過面積0.083m²、分画分子量10,000）と実効容積0.17
の外浴付晶析槽とを第２図の様式に従って連結して用
いる。

（２）生体触媒微生物細胞を次の如く調製した。

まず、グルコース１％、（NH₄）₂HPO₄0.2％、ミース
トＮ（ビール酵母エキス）１％、コーンスチープリカー
１％、ペプトン0.5％、KH₂PO₄0.1％、MgSO₄・7H₂O0.05
％、カラリン0.03％を含む培地５（pH7.0）にパラコ
ッカス・デニトリフィカンスIFO12442の前培養液0.05
を植菌し、30℃で24時間通気攪拌培養した。培養液に１
％のセチルトリメチルアンモニウムブロマイドを0.05
添加し、30℃で0.5時間放置して微生物細胞の活性化を
行った後、遠心分離によって1/15に濃縮し、濃縮微生物
細胞を調製した。

（３）操作この濃縮微生物細胞16gに水を加えて全量を0.031と
し、30℃に保温したUF膜の外側空間部に充填した。他
方、晶析槽には、0.064molのフェニルピルビン酸ナトリ
ウム（１水塩）、0.204molのＬ−アスパラギン酸アンモ
ニウム、２×10^-5molのピリドキサル５′−リン酸（補
酵素）を充填し、水で全量を0.165とした。

晶析槽の温度を５℃に設定し、0.09/hの循環流速で
濾液循環を行い反応を開始した。反応開始2,3,および12
時間目にフェニルピルビン酸ナトリウムをそれぞれ0.03
1molずつ追加し、反応を続けたところ、25.5時間後フェ
ニルピルビン酸は完全になくなり、晶析槽にＬ−フェニ
ルアラニンの結晶が蓄積した。

フェニルピルビン酸のＬ−フェニルアラニンへの転換
率は92.4％で、そのうち65.5％が固相に、そして残りの
34.5％が液相に存在していた。

上記の実施例２で使用した生体触媒の固定化標品を用
い、従来の晶析槽を備えた装置、およびカラムを用いる
連続系で以下の実験例に従って反応を行い、その結果を
比較した。

実験例１（ａ）晶析槽を備えた装置を用いる方法実施例２−（２）で調製した濃縮微生物細胞をκ−カ
ラギーナンゲルで包括した固定化パラコッカスデニトリ
フィカンスを用いてＬ−フェニルアラニンのけん濁反応
を行った。

（１）装置実施例２の装置におけるUF膜に代えて、目皿式攪拌槽
型反応器（実効容積0.13）と実効容積0.325の晶析
槽を閉回路で連結（連結様式は第２図参照）したものを
用いた。

（２）固定化生体触媒固定化微生物細胞は次の如く調製した。

まず上記濃縮固定化微生物細胞80gに生理食塩水を加
えて全量を0.16として40℃に保温した。

これと別にκ−カラギーナン12.5gを含んだ45℃の溶
液0.207を用意し、両者を混合して10℃に冷却してゲ
ル化した。

得られたゲルの塊を２％塩化カリウム溶液に浸せき
し、10℃以下で一夜放置してから、平均粒径3m/mφに成
形し、成形品を２％塩化カリウム溶液で洗浄して標品と
した。

（３）操作上記（２）で調製した標品55gを反応槽に充填し、同
時に晶析槽には0.1molのフェニルピルビン酸ナトリウ
ム、0.45molのＬ−アスパラギン酸アンモニウム、4.5×
10^-5molピリドキサル５′−リン酸を充填し、全量を0.3
15（pH8.0）とした。

反応槽の温度を30℃、晶析槽の温度を５℃に調節して
濾液を1.16/hの流速で循環し反応を開始した。

反応開始5.5、30.5、47.5、および55.5時間目にフェ
ニルピルビン酸ナトリウムを0.05molずつ加えて反応を
続けたところ、95時間目にフェニルピルビン酸は完全に
なくなり、晶析槽にはＬ−フェニルアラニンの結晶が蓄
積した。

この場合、フェニルピルビン酸のＬ−フェニルアラニ
ンへの転換率は71.2％で、生成したＬ−フェニルアラニ
ンのうち、65.3％が固相に、残りの34.7％が液相に存在
した。

（ｂ）連続系による方法上記（ａ）−（２）で調製した固定化微生物細胞を用
い、連続系でＬ−フェニルアラニンの生産を行った。

（１）装置および操作使用した反応器は直径3cmφ、高さ25cmの外浴付円筒
カラムで、この中に固定化微生物細胞0.0685充填（充
填率0.585）した。

カラムを30℃に制御し、その中へフェニルピルビン酸
ナトリウム0.25M、Ｌ−アスパラギン酸アンモニウム0.3
25M、ピリドキサル５′−リン酸10^-4Mの基質溶液（pH8.
0）をポンプによって連続的に供給した。

流速が0.0076/h（平均滞留時間9h）の時、カラム出
口のフェニルピルビン酸の濃度は０であり、Ｌ−フェニ
ルアラニンの濃度は0.197Mであった。この値から、フェ
ニルピルビン酸のＬ−フェニルアラニンへの転換率は7
8.8％と計算される。

以上の実施例２および実験例（ａ）および（ｂ）の反
応で実際に蓄積したＬ−フェニルアラニンの濃度と、微
生物細胞当たりのＬ−フェニルアラニンの生産性をまと
めると第１表の如くとなった。

上記表より明らかな如く、本発明方法によれば従来の
晶析槽を併置した固定化生体触媒反応器や、カラム型反
応器による生産法よりも、高濃度のＬ−フェニルアラニ
ンを蓄積でき、生産性が向上される。

［発明の効果］上記の如く、本発明方法によれば、簡単な装置と操作
により、生体触媒が高活性を保った状態で、高濃度の基
質の存在下、生成物を高濃度に製造し、蓄積させること
ができる。従って、基質および生体触媒を無駄なく利用
し、効率よく反応を行うことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の実施例を示す装置の概略ブロック図、
第２図は他の実施例を示す装置の概略ブロック図であ
る。図中、（１）は反応槽、（２）はUF膜、（３）は晶析
槽、（４）は濾過器、（５）〜（７）はポンプ、（８）
および（９）は攪拌機、（10）、（10′）および（1
0″）は送液ライン。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献特開昭61−5789（ＪＰ，Ａ) 特開昭62−259576（ＪＰ，Ａ) 特開昭61−88872（ＪＰ，Ａ) 特開昭59−130180（ＪＰ，Ａ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】基質と生体触媒とを反応させて有用物質を
製造する方法において、反応混合物を限外濾過膜に通し
て生成物に富む濾液を分離し、該濾液から生成物を析
出、蓄積させることを特徴とする方法。
【請求項２】限外濾過膜を併置する反応槽からなる反応
部と、温度調節機構を備えた晶析槽に濾過器を併置して
なる晶析部とで構成された装置を用い、反応混合物を反
応槽から限外濾過膜に循環させて生成物に富む濾液を
得、該濾液を生成物の析出温度に設定した晶析槽に送っ
て生成物を析出させ、濾過器で分離した後、その母液を
反応槽に循環させることからなる請求項１に記載の方
法。
【請求項３】生体触媒がトランスアミナーゼであり、基
質がフェニルピルビン酸およびＬ−アスパラギン酸であ
り、生成物がＬ−フェニルアラニンである請求項１また
は２に記載の方法。
【請求項４】反応槽および生体触媒を透過させない限外
濾過膜からなる反応部と、温度調節機構を有する晶析槽
および濾過器からなる晶析部とを相互に連結してなるこ
とを特徴とする生体触媒反応用の装置。