JP2804247B2 - 固定化生体触媒を用いる反応方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は酵素、微生物菌体な
どの生体触媒に基質を反応させて種々の有用物質を製造
する方法において、反応を効率よく実施するための方法
および装置に関するものである。さらに詳しくは、本発
明は機能を失いやすい生体触媒含有限外ろ過膜を使用す
る固定化生体触媒反応において、膜活性を低下させるこ
となく、高濃度の基質から高濃度の生成物を蓄積させる
反応方法とそのための装置に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】酵素、微生物菌体などの生体触媒は高い
基質特異性を有するため、常温常圧などの緩和な条件下
で効率よく触媒反応が進むことから、近年種々の有用物
質の生産に利用されており、たとえば、生体触媒を用い
る反応を均一相で行なったのち、反応液から限外ろ過膜
で生体触媒を回収する方法が考案されていた（特開平２
−４２９９２号）。しかしながらこれら生体触媒は容易
に失活するため、反応液から分離し、かつ変性させずに
回収し再利用することはきわめて困難であり、経済的に
問題があった。さらに、生体触媒はたんぱく質でできて
いるため、熱、酸、アルカリおよび有機溶媒中では不安
定であり、そのまま溶媒に添加して用いるばあいは、通
常水系の溶媒中で用いられるのみであり、応用範囲が限
られていた。

【０００３】近年、これら生体触媒に関する問題を解決
すべく、生体触媒を適当な担体に吸着させたり適当な担
体で包括させることにより不溶性の状態とし、反応液か
らの分離が容易で、かつ安定化された固定化生体触媒が
開発された。

【０００４】物質生産プロセスにこのような固定化生体
触媒を用いるばあい、生体触媒が安定化されているため
反復利用が可能となり、反応液を触媒から分離するのが
容易であるため澄明な反応液がえられ、反応後の後処理
が容易になった。そして、生体触媒の固定化が触媒自身
の安定性を向上させるという点に着目し、最近有用物質
生産のための反応を有機溶媒系で操作することも頻繁に
試みられるようになっている。

【０００５】これらの固定化生体触媒を利用した方法の
なかで、近年、酵素を反応器内で保持でき、しかも油相
と水相を用いて反応を進めるばあいにも、液々分離のた
めの遠心分離機などを付設する必要のない方法が注目さ
れている。すなわち、精密ろ過膜（ＭＦ膜）や限外ろ過
膜（ＵＦ膜）などの製膜および膜応用技術の発展と関連
して、生体触媒をこれらの膜と組合わせて使用し、生体
触媒反応を行なわせる方法であり、油脂の加水分解反応
などに適用する方法が開発されている（バイオサイエン
スとインダストリー、第４７巻、１７頁（１９８
９））。膜を用いるこれらの方法においては、生体触媒
は膜に吸着させるなどして用い、たとえば、生体触媒含
有限外ろ過膜を使用する方法が特表昭６３−５０１６１
２号、特表平２−５０２８７５号および国際公開公報Ｗ
０９０／０４６４３号明細書に開示されている。これら
の方法は酵素の再利用、副生成物の除去などの点におい
てすぐれたものである。

【０００６】しかしながら、これら膜を用いる方法で
は、膜の内部および表面に生成物などの結晶が析出する
と、円滑な反応がいちじるしく阻害されるという問題が
ある。したがって、反応は通常溶液の状態で行なわれる
ため、従来の方法では蓄積できる生成物の濃度に限界が
あり、一般には反応温度におけるそれ自身の飽和溶解度
が蓄積できる上限濃度となる。もしも、高濃度の生成物
をえるために反応系を生成物の飽和溶解度以上で操作し
ようとすれば、反応液中に結晶が析出し、前述したよう
に膜機能の低下をきたすことになる。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らはかかる実
情に鑑み、生体触媒の活性を維持し、生体触媒反応の応
用範囲を広げるために生体触媒を限外ろ過膜に固定化し
ながらも、生成物などの結晶化により機能を失い易い膜
の機能を保って反応を効率よく実施して、高濃度の目的
物をえるための方法および装置を提供することを目的と
する。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は生体触媒含有限
外ろ過膜を用いて基質と生体触媒とを反応させ有用物質
を製造する方法において、ろ過機能を併有する温度調節
可能な晶析槽で生成物に富む反応液から生成物を晶析・
分離したのち、その母液を基質の溶媒として循環させる
ことを特徴とする方法および生体触媒含有限外ろ過膜を
併有する反応槽からなる反応部およびろ過機能を併有す
る温度調節可能な晶析槽からなる晶析部を相互に連結し
てなることを特徴とする生体触媒反応用の装置に関す
る。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明の方法は基質をＵＦ膜に固
定化した生体触媒と接触させることにより反応を進め、
生成物の析出温度に設定した晶析槽で生成物に富む反応
液から生成物を結晶化させ、ろ過により結晶を分離した
のち、未反応の基質を含有する母液に基質を添加して基
質濃度を上げたうえで、反応させる操作をくり返し行な
い、その一方で、反応により副生した不純物をＵＦ膜を
通して除去しながら反応を続けることにより、高濃度に
仕込んだ基質を高濃度の生成物に転換させるものであ
る。

【００１０】本発明で使用するＵＦ膜は有機溶媒に対す
る耐性があり、かつ、酵素や微生物細胞などの生体触媒
および基質や生成物を透過させず、低分子量の分解物や
不純物などのみを透過させる適当な孔径の細孔膜であ
り、さらに単位容積当りの表面積（比表面積）が大き
く、生体触媒を高濃度に吸着でき、安定化できるもので
あればいずれのものでもよいが、膜の比表面積が０．１
〜１００ｃｍ² ／ｃｍ³ であり、好ましくは１０〜５０
ｃｍ² ／ｃｍ³ であるものが好適である。このような膜
としては、平膜、プリーツ膜、スパイラル膜、ホローフ
ァイバー膜、円筒状膜などいずれの型式のものでもよい
が、比表面積の大きいホローファイバー型のものが適し
ている。具体的にはポリスルホン、ポリアクリロニトリ
ルなどの各種合成高分子膜、あるいは多孔質カーボン、
多孔質ガラスなどの無機膜などがあげられるが、たとえ
ば、反応が後述のエポキシ体の不斉加水分解などのばあ
いには、米国セプラコール社の親水性ポリアクリロニト
リル膜が好適である。

【００１１】晶析槽は熱交換機能、ろ過機能を有するも
のであればいかなる型式のものであってもよく、撹拌機
能を併有していてもよい。ろ過器としては、生成物の結
晶を通過させずにろ液がえられる細孔を有するろ材で、
有機溶媒に対する耐性のすぐれた素材であればいかなる
ものであってもよく、たとえばガラスフィルター、焼結
合金フィルターなどが好ましい。またろ過器の形状はと
くに制限はなく、平板、円筒、ヒダ状など必要なろ過面
積に合わせて適当に選べばよい。

【００１２】本発明の方法は通常の生体触媒を用いる反
応に広く適用でき、生体触媒としては、限外ろ過膜に固
定化できるものであれば、リパーゼ、エステラーゼ、ペ
プチダーゼ、オキシダーゼ、リダクターゼなどをいずれ
も使用できるが、とりわけリパーゼ、エステラーゼを用
いるのが好ましい。また、市販されている粗酵素、精製
酵素を適宜使用しうるが、微生物培養液を用いるばあい
には、培養工程での夾雑物を除くため、精製、濃縮した
ものを用いるとよい。これら生体触媒は、一般には適当
な緩衝液で希釈したのち、限外ろ過することにより、物
理的にあるいは適当な化学結合を使って化学的に膜内お
よび膜表面に固定化することができる。

【００１３】基質は目的生成物に対応するものを選び、
溶液状態で生体触媒含有限外ろ過膜と接触させる。基質
としては生体触媒の活性を阻害せず、目的物は限外ろ過
膜を通過して除去されることがなく、一方、副生物のみ
が限外ろ過膜を通過して除去されるものであれば、いか
なるものであっても使用することが可能であり、たとえ
ば、３−（４−メトキシフェニル）または３−（４−メ
チルフェニル）グリシッド酸エステルのラセミ体を好適
に使用することができる。基質を晶析後の母液に添加す
る方法に制限はなく、晶析槽に一括して添加してもよ
く、基質阻害のある反応や基質自身が不安定なばあいに
は、反応の進行に応じて分割して添加してもよい。

【００１４】本発明の基質を溶解する溶媒は、限外ろ過
膜の材質を溶解せず、生体触媒の活性を阻害せず、水と
混和しない有機溶媒であればよく、基質の種類により、
溶解度、安定性などを考慮して、適宜選択することがで
きるが、たとえば、酢酸エチル、酢酸ブチルなどのエス
テル系溶媒、アミルアルコールなどのアルコール系溶
媒、ジエチルエーテル、ジメチルエーテル、ジイソプロ
ピルエーテルなどのエーテル系溶媒、メチルイソブチル
ケトンなどのケトン系溶媒、ベンゼン、トルエン、キシ
レンなどの芳香族炭化水素、四塩化炭素、クロロホル
ム、ジクロロメタン、トリクロロメタンなどのハロゲン
化炭化水素、ヘプタンなどの脂肪族炭化水素をいずれも
好適に使用することができる。

【００１５】一方、副生物を限外ろ過膜を通して除去す
るために用いる溶媒としては、これら有機溶媒と混和せ
ず、生体触媒を固定化した限外ろ過膜に悪影響を及ぼさ
ないもののうちから、副生物の溶解度の高いものを適宜
選択することができるが、とりわけ、水、生体触媒の適
性ｐＨに調整した緩衝液などを好適に使用することがで
き、これらに副生物の除去を促進する薬物を混入しても
よい。また、副生物としてアルデヒド化合物が生じるば
あいには、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウムなどの亜
硫酸イオン供与体を添加し、アルデヒド化合物による生
体触媒の失活を防ぐのが好ましい。

【００１６】本発明の方法では、基質溶液を生体触媒含
有ＵＦ膜に接触させ、膜を通して副生物を除去しなが
ら、生成物に富む反応液を晶析槽に導き、該槽内で生成
物を析出させて分離したのち、反応母液すなわち未反応
基質を含有するろ液に基質を添加して、基質溶液として
循環させる。

【００１７】この際の操作温度は限外ろ過膜に固定化し
た生体触媒の活性を保持するために通常０〜６０℃であ
ればよいが、とりわけ１０〜４０℃程度が好適である。

【００１８】また、晶析槽の温度は、反応温度における
生成物の飽和溶解度よりも低い溶解度を与える値に設定
する必要があり、溶解度が温度とともに上昇するばあい
には晶析槽は主反応槽よりも低い温度に設定し、逆のば
あいは高い温度に設定すればよい。

【００１９】かかる本発明の方法は、酸化、還元、加水
分解、転移、異性化などの一般的な生体触媒を用いる反
応に適用することができるが、加水分解を用いるラセミ
体基質の光学分割にとりわけ好適に適用することができ
る。

【００２０】また、本発明の方法は、生体触媒含有限外
ろ過膜でえられる反応液を反応槽に導き、反応槽から生
成物に富む反応液の一部を抜き出し、温度調節可能な晶
析槽へ導いて生成物を晶析させ、ろ過した後、母液に基
質を添加して反応槽に戻すことにより実施することもで
きる。

【００２１】反応槽は外部拡散抵抗が除去できる機能を
有しておればどのような形式のものでもよく、適当な撹
拌機付の撹拌槽やポンプを併置する塔形式のものを用い
ることができる。かかる反応槽を設けることにより、生
成物の晶析に時間を要するばあいにも基質濃度が均一な
基質溶液を容易に短時間でえることができるため、生体
触媒含有限外ろ過膜に高濃度の基質溶液を高流速で連続
的に供給し、生体触媒反応の効率を高めることができ
る。また、生体触媒反応の反応時間を短縮することもで
きるため、経時的な生体触媒の失活および基質の化学的
な分解を抑えて生産性を上げることもできる。

【００２２】晶析槽と反応槽の間の循環は、連続的ある
いは断続的に行えばよいが、反応槽から抜き出した反応
液を流入させた晶析槽全体の温度を適切な温度に調節
し、生成物を晶析させるため、晶析槽内でのショートパ
スを避ける必要があり、断続的に循環させるのが好まし
い。また、このばあいの流速はとくに制限されないが、
効率よく生体触媒による反応を進行させるために、生体
触媒含有限外ろ過膜に接触させる基質の濃度が低下しな
いように、反応槽の基質濃度が高く保てるような流速で
晶析槽から基質を添加した母液を反応槽に循環させるの
がよい。

【００２３】なお、本発明の方法を実施するに際して
は、必要であれば、ＵＦ膜を通して除去された副生物を
回収するために、反応槽以外に副生物を蓄積する副反応
槽を備えていてもよい。

【００２４】つぎに本発明の方法および装置の一実施態
様を図面にしたがって説明する。

【００２５】図１は本発明の反応の反応装置の概略ブロ
ック図である。反応部はＵＦ膜１と、流路がそのＵＦ膜
の外側（シェル側）に連結される反応槽２と、ＵＦ膜の
内側（ルーメン側）に連結される副反応槽３とから構成
されており、それぞれの反応槽とＵＦ膜間には反応混合
物循環用のポンプ４および５が設置されている。

【００２６】また、ＵＦ膜シェル側の出口には生体触媒
が膜から脱離するのを抑制する目的で系内を一定の加圧
状態に保持する保圧弁６が設置されている。

【００２７】晶析部は晶析槽７からなり、晶析槽７内に
はろ過板８が併置され、反応槽２との間にはろ液循環ポ
ンプ９が介装されている。また、反応部と晶析部は反応
槽２から反応混合物が流出する流路１０とろ液流路１１
で連結されており、反応槽２、３および晶析槽には撹拌
機１２、１３および１４がそれぞれ設置されている。

【００２８】本発明装置を用いて反応を行なうには、ま
ず反応槽２に生体触媒を含有する水溶液を充填し、ポン
プ４を使って該溶液を循環させながらシェル側からルー
メン側に向けての限外ろ過を行ない、生体触媒を膜の細
孔および表面に固定化する。この際、生体触媒の洗浄が
必要なばあいは蒸留水または適当な緩衝液で同様の操作
を行ない洗浄する。さらに、基質が水に不安定なばあい
には反応前にシェル側の水滴を除去しておく必要から、
基質を溶解する溶媒で同様の操作を行ない、水分のみを
ルーメン側に除去するのが好ましい。

【００２９】つぎに晶析槽７に基質を溶液状態またはけ
ん濁状態で仕込み、撹拌機１４で撹拌しながら所望の温
度に調整する。このとき反応槽２に反応溶媒を、また反
応で分解した副生物を膜を通して除去するために反応槽
３に水、緩衝液、あるいは副生物の膜透過を促進する薬
液を充填しそれぞれ目的の温度に設定する。温度が一定
になったことを確認したのち、ポンプ４および５を作動
させ循環を開始する。同時にろ液循環ポンプ９を作動さ
せ、ろ液流路11を通して基質を反応槽２に送り込む。し
たがって、基質はポンプ４によりさらに生体触媒含有ろ
過膜に接触せしめられることになり反応が開始する一
方、反応槽２からの生成物に富む流出液は流路１０を通
して晶析槽に戻される。晶析槽は生成物の溶解度が反応
温度での飽和溶解度よりも低い値を与えるように温度設
定してあるために、晶析槽に戻された反応混合物は過飽
和になった生成物を析出し、未飽和状態にある基質のみ
を溶解する。このため、晶析槽では生成物がろ取され、
ろ液は未反応の基質を含有する母液として流路１１を通
り再び反応槽２に戻される。

【００３０】また、ポンプ５により循環される副反応槽
３では、水、緩衝液あるいは不純物の膜透過性を促進す
る薬液が、生体触媒含有限外ろ過膜と接して副生した不
純物を効果的に蓄積し、必要に応じてこの副生物を回収
することができる。この操作を基質が消耗するまで続け
ると、最終的に晶析槽には高濃度の生成物のみを含有す
る懸濁液がえられる。

【００３１】つぎに実施例をあげて本発明を詳しく説明
するが、本発明はかかる実施例のみに限定されるもので
はない。

【００３２】

【実施例】

実施例１ リパーゼＯＦ−３６０を用いるラセミ型３−（４−メト
キシフェニル）グリシッド酸メチルエステルからの光学
活性３−（４−メトキシフェニル）グリシッド酸メチル
エステルの生産 (1) 反応装置 以下の容量のものを図１にしたがって連結した装置に用
いた。

【００３３】ＵＦ膜(1) ：ホローファイバー型（米国セ
プラコール社製、ＭＢＲ−５００システム；有効膜面積
０．７５ｍ² 比表面積３０ｃｍ² ／ｃｍ³、ファイバー
径０．２／０．３ｍｍ^φ、分画分子量５０，０００；材
質ポリアクリロニトリル） 反応槽Ｉ(2) ：実効容積０．２５リットル 反応槽II(3) ：実効容積１２．７リットル 晶析槽(7) ：実効容積１．２５５リットル ろ過器：直径１０ｃｍのガラスフィルター (2) 生体触媒 リパーゼＯＦ−３６０（名糖産業、キャンディダシリン
ドラシア（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）
由来） (3) 操作 リパーゼＯＦ−３６０ １０ｇを０．２Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０；１リットル）に室温下けん濁溶解し、遠
心機によって不溶物と上清に分離した。上清１リットル
を温度２０℃に設定した反応槽２に充填し、ポンプ４を
使ってシェル側からルーメン側へ液を透過させた。つぎ
に蒸留水１リットルで同様の操作を行ない膜を洗浄し
た。さらにトルエンを用いて同様の操作を行ないシェル
側に残存する水滴を完全にルーメン側へ排出させ固定化
を終了した。晶析槽７にトルエン０．８リットル、ラセ
ミ型３−（４−メトキシフェニル）グリシッド酸メチル
エステル（以下ラセミ体と称す）４８７．５ｇ（２．３
４ｍｏｌ）を充填し、撹拌下、温度１０℃に保持した。
このとき反応槽３には反応の分解物を膜を通して効果的
に除く目的で、２％亜硫酸水素ナトリウム溶液を１２．
７リットル充填し、撹拌下２０℃に保持した。

【００３４】反応槽Ｉ、ＩＩおよび晶析槽の温度が設定
値に達していることを確認したのち、ポンプ４、５、９
の順に作動させ、反応を開始した。この際、膜のシェル
側がルーメン側よりも０．３ｋｇ／ｃｍ² の陽圧になる
ように、保圧弁６を設定した。

【００３５】また、ろ液循環ポンプ９は１５リットル／
時間の流速で２分作動、１分停止の断続運転とした。反
応中、分解物の蓄積によって反応槽３のｐＨが若干変動
するため、１０Ｎの硫酸および水酸化ナトリウムを添加
してｐＨ８．５に保持した。反応開始４３時間後、ポン
プ循環をやめ反応を停止させたところ、トルエン相に光
学活性３−（４−メトキシフェニル）グリシッド酸メチ
ルエステル（（２Ｒ、３Ｓ）体、以下ｌｅｖｏ体と称
す）が２１５．９ｇ、その対掌体（（２Ｓ、３Ｒ）体、
以下ｄ体と称す）が１７．６ｇ残存し、このうち９４ｇ
が晶析槽に結晶として回収された。この結晶の光学純度
は９９．８％であった。

【００３６】比較例１（実施例１の対照実験） (1) 反応装置 反応槽２の代わりに実効容積０．９５リットルの槽を用
い、晶析槽を使用しなかった以外はすべて実施例１と同
様の装置を用いた。

【００３７】(2) 生体触媒 実施例１で使用したものと同等品を使用した。

【００３８】(3) 操作 実施例１と同様の条件で生体触媒を固定化したのち、反
応槽２にラセミ体２３９．６ｇ、トルエン０．９４リッ
トルを充填し、副反応槽３には、２％亜硫酸水素ナトリ
ウム溶液（６．２リットル；ｐＨ８．５）を充填し、シ
ェルおよびルーメン側の循環によって完全な溶液状態で
の反応を開始した。２３時間後反応を停止したところ、
トルエン相にｌｅｖｏ体が９７ｇ、ｄ体が６ｇ残存し
た。

【００３９】実施例１および比較例１の成績をまとめる
と表１の結果となった。

【００４０】

【表１】

【００４１】上表より明らかなように、本発明の方法で
は従来の方法の約２倍濃度のlevo体が蓄積でき、生産性
も向上した。

【００４２】実施例２ (a) セラチアマルセッセンスのエステラーゼを用いるラ
セミ型３−（４−メトキシフェニル）グリシッド酸メチ
ルエステルからの光学活性３−（４−メトキシフェニ
ル）グリシッド酸メチルエステルの生産 (1) 反応装置 実施例１の装置を用いた。

【００４３】(2) 生体触媒 セラチアマルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃ
ｅｓｃｅｎｓ）Ｓｒ４１（ＦＥＲＭ Ｂｐ−４８７）の
エステラーゼはつぎの手順で調製した。まず、ミースト
（アサヒビール株式会社製）Ｓ２％、リン酸１カリウム
０．２％、硫酸アンモニウム０．２％、硫酸マグネシウ
ム０．０５％、硫酸第１鉄０．００１％、カラリン（三
洋化成工業株式会社製）０．２％、スパン（Ｓｐａｎ）
８５（日本油脂株式会社製）１．５％、パインデックス
（＃３、松谷化学株式会社製）１％の培地（ｐＨ７．３
〜７．５）１８リットルにセラチアマルセッセンスを植
菌し、２５〜２６℃で２９時間好気的に培養した。培養
中、栄養源としてＬ−プロリンを最終濃度１．５％の条
件で連続的に添加した。培養液は精密ろ過膜によって菌
体を除去し、さらにＵＦ膜によって約１／１０液量まで
濃縮して濃縮酵素標品をえた。

【００４４】(3) 操作 上記濃縮酵素標品３０ｍｌ（エステラーゼ活性０．１２
２×１０⁶ Ｕ）を蒸留水で１リットルに希釈し、実施例
１に記載の方法でＵＦ膜に固定化した。晶析槽にラセミ
体６３５．７ｇ、トルエン０．８リットルを充填し、同
時に副反応槽３には２％亜硫酸水素ナトリウム溶液（ｐ
Ｈ８．５；１６．７リットル）を充填して反応を開始し
た。２２時間後反応を停止したところ、トルエン相にｌ
ｅｖｏ体２９１．８ｇ、ｄ体８．９ｇが残存し、このう
ち２０８ｇが晶析槽に結晶として回収でき、結晶の光学
純度は１００％であった。

【００４５】(b) ラセミ体の分割添加による生産 実施例２(a) と同様の手段で調製した反応装置を用い、
ラセミ体の総仕込量２８３６．２ｇの条件で反応させ
た。最初、晶析槽にラセミ体６３５．７ｇ、トルエン
０．８リットルを、反応槽３には２％亜硫酸水素ナトリ
ウム溶液（ｐＨ８．５；１６．７リットル）を充填し、
２２時間反応させたのち、晶析槽の結晶を全量抜き出
し、母液に新たにラセミ体７８２．４ｇを添加した。同
時に反応槽２の分解物を含んだ溶液は廃棄し、新たに２
％亜硫酸水素ナトリウム溶液２１リットル（ｐＨ８．
５）を充填して２６．５時間反応させた。さらにラセミ
体６３５．７ｇ、２％亜硫酸水素ナトリウム溶液２１リ
ットルで２５．５時間、ラセミ体７８２．４ｇ、２％亜
硫酸水素ナトリウム２１リットルで４０．５時間同様の
操作を行ない、延べ１１４．５時間で反応を終了した。
このとき、回収した結晶は１３８１．６ｇで、光学純度
は８０．１％であった。また、最終母液には、ｌｅｖｏ
体が１３４．８ｇ、ｄ体が９７．９ｇ残存した。

【００４６】比較例２（実施例２の対照実験） 比較例１と同様の装置にセラチアマルセッセンス濃縮酵
素標品１５．８ｍｌ（エステラーゼ活性０．０６４×１
０⁶ Ｕ）を固定化し、ラセミ体２３９．６ｇ、トルエン
０．９４リットルを反応槽２に２％亜硫酸水素ナトリウ
ム溶液（６．２リットル；ｐＨ８．５）を反応槽３に充
填して反応を開始した。１６時間後反応を停止したとこ
ろ、トルエン相にｌｅｖｏ体１０１．８ｇ、ｄ体１１．
２ｇが残存した。

【００４７】実施例２および比較例２の成績をまとめる
と表２の結果となった。

【００４８】

【表２】

【００４９】上表より明らかなように、本発明の方法で
は、分割添加によりみかけの値で、従来の方法の約９．
８倍の濃度のｌｅｖｏ体が蓄積できた。

【００５０】実施例３ セラチアマルセッセンスのエステラーゼを用いるラセミ
型３−（４−メトキシフェニル）グリシッド酸メチルエ
ステルからの光学活性３−（４−メトキシフェニル）グ
リシッド酸メチルエステルの生産（反復実験） (1) 反応装置 実施例１の装置を用いた。

【００５１】(2) 生体触媒 実施例２で使用したものと同等品を使用した。

【００５２】(3) 操作 実施例２と同様の方法で濃縮酵素標品２６ｍｌ（エステ
ラーゼ活性０．１０６×10⁶ Ｕ）を膜に固定化した。晶
析槽にラセミ体７３３．５ｇ、トルエン０．８リットル
を充填、副反応槽３には２％亜硫酸水素ナトリウム溶液
１９．２リットルを準備し、反応を開始した。このと
き、ろ液循環ポンプは１８リットル／時間の流速で２分
作動、２分停止の断続運転を行なった。２２．５時間後
反応を停止し、晶析槽の結晶を抜き出すとともに、母液
に１回目と同量のラセミ体を仕込み、また副反応槽３に
は新規に２％亜硫酸水素ナトリウム（２１リットル；ｐ
Ｈ８．５）を準備し、反応を開始した。２７時間後反応
を停止し、結晶を回収するとともに、母液は廃棄した。
１回目の反応と同量のトルエンおよびラセミ体を用い、
２回に１度母液を廃棄する方法で延べ６回の反応を操作
した。

【００５３】反応の成績をまとめると表３の結果となっ
た。

【００５４】

【表３】

【００５５】上表に示すように、反復回数の増加ととも
に酵素活性が低下し、操作時間が延長したが、高純度の
ｌｅｖｏ体が好収率で取得できた。

【００５６】

【発明の効果】本発明の方法によれば、簡単な装置と操
作により、生体触媒含有限外ろ過膜の内部および表面に
おける生成物の結晶析出を生じさせず生体触媒の活性を
長時間保った状態で、生成物を高濃度で効率的に製造
し、蓄積させることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の装置の一実施例を示す概略ブロック図
である。

【符号の説明】

１ ホローファイバー型生体触媒含有限外ろ過膜 ２ 主反応槽 ３ 副反応槽 ４、５ 反応混合物循環ポンプ ６ 保圧弁 ７ 晶析槽 ８ ろ過板 ９ ろ液循環ポンプ １０ 反応混合物流出流路 １１ ろ液流路 １２、１３、１４ 撹拌機

フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12M 1/00 - 3/10 C12P 1/00 C12P 41/00

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 生体触媒含有限外ろ過膜を用いて基質と
   生体触媒とを反応させて有用物質を製造する方法であっ
   て、副生した不純物を生体触媒含有限外ろ過膜を通して
   取り除きながら反応を行い、ろ過機能を併有する温度調
   節可能な晶析槽で生成物に富む反応液から生成物を晶
   析、分離したのち、その母液を基質の溶媒として循環さ
   せることを特徴とする方法。
2. 【請求項２】 生体触媒含有限外ろ過膜を併有する反応
   槽からなる反応部およびろ過機能を併有する温度調節可
   能な晶析槽からなる晶析部により構成される装置を用
   い、反応槽から生成物に富む反応液の一部を抜き出し、
   生成物の析出温度に設定した晶析槽に移送して生成物を
   晶析させ、ろ過により分離後、その母液に基質を添加
   し、反応槽に戻して反応させる一連の操作を繰り返し、
   晶析槽に懸濁状の生成物を蓄積させることを特徴とする
   請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 生体触媒がエステラーゼ、リパーゼまた
   はこれらを含む微生物培養液であり、限外ろ過膜がホロ
   ーファイバー膜である請求項１または２記載の方法。
4. 【請求項４】 反応溶媒として有機溶媒を使用する請求
   項１、２または３記載の方法。
5. 【請求項５】 基質が３−（４−メトキシフェニル）グ
   リシッド酸エステルのラセミ体であり、生成物が光学活
   性体である請求項１、２、３または４記載の方法。
6. 【請求項６】 生体触媒がエステラーゼ、リパーゼまた
   はこれらを含む微生物培養液である請求項１または２記
   載の方法。
7. 【請求項７】 限外ろ過膜がホローファイバー膜である
   請求項１または２記載の方法。