JPH0545236B2

JPH0545236B2 -

Info

Publication number: JPH0545236B2
Application number: JP62047447A
Authority: JP
Inventors: Masahiko Ishida; Tetsuo Yamaguchi; Toshiki Mutsukushi; Jusaku Nishimura; Setsuo Saito
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1987-03-04
Filing date: 1987-03-04
Publication date: 1993-07-08
Also published as: JPS63214188A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、アミノ酸脱炭酸生成物の製造方法に
係り、特にＬ−グルタミン酸から固定化Ｌ−グル
タミン酸脱炭酸酵素により脱炭酸生成物を得るに
好適な製造方法に関する。〔従来の技術〕アミノ酸の脱炭酸生成物、例えばγ−アミノ酪
酸は医薬用に使用されており、現在化学合成法に
より製造されている。本発明者らは、酵素反応を利用した実用性の高
い製造方法、すなわち、高濃度でかつ純度の高い
脱炭酸生成物を含む反応液を得ることができる製
造方法の発明を目的とし研究した。酵素によるアミノ酸の脱炭酸反応の存在は、す
でに知られており、各反応に対応する酵素のいく
つかは植物及び微生物から分離されている。これ
らについては、ジヤーナル・バイオロジカル・ケ
ミストリー、第206巻（1954年）p215〜219、ジ
ヤーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第
235巻（1960年）p1649〜1652、ジヤーナル・バ
イオロジカル・ケミストリー、第235巻（1960年）
p1653〜1657、バイオケミカル・ジヤーナル、第
62巻、p301〜303（Journal Biological
Chemistry、206、p215、1954年、p215〜219、
Journal Biological Chemistry.235．、1960年、
p1649〜1652、Journal Biological Chemistry、
235．、1960年、p1653〜1657、Biochemical
Journal.62、p301（1956年））において論じられて
いる。〔発明が解決しようとする問題点〕しかし、これらの酵素は作用PH域が狭く、か
つ、脱炭酸生成物は水への溶解性が極めて高く、
吸湿性で結晶化しにくい。さらに、公知の方法
は、希薄な基質濃度でかつPH緩衝液存在下でのみ
行つており、反応後、大がかりな濃縮操作や、化
学合成法と同様に反応後のPH緩衝剤や中和剤を除
去し生成物を分離精製することが必要である。本発明者らは、酵素を溶液状態で、かつ高濃度
の基質溶液と、緩衝液の存在下や中和剤の添加な
しに接触させ、脱炭酸反応を試みた。しかし、上
記条件下では、酵素は高濃度基質阻害作用を受
け、かつ、反応開始時のPHが好適PH域にないた
め、酵素が失活し、第１図に示すように、反応速
度が低下し、効率よく反応させることが困難であ
ることがわかつた。〔問題点を解決するための手段〕そこで、本発明者らは、PH緩衝液や中和剤の添
加なしに、高濃度の脱炭酸アミノ酸の溶液を得る
方法について鋭意検討した。その結果、アミノ酸脱炭酸酵素を固定化するこ
とにより、上記高濃度基質阻害作用が軽減し、か
つ、反応PHが好適域からある程度はずれていても
失活しにくく、PH安定性が増加することを見い出
した（第２図）。固定化しないフリーの酵素を用
い、第３図に示すように緩衝液や中和剤を添加せ
ずに反応進行に伴う反応液のPH変化を監視しなが
ら、原料アミノ酸を好適PH域になるように半連続
的に供給すれば反応をある程度の期間継続でき
る。しかし、PHの変化によりやがて酵素が失活
し、反応が停止してしまう。しかし、PH変化に対
しさらに安定な固定化酵素を使用することによ
り、第４図に示すように反応を継続的に行えるこ
とを見い出した。本発明は、上記新規な知見に基づいて、さらに
研究を重ねた結果完成したものであつて、Ｌ−グルタミン酸に、固定化Ｌ−グルタミン酸
デカルボキシラーゼを作用させてγ−アミノ酪酸
を製造するに当り、緩衝剤を含まず、実質的に前
記固定化Ｌ−グルタミン酸カルボキシラーゼのみ
を含む水溶液に、Ｌ−グルタミン酸のみを添加し
て反応せしめ、反応の進行に伴つてアルカリ側に
変動する反応液のPHを、前記反応液にＬ−グルタ
ミン酸を添加することにより、前記Ｌ−グルタミ
ン酸デカルボキシラーゼの最適作用PH範囲内のPH
値に調整し、次いで得られる反応液を濃縮するこ
とを特徴とするγ−アミノ酪酸の製造方法を要旨
とするものである。以下、本発明の内容をさらに詳しく説明する。本発明に適用できる酵素反応は、２塩基性アミ
ノ酸の脱炭酸反応であるグルタミン酸から対応す
る１塩基性アミノ酸とα位のカルボキシル基起源
の炭酸ガスを生成する脱炭酸反応である。本発明に使用する酵素の起源は、特に限定され
ない。例えば、グルタミン酸脱炭酸酵素としては
大腸菌などの微生物起源の酵素でも、カボチヤな
どの植物起源の酵素でも使用できる。固定化方法も特に限定されない。例えば、グル
タルアルデヒドによる共有結合法、ポリアクリル
アミドゲルによるゲル包括法等、従来公知の方法
も十分適用できる。基質としての原料アミノ酸は、フリーの２塩基
アミノ酸を用いる。前記アミノ酸の形態として
は、結晶等の固体であつても、固体を分散したス
ラリーであつても、さらに濃厚溶液であつてもよ
い。但し、スラリー及び液体は、出来るだけ濃厚
であることが好ましいが、好ましくは１％以上が
良い。そして、反応液中の原料アミノ酸及び反応生成
物の合計濃度を１％以上の高い濃度に保つことに
より、反応生成物の分離を容易にすることができ
る。 PHは、反応すなわち、使用する酵素の特性によ
つて適宜選択される。一般に脱炭酸反応の好適PH
は６以下である。反応温度も、対応する酵素の熱安定性により適
宜選択される。通常30℃以上で行うことができ
る。30℃以下では反応速度が低く、実用的ではな
い。反応PHの検出方法も特に限定されず、従来公知
の方法が十分用いられる。例えば、PH電極による
検出が行われる。反応形式は、反応の進行に伴い、炭酸ガスが発
生することと、反応液のPHを均一に調節するため
流動層方式が適している。〔作用〕本発明は反応触媒として脱炭酸酵素を固定化し
た酵素を用いるので、これにより高濃度基質阻害
を防ぎ又は軽減させることができ、また、反応PH
が好適域からある程度はずれていても酵素が失活
しにくくなる。さらに、本発明は反応液中のPHを検出し、反応
中にPH緩衝剤や中和剤の添加なしに、基質である
原料アミノ酸の添加のみで、かつ反応PHを該固定
化酵素の最適PH域になるように原料アミノ酸を過
不足なく添加することにより調整するようにして
いるので、反応後にPH緩衝剤や中和剤の除去なし
に、反応生成物を得ることができる。〔実施例〕まず、本発明に使用するアミノ酸脱炭酸生成物
質製造装置の具体例を概略図に基づいて、本発明
の具体的プロセスフローを説明する。第５図に於いて、原料液１、すなわち、２塩基
性アミノであるＬ−グルタミン酸の溶液もしくは
スラリーは原料液貯槽２から原料液移送ポンプ４
により原料液移送配管３を経て反応槽５に供給さ
れる。反応槽５の槽内は、目的とする脱炭酸反応
に対応する酵素を固定化した固定化粒子を反応液
中に懸垂させた流動層を形成している。流動化の
駆動力としては、通気、例えば反応により生成す
る炭酸ガスを循環して通気することによつても、
機械撹拌によつて行つてもよい。反応液６のPHPH
検出装置８により検出され、その信号がPH自動調
整装置９に送信される。PH自動調整装置には、あ
らかじめ、反応の最適PHに入るように原料移送ポ
ンプ４のon−offを行う上限値、下限値のいずれ
か一方、或いは両方が設定されている。反応の進
行により、反応液のPHが変化し、最適域からはず
れた際には、上記のPH自動調整系統により、過不
足なく原料液が供給される。反応中に発生する炭
酸ガスは生成炭酸ガス排出用配管７により反応槽
から排出される。生成した１塩基性アミノ酸を含
む反応液６は反応液移送配管１０を経て、濃縮装
置１１に移送され濃縮される。濃縮反応液はさら
に濃縮反応液移送配管１２を経て乾燥装置１３に
より乾燥され乾燥生成物移送配管１４を経て系外
に乾燥生成物１５として抜き出される。また、生成物の純度を高めるには、第６図のフ
ローのように、反応液６を濃縮装置１１で濃縮す
る際析出する未反応の原料アミノ酸結晶を固液分
離装置１６で除去し、反応生成物を含む母液のみ
を乾燥装置１３で乾燥することもできる。また、第７図に示すように、反応液を濃縮装置
１１で濃縮後、冷却装置２０で冷却して、未反応
アミノ酸結晶をさらに効率よく除去し、製品の純
度を高めることもできる。さらに、図示はしていないが、反応液からの未
反応の原料アミノ酸の除去をさらに十分に行うた
めに、固液分離装置１６と乾燥装置１３との中間
にイオン交換体充填塔を配設してもよい。次に、本発明に使用するアミノ酸脱炭酸生成物
質製造装置の具体例の概略図を示す第５図に基づ
いて、前記装置の操作方法について述べる。第５図において、まず反応槽５に、アミノ酸脱
炭酸酵素であるＬ−グルタミン酸デカルボキシラ
ーゼの固定化粒子を所定濃度になる様に水中に懸
垂し、撹拌下で恒温に保持する。次いで、原料移
送配管３より原料アミノ酸であるＬ−グルタミン
酸を所定PHになるまで添加する。反応が進行し、
PHが設定PHよりも上昇するのを待つて、順次原料
を添加し、所定の生成物濃度になるまで添加す
る。所定の生成物濃度に到達後、その生成物濃度
に相当する濃度の原料アミノ酸のスラリーを、PH
検出装置８、PH自動調整装置９に連動した供給ポ
ンプ４により供給すると共に、同容量の反応液を
反応液移送配管１０より抜き出すことにより連続
的に運転する。以下、本発明のＬ−グルタミン酸脱炭酸生成物
質の製造方法の実施例について説明する。実施例１大腸菌エシエリシア・コリ起源のＬ−グルタミ
ン酸脱炭酸酵素１×10⁵単位を含む水溶液５mlと
アミノ化シリカゲル（φ1mm）５mlとグルタルア
ルデヒド３ml添加下で40℃で１時間接触させ、ア
ミノシリカゲル粒子にグルタルアルデヒドを架橋
剤としてＬ−グルタミン酸脱炭酸酵素を5.3×10⁴
単位固定した。本固定化酵素５mlと水35mlを50ml
（φ30×71mm）の円筒形反応槽に入れ、槽底部に
設置した単孔ノズルから液中に反応槽気相部の気
体を200ml／minで循環通気させ、固定化酵素の
粒子を流動化させた。反応槽内は40℃に恒温化
し、かつ反応槽側面にPH電極を設置し、設定PHを
本酵素の最適PHである4.5に設定し、PH自動調整
装置によりPHを自動調整できるようにした。一方、Ｌ−グルタミン酸結晶の20％スラリーを
調製し、上記のPH自動調整装置と連動させた供給
ポンプにより反応槽中にon−off制御により供給
した。20時間経過後に反応液中のγ−アミノ酪酸
は平衡濃度13.9％に達した。反応モル収率は99％
であつた。本反応液を収集し、50mlを10mlに減圧濃縮し
た。生成するＬ−グルタミン酸の結晶を濾別して
濃縮液10mlを得た。本液を減圧乾燥し、純白の乾
燥粉末6.7ｇ（モル収率98％）を得た。純度は
99.5％であつた。本粉末にはＬ−グルタミン酸
0.5％を含む。実施例２カボチヤ起源のＬ−グルタミン酸脱炭酸酵素２
×10⁵単位を含む水溶液10mlを、下記の３成分を
混合した液と混合し、ゾル状物30ｇを得た。Ａ：1N Hcl 24ml トリスヒドロキシメチルアミノメタン 1.9ｇ蒸溜水 3.2ml Ｂ：アクリルアミド３ｇメチレンビスアクリルアミド 0.08ｇフエリシアン化カリウム 0.7ｇ蒸溜水７ml Ｃ：1.4％過硫酸アンモニウム２ml 上記ゾルを1.5mmの間隙を有するガラス壁間に
流し入れ、窒素雰囲気下で、100ルツクスの照明
下に15℃、40分間静置して、厚さ1.5mmのゲルプ
レートを調製した。上記ゲルプレートを１mm角に細断し、Ｌ−グル
タミン酸脱炭酸酵素を固定化した粒子を調製し
た。本粒子と水120mlを200ml（φ40×160mm）の
円筒形反応槽に入れ、槽底部に設置したノズルか
ら液中に反応槽気相部の気体を300ml／minで循
環通気して、固定下酵素の粒子を流動下させた。
反応槽内の温度は40℃に恒温下し、かつ反応槽側
面にPH電極を設置し、設定PHを本酵素の最適PHで
ある4.4に設定し、PH自動調節装置によりPHを自
動調整できるようにした。一方、Ｌ−グルタミン酸結晶の25％スラリーを
調製し、上記のPH自動調節装置と連動させた供給
ポンプにより、反応槽中にon−off制御により供
給した。20時間経過後に反応液のγ−アミン酪酸
は平衡濃度17.2％に達した。反応モル収率は98％
であつた。本反応液を収集し、200mlを100mlに減圧濃縮し
た。生成するＬ−グルタミン酸の結晶を濾別し
て、濃縮液100mlを得た。本液を減圧乾燥し、純
白の乾燥粉末27.3ｇ（モル収率98％）を得た。純
度は99.3％であつた。本粉末にはＬ−グルタミン
酸を0.2％含む。実施例３嫌気性細菌クロストリジウム・ウエルチイ起源
のＬ−グルタミン酸脱炭酸酵素1.1×10⁵単位を含
む水溶液５mlとアミノ化シリカゲル（φ1mm）５
mlとをグルタルアルデヒド３ml添加下で40℃、１
時間接触させ、アミノ化シリカゲル粒子にＬ−グ
ルタミン酸脱炭酸酵素を3.8×10⁴単位固定した。本固定化酵素５mlと水35mlを50ml（φ30×71
mm）の円筒形反応槽に入れ、槽底部に設置した単
孔ノズルから液中に反応槽気相部の気体を200
ml／minで循環通気させ、固定化酵素の粒子を流
動下させた。反応槽内は40℃に恒温下した。ま
た、反応槽側面にPH電極を設置し、設定PHを本酵
素の最適PHである4.7に設定し、PH自動調整装置
によりPHを自動調整できるようにした。一方、Ｌ−グルタミン酸結晶の20％スラリーを
調製し、上記のPH自動調節装置と連動させた供給
ポンプにより反応槽中にon−off制御により供給
した。20時間経過後に反応槽中のγ−アミノ酪酸
は平衡濃度13.9％に達した。反応モル収率は99％
であつた。本反応液50mlを10mlに減圧濃縮した。生成する
Ｌ−グルタミン酸の結晶の濾別して濃縮液10mlを
得た。本液を減圧乾燥し、純白の乾燥粉末6.8ｇ
（モル収率97％）を得た。純度は99.5％であつた。
本粉末にはＬ−グルタミン酸を0.5％含む。比較例実施例１で用いた同一ロツドのＬ−グルタミン
酸脱炭酸酵素5.3×10⁴単位を0.5Mクエン酸ソーダ
緩衝液40mlと混合した、40mlの酵素液を得た。こ
れを実施例１で用いた円筒形反応槽に入れ、同一
濃度のＬ−グルタミン酸スラリーを同一速度、同
一温度で供給した。撹拌も実施例１と同条件で行
つた。PHは6N NaOHを用いてPH4.5に自動調節
した。反応槽から溶出する液は１時間毎に収集
し、分子濾過して低分子画分を反応液として分析
に供し、高分子画分を酵素液として反応槽に戻し
た。20時間経過後の反応液中のγ−アミノ酪酸濃
度を測定した結果、モル反応収率は5.4％であつ
た。本反応液50mlを減圧濃縮し、純白の乾燥粉末
11.3ｇを得た。本粉末にはグルタミン酸9.4ｇ、
ナトリウムイオン1.5ｇを含む。純度は3.4％であ
つた。実施例１と比較例との比較により明らかなよう
に、本発明により、中和剤や緩衝剤の使用なしに
反応し、収率よく純度の高い目的生成物を得るこ
とができる。〔発明の効果〕医薬用として有用なγ−アミノ酪酸を高純度
で、かつ、中和剤やPH緩衝剤を使用せずに合成で
きる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、固定化しないＬ−グルタミン酸脱炭
酸酵素を各Ｌ−グルタミン酸濃度で反応させた場
合のγ−アミノ酪酸濃度とPHの時間経過を観測し
た図である。第２図は、固定化したＬ−グルタミ
ン酸脱炭酸酵素を各Ｌ−グルタミン酸濃度で反応
させた場合のγ−アミノ酪酸濃度とPHの時間経過
を観測した図である。第３図は、固定化しないＬ
−グルタミン酸脱炭酸酵素を用いて、基質のＬ−
グルタミン酸を段階的に添加した際のγ−アミノ
酪酸濃度とPHの時間経過を観測した図である。第
４図は、固定化したＬ−グルタミン酸脱炭酸酵素
を用いて、基質のＬ−グルタミン酸を単位時間当
たり一定の添加量で連続的に添加した際のγ−ア
ミノ酪酸濃度とPHの時間経過を観測したものであ
る。第５〜第７図は、本発明に使用するＬ−グル
タミン酸脱炭酸生成物質製造装置の概略図、及び
それによる本発明のプロセスフローを示す図であ
る。１……原料液、２……原料液貯槽、３……原料
液移送配管、４……原料液移送ポンプ、５……反
応槽、６……反応液、７……生成炭酸ガス排出用
配管、８……PH検出装置、９……PH自動調整装
置、１０……反応液移送配管、１１……反応液濃
縮装置、１２……濃縮反応液移送配管、１３……
乾燥装置、１４……乾燥生成物移送配管、１５…
…乾燥生成物、１６……固液分離装置、１７……
未反応原料結晶抜き出し配管、１８……未反応原
料結晶、１９……反応生成物濃縮液移送配管、２
０……冷却装置、２１……冷却濃縮液移送配管、
２２……反応生成物濃縮冷却液移送配管。

Claims

【特許請求の範囲】１Ｌ−グルタミン酸に、固定化Ｌ−グルタミン
酸デカルボキシラーゼを作用させてγ−アミノ酪
酸を製造するに当り、緩衝剤を含まず、実質的に
前記固定化Ｌ−グルタミン酸カルボキシラーゼの
みを含む水溶液に、Ｌ−グルタミン酸のみを添加
して反応せしめ、反応の進行に伴つてアルカリ側
に変動する反応液のPHを、前記反応液にＬ−グル
タミン酸を添加することにより、前記Ｌ−グルタ
ミン酸デカルボキシラーゼの最適作用PH範囲内の
PH値に調整し、次いで得られた反応終了液を濃縮
することを特徴とするγ−アミノ酪酸の製造方
法。２反応終了後PH調整のため添加したＬ−グルタ
ミン酸により増加した容積分だけ反応液を系外に
抜き出す特許請求の範囲第１項記載のγ−アミノ
酪酸の製造方法。３反応終了液の濃縮が減圧乾燥で行なわれる特
許請求の範囲１または２記載のγ−アミノ酪酸の
製造方法。