JPH05317067A - Ｌ−トリプトファンの製造方法 - Google Patents
Ｌ−トリプトファンの製造方法Info
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- JPH05317067A JPH05317067A JP12627392A JP12627392A JPH05317067A JP H05317067 A JPH05317067 A JP H05317067A JP 12627392 A JP12627392 A JP 12627392A JP 12627392 A JP12627392 A JP 12627392A JP H05317067 A JPH05317067 A JP H05317067A
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 バイオリアクターを用いて、インドールとＬ
−セリンから酵素反応により連続的にＬ−トリプトファ
ンを製造する際に、反応器からの未反応のインドールを
流出する時期を予測し、インドールを分離精製系に流出
させない反応方式の提供。 【構成】 流通式撹拌槽型反応器、流通式管型反応器及
び限外濾過膜をこの順に直列に連結し、前記限外濾過膜
での濃縮液を前記流通式撹拌槽型反応器へ循環するバイ
オリアクターを使用する。
−セリンから酵素反応により連続的にＬ−トリプトファ
ンを製造する際に、反応器からの未反応のインドールを
流出する時期を予測し、インドールを分離精製系に流出
させない反応方式の提供。 【構成】 流通式撹拌槽型反応器、流通式管型反応器及
び限外濾過膜をこの順に直列に連結し、前記限外濾過膜
での濃縮液を前記流通式撹拌槽型反応器へ循環するバイ
オリアクターを使用する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、Ｌ−トリプトファンの
製造方法に関するものである。詳しくは、原料としてイ
ンドールおよびＬ−セリンを用い、トリプトファンシン
ターゼの存在下、酵素反応によりＬ−トリプトファンを
製造する際の反応方式に関するものである。
製造方法に関するものである。詳しくは、原料としてイ
ンドールおよびＬ−セリンを用い、トリプトファンシン
ターゼの存在下、酵素反応によりＬ−トリプトファンを
製造する際の反応方式に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】インドールおよびＬ−セリンを基質とし
てトリプトファンシンターゼを触媒とする酵素反応によ
り、Ｌ−トリプトファンを製造する場合、最も障害とな
るのはインドール自体が酵素活性阻害剤となることであ
り、それを回避するためには反応液中でのインドール濃
度を一定値以下に抑えなければならない。この問題点を
解決するためには、反応運転時に反応液中でのインドー
ル濃度を一定値以下になる様に、インドールを間欠的あ
るいは連続的に供給するのが一般的である（特開昭58-1
6692号公報）。
てトリプトファンシンターゼを触媒とする酵素反応によ
り、Ｌ−トリプトファンを製造する場合、最も障害とな
るのはインドール自体が酵素活性阻害剤となることであ
り、それを回避するためには反応液中でのインドール濃
度を一定値以下に抑えなければならない。この問題点を
解決するためには、反応運転時に反応液中でのインドー
ル濃度を一定値以下になる様に、インドールを間欠的あ
るいは連続的に供給するのが一般的である（特開昭58-1
6692号公報）。
【０００３】連続反応操作では、酵素や微生物などの生
体触媒を、膜を利用して系内に封じ込め、反応と同時に
生成物を含有した透過液を抜きだし、菌体分離を連続的
に行いうるメンブレンリアクターが、盛んに研究されて
きている。該リアクターは、(1)連続操作が容易であ
る、(2)阻害物質が蓄積しにくい、(3)膜は分画分子量を
有するものが使用でき、分離精製プロセスへの負荷を減
らせる、(4)装置洗滌および殺菌が容易である等のメリ
ットもあり、酵素反応系では、副反応も少なく極めて有
利なリアクターである。最近では、耐熱性、耐薬品性に
優れた膜モジュールが実用に供されてきており、メンブ
レンリアクターとして工業化された例も報告されてきて
いる。
体触媒を、膜を利用して系内に封じ込め、反応と同時に
生成物を含有した透過液を抜きだし、菌体分離を連続的
に行いうるメンブレンリアクターが、盛んに研究されて
きている。該リアクターは、(1)連続操作が容易であ
る、(2)阻害物質が蓄積しにくい、(3)膜は分画分子量を
有するものが使用でき、分離精製プロセスへの負荷を減
らせる、(4)装置洗滌および殺菌が容易である等のメリ
ットもあり、酵素反応系では、副反応も少なく極めて有
利なリアクターである。最近では、耐熱性、耐薬品性に
優れた膜モジュールが実用に供されてきており、メンブ
レンリアクターとして工業化された例も報告されてきて
いる。
【０００４】メンブレンリアクターでは、流通式撹拌槽
型反応器（以下、ＣＳＴＲと略記することがある）と限
外濾過膜（以下、ＵＦ膜と略記することがある）とを組
み合わせて構成するのが一般的で、基質をＣＳＴＲに連
続的に供給し、生体触媒と反応させながらＵＦ膜に送液
し、反応生成物を透過液として連続的に濾過して、同時
に濃縮液をＣＳＴＲに循環させる方式である。この方式
のメンブレンリアクターを用いて、本発明で扱うような
基質阻害性を有する酵素反応を行う場合、反応槽をＣＳ
ＴＲとすることは基質阻害を緩和する効果があり有利で
ある。すなわち、撹拌による混合効果により、反応器内
の基質濃度を低く押さえることができるのである。
型反応器（以下、ＣＳＴＲと略記することがある）と限
外濾過膜（以下、ＵＦ膜と略記することがある）とを組
み合わせて構成するのが一般的で、基質をＣＳＴＲに連
続的に供給し、生体触媒と反応させながらＵＦ膜に送液
し、反応生成物を透過液として連続的に濾過して、同時
に濃縮液をＣＳＴＲに循環させる方式である。この方式
のメンブレンリアクターを用いて、本発明で扱うような
基質阻害性を有する酵素反応を行う場合、反応槽をＣＳ
ＴＲとすることは基質阻害を緩和する効果があり有利で
ある。すなわち、撹拌による混合効果により、反応器内
の基質濃度を低く押さえることができるのである。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】上記のメンブレンリア
クターを用いて、連続的にＬ−トリプトファンを生成す
る酵素反応を実施する場合、酵素が失活しない運転初期
においては、ＣＳＴＲより未反応のインドールを流出さ
せない状況を達成しうる。しかしながら、時間経過に伴
い酵素が失活すると、インドールのＣＳＴＲからの流
出、さらに、ＵＦ膜での透過液側への流出が進行するこ
とが避けられなくなる。このことは、Ｌ−トリプトファ
ンの分離精製の面から見て不利な状況を呈するもので、
インドールの流出するタイミングを予想し分離精製系に
流出させない方法の開発が望まれていた。
クターを用いて、連続的にＬ−トリプトファンを生成す
る酵素反応を実施する場合、酵素が失活しない運転初期
においては、ＣＳＴＲより未反応のインドールを流出さ
せない状況を達成しうる。しかしながら、時間経過に伴
い酵素が失活すると、インドールのＣＳＴＲからの流
出、さらに、ＵＦ膜での透過液側への流出が進行するこ
とが避けられなくなる。このことは、Ｌ−トリプトファ
ンの分離精製の面から見て不利な状況を呈するもので、
インドールの流出するタイミングを予想し分離精製系に
流出させない方法の開発が望まれていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の様
な問題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、簡便で工業
的にＬ−トリプトファンを製造する方法になりうるバイ
オリアクターを発明するに至った。すなわち、本発明の
方法は、インドールおよびＬ−セリンを基質としてトリ
プトファンシンターゼを触媒とする酵素反応により、Ｌ
−トリプトファンを製造するに際し、流通式撹拌槽型反
応器、流通式管型反応器及び限外濾過膜をこの順に直列
に連結し、前記限外濾過膜での濃縮液を前記流通式撹拌
槽型反応器へ循環するバイオリアクターを使用すること
を特徴とするものである。
な問題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、簡便で工業
的にＬ−トリプトファンを製造する方法になりうるバイ
オリアクターを発明するに至った。すなわち、本発明の
方法は、インドールおよびＬ−セリンを基質としてトリ
プトファンシンターゼを触媒とする酵素反応により、Ｌ
−トリプトファンを製造するに際し、流通式撹拌槽型反
応器、流通式管型反応器及び限外濾過膜をこの順に直列
に連結し、前記限外濾過膜での濃縮液を前記流通式撹拌
槽型反応器へ循環するバイオリアクターを使用すること
を特徴とするものである。
【０００７】以下に本発明方法を詳述する。 １．Ｌ−トリプトファン製造用バイオリアクターの構成 本発明のバイオリアクターの例として、図１に示したも
のを挙げることができる。本バイオリアクターは、流通
式撹拌槽型反応器（ＣＳＴＲ）１、流通式管型反応器
（以下、ＰＦＲと略記することがある）２、および限外
濾過膜（ＵＦ膜）３を有し、この順に連結する。さらに
循環ポンプ６によってＵＦ膜での濃縮液をＣＳＴＲ１に
戻して循環させるラインをもつ。
のを挙げることができる。本バイオリアクターは、流通
式撹拌槽型反応器（ＣＳＴＲ）１、流通式管型反応器
（以下、ＰＦＲと略記することがある）２、および限外
濾過膜（ＵＦ膜）３を有し、この順に連結する。さらに
循環ポンプ６によってＵＦ膜での濃縮液をＣＳＴＲ１に
戻して循環させるラインをもつ。
【０００８】Ｌ−トリプトファンを製造する連続酵素反
応を行うには、Ｌ−セリンを含む供給液を調整槽４より
ＣＳＴＲ１へ、供給用ポンプ７を用いて連続投入すると
同時に、Ｌ−トリプトファンを含む反応液を同量ＵＦ膜
３の透過液としてコントロールバルブ８によって抜き出
す方法により、反応液を貯槽５に貯蔵する。この方法に
従うと循環系の液体積を一定に保ち、酵素を循環系に封
じ込めたまま連続反応を行いうる。本発明における流通
式反応器とは、上記の様に連続反応を実施可能とする、
すなわち、一定量の原料が反応器に入ると同時に他方よ
り反応生成物が出て行くことを可能とする反応器を指す
ものである。
応を行うには、Ｌ−セリンを含む供給液を調整槽４より
ＣＳＴＲ１へ、供給用ポンプ７を用いて連続投入すると
同時に、Ｌ−トリプトファンを含む反応液を同量ＵＦ膜
３の透過液としてコントロールバルブ８によって抜き出
す方法により、反応液を貯槽５に貯蔵する。この方法に
従うと循環系の液体積を一定に保ち、酵素を循環系に封
じ込めたまま連続反応を行いうる。本発明における流通
式反応器とは、上記の様に連続反応を実施可能とする、
すなわち、一定量の原料が反応器に入ると同時に他方よ
り反応生成物が出て行くことを可能とする反応器を指す
ものである。
【０００９】２．流通式撹拌槽型反応器（ＣＳＴＲ） 本発明のＣＳＴＲとは、撹拌翼を有する完全混合槽タイ
プのものを指し、反応液が十分に混合されれば何ら制限
はない。ただし、混合条件が不適当で反応液の発泡がは
なはだしい条件は選ぶべきではない。槽高／槽径比が
３：１〜１：３の範囲が好ましい。撹拌翼については、
翼径／槽径比が１：５〜１：２、翼の枚数は液深を考慮
して１〜３枚、複数枚を設ける場合には液深を均等に分
割する位置に設けるのが好ましい。翼の形状は、特に問
わないが、例えばパドル型、プロペラ型などを挙げるこ
とができる。混合を促進する目的の邪魔板についての設
置条件は何ら制限はないが、液深に同じ高さを有し、半
径方向の板巾／槽径が１：１０〜１：２０が好ましい。
放射方向に当分割する位置に枚数２〜６枚を設けるのが
好ましい。液の流通方式も特に限定しない。
プのものを指し、反応液が十分に混合されれば何ら制限
はない。ただし、混合条件が不適当で反応液の発泡がは
なはだしい条件は選ぶべきではない。槽高／槽径比が
３：１〜１：３の範囲が好ましい。撹拌翼については、
翼径／槽径比が１：５〜１：２、翼の枚数は液深を考慮
して１〜３枚、複数枚を設ける場合には液深を均等に分
割する位置に設けるのが好ましい。翼の形状は、特に問
わないが、例えばパドル型、プロペラ型などを挙げるこ
とができる。混合を促進する目的の邪魔板についての設
置条件は何ら制限はないが、液深に同じ高さを有し、半
径方向の板巾／槽径が１：１０〜１：２０が好ましい。
放射方向に当分割する位置に枚数２〜６枚を設けるのが
好ましい。液の流通方式も特に限定しない。
【００１０】３．流通式管型反応器（ＰＦＲ） 本発明の流通式管型反応器とは、反応時間を所望量与え
うるものであれば何ら制限はない。形状としては、特に
限定はしないが円筒型のものが好ましく、流通方向も好
ましくは鉛直方向を下から上に流通するのがよい。管長
／管径比は１：１〜１０：１の範囲が好ましい。しかし
ながらＰＦＲの設計および運転方法は、反応器内での流
れの状態を考慮し、好ましくは流通方向に押し流れとな
るように配慮すべきである。
うるものであれば何ら制限はない。形状としては、特に
限定はしないが円筒型のものが好ましく、流通方向も好
ましくは鉛直方向を下から上に流通するのがよい。管長
／管径比は１：１〜１０：１の範囲が好ましい。しかし
ながらＰＦＲの設計および運転方法は、反応器内での流
れの状態を考慮し、好ましくは流通方向に押し流れとな
るように配慮すべきである。
【００１１】４．限外濾過膜（ＵＦ膜） 本発明の限外濾過膜としては、中空系モジュール型のも
のが適しており、分画分子量は、約５００〜１００,０
００の範囲の種々のものであればよく、好ましくは約
６,０００〜５０,０００である。膜を形成するポリマー
は、例えばポリスルホン、ポリアクリルニトリル、フッ
化ポリビニリデンおよびセルロースなどが好ましい例と
して挙げられる。操作圧力は、入口圧が０.５〜５.０kg
／cm2の範囲であり、反応液線速度は０.１〜１０m／s、
膜での透過量（フラックス）は、１０〜１５０l/m2/hr
の範囲が有利である。反応液線速を上げるために、限外
濾過膜の部分だけ更に循環ポンプを設けることも可能で
ある。ＵＦ膜からの透過液流量については、特に限定は
しないが循環液流量の１〜１０％程度が好ましい。
のが適しており、分画分子量は、約５００〜１００,０
００の範囲の種々のものであればよく、好ましくは約
６,０００〜５０,０００である。膜を形成するポリマー
は、例えばポリスルホン、ポリアクリルニトリル、フッ
化ポリビニリデンおよびセルロースなどが好ましい例と
して挙げられる。操作圧力は、入口圧が０.５〜５.０kg
／cm2の範囲であり、反応液線速度は０.１〜１０m／s、
膜での透過量（フラックス）は、１０〜１５０l/m2/hr
の範囲が有利である。反応液線速を上げるために、限外
濾過膜の部分だけ更に循環ポンプを設けることも可能で
ある。ＵＦ膜からの透過液流量については、特に限定は
しないが循環液流量の１〜１０％程度が好ましい。
【００１２】５．ＣＳＴＲとＰＦＲとの関係および運転
条件 本発明の酵素反応用バイオリアクターを使用することに
より、インドールの有する基質阻害効果をＣＳＴＲにて
緩和し、同時に未反応インドールをＰＦＲにてほぼ完全
に反応させ、結果的にＵＦ膜からの透過液にインドール
を実質的に流出させないことが、連続反応の長時間に亘
って可能となる。ここで実質的というのは、プロセス構
築上、流出しないものとして扱えるということであり、
インドールの分離回収工程ならびにリサイクル工程の必
要性が認められないことを意味する。この点に関して、
工業的製造方法として極めて有利な条件を与えるものと
考えられる。また、流通式撹拌槽型反応器の流出液中の
インドール濃度を経時的に測定することにより、連続反
応終了時間、即ちＵＦ膜の透過液への実質的なインドー
ル流出のタイミングを推定することが可能である。
条件 本発明の酵素反応用バイオリアクターを使用することに
より、インドールの有する基質阻害効果をＣＳＴＲにて
緩和し、同時に未反応インドールをＰＦＲにてほぼ完全
に反応させ、結果的にＵＦ膜からの透過液にインドール
を実質的に流出させないことが、連続反応の長時間に亘
って可能となる。ここで実質的というのは、プロセス構
築上、流出しないものとして扱えるということであり、
インドールの分離回収工程ならびにリサイクル工程の必
要性が認められないことを意味する。この点に関して、
工業的製造方法として極めて有利な条件を与えるものと
考えられる。また、流通式撹拌槽型反応器の流出液中の
インドール濃度を経時的に測定することにより、連続反
応終了時間、即ちＵＦ膜の透過液への実質的なインドー
ル流出のタイミングを推定することが可能である。
【００１３】運転管理の意味からも、本発明のバイオリ
アクターは有利な条件を与えうる。所定の連続酵素反応
時間を達成するには、流通式撹拌槽型反応器と流通式管
型反応器の体積比ならびにポンプ流量等の運転条件を十
分に考慮する必要がある。流通式管型反応器の体積は、
流通式撹拌槽型反応器の体積に比べて、小さすぎても本
発明の効果が期待できず、また大きすぎても工業的には
建設固定費の増大につながってしまい好ましくない。本
発明で対象とする酵素反応の場合、体積比は、流通式管
型反応器／流通式撹拌槽型反応器の値として、限定はし
ないが通常０.１〜１０の範囲、好ましくは０.３〜３の
範囲がよい。
アクターは有利な条件を与えうる。所定の連続酵素反応
時間を達成するには、流通式撹拌槽型反応器と流通式管
型反応器の体積比ならびにポンプ流量等の運転条件を十
分に考慮する必要がある。流通式管型反応器の体積は、
流通式撹拌槽型反応器の体積に比べて、小さすぎても本
発明の効果が期待できず、また大きすぎても工業的には
建設固定費の増大につながってしまい好ましくない。本
発明で対象とする酵素反応の場合、体積比は、流通式管
型反応器／流通式撹拌槽型反応器の値として、限定はし
ないが通常０.１〜１０の範囲、好ましくは０.３〜３の
範囲がよい。
【００１４】６．酵素反応 本発明で対象とする酵素反応は、反応基質としてインド
ールおよびＬ−セリンを用い、酵素トリプトファンシン
ターゼによりＬ−トリプトファンを生成するものであ
る。本反応は、該酵素を含有する、例えばエシェリヒア
・コリＫ１２ ＹＫ２０１４等を用いて行う。この菌体
をそのままあるいは菌体破砕したもの、酵素精製したも
の等を用いても構わない。使用する酵素量は、湿菌体を
反応器内に投入し、湿菌体換算で０.１〜１０重量％、
好ましくは１〜６重量％となるように調整する。反応温
度は、２０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃とし、p
Ｈは７〜１０、好ましくは原料Ｌ−セリンの分解を抑制
するために弱アルカリ性である７.５〜９.５が好まし
い。またpＨ調整用助剤は特に限定はしないが、アンモ
ニアが好ましい。
ールおよびＬ−セリンを用い、酵素トリプトファンシン
ターゼによりＬ−トリプトファンを生成するものであ
る。本反応は、該酵素を含有する、例えばエシェリヒア
・コリＫ１２ ＹＫ２０１４等を用いて行う。この菌体
をそのままあるいは菌体破砕したもの、酵素精製したも
の等を用いても構わない。使用する酵素量は、湿菌体を
反応器内に投入し、湿菌体換算で０.１〜１０重量％、
好ましくは１〜６重量％となるように調整する。反応温
度は、２０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃とし、p
Ｈは７〜１０、好ましくは原料Ｌ−セリンの分解を抑制
するために弱アルカリ性である７.５〜９.５が好まし
い。またpＨ調整用助剤は特に限定はしないが、アンモ
ニアが好ましい。
【００１５】反応基質であるＬ−セリンの供給は、Ｌ−
セリンを所定量溶解させ、調整槽にて行う。反応液中で
Ｌ−セリンの濃度が０.１〜１０重量％、好ましくは０.
１〜１重量％となるように仕込む。Ｌ−セリンのかわり
にＤＬ−セリンを使用することも可能であるが、その場
合にはＬ−セリンの濃度を所定の値にする。さらにpＨ
をアンモニアにて７.５〜９.５に調整する。もう一方の
基質インドールの供給量は、循環系に仕込む湿菌体量に
連動して決められる。供給インドール速度（g−インド
ール／hr）／湿菌体量（g−菌体）の比が０.００５〜
０.５好ましくは、０.０１〜０.３（g−インドール／g
−菌体／hr）がよい。インドールの供給方法としては、
融点以上に予め溶解したものをＣＳＴＲに投入する。反
応液中への溶解を遅延させる粉体フィードは好ましくな
い。反応で生成するＬ−トリプトファンのＵＦからの抜
き出し濃度は、循環系での平均滞留時間（循環系液量／
抜き出し速度）およびインドールの供給速度と連動して
決まるが、０.１〜５重量％、好ましくは０.５〜２重量
％が望ましい。Ｌ−トリプトファンはpＨに対して溶解
度に差があるが、難水溶性であるのでこの点に留意すべ
きである。
セリンを所定量溶解させ、調整槽にて行う。反応液中で
Ｌ−セリンの濃度が０.１〜１０重量％、好ましくは０.
１〜１重量％となるように仕込む。Ｌ−セリンのかわり
にＤＬ−セリンを使用することも可能であるが、その場
合にはＬ−セリンの濃度を所定の値にする。さらにpＨ
をアンモニアにて７.５〜９.５に調整する。もう一方の
基質インドールの供給量は、循環系に仕込む湿菌体量に
連動して決められる。供給インドール速度（g−インド
ール／hr）／湿菌体量（g−菌体）の比が０.００５〜
０.５好ましくは、０.０１〜０.３（g−インドール／g
−菌体／hr）がよい。インドールの供給方法としては、
融点以上に予め溶解したものをＣＳＴＲに投入する。反
応液中への溶解を遅延させる粉体フィードは好ましくな
い。反応で生成するＬ−トリプトファンのＵＦからの抜
き出し濃度は、循環系での平均滞留時間（循環系液量／
抜き出し速度）およびインドールの供給速度と連動して
決まるが、０.１〜５重量％、好ましくは０.５〜２重量
％が望ましい。Ｌ−トリプトファンはpＨに対して溶解
度に差があるが、難水溶性であるのでこの点に留意すべ
きである。
【００１６】
【実施例】以下、本発明を実施例について更に詳細に説
明する。なお、以下の実施例に於いて「％」は特に限定
しない限り重量％を示すものであり、インドールの液中
濃度は高速液体クロマトグファフィーにより定量した。
明する。なお、以下の実施例に於いて「％」は特に限定
しない限り重量％を示すものであり、インドールの液中
濃度は高速液体クロマトグファフィーにより定量した。
【００１７】参考例 下記第１表に示した培地１００mlを５００ml容フラスコ
に分注し、１２０℃で１５分間滅菌処理したものにトリ
プトファンシンターゼ生産菌であるエシエリヒア・コリ
（Escherichia coli）Ｋ１２ ＹＫ２０１４（ＦＥＲＭ
ＢＰ−３２４５）を植菌し、３７℃にて１日振盪培養
後、該培養物の２００ml（フラスコ２本分）を同様にし
て調整した３０lジャーファーメンターの中の培地１５l
に接種し、３７℃にて回転数６００rpm、通気量１vvm、
pＨ７.２（２８％アンモニア水で調整）で培養した。３
０時間培養した後、培養液を遠心分離にて集菌して湿菌
体を約６００g得た。これを密封容器に入れて、−２０
℃の冷凍庫に保管した。
に分注し、１２０℃で１５分間滅菌処理したものにトリ
プトファンシンターゼ生産菌であるエシエリヒア・コリ
（Escherichia coli）Ｋ１２ ＹＫ２０１４（ＦＥＲＭ
ＢＰ−３２４５）を植菌し、３７℃にて１日振盪培養
後、該培養物の２００ml（フラスコ２本分）を同様にし
て調整した３０lジャーファーメンターの中の培地１５l
に接種し、３７℃にて回転数６００rpm、通気量１vvm、
pＨ７.２（２８％アンモニア水で調整）で培養した。３
０時間培養した後、培養液を遠心分離にて集菌して湿菌
体を約６００g得た。これを密封容器に入れて、−２０
℃の冷凍庫に保管した。
【００１８】
【表１】第１表 グルコース ３０g ＫＨ2ＰＯ4 １.６g Ｋ2ＨＰＯ4 ５.５g （ＮＨ4)2ＳＯ4 ３.０g ＭgＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.１g ＦeＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２７mg（０.１mＭ） 酵母エキス ２.０g ペプトン ２.０g 蒸留水 １０００ml (pＨ ７．２）
【００１９】（連続酵素反応装置）容量を任意に変更し
うるＣＳＴＲ、ＰＦＲを直列に循環ポンプを介し接続
し、さらにＵＦ膜としてポリスルホン製膜（ダイセル社
ＵＦラボモジュールＦＵＳ−４０８１、公称分画分子量
５万）を直列に連結、ＵＦ膜での濃縮液をＣＳＴＲに循
環させるメンブレンリアクターを構成した。ＣＳＴＲ
は、容量が３〜９lまで変更可能であり、それに伴って
槽高／槽径比が１：２〜３：２と変化する。撹拌翼は２
枚のパドル型を液深を均等に分割する位置に設け、翼径
／槽径比が１：３の大きさである。また邪魔板は液深よ
り十分に高い位置まであり板巾／槽径比１：１０のもの
が３枚、放射方向に当分割する位置に設けられている。
回転数は２００rpmとした。ＰＦＲは、鉛直下方より上
方に流通させ容量が全部で３〜６lの円筒型で管長／管
径比が２：１〜４：１下方部はそれ以外に４５°を底角
とする円すい形を有している。循環系のパイプ太さは管
径比として１：１０となっている。その他、循環ポンプ
によって１.５〜２.０l／分の流速で反応液を循環して
いる。循環系での全容量には、ＣＳＴＲおよびＰＦＲの
各容量に配管類の容量１lを加えた。
うるＣＳＴＲ、ＰＦＲを直列に循環ポンプを介し接続
し、さらにＵＦ膜としてポリスルホン製膜（ダイセル社
ＵＦラボモジュールＦＵＳ−４０８１、公称分画分子量
５万）を直列に連結、ＵＦ膜での濃縮液をＣＳＴＲに循
環させるメンブレンリアクターを構成した。ＣＳＴＲ
は、容量が３〜９lまで変更可能であり、それに伴って
槽高／槽径比が１：２〜３：２と変化する。撹拌翼は２
枚のパドル型を液深を均等に分割する位置に設け、翼径
／槽径比が１：３の大きさである。また邪魔板は液深よ
り十分に高い位置まであり板巾／槽径比１：１０のもの
が３枚、放射方向に当分割する位置に設けられている。
回転数は２００rpmとした。ＰＦＲは、鉛直下方より上
方に流通させ容量が全部で３〜６lの円筒型で管長／管
径比が２：１〜４：１下方部はそれ以外に４５°を底角
とする円すい形を有している。循環系のパイプ太さは管
径比として１：１０となっている。その他、循環ポンプ
によって１.５〜２.０l／分の流速で反応液を循環して
いる。循環系での全容量には、ＣＳＴＲおよびＰＦＲの
各容量に配管類の容量１lを加えた。
【００２０】（使用菌体の調整方法）予め設定した反応
条件に従い、設定湿菌体濃度と循環系全容量の積から必
要湿菌体量を求めておく。参考例で示した湿菌体を必要
量、液量２lの器量体懸濁槽に、補酵素ピリドキサール
リン酸６０mgとともに投入溶解せしめ、液温１０℃に保
ちながら低回転にて１時間撹拌した。撹拌をとめて更に
１０℃のまま２時間放置した。
条件に従い、設定湿菌体濃度と循環系全容量の積から必
要湿菌体量を求めておく。参考例で示した湿菌体を必要
量、液量２lの器量体懸濁槽に、補酵素ピリドキサール
リン酸６０mgとともに投入溶解せしめ、液温１０℃に保
ちながら低回転にて１時間撹拌した。撹拌をとめて更に
１０℃のまま２時間放置した。
【００２１】（リアクターの準備）一方、酵素反応器の
循環系（流通式撹拌槽型反応器、流通式管型反応器、限
外濾過膜をこの順に循環ポンプにて循環させる部分をさ
す。）を、適当量の水を投入し循環させ３７℃に保持し
た。次いで、流通式撹拌槽型反応器に上記菌体懸濁液、
ＤＬ−セリンを濃度が２０g／lになる所定量を投入し、
全循環液量を所定量にメスアップした。この後、全循環
系が３７℃になるまで調整した。酵素反応は、溶融イン
ドールを２０g／ｈrで流通式撹拌槽型反応器に連続投入
することにより開始し、回分反応を２時間行った。その
後ＤＬ−セリン２０g／lおよびピリドキサールリン酸１
０mg／lを含む原料液を３l／ｈrにて流通式撹拌槽型反
応器に連続投入すると同時に、限外濾過膜の濾液を同流
量抜き出して、連続反応に切かえた。又、酵素反応をp
Ｈ７.８で行わせる様にアンモニア液を添加してコント
ロールした。サンプルを流通式撹拌槽型反応器内および
限外濾過膜の濾液より採取し、インドール濃度を測定し
た。この時、連続反応途中では、生成Ｌ−トリプトファ
ンの濃度がほぼ１.２重量％となった。
循環系（流通式撹拌槽型反応器、流通式管型反応器、限
外濾過膜をこの順に循環ポンプにて循環させる部分をさ
す。）を、適当量の水を投入し循環させ３７℃に保持し
た。次いで、流通式撹拌槽型反応器に上記菌体懸濁液、
ＤＬ−セリンを濃度が２０g／lになる所定量を投入し、
全循環液量を所定量にメスアップした。この後、全循環
系が３７℃になるまで調整した。酵素反応は、溶融イン
ドールを２０g／ｈrで流通式撹拌槽型反応器に連続投入
することにより開始し、回分反応を２時間行った。その
後ＤＬ−セリン２０g／lおよびピリドキサールリン酸１
０mg／lを含む原料液を３l／ｈrにて流通式撹拌槽型反
応器に連続投入すると同時に、限外濾過膜の濾液を同流
量抜き出して、連続反応に切かえた。又、酵素反応をp
Ｈ７.８で行わせる様にアンモニア液を添加してコント
ロールした。サンプルを流通式撹拌槽型反応器内および
限外濾過膜の濾液より採取し、インドール濃度を測定し
た。この時、連続反応途中では、生成Ｌ−トリプトファ
ンの濃度がほぼ１.２重量％となった。
【００２２】実施例１ ＣＳＴＲ３ｌ、ＰＦＲ６ｌ、循環系全容量１０lとし、
湿菌体濃度３重量％にて実施した。その結果、連続運転
２０時間目に、ＣＳＴＲ出口ではじめてインドールを検
出し、その後７０時間目にインドールが０.０１重量％
の濃度になるまで濃度が増大した。その後ＣＳＴＲでの
インドールの濃度が急激に上昇したので、連続反応を終
了した。本実施例において、連続運転７０時間目に至る
までＵＦ膜からの透過液ではインドールが検出限界以下
の濃度であった。
湿菌体濃度３重量％にて実施した。その結果、連続運転
２０時間目に、ＣＳＴＲ出口ではじめてインドールを検
出し、その後７０時間目にインドールが０.０１重量％
の濃度になるまで濃度が増大した。その後ＣＳＴＲでの
インドールの濃度が急激に上昇したので、連続反応を終
了した。本実施例において、連続運転７０時間目に至る
までＵＦ膜からの透過液ではインドールが検出限界以下
の濃度であった。
【００２３】
【表２】 第２表 インドール濃度の測定点 インドール濃度が検出限界以下であった時間 ＣＳＴＲ出口 連続運転２０時間まで ＵＦ膜／透過液 連続運転７０時間まで
【００２４】実施例２ ＣＳＴＲ６l、ＰＦＲ３lの循環系全容量１０l、全湿菌
体量を実施例１と同じくして実施した。その結果、第３
表に示すようになった。
体量を実施例１と同じくして実施した。その結果、第３
表に示すようになった。
【００２５】
【表３】 第３表 インドール濃度の測定点 インドール濃度が検出限界以下であった時間 ＣＳＴＲ出口 連続運転３５時間まで ＵＦ膜／透過液 連続運転７０時間まで
【００２６】比較例 ＣＳＴＲ、循環ポンプ、ＵＦ膜をこの順に直列に連結し
たメンブレンリアクターを組み立て、ＣＳＴＲ９l、全
循環系容量を１０lとした。全湿菌体量を実施例１と同
じくして実施した。その結果、連続運転４５時間目に、
ＣＳＴＲ出口ではじめてインドールを検出し、ほぼ同時
にＵＦ膜からの透過液においてもインドールを検出し
た。その後７０時間目にインドールが０.０１重量％の
濃度になるまで、ＣＳＴＲ出口およびＵＦ膜透過液での
濃度はほぼ同じく増大した。７０時間目以降には急激に
インドール濃度が上昇して反応を終了せざるを得なかっ
た。
たメンブレンリアクターを組み立て、ＣＳＴＲ９l、全
循環系容量を１０lとした。全湿菌体量を実施例１と同
じくして実施した。その結果、連続運転４５時間目に、
ＣＳＴＲ出口ではじめてインドールを検出し、ほぼ同時
にＵＦ膜からの透過液においてもインドールを検出し
た。その後７０時間目にインドールが０.０１重量％の
濃度になるまで、ＣＳＴＲ出口およびＵＦ膜透過液での
濃度はほぼ同じく増大した。７０時間目以降には急激に
インドール濃度が上昇して反応を終了せざるを得なかっ
た。
【００２７】
【表４】 第４表 インドール濃度の測定点 インドール濃度が検出限界以下であった時間 ＣＳＴＲ出口 連続運転４５時間 ＵＦ膜／透過液 連続運転４５時間
【００２８】
【発明の効果】インドールおよびＬ−セリンを基質とし
てトリプトファンシンターゼを触媒とする酵素反応を連
続的に行うことにより、Ｌ−トリプトファンを製造する
際に、流通式撹拌槽型反応器のあとに適当な容量をもつ
流通式管型反応器を直列に連結する極めて簡便なＵＦ膜
を有するメンブレンリアクターを使用することにより、
ＵＦ膜からの未反応インドールの漏出タイミングを予想
することが可能となった。よってインドールを反応の後
工程で分離したり、リサイクルしたりする工程が不要と
なり、本発明によるリアクターは工業的にＬ−トリプト
ファンを製造するに当たって極めて有利なものになりう
る。
てトリプトファンシンターゼを触媒とする酵素反応を連
続的に行うことにより、Ｌ−トリプトファンを製造する
際に、流通式撹拌槽型反応器のあとに適当な容量をもつ
流通式管型反応器を直列に連結する極めて簡便なＵＦ膜
を有するメンブレンリアクターを使用することにより、
ＵＦ膜からの未反応インドールの漏出タイミングを予想
することが可能となった。よってインドールを反応の後
工程で分離したり、リサイクルしたりする工程が不要と
なり、本発明によるリアクターは工業的にＬ−トリプト
ファンを製造するに当たって極めて有利なものになりう
る。
【図１】本発明の酵素反応用バイオリアクターの一例を
示すフローシートである。
示すフローシートである。
１ 流通式撹拌槽型反応器（ＣＳＴＲ） ２ 流通式管型反応器（ＰＦＲ） ３ 限外濾過膜（ＵＦ膜モジュール） ４ 反応原料調整槽 ５ 反応生成液貯蔵槽 ６ 循環ポンプ ７ 反応原料供給ポンプ ８ 反応生成液抜き出しポンプ
Claims (1)
- 【請求項１】 トリプトファンシンターゼの存在下に、
インドールとＬ−セリンを酵素反応せしめてＬ−トリプ
トファンを製造するに際し、流通式撹拌槽型反応器、流
通式管型反応器及び限外濾過膜をこの順に直列に連結
し、前記限外濾過膜での濃縮液を前記流通式撹拌槽型反
応器へ循環するバイオリアクターを使用することを特徴
とするＬ−トリプトファンの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12627392A JPH05317067A (ja) | 1992-05-19 | 1992-05-19 | Ｌ−トリプトファンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12627392A JPH05317067A (ja) | 1992-05-19 | 1992-05-19 | Ｌ−トリプトファンの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05317067A true JPH05317067A (ja) | 1993-12-03 |
Family
ID=14931122
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12627392A Pending JPH05317067A (ja) | 1992-05-19 | 1992-05-19 | Ｌ−トリプトファンの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05317067A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000075193A1 (fr) * | 1999-06-08 | 2000-12-14 | Kaneka Corporation | Procede de polymerisation vivante cationique en continu |
| JP2009296921A (ja) * | 2008-06-12 | 2009-12-24 | Toray Ind Inc | 連続培養装置および化学品の製造方法 |
-
1992
- 1992-05-19 JP JP12627392A patent/JPH05317067A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000075193A1 (fr) * | 1999-06-08 | 2000-12-14 | Kaneka Corporation | Procede de polymerisation vivante cationique en continu |
| US6602965B1 (en) | 1999-06-08 | 2003-08-05 | Kaneka Corporation | Method of continuous cationic living polymerization |
| JP2009296921A (ja) * | 2008-06-12 | 2009-12-24 | Toray Ind Inc | 連続培養装置および化学品の製造方法 |
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