NO172064B - PROCEDURE FOR ENZYMATIC SYNTHESIS OF PEPTIDES AND PROCEDURE FOR ENZYMATIC SEPARATION OF RACEMIC CARBOXYLIC ACID COMPOUNDS - Google Patents
PROCEDURE FOR ENZYMATIC SYNTHESIS OF PEPTIDES AND PROCEDURE FOR ENZYMATIC SEPARATION OF RACEMIC CARBOXYLIC ACID COMPOUNDS Download PDFInfo
- Publication number
- NO172064B NO172064B NO881669A NO881669A NO172064B NO 172064 B NO172064 B NO 172064B NO 881669 A NO881669 A NO 881669A NO 881669 A NO881669 A NO 881669A NO 172064 B NO172064 B NO 172064B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- membrane
- peptide
- uncharged
- reaction mixture
- product
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 57
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 35
- -1 CARBOXYLIC ACID COMPOUNDS Chemical class 0.000 title claims description 26
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims description 23
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 title claims description 15
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title claims description 12
- 238000000926 separation method Methods 0.000 title claims description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 96
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 61
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 36
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 32
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 31
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 30
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 30
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 17
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N dodecane Chemical compound CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 15
- VSDUZFOSJDMAFZ-UHFFFAOYSA-N methyl 2-amino-3-phenylpropanoate Chemical compound COC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 VSDUZFOSJDMAFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 11
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 11
- 108010003977 aminoacylase I Proteins 0.000 claims description 11
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 claims description 10
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 claims description 10
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 9
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 8
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 claims description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 7
- 238000009833 condensation Methods 0.000 claims description 7
- 230000005494 condensation Effects 0.000 claims description 7
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 claims description 7
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 claims description 7
- CWNSVVHTTQBGQB-UHFFFAOYSA-N N,N-Diethyldodecanamide Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)N(CC)CC CWNSVVHTTQBGQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 125000005907 alkyl ester group Chemical group 0.000 claims description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 6
- 108010056079 Subtilisins Proteins 0.000 claims description 5
- 102000005158 Subtilisins Human genes 0.000 claims description 5
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 4
- 108010027597 alpha-chymotrypsin Proteins 0.000 claims description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 4
- LQZZUXJYWNFBMV-UHFFFAOYSA-N dodecan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCCCO LQZZUXJYWNFBMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 4
- BXWNKGSJHAJOGX-UHFFFAOYSA-N hexadecan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCO BXWNKGSJHAJOGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000005871 repellent Substances 0.000 claims description 3
- 150000001793 charged compounds Chemical group 0.000 claims description 2
- 239000012982 microporous membrane Substances 0.000 claims description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 claims 1
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 claims 1
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 claims 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 74
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 60
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 25
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 23
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 19
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- IAOZJIPTCAWIRG-QWRGUYRKSA-N aspartame Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)OC)CC1=CC=CC=C1 IAOZJIPTCAWIRG-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 15
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 15
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000000605 aspartame Substances 0.000 description 14
- 229960003438 aspartame Drugs 0.000 description 14
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 14
- 108090001109 Thermolysin Proteins 0.000 description 13
- VSDUZFOSJDMAFZ-VIFPVBQESA-N methyl L-phenylalaninate Chemical compound COC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 VSDUZFOSJDMAFZ-VIFPVBQESA-N 0.000 description 13
- 108010011485 Aspartame Proteins 0.000 description 11
- 235000010357 aspartame Nutrition 0.000 description 11
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 10
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 241000894007 species Species 0.000 description 9
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 9
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 8
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 7
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 7
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 7
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 6
- 108010005636 polypeptide C Proteins 0.000 description 6
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 6
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 5
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 5
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 5
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 5
- IVWWFWFVSWOTLP-YVZVNANGSA-N (3'as,4r,7'as)-2,2,2',2'-tetramethylspiro[1,3-dioxolane-4,6'-4,7a-dihydro-3ah-[1,3]dioxolo[4,5-c]pyran]-7'-one Chemical compound C([C@@H]1OC(O[C@@H]1C1=O)(C)C)O[C@]21COC(C)(C)O2 IVWWFWFVSWOTLP-YVZVNANGSA-N 0.000 description 4
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 4
- VSDUZFOSJDMAFZ-SECBINFHSA-N methyl (2r)-2-amino-3-phenylpropanoate Chemical class COC(=O)[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 VSDUZFOSJDMAFZ-SECBINFHSA-N 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YZQCXOFQZKCETR-UWVGGRQHSA-N Asp-Phe Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 YZQCXOFQZKCETR-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 3
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 3
- 235000019439 ethyl acetate Nutrition 0.000 description 3
- 150000004702 methyl esters Chemical group 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 3
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 3
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- ULGJWNIHLSLQPZ-UHFFFAOYSA-N 7-[(6,8-dichloro-1,2,3,4-tetrahydroacridin-9-yl)amino]-n-[2-(1h-indol-3-yl)ethyl]heptanamide Chemical compound C1CCCC2=NC3=CC(Cl)=CC(Cl)=C3C(NCCCCCCC(=O)NCCC=3C4=CC=CC=C4NC=3)=C21 ULGJWNIHLSLQPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 2
- 241000228257 Aspergillus sp. Species 0.000 description 2
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 2
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 2
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 2
- HUMNYLRZRPPJDN-UHFFFAOYSA-N benzaldehyde Chemical compound O=CC1=CC=CC=C1 HUMNYLRZRPPJDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000009903 catalytic hydrogenation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 2
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 2
- MWKFXSUHUHTGQN-UHFFFAOYSA-N decan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCO MWKFXSUHUHTGQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 2
- BTNMPGBKDVTSJY-UHFFFAOYSA-N keto-phenylpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=O)CC1=CC=CC=C1 BTNMPGBKDVTSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 2
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 2
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 2
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 2
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 2
- KYWIYKKSMDLRDC-UHFFFAOYSA-N undecan-2-one Chemical compound CCCCCCCCCC(C)=O KYWIYKKSMDLRDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- POLGZPYHEPOBFG-NSHDSACASA-N (2s)-2-benzamido-4-methylpentanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)C1=CC=CC=C1 POLGZPYHEPOBFG-NSHDSACASA-N 0.000 description 1
- QDGAVODICPCDMU-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3-[3-[bis(2-chloroethyl)amino]phenyl]propanoic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=CC(N(CCCl)CCCl)=C1 QDGAVODICPCDMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001903 2-oxo-3-phenylpropanoic acid Substances 0.000 description 1
- UDTSPKADQGPZFS-UHFFFAOYSA-N 5-benzylideneimidazolidine-2,4-dione Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C1=CC1=CC=CC=C1 UDTSPKADQGPZFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000590020 Achromobacter Species 0.000 description 1
- 108091005658 Basic proteases Proteins 0.000 description 1
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700033921 EC 3.4.23.20 Proteins 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000018389 Exopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010091443 Exopeptidases Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N L-Aspartic acid Natural products OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 101000621261 Xanthomonas sp. (strain T-22) Xanthomonalisin Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- DEDGUGJNLNLJSR-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxycinnamic acid Natural products OC(=O)C(O)=CC1=CC=CC=C1 DEDGUGJNLNLJSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002528 anti-freeze Effects 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- KCXMKQUNVWSEMD-UHFFFAOYSA-N benzyl chloride Chemical compound ClCC1=CC=CC=C1 KCXMKQUNVWSEMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940073608 benzyl chloride Drugs 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010364 biochemical engineering Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 230000006315 carbonylation Effects 0.000 description 1
- 238000005810 carbonylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000017858 demethylation Effects 0.000 description 1
- 238000010520 demethylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 description 1
- 238000000909 electrodialysis Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940066758 endopeptidases Drugs 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010931 ester hydrolysis Methods 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000058 esterolytic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 229920001600 hydrophobic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000012886 linear function Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- SWVMLNPDTIFDDY-SBSPUUFOSA-N methyl (2r)-2-amino-3-phenylpropanoate;hydrochloride Chemical compound Cl.COC(=O)[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 SWVMLNPDTIFDDY-SBSPUUFOSA-N 0.000 description 1
- 230000001035 methylating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229940094933 n-dodecane Drugs 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 description 1
- QNGNSVIICDLXHT-UHFFFAOYSA-N para-ethylbenzaldehyde Natural products CCC1=CC=C(C=O)C=C1 QNGNSVIICDLXHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 229920005597 polymer membrane Polymers 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000000707 stereoselective effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- BFKJFAAPBSQJPD-UHFFFAOYSA-N tetrafluoroethene Chemical compound FC(F)=C(F)F BFKJFAAPBSQJPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for enzymatisk syntese av peptider, og det særegne ved denne fremgangsmåte er trinnene med: en N-acyl-p-substituert-L-aspartinsyre med en a-karboksylatgruppe kondenseres med en fenylalanin-lavere alkylester med en alfa-ammoniumgruppe, i en vandig reaksjonsblanding inkluderende et kondensasjonsenzym og danner derved N-acyl-L-aspartyl- ((3-substituert) -L-fenylalanin (lavere alkylester) i form av et uladet peptid, The present invention relates to a method for the enzymatic synthesis of peptides, and the distinctive features of this method are the steps of: an N-acyl-p-substituted-L-aspartic acid with an α-carboxylate group is condensed with a phenylalanine-lower alkyl ester with an alpha- ammonium group, in an aqueous reaction mixture including a condensation enzyme and thereby forms N-acyl-L-aspartyl-((3-substituted)-L-phenylalanine (lower alkyl ester) in the form of an uncharged peptide,
dette uladede peptid transporteres fra den vandige reaksjonsblanding gjennom en ibneavstøtningsmembran inn i en produktblanding ved osmose, idet membranen foretrukket omfatter en vannublandbar organisk væske immobilisert i porene av en mikroporøs membran, og this uncharged peptide is transported from the aqueous reaction mixture through an antifreeze membrane into a product mixture by osmosis, the membrane preferably comprising a water-immiscible organic liquid immobilized in the pores of a microporous membrane, and
det uladede peptid i produktblandingen omdannes til en ladet forbindelsesform som ikke kan tilbakediffundere gjennom membranen til den initiale reaksjonsblanding, the uncharged peptide in the product mixture is converted into a charged compound form that cannot diffuse back through the membrane to the initial reaction mixture,
idet omdannelsen av det uladede peptid foretrukket skjer ved enzymatisk spaltning. with the conversion of the uncharged peptide preferably occurring by enzymatic cleavage.
Oppfinnelsen vedrører videre separering av racemiske karboksylsyreforbindelser, og det særegne ved denne fremgangsmåte er at den omfatter trinnene med: hydrolysering av en racemisk karboksylsyreester-forbindelse i en vandig reaksjonsblanding som inkluderer et hydrolyserende enzym for å danne en ladet enantiomer forbindelse og en uladet enantiomer esterforbindelse i den vandige reaksjonsblanding, og The invention further relates to the separation of racemic carboxylic acid compounds, and the peculiarity of this method is that it comprises the steps of: hydrolyzing a racemic carboxylic acid ester compound in an aqueous reaction mixture which includes a hydrolyzing enzyme to form a charged enantiomeric compound and an uncharged enantiomeric ester compound in the aqueous reaction mixture, and
transportering av den uladede enantiomere ester-forbindelse fra den vandige reaksjonsblanding gjennom en ioneavstøtende membran inn i en produktblanding. transporting the uncharged enantiomeric ester compound from the aqueous reaction mixture through an ion-repelling membrane into a product mixture.
Disse og andre trekk ved oppfinnelsen fremgår av patent-kravene. These and other features of the invention appear in the patent claims.
Anvendelse av proteolytiske enzymer som kondensasjons-katalysatorer for den stereospesifikke kobling av to L-amino-syrer til å gi L,L-peptider er kjent siden de The use of proteolytic enzymes as condensation catalysts for the stereospecific coupling of two L-amino acids to give L,L-peptides is known since they
tidligere dager for protein-kjemien. Så tidlig som 1909 earlier days for protein chemistry. As early as 1909
beskrev Mohr og Strohschein dannelse av det vannuoppløse- Mohr and Strohschein described formation of the water-insoluble
lige dipeptid Bz-Leu-Leu-NH^ ved å omsette Bz-Leu-OH og H-Leu-Nr^ i nærvær av det proteinnedbrytende enzym equal dipeptide Bz-Leu-Leu-NH^ by reacting Bz-Leu-OH and H-Leu-Nr^ in the presence of the proteolytic enzyme
papain. E. Mohr og F. Strohschein, Ber 42, 2521 (1909). papain. E. Mohr and F. Strohschein, Ber 42, 2521 (1909).
Mohr og Strohschein-type-reaksjonen er mulig bare mellom diamino-syrer som danner peptid-bindinger som er utsatt The Mohr and Strohschein-type reaction is possible only between diamino acids forming peptide bonds that are exposed
for spaltning med papain eller annet- anvendt enzym. Kondensasjonsreaksjonens likevekt mellom amino-syre-reaksjonskomponentene og peptidproduktet er kraftig forskjøvet mot de reagerende amino-syrer. Likevel kan for cleavage with papain or another enzyme used. The condensation reaction's equilibrium between the amino acid reaction components and the peptide product is strongly shifted towards the reacting amino acids. Still can
kondensasjonsreaksjonen drives til fullføring ved hjelp av massevirkning hvis -f.eks. dipeptid-produktet er dårlig oppløselig og felles ut av reaksjonsfasen. the condensation reaction is driven to completion by means of mass action if - e.g. the dipeptide product is poorly soluble and precipitates out of the reaction phase.
På grunn av den kommersielle betydning av visse peptider Because of the commercial importance of certain peptides
og det faktum at enzymer er kjent å katalysere peptid- and the fact that enzymes are known to catalyze peptide-
dannelse under milde betingelser har det vært foretatt mye forskning på den enzymatiske syntese av peptider og særlig enkle dipeptider. K. Oyama og K. Kihara, Kagaku Sosetsu 35, 195 (1982); K. Oyama og K. Kihara, ChemTech. formation under mild conditions, much research has been carried out on the enzymatic synthesis of peptides and particularly simple dipeptides. K. Oyama and K. Kihara, Kagaku Sosetsu 35, 195 (1982); K. Oyama and K. Kihara, ChemTech.
14, 100 (1984). 14, 100 (1984).
Fremgangsmåten for enzymatisk syntese av peptid-derivatet aspartam, beskrevet i US patentskrift nr. 4.165.311, i det følgende benevnt 311-prosessen, innbefatter den termolysin-katalyserte kondensasjon av N-karbobenzoksy-L-aspartin-syre med D,L-fenylalanin-metyl-ester og The process for the enzymatic synthesis of the peptide derivative aspartame, described in US Patent No. 4,165,311, hereinafter referred to as the 311 process, involves the thermolysin-catalyzed condensation of N-carbobenzoxy-L-aspartic acid with D,L-phenylalanine -methyl ester and
utfelling av et mellomprodukt-kompleks, D-fenylalanin-metyl-ester-salt av N-karbobenzoksy-aspartam, for å drive reaksjonen til peptid-produktsiden. Videre behandling av dette mellomprodukt-kompleks tillater utvinning av D-fenylalanin-metyl-ester som kan resirkuleres etter racemisering, og av N-karbobenzoksy-aspartam-derivatet som kan omdannes til aspartam ved fjernelse av den N-karbobenzoksy-beskyttende gruppe. 311-prosessen må utøves på porsjonsbasis som er omstendelig og kompliserer gjenvinningen av enzym. Se også K. Oyama, S Irino, T. Harada og N. Hagi, Ann. N.Y. Acad. Sei. 434, 95 (1985). Willi Kullmann, Enzymatic Peptide Synthesis (1987). precipitation of an intermediate complex, D-phenylalanine methyl ester salt of N-carbobenzoxy-aspartame, to drive the reaction to the peptide product side. Further treatment of this intermediate complex allows recovery of D-phenylalanine methyl ester which can be recycled after racemisation, and of the N-carbobenzoxy-aspartame derivative which can be converted to aspartame by removal of the N-carbobenzoxy protecting group. The 311 process must be performed on a batch basis which is cumbersome and complicates the recovery of enzyme. See also K. Oyama, S. Irino, T. Harada, and N. Hagi, Ann. NEW. Acad. Pollock. 434, 95 (1985). Willi Kullmann, Enzymatic Peptide Synthesis (1987).
Den N-karbobenzoksy-beskyttende gruppe spiller en vesentlig rolle i 311-prosessen: ved å oppfylle det strukturelle krav som settes av det aktive punkt i termolysin, og ved å bidra til uoppløseligheten av mellomprodukt-komplekset slik at utbyttet ved reaksjonen øker. Fjernelse av den N-karbobenzoksy-beskyttende gruppe fra aspartam-derivatet må gjennomføres under milde betingelser, f.eks. The N-carbobenzoxy protecting group plays an essential role in the 311 process: by fulfilling the structural requirement set by the active point in thermolysin, and by contributing to the insolubility of the intermediate complex so that the yield of the reaction increases. Removal of the N-carbobenzoxy protecting group from the aspartame derivative must be carried out under mild conditions, e.g.
katalytisk hydrogenering, for å forhindre spaltning av metylester-funksjonen. Katalytisk hydrogenering innbefatter ulempen ved å håndtere hydrogengass i stor skala. catalytic hydrogenation, to prevent cleavage of the methyl ester function. Catalytic hydrogenation involves the disadvantage of handling hydrogen gas on a large scale.
Alternative forsøk på å drive enzymatiske kondensasjons-reaksjoner til fullstendighet er også beskrevet i den kjemiske litteratur. F.eks. er bruken av organiske løsningsmidler som reaksjonsmedier blitt funnet å være effektive for å øke peptid-produktutbyttene selv om den samtidige nedsettelse av enzymstabiliteten har forhindret dets bruk i stor målestokk, K. Oyama, S. Nishimura, Y. Nonaka, K. Hihara og T. Hashimoto, J. Org. Chem. 46, 5241 Alternative attempts to drive enzymatic condensation reactions to completion are also described in the chemical literature. E.g. the use of organic solvents as reaction media has been found to be effective in increasing peptide product yields although the concomitant decrease in enzyme stability has prevented its use on a large scale, K. Oyama, S. Nishimura, Y. Nonaka, K. Hihara and T .Hashimoto, J. Org. Chem. 46, 5241
(1981); H. Ooshima, H. Mori og Y. Harano, Biotechnology Letters 7, 789 (1985) og K. Nakanishi, T. Kamikubo og (1981); H. Ooshima, H. Mori and Y. Harano, Biotechnology Letters 7, 789 (1985) and K. Nakanishi, T. Kamikubo and
R. Matsuno, Biotechnology 3, 459 (1985). R. Matsuno, Biotechnology 3, 459 (1985).
På bakgrunn av de ovennevnte vanskeligheter ved utøvelse av tidligere kjente metoder for enzymatisk syntese av peptider, særlig kravene til utfelling av et mellomprodukt-kompleks og håndtering av farlige reagenser har det vært ønskelig å tilveiebringe en forbedret fremgangsmåte som unngår disse vanskeligheter og som sikkert tilveiebringer effektive utbytter uten hurtig deaktivering av enzym-katalysatorene. On the basis of the above-mentioned difficulties in carrying out previously known methods for the enzymatic synthesis of peptides, in particular the requirements for the precipitation of an intermediate product complex and the handling of dangerous reagents, it has been desirable to provide an improved method which avoids these difficulties and which certainly provides effective yields without rapid deactivation of the enzyme catalysts.
Den foreliggende oppfinnelse oppfyller disse formål. The present invention fulfills these purposes.
De foregående og andre formål og fordeler oppnås ved oppfinnelsen som det fremgår av den etterfølgende detaljerte beskrivelse sett i sammenheng med de vedføyde tegninger hvori: Figur 1 er et skjematisk illustrasjon av den enzymatiske syntese av aspartam i samsvar med den foreliggende oppfinnelse. Figur 2 er et skjematisk riss av et apparat for utøvelse av fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse. Figur 3 er en grafisk fremstilling som illustrerer mengden av produkt (aspartam-derivat) funnet over tid i eksemplene 1 og 2. Figur 4 er et grafisk fremstilling som illustrerer mengden av produkt (aspartam-derivat) dannet over tid i eksempel 4. Figur 5 er en grafisk fremstilling som illustrerer mengden av produkt (aspartam-derivat) dannet over tid i eksempel 5. Figur 6 er en grafisk fremstiling som illustrerer mengden av produkt (aspartam-derivat) dannet over tid i eksempel 6. Figur 7 er en grafisk fremstiling som illustrerer mengden av produkt (aspartam-derivat) dannet over tid i The foregoing and other objects and advantages are achieved by the invention as can be seen from the subsequent detailed description seen in connection with the attached drawings in which: Figure 1 is a schematic illustration of the enzymatic synthesis of aspartame in accordance with the present invention. Figure 2 is a schematic view of an apparatus for carrying out the method according to the present invention. Figure 3 is a graphical representation illustrating the amount of product (aspartame derivative) found over time in examples 1 and 2. Figure 4 is a graphical representation illustrating the amount of product (aspartame derivative) formed over time in example 4. Figure 5 is a graphical representation illustrating the amount of product (aspartame derivative) formed over time in example 5. Figure 6 is a graphical representation illustrating the amount of product (aspartame derivative) formed over time in example 6. Figure 7 is a graphical representation which illustrates the amount of product (aspartame derivative) formed over time i
eksempel 7. example 7.
Figur 8 er en grafisk fremstilling som illustrerer mengden av produkt (aspartam-derivat) dannet over tid i eksempel 8. Figur 9 er en skjematisk fremstilling av et apparat for utøvelse av den foreliggende oppfinnelse og illustrerer beholderne på produktsiden som beskrevet i eksempel 9. Figur 10 er en grafisk fremstilling som illustrerer mengden av produkt (aspartam-derivat) dannet over tid i eksempel 9 med og uten anvendelse av en ione-bytterharpiks. Figure 8 is a graphic representation illustrating the amount of product (aspartame derivative) formed over time in example 8. Figure 9 is a schematic representation of an apparatus for practicing the present invention and illustrates the containers on the product side as described in example 9. Figure 10 is a graphic representation illustrating the amount of product (aspartame derivative) formed over time in Example 9 with and without the use of an ion exchange resin.
Oppfinnelsen omhandlet heri tilveiebringer en prosedyre for å drive den enzymatiske syntese av peptider i en vandig reaksjonsblanding til fullstendighet ved å The invention disclosed herein provides a procedure for driving the enzymatic synthesis of peptides in an aqueous reaction mixture to completion by
separere det uladede peptid-mellomprodukt, eller derivat derav, fra reaksjonsblandingen ved hjelp av en membran som selektivt transporterer det uladede peptid ut av reaksjonsblandingen inn i en produktblanding. På grunn av at membranen er hovedsakelig impermeabel overfor reaksjonskomponenter (ladede molekyler) bevirker fjernelse av peptid-mellomproduktet fra reaksjonsblandingen en nedsettelse av peptidkonsentrasjonen ved likevekt som forskyver reaksjonen mot fullstendighet ved massevirkning. separating the uncharged peptide intermediate, or derivative thereof, from the reaction mixture by means of a membrane which selectively transports the uncharged peptide out of the reaction mixture into a product mixture. Because the membrane is essentially impermeable to reaction components (charged molecules), removal of the peptide intermediate from the reaction mixture causes a decrease in the peptide concentration at equilibrium which shifts the reaction towards completion by mass action.
De membraner som er mest egnet ved utøvelse av den foreliggende oppfinnelse er "Immobilized Liquid Membranes" (ILM) omfattende en ikke-polar væske innleiret The membranes most suitable for practicing the present invention are "Immobilized Liquid Membranes" (ILM) comprising a non-polar liquid embedded
i et mikroporøst bærermaterial, foretrukket et polymert ark som er hovedsakelig ugjennomtrengelig for enzymene, reaksjonskomponentene og produktene. Hydrofobe polymerer som f.eks. polypropylen er foretrukne bærer-materialer. ILM-moduler kan fremstilles under anvendelse in a microporous support material, preferably a polymeric sheet which is substantially impermeable to the enzymes, reaction components and products. Hydrophobic polymers such as polypropylene are preferred carrier materials. ILM modules can be manufactured during application
av polypropylen-hulfibre. "Celgard" er et eksempel på kommersielt tilgjengelige hulfibre av polypropylen. Innleirings-forbindelser kjent på området og polyvinylklorid-rør eller slanger kan eventuelt anvendes ved fremstilling av en ILM-modul. En ytterligere polymer for fremstilling av det mikroporøse bærermaterial er "TEFLON" som et eksempel på of polypropylene hollow fibres. "Celgard" is an example of commercially available polypropylene hollow fibers. Embedding compounds known in the field and polyvinyl chloride pipes or hoses can optionally be used when manufacturing an ILM module. A further polymer for making the microporous support material is "TEFLON" as an example
fluorerte hydrokarbon-polymerer. fluorinated hydrocarbon polymers.
Mikroporene passerer gjennom bærermaterialet og kan gis en størrelse slik at en immobilisert"væske vil bli fastholdt deri ved kapillaritetskrefter og vil ikke unnslippe derfra når materialet utsettes f.eks. for trykkdifferensialer over membranet eller andre vanlige reaksjonsbetingelser. Ut fra de ovennevnte begrensninger er det fordelaktig å maksimalisere kontaktområdet mellom den immobiliserte væske og reaksjonsblandingen for å maksimalisere overføringstakten (fluks) av det uladede peptidprodukt gjennom membranen. Det vil være klart at det foretrukne porestørrelse vil variere i avhengighet av egenskapene av den spesielle immobiliserte væske, anvendte reaksjonskomponenter, produkter som fremstilles og lignende faktorer, og videre at den optimale pore-størrelse kan bestemmes empirisk av fagkyndige på området. En nyttige drøftelse av porestørrelses-seleksjon finnes i US patentskrift nr. 4.174.374. Bruken og fremstillingen av immobiliserte væskemembraner er beskrevet i følgende henvisninger, S.L.. Matson, J.A. Quinn, Coupling Separation and Enrichment to Chemical Conversion in a Membrane Reactor, et arbeid fremlagt ved AICHE Annual Meeting, New Orleans, Louisiana (November 8-12, 1981) og S.L. Matson og J.A. Quinn, Membrane Reactors in Bioprocessing, Ann. N.Y. Acad. Sei. 469, 152 (1986). The micropores pass through the carrier material and can be sized so that an immobilized "liquid" will be retained therein by capillarity forces and will not escape from there when the material is exposed, for example, to pressure differentials across the membrane or other common reaction conditions. Based on the above limitations, it is advantageous to maximize the contact area between the immobilized liquid and the reaction mixture to maximize the rate of transfer (flux) of the uncharged peptide product through the membrane. It will be appreciated that the preferred pore size will vary depending on the properties of the particular immobilized liquid, reaction components used, products being prepared and similar factors, and further that the optimal pore size can be determined empirically by experts in the field. A useful discussion of pore size selection can be found in US Patent No. 4,174,374. The use and manufacture of immobilized liquid membranes is described in the following reference is, S.L.. Matson, J.A. Quinn, Coupling Separation and Enrichment to Chemical Conversion in a Membrane Reactor, a paper presented at the AICHE Annual Meeting, New Orleans, Louisiana (November 8-12, 1981) and S.L. Matson and J.A. Quinn, Membrane Reactors in Bioprocessing, Ann. NEW. Acad. Pollock. 469, 152 (1986).
Den immobiliserte væske som fastholdes i den mikroporøse bærer ved kapillaritetskrefter bør være vann-ublandbar og et godt løsningsmiddel for det uladede peptidprodukt som skal transporteres gjennom membranen (diffuseres) The immobilized liquid retained in the microporous support by capillarity forces should be water-immiscible and a good solvent for the uncharged peptide product to be transported through the membrane (diffuse)
med en rimelig takt, dvs. gode transportegenskaper/høy fluks, mens ladede eller ioniserte molekyler på både reaksjonssiden og produktsiden av membranen for det meste ikke transporteres gjennom membranen i noen retning, dvs. god selektivitet/ionavstøtning. at a reasonable rate, i.e. good transport properties/high flux, while charged or ionized molecules on both the reaction and product side of the membrane are mostly not transported through the membrane in any direction, i.e. good selectivity/ion repulsion.
Seleksjon av den beste kombinasjon av bærermaterial og immobilisert væske for bruk ved en enzymatisk syntese av et peptid i samsvar med den foreliggende oppfinnelse vil delvis avhenge av arten av de spesielle reaksjonskomponenter som anvendes, ønskede produkter og løsnings-midler i systemet. Selection of the best combination of carrier material and immobilized liquid for use in an enzymatic synthesis of a peptide in accordance with the present invention will depend in part on the nature of the particular reaction components used, desired products and solvents in the system.
De generelt foretrukne immobilsierte væsker for utøvelse av den foreliggende oppfinnelse inkluderer vann-ublandbare organiske løsningsmidler, som f.eks. forgrenede og uforgrenede alkoholer med 6 til 12 karbonatomer, f.eks. n-dekanol, n-dodekanol, n-heksadekanol og blandinger derav. Også foretrukket er blandinger av vannublandbare organiske løsningsmidler inklusive blandinger derav. Slike løsningsmidler inkluderer, men er ikke begrenset til N,N-dietyldodekanamid, dodekan og 2-undekanon. The generally preferred immobilized liquids for practicing the present invention include water-immiscible organic solvents, such as e.g. branched and unbranched alcohols with 6 to 12 carbon atoms, e.g. n-decanol, n-dodecanol, n-hexadecanol and mixtures thereof. Also preferred are mixtures of water-immiscible organic solvents including mixtures thereof. Such solvents include, but are not limited to, N,N-diethyldodecanamide, dodecane, and 2-undecanone.
En ytterligere type av membran egnet ved utøvelse av den foreliggende oppfinnelse omfatter hydrofobe faste filmer fremstilt av organiske polymerer som f.eks. polyvinyl-klorid eller lignende. Fremstillingen av disse polymer-membraner er godt beskrevet i litteraturen, f.eks. A further type of membrane suitable in the practice of the present invention comprises hydrophobic solid films made from organic polymers such as e.g. polyvinyl chloride or the like. The production of these polymer membranes is well described in the literature, e.g.
O.J. Sweeting, utgiver, Science and Technology of O.J. Sweeting, publisher, Science and Technology of
Polymer Films, Interscience, New York (1968), mens utstrakt bruk av disse membraner ved separering av gasser og væsker er drøftet i S.T. Hwang og K. Kammermeyer, Membranes in Separations, Techniques of Chemistry, Vol. VII, (A. Weissberger, utgiver) John Wiley & Sons, Inc., New York (1975) . Polymer Films, Interscience, New York (1968), while extensive use of these membranes in the separation of gases and liquids is discussed in S.T. Hwang and K. Kammermeyer, Membranes in Separations, Techniques of Chemistry, Vol. VII, (A. Weissberger, Publisher) John Wiley & Sons, Inc., New York (1975) .
En foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen anvender en membran-reaktor/separator-system som tilveiebringer en vandig reaksjonsblanding eller fase som sirkulerer i kontakt med en side av en ILM-membran og en vandig produkt-fase eller blanding som sirkulerer i motstrøm ved den motsatte siden av membranen. S.L. Matson og J.A. Quinn, Ann. N.Y. Acad. Sei. 469, 152 (1986). pH og temperaturen ved reaksjonen og produktfåsene opprettholdes ved en verdi som holder reaksjonskomponentene i en form som nedsetter deres transport gjennom membranen ved pH mellom 4,0 og 9,0 til et minimum. Transport av det uladede peptid-mellomprodukt fra reaksjonsfasen til produktfasen drives av konsentrasjonsgradienten over membranen etablert ved å øke nøytral- eller uladet peptidkonsentrasjon i reaksjonsfasen . Transport-aktiviteten eller fluksen gjennom membranen kan vesentlig forbedres ved den samtidig, irreversible omdannelse av det transporterte peptid i produktfasen, til en species som ikke kan diffundere tilbake. F.eks. kan den sist-nevnte omdannelse resultere i dannelse av et polart peptid som ikke kan diffundere tilbake og således supplere drivkraften for å oppnå fullstendiggjøring av koblingsreaksjonen. Et eksempel på en membranreaktor/separator som kan tilpasses for utøvelse av den foreliggende oppfinnelse finnes i US patentskrift nr. 4.187.086. A preferred embodiment of the invention utilizes a membrane reactor/separator system which provides an aqueous reaction mixture or phase circulating in contact with one side of an ILM membrane and an aqueous product phase or mixture circulating countercurrently on the opposite side of the membrane. S.L. Matson and J.A. Quinn, Ann. NEW. Acad. Pollock. 469, 152 (1986). The pH and temperature of the reaction and product phases are maintained at a value that keeps the reaction components in a form that reduces their transport through the membrane at pH between 4.0 and 9.0 to a minimum. Transport of the uncharged peptide intermediate from the reaction phase to the product phase is driven by the concentration gradient across the membrane established by increasing neutral or uncharged peptide concentration in the reaction phase. The transport activity or the flux through the membrane can be significantly improved by the simultaneous, irreversible transformation of the transported peptide in the product phase into a species that cannot diffuse back. E.g. can the latter conversion result in the formation of a polar peptide which cannot diffuse back and thus supplement the driving force to achieve completion of the coupling reaction. An example of a membrane reactor/separator that can be adapted for the practice of the present invention can be found in US Patent No. 4,187,086.
Tilgjengelige alternative membranreaktor/separator-konfigurasjoner som kan tilpasses utøvelse av den foreliggende oppfinnelse inkluderer hulfibermodulene beskrevet i UK patentansøkning nr. 2.047.564 A, og konvensjonelle plater- og ramme-type filterinnretninger som er vel kjent på området. Available alternative membrane reactor/separator configurations that can be adapted to the practice of the present invention include the hollow fiber modules described in UK Patent Application No. 2,047,564 A, and conventional plate and frame type filter devices which are well known in the art.
I tillegg til selektiv transport av det uladede peptid tilveiebringer membranen en barriere mellom reaksjonsfasen og produktfasen som forhindrer uønsket blanding av og reaksjoner mellom komponentene i hver fase. In addition to selective transport of the uncharged peptide, the membrane provides a barrier between the reaction phase and the product phase that prevents unwanted mixing of and reactions between the components of each phase.
Ved en foretrukket membranreaktor/separator i samsvar med den foreliggende oppfinnelse blir den kjemiske likevekt mellom reaksjonskomponentene faktisk "forskjøvet" gjennom membranen ved å gjennomføre en irreversibel omdannelse av det transporterte uladede peptid, til en membran-impermeabel species, på produktsiden av membranen. Denne type av membranreaktor/ separator anvender en koblet to-enzym (E 1 og E 2) prosess av den generelle type: In a preferred membrane reactor/separator in accordance with the present invention, the chemical equilibrium between the reaction components is actually "shifted" through the membrane by carrying out an irreversible conversion of the transported uncharged peptide, into a membrane-impermeable species, on the product side of the membrane. This type of membrane reactor/separator uses a coupled two-enzyme (E 1 and E 2) process of the general type:
De ladede reaksjonskomponenter A og B er aminosyrer og/eller små peptider som kondenseres ved hjelp av det peptiddannende enzym E"<*>" til å danne det uladede mellomproduktpeptid C som transporteres selektivt gjennom membranen til produktsiden. Det er klart at de reaktive funksjonelle grupper i reaksjonskomponentene som ikke deltar i den ønskede reaksjon kan beskyttes eller blokkeres om nødvendig for å forhindre uønskede bireaksjoner og/eller endringer i produktene. På produktsiden av membransiden blir det uladede peptid C omdannet til det ladede peptid D som ikke kan diffundere tilbake gjennom membranen slik at den kjemiske likevekt i reaksjonsblandingen bringes til å forskyves i retning av produksjon av mer C. The charged reaction components A and B are amino acids and/or small peptides which are condensed by the peptide forming enzyme E"<*>" to form the uncharged intermediate peptide C which is selectively transported through the membrane to the product side. It is clear that the reactive functional groups in the reaction components which do not participate in the desired reaction can be protected or blocked if necessary to prevent unwanted side reactions and/or changes in the products. On the product side of the membrane side, the uncharged peptide C is converted into the charged peptide D which cannot diffuse back through the membrane so that the chemical equilibrium in the reaction mixture is shifted in the direction of the production of more C.
Dette konsept illustreres i fig. 1 for det spesielle tilfelle av enzymatisk kondenserng av D,L-fenylalanin-metyl-ester med (N- og -beskyttet) N-formyl-g-benzyl-L-aspartat, i nærvær av termolysin ved omtrent pH 5,5. This concept is illustrated in fig. 1 for the special case of the enzymatic condensation of D,L-phenylalanine methyl ester with (N- and -protected) N-formyl-g-benzyl-L-aspartate, in the presence of thermolysin at about pH 5.5.
I reaksjonsskjemaet illustrert i fig. 1 er reaksjonskomponenten A<+> D, L-f enylalanin-metyl-ester og B_ er N-formyl-3-benzyl-L-aspartat. Reaksjonskomponentene kondenseres på reaksjonstiden av membranen ved hjelp av enzymet E"<*>" termolysin som danner det uladede peptid C. pH velges slik at reaksjonskomponentene opprettholdes i deres ladede tilstand og nedsetter således deres diffusjon gjennom membranen sammen med det uladede peptid C til et minimum. In the reaction scheme illustrated in fig. 1 is the reaction component A<+> D, L-phenylalanine methyl ester and B_ is N-formyl-3-benzyl-L-aspartate. The reaction components are condensed during the reaction time by the membrane with the help of the enzyme E"<*>" thermolysin which forms the uncharged peptide C. The pH is chosen so that the reaction components are maintained in their charged state and thus reduces their diffusion through the membrane together with the uncharged peptide C to a minimum .
Selv om den kjemiske likevekt for kondensasjonsreaksjonen stort sett begunstiger reaksjonskomponent A<+ >og B species, krever diffusjon av det uladede peptidprodukt C gjennom membranen til produktsiden konstant produksjon av C for å opprettholde den kjemiske likevekt på reaksjonssiden av membranen. Although the chemical equilibrium for the condensation reaction largely favors reaction component A<+ >and B species, diffusion of the uncharged peptide product C through the membrane to the product side requires constant production of C to maintain the chemical equilibrium on the reaction side of the membrane.
På produktsiden av membranen omdanner et esteraseenzym E 2 hurtig og irreversibelt det uladede peptid C som har diffundert gjennom membranen til ladet peptid D som ikke kan diffundere tilbake til reaksjonssiden. Den kjemiske likevekt på reaksjonssiden blir således effektivt On the product side of the membrane, an esterase enzyme E 2 quickly and irreversibly converts the uncharged peptide C that has diffused through the membrane into charged peptide D that cannot diffuse back to the reaction side. The chemical equilibrium on the reaction side thus becomes effective
"trukket" gjennom membranen og mot produksjon av uladet produkt C. Deretter omdannes peptidet D til aspartam ved hjelp av sur hydrolyse, som fjerner formyl- og benzyl-beskyttende grupper, etterfulgt av C-terminal ende-forestring med metanol. "pulled" through the membrane and towards the production of uncharged product C. Peptide D is then converted to aspartame by acid hydrolysis, which removes formyl and benzyl protecting groups, followed by C-terminal end-esterification with methanol.
Den ovenstående metode kan gjennomføres i en motstrøms-membranreaktor/separator 10, som vist i fig. 2, ved å arbeide under kontrollerte betingelser med hensyn til pH og temperatur, slik at en reaksjonsblanding omfattende ert N-acyl-g-substituert-L-aspartin-syre, f.eks. N-formyl-3-benzyl-L-aspartat, med en fri a-karboksylat-gruppe The above method can be carried out in a counter-flow membrane reactor/separator 10, as shown in fig. 2, by working under controlled conditions with regard to pH and temperature, so that a reaction mixture comprising pea N-acyl-g-substituted-L-aspartic acid, e.g. N-formyl-3-benzyl-L-aspartate, with a free α-carboxylate group
(elektronegativ species) som får kondensere med en reaksjonskomponent, f.eks. D,L-fenylalanin-metyl-ester, (electronegative species) which is allowed to condense with a reaction component, e.g. D,L-phenylalanine methyl ester,
med en protonert fri a-amino-gruppe (elektropositiv species) under den katalytiske innvirkning av protease with a protonated free α-amino group (electropositive species) under the catalytic action of protease
aktive i pH-området omtrent 4,0 til 9,0 , til å gi et fullstendig beskyttet L-aspartyl-L-fenylalanin-dipeptid som ikke bærer noen ioniserte grupper (elektronoytral species). På reaksjonssiden av membranen sirkuleres reaksjonsblandingen fra reaktortanken 12 ved hjelp av pumpen 14, gjennom innførselsledningen 16 gjennom separatoren 18 til utførselsledningen 20 som returnerer til reaktortanken 12. På produktsiden av membranen blir en produktblanding eller opptaksblanding som inkluderer fullt beskyttet uladet peptid, f.eks. N-formyl-ø-benzyl-L-aspartyl-L-fenylalanin-metyl-ester som er transportert gjennom membranen, sirkulert fra produktreaktortanken 22, ved hjelp av pumpen 24, gjennom produkttilførsels-ledningen 26, gjennom produktsiden av separatoren 18, active in the pH range approximately 4.0 to 9.0, to give a fully protected L-aspartyl-L-phenylalanine dipeptide bearing no ionized groups (electroneutral species). On the reaction side of the membrane, the reaction mixture is circulated from the reactor tank 12 by means of the pump 14, through the inlet line 16 through the separator 18 to the outlet line 20 which returns to the reactor tank 12. On the product side of the membrane, a product mixture or uptake mixture that includes fully protected uncharged peptide, e.g. N-formyl-ø-benzyl-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester which is transported through the membrane, circulated from the product reactor tank 22, by means of the pump 24, through the product supply line 26, through the product side of the separator 18,
til produkt-utførselsledningen 30. Denne produktblanding inkluderer et annet enzym E 2 i form av en esterase, eller annen passende reagens, som kan spalte i det minste en av de beskyttede grupper som bæres av det uladede peptid slik at det utvikles en elektroladet species som ikke kan unnslippe opptaksstrømmen ved å diffundere tilbake gjennom membranen. Hvis en esterase anvendes vil en foretrukket esterase ha en proteolytisk aktivitet og et foretrukket pH-område på fra omtrent 6,0 til 9,0. Aminoacylace I, a-chymotrypsin og subtilisin A er eksempler på esteraser som er ansett som nyttige ved den foreliggende oppfinnelse. to the product outlet line 30. This product mixture includes another enzyme E 2 in the form of an esterase, or other suitable reagent, which can cleave at least one of the protected groups carried by the uncharged peptide so that an electro-charged species is developed which cannot escape the uptake current by diffusing back through the membrane. If an esterase is used, a preferred esterase will have a proteolytic activity and a preferred pH range of from about 6.0 to 9.0. Aminoacylace I, α-chymotrypsin and subtilisin A are examples of esterases which are considered useful in the present invention.
Det ladede produkt kan periodisk tømmes ut og/eller kontinuerlig fjernes fra produktfasen ved konvensjonelle midler som f.eks. ionebytterharpikser, og den resterende utstrømning kan resirkuleres gjennom systemet. Det resulterende produkt bundet til ionebytterharpiksen kan desorberes og utvinnes under anvendelse av konvensjonelle prosedyrer. The charged product can be periodically emptied out and/or continuously removed from the product phase by conventional means such as e.g. ion exchange resins, and the remaining effluent can be recycled through the system. The resulting product bound to the ion exchange resin can be desorbed and recovered using conventional procedures.
Seleksjonen av passende avbeskyttelsesreagenser bestemmes ved den kjemiske art av de beskyttende grupper anvendt på reaksjonskomponentene, som f.eks. N-beskyttet-L-aspartinsyre, og som indikert i det foregående blir valget av beskyttende grupper i sin tur diktert av strukturmessige begrensninger som pålegges ved det aktive punkt av det kondenserende enzym. The selection of suitable deprotection reagents is determined by the chemical nature of the protecting groups applied to the reaction components, such as N-protected-L-aspartic acid, and as indicated above, the choice of protecting groups is in turn dictated by structural constraints imposed at the active site of the condensing enzyme.
Generelt er enzymene brukbare ved utøvelsen av den foreliggende oppfinnelse proteolytiske enzymer, enkelte ganger benevnt proteaser, som kan deles i to grupper. In general, the enzymes usable in the practice of the present invention are proteolytic enzymes, sometimes referred to as proteases, which can be divided into two groups.
Den mest vanlige anvendte er endopeptidaser, som bare spalter indre bindinger, so eksopeptidaser, som bare spalter terminale endebindinger. Brukbare enzymer inkluderer serinproteinaser (EC 3.4.21) som chymotrypsin, trypsin, subtilisin BNP' og Achromobacter protease, videre tiol proteinaser (EC 3.4.22), som f.eks. papain, karboksyl-proteinaser (EC 3.4.23) som pepsin, og metallo-proteinaser (EC 3.4.24) som f.eks. termolysin, prolisin, Tacynasen N (St. caespitosus) og Dispase. Binding av enzymene til uoppløselige bærere, ved å følge prosedyrer som er vel kjent for fagkyndige på området, kan innlemmes ved utøvelsen av oppfinnelsen, og selv om binding av enzymene ikke er noe vesentlig trinn, kan den være ønskelig for visse anvendelser. Blant de mange proteaser som er potensielt nyttige ved utøvelse av oppfinnelsen er termolysin (EC 3.4.24) det kondenserende enzym som er mest foretrukket på grunn av dets bemerkelsesverdige termostabilitet, lette tilgjengelighet, lave pris og brede brukbare pH-områder mellom omtrent 5,0 og 9,0. Andre foretrukne proteaser inkluderer pepsin og penicillo-pepsin (T- Hofmann og R. Shaw, Biochim. Biophys. Acta. The most commonly used are endopeptidases, which only cleave internal bonds, and exopeptidases, which only cleave terminal end bonds. Useful enzymes include serine proteinases (EC 3.4.21) such as chymotrypsin, trypsin, subtilisin BNP' and Achromobacter protease, further thiol proteinases (EC 3.4.22), such as e.g. papain, carboxyl proteinases (EC 3.4.23) such as pepsin, and metallo-proteinases (EC 3.4.24) such as thermolysin, prolysin, Tacynasen N (St. caespitosus) and Dispase. Binding of the enzymes to insoluble supports, following procedures well known to those skilled in the art, may be incorporated in the practice of the invention, and although binding of the enzymes is not an essential step, it may be desirable for certain applications. Among the many proteases potentially useful in the practice of the invention, thermolysin (EC 3.4.24) is the most preferred condensing enzyme because of its remarkable thermostability, easy availability, low cost, and wide usable pH ranges between about 5.0 and 9.0. Other preferred proteases include pepsin and penicillo-pepsin (T- Hofmann and R. Shaw, Biochim. Biophys. Acta.
92 543 (1964)) og termostabil protease fra penicillium duponti (S. Emi, D.V. Myers og G.A. Iacobucci, Bio-chemistry 15, 842 (1976)). Disse ville forventes å 92 543 (1964)) and thermostable protease from penicillium duponti (S. Emi, D. V. Myers and G. A. Iacobucci, Bio-chemistry 15, 842 (1976)). These would be expected to
virke ved pH omtrent 5,5, fremvise god stabilitet ved slike pH-verdier og ikke kreve nærvær av Zn<++> og Ca<++->ioner for å opprettholde deres aktivitet. act at pH approximately 5.5, exhibit good stability at such pH values and do not require the presence of Zn<++> and Ca<++> ions to maintain their activity.
Den praktiske etablering av enantiomerisk selektivitet, som i det tilfelle som er beskrevet i det foregående, er fremstilling av bare L,L-isomeren av peptidet C, er direkte forbundet med det valgte enzym, optimal virke-måte for membranen, kjemisk art av bærermaterialet og pH i den vandige reaksjonsfase. The practical establishment of enantiomeric selectivity, which in the case described above is the production of only the L,L isomer of the peptide C, is directly related to the chosen enzyme, optimal mode of action of the membrane, chemical nature of the carrier material and pH in the aqueous reaction phase.
En foretrukket membran for utøvelse av den ovenfor beskrevne spesifikke metode er et mikroporøs poly-propylenbærermaterial som inkluderer en blanding av n-heksadekanol og n-dodekan immobilisert deri. Denne membran kan fås under handelsnavnet A preferred membrane for practicing the specific method described above is a microporous polypropylene support material which includes a mixture of n-hexadecanol and n-dodecane immobilized therein. This membrane is available under the trade name
"Type 1 Hollow Fiber Selective Dialysis Mebrane" og foretrekkes med reaksjonene i eksemplene 1 til 4. En annen foretrukket membran anvender "Celgard " "Type 1 Hollow Fiber Selective Dialysis Mebrane" and is preferred with the reactions in Examples 1 to 4. Another preferred membrane uses "Celgard"
Type 2400 polypropylen hulfiber som er et Type 2400 polypropylene hollow fiber which is a
mikroporøst bærermaterial som inkluderer en blanding av 30% volum/volum N,N-dietyl-dodekanamid i dodekan som vann-uoppløselig organisk væske som immobiliseres ved kapillaritet i porene av et mikroporøst ark av "Celgard". Denne membran angis som "Type 2 Hollow Fiber Selective Dialysis microporous carrier material which includes a mixture of 30% v/v N,N-diethyl dodecanamide in dodecane as a water-insoluble organic liquid which is immobilized by capillarity in the pores of a microporous sheet of "Celgard". This membrane is designated as "Type 2 Hollow Fiber Selective Dialysis
Membrane" og foretrekkes ved reaksjonene i eksemplene 5-9. "Celgard" type 2400 polypropylen hulfibre med porestørrelse 0,025 til 0,050 } im og en veggtykkelse på Membrane" and is preferred in the reactions in Examples 5-9. "Celgard" type 2400 polypropylene hollow fibers with a pore size of 0.025 to 0.050 } in and a wall thickness of
25 ^im ble anvendt i "Type 2 Hollow Fiber 25 µm was used in Type 2 Hollow Fiber
Selective Dialysis Membrane". Når man Selective Dialysis Membrane". When man
arbeidet ved pH på omtrent 5,5 fremviste disse membraner en høy selektivitet, f.eks. når man gjennomførte prosessen i fig. 1, med selektiviteter i området omtrent 500:1 (vekt/vekt) i favør av det uladede peptidspecies er blitt målt. Det vil si 500 mg av det uladede peptid ( C) transporteres gjennom membranen for hvert mg ladet reaksjonskomponent (A<+> eller B~) som transporteres. operated at a pH of approximately 5.5, these membranes exhibited a high selectivity, e.g. when carrying out the process in fig. 1, with selectivities in the range of approximately 500:1 (w/w) in favor of the uncharged peptide species have been measured. That is, 500 mg of the uncharged peptide (C) is transported through the membrane for every mg of charged reaction component (A<+> or B~) that is transported.
Som nevnt i det foregående, for anvendelse av den foreliggende oppfinnelse, vil det være nødvendig eller ønskelig å blokkere eller beskytte forskjellige funksjonelle grupper på reaksjonskomponentene og produktene for å forhindre uønskede bireaksjoner som kunne forhindre produksjon av det ønskede produkt og/eller redusere dets utbytte og undertrykke elektro-ladninger i mellomproduktpeptid. Tabell I angir en serie av valgte kombinasjoner av beskyttende grupper og avbeskyttelsesbetingelser nyttige i forbindelse med utøvelse av den foreliggende oppfinnelse. As mentioned above, for the application of the present invention, it will be necessary or desirable to block or protect various functional groups on the reaction components and products in order to prevent unwanted side reactions that could prevent the production of the desired product and/or reduce its yield and suppress electro-charges in intermediate peptide. Table I sets forth a series of selected combinations of protecting groups and deprotection conditions useful in the practice of the present invention.
Som et resultat av enantio-se-lektiviteten av utvalgte kondensasjonsenzymer og den funksjonelle diskriminering som utøves av membranen, kan det ved utøvelse av oppfinnelsen under anvendelse av N-formyl-L-aspartyl-g-benzyl-ester og D,L-fenylalanin-metyl-ester oppnås en 99,8% enantiomerisk oppløsning av den racemiske fenylalanin-metyl-ester-reaksjonskomponent, idet L-enantiomeren som forekommer som N-formyl-L-aspartyl(g-benzyl)-L-fenylalanin-metyl-ester, et aspartam-derivat, sammen med den ureagerte D-enantiomer er tilbake i reaksjonsfasen. As a result of the enantio-selectivity of selected condensation enzymes and the functional discrimination exercised by the membrane, in practicing the invention using N-formyl-L-aspartyl-g-benzyl ester and D,L-phenylalanine- methyl ester, a 99.8% enantiomeric resolution of the racemic phenylalanine methyl ester reaction component is obtained, the L-enantiomer occurring as N-formyl-L-aspartyl(g-benzyl)-L-phenylalanine methyl ester, an aspartame derivative, together with the unreacted D-enantiomer is back in the reaction phase.
D-fenylanalin-metyl-esteren som er tilbake i reaksjonsfasen kan utvinnes derfra, racemiseres tilbake til D,L-trinnet, og resirkuleres i tilførselen. Dette er The D-phenylanaline methyl ester that is back in the reaction phase can be recovered from there, racemized back to the D,L step, and recycled in the feed. This is
en fordel som er felles for mange prosesser som anvender racemisk aminosyre-reaksjonskomponenter, f.eks. 311-prosessen beskrevet i det foregående. an advantage common to many processes using racemic amino acid reaction components, e.g. 311 process described above.
De økonomiske fordeler ved oppfinnelsen avledes i det minste delvis fra bruken av en racemat-tilførsels-reaksjonsblanding snarere enn en dyrere forhåndsoppløst L-enantiomer. Denne fordel gjøres mulig ved in situ optisk separering av D,L-fenylalanin-metyl-esteren på grunn av (a) enantioselektiviteten av det kondenserende enzym og (b) den•høye selektivitet av membranen til gunst for den uladede species. Foretrukne metoder for billig syntese av racemisk fenylalanin er dem som er basert på utnyttelse av benzaldehyd via 5-benzalhydantoin enkelte ganger benevnt Grace-prosessen, eller den katalytiske karbonylering av ' benzylklorid til fenylpyro druesyre, en prosedyre som er utviklet av Sagami Chemical Research Center, Tokyo, Japan (enkelte ganger referert til som Toyo Soda-prosessen utviklet av Toyo Soda manufacturing Co., Ltd., Yamaguchi, Japan). The economic advantages of the invention are derived at least in part from the use of a racemate feed-reaction mixture rather than a more expensive predissolved L-enantiomer. This advantage is made possible by in situ optical separation of the D,L-phenylalanine methyl ester due to (a) the enantioselectivity of the condensing enzyme and (b) the high selectivity of the membrane in favor of the uncharged species. Preferred methods for the inexpensive synthesis of racemic phenylalanine are those based on the utilization of benzaldehyde via 5-benzalhydantoin sometimes referred to as the Grace process, or the catalytic carbonylation of 'benzyl chloride to phenylpyruvic acid, a procedure developed by the Sagami Chemical Research Center, Tokyo, Japan (sometimes referred to as the Toyo Soda process developed by Toyo Soda manufacturing Co., Ltd., Yamaguchi, Japan).
Eksempel 1. Example 1.
Et aspartam-derivat ble fremstilt i samsvar med den foreliggende oppfinnelse som følger: Til en oppløsning inneholdende 5,02 g (20 mmol) N-formyl-L-aspartyl-B-benzylester, 4,31 g (20 mmol) L-fenylalaninmetylester i 100 ml vann, innstilt til pH 5,5, ble tilsatt 500 mg termolysinenzym (Daiwa Chem. Co., Osaka, Japan) representerende totalt 8 x 10 5 proteolytiske enheter. An aspartame derivative was prepared in accordance with the present invention as follows: To a solution containing 5.02 g (20 mmol) of N-formyl-L-aspartyl-B-benzyl ester, 4.31 g (20 mmol) of L-phenylalanine methyl ester in 100 ml of water, adjusted to pH 5.5, was added 500 mg of thermolysin enzyme (Daiwa Chem. Co., Osaka, Japan) representing a total of 8 x 10 5 proteolytic units.
Den resulterende klare reaksjonsblanding ble inkubert i 15 timer ved 40°C hvor nærværet av uoppløselig dipeptid-N-formyl-3-benzyl-L-aspartyl-L-fenylalanin-metyl-ester viste seg. Den resulterende blanding ble så anbragt i en 200 ml beholder, forbundet til reaksjonssiden, i dette tilfelle rørsiden av en eksperimentell hulfiberseparator av en Bend Research, Inc. "Type 1 Hollow Fiber Selective Dialysis Membrane" som ga omtrent 9 dm 2 areal. Produktsiden av membranen (kappesiden av separatoren) var forbundet til en kilde (produkt) blanding (totalt volum 200 ml) inneholdende 500 mg av enzymet Acylase I (EC 3.5.1.14) fra Aspergillus Sp. The resulting clear reaction mixture was incubated for 15 hours at 40°C where the presence of insoluble dipeptide-N-formyl-3-benzyl-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester was revealed. The resulting mixture was then placed in a 200 ml container, connected to the reaction side, in this case the tube side of an experimental hollow fiber separator of a Bend Research, Inc. "Type 1 Hollow Fiber Selective Dialysis Membrane" giving approximately 9 dm 2 of area. The product side of the membrane (sheath side of the separator) was connected to a source (product) mixture (total volume 200 ml) containing 500 mg of the enzyme Acylase I (EC 3.5.1.14) from Aspergillus Sp.
(Sigma A 2156) ved pH 7,5. Dette enzym, vanlig beskrevet som en aminoacylase, ble funnet å virke som en C-terminal endeesterase, på både N-acetyl- og N-formyl-B-benzyl-aspartam. (Sigma A 2156) at pH 7.5. This enzyme, commonly described as an aminoacylase, was found to act as a C-terminal endesterase, on both N-acetyl- and N-formyl-B-benzyl-aspartame.
Reaksjonskomponent- og produkt-blandinger ble sirkulert ved romtemperatur gjennom hulfiberseparatoren i med-strøm med takt 600 ml/min., ved hjelp av peristaltiske pumper. Konfigurasjonen av dette apprat ligner det som er illustrert i fig. 2. Ettersom begge reaksjoner (kondensasjon og ester-hydrolyse) er protogeniske faller pH i både reaksjonskomponent- og produkt-blandingene ettersom prosessen går fremover. Konstant pH, både i reaksjonskomponent- og produkt-blandingene, ble opprett-holdt ved bruk av pH-stater. Reaction component and product mixtures were circulated at room temperature through the hollow fiber separator in co-current at a rate of 600 ml/min., using peristaltic pumps. The configuration of this apparatus is similar to that illustrated in fig. 2. As both reactions (condensation and ester hydrolysis) are protogenic, the pH of both the reactant and product mixtures falls as the process progresses. Constant pH, both in the reaction component and product mixtures, was maintained by using pH-stats.
Dannelsen av N-formyl-3-benzyl-L-aspartyl-L-fenylalanin ble overvåket ved hjelp av HPLC. Kromatografisk analyse ble gjennomført på en Tracor modell 995 instrument sammen med en LDC spektromonitor II detektor innstlt ved 254 nm for deteksjon av amino-syrene, fullstendig beskyttet produkt-dipeptid og dipeptid. Kolonnen som ble anvendt var en NOVA-PAK C^g Radial-Pak-patron, 8 mm x 10 cm, som var rommet i en Millipore Waters RCM-100 Radial Compression Module. The formation of N-formyl-3-benzyl-L-aspartyl-L-phenylalanine was monitored by HPLC. Chromatographic analysis was carried out on a Tracor model 995 instrument together with an LDC spectromonitor II detector set at 254 nm for detection of the amino acids, fully protected product dipeptide and dipeptide. The column used was a NOVA-PAK C^g Radial-Pak cartridge, 8 mm x 10 cm, which was housed in a Millipore Waters RCM-100 Radial Compression Module.
Den mobile fase anvendt for deteksjonen av det fullstendig beskyttede dipeptid var en volum/volum blanding av 45% metanol (HPLC renhet) 5% tetrahydrofuran The mobile phase used for the detection of the fully protected dipeptide was a volume/volume mixture of 45% methanol (HPLC purity) 5% tetrahydrofuran
(HPLC renhet) og 50% av en 1% KH2P04 buffer-oppløsning. For deteksjonen av produkt-dipeptidet besto den mobile fase av en volum/volum blanding av 40% metanol og 60% (HPLC purity) and 50% of a 1% KH 2 PO 4 buffer solution. For the detection of the product dipeptide, the mobile phase consisted of a volume/volume mixture of 40% methanol and 60%
av en 1% KH2P0^ buffer-oppløsning (1 ml trietylamin pr. liter løsningsmiddel ble tilsatt for å nedsette etterslep til et minimum og pH ble innstilt ned til 4,3 under anvendelse av 80% fosforsyre). Strømningstakten ble holdt ved 1 ml/min. of a 1% KH 2 PO 3 buffer solution (1 ml of triethylamine per liter of solvent was added to minimize lag and the pH was adjusted down to 4.3 using 80% phosphoric acid). The flow rate was maintained at 1 ml/min.
Data for HPLC vedrørende dannelse av N-formyl- -benzyl-L-aspartyl-L-fenylalanin er oppsummert i tabell II i det følgende og er uttrykt som total mengde (mg) produkt-dipeptid akkumulert i produktoppløsningen som en funksjon av tiden. HPLC data regarding formation of N-formyl-benzyl-L-aspartyl-L-phenylalanine are summarized in Table II below and are expressed as total amount (mg) of product dipeptide accumulated in the product solution as a function of time.
Verdien av den uladede dipeptid-konsentrasjon med likevekt som tilsvarer dets metningspunkt i vann ved pH 5,5 ble funnet å være omtrent 0,05% ved 25°C. Mengden av uladet The value of the uncharged dipeptide concentration at equilibrium corresponding to its saturation point in water at pH 5.5 was found to be approximately 0.05% at 25°C. The amount of uncharged
2 2
dipeptid som transporteres pr. dm membran pr. time ble funnet å være omtrent 18 mg, og indikerte opprettholdelse av vedlikeholdelse av likevekten krevet oppløsning av uoppløselig dipeptid og/eller dipeptid-syntese på nytt. Nesten fullstendig oppløsning av uoppløselig uladet dipeptidfase i reaksjonsblandingen ble iakttatt etter omtrent 5 timer, og da ble reaksjonen stanset. En avsetning av data i tabell II er vist i fig. 3. Den lineære funksjon indikerer at overføring av peptid gjennom membranen foregår i stabil tilstand. Den iakttatte dannelseshastighet av produkt-dipeptid på omtrent 18 mg/dm 2/time (Tabell II) ble bekreftet tilsvarende fluks av uladet dipeptid gjennom membranen (17 mg/dm 2/time) målt ved 0,05% i vann som forventet på teoretisk basis. dipeptide that is transported per dm membrane per hour was found to be approximately 18 mg, indicating maintenance of equilibrium required dissolution of insoluble dipeptide and/or dipeptide resynthesis. Almost complete dissolution of insoluble uncharged dipeptide phase in the reaction mixture was observed after about 5 hours, and then the reaction was stopped. A deposition of data in table II is shown in fig. 3. The linear function indicates that transfer of peptide through the membrane takes place in a stable state. The observed formation rate of product dipeptide of approximately 18 mg/dm 2/hour (Table II) was confirmed corresponding to the flux of uncharged dipeptide through the membrane (17 mg/dm 2/hour) measured at 0.05% in water as expected on theoretical basis.
Ved dette punkt ville det beskrevne system forventes å fortsette i stabil tilstand hvis kontinuerlig tilsetning ble foretatt til reaksjonsblandingen av de to aminosyre-reaksjonskomponenter, i en takt på omtrent 120 mg/time hver, for å holde systemet mettet på uladet dipeptid. At this point, the described system would be expected to continue in steady state if continuous addition were made to the reaction mixture of the two amino acid reaction components, at a rate of approximately 120 mg/hr each, to keep the system saturated with uncharged dipeptide.
Fo fullt ut å realisere membranens selektivitet kan innsetting av en annen membran i serie med den første membran før kontakten med det annet enzym være nødvendig på grunn av at selektiviteten gjennom en enkelt membran er lavere på grunn av den høye aminosyre-konsentrasjonen i reaksjonsblandingen. To fully realize the selectivity of the membrane, the insertion of another membrane in series with the first membrane before the contact with the second enzyme may be necessary because the selectivity through a single membrane is lower due to the high amino acid concentration in the reaction mixture.
Produktoppløsningen (200 ml) ble gjenvunnet, innstilt til pH 2,5 og avkjølt ved 4°C over natten. Det samlede bunnfall ble isolert og omkrystallisert fra MeOH:K20 til å gi 307 mg N-formyl-3-benzyl-L-aspartyl-L-fenyl-npO The product solution (200 mL) was recovered, adjusted to pH 2.5 and cooled at 4°C overnight. The combined precipitate was isolated and recrystallized from MeOH:K 2 O to give 307 mg of N-formyl-3-benzyl-L-aspartyl-L-phenyl-npO
alanin [a]D = -5,6° (C=l,2; EtOH), identisk ved (IR, 13C-NMR) med en autentisk prøve fremstilt ved porsjonshydrolyse av N-formyl-3-benzyl-aspartam med Aspergillus esterase, [a]D 0 c = -5,3 (C=l,3; EtOH). alanine [a]D = -5.6° (C=1.2; EtOH), identical by (IR, 13C-NMR) to an authentic sample prepared by batch hydrolysis of N-formyl-3-benzyl-aspartame with Aspergillus esterase , [a]D 0 c = -5.3 (C=1.3; EtOH).
Eksempel 2 Example 2
Et forsøk lignende forsøket i eksempel 1 ble gjennomført med unntagelse av bruk av 8,63 g D,L-fenylalanin-metyl-ester i stedet for L-enantiomeren. Resultatene er oppsummert i tabell III. Isolering av det uladede peptid fra 200 ml av produktoppløsning ga 310 mg produkt [a]p = -6,4 (C=l,4, EtOH), identisk i alle henseender (IR, 13C-NMR) med en autentisk prøve av N-formyl-ø-benzyl-L-aspartyl-L-fenylalanin. An experiment similar to the experiment in example 1 was carried out with the exception of using 8.63 g of D,L-phenylalanine methyl ester instead of the L-enantiomer. The results are summarized in Table III. Isolation of the uncharged peptide from 200 ml of product solution gave 310 mg of product [a]p = -6.4 (C=1.4, EtOH), identical in all respects (IR, 13C-NMR) to an authentic sample of N -formyl-o-benzyl-L-aspartyl-L-phenylalanine.
En avsetning av data oppsummert i tabell III (fig. 3) viste på nytt nærværet av en stabil tilstandsprosess når reaktoren ble drevet med D,L-fenylalanin-metyl-ester. Stereospesifisiteten av termolysin påvises ved den utelukkende dannelse av det samme L,L-dipeptid som beskrevet i eksempel 1. D-fenylalanin-metyl-esteren tilbakeholdt i rørfasen (reaksjonsblandingen) inhiberte ikke de totale kinetiske forhold ved peptiddannelsen. A plot of data summarized in Table III (Fig. 3) again showed the presence of a steady state process when the reactor was operated with D,L-phenylalanine methyl ester. The stereospecificity of thermolysin is demonstrated by the exclusive formation of the same L,L-dipeptide as described in example 1. The D-phenylalanine methyl ester retained in the tube phase (reaction mixture) did not inhibit the overall kinetic conditions of the peptide formation.
Eksempel 3 Example 3
En blanding av 1,0 g N-formyl-3-benzyl-L-aspartyl-L-fenylalanin, fremstilt i samsvar med eksempel 1,4,0 ml vann, 4,0 ml tetrahydrofuran og 1,0 ml kons. saltsyre (12N) ble oppvarmet under tilbakeløp i 9 timer. Blandingen ble så avkjølt og pH innstilt til 4,0 med 50% NaOH-oppløsning. Tetrahydrofuran ble så fjernet ved inndamping ved mindre enn 3 5°C og 20 mm Hg. Krystallisasjon ble fullført ved <35°C og 20 mm Hg. Krystallisasjon ble fullført ved lagring ved 5° i 1 time, prøven ble så filtrert, vasket med 1 ml isblandet vann og tørket under vakuum til å gi 367 mg av hvitt faststoff. Dette material var identisk med en autentisk prøve av aspartyl-fenylalanin ved hjelp av HPLC og IR sammenligning. [a]2^°= + 12° (c = 0.5; 0.1 N HC1 i 50% MeOH). A mixture of 1.0 g of N-formyl-3-benzyl-L-aspartyl-L-phenylalanine, prepared in accordance with example 1.4, 0 ml of water, 4.0 ml of tetrahydrofuran and 1.0 ml of conc. hydrochloric acid (12N) was heated under reflux for 9 hours. The mixture was then cooled and the pH adjusted to 4.0 with 50% NaOH solution. Tetrahydrofuran was then removed by evaporation at less than 35°C and 20 mm Hg. Crystallization was completed at <35°C and 20 mm Hg. Crystallization was completed by storage at 5° for 1 hour, the sample was then filtered, washed with 1 mL ice water and dried under vacuum to give 367 mg of white solid. This material was identical to an authentic sample of aspartyl-phenylalanine by HPLC and IR comparison. [α]2^°= + 12° (c = 0.5; 0.1 N HCl in 50% MeOH).
Aspartyl-fenylalanin ble omdannet til aspartam ved behandling med metanol og saltsyre, som beskrevet i G.L. Bachman og B.D. Vineyard, US patentskrift Aspartyl-phenylalanine was converted to aspartame by treatment with methanol and hydrochloric acid, as described in G.L. Bachman and B.D. Vineyard, US Pat
nr. 4.173.562, eksempel nr. 1. No. 4,173,562, Example No. 1.
Eksempel 4 Example 4
Et forsøk tilsvarende forsøket i eksempel 1 ble gjennomført, med unntagelse av bruken av 5,65 g (20,1 mmol) N-karbobenzoksy-L-aspartin-syre-g-metyl-ester og 4,38 g (20,3 mmol) L-fenylalaninmetylester som reaksjonskomponenter. Aminosyrene ble oppløst i 100 ml vann, pH i oppløsningen innstilt til 5,5, og 500 mg termolysin Daiwa (8 x 10^ protelytiske enheter) ble tilsatt. Oppløsningen ble forinkubert i 15 timer ved 40°C hvor en større mengde N-CBZ-(3-metyl-ester)-L-asp-L-fenylalanin-metyl-ester ble utfelt. Suspensjonen ble forbundet til rørsiden av en "type 1 Hollow Fiber Selective Dialysis Membrane" (Bend Research Inc.) inneholdende omtrent 10 dm 2 membranoverflate, og maskinen ble drevet ved romtemperatur i 5 timer mot en kappesidefase av 200 ml vann inneholdende 500 mg acylase I (Sigma) ved pH 7,5. Akkumulering av peptidprodukt i kappefasen ble overvåket ved hjelp av HPLC An experiment similar to the experiment in example 1 was carried out, with the exception of the use of 5.65 g (20.1 mmol) of N-carbobenzoxy-L-aspartic acid-g-methyl ester and 4.38 g (20.3 mmol ) L-phenylalanine methyl ester as reaction components. The amino acids were dissolved in 100 ml of water, the pH of the solution adjusted to 5.5, and 500 mg of thermolysin Daiwa (8 x 10^ proteolytic units) was added. The solution was pre-incubated for 15 hours at 40°C where a larger amount of N-CBZ-(3-methyl-ester)-L-asp-L-phenylalanine-methyl-ester was precipitated. The suspension was connected to the tube side of a "type 1 Hollow Fiber Selective Dialysis Membrane" (Bend Research Inc.) containing approximately 10 dm 2 of membrane surface area, and the machine was operated at room temperature for 5 hours against a mantle side phase of 200 ml of water containing 500 mg of acylase I (Sigma) at pH 7.5. Accumulation of peptide product in the coat phase was monitored by HPLC
og resultatene er gjengitt i tabell IV og fig. 4. and the results are reproduced in table IV and fig. 4.
Etter 5 timers kjøring ble reaksjonen stanset, kappe-sidefasen (200 ml) ble isolert, innstilt til pH 2,5 og lagret over natten ved 4°C. Det utfelte produkt ble samlet og omkrystallisert fra CH^OHtP^O og ga 405 mg (86% gjenvinning) N-CBZ-(g-metyl-ester)-L-asp-L-fenylalanin (N-CBZ-iso-APM) [a]^<5>= +6,0° (C = 1,1, EtOH), identisk ( 13C-NMR) ned en autentisk prøve av N-CBZ-iso-APM, [a]p = +5,5° (C = 1,1, EtOH), fremstil ved kjemisk kobling og delvis esterolyse med acylase I. After running for 5 hours, the reaction was stopped, the jacket-side phase (200 ml) was isolated, adjusted to pH 2.5 and stored overnight at 4°C. The precipitated product was collected and recrystallized from CH^OHtP^O to give 405 mg (86% recovery) N-CBZ-(g-methyl ester)-L-asp-L-phenylalanine (N-CBZ-iso-APM) [a]^<5>= +6.0° (C = 1.1, EtOH), identical ( 13C-NMR) to an authentic sample of N-CBZ-iso-APM, [a]p = +5, 5° (C = 1.1, EtOH), prepare by chemical coupling and partial esterolysis with acylase I.
Som iakttatt tidligere i forsøkene i eksemplene 1 og 2 indikerer avsetningen i fig. 4 at akkumulering av N-CBZ-iso-APM foregår i en stabil takt på omtrent As observed earlier in the experiments in examples 1 and 2, the deposit in fig. 4 that accumulation of N-CBZ-iso-APM takes place at a stable rate of approx
200 mg/time. 200 mg/hour.
Omdannelsen av N-CBZ-iso-APM til AMP kan gjennomføres under betingelsene beskrevet i eksempel 3. The conversion of N-CBZ-iso-APM to AMP can be carried out under the conditions described in Example 3.
Eksempel 5 Example 5
Aspartam-derivatet, N-formyl-(3-metyl)-asp-phe ble fremstilt i samsvar med den foreliggende oppfinnelse som følger: Til en oppløsning inneholdende 6,00 g (35 mmol) N-formul-(g-metyl)-L-aspartin-syre, 10,00 g (48 mmol) L-fenylalanin-metyl-ester i 100 ml vann, innstilt til pH 7,0, ble tilsatt 770 mg termolysin-enzym (Daiwa The aspartame derivative, N-formyl-(3-methyl)-asp-phe was prepared in accordance with the present invention as follows: To a solution containing 6.00 g (35 mmol) of N-formul-(g-methyl)- L-aspartic acid, 10.00 g (48 mmol) L-phenylalanine methyl ester in 100 ml of water, adjusted to pH 7.0, was added 770 mg of thermolysin enzyme (Daiwa
Chemical Co., Osaka, Japan) representerende totalt Chemical Co., Osaka, Japan) representing total
1,2 x 10 proteolytiske enheter. Den resulterende klare oppløsning ble inkubert i en time ved 40°C når HPLC-analyse indikerte nærvær av 433,8 mg N-formyl- ((3-metyl)-asp-phe-OMe. Oppløsningen ble avkjølt til 25°C, pH innstilt til 5,0, og oppløsningen anbragt i en 200 ml beholder forbundet til rørsiden av hulfiber-separatorer ("Type 2 1.2 x 10 proteolytic units. The resulting clear solution was incubated for one hour at 40°C when HPLC analysis indicated the presence of 433.8 mg of N-formyl-((3-methyl)-asp-phe-OMe. The solution was cooled to 25°C, pH set to 5.0, and the solution placed in a 200 ml container connected to the tube side by hollow fiber separators ("Type 2
Hollow Fiber Selective Dialysis Membrane", Bend Research Hollow Fiber Selective Dialysis Membrane”, Bend Research
2 2
Inc.) som tilveiebragte omtrent 4,5 dm av en ILM Inc.) which provided approximately 4.5 dm of an ILM
fremstilt av 30% volum/volum N,N-dietyl-dodekanamid i dodekan. Kappesiden av separatoren ble forbundet til produktbeholderen inneholdende 500 mg av enzymet ancyle I (EC 3.5.1.14) fra Aspergillus Sp. (Aminoacylase AMANO, Nagoya, Japan), ved pH 7,5. prepared from 30% v/v N,N-diethyl dodecanamide in dodecane. The jacket side of the separator was connected to the product container containing 500 mg of the enzyme ancyle I (EC 3.5.1.14) from Aspergillus Sp. (Aminoacylase AMANO, Nagoya, Japan), at pH 7.5.
De to faser ble sirkulert ved 25°C i motstrøm med takt The two phases were circulated at 25°C in countercurrent with beat
50 ml/min. (rørfasen) og 500 ml/min. (kappefasen) ved hjelp av to pertistaltiske pumper under anvendelse av konfigurasjonen illustrert i fig. 2. Konstant pH i begge faser ble sikret ved bruk av pH-stater. 50 ml/min. (tube phase) and 500 ml/min. (jacket phase) by means of two peristaltic pumps using the configuration illustrated in fig. 2. Constant pH in both phases was ensured by the use of pH-stats.
Dannelse av N-formyl-( -metyl)-asp-phe ble overvåket Formation of N-formyl-(-methyl)-asp-phe was monitored
ved hjelp av HPLC under anvendelse av et Tracor Model 995 instrument sammen med en LDC-spektromonitor II by HPLC using a Tracor Model 995 instrument coupled with an LDC spectromonitor II
detektor innstilt ved 254 nm. Den anvendte kolonne var en NOVA-PAK C18 radial-Pak patron, 8 mm x 100 mm, inne-sluttet i en Millipore Waters RCM-100 Radial Compression Module. detector set at 254 nm. The column used was a NOVA-PAK C18 radial-Pak cartridge, 8 mm x 100 mm, enclosed in a Millipore Waters RCM-100 Radial Compression Module.
De mobile faser anvendt for analysen var: The mobile phases used for the analysis were:
(a) for N-formyl-(8-metyl)-asp-phe-OMe: 40% volum/volum metanol i 0., 1% KH2P04 buffer pH 4,6; (b) for N-formyl-(g-metyl)-asp-phe: 20% volum/volum (a) for N-formyl-(8-methyl)-asp-phe-OMe: 40% v/v methanol in 0.1% KH 2 PO 4 buffer pH 4.6; (b) for N-formyl-(g-methyl)-asp-phe: 20% v/v
metanol i 0,1% KH2P0^ pH 4,6. De anvendte strømnings-takter var 1 ml/min. for begge analyser. methanol in 0.1% KH2P0^ pH 4.6. The flow rates used were 1 ml/min. for both analyses.
Data vedrørende dannelse av N-formyl-(8-metyl)-asp-phe produkt dipeptid) er gjengitt i følgende V og er uttrykt som total mengde (mg) akkumulert i 200 ml kappefase som en funksjon av tiden. Data regarding formation of N-formyl-(8-methyl)-asp-phe product dipeptide) are reproduced in the following V and are expressed as total amount (mg) accumulated in 200 ml of coat phase as a function of time.
En avsetning av data i tabell V er vist i fig. 5. A provision of data in table V is shown in fig. 5.
Ved slutten av forsøket indikerte HPLC-analyse nærvær av 283 mg N-formyl-( g-metyl)-asp-phe-OMe i rørfasen. Disse verdier tillot beregning av mengden peptid syntetisert under driften av reaktoren. At the end of the experiment, HPLC analysis indicated the presence of 283 mg of N-formyl-(g-methyl)-asp-phe-OMe in the tube phase. These values allowed calculation of the amount of peptide synthesized during the operation of the reactor.
3 36 P = peptid overført i kappefasen = 400 " = 417,4 mg Pq = initialt peptid i rørfasen = 433,8 mg 3 36 P = peptide transferred in the coat phase = 400 " = 417.4 mg Pq = initial peptide in the tube phase = 433.8 mg
P = peptid tilbake i rørfasen ved slutten av forsøket P = peptide back in the tubular phase at the end of the experiment
273 mg. 273 mg.
V på 53,5 mg/time 100 ml faller sammen med syntese-syn * 3 JV of 53.5 mg/hour 100 ml coincides with synthesis view * 3 J
takten (500 mg/time L) målt for syntesehastigheten i likevektsundersøkelser foretatt med N-formyl-( -metyl)-L-aspartin-syre og L-fenylalanin-metyl-ester i nærvær av termolysin. rate (500 mg/hour L) measured for the rate of synthesis in equilibrium studies carried out with N-formyl-(-methyl)-L-aspartic acid and L-phenylalanine methyl ester in the presence of thermolysin.
Produktoppløsningen (200 ml) ble isolert, innstilt til pH 2 med 1 N HC1 og ekstrahert to ganger med 200 ml EtOAc. De kombinerte ekstrakter etterlot en hvit rest ved avdamping og denne ga etter omkrystallisering fra EtOAc^heksan 100 mg N-formyl-(8-metyl)-L-asp-L-phe, [a]^<5> = + 0,70 ° (c, 0,29, MeOH), identisk (IR, <13>C-NMR) med en autentisk prøve fremstilt ved porsjonsvis hydrolyse av syntetisk N-formyl-(8-metyl)-L-asp-L-phe-OMe med Aspergillus esterase, The product solution (200 mL) was isolated, adjusted to pH 2 with 1 N HCl and extracted twice with 200 mL EtOAc. The combined extracts left a white residue on evaporation which, after recrystallization from EtOAc^hexane, gave 100 mg of N-formyl-(8-methyl)-L-asp-L-phe, [a]^<5> = + 0.70 ° (c, 0.29, MeOH), identical (IR, <13>C-NMR) to an authentic sample prepared by batchwise hydrolysis of synthetic N-formyl-(8-methyl)-L-asp-L-phe- OMe with Aspergillus esterase,
[a]p<5> = +0,80° (c, 0,29, MeOH). [α]p<5> = +0.80° (c, 0.29, MeOH).
Eksempel 6 Example 6
Forsøket beskrevet i eksempel 5 ble oppskalert i en type 2 Hollow Fiber Dialysis Membrane (Bend Research Ind.) inneholdende 9 dm <2>flytende membran (30% volum/ volum N,N-dietyl-dodekantamid i dodekan). Rørfasen inneholdt 40 g L-phe-OMe, 24 g N-formyl-(8-metyl)-L-asp og 3,08 g termolysin Daiwa (et totalt 5 x 10 proteolytiske enheter) i 400 ml vann, innstilt til pH 7,0. Etter en inkubasjonsperiode på 1 time ved 40°C ble det funnet å være tilstede en mengde på 1,068 g (2,7 g/L) N-formyl-(8-metyl)-L-asp-L-phe-OMe. Oppløsningen ble avkjølt ved 25°C, innstilt til pH 5,0 med 1 N HC1 og forbundet til rørsiden av hulfiberseparatoren. Kappefasen besto av 400 ml vann, pH 7,5, inneholdende 2 g aminoacylace I (Amano). De to faser ble sirkulert i motstrøm ved 25°C i 5 timer, som beskrevet eksempel 5. Resultatene er oppsummert i tabell VI og fig. 6. The experiment described in example 5 was scaled up in a type 2 Hollow Fiber Dialysis Membrane (Bend Research Ind.) containing 9 dm <2> liquid membrane (30% volume/volume N,N-diethyl-dodecantamide in dodecane). The tube phase contained 40 g L-phe-OMe, 24 g N-formyl-(8-methyl)-L-asp and 3.08 g thermolysin Daiwa (a total of 5 x 10 proteolytic units) in 400 ml water, adjusted to pH 7 ,0. After an incubation period of 1 hour at 40°C, an amount of 1.068 g (2.7 g/L) of N-formyl-(8-methyl)-L-asp-L-phe-OMe was found to be present. The solution was cooled at 25°C, adjusted to pH 5.0 with 1N HCl and connected to the tube side of the hollow fiber separator. The jacket phase consisted of 400 ml of water, pH 7.5, containing 2 g of aminoacylace I (Amano). The two phases were circulated in countercurrent at 25°C for 5 hours, as described in example 5. The results are summarized in table VI and fig. 6.
Ved slutten av forsøket var mengden av N-formyl-(8-metyl)-asp-phe-OMe tilbake i rørfasen 586 mg. At the end of the experiment, the amount of N-formyl-(8-methyl)-asp-phe-OMe back in the tube phase was 586 mg.
Den høyeste transportverdi som ble iakttatt (404 mg/time) under de første 30 min. er resultatet av den høye initiale peptidkonsentrasjon som frembringes under forinkubasjonsperioden. Avvik fra likevekt bevirket ved transport av peptid førte til syntese av mer peptid slik at det ble etablert en stabil tilstand etter den første time av forsøket, på et forventet nivå på 200 mg/ time (fig . 6) . The highest transport value observed (404 mg/hour) during the first 30 min. is the result of the high initial peptide concentration produced during the pre-incubation period. Deviation from equilibrium caused by the transport of peptide led to the synthesis of more peptide so that a stable state was established after the first hour of the experiment, at an expected level of 200 mg/hour (fig. 6).
Eksempel 7 Example 7
Et forsøk i likhet med eksempel 5 ble gjennomført, med unntagelse av bruken av 10,00 g D,L-fenylalanin-metyl-ester i stedet for L-enantiomeren. Resultatene, An experiment similar to Example 5 was carried out, with the exception of the use of 10.00 g of D,L-phenylalanine methyl ester in place of the L-enantiomer. The results,
fremlagt i tabell VII og fig. 7, viser klart at den iakttatte dannelsestakt av N-formyl-(8-metyl)-L-asp-L-phe var halvparten av den som sees med L-phe-OMe (eksempel 5, tabell V) som forventet fra enantioselektiviteten av termolysin og de tidligere resultater i eksempler 1 og 2. presented in table VII and fig. 7, clearly shows that the observed rate of formation of N-formyl-(8-methyl)-L-asp-L-phe was half that seen with L-phe-OMe (Example 5, Table V) as expected from the enantioselectivity of thermolysin and the previous results in examples 1 and 2.
Eksempel 8 Example 8
Membran-assistert enzymatisk oppløsning av D,L-fenylalanin-metyl-ester ble anvendt i samsvar med den foreliggende oppfinnelse på følgende måte: Til en oppløsning av 1,0 g (5,6 mmol) D,L-fenylalanin-metyl-ester i 100 ml vann, pH 7,5, ble tilsatt 500 mg amino-acylase I (Amano Pharmaceutical Co., Nagoya, Japan). Blandingen fikk reagere ved 25°C i 30 min. og ved slutten av denne periode ble det iakttatt nærvær av 266 mg L-phe (1,6 mmol) og 712 mg D,L-Phe-PMe (4 mmol) ved hjelp av HPLC-analyse. Denne oppløsning ble innført i rørsiden (reaksjonssiden) av en "Celgard" hulfiber-understøttet ILM-separator ("Type 2 Hollow Fiber Selective Dialysis Membrane", Bend Research Inc.) inneholdende 4,5 dm 2 av en 30% volum/volum N,N-dietyl-dodekanamid i dodekan-væskefilm i membranen. Produktsiden av membranen (kappesiden av separatoren) ble fylt med 200 ml vann innstilt til pH 2,0 med fortynnet HC1. De to faser ble sirkulert gjennom separatoren i motstrøm i en takt på 200 ml/min., ved hjelp av peristaltiske pumper (fig. 2). Separeringen foregikk ved den kontinuerlige tilsetning av D,L-Phe-0Me til rørfasen, foretatt i en takt på omtrent 1 g D,L-Phe-0Me pr. time. Totalt 30 ml av en 7% oppløsning av D,L-Phe-0Me (2,1 g, 11,7 mmol) i vann ved pH 7,5 ble tilsatt i løpet av en periode på 2 timer. pH i begge faser ble holdt konstant ved bruk av pH-stater. Membrane-assisted enzymatic resolution of D,L-phenylalanine methyl ester was used in accordance with the present invention in the following way: To a solution of 1.0 g (5.6 mmol) D,L-phenylalanine methyl ester in 100 ml of water, pH 7.5, was added 500 mg of amino-acylase I (Amano Pharmaceutical Co., Nagoya, Japan). The mixture was allowed to react at 25°C for 30 min. and at the end of this period the presence of 266 mg of L-phe (1.6 mmol) and 712 mg of D,L-Phe-PMe (4 mmol) was observed by HPLC analysis. This solution was introduced into the tube side (reaction side) of a "Celgard" hollow fiber-supported ILM separator ("Type 2 Hollow Fiber Selective Dialysis Membrane", Bend Research Inc.) containing 4.5 dm 2 of a 30% v/v N ,N-diethyl dodecanamide in dodecane liquid film in the membrane. The product side of the membrane (sheath side of the separator) was filled with 200 ml of water adjusted to pH 2.0 with dilute HCl. The two phases were circulated through the separator in countercurrent at a rate of 200 ml/min., using peristaltic pumps (Fig. 2). The separation took place by the continuous addition of D,L-Phe-0Me to the tube phase, carried out at a rate of approximately 1 g D,L-Phe-0Me per hour. A total of 30 mL of a 7% solution of D,L-Phe-0Me (2.1 g, 11.7 mmol) in water at pH 7.5 was added over a period of 2 hours. The pH in both phases was kept constant using pH-stats.
Forløpet av oppløsningen ble fulgt ved HPLC, på prøver tatt fra begge faser hver 30 min. HPLC-instrumentering og prosedyrer er dem som beskrevet i eksempel 5. Den mobile fase anvendt i dette tilfelle var 20% volum/volum metanol i 0,1% KK^ PO^ buffer pH 4,6, med en strømnings-takt på 1 ml/min. Resultatene, fremlagt i tabell VII og avsatt i fig. 8, viste akkumulering av L-Phe i rør-fasen og av D-Phe-OMe i kappefasen. Ved slutten av forsøket ble begge fase isolert og opparbeidet som følger: (a) Rørfase: Innholdet (130 ml) ble innstilt til pH 8,5 med IN NaOH og deretter ekstrahert med 2 x 50 ml EtOAc. Den vandige fase ble så innstilt til pH 4,0 med IN HC1 og oppløsningen ført gjennom en 2,5 x 20 cm "Dowex" 50 (NH^) kolonne. Etter vasking med 200 ml vann, ble produktet eluert med 200 ml 10% NH^OH. Eluatet ble konsentrert i 50 ml under vakuum og oppløsningen frysetørket. Utbytte: 249 mg, The course of the dissolution was followed by HPLC, on samples taken from both phases every 30 min. HPLC instrumentation and procedures are as described in Example 5. The mobile phase used in this case was 20% vol/vol methanol in 0.1% KK^ PO^ buffer pH 4.6, with a flow rate of 1 ml /my. The results, presented in table VII and set out in fig. 8, showed accumulation of L-Phe in the tube phase and of D-Phe-OMe in the sheath phase. At the end of the experiment, both phases were isolated and worked up as follows: (a) Tube phase: The contents (130 ml) were adjusted to pH 8.5 with 1N NaOH and then extracted with 2 x 50 ml EtOAc. The aqueous phase was then adjusted to pH 4.0 with 1N HCl and the solution passed through a 2.5 x 20 cm "Dowex" 50 (NH 2 ) column. After washing with 200 ml of water, the product was eluted with 200 ml of 10% NH 3 OH. The eluate was concentrated to 50 ml under vacuum and the solution freeze-dried. Yield: 249 mg,
hvitt faststoff. white solid.
L-fenylalanin, [a] = -29,2° (c, 2, HO), lit. L-phenylalanine, [a] = -29.2° (c, 2, HO), lit.
(Aldrich) [aJD 25 = D-35,0 (c, 2, H20) optisk renhet 92%. (Aldrich) [αJD 25 = D-35.0 (c, 2, H 2 O) optical purity 92%.
(b) Kappe- fase: (200 ml) ble innstilt til pH 8,5 (b) Shell phase: (200 ml) was adjusted to pH 8.5
med fortynnet NaOH og ekstrahert med 2 x 50 ml EtOAc. with dilute NaOH and extracted with 2 x 50 mL EtOAc.
Den organiske ekstrakt ble tørket over vannfritt. Na2S04, inndampet til tørrhet, oppløst i 50 ml vann surgjort til pH 3,0 med IN HC1 og deretter fryse-tørket, og ga 989 mg (4,6 mmol) D-Phe-OMe HC1, hvitt fastst<off,> [a]<25>° = _2i.o° (c, 2; EtOH), lit. The organic extract was dried over anhydrous. Na 2 SO 4 , evaporated to dryness, dissolved in 50 mL water acidified to pH 3.0 with 1N HCl and then freeze-dried to give 989 mg (4.6 mmol) D-Phe-OMe HCl, white solid<off,> [ a]<25>° = _2i.o° (c, 2; EtOH), lit.
(Aldrich) [a] 5D °= -32.4° (c, 2; EtOH), optisk renhet 83%. (Aldrich) [a] 5D °= -32.4° (c, 2; EtOH), optical purity 83%.
Basert på permeabilitetsverdien på o 32 mg/cm 2 ■min. funnet for Phe-OMe (vann, pH 8, 25°C) på denne membran var den forventede fluks for et membranareal på 4,5 dm 2880 mg/ time. Tabell VIII viser at mengden av Phe-OMe overført i kappefasen ved slutten av den første time var 860 mg, som antyder at transporten ble gjennomført under membran-grensebetingelser. Based on the permeability value of o 32 mg/cm 2 ■min. found for Phe-OMe (water, pH 8, 25°C) on this membrane, the expected flux for a membrane area of 4.5 dm was 2880 mg/h. Table VIII shows that the amount of Phe-OMe transferred in the mantle phase at the end of the first hour was 860 mg, which suggests that the transport was carried out under membrane boundary conditions.
Porsjonsoppløsning av D,L-Phe-OMe ved enantioselektiv hydrolyse av metyl-esterfunksjonen katalysert av subtilisin A (en alkalisk protease av serin-typen) er nylig blitt vist (Shui-Tein Chen, Kung-Tsung Wang og Chi-Huey Wong, J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1986 1514). Batch resolution of D,L-Phe-OMe by enantioselective hydrolysis of the methyl ester function catalyzed by subtilisin A (a serine-type alkaline protease) has recently been demonstrated (Shui-Tein Chen, Kung-Tsung Wang and Chi-Huey Wong, J . Chem. Soc. Chem. Commun. 1986 1514).
En hydrolyse er nødvendig for membranoppløsning av racemiske karboksylsyrer. En hydrolase som er en esterase som f.eks. aminoacylase I, a-chymotrypsin og subtilisin A kan anvendes for oppløsning av en D,L-amino-syreforbindelse som D,L-fenylalanin-metyl-ester. Amino-acylase I foretrekkes generelt for demetylering av peptider fremfor andre esterolytiske enzymer som subtilisin A og a-chymotrypsin med sterke proteolytiske virkninger. A hydrolysis is necessary for membrane dissolution of racemic carboxylic acids. A hydrolase which is an esterase such as e.g. aminoacylase I, α-chymotrypsin and subtilisin A can be used to dissolve a D,L-amino acid compound such as D,L-phenylalanine methyl ester. Amino-acylase I is generally preferred for the demethylation of peptides over other esterolytic enzymes such as subtilisin A and α-chymotrypsin with strong proteolytic effects.
Hvis den ovenfor beskrevne oppløsning av D,L-fenylalanin-metyl-esteren anvendes for fremstilling av et peptid som beskrevet med den foreliggende oppfinnelse, blir L-fenylalaninet som fremstilles metylert ved hjelp av standard metyleringsmidler kjent på området. If the above-described solution of the D,L-phenylalanine methyl ester is used for the production of a peptide as described with the present invention, the L-phenylalanine which is produced is methylated using standard methylating agents known in the field.
Dette eksepel kan tilpasses for oppløsning av andre racemiske karboksylsyrer. F.eks. kan en racemisk karboksylsyre-ester-forbindelse i en vandige reaksjonsblanding som inkluderer et hydrolyserende enzym hydrolyseres til å danne en ladet enantiomer forbindelse og en uladet enantiomer esterforbindelse i den vandige reaksjonsblanding. Den uladede enantiomere ester-forbindelse blir så transportert fra den vandige reaksjonsblanding tvers gjennom en ione-avstøtende membran i samsvar med den foreliggende oppfinnelse inkluderende Type 1 eller Type 2 "Hollow Fiber Selective Dialysis Membranes" fra Bend Research, Inc. I en type av eksempel som f.eks. eks. 8 er den racemiske karboksyl-syreesterforbindelse en D,L-aminosyre-ester-forbindelse, den ladede enantiomere forbindelse er en L-amino-syre-forbindelse og den uladede enantiomere esterforbindelse er en deaminosyre-ester-forbindelse. Det sees at seleksjon av enzymer og reaksjonsbetingelser er innenfor forståelse og kunnskap for personer med kyndigheter på området tilsvarende den foreliggende oppfinnelse. This example can be adapted for the resolution of other racemic carboxylic acids. E.g. a racemic carboxylic acid ester compound in an aqueous reaction mixture that includes a hydrolyzing enzyme can be hydrolyzed to form a charged enantiomeric compound and an uncharged enantiomeric ester compound in the aqueous reaction mixture. The uncharged enantiomeric ester compound is then transported from the aqueous reaction mixture across an ion-repelling membrane in accordance with the present invention including Type 1 or Type 2 "Hollow Fiber Selective Dialysis Membranes" from Bend Research, Inc. In one type of example like for example. e.g. 8, the racemic carboxylic acid ester compound is a D,L-amino acid ester compound, the charged enantiomeric compound is an L-amino acid compound and the uncharged enantiomeric ester compound is a deamino acid ester compound. It can be seen that selection of enzymes and reaction conditions are within the understanding and knowledge of persons with expertise in the field corresponding to the present invention.
Kontinuerlige eller porsjonsvise prosessmidler tilveiebringes ved dette eksempel ved at den ønskede enantiomer av reaksjonskomponenten kan fremstilles og tilsettes reaksjonsblandingen. Continuous or batch-wise processing agents are provided in this example by the fact that the desired enantiomer of the reaction component can be prepared and added to the reaction mixture.
Eksempel 9 Example 9
Syntese av N-formyl-(g-metyl)-L-asp-L-phe i samsvar med den foreliggende oppfinnelse ble gjennomført under anvendelse av immobilisert amino-acylase I og ionebytterharpikser for å fjerne permeable produkter på følgende måte: Til en oppløsning av 10,0 g (48 mmol) L-fenylalanin-metyl-ester og 6,0 g (35 mmol) N-formyl-(B-metyl)-L-aspartinsyre i 100 1 avionisert vann, innstilt til pH 7, ble tilsatt 770 mg termolysin (Daiwa Chemical Comapny, Osaka, Japan) som representerte totalt 1,2 x 10 proteolytiske enheter. Den resulterende oppløsning ble inkubert i 1 time ved 40°C og HPLC-analyse indikerte da nærvær av 383 mg N-formyl-(g-metyl)-asp-phe-OMe. Oppløsningen ble avkjølt til 25°C, pPT innstilt til 5,0, og oppløsningen ble anbragt i en 200 ml beholder 40 forbundet til rør-siden 46 av en hulfiberseparator 44 ("Type 2 Hollow Fiber Selective Dialysis Membrane", Bend Research, Inc.) Synthesis of N-formyl-(g-methyl)-L-asp-L-phe according to the present invention was carried out using immobilized amino-acylase I and ion exchange resins to remove permeable products as follows: To a solution of 10.0 g (48 mmol) of L-phenylalanine methyl ester and 6.0 g (35 mmol) of N-formyl-(B-methyl)-L-aspartic acid in 100 L of deionized water, adjusted to pH 7, were added 770 mg of thermolysin (Daiwa Chemical Comapny, Osaka, Japan) which represented a total of 1.2 x 10 proteolytic units. The resulting solution was incubated for 1 hour at 40°C and HPLC analysis then indicated the presence of 383 mg of N-formyl-(g-methyl)-asp-phe-OMe. The solution was cooled to 25°C, pPT set to 5.0, and the solution was placed in a 200 ml container 40 connected to the tube side 46 of a hollow fiber separator 44 ("Type 2 Hollow Fiber Selective Dialysis Membrane", Bend Research, Inc .)
2 2
inneholdende 900 cm av en hydrofob væskemembran fremstilt av 30% N,N-dietyl-dodekanamid i dodekan. Kappesiden av separatoren 48 ble anordnet som en lukket krets fremstilt av en rekke forbundne beholdere illustrert i fig. 9. Oppløsningen som returnerte til separatoren 44 ble innstilt til pH 4,0 for å protonere L-phe-OMe som trengte gjennom sammen med dipeptidet N-formyl-( B-metyl)-asp-phe-OMe. Sirkulasjon gjennom en kolonne av "Dowex" 50 (Na<+>) 50 fjernet positivt ladet L-phe-OMe og etterlot det uladede dipeptid i oppløsning. Utstrømningen ble innstilt til pH 7,0 og utsatt for innvirkning av aminoacylasen I, immobilisert over DEAE-Sephadex 52 (T. Tosa, T. Mori og I Chibata, Agr. Biol. Chem. 33, 1053 (1969)). Det resulterende dipeptid N-formyl-( g-metyl)-asp-phe var negativt ladet ved denne pH og ble deretter innfanget av Dowex 1 (C1-) harpiksen 54. Utstrømningen ble returnert til membranseparatoren før innstilling til pH 4,0 og lukket således kretsløpet. containing 900 cm of a hydrophobic liquid membrane prepared from 30% N,N-diethyl dodecanamide in dodecane. The casing side of the separator 48 was arranged as a closed circuit made of a series of connected containers illustrated in fig. 9. The solution returned to separator 44 was adjusted to pH 4.0 to protonate L-phe-OMe which permeated along with the dipeptide N-formyl-(B-methyl)-asp-phe-OMe. Circulation through a column of "Dowex" 50 (Na<+>) 50 removed positively charged L-phe-OMe leaving the uncharged dipeptide in solution. The effluent was adjusted to pH 7.0 and exposed to aminoacylase I, immobilized over DEAE-Sephadex 52 (T. Tosa, T. Mori and I Chibata, Agr. Biol. Chem. 33, 1053 (1969)). The resulting dipeptide N-formyl-(g-methyl)-asp-phe was negatively charged at this pH and was then captured by the Dowex 1 (C1-) resin 54. The effluent was returned to the membrane separator before adjustment to pH 4.0 and closed thus the circuit.
Røret 46 (100 ml) og kappen 48 (500 ml) fasene ble sirkulert ved 25°C i motstrøm gjennom membranseparatoren med hastigheter 50 ml/min. (rørfase) og 120 ml/min. The tube 46 (100 mL) and jacket 48 (500 mL) phases were circulated at 25°C countercurrently through the membrane separator at rates of 50 mL/min. (tube phase) and 120 ml/min.
(kappefase). (mantle phase).
Periodisk prøvetagning av kappefasen ble foretatt på utstrømningen fra det annet enzym (E2), (fig. 9, prøve-åpning 56, før den gikk inn i "Dowex" 1 (Cl-)-kolonnen 54) og prøvene ble overvåket ved hjelp av HPLC ved å følge prosedyrene beskrevet i eksempel 5. Som forventet, ved dette punkt av kretsløpet (fig. 9) ble ikke noe L-phe som kunne resultere fra den enzymatiske hydrolyse av Periodic sampling of the jacket phase was carried out on the effluent from the second enzyme (E2), (Fig. 9, sample port 56, before entering the "Dowex" 1 (Cl-) column 54) and the samples were monitored using HPLC following the procedures described in Example 5. As expected, at this point in the circuit (Fig. 9) no L-phe that could result from the enzymatic hydrolysis of
L-phe-OMe av E2 (se eks. 8) detektert. Bare et sirkulerende stabilt nivå av N-formyl-(8-metyl)-asp-phe (gjennom-snittskonsentrasjon 54 mg/L) ble iaktatt og reflekterte den kontinuerlige overføring av dipeptidet N-formyl-(6-metyl-APM gjennom membranen og dets etterfølgende hydrolyse av E2 . Den effektive innfanging av det ladede bipeptid ved hjelp av "Dowex" 1. harpiks indikeres ved den lave konsentrasjon av dipeptidet iakttatt ved punkt A under hele forsøket. Et lignende parallellforsøk gjennomført i fravær av "Dowex" 1 resulterte i peptid i kappefasen, som kunne forventes fra resultatene drøftet i det foregående. Heller ikke her ble noe L-phe funnet i den sirkulerende kappefase. En sammenligning av begge forsøk sees i fig. 10 og tabell IX. L-phe-OMe of E2 (see Ex. 8) detected. Only a circulating steady-state level of N-formyl-(8-methyl)-asp-phe (mean concentration 54 mg/L) was observed and reflected the continuous transfer of the dipeptide N-formyl-(6-methyl-APM) across the membrane and its subsequent hydrolysis of E2. The effective capture of the charged bipeptide by "Dowex" 1 resin is indicated by the low concentration of the dipeptide observed at point A throughout the experiment. A similar parallel experiment carried out in the absence of "Dowex" 1 resulted in peptide in the envelope phase, as would be expected from the results discussed above. Again, no L-phe was found in the circulating envelope phase. A comparison of both experiments is seen in Fig. 10 and Table IX.
I tillegg til å separere fenylalanin lavere alkyl-ester In addition to separating phenylalanine lower alkyl ester
som også trenger gjennom den ioneavstøtende membran inn i produktblandingen under anvendelse av ionebytterharpikser som beskrevet i dette eksempel, kan aspartin-syre som også trenger gjennom den ioneavstøtende membran inn i produktblandingen separeres under anvendelse av slike harpikser. Species eller produkt som ikke kan diffundere tilbake gjennom membranen fra produktblandingen kan fjernes under anvendelse av slike ionebytterharpikser. Andre separasjonsmetoder kjent på området inklusive, men ikke begrenset til elektroforese, elektrodialyse og membranseparasjoner som er ekvivalenter ved ionebytter-harpiksseparasjoner kan også anvendes, ved den foreliggende oppfinnelse. which also penetrates through the ion-repellent membrane into the product mixture using ion exchange resins as described in this example, aspartic acid which also penetrates through the ion-repellent membrane into the product mixture can be separated using such resins. Species or product that cannot diffuse back through the membrane from the product mixture can be removed using such ion exchange resins. Other separation methods known in the field including, but not limited to electrophoresis, electrodialysis and membrane separations which are equivalent to ion exchange resin separations can also be used, in the present invention.
Immobilisering av det kondenserende enzym tillater at den enzymatiske reaksjon i rørfasen kan gjennomføres ved en initial pH i reaksjonsblandingen foretrukekt for optimal effektivitet av den enzymatiske reaksjon i betraktning av reaksjonskomponentene, produkter og enzym inklusive den ønskede likevekt av den enzymatiske reaksjon. Eventuelt kan den initiale pH i reaksjonsblandingen i rørfasen innstilles på nytt til en pH i den annen reaksjonsblanding før denne bringes i kontakt med membranen slik at pH i den annen reaksjonsblanding vil maksimalisere membranvirkningsgraden ved å transportere det uladede produkt fra rørfasen gjennom membranen inn i kappefasen. Fig . 9 viser ikke innstilling av pH i den initiale reaksjonsblanding i rørfasen til en pH i den annen reaksjonsfase. Immobilization of the condensing enzyme allows the enzymatic reaction in the tube phase to be carried out at an initial pH in the reaction mixture preferred for optimal efficiency of the enzymatic reaction in consideration of the reaction components, products and enzyme including the desired equilibrium of the enzymatic reaction. Optionally, the initial pH in the reaction mixture in the tube phase can be re-adjusted to a pH in the second reaction mixture before this is brought into contact with the membrane so that the pH in the second reaction mixture will maximize the membrane efficiency by transporting the uncharged product from the tube phase through the membrane into the jacket phase. Fig . 9 does not show setting the pH in the initial reaction mixture in the pipe phase to a pH in the second reaction phase.
Tilsvarende kan esterasen i kappefasen immobiliseres og Similarly, the esterase in the coat phase can be immobilized and
pH i produktblandingen i kappefasen kan innstilles og innstilles på nytt etter behov for å gjennomføre den mest effektive prosessgjennomføring. Eksempel 8 og det foregående eksempel tilveiebringer ytterligere midler for effektiv kontinuerlig eller porsjonsvis prosessgjennomføring The pH of the product mixture in the jacket phase can be adjusted and re-adjusted as needed to achieve the most efficient process execution. Example 8 and the preceding example provide additional means for efficient continuous or batchwise process execution
under anvendelse av den foreliggende oppfinnelse. Ved kontinuerlig prosessføring kan den ønskede enantiomer av reaksjonskomponenter og hvilke som helst forbindelser som trenger gjennom sammen med disse returneres til rørfasen eller reaksjonsblandingen. using the present invention. With continuous processing, the desired enantiomer of reaction components and any compounds that penetrate together with these can be returned to the tube phase or the reaction mixture.
Claims (8)
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US06/897,679 US5037741A (en) | 1986-08-18 | 1986-08-18 | Enzymatic method for the synthesis and separation of peptides |
US07/078,504 US5002871A (en) | 1986-08-18 | 1987-07-28 | Enzymatic membrane method for the synthesis and separation of peptides |
PCT/US1987/002030 WO1988001298A2 (en) | 1986-08-18 | 1987-08-14 | Enzymatic membrane method for the synthesis and separation of peptides |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO881669D0 NO881669D0 (en) | 1988-04-18 |
NO881669L NO881669L (en) | 1988-04-18 |
NO172064B true NO172064B (en) | 1993-02-22 |
NO172064C NO172064C (en) | 1993-06-02 |
Family
ID=27373295
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO881669A NO172064C (en) | 1986-08-18 | 1988-04-18 | PROCEDURE FOR ENZYMATIC SYNTHESIS OF PEPTIDES AND PROCEDURE FOR ENZYMATIC SEPARATION OF RACEMIC CARBOXYLIC ACID COMPOUNDS |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
HK (1) | HK50691A (en) |
NO (1) | NO172064C (en) |
-
1988
- 1988-04-18 NO NO881669A patent/NO172064C/en unknown
-
1991
- 1991-07-04 HK HK50691A patent/HK50691A/en unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
HK50691A (en) | 1991-07-12 |
NO172064C (en) | 1993-06-02 |
NO881669D0 (en) | 1988-04-18 |
NO881669L (en) | 1988-04-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5002871A (en) | Enzymatic membrane method for the synthesis and separation of peptides | |
JP2677403B2 (en) | Resolution of stereoisomers in multiphase and extraction membrane reactors. | |
US6987010B2 (en) | Process for the enzymatic preparation of enantiomer-enriched β-amino acids | |
US5350681A (en) | Enzymatic membrane method for the synthesis and separation of peptides | |
US5037741A (en) | Enzymatic method for the synthesis and separation of peptides | |
US5057415A (en) | Continuous enzymatic process for preparing peptides | |
US5336601A (en) | Enzymatic membrane method for the snythesis and separation of peptides | |
US5202235A (en) | Enzymatic method for the synthesis and separation of peptides | |
NO172064B (en) | PROCEDURE FOR ENZYMATIC SYNTHESIS OF PEPTIDES AND PROCEDURE FOR ENZYMATIC SEPARATION OF RACEMIC CARBOXYLIC ACID COMPOUNDS | |
JP4662694B2 (en) | Enzymatic production of enantiomerically enriched N-unprotected β-amino acids | |
CA1314254C (en) | Enzymatic membrane method for the synthesis and separation of peptides | |
JP4386670B2 (en) | Enzymatically enriched N-unprotected β-amino acid production method, β-amino acid-n-propyl ester and use thereof | |
AU641161B2 (en) | Enzymatic membrane method for the synthesis and separation of peptides | |
Kijima et al. | Facile optical resolution of amino acid esters via hydrolysis by an industrial enzyme in organic solvents | |
WO2001087819A1 (en) | PROCESS FOR PRODUCING OPTICALLY ACTIVE α-AMINO ACID AND OPTICALLY ACTIVE α-AMINO ACID AMIDE | |
EP0220028B1 (en) | Process for producing l-aspartyl-l-phenylalanine and its diketopiperazine | |
CZ20032077A3 (en) | Process for preparing enantiomer-enriched amino acids | |
Furutani et al. | Resolution of N-acetyl-DL-methionine methyl ester by protease-catalyzed hydrolysis with mild base as the pH control reagent | |
Nakamura et al. | Phenylalanine methyl ester production from phenylpyruvate methyl ester by immobilized Nocardia opaca under high hydrogen pressure | |
JPH11103887A (en) | Production of d-amino acid | |
Rethwisch et al. | Enzymatic Catalysis in Bioseparations | |
NO312275B1 (en) | Process for the preparation of water-soluble salts of carboxylic and amino acids | |
JPH0716427B2 (en) | Method for producing L-amino acid | |
JPH0347083A (en) | Method for racemizing amino acid |