KR900004070B1 - 펩티드의 합성 및 분리를 위한 효소막법 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]
펩티드의 합성 및 분리를 위한 효소막법
[도면의 간단한 설명]
전술한, 그리고 기타의 목적 및 장점은 본 발명에 의해 달성될 수 있으며 이는 첨부된 도면에 의해 더욱 구체적으로 설명하면 분명해 질 것이다.
제 1 또는 본 발명에 따른 아스파탐의 효소적 합성법을 예시한 것임
제 2 또는 본 발명의 방법의 실시를 위한 장치를 도식적으로 나타낸 도면.
제 3 또는 실시예 1 및 2에서 생성된 생성물 (아스파탐 유도체)의 양을 나타낸 그래프.
제 4 또는 실시예 4에서 생성된 생성물 (아스파탐 유도체)의 양을 나타낸 그래프.
제 5 또는 실시예 5에서 생성된 생성물 (아스파탐 유도체)의 양을 나타낸 그래프.
제 6 또는 실시예 6에서 생성된 생성물 (아스파탐 유도체)의 양을 나타낸 그래프.
제 7 또는 실시예 7에서 생성된 생성물 (아스파탐 유도체)의 양을 나타낸 그래프.
제 8 또는 실시예 8에서 생성된 생성물 (아스파탐 유도체)의 양을 나타낸 그래프.
제 9 또는 실시예 9에서 설명된 것과 같이 생성물 쪽의 용기를 예시한 본 발명을 실시하기 위한 장치를 도식적으로 나타낸 도면.
제 10 또는 실시예 10에서 이온교환 수지를 이용한 것과 이용하지 않고 생성된 생성물 (아스파탐 유도체)의 양을 나타낸 그래프.
[발명의 상세한 설명]
기술분야
본 발명은 비하전 펩티드는 투과시키나 하전분자는 투과시키지 않는 막을 이용하여 펩티드를 합성하고 분리시키는 효소법에 관한 것이다. 더욱 자세히 말하자면 본 발명은 L,L-디펩티드를 동시에 합성 및 정제하는 방법 및 L-아스파르틸-L-페닐알라닌 메탈에스테트 [아스파탐(aspartame)]의 제조에 대한 그의 응용에 관한 것이다:
[배경기술]
L,L-펩티드를 생산하기 위해 2개의 L-아미노산을 입체 특이적으로 커플링 시키기 위한 축합 촉매로서의 단백질 분해효소의 용또는 단백질 화학의 초창기부터 알려져 왔다. 1909년 모어(Mohr) 및 스트로쉐인(Strohschein)은 단백질 분해효소 파파인의 존재하에서 Bz-Leu-OH와 H-Leu-NH2를 반응시켜 비수용성 디펩티드 Bz-Leu-Leu-NH2를 제조하는 방법에 대하여 설명하였다. [E, 모어 및 F 스트로쉐인, Ber 42권 2521면 (1909)]. 모어 및 스트로쉐인타잎 반응은 파파인 및 사용된 기타효소에 의해 용이하게 분해될수 있는 펩티드 결합을 형성하는 아미노산들 사이에서만 가능하다. 실제로 아미노산 반응물과 펩티드 생성물사이의 축합반응의 평형은 대체로 반응 아미노산 쪽으로 이동된다. 그럼에도 불구하고, 만일, 예컨대 디펩티드 생성물이 거의 용해하지 않아 반응상으로부터 석출되어 나온다면 축합 반응들은 질량 작용에 의해완결된 상태로 될 수 있다.
특정 펩티드의 산업적 중요성 및 효소가 온화한 조건하에서 펩티드 형성을 촉진 시킨다는 사실 때문에 펩티드, 특히 간단한 디펩티드의 효소적 합성에 대해 수많은 연구가 행해져왔다. [K.오야마 및 K.기하라 가가꾸 소세쯔 35권 195면 (1982) ; K 오야마 및 K 기하라
Figure kpo00001
14권 100면 (1984)].
미국 특허 제 4,165,311호에 기재된 펩티드유도체 아스파탐의 효소적 합성방법 (이하 '311 방법이라 칭함)은 반응을 펩티드 생성쪽으로 유도하는 N-카르보벤족시-L-아스파라긴산과 D,L-페닐알라닌 메틸에스테르사이의 써모리신(thermolysin)에 의해 촉매된 축합반응 및 중간 복합체, N-카르보벤족시-아스파탐의 D-페닐알라닌 메틸에스테르염의 침전을 포함한다.
이 중간복합체를 계속 반응시키면 라세미화후에 재순환될 수 있는 D-페닐 알라닌 메틸에스테르 및 N-카르보벤족시 보호기를 제거함으로써 아스파탐으로 전환될 수 있는 N-카르보벤족시-아스파탐 유도체를 회수할 수 있다. 상기 '311 방법은 효소의 회수를 어렵고 복잡하게 만드는 회분식 방법으로 수행되어야만한다. [K.오야마, S.이리노, T.하라다 및 N. 하기
Figure kpo00002
434권 95면 (1985)] [윌리클만, 효소적 펩티드합성 (1987)].
N-카르보벤족시 보호기는 '311 방법에서 써모리신의 활성부위에 의해 부과된 구조적 요구성을 만족시키고, 중간 복합체의 불용성에 기여하여 반응의 수율을 증가시킴으로써 '311 방법에서 필수적인 역할을 한다.아스파탐 유도체로부터 N-카르보벤족시보호기의 제거는 메틸 에스테르기의 분해를 방지하기위해 예컨대 촉매적 수소첨가 반응과 같은 온화한 조건하에서 수행되어야만 한다. 촉매적 수소첨가반응은 수소기체를 대량으로 처리해야 하는 불편함을 수반한다. 효소적 축합 반응을 완결시키기 위한 다른 접근 방법은 화확 참고 문헌에도 기재되어 있다. 예컨대, 반응매체로서 유기용매를 사용하면 비록 그의 대규모 실험에서 효소안정성의 부수적 감소가 예상되긴 하였으나 펩티드 생산수율을 증가시키는데는 효과적인 것으로 알려져왔다. [K.오야마, S.니시무라, Y.노나까, K.기하라 및 T.하시모또,
Figure kpo00003
46권 5241면 (1981) : H.오오시마, H.모리 및 Y.하라노.
Figure kpo00004
7권 789면 (1985) : K.나까니시, T.가미구보 및 R.마쯔노,
Figure kpo00005
3권 459면 (1985)].
펩티드의 효소적 합성에 대한 기존 기술 방법상의 실시에 따른 전술한 난점, 특히 중간 복합체의 침전에 대한 요구사항 및 위험한 시약의 조작등의 면에서 볼 때, 이들난점을 피하면서 효소촉매의 급속한 활성의 감소가 일어나지 않고 안전하게 효과적인 수율을 얻을 수 있는 개선된 방법을 제공하는 것이 요구된다.
[발명의 개요]
본 발명은 제 1 반응물을 제 2 반응물과 커플링시켜 막 투과성 화합물을 제조하고, 투과성 화합물로 하여금 반응물은 이동시키지 않는 막을 투과하게하고, 이동된 화합물을 막을 통해 재이동할 수 없는 형태로 비가역적으로 전환시키는 단계를 포함하는 화합물의 합성 및 정계방법을 제공한다.
본 발명은 또한 수성혼합물중에서 축합 효소를 이용하여 수소가 첨가된 아미노기(암모늄)를 포함하는 제 1 화합물과 유리카르복실레이트기를 포함하는 제 2 화합물을 커플링시켜 비하전 (또는 비이온화) 커플링 화합물을 제조하고, 비하전 화합물 만을 선택적으로 막의 생성물 부위로 이동시키는 막을 통한 확산에 의해 수성 혼합물로부터 비하전 결합 화합물을 연속적으로 제거하는 단계로 이루어진 화합물의 효소적 합성 및 정제 방법을 제공한다. 이동된 커플링 화합물은 막을 통해 역확산 되지 못하도록 하전(이온화된)분자로 전환되는 펩티드 또는 그의 유도체인 것이 바람직하다. 따라서, 커필링 생성물의 생성은 반응 혼합물 내에서 이루어지는 것이 바람직한데 이는 이 생성물이 반응 혼합물로부터 계속 제거되기 때문이다.
본 발명은 또한 축합효소롤 포함하는 수성 반응혼합물내에서 α-카르복실레이트기를 포함하는 N-아실-β-치환-L-아스파라긴산과 α-암모늄기를 포함하는 페닐알라닌 저급알킬 에스테르를 축합시켜 비하전 펩티드인 N-포르밀-L-아스파르틸 (β-치환)-L-페닐 알라닌 저급 알킬 에스테르(즉 탄소수 1∼6)를 생성시키고 이 비하전 펩티드를 수성반응 혼합물로부터 선택투과막을 통해 생성 혼합물로 이동시키는 단계로 이루어지는 아스파탐 및 그 유사물과 같은 펩티드 유도체를 효소적으로 합성하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 수성 반응 혼합물내에서 제 1 및 제 2 아미노산을 축합시켜 비하전 화합물을 생성시키고, 상당량의 아미노산은 이동시키지 않는 막을 통해 비하전 화합물을 제 2 수성반응 혼합물로 이동시키며 이동된 비하전 화합물을 막을 통해 초기 반응혼합물로 재이동 할 수 없는 형태로 전환시키는 단계로 되는 펩티드의 효소적 합성 방법을 제공한다. 또한, 비하전 화합물과 함께 제 2 반응 혼합물로 공침투하는 제 1 및 제 2 화합물을 제 2 반응혼합물로부터 분리하여 선택적으로 초기 반응 혼합물로 복귀시킬 수 있다.
본 발명은 또한 가수분해 효소를 포함하는 수성반응 혼합물중에 D.L-아미노산을 가수분해하여 수성 반응 혼합물내에 하전 L-아미노산 화합물 및 비하전 D-아미노산 화합물을 생성시키고, 비하전 D-아미노산 화합물을 혐이온성 막을 통해 수성반응 혼합물로부터 생성 혼합물로 이동시켜 에난티오머를 분해하게 하는 단계로 이루어진 아미노산 화합물의 효소적 분해 방법을 제공한다. 생성 혼합물 내의 비하전 D-아미노산 혼합물은 축적되어 통상적인 수단에 의해 회수할 수 있다. 아미노산 화합물의 효소적 분해방법은 전술한 기타 방법과 결합시킬 수도 있다.
본 발명의 목적은 펩티드 생성물을 동시에 합성 및 정제할 수 있게 하는 펩티드의 효소적 합성방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또다른 목적은 펩티드 및 그의 유도체, 특히 아스파탐을 안전하고 경제적으로 또 효율적으로 합성하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또다른 목적은 효소의 효율적 이용과 연속적 방법으로 합성할 수 있는 수단을 제공하는 경제적인 펩티드의 효소적 합성방법을 제공하는데 있다.
끝으로 본 발명의 또 하나의 목적은 아스파탐과 D,L-페닐알라닌 및 N-보호-β-치환-L-아스파라긴산염으로된 그의 유도체를 상당한 수율로, 특히 효소적으로 합성하는데 적용되는 방법을 제공하는데 있다.
[발명의 수행을 위한 최상의 형태]
본 발명은 비하전 펩티드 만을 선택적으로 반응 혼합물에서 생성혼합물 쪽으로 이동시키는 막을 이용해 비하전 펩티드 중간 생성물 또는 그의 유도체를 반응 혼합물로부터 분리시킴으로써 수성 반응 혼합물 중에서 펩티드의 효소적 합성을 완결시키게하는 방법을 제공한다. 실제적으로 막은 반응물(하전 분자)에 대하여는 비침투성이므로 반응 혼합물로부터의 펩티드 중간 생성물의 제거는 반응을 질량 작용에 의해 완결시키려하는 평형상태에서의 펩티드의 농도를 감소시킨다.
본 발명의 실시에 있어서 가장 유용한 막은 미세다공성 지지물 중에 내포된 비극성 액체로 이루어진 고정액상 막(ILM)으로서 이때 지지물로는 효소, 반응물 및 생성물은 실제로 통과시키지 않는 폴리머 시트가 바람직하다. 폴리프로필렌과 같은 소수성 폴리머가 지지물로서 바람직하다. ILM 모듈은 폴리프로필렌 공동섬유를 이용하여 생산 할 수 있다. 상업적으로 구득할 수 있는 폴리프로필렌 공동섬유의 한 예로 셀가드[셀라니즈 코오포레이션 (미국 1211번가 뉴욕 N.Y.10036)의 등록상표 셀라니즈 섬유판매 조합에서 판매(샬로트 N.C.)를 들 수 있다.
본 기술분야에 공지된 포팅(potting) 화합물 및 염화 폴리비닐도관 또는 튜브도 ILM 모듈을 조립하는 데 선택적으로 사용될 수 있다. 미세다공성 지지물을 제조하는데 쓰이는 또다른 폴리머로 불화탄화수소 폴리머인 E.I.Du Pont de Nemours ＆ Co.의 상표인 TEFLON을 들 수 있다. 전형적인 미세다공성 지지물은 W.C. Gore ＆ Ass.Inc.의 상표인 GORE-TEX이다.
미세기공은 지지물을 통과하여 막주위의 압력차나 기타 일반적 반응 조건에 접해서도 고정액상이 모관현상에 의해 그안에 보유되어 그로부터 빠져나을 수 없도록 크기를 결정해야 한다. 상기와 같이 제한하면 비하전 펩티드 생성물이 막을 통과하는 이동률(유량)이 최대화 되도록 고정액상과 반응 혼합물간의 접촉 면적을 최대화하는데 유리하다. 바람직한 기공의 크기는 특정 고정액상, 사용된 반응물, 제조된 생성물의 특성및 기타 인자에 따라 달라져야 한다는 것을 인식해야 하며 최적의 기공 크기는 본 기술 분야에 숙련된 자라면 수치적으로 결정할 수 있을 것이다. 기공 크기의 선택에 대한 유용한 논의가 미국 특허 제 4,174,374호에 기재되어 있다. 고정액상막의 용도 및 제조방법이 하기 참고문헌에 기재되어 있다 [AICHE 연차회의 (뉴올리언즈, 루이지애나 (1981년 11월 8∼12일)에서 제출된 논문, SL 맷슨 및 J.A. 킨막 반응기 내에서의 화학전환에 대한 결합분리 및 강화] 및 [S.L. 맷슨 및 J.A.킨. 바이오프로세싱에 있어서의 막 반응기,
Figure kpo00006
469,152면 (1986)]
미세다공성 지지물 내에 모관현상에 의해 보유되는 고정 액상은 물에 비 혼합성 이어야하고 적당한 속도로 막을 통과해야 하는 비하전 펩티드 생성물에 대하여는 우수한 이동특성/고유인 반면 막의 어느 방향으로도 이동되지 못하는, 막의 양부위 즉 반응부위와 생성물 부위 모두의 하전 또는 이온화된 분자에 대하여는 우수한 선택성/혐이온성인 우수한 용매이어야한다.
본 발명에 따른 펩티드의 효소적 형성에 이용되는 지지물과 고정액의 최상의 혼합을 선택하는 것은 부분적으로는 사용된 특정 반응물, 목적하는 생성물 및 그 반응계의 용매의 성질에 의존할 것이다
본 발명의 실시를 위해 일반적으로 선호되는 고정액은 탄소수가 6∼20이며 가지를 갖는 그리고, 가지를 갖지않는, 예컨대 n-데칸올, n-도데칸올, n-헥사데칸올 및 그의 혼합물등의 알코올류와 같은 물과 비혼합성인 유기용매를 포함한다. 또한 물과 비혼합성인 유기용매의 혼합물 및 그 자체의 혼합물들도 바람직하다. 이러한 용매에는 N,N-디에틸-도데칸아미드, 도데칸 및 2-운데칸온이 있으나 이들로 한정시키는 것은 아니다.
본 발명을 실시할 때 유용한 또다른 형태의 막은 염화 폴리비닐 또는 기타의 유기폴리머로 만들어진 소수성 고체막이다. 이러한 폴리머막의 제조방법은 예를들면, [O.J.스위팅편집인 폴리머 필름의 과학과 기술뉴욕 (1968)]에 잘 기재되어 있고 이러한 막을 기체 및 액체의 분리에 까지 확대 적용한 것은 S.T. 황 및 K. 캄머마이어, 분리에 있어서의 막. 화학의 기술 7 권 (A. 바이스버거, 편집인), 존 와일리 ＆ 선즈, Inc.뉴욕 (1975)]에 기술되어 있다.
본 발명의 바람직한 실시예는 ILM막의 한면과 접촉하여 순환하는 수성 반응혼합물 또는 수성 반응상과 막의 반대면에서 역순환하는 생성물의 액상 또는 수성반응상을 제공하는 막 반응기/분리기 시스템을 사용하는 것이다. (S L 맷슨 및 J.A. 킨. Ann, N.Y, Sci 469권 152면 (1986)]. 반응상 및 생성물상의 pH 및 온또는 반응물이 pH 약 4∼9에서 막을 통한 그들의 이동을 최소화하는 형태로 유지되는 수준에서 유지된다. 반응상으로부터 생성물상으로의 비하전 펩티드 중간 생성물의 이동은 반응상에서의 중성 또는 비하전 펩티드 농도의 증가로 인해 생긴 막 전역에 걸친 농도구배에 의해 추진된다. 막을 통한 이동활성 또는 유량은 생성물상에서 이동된 펩티드를 동시에 비가역적으로 역확산 할 수 없는 종류로 전환시킴으로써 현저히 증대될 수 있다. 예를들면 후자로의 전환은 역확산할 수 없고 그 때문에 결합반응의 완성을 달성케하는 추진력을 보충할 수 있는 극성 펩티드를 생성시킬 것이다. 본 발명의 실시에 이용할 수 있는 막 반응기/분리기의 일례가 미국 특허 제 4,187,086호에 나타나 있다.
본 발명의 실시에 이용할 수 있는 다른 구득가능한 막 반응기/분리기 형태에는 영국 특허출원 번호 제 2,047,564a호에 기재된 공동 섬유모듈과 공지의 재래식 판 및 프레임형 여과기 장치가 있다.
비하전 펩티드의 선택적 이동에 대하여 부언하면 이 막은 각 상의 구성성분간의 바람직하지 못한 혼합 및 반응을 방지해주는 반응상과 생성물상간의 장벽을 제공한다.
본 발명에 따라 구상된 바람직한 막 반응기/분리기에서는 비하전 펩티드를 막의생성막 비침투성 펩티드로 비가역적으로 전환시킴으로써 반응물 사이의 화학평형은 실제로 막을 통해 이동된다. 이 형태의 막 반응기/분리기엔, 일반적 형태인 결합된 두가지 효소(E1및 E2) 방법이 적용된다.
Figure kpo00007
하전 반응물
Figure kpo00008
는 펩티드 형성 효소 E1의 도움으로 축합되는 아미노산 및/또는 작은 펩티드로서 이들은 막을 통해 생성물 쪽으로 선택적으로 이동되는 비하전 중간생성물 펩티드
Figure kpo00009
를 형성한다. 목적하는 반응에 참여하지 않는 반응물에 있어서의 반응성 관능기는 필요한 부위에서는 바람직하지 못한 부작용 및/또는 생성물의 변화를 방지하기 위해 보호되거나 차단될 지도 모르는 것으로 이해된다. 막의 생성물 부위에서는 비하전 펩티드티드 C가 막을 통해 역확산할 수 없는 하전 펩티드이므로 전환되어 반응혼합물 내에서의 화학평형은 더 많은
Figure kpo00010
를 생성시키는 쪽으로 이동하게된다.
이 개념은 제 1 도에 예시되어 있으며 pH 5.5 정도에서 써모리신의 존재하에 D,L-페닐알라닌 메틸에스테르와 (N 및 β-보호) N-포르밀-β-벤질-L-아스파라긴산염을 효소적으로 촉합시키는 특정예를 든것이다.
제 1 도에 예시된 반응식에서 반응물
Figure kpo00011
는 D,L-페닐알라닌 메틸 에스테르이고
Figure kpo00012
는 N-포로밀-β-벤질-L-아스파라긴산염이다. 반응물은 막의 반응부위에서 효소 E1써모리신에 의해 축합되어 비하전 펩티드 C를 생성시킨다. pH는 반응물로 하여금 하전상태로 유지하게 하여 그들이 비하전 펩티드 C를 따라 막을 통해 확산하는 것을 최소화하도록 선택된다.
비록 축합반응에 대한 화학평형이 대체로 반응물
Figure kpo00013
종류로 기울어지나 비하전 펩티드 생성물
Figure kpo00014
가 막을 통해 생성부위로 확산하기 위해서는 막의 반응 부위의 화학평형을 유지하기 위해
Figure kpo00015
를 일정하게 생산시키는 것이 요구된다.
막의 생성부위에서는 에스터라제 효소 E2가 비하전 펩티드
Figure kpo00016
를 막을 통해 반응부위로 역확산할 수 없는 하전 펩티드
Figure kpo00017
로 비가역적으로 전환시킨다. 그리하여, 반응 부위에서의 화학평형은 막을 통해 효율적으로 비하전 생성물
Figure kpo00018
의 생성쪽으로 이동된다. 그 다음 펩티드
Figure kpo00019
는 포르밀 및 벤질 보호기를 제거하는 산 가수분해에 의해 아스파탐으로 전환된 후 메탄올로 C-말단이 에스테르화 된다.
전술한 방법은 제 2 도에서 도시된 바와같이 반응물, 예컨대 수소가 첨가된 유리 α-아미노기 (전기적으로 양성인 종류)를 갖는 D,L-페닐알라닌메틸 에스테르와 축합되는 N-아실-β-치환-L-아스파라긴산, 예컨대 유리 α-카르복실기를 갖는 N-포르밀-β-벤질-L-아스파라긴산염으로 이루어진 반응 혼합물이 pH 약 4∼9에서 활성인 프로테아제의 촉매작용하에서 완전히 보호되고 이온기를 갖지않는 (전기적으로 중성인 종류) L-아스파르틸-L-페닐알라닌 디펩티드를 생산하도록 역류유동 막 반응기/분리기(10)내에서, pH와 온도가 조절된 조건하에서 조절하므로써 시행될 수 있을 것이다. 막의 반응부위에서 반응 혼합물은 펌프(14)로 보관된 반응기 탱크(12)로 부터 원료주입도관(16), 분리기(18)을 통해 다시 반응기 탱크(12)로 이어지는 원료방출도관(20)으로 순환된다. 막의 생성부위에서는 완전히 보호된 비하전 펩티드, 즉 막을 통해 이동된 N-포르밀-β-벤질-L-아스파틸-L-페닐알라닌 메틸 에스테르를 포함하는 스위프 또는 생성혼합물이 점프(24)로 보완된 생성물 반응기 탱크(22)로부터 생성물 스위프 주입도관(26)과 생성부위쪽의 분리기(18)을 통해 생성물 스위프 방출도관(30)으로 순환한다. 이 반응 혼합물은 비하전 펩티드에 의해 생긴 보호기를 적어도 하나 이상 분해하여 역확산에 의해 막을 통해 스위프 흐름으로부터 빠져나올 수 없는 전기적으로 전하를 띠는 종류로 만들어 내는 에스터라제 제 2 효소 E2또는 기타 적합한 시약을 포함한다. 에스터라제가 사용될 경우 단백질 분해 활성을 가지면서 적정 pH 범위를 6.0∼9.0으로 하는 에스터라제가 바람직할 것이다. 아미노아실라제 I,α-키모트립신 및 서브티리신 A는 본 발명에서 유용하다고 여겨지는 에스터라제의 몇가지 예이다.
전하성 생성물은 생성상으로부터 이온교환수지와 같은 통상적인 수단에 의해 주기적으로 방출 및/또는 연속적으로 제거되어질 수 있으며 잔여 용출물은 계를 주기적으로 방출 및/또는 연속적으로 제거되어질 수 있으며 잔여 용출물은 계를 통해 재순환 될 수도 있다. 이온 교환수지에 결합되어있는 최종 생성물은 통상적인 방법에 의해 제거하여 회수할 수 있다.
적절한 탈 보호시약의 선택은 N-보호-L-아스파틱산과 같은 반응물에 사용된 보호기의 화학적 성질에의해 결정되며, 앞서 지적된 바와같이 보호기의 선택은 이번에는 축합효소의 활성부위에 의해 부과되는 구조적인 구속에 의해 정해진다.
일반적으로, 본 발명의 실시에 유용한 효소는 때때로 프로테아제라고도 불리는 단백질 가수분해효소로서 이는 두가지 군으로 나뉠수 있다. 보다 일반적으로 사용되는 효소는 내부 결합만 절단하는 엔도펩티다제와 말단 결합만 절단하는 엑소펩티다제이다. 유용한 효소로는 키모트립신, 트립신, 서브티리신 BNP' 및
Figure kpo00020
프로테아제와 같은 세린프로티나제 (EC 3,4,21), 파파인과 같은 싸이올 프로티나제 (EC 3,4,22), 펩신과 같은 카르복실 프로티나제(EC 3,4,23), 써모리신, 프로리신, 타시나센 N(St. 세스피토수스) 및 디스파제와 같은 메탈로프로티나제 (EC 3,4,24)를 들 수 있다. 숙련된 자들에게는 잘 알려진 하기의 방법인 불용성 지지물에 효소를 결합하는 것은 본 발명의 실시에 병합하여 사용할 수 있으며 효소를 결합하는 것이 필수적인 단계는 아니지만 어떠한 작용에서는 바람직할 수도 있다. 본 발명의 실시에 잠재적으로 유용한 많은 프로테아제 중에서 써모리신 (E.C,3,4,24)은 가장 선호되는 축합 효소인데, 그 이유는 이 효소의 뛰어난 열 안정성, 광범위한 구득성, 저렴한 경비 및 5.0∼9.0 사이의 넓은 유효 pH 범위 때문이다. 기타 선호되는 프로테아제에는 펩신 및 페니실로 펩신 [T. 호프만 및 R. 쇼우
Figure kpo00021
Figure kpo00022
92권 543면 (1964)] 및
Figure kpo00023
Figure kpo00024
로부터 얻는 열안정성 프로테아제 [S, 애미 D.V. 마이어 및 G.A. 이아코부치,
Figure kpo00025
(15권 842면 (l976)]을 들수 있다. 이들은 pH 5.5정도에서 작용하는 것으로 기대되며 이 pH에서 우수한 안정성을 보이고 활성을 유지하는데 있어서 아연 또는 칼슘이온을 필요로 하지 않는다.
예난티오머 선택성을 실제로 실현하는것, 즉, 전술한 경우에 있어서는 오직 펩티드
Figure kpo00026
의 L,L 이성질체만을 생산하는 것은 선택된 효소, 막의 선택적 기능, 지지물의 화학적 성질 및 수성반응상의 pH에 직접 관련된다.
전술한 특별법을 실시하기에 좋은 한 가지 막은 그안에 고정되어 있는 n-헥사데칸을 및 n-도네칸의 혼합물을 포함하는 미세다공성 폴리프로필렌 지지물이다. 이 막은 밴드 리서치 Inc. [64550 리서치로드, 밴드, 오레건, 97701, U.S.A.]로부터 구입할 수 있고 "타잎 1 공동섬유 선택성 투석막"이라는 상표명을 가지며 실시예 1-4의 반응에 바람직하다. 또하나의 선호되는 막은 셀가드타잎 폴리프로필렌 공동섬유 [셀가드는 셀라니즈 고어포레이션 (America 1211번가, 뉴욕 N.Y.10036)의 등록상표로서 셀라니즈 섬유 판매조함 (샬로트, N.C)에서 구입할 수 있음)]를 셀가드의 미세 다공성 시트의 기공내에 모관현상에 의해 고정된 물과 미혼합성인 유기용매로서 도데칸중에 30% V/V N,N-디에틸-도데칸아미드를 포함하는 미세다공성 지지물로 사용한다.이 막은 밴드 리서치 Inc.(64550 리서치로드, 밴드, 오레건, 97701, U.S.A.)로 부터 구입하였고 '타잎 2 공동섬유 선택성 투석막' 이라는 상표명을 갖고 있으며, 실시예 5∼9의 반응에 바람직하다. 밴드 리서치, Inc.의 타잎 2 공동 선택성 투석막에는 기공크기가 0.025∼0.050μm이고 벽의 두께가 25μm 인 셀가드 타잎 2400 폴리프로필렌 공동섬유가 사용되었다. pH 5.5정도에서 조작되었을때 이막은 예컨대 제 1 도의 방법으로 실시했을때 비하전 펩티드 종류의 편으로 500:1 (W/W)정도의 선택성이 측정된 바와 같이 고도의 선택성을 나타내었다. 즉 하전반응물 (
Figure kpo00027
또는
Figure kpo00028
) 1mg이 막을 통해 이동하는동안 비하전 펩티드
Figure kpo00029
는 500mg이 이동된다는 것이다.
전술한 바와같이, 본 발명을 이용하는데 있어 목적하는 생성물의 생성을 방해하고/또는 그의 수율을 감소시킬 수도 있는 바람직하지 못한 부작용을 방지하고 중간생성물 펩티드에 있어서의 전기전하를 억제하기 위해 반응물 및 생성물상의 여러가지 작용기를 차단하거나 보호해야하는 경우가 필요하거나 바람직할 수 있을것이다. 하기의 표 1은 본 발명의 실시와 관련 일련의 유용한 보호기 및 탈 보호조건의 선택된 결합을 나타낸다.
[표 1] 아스파탐(APM) 합성에 유용한 보호기 및 탈 보호시약
Figure kpo00030
선택된 축합효소의 에난티오머 선택성과 막에 의해 발휘된 기능적 식별력의 결과로, N-포르밀-L-아스파르틸-β-벤질에스테르 및 P,L-페닐알라닌 메탈에스테르를 사용하여 본 발명을 실시하자 D-에난티오머는 반응상에서 반응되지 않은 상태로 남은채 N-포르밀-L-아스파르틸(β-벤질)-L-페닐알라닌 메틸 에스테르로 나타나는 L-에난티오머를 얻어 99.8%의 라세믹 페닐알라닌 메틸 에스테트 반응물의 분해능을 달성할 수 있었다.
반응상에 남아있는 D-페닐알라닌 메틸 에스테르는 그로부터 회수되어 D,L-단계로 다시 라세미화되어 원료저장고로 재순환될 수 있다. 이는 전술한 '311 방법과 같이 라세믹 아미노산 반응물을 사용하는 많은 방법에 공통적인 장점이다.
본 발명의 경제적인 장점은, 적어도 부분적으로는, 본 발명이 더 비싼 미리-분할된 L-에난티오머 대신 라세메이드 원료 반응물을 사용한다는데 기인한다. 이 장점은 (a) 축합효소의 에난티오머 선택성: 및 (b)비하전 종류를 선호하는 막의 고 선택성에 기인하는 D,L-페닐알라닌 메틸에스테르의
Figure kpo00031
광학적 분합에 의해 가능한 것이다.
라세믹 페닐알라닌을 저 경비로 합성하는 바람직한 방법은 사가미 화학연구소 [도꾜, 일본에 의해 개발된 방법으로 그레이스 방법, 또는 염화 벤질의 페닐 피루빅 산으로의 효소적 카르보닐화라고 불리는 방법으로 5-벤잘히단토인을 경유하여 벤즈알데히드를 이용하는 것에 기초하는 방법들이다.[때때로 도요 소다 제조회사 Ltd.(야마구치, 일본)의 도요 소다 방법이라고도 불림]
본 기술에 숙련된 자들이라면 이 방법의 실시가 아스파탐 또는 그의 유사물질 및 유도체와 같은 펩티드감미료의 합성에만 국한되지 않는다는 것을 인식할 것이다. 본 발명은 또한 적절한 비율로 선택투과성 막을 통해 확산할 능력이 있는 디-, 트리-, 테트라- 및 펜타 펩티드, 또는 더 복잡한 펩티드 등의 기타 유용한펩티드의 합성에도 사용될 수 있다. 예를들어 써모리신의 결합 특이성을 고려해보고 생성물내에 써모리신에민감한 결합이 오직 한군데 있다고 가정하면 (하기 구조식에서 화살표 된곳), 하기 반응식에 따라 Met-엔케괄린
Figure kpo00032
을 합성 할 수 있다.
Figure kpo00033
Figure kpo00034
α-키모트립신과 파파인을 사용하는 Met-엔케팔린의 단계적인 전효소적 합성방법의 실행성이 참고문헌에 기재되어 있다.[참고 : W.클만,
Figure kpo00035
255권 8234면(1980)]
본 발명의 또 하나의 잠재적으로 유용한 적용예는 하기의 반응식에 의한 그라미시딘 S(2)의 효소적 합성이다.
Figure kpo00036
본 발명이 사용될 수 있고 참고문헌에 기재된 유용한 펩티드생성물의 효소적 합성의 기타 다양한 실시예로 안지오텐신, 물질 P, 엘레도이신, 세를레인 및 Leu-엔케팔린의 합성을 들 수 있다.
본 기술에 숙련된 자들은 본 발명이 펩티드 이외의 다른 반응계에도 적용될 수 있음을 인식할 것이다.
예를 들면 프로키랄 디카르복실산 디에스테르를 키랄 모노에스테르로 비대칭 분할 하는데 돼지 간 에스터라제 [EC 3.1.1.1]와 같은 에스테르 가수분해 효소를 사용하는 것은 잘 알려져 있는 예이다.
[C.J.Sih의 공동 발명자
Figure kpo00037
471권 239면(1986)]동일한 효소가 반응상에서의 비 반응성 에난티오머산의 보유와 막을 통한 키랄 에스테르의 선택적 이동을 통해 라세믹 카로복실산을 분해하는데 본 발명에 기재된 형태로 이용될 수 있다.
[실시예 1]
본 발명에 따라 아스파탐 유도체가 다음과 같이 제조되었다. pH 5.5 조정된 물 100mL에 N-포르밀-L-아스파르틸-β-벤질 에스테르 5.02g(20m몰), L-페닐알라닌 메틸에스테르 4.31g(20m몰)을 포함하는 용액에 전체 단백질 분해 단위가 8×105으로 나타나는 써모리신 효소(다이와 화학사 오사카, 일본) 500mg을 첨가했다.
불용성 디 펩티드 N-포르밀-β-벤질-L-아스파르틸-L-페닐알라닌 메틸 에스테르의 존재가 확실해졌을 때 결과되는 청청반응 혼합물을 40℃에서 15시간동안 정치시켰다. 그다음, 결과되는 혼합물을 막면적 1ft2인 벤드리서치 Inc.의 "타잎 1공동 섬유 선택성 투석막"의 실험용 공동-섬유 분리기의 반응부위, 이 경우 튜브(tube)부위에 연결된 200mL용기로 옮겼다. 막의 생성물부위 (분리기의 외피(shell)부위)는 pH 7.5에서
Figure kpo00038
(시그마 A2156)로부터 얻은 아실라제효소 그(EC 3,5,1,14) 500mg을 포함하는 수성(생성물) 혼합물(전체부피=200mL)공급원에 연결시켰다. 대개 아미노 아실라제로 지칭되는 이 효소는 N-아세틸- 및 N-포르밀-β-벤질 아스파탐 모두에서 C-말단 에스티라제로 작용한다는 것이 밝혀졌다.
반응혼합물과 생성혼합물은 연동 펌프의 보조를 받아 실온에서 600mL/min의 속도로 공동 섬유 분리기를 서로 역방향으로 순환시켰다. 이 기구의 형태는 제 2 도에 도시된 것과 유사하다. 두반응 모두(축합반응과 에스테르 가수분해 반응) 재결정, 고체화등에 의해 형성되는 것이기 때문에 두 반응혼합물 및 생성혼합물의 pH는 공정이 진행됨에 따라 하강되어졌다. 반응 혼합물 및 생성혼합물에서의 pH는 pH 스텟을 사용하여 일정하게 유지시켰다.
N-포르밀-β-벤질-L-아스파르틸-L-페닐알라닌의 생성은 HPLC로 모니 터 되었다. 아미노산, 완전히 보호된 생성물 디펩티드 및 디펩티드의 검색을 위해 254nm로 맞춰진 LDC 스펙트로모니터 II와 함께 Tracor 모델 995 기기로 크로마토그래피 분석을 행하였다. 컬럼으로는 밀리포어 워터즈 RCM-100방사형압측 모듈내에 저장해 둔 NOVA-PAC C18레디얼 팩 카트리지를 사용하였다.
완전히 보호된 디펩티드의 검색에 사용된 이동상은 V/V 45% 메탄올(HPLC 눈금) 5% 테트라히드로퓨란(HPLC 눈금) 및 1% KH2PO4완충용액 50%로 된 V/V 혼합물이었다. 생성물 디펩티드의 검색을 위해 40% 메탄올 및 1% KH2PO4완충용액(테일링을 최소화하기 위해 용매 IL당 트리에틸아민 1mL를 첨가하고 80% 인산을 이용하여 pH를 4.3으로 하향조정하였음) 60%의 V/V 혼합물을 이동상으로 사용하였다. 유속은 1mL/min으로 유지시켰다.
N-포르밀-β-벤질-L-아스파르틸-L-페닐알라닌의 생성에 관련된 HPLC데이타는 하기 표 2에 요약하였으며 생성물 용액내에 축적된 생성물의 전체량(g)을 시간에 대한 함수로서 표시하였다.
pH 5.5의 물속에서 그의 포화점에 해당하는 평형상태에서의 비하전 디펩티드의 농도치는 25℃에서 0.05％가량인 겻으로 발견되었다.
시간당 1ft2의 막면적을 이동한 비하전 디펩티드의 양은 대략 200mg으로 밝혀졌으며 이는 평형상태를 유지하는데는 불용성 디펩티드가 분해되어야하고/또는
Figure kpo00039
법으로 디펩티드가 합성되어야 함을 가리키는 것이다. 반응 혼합물에서 불용성 비하전상 디펩티드가 거의 완전히 분해 된 것은 반응이 종결된 때인, 5시간 정도가 지난뒤였다. 표 2의 데이타를 제 3 도에 도시하였다. 이 선형 함수관계는 막을 통한 펩티드의 이동이 안전상태로 진행됨을 가리킨다. 생성물 디펩티드의 관찰된 생성속도가 약 200mg/ft2/hr(표 2)인 것은 0.05% 물속에서 측정된 막을 통한 비전하성 디펩티드의 유량(190mg/ft2/hr)과 유사하다는 것이 확인되었는데 이는 이론적인 기초에서 예상된 바와 같다.
이러한 점에서 볼때, 계를 비하전 디펩티드로 포화시키기 위해 2가지 아미노산 반응물을 반응혼합물에 각각 약 120mg/hr 씩 연속적으로 첨가한다면 전술한 계가 안정상태를 유지할 것으로 기대된다.
막의 선택성을 완전히 실현시키기 위해서는 2가지 효소의 접촉에 우선하여 제 1막과 제 1막의 개재(介在)가 필요한데 이는 반응 용액에서의 아미노산 농도가 높은데 기인하여 단일막의 선택성이 더 낮기 때문이다.
생성물 용액(200mL)은 회수되고 pH 2.5로 조정회수된 다음 4℃에서 하룻밤냉각시켰다. 수집된 침전물을 회수하고 MeOH:H2O로 재결정시켜
Figure kpo00040
에스터라제로 회분식 가수분해에 의해 얻은 맏을 수 있는 샘플 N-포르밀-β-벤질 -아스파탐
Figure kpo00041
= -5.3°C=(1.3:EtOH)]과 동일한 N-포르밀-β-벤질-아스파르틸-L-페닐 알라닌
Figure kpo00042
= -5.6°(C=1.2 : EtOH)]307mg을 얻었다.
[표 2]
Figure kpo00043
[실시예 2]
L-에난티오머 대신 8.63g의 D,L-페닐알라닌 메틸 에스테르를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 유사한 실험이 수행되었다. 그 결과는 표 3에 요약되어 있다. 생성물 용액 200mL로 부터 비하전 펩티드를 분리하여 310mg의 생성물
Figure kpo00044
= -6.4°(C=1.4:EtOH)]을 얻었는데, 이는 모든면에 있어서 (IR,13C-NMR)믿을 수 있는 샘플 N-포르밀-β-벤질-L-아스파르틸-L-페닐 알라닌과 동일한 것이었다.
[표 3]
Figure kpo00045
표 3에 요약된 데이타를 도시한 것(제 3 도)으로부터 반응기가 D,L-페닐알라닌 메틸 에스테르로 조작되는 경우 안정상태로 반응이 진행됨을 다시 한번 알 수 있다. 써모리신의 입체 특이성은 실시예 l에 기술된 것과 같은 L,L-디펩티드의 독점적 생성에 의해 입증된다. 튜브상(반응 혼합물)내에 보유된 D-페닐알라닌은 펩티드 생성의 전체적인 운동성을 저해하지 않았다.
[실시예 3]
실시예 1에 따라 준비된 N-포르밀-β-벤질-L-아스파르틸-L-페닐알라닌 1.0g, 물 4.0mL, 데트라히드로퓨란 4.0mL 및 진한 염산(12N) 1.0mL로 된 혼합물을 9시간 동안 환류시키면서 가열하였다. 그 다음 혼합물을 냉각하고 50% NaOH 용액으로 pH를 4.0으로 조정하였다. 그리고나서 테트라히드로푸란을 35°이하 및 20mmHg로 증류에 의해 제거하였다. 5℃에서 1시간 보존함으로써 결정화를 완결짓고나서 샘플을 여과한 다음 빙수 1mL로 세척하고 진공하에서 건조시켜 백색고체 367mg을 얻었다. 이 물질은 HPLC와 IR로 대조해 본 결과 믿을 수 있는 샘플 아스파르틸 페닐알라닌과 동일한 것으로 나타났다.
Figure kpo00046
+12°(C=0.5:0.1NHCl in 50％ MeOH)]
아스파르틸 페닐알라닌은 G.L 베취맨 및 B.D. 바인야드의 미국 특허 제 4,173,562호 실시예 #1에 기재된 것처럼 메탄올 및 염산으로 처리하여 아스파탐으로 전환되어 왔다.
[실시예 4]
반응물로서 N-카르보벤족시-L-아스파라긴산 β-메틸에스테르 5.65g(20.1 m몰) 및 L-페닐알라닌 메틸에스테르 4.38g(20.3m몰)을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1과 유사한 실험이 수행되었다. 아미노산을 물 100mL에 용해시키고 이 용액의 pH를 5.5로 조정한 다음 써모리신 다이와 (8×105단백질 분해단위)500mg을 첨가했다. 이 용액은 상당량의 N-CBZ-(β-메틸 에스테르)-L-asp-L-페닐알라닌 메틸 에스테르가 침전되었을 때 40℃에서 15시간동안 미리 정치시켰다. 현탁액은 1ft2의 막 표면을 포함하는 "타잎 1공동섬유 선택성 투석막(벤드 리서치 Inc.)의 튜브 부위에 접촉시키고 pH 7.5에서 아실라제 I 500mg을 함유하는 물 200mL의 외피상에 반하여 실온에서 5시간 동안 기계를 작동시켰다. 외피상에서의 펩티드생성물의 축적을 HPLC로 모니터하고 그 결과는 표 4 및 제 4 도에 나타내었다.
5시간동안 계속된 반응을 정지시키고 외피상(200mL)을 회수하여 pH 2.5로 조정하고 4℃에서 하룻밤 저장하였다. 석출된 생성물은 수집하고 CH3OH : H2O로부터 재결정시켜 화학적 커플링 및 아실라제 I으로 부분적 에스테롤리시스시켜 제조된 믿을 수 있는 샘플 N-CBZ-이소-APM
Figure kpo00047
= +5.5°(C=1.1EtOH)]과 동일한 N-CBZ-(β-메틸에스테르)-L-asp-L-페닐알라닌 (N-CBZ-이소-APM)
Figure kpo00048
=+ 6.0°(C=1.1, EtOH)]을 405mg(86%회수) 생산하였다.
[표 4]
Figure kpo00049
실시예 1의 실험에서 관찰되었듯이 제 4 또는 N-CBZ-이소 APM의 축적이 200mg/hr의 일정속도로 진행되었음을 가리킨다.
N-CBZ-이소 APM의 APM으로의 전환은 실시예 3에 기재된 조건하에서 실시될 수 있다.
[실시예 5]
본 발명에 따라 하기와 같이 아스파탐 유도체, N-포로밀-(β-메틸)-asp-phe가 제조되었다. N-포로밀-(β-메틸) -L-아스파라긴산 6.00g(35m몰)과 L-페닐알라닌 메틸 에스테르 10.00g(48m몰)이 100mL 물속에 포함된 용액을 pH 7.0으로 조정하고 전체 단백질 분해단위가 l.2×106인 써모리신 효소(다이와화학사, 오사카, 일본) 770mg을 첨가하였다. 결과적인 청정용액을 HPLC로 분석한 결과 N-포르밀-(β-메틸)-asp-phe-OMe이 433.8mg 존재한다고 나타났을때 40℃에서 1시간 동안 방치시켰다. 이 용액을 25℃로 냉각시키고 pH를 5.0으로 조정한 다음 도데칸 내에 30% V/V N,N-디에틸-도데칸 아미드로 만들어진 ILM 0.5ft2(450cm2)을 제공하는 공동 섬유분리기"타잎 2 공동 섬유선택성 투석막" 벤드 리서치Inc.)의 튜브 부위에 연결된 200mL 용기에 옮겼다. 분리기의 외피부위는 pH 7.5에서 Aspergillus sp.(아미노아실타제 아미노, 나고야, 일본)로 부터 얻어진 효소 아실라제 I(EC 3,5,1,14) 500mg을 함유하는 생성물 용기에 접촉시켰다.
두 상은 제 2 도에 도시된 형태를 사용하여 2개의 연동펌프의 보조를 받아 25℃에서 50mL/min(튜브상)및 500mL/min(외피상)의 속도로 서로 역방향으로 순환되었다. 두상에 있어서의 pH는 스텟을 사용하여 일정하게 유지시켰다.
M-포르밀-(β-메틸)-asp-phe의 생성은 254nm로 맞취진 LDC스펙트로모니터II 감지기와 함께 Tracor 995기기를 사용하여 HPLC로 모니터 하였다. 컬럼으로는 밀리포어 워터즈 RCM-100 방사형 압축모듈내에 저정해둔 NOVA-PAK C18레디얼-펙 카트리지 8mm×100mm를 사용하였다.
분석에 사용된 이동상은 다음과 같다.
(a) N-포르밀-(β-메틸)-asp-phe-OMe의 경우 : pH 4.6의 0.1% KH2P O4완충액내의 40% V/V메탄올 ; (b) N-포로밀(β-메틸)-asp-phe의 경우: pH 4. 6의 0.1% KH2PO4내의 20% V/V메탄을 유속은 두가지 분석 모두에서 1mL/min이었음.
N-포르밀-(β-메틸)-asp-phe(생성물 디펩티드)의 생성에 관련되는 데이타는 하기의 표 V에 나타내었고 외피상 200mL내에서의 전체 축적량(mg)을 시간에 대한 함수로서 표현하였다.
[표 5]
Figure kpo00050
표 V의 데이타를 제 5 도에 도시하였다. 분석 말기에서 HPLC 분석결과 튜브상에 283mg의 N-포르밀-(β-메틸)-asp-phe-OMe가 존재하는 것으로 나타났다. 이 값들로부터 반응기가 작동하는 동안에 합성된 펩티드의 양을 계산해낼 수 있었다.
Figure kpo00051
P0=튜브상에서의 최초의 펩티드=433.8mg
PT=분석말기에서의 튜브내에 잔제하는 펩티드=273mg
Ptr= (P0-PT)fPsyn
Psyn=Ptr-(P0-PT) =266.6mg 및
Figure kpo00052
53.5mg/hr,l00mL의 Vsyn은 써모리신 존재하에서 N-포르밀-(β-메틸) -L-아스파라긴산 및 L-페닐알라닌 메틸 에스테르에 대해 행해진 평형 연구에서 앞서 측정된 합성속도(500mg/hr,L)와 일치한다.
생성물 용액(200mL)을 회수하고 1N HCl로 pH 2로 조정한 후 200mL EtOAc로 2번 추출하였다. 합쳐진 추출물은 증류시키자 백색잔사가 남았으며 이를 EtOAc/헥산으로부터 재결정시켜
Figure kpo00053
에스터라제를 사용하여 합성 N-포르밀-(β-메틸)-L-asp-L-phe-OMe를 회분식 가수분해하여 제조한 믿을 수 있는 샘플
Figure kpo00054
=+0.80(C. 0.29; MeOH)]과 동일한 (IR,13C-NMR] N-포르밀-(β-메틸) -L-asp-L-Phe
Figure kpo00055
=+0.70(C. 0.29; MeOH)]100mg을 제조했다.
[실시예 6]
실시예 5에 기재된 실험을 1ft2의 액체막(도데칸중에 30% V/V N,N-디에틸-도데칸아미드)을 함유하는 타잎 2 공동섬유 투석막"(벤드 리서치 Inc.)에서 대규모화 하였다. 튜브상은 400m1의 물에 L-Phe-OMe 40g, N-포로밀-(β-메틸)-L-asp 24g 및 써모리신 다이와 3.08g(전체 단백질 분해단위 5×106)을 함유하였고 pH 7.0으로 함유하였고 pH 7.0으로 조정되었다. 40℃에서 1시간 동안 방치하자 1.068g(2.7g/L)에 달하는 N-포르밀-(β-메틸)-L-asp-L-Phe-OMe가 존재하는 것이 발견되었다. 이 용액은 25℃로 냉각시키고, INHCl로 pH 5.0으로 조정한 다음 공동섬유분리기의 튜브부위에 연결시켰다. 외피상은 2g의 아미노아실라제 I(아마노)을 함유하는 pH 7.5의 400mL의 물로 구성되었다. 이 두상은 실시예 5에 기재된 바와같이 25℃에서 5시간동안 서로 역방향으로 순환시켰다. 이 결과는 표 6 및 제 6 도에 요약되어 있다.
[표 6]
Figure kpo00056
반응말기에서 튜브상에 잔재하는 N-포르밀-(β-메틸) -asp-phe-OMe의 양은 586mg이었다.
최초의 30분동안에 최고 이동치(404mg/hr)가 관찰된 것은 미리 정치된 기간중에 펩티드가 초기 고농도로 생산되었기 때문이다. 펩티드의 이동에 의해 야기된 평형상태로부터의 이탈은 더 많은 펩티드를 합성하기 시작하게 하여 반응에 들어간 최초의 1시간 후에는 예상수준 200mg/hr에서 안정상태 조건이 이루어졌다.(제 6 도)
[실시예 7]
L-에난티오머 대신 10.00g의 D,L-페닐알라닌 메틸 에스테르를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 5와 유사한 실험이 수행되었다. 표 7 및 제 7 도에 나타난 결과는 써모리신의 에난티오머 선택성과 실시예 1 및 2의 전술한 결과로부터 예상된 바와같이 N-포르밀-(β-메틸)-L-asp-L-phe의 관측된 생성속도가 L-phe-OMe(실시예 5, 표 5)의 생성속도의 절반임을 명확히 보여준다.
Figure kpo00057
[실시예 8]
본 발명에 따라 D,L-페닐알라닌 메틸 에스테르의 막-보조 효소적 분해법이 하기와 같이 이용되었다. pH 7.5의 100mL의 물에 D,L-페닐알라닌 메틸 에스테르 1.0g(5.6m몰)이 함유된 용액에 아미노아실라제 I(아미노 제약회사, 나고야, 일본) 500mg을 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 30분간 반응시키자 반응말기에 266mg의 L-phe(1.6m몰) 및 712mg의 D,L-phe-OMe(4m몰)이 존재하는 것이 HPLC분석으로 관찰되었다. 이 용액은 도데칸 액체막 내에 30%V/V N,N-디에틸-도데칸 아미드 0.5ft2을 포함하는 ILM분리기("타잎 2 공동섬유 선택성투석막"벤드 리서치 Inc.)로 지지되는 공동섬유 셀가드의 튜브(반응)부위로 주입되었다. 막의 생성물 부위(분리기의 외피부위)는 묽은 염산을 사용하여 pH 2.0으로 조정된 물 200mL로 충전시켰다. 두 상을 연동펌프(제 2 도)의 보조를 받아 200mL/min의 속도로 분리기를 통해 서로 역방향으로 순환시켰다. 튜브상에 시간당 D,L-phe-OMe 1g의 비율로 D,L-phe-OMe를 연속적으로 첨가하면서 분리를 진행하였다. pH 7.5의 물에 전체량 30mg의 D,L-phe-OMe 7%용액(2.lg:11.7m몰)을 2시간동안 첨가하였다. 양쪽상의 pH는 pH스탯을 사용하여 일정하게 유지시켰다.
매 30분마다 양쪽 상으로부티 취한 샘플을 분해한 후 HPLC처리를 하였다. HPLC기기의 사용법 및 공정은 실시예 5에 기재된 바와같다. 이 경우 사용된 이동상은 pH 4.6의 0.1% KH2PO4완충액내의 20% V/V메탄올이었고 유속은 1mL/min이였다. 표 7 및 제 8 도에 도시된 결과는 튜브상에는 L-phe이, 외피상에는 D-phe-OMe가 축적되었음을 보여준다. 실험말기 무렵에서는 두상을 모두 회수하여 하기와 같이 처리하였다.
(a) 튜브상: 내용물(130mL)을 1N NaOH를 사용하여 pH 8.5로 조정한 다음 2×50mL EtOAc로 추출하였다. 그 다음 수성층을 1N HCl로 pH 4.0으로 조정하고 이 용액을 2.5×20cm 다우엑스(Dowex) 50이(NH4)컬럼에 통과시켰다. 200mL물로 세척한 후, 생성물을 10% NH4OH 200mL로 용출시켰다. 용출물을 진공하에서 50mL로 농축시키고 용액을 동결건조시켰다. 생산량: 249mg, 백색고체 L-페닐알라닌,
Figure kpo00058
Figure kpo00059
=-29.2°(C, 2: H2O), lit (Aldrich)
Figure kpo00060
=-35.0(C, 2: H2O)광학순도 92％
(b) 외피상: 묽은 NaOH를 사용하여 내용물(200mL)을 pH 8.5로 조정하고 2×50mL EtOAc로 추출하였다. 유기추출물은 무수 Na2SO4로 건조시키고 건조상태로 증발시킨후 1NHCl을 사용하여 pH 3.0으로 산성화시킨 50mL물에 용해시키고 동결건조시켜 989mg(4.6m몰)의 D-phe-OMe·HCl, 백색고체를 생산하였다.
Figure kpo00061
=-21.0°(C, 2: EtOH) lit, (Aldrich)
Figure kpo00062
=-32.4o(C, 2: EtOH)광학순도 83% 이 막에서의 phe-OMe(물 pH 8,25℃)의 투과능 값이 32mg/cm2·min임에 근거하였을때, 막면적 450cm2(0.5ft2)에 대한 예상되는 유량은 880mg/hr이었다. 표 8은 첫번째 시간의 말기에서 외피상을 이동해간 Phe-OMe의 양이 860mg이었음을 보여주는데 이는 이동이 막-제한 조건하에서 수행되었음을 나타내는 것이다.
[표 8]
Figure kpo00063
서브티리신 A(세린-타일 알칼린 프로테아제)에 의해 촉매된 메틸 에스테르 용기의 선택적인 에난티오머 가수분해를 통한 D,L-Phe-OMe의 회분식 분해법이 최근 공개되어 왔다. [슈이-테인 첸, 킁-충왕 및 치-훼이 윙.
Figure kpo00064
1986.1514]라세믹 카르복식산 화학물의 막의 분해를 위해서는 가수분해효소가 요구된다. 아미노아실라제 I, α-키모트립신 및 서브티티신 A와 같이 에스터라제인 가수분해효소는 D,L-페닐알라닌 메틸에스테르와 같은 D,L-아미노산 화합물을 분해하는데 사용될 수 있다. 아미노아실라제 I은 강한 단백질 분해 활성을 갖는 서브티리신 A 및 α-키모트립신과 같은 기타 에스테로 분해 효소보다 펩티드의 탈 메틸화 공정에서 일반적으로 더 선호되고 있다.
만일 상술한 D,L-페닐알라닌 메틸에스테르의 분할법이 본 발명에 기재된 펩티드 생산에 이용된다면 생산된 L-펩티드 생산에 이용된다면 생산된 L-페닐알라닌은 공지의 표준적인 메틸화 수단에 의해 메탈화될 것이다.
이 실시예는 기타의 라세믹 카르복실산의 분해에도 적응시킬 수 있다. 예를들면, 가수분해 효소를 포함하는 수성반응 혼합물 내의 카르복실산은 가수분해되어 수성반응 혼합물내에 하전 에난티오머 화합물 및 비하전 에난티오머 에스테르화합물을 생성시킬 수 있다. 그 다음 비하전 에난티오머 에스테르화합물은 수성반응혼합물로부터 타잎 1 또는 타잎 2 공동섬유 선택성 투석막(벤드 리서치 Inc.)을 포함하는 본 발명의 혐이온성 막을 통과하여 이동한다. 실시예 8과 같은 타잎의 실시예에서는 라세믹 카르복실산 에스테르화합물은 D,L-아미노산 에스테르화합물이고, 하전 에난티오머 화합물은 L-아미노산 화합물이며 비하전 에난티오머 에스테르화합물은 D-아미노산 에스테르화합물이다. 본 발명의 기술에 숙련된 자들이라면 효소의 선택 및 반응조건을 잘 이해하고 알 수 있을 것이다.
회분식 또는 연속식 공정수단이 본 실시예에 의해 제시되는데 이로부터 목적하는 반응물의 에난티오머가 제조될 수 있고 반응 혼합물에 첨가될 수 있다.
[실시예 9]
본 발명에 따라 N-포로밀-(β-메틸)-L-asp-L-phe의 합성이 하기와 같이 투과가능한 생성물을 제거하기 위해 고정된 아미노아실라제 I 및 이온교환수지를 사용하여 수행되었다. 10.0g(48m몰) L-페닐알라닌 메틸에스테르 및 6.0g(35m몰)의 N-포르밀-(β-메틸)-L-아스파라긴산이 용해된 pH 7.0의 이온 제거된 물 100L에 전체 단백질 분해단위가 1.2×106인 써모리신(다이와 화학사, 오사카, 일본) 770mg을 첨가하였다. HPLC 분석결과 N-포로밀-(β-메틸) -asp-phe-OMe가 383mg 존재한다고 나타났을때 이 결과되는 용액을 40℃에서 1시간 동안 방치시켰다. 이 용액을 25℃까지 냉각한 다음 pH를 5.0으로 조정하고 도데칸내에 30% N,N-디메틸-도데칸 아미드로 만들어진 소수성 액체막 900cm2(l ft2)을 포함하는 공동섬유 분리기(44)("타잎 2공동섬유 선택성 투석막" 밴드 리서치, Inc.)의 튜브 부위(46)에 연결된 200mL용기(40)에 이 용액올 옮겼다. 분리기(48)의 외피부위는 제 9 도에 도시된 일련의 연결용기로 만들어진 폐쇄회로로 배열되어졌다. 분리기(44)로 되돌아오는 용액은 디펩티드 N-프로필-(β-메틸) -asp-phe-OMe와 공침투하는 L-phe-OMe에 수소를 첨가하기위해 pH 4.0으로 조절하였다. 다우엑스 50(Na+)(50)의 컬럼을 통과하는 순환으로, 양 전하를 띄는 L-phe-0Me는 제거되고 비하전 디펩티드는 용액내에 남았다. 유출물을 pH 7.0으로 조절하고 DEAE-세파덱스(52)[T.도사.T.모리 및 I.치바따,
Figure kpo00065
33권 1053면(1969)]상에 고정된 아미노아실라제 I의 작용을 받게 하였다. 결과되는 디 펩티드 N-포르밀-(β-메틸)-asp-phe은 이 pH에서는 음전하를 띄고 결국 다우엑스 1(C1-) 수지(54)에 의해 포획된다. 유출물은 pH 4.0으로 조정되기에 앞서 막 분리기로 되들아옴으로써 루프가 닫히게 된다.
튜브(46)(100mL) 및 외피(48)(500mL)상들은 25℃에서 50mL/min(튜브상) 및 120mL/min(외피상)의 속도를 막 분리기를 서로 역방향으로 순환시켰다.
외피상으로부터 주기적인 샘플 채취는 제 2효소(E2)(제 9 도 샘플채취포트(56) 다우엑스1(C1-)컬럼(54)로 들어가기전)로부터의 유출물 상에서 행해졌으며 샘플은 실시예 5에 기재된 방법에 따라 HPLC로 모니터되었다. 예상했던 대로 회로의 이 위치(제 9 도)에서는 E2에 의한 L-phe-OMe의 효소적 가수분해로 생길수 있는 L-phe은 감지되지 않았고, 오직 N-포르밀-(β-메틸)-asp-phe이 안정상태 수준으로 순환(평균농도: 54mg/L)하는 것만이 관측되었는데 이는 막을 통한 디펩티드 N-포르밀-(β-메틸)-APM의 연속적인 이동 및 E2에 의한 후속적인 가수분해를 반영하는 것이다. 다우엑스-1 수지에 의한 전하성 디펩티드의 효율적인 수집이 순환을 통틀어 점 A상에서 관측된 그의 저농도에 의해 나타내진다. 상술한 결과로부터의 예상될수 있듯이 유사한 병행실험이 외피상에서 다우엑스-1 펩티드의 부재하에 수행되었다. 이번에도 순환 외피상에서는 L-phe이 발전되지 않았다. 두 실험을 비교한 것을 제 10 도 및 표 9에 나타내었다.
[표 9]
Figure kpo00066
본 실시예에 기재된 대로 이온교환 수지를 이용하여 혐이온성 막을 통해 생성 혼합물로 공침투하는 페닐알라닌 저급알킬에스테르를 분리하는 것에 덧붙여 혐이온성 막을 통해 생성 혼합물로 공침투하는 아스파라긴산도 이러한 수지를 이용하여 분리할 수 있다. 막을 통해 역확산할 수 없는 종류 또는 생성물도 이러한 이온교환 수지를 이용하여 생성혼합물로부터 제거할 수 있다. 또한 이온 교환수지분리에 상당하는 막분리, 전기영동 및 전기투석을 포함하는 (그러나 이들로 한정하지 않음) 공지의 기술도 본 발명에 이용될 수 있다.
축합효소를 고정함으로씨 효소적 반응의 목적하는 평형을 포함하여 반응물, 생성물 및 효소등을 고려하여 효소적 반응의 최적 효율에 바람직한 초기반응 혼합물의 pH로 튜브상에서 효소적 반응이 수행될 수 있다. 제 2 반응 혼합물의 pH가 비하전 생성물을 튜브상으로부터 막을 통해 외피상으로 이동시키는 막 효율을 최대화 시키기 위해 튜브상에서 초기반응 혼합물의 pH가 막에 접촉되기에 앞서 선택적으로 반응혼합물의 pH로 재조정될 수 있다.
제 9 또는 튜브상에 있어서의 초기 반응혼합물의 pH를 제 2 반응혼합물의 pH로 조정하는 것을 보여주지 않는다.
이와 유사하게 외피상의 에스터라제는 고정될 수 있으며 외피상내의 생성혼합물의 pH로 가장 효율적인 반응을 진행시키기 위해서는 필요하다면 조정되고 재조정될 수 있다. 실시예 8 및 상기 실시예는 본 발명을 이용하는 효율적인 연속식 또는 회분식 공정을 위한 부가적인 수단을 제공한다. 연속식 공정에서는 목적하는 화합물의 에난티오머 및 이러한 공침투성 화합물 튜브상 또는 반응혼합물로 복귀시킬 수 있다.
[산업적 용융성]
본 발명은 약리적으로 활성인 펩티드를 포함한 기타 펩티드 뿐 아니라 아스파탐을 생산하는데 활용될 수있다.
본 발명의 원리를 적용시키는 방법을 자세히 설명하기 위해 본 발명의 특정예를 나타내고 기재하였으나 본 발명이 이러한 원리로부터 벗어남이 없이 다른 방법으로 구체화 할 수 있음을 이해하여야만 할 것이다.

Claims (54)

  1. α-카르복실레이트기를 갖는 N-아실-β-치환-L-아스파라긴산을 축합효소를 함유하는 수성 반응혼합물내에서 α-암모늄기를 갖는 페닐알라닌 저급알킬에스테르와 축합반응시켜 비하전 펩티드인 N-아실-L-아스파르틸-(β-치환)-L-페닐알라닌 저급알킬에스테르를 생성시키고 이 비하전 펩티드를 혐이온성 막을 통해 수성반응 혼합물로부터 생성물의 혼합물로 이동시키는 단계로 이루어짐을 특징으로 하는 펩티드의 효소적 합성방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 축합효소가 pH 약 4.0∼9.0에서 활성인 펩티드 생성프로테아제인 것이 특징인 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 생성물의 혼합물내에서 비하전 펩티드를 막을 통해 역확산 할 수 없는 종류로 전환시키는 단계를 추가시킴을 특징으로하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 비하전 펩티드를 에스터라제 효소로 분해함에 따라 하전 펩티드로 전환시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 에스터라제 효소가 pH 약 6.0∼9.0에서 활성인 것이 특징인 방법.
  6. 제 4 항에 있어서, 에스터라제 효소가 아미노아실라제 I,α-키모트립신 및 서브티리신 A 중에서 선택되는 것이 특징인 방법.
  7. 제 4 항에 있어서, 에스터라제 효소가 아미노아실라제 I이고 반응혼합물의 pH가 약 7.0인 것이 특징인 방법.
  8. 제 3 항에 있어서, 이 막이 미세다공성 시트중의 세공내에 모관현상에 의해 고정된 물과 비혼합성인 유기 액체를 함유하여 이 유기용매가 비하전 펩티드의 용매 역할을 하는 것이 특징인 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 미세다공성 시트가 폴리테트라플루오로에틸렌 및 폴리프로필렌 중에서 선택된 물질로 제조되며 이 용매가 n-1-데칸올, n-헥사데칸올, n-도데칸올 N-N-디에틸-도데칸아미드, 도데칸, 2-운데칸온 및 이들의 혼합물 중에서 선택된 적어도 한가지 이상의 화합물로 이루어지는 것이 특징인 방법.
  10. 제 8 항에 있어서, 미세다공성 시트는 폴리프로필렌 공동섬유로 되며 용매는 N.N-디에틸-도데칸아미드와 도데칸으로 구성되는 것이 특징인 방법.
  11. 제 8 항에 있어서, 막이 밴드형 타잎 2 공동 섬유선택성 투석막인 것이 특징인 방법.
  12. 제 3 항에 있어서, 제 1 화합물은 D,L-페닐알라닌 메틸에스테르이고 제 2 화합물은 α-카르복실레이트기를 갖는 N-아실-β-치환-L-아스파라긴산인 것이 특징인 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, N-아실기가 ψCH2OCO-,-CH=O 및 ψCH2CO- 중에서 선택되고 β-치환체는 ψCH2O-, ter Buo-, CH3O-, NH2- 중에서 선택되는 것이 특징인 방법.
  14. 제 3 항에 있어서, 축합효소가 고정화 된 것이 특징인 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 축합효소가 써모리신이며 반응 혼합물의 pH가 약 7.0인 것이 특징인 방법.
  16. 제 14 항에 있어서, 비하전 펩티드를 반응혼합물로부터 혐이온성 막을 통해 이동시키기에 앞서 반응혼합물의 pH를 5.0으로 재조정하는 단계를 추가시키는 것을 특징으로하는 방법.
  17. 제 3 항에 있어서, 혐이온성 막을 통해 생성물의 혼합물내로 공침투하는 N-아실-β-치환-L-아스파라긴산을 분리시키는 단계를 추가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 3 항에 있어서, 혐이온막을 통해 생성물의 혼합물내로 공침투하는 페닐알라닌 저급알킬에스테르를 분리시키는 단계를 추가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 축합효소를 함유하는 수성반응 혼합물내에서 α-카르복실레이트기를 갖는 N-아실-β-치환-L-아스파라긴산을 α-암노늄기를 갖는 페닐알라닌 저급알킬에스테르와 축합반응시켜 비하전 펩티드 N-아실-L-아스파르틸-(β-치환)-L-페닐알라닌 저급알킬에스테르를 생성시키고 이 비하전 펩티드를 혐이온성 막을 통해 수성반응 혼합물로부터 생성물의 혼합물로 이동시키고 생성물의 혼합물내의 비하전 펩티드를 막을 통해 역확산할 수 없는 펩티드로 전환시키며, 막을 통해 역확산할 수 없는 이 펩티드를 생성물의 혼합물로부터 제거시키는 단계로 구성됨을 특징으로 하는 펩티드의 효소적 합성방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 혐이온성 막을 통해 생성물의 혼합물내로 공침투하는 N-아실-β-치환-L-아스파라긴산을 분리시키는 단계를 추가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서, 혐이온막을 통해 생성혼합물로 공침투하는 페닐 알라닌 저급알킬에스테르를 분리시키는 단계를 추가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 초기수성반응 혼합물내에서 제 1 및 제 2 아미노산을 효소적으로 축합시켜 비하전 화합물을 생성시키고, 이 비하전 화합물을 상당량의 아미노산 화합물을 이동시키지 않는 막을 통해 제 2 수성반응 혼합물로 이동시키고, 이 이동된 비하전 화합물을 막을 통해 초기반응 혼합물로 재 이동시킬 수 없는 형태로 전환시키며, 막을 통해 초기반응 혼합물로 재이동 시킬 수 없는 화합물 형태를 제거시키는 단계로 이루어짐을 특징으로하는 펩티드의 효소적 합성방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 막을 통해 비하전 화합물과 함께 제 2 수성반응 혼합물로 공침투하는 제 1 아미노산을 제 2 수성반응 혼합물로부터 제거시키는 단계를 추가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 22 항에 있어서, 막을 통해 비하전 화합물과 함께 제 2 수성반응 혼합물로 공침투하는 제 2 아미노산을 제 2 수성반응 혼합물로부터 제거시키는 단계를 추가시키는 것을 특징으로하는 방법.
  25. 제 23 항에 있어서, 비하전 화합물과 함께 막을 공침투시키는 제 1 아미노산 화합물을 초기수성반응 화합물로 복귀시키는 단계를 추가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 23 항에 있어서, 비하전 화합물과 함께 막을 공침투시키는 제 2 아미노산 화합물을 초기수성반응 화합물로 복귀시키는 단계를 추가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 가수분해 효소를 함유하는 수성반응 혼합물내에서 라세미 카르복실산 에스테르화합물을 가수분해시켜 수성반응 혼합물내에 하전 에난티오머 화합물 및 하전 에난티오머 에스테르화합물을 생성시키고, 이 하전에 난티오머 에스테르화합물을 혐이온성막을 통해 수성반응 혼합물로부터 생성물의 혼합물로 이동시키는 것을 특징으로 하는 라세미 카르복실산의 효소적 분해방법.
  28. 제 27 항에 있어서, 라세미 카르복실산 에스테르화합물이 D,L-아미노산 에스테르화합물이고, 하전 에난티오머 화합물은 L-아미노산 화합물이며, 비하전 에난티오머 화합물은 D-아미노산 에스테르화합물인 것이 특징인 방법.
  29. 제 28 항에 있어서, 생성혼합물 내의 비하전 D-아미노산 에스테르화합물을 막을 통해 역확산할 수 없는 화합물로 전환시키는 단계를 추가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 29 항에 있어서, 전환단계가 생성물의 혼합물의 pH를 약 2.0로 조종하는 단계인 것이 특징인 방법.
  31. 제 29 항에 있어서, 가수분해 효소가 아미노아실라제 I,α-키모트립신 및 서브티리신 A중에서 선택되는 것이 특징인 방법.
  32. 제 29 항에 있어서, 가수분해효소가 고정화된 것이 특징인 방법.
  33. 제 29 항에 있어서, 막이 미세다공성 시트중의 세공내에 모관현상에 의해 고정화된 물과 비혼합성인 유기액체를 포함하며, 상기 유기액체가 비하전 펩티드에 대한 용매로 작용하는 것이 특징인 방법.
  34. 제 33 항에 있어서, 미세다공성 시트가 폴리테트라 폴루오로에틸렌 및 폴리프로필렌 중에서 선택된 물질로 만들어지며 용매는 n-1-데칸올, n-헥사데칸올, n-도데칸올, N,N-디에틸-도데칸아미드, 도데칸, 2-운데칸온 및 그의 혼합물 중에서 선택된 화합물중 적어도 1가지 이상을 포함하는 것이 특징인 방법.
  35. 제 33 항에 있어서, 미세다공성 시트는 폴리프로필렌 공동 섬유로 되며 용매는 N,N-디에틸-도데칸아미드 및 도데칸으로 구성되는 것이 특징인 방법.
  36. 제 33 항에 있어서, 막이 밴드형 타입 2 공동 섬유 선택성 투석막인 것이 특징인 방법.
  37. 제 29 항에 있어서, D,L-아미노산 에스테르화합물이 α-암모늄기를 갖는 D,L-페닐알라닌 저급알킬에스테르인 것이 특징인 방법.
  38. 제 37 항에 있어서, D,L-페닐알라닌 저급알킬에스테르가 D,L-페닐 알라닌 메틸에스테르인 것이 특징인 방법.
  39. 제 29 항에 있어서, 초기 수성반응 혼합물내에서 하전 L-아미노산 화합물을 2차 아미노산 화합물과 축합시켜 비하전 화합물을 생성시키고, 이 비하전 화합물을 상당량의 아미노산 화합물은 통과시키지 않는 막을 통해 제 2 수성반응 혼합물 내로 이동시키며, 이동된 비하전 화합물을 막을 통해 초기반응 혼합물로 재이동시킬 수 없는 형태로 전환시키는 단계들을 추가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 39 항에 있어서, 막을 통해 제 2 수성반응 혼합물내로 공침투하는 아미노산 화합물을 분리시키는 단계를 추가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제 1 항에 있어서, 생성 혼합물내의 비하전 펩티드를 막을 통해 역확산할 수 없는 펩티드로 전환시키는 단계를 추가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 41 항에 있어서, 비하전 펩티드가 에스테라제 효소에 의해 분해되어 하전 펩티드로 전환시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 41 항에 있어서, 축합효소가 pH 4.0~8.0에서 활성인 펩티드 생성 산성 또는 중성 프로테아제인 것이 특징인 방법.
  44. 제 41 항에 있어서, 축합효소가 세린프로티나제, 싸이올 프로티나제, 카르복실프로티나제 및 메탈로프로티나제 중에서 선택된 프로티나제인 것이 특징인 방법.
  45. 제 41 항에 있어서, 축합효소가 키모트립신, 트립신, 서브티리신 BNP', Achromobacter 프로테아제, 파파인, 펩신, 써모리신 및 프로리신 중에서 선택되며 반응혼합물의 ph가 4.0~8.0인 것이 특징인 방법.
  46. 제 41 항에 있어서, 축합효소가 써모리신이며 반응 혼합물의 pH가 약 5.5인 것이 특징인 방법.
  47. 제 45 항에 있어서, 막이 미세다공성 시트중의 세공내에 모관현상에 의해 고정된 물과 미혼합성인 유기 액체를 함유하며 이 유기액체가 비하전 펩티드에 대한 용매로 작용하는 것이 특징인 방법.
  48. 제 47 항에 있어서, 미세다공성 시트가 폴리테트라플루오로 에틸렌 및 폴리프로필렌 중에서 선택된 물질로 만들어지며, 용매는 n-1-데칸올, n-헥사 데칸올, n-도데칸올 및 그들의 혼합물 중에서 선택된 화합물중 적어도 한가지 이상으로 구성된 것이 특징인 방법.
  49. 제 47 항에 있어서, 막이 밴드형, 타일 1공동 섬유 선택성 투석막인 것이 특징인 방법.
  50. 제 44 항에 있어서, 수용액의 pH가 약 4.0∼6.0인 것이 특징인 방법.
  51. 제 45 항에 있어서, 수용액의 pH가 약 4.0∼6.0인 것이 특징인 방법.
  52. 제 46 항에 있어서, 제 1 화합물은 D,L-폐닐알라닌 메틸에스테르이고 제 2 화합물은 그 4-카르복실레이트기를 가진 N-아실-β-치환-L-아스파라긴산이 것이 특징인 방법.
  53. 제 52 항에 있어서, N-아실기는 ψCH2OCO-, -CH=O 및 ψCH2CO- 중에서 선택되며 -치환체는 ψCH2O-, ter Buo-, CH3O-, NH2- 중에서 선택되는 것이 특징인 방법.
  54. 초기수성반응 혼합물내에서 제 1 및 제 2 아미노산 화합물을 축합시켜 비하전 화합물을 생성시키고, 비하전 화합물을 상당량의 아미노산 화합물을 이동시키지 않는 막을 통해 제 2 수성반응 혼합물로 이동시키며, 이동된 비하전 화합물을 막을 통해 초기반응혼합물로 재이동시킬 수 없는 형태로 전환시키는 단계로 이루어지는 것을 특징으로하는 방법.
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