DE3789309T2

DE3789309T2 - Enzymatische membran, verfahren zur herstellung und trennung von peptiden.

Info

Publication number: DE3789309T2
Application number: DE3789309T
Authority: DE
Inventors: Guillermo Iacobucci
Original assignee: Coca Cola Co
Current assignee: Coca Cola Co
Priority date: 1986-08-18
Filing date: 1987-08-14
Publication date: 1994-10-06
Anticipated expiration: 2007-08-15
Also published as: CN87106791A; AR242264A1; PT85548A; ATE102654T1; JPH06319592A; KR880701778A; IL98061A; CN1026498C; AU7854387A; AU610520B2; DK209388D0; GB8903271D0; KR900004070B1; ES2007103A6; IL83564A0; EG18454A; GB2218991B; MX168598B; EP0321479A1; WO1988001298A2

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf ein enzymatisches Verfahren für die Synthese und Abtrennung von Peptiden unter Verwendung einer für ungeladene Peptide durchlässigen, aber für geladene Moleküle undurchlässigen Membran und, insbesondere, auf die gleichzeitige Synthese und Reinigung von L,L-Dipeptiden und dessen Verwendung für die Darstellung von L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester (Aspartam).
Die Verwendung proteolytischer Enzyme als Kondensationskatalysatoren für die stereospezifische Verknüpfung zweier L-Aminosäuren, um L,L-Peptide zu erhalten, ist seit den frühen Tagen der Proteinchemie bekannt. Schon 1938 haben Bergmann und Fraenkel-Conrat die Bildung des in Wasser nicht löslichen Dipeptids Bz-Leu-Leu-NHPh durch Reaktion von Bz-Leu-OH und H-Leu-NHPh in Gegenwart des proteinabbauenden Enzyms Papain beschrieben M. Bergmann und H. Fraenkel-Conrat, J. Biol. Chem. 124, 1 (1938). Diese Reaktion ist nur zwischen denjenigen Aminosäuren möglich, die Peptidbindungen bilden, die der Spaltung durch Papain oder ein anderes verwendetes Enzyme zugänglich sind. Tatsächlich ist das Gleichgewicht der Kondensationsreaktion zwischen den Aminosäurereaktanten und dem Peptidprodukt weitgehend zu den reagierenden Aminosäuren verschoben Nichtsdestoweniger kann der Kondensationsreaktant durch Massenwirkung zur Vollständigkeit gebracht werden, wenn, z. B., das Dipeptidprodukt schlecht löslich ist und aus der Reaktionsphase ausfällt.
Auf Grund der kommerziellen Bedeutung einiger Peptide und der Tatsache, daß bekannt ist, daß Enzyme die Peptidbildung unter milden Bedingungen katalysieren, ist sehr viel zu der enzymatischen Synthese von Peptiden, insbesondere einfachen Dipeptiden geforscht worden. K. Oyama und K. Kihara, Kagaku Sosetsu 35, 195 (1982); K. Oyama und K. Kihara, ChemTech. 14, 100 (1984).
Das Verfahren zur enzymatischen Synthese des Peptidderivats Aspartam, beschrieben in US-A-4 165 311, hierin nachfolgend das '311-Verfahren, umfaßt die thermolysinkatalysierte Kondensation von N-Carbobenzoxy-L-asparaginsäure mit D,L- Phenylalanin-methylester und Fällung eines intermediären Komplexes, D-Phenylalanin-methylester-Salz des N-Carbobenzoxy-Aspartams, um die Reaktion auf die Peptidproduktseite zu verschieben. Die weitere Verarbeitung dieses intermediären Komplexes ermöglicht die Gewinnung von D-Phenylalanin-methylester, der nach Racemisierung in den Kreislauf zurückgeführt werden kann, und von dem N-Carbobenzoxy- Aspartamderivat, das durch Eliminierung der N-Carbobenzoxy- Schutzgruppe in Aspartam überführt werden kann. Das '311- Verfahren muß auf diskontinuierliche Weise, die umständlich ist und die Enzymrückgewinnung erschwert, durchgeführt werden. Siehe auch: K. Oyama, S. Irino, T. Harada und N. Hagi, Ann. N.Y. Acad. Sci. 434, 95 (1985). Willi Kullmann, Enzymatic Peptide Synthesis (1987).
Die N-Carbobenzoxy-Schutzgruppe spielt eine wesentliche Rolle in dem '311-Verfahren durch: Erfüllen des strukturellen Erfordernisses, das durch die aktive Stelle des Thermolysins vorgegeben ist, und durch Beitragen zur Unlöslichkeit des intermediären Komplexes, wodurch die Reaktionsausbeute steigt. Eliminierung der N-Carbobenzoxy- Schutzgruppe aus dem Aspartamderivat muß unter milden Bedingungen, z. B. katalytischer Hydrierung, ausgeführt werden, um die Spaltung der Methylesterfunktion zu verhindern. Katalytische Hydrierung schließt die Unannehmlichkeit der Handhabung von Wasserstoffgas in einem großen Maßstab ein.
Alternative Versuche, enzymatische Kondensationsreaktionen zur Vollständigkeit zu bringen, sind auch in der chemischen Literatur beschrieben worden. Zum Beispiel hat man gefunden, daß die Verwendung organischer Lösungsmittel als Reaktionsmedia wirksam ist, um die Peptidproduktausbeuten zu steigern, obwohl die gleichzeitige Abnahme der Enzymstabilität deren Verwendung in großem Maßstab ausgeschlossen hat. K. Oyama, S. Nishimura, Y. Nonaka, K. Kihara und T. Hashimoto, J. Org. Chem. 46, 5241 (1981); H. Ooshima, H. Mori und Y. Harano, Biotechnology Letters 7, 789 (1985); K. Nakanishi, T. Kamikubo und R. Matsuno, Biotechnology 3, 459 (1985). EP-A-188 342 offenbart eine enzymatische Synthese von Polypeptiden, besonders von Aspartam, bei der die Produkte von den Reaktanten durch Elektrodialyse der Reaktionsmischung abgetrennt werden.
In Hinblick auf die obengenannten Schwierigkeiten bei der Ausübung der Verfahren des Stands der Technik für die enzymatische Synthese von Peptiden, besonders die Erfordernisse für die Fällung eines intermediären Komplexes und die Handhabung gefährlicher Reagenzien, wäre es wünschenswert, ein verbessertes Verfahren bereitzustellen, das diese Schwierigkeiten vermeidet und das sicher effektive Ausbeuten ohne schnelle Desaktivierung der Enzymkatalysatoren zur Verfügung stellt.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren für die enzymatische Synthese und Reinigung von Peptiden bereit, umfassend die Schritte, eine erste Aminosäureverbindung, die eine protonierte Aminogruppe (Ammonium) umfaßt, und eine zweite Aminosäureverbindung, die eine freie Carboxylatgruppe umfaßt, zu verknüpfen unter Verwendung eines Kondensationsenzyms in einer wäßrigen Mischung unter Bildung einer ungeladenen (oder nichtionisierten) verknüpften Verbindung, ständig die ungeladene verknüpfte Verbindung aus der wäßrigen Mischung durch Diffusion durch eine Membran, die selektiv die ungeladene verknüpfte Verbindung auf die Produktseite der Membran transportiert, zu entfernen. Die transportierte verknüpfte Verbindung, die ein Peptid oder ein Derivat davon ist, wird in ein geladenes (oder ionisiertes) Molekül überführt, so daß es nicht durch die Membran zurückdiffundiert. Somit ist die Bildung des verknüpften Verbindungsprodukts in der Reaktionsmischung begünstigt, da es ständig hieraus entfernt wird.
Vorzugsweise ist das verknüpfte Verbindungsprodukt ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Met-Enkephalin, Gramicidin S, Angiotensin, Substanz P, Eledoisin, Caerulein und Leu-Enkephalin.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren für die enzymatische Synthese von Peptiden bereit, umfassend die Schritte, enzymatisch erste und zweite Aminosäureverbindungen in einer wäßrigen Ausgangsreaktionsmischung unter Bildung einer ungeladenen Verbindung zu kondensieren, die ungeladene Verbindung durch Diffusion in eine wäßrige zweite Reaktionsmischung durch eine Membran, die wesentliche Mengen der Aminosäureverbindungen nicht transportieren wird, zu transportieren und die transportierte ungeladene Verbindung in eine Form zu überführen, die nicht durch die Membran in die Ausgangsreaktionsmischung zurückgeführt werden kann. Die transportierte Verbindung, die in eine Form überführt ist, die nicht durch die Membran rücktransportiert wird, wird aus der zweiten Reaktionsmischung entfernt. Auch können erste und zweite Aminosäureverbindungen, die die Membran mit der ungeladenen Verbindung in die zweite Reaktionsmischung mitdurchdringen, aus der zweiten Reaktionsmischung abgetrennt werden und gegebenenfalls in die Ausgangsreaktionsmischung zurückgeführt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren für die enzymatische Synthese von Peptidderivaten, wie Aspartam und dessen Analoge bereit, umfassend die Schritte, eine N-Acylβ-substituiert-L-asparaginsäure, die eine α-Carboxylatgruppe umfaßt, mit einem Phenylalanin-Niederalkylester, der eine α-Ammoniumgruppe umfaßt, in einer wäßrigen Reaktionsmischung, die ein Kondensationsenzym umfaßt, unter Bildung von N-Acyl (insbesondere Formyl)-L-aspartyl-(β-substituiert)-L-phenylalanin-Niederalkylester (d. h. 1-6 Kohlenstoffatome), einem ungeladenen Peptid, zu kondensieren, und das ungeladene Peptid durch Diffusion aus der wäßrigen Reaktionsmischung durch eine permselektive Membran (eine Ionen abweisende Membran) in eine Produktmischung zu transportieren und das ungeladene Peptid in der Produktmischung in eine Spezies zu überführen, die nicht durch die Membran zurückdiffundieren kann.
Das Reaktionsprodukt kann aus der Reaktionsmischung entfernt werden, und die Reaktanten, die Ionen abweisende Membran mitdurchdringen, können von dem Reaktionsprodukt abgetrennt werden.
Das Kondensationsenzym ist vorzugsweise eine peptidbildende Protease, die in einem pH-Bereich von etwa 4,0 bis 9,0 wirksam ist. Die Überführung in die geladene Verbindung wird dann durch Spaltung der ungeladenen Verbindung mit einem Esteraseenzym durchgeführt. Das Esteraseenzym ist vorzugsweise in einem pH-Bereich von etwa 6,0 bis 9,0 wirksam und ist vorzugsweise aus Aminoacylase I, α-Chymotrypsin und Subtilisin A ausgewählt. Vorzugsweise ist das Esteraseenzym Aminoacylase I, und der pH-Wert der Reaktionsmischung ist etwa 7,0.
Das Kondensationsenzym ist vorzugsweise immobilisiert Thermolysin und ein pH-Wert von etwa 7,0 sind dann bevorzugt, ebenso wie Nacheinstellung des pH-Wertes der Reaktionsmischung auf einen pH-Wert von etwa 5,0 vor dem Transport des ungeladenen Peptids aus der Reaktionsmischung durch die Ionen abweisende Membran.
Bevorzugte Kondensationsenzyme sind auch peptidbildende saure oder neutrale Proteasen, vorzugsweise Serinproteinasen, Thiolproteinasen, Carboxylproteinasen und Metallproteinasen, insbesondere Chymotrypsin, Trypsin, Subtilisin BNP', Achromobacter-Protease, Papain, Pepsin, Thermolysin und Prolisin, die in einem pH-Bereich von etwa 4,0 bis 8,0 wirksam sind. Thermolysin und ein pH-Wert von etwa 5,5 sind besonders bevorzugt. Der bevorzugte pH-Bereich der wäßrigen Lösung ist für die obengenannten bevorzugten Proteinasen zwischen etwa 4,0 und 6,0.
Bevorzugte Ausgangsverbindungen für die Kondensation mit einer peptidbildenden Protease, die in einem pH-Bereich von etwa 4,0 bis 9,0 wirksam ist, besonders mit Thermolysin bei einem pH-Wert von etwa 5,5, sind D,L-Phenylalanin-methylester und N-Acyl-β-substituiert-L-asparaginsäure, worin die N-Acylgruppe vorzugsweise PhCH&sub2;OCO-, -CH=0 und PhCH&sub2;CO- ist, und der β-Substituent vorzugsweise PhCH&sub2;O-, t-BuO-, CH&sub3;O- oder NH&sub2;- ist.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren für die enzymatische Trennung von racemischen D,L-Aminosäureverbindungen bereit, umfassend die Schritte: eine racemische D,L-Aminosäureesterverbindung in einer wäßrigen Reaktionsmischung, die ein Hydrolyseenzym umfaßt, zu hydrolysieren, um eine geladene L-Aminosäureverbindung und eine ungeladene D-Aminosäureesterverbindung in der wäßrigen Reaktionsmischung zu bilden, und die ungeladene D-Aminosäureesterverbindung aus der wäßrigen Reaktionsmischung durch Diffusion durch eine Ionen abweisende Membran in eine Produktmischung zu transportieren, womit eine enantiomere Trennung bewirkt wird. Die ungeladene D-Aminosäureverbindung in der Produktmischung kann akkumuliert und durch herkömmliche Mittel gewonnen werden. Das Verfahren für die enzymatische Trennung von Aminosäureverbindungen kann mit den anderen oben diskutierten Verfahren kombiniert werden. Die ungeladene D-Aminosäureesterverbindung wird in der Produktmischung in eine Spezies überführt, die nicht durch die Membran zurückdiffundieren kann.
Die Überführung wird vorzugsweise durch Einstellung des pH- Wertes der Produktmischung auf einen pH-Wert von etwa 2,0 ausgeführt.
Das Hydrolyseenzym ist vorzugsweise Aminoacylase I, α- Chymotrypsin oder Subtilisin A und vorzugsweise immobilisiert.
Die D,L-Aminosäureesterverbindung ist vorzugsweise D,L- Phenylalanin-Niederalkylester, besonders D, L-Phenylalaninmethylester, mit einer α-Ammoniumgruppe.
Die enzymatische Trennung der racemischen D,L-Aminosäureesterverbindung kann mit den Schritten kombiniert werden:
die geladene L-Aminosäureverbindung mit einer zweiten Aminosäureverbindung in einer wäßrigen Ausgangsreaktionsmischung enzymatisch zu kondensieren, um eine ungeladene Verbindung zu bilden,
die ungeladene Verbindung durch Diffusion in eine wäßrige zweite Reaktionsmischung durch eine Membran zu transportieren, die wesentliche Mengen der Aminosäureverbindung nicht transportieren wird, und
die transportierte ungeladene Verbindung in eine Form zu überführen, die nicht durch die Membran in die Ausgangsreaktionsmischung zurücktransportiert werden kann.
Die Aminosäureverbindungen, die die Membran mitdurchdringen, werden vorzugsweise abgetrennt.
Es ist daher ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren für die enzymatische Synthese von Peptiden bereitzustellen, das gleichzeitige Synthese und Reinigung des Peptidprodukts bereitstellt.
Es ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren für die sichere, ökonomische und effiziente Synthese und Reinigung von Peptiden und Derivaten davon, besonders Aspartam, bereitzustellen.
Es ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein ökonomisches Verfahren für die enzymatische Synthese von Peptiden bereitzustellen, das die wirkungsvolle Enzymverwendung und die Mittel, die Synthese auf einer kontinuierlichen Basis auszuführen, bereitstellt.
Es ist noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren, das besonders an die enzymatische Synthese von Aspartam und dessen Derivaten angepaßt ist, mit D,L-Phenylalanin und N-geschützt-β-substituiert-L- aspartat in praktisch quantitativer Ausbeute bereitzustellen.
Die vorangegangenen und anderen Gegenstände und Vorteile werden durch die Erfindung erlangt, wie aus der folgenden detaillierten Beschreibung in Verbindung mit den begleitenden Zeichnungen ersichtlich sein wird, wobei:
Fig. 1 eine schematische Abbildung der enzymatischen Synthese von Aspartam gemäß der vorliegenden Erfindung ist.
Fig. 2 eine schematische Darstellung einer Vorrichtung für die Durchführung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist.
Fig. 3 eine Kurve ist, die die Produktmenge (Aspartam- Derivat), die mit der Zeit in den Beispielen 1 und 2 gebildet wird, veranschaulicht.
Fig. 4 eine Kurve ist, die die Produktmenge (Aspartam- Derivat), die mit der Zeit in Beispiel 4 gebildet wird, veranschaulicht.
Fig. 5 eine Kurve ist, die die Produktmenge (Aspartam- Derivat), die mit der Zeit in Beispiel 5 gebildet wird, veranschaulicht.
Fig. 6 eine Kurve ist, die die Produktmenge (Aspartam- Derivat), die mit der Zeit in Beispiel 6 gebildet wird, veranschaulicht.
Fig. 7 eine Kurve ist, die die Produktmenge (Aspartam- Derivat), die mit der Zeit in Beispiel 7 gebildet wird, veranschaulicht.
Fig. 8 eine Kurve ist, die die Produktmenge (Aspartam- Derivat), die mit der Zeit in Beispiel 8 gebildet wird, veranschaulicht.
Fig. 9 eine schematische Darstellung einer Vorrichtung für die Durchführung der vorliegenden Erfindung ist, die die Behälter auf der Produktseite, wie in Beispiel 9 beschrieben, veranschaulicht.
Fig. 10 eine Kurve ist, die die Produktmenge (Aspartam- Derivat), die mit der Zeit in Beispiel 9 mit und ohne der Verwendung eines Ionenaustauscherharzes gebildet wird, veranschaulicht.
Die hierin offenbarte Erfindung stellt ein Verfahren bereit, um die enzymatische Synthese von Peptiden in einer wäßrigen Reaktionsmischung zu vervollständigen durch Abtrennung des ungeladenen Peptid-Zwischenprodukts oder eines Derivates davon aus der Reaktionsmischung mittels einer Membran, die selektiv das ungeladene Peptid aus der Reaktionsmischung heraus in eine Produktmischung hinein transportiert. Da die Membran für die Reaktanten (geladene Moleküle) im wesentlichen impermeabel ist, verursacht die Entfernung des Peptid-Zwischenprodukts aus der Reaktionsmischung eine Abnahme der Peptidkonzentration beim Gleichgewicht, die die Reaktion durch Massenwirkung zur Vollständigkeit verschiebt.
Die in der Anwendung der vorliegenden Erfindung brauchbarsten Membranen sind immobilisierte Flüssigmembranen (IFM), die eine unpolare Flüssigkeit umfassen, eingebettet in ein mikroporöses Trägermaterial, bevorzugt eine polymere Folie, die im wesentlichen für die Enzyme, Reaktanten und Produkte impermeabel ist. Hydrophobe Polymere wie Polypropylen sind bevorzugte Trägermaterialien. IFM-Module können unter Verwendung von Polypropylen-Hohlfasern hergestellt werden. Celgard®, ein eingetragenes Warenzeichen der Celanese Corporation, 1211 Avenue of the Americas, New York, N.Y. 10036 und verkauft von Celanese Fibers Marketing Corporation, Charlotte, N.C., ist ein Beispiel kommerziell erhältlicher Polypropylen-Hohlfasern. Einbettende Verbindungen, die der Fachwelt bekannt sind, und Polyvinylchloridrohr oder -rohrleitung können gegebenenfalls für die Herstellung eines IFM-Moduls verwendet werden. Ein weiteres Polymer für die Herstellung des mikroporösen Trägermaterials ist TEFLON®, ein Warenzeichen von E. I. DuPont de Nemours & Co. für fluorierte Kohlenwasserstoffpolymere. Ein typischer mikroporöser Träger ist GORE-TEX®, ein Warenzeichen der W. C. Gore & Associates, Inc.
Die Mikroporen führen durch das Trägermaterial und sollten so ausgelegt sein, daß eine immobilisierte Flüssigkeit darin durch Kapillarwirkung gehalten und daraus nicht entweichen wird, wenn sie z. B. Druckunterschieden durch die Membran oder anderen üblichen Reaktionsbedingungen ausgesetzt ist. Unter Vorbehalt der vorgenannten Einschränkungen ist es vorteilhaft, die Berührungsfläche zwischen der immobilisierten Flüssigkeit und der Reaktionsmischung zu maximieren, um die Überführungsrate (Durchfluß) des ungeladenen Peptidprodukts durch die Membran zu maximieren. Man erkennt, daß die bevorzugte Porengröße in Abhängigkeit von den Eigenschaften der einzelnen immobilisierten Flüssigkeit, verwendeten Reaktanten, hergestellten Produkte und ähnlichen Faktoren variieren wird und ferner, daß die optimale Porengröße empirisch durch die Fachleute bestimmt werden kann. Eine brauchbare Diskussion der Porengrößeauswahl findet sich in US-A-4 174 374. Die Verwendung und die Herstellung immobilisierter Flüssigmembranen werden in den folgenden Literaturstellen beschrieben, S. L. Matson, J. A. Quinn, Coupling Separation and Enrichment to Chemical Conversion in a Membrane Reactor, Veröffentlichung präsentiert bei dem AICHE Annual Meeting, New Orleans, Louisiana (8-12. November, 1981) und S. L. Matson und J. A. Quinn, Membrane Reactors in Bioprocessing, Ann. N.Y. Acad. Sci. 469, 152 (1986).
Die immobilisierte Flüssigkeit, die durch Kapillarwirkung in dem mikroporösen Träger gehalten wird, sollte nicht mit Wasser mischbar und ein gutes Lösungsmittel für das ungeladene Peptidprodukt sein, das in einer angemessenen Geschwindigkeit, d. h. gute Transportcharakteristika/hoher Durchfluß, durch die Membran transportiert (diffundiert) werden muß, während geladene oder ionisierte Moleküle sowohl auf der Reaktionsseite als auch auf der Produktseite der Membran zum größten Teil in keine der beiden Richtungen durch die Membran transportiert werden, d. h. gute Selektivität/Ionenabweisung.
Die Auswahl der besten Kombination von Trägermaterial und immobilisierter Flüssigkeit für die Verwendung in einer enzymatischen Peptidsynthese gemäß der vorliegenden Erfindung wird zum Teil von der Natur der einzelnen verwendeten Reaktanten, den erwünschten Produkten und den Lösungsmitteln in dem System abhängen.
Die allgemein bevorzugten immobilisierten Flüssigkeiten für die Anwendung der vorliegenden Erfindung umfassen mit Wasser nicht mischbare organische Lösungsmittel, wie Alkohole mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen, verzweigt und unverzweigt, zum Beispiel n-Decanol, n-Dodecanol, n- Hexadecanol und Mischungen davon. Auch mit Wasser nicht mischbare organische Lösungsmittelmischungen, einschließlich Mischungen davon, sind bevorzugt. Solche Lösungsmittel umfassen, sind aber nicht auf N,N-Diethyl-dodecanamid, Dodecan und 2-Undecanon begrenzt.
Eine andere Membranart, die in der Anwendung der Erfindung brauchbar ist, umfaßt hydrophobe feste Folien, die aus organischen Polymeren, wie Polyvinylchlorid, hergestellt sind. Die Herstellung dieser polymeren Membranen ist in der Literatur gut beschrieben, zum Beispiel O. J. Sweeting, Herausgeber, Science and Technoloqy of Polymer Films, Interscience, New York (1968), während umfassende Anwendungen solcher Membranen für die Abtrennung von Gasen und Flüssigkeiten in S. T. Hwang und K. Kammermeyer, Membranes in Separations, Techniques of Chemistry, Vol. VII, (A. Weissberger, Herausgeber) John Wiley & Sons, Inc., New York (1975) diskutiert werden.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung verwendet ein Membran-Reaktor/Separator-System, das eine wäßrige Reaktionsmischung oder -phase, die in Kontakt mit einer Seite einer IFM-Membran zirkuliert, und eine wäßrige Produktphase oder -mischung zur Verfügung stellt, die im Gegenstrom an der entgegengesetzten Oberfläche der Membran zirkuliert. S. L. Matson und J. A. Quinn, Ann. N.Y. Acad. Sci. 469, 152 (1986). Der pH-Wert und die Temperatur der Reaktions- und der Produktphase werden bei einem Wert gehalten, der die Reaktanten in einer Form hält, die deren Transport durch die Membran bei pH-Werten zwischen etwa 4,0 und 9,0 minimiert. Der Transport des ungeladenen Peptid-Zwischenprodukts aus der Reaktionsphase in die Produktphase wird durch den Konzentrationsgradienten durch die Membran angetrieben, der durch das Anwachsen der neutralen oder ungeladenen Peptidkonzentration in der Reaktionsphase verursacht wird. Die Transportaktivität oder der Durchfluß durch die Membran kann beträchtlich durch die gleichzeitige irreversible Überführung des transportierten Peptids in der Produktphase in eine Spezies, die nicht zurückdiffundieren kann, gesteigert werden. Zum Beispiel kann die letztere Überführung zu der Bildung eines polaren Peptids führen, das nicht zurückdiffundieren kann, und so die Antriebskraft ergänzen, um Vollständigkeit der Verknüpfungsreaktion zu erreichen. Ein Beispiel eines Membran-Reaktor/Separators, der für die Anwendung der vorliegenden Erfindung angepaßt werden könnte, findet sich in US-A-4 187 086.
Verfügbare alternative Membran-Reaktor/Separator-Anordnungen, die zur Ausübung der vorliegenden Erfindung angepaßt werden könnten, sind u. a. die in GB-A-2 047 564 beschriebenen Hohlfaser-Module und herkömmliche Platten- und Rahmentyp-Filtervorrichtungen, die der Fachwelt gut bekannt sind.
Zusätzlich zu dem selektiven Transport des ungeladenen Peptids stellt die Membran eine Barriere zwischen der Reaktionsphase und der Produktphase dar, die unerwünschtes Vermischen von und Reaktionen zwischen den Komponenten jeder Phase verhindert.
In einem bevorzugten Membran-Reaktor/Separator in einer Form gemäß der vorliegenden Erfindung wird das chemische Gleichgewicht zwischen den Reaktanten tatsächlich durch die Membran "gezogen" durch Durchführung einer irreversiblen Überführung des transportierten ungeladenen Peptids in eine membranimpermeable Spezies auf der Produktseite der Membran. Dieser Membran-Reaktor/Separator-Typ verwendet ein kombiniertes Zweienzym (E¹ und E²)-Verfahren des allgemeinen Typs:
Die geladenen Reaktanten A und B sind Aminosäuren und/oder kleine Peptide, die mit Hilfe von peptidbildendem Enzym E¹ kondensiert werden, um das ungeladene Peptid-Zwischenprodukt C zu bilden, das selektiv durch die Membran auf die Produktseite transportiert wird. Es versteht sich, daß reaktive funktionelle Gruppen in den Reaktanten, die nicht an der erwünschten Reaktion teilnehmen, wo nötig geschützt oder geblockt werden können, um unerwünschte Nebenreaktionen und/oder Veränderungen in den Produkten zu verhindern. Auf der Produktseite der Membran wird ungeladenes Peptid C in geladenes Peptid D überführt, das nicht durch die Membran zurückdiffundieren kann, wodurch das chemische Gleichgewicht in der Reaktionsmischung zu der Herstellung von mehr C verschoben wird.
Dieses Konzept wird in Fig. 1 für den spezifischen Fall der enzymatischen Kondensation von D,L-Phenylalaninmethylester mit (N- und β-geschütztem) N-Formyl-β-benzyl-L- aspartat in Gegenwart von Thermolysin bei einem pH-Wert von etwa 5,5 veranschaulicht.
In dem in Fig. 1 veranschaulichten Reaktionsschema ist der Reaktant A&spplus; D,L-Phenylalanin-methylester, und B&supmin; ist N- Formyl-β-benzyl-L-aspartat. Die Reaktanten werden unter Bildung des ungeladenen Peptids C auf der Reaktionsseite der Membran durch das Enzym E¹ Thermolysin kondensiert. Der pH-Wert wird ausgewählt, um die Reaktanten in ihrem geladenen Zustand zu halten und so ihre Diffusion durch die Membran zusammen mit ungeladenem C zu minimieren.
Obwohl das chemische Gleichgewicht für die Kondensationsreaktion weitgehend die Reaktanten-A+- und -W-Spezies begünstigt, erfordert die Diffusion des ungeladenen Peptidprodukts C durch die Membran auf die Produktseite die konstante Herstellung von C, um das chemische Gleichgewicht auf der Reaktionsseite der Membran aufrechtzuerhalten.
Auf der Produktseite der Membran überführt ein Esteraseenzym E² das ungeladene, durch die Membran diffundierte Peptid C schnell und irreversibel in das geladene Peptid D, das nicht auf die Reaktionsseite zurückdiffundieren kann. So wird das chemische Gleichgewicht auf der Reaktionsseite wirksam durch die Membran und zu der Herstellung von ungeladenem Produkt C "gezogen". Danach wird das Peptid D durch Säurehydrolyse, wobei die Formyl- und Benzylschutzgruppen entfernt werden, gefolgt von C-terminaler Veresterung mit Methanol in Aspartam überführt.
Das vorangegangene Verfahren kann, wie in Abbildung 2 gezeigt, in einem Gegenstrom-Membran-Reaktor/Separator 10 ausgeführt werden, wobei unter kontrollierten Bedingungen des pH-Wertes und der Temperatur gearbeitet wird, so daß man eine Reaktionsmischung, die eine N-Acyl-β-substituiert- L-asparaginsäure, z. B. N-Formyl-β-benzyl-L-aspartat, mit einer freien α-Carboxylatgruppe (elektronegative Spezies) umfaßt, mit einem Reaktanten, z. B. D,L-Phenylalanin-methylester, mit einer protonierten freien α-Aminogruppe (elektropositive Spezies) unter der katalytischen Wirkung von Proteasen, die in einem pH-Bereich von etwa 4,0-9,0 wirksam sind, kondensieren läßt, um ein vollständig geschütztes L- Aspartyl-L-phenylalanin-Dipeptid, das keine ionisierten Gruppen (elektroneutrale Spezies) trägt, zu erhalten. Auf der Reaktionsseite der Membran wird die Reaktionsmischung von Reaktortank 12, unterstützt durch Pumpe 14, durch Einlaßleitung 16 durch Separator 18 zur Auslaßleitung 20, die zum Reaktortank 12 zurückführt, zirkuliert. Auf der Produktseite der Membran wird eine Produktmischung oder ein -durchfluß, einschließlich vollständig geschütztes ungeladenes Peptid, z. B. N-Formyl-β-benzyl-L-aspartyl-L- phenylalanin-methylester, das durch die Membran transportiert wird, vom Produktreaktortank 22, unterstützt durch Pumpe 24, durch Produktdurchfluß-Einlaßleitung 26 durch die Produktseite des Separators 18 zur Produktdurchfluß- Auslaßleitung 30 zirkuliert. Diese Produktmischung enthält u. a. ein zweites Enzym E², eine Esterase, oder ein anderes geeignetes Reagens, das wenigstens eine der geschützten Gruppen, die das ungeladene Peptid trägt, abspalten kann, wodurch eine elektronisch geladene Spezies erzeugt wird, die dem Durchflußstrom nicht durch Rückdiffusion durch die Membran entkommen kann. Wenn eine Esterase verwendet wird, wird eine bevorzugte Esterase einen bevorzugten pH-Bereich von etwa 6,0 bis 9,0 haben. Aminoacylase I, α-Chymotrypsin und Subtilisin A sind Beispiele von Esterasen, die in der vorliegenden Erfindung als brauchbar betrachtet werden.
Das geladene Produkt kann periodisch entnommen und/oder durch herkömmliche Mittel, wie Ionenaustauscherharze, ständig aus der Produktphase entfernt werden, und der zurückbleibende Ablauf kann durch das System dem Kreislauf wieder zugeführt werden. Das resultierende Produkt, das an das Ionenaustauscherharz gebunden ist, kann unter Verwendung herkömmlicher Verfahren desorbiert und gewonnen werden.
Die Auswahl des (der) Reagenzes(ien), das (die) neben Esterasen zur Schutzgruppen-Entfernung geeignet ist (sind), wird durch die chemische Natur der Schutzgruppen, die an den Reaktanten verwendet werden, wie N-geschützte-L- asparaginsäure, und, wie oben angezeigt, ist die Wahl der Schutzgruppen umgekehrt durch strukturelle Erfordernisse, die durch die aktive Stelle des Kondensationsenzyms vorgegeben sind, vorgeschrieben.
Im allgemeinen sind die für die Anwendung der vorliegenden Erfindung brauchbaren Enzyme proteolytische Enzyme, manchmal Proteasen genannt, die in zwei Gruppen aufgeteilt werden können. Die gewöhnlich mehr genutzten sind Endopeptidasen, die nur innere Bindungen spalten, und Exopeptidasen, die nur terminale Bindungen spalten. Geeignete Enzyme umfassen Serinproteinasen (EC 3.4.21), wie Chymotrypsin, Trypsin, Subtilisin BNP' und Achromobacter- Protease, Thiolproteinasen (EC 3.4.22), wie Papain, Carboxylproteinasen (EC 3.4.23), wie Pepsin, und Metallproteinasen (EC 3.4.24), wie Thermolysin, Prolisin, Tacynasen N (St. caespitosus) und Dispase. Binden der Enzyme an unlösliche Träger, gemäß Verfahren, die den Fachleuten gut bekannt sind, kann in die Anwendung dieser Erfindung aufgenommen werden, und obwohl das Binden der Enzyme kein wesentlicher Schritt ist, kann es bei einigen Anwendungen erwünscht sein. Unter den vielen Proteasen, die potentiell für die Anwendung dieser Erfindung brauchbar sind, ist Thermolysin [E.C. 3.4.24] wegen seiner bemerkenswerten Thermostabilität, ausgedehnten Verfügbarkeit, niedrigen Kosten und seines breiten brauchbaren pH-Bereichs zwischen etwa 5,0 bis 9,0 das am meisten bevorzugte Kondensationsenzym. Andere bevorzugte Proteasen sind u. a. Pepsin und Penicillopepsin [T. Hofmann und R. Shaw, Biochim. Biophys. Acta 92, 543 (1964)] und die thermostabile Protease aus Penicillium duponti [S. Emi, D. V. Myers und G. A. Iacobucci, Biochemistry 15, 842 (1976)]. Es wird erwartet, daß sie bei einem pH-Wert von etwa 5,5 wirksam sind, daß sie bei solchen pH-Werten gute Stabilität aufweisen und daß sie nicht die Anwesenheit von Zn&spplus;&spplus;- und Ca&spplus;&spplus;-Ionen benötigen, um ihre Wirksamkeit zu bewahren.
Die praktische Verwirklichung der enantiomeren Selektivität, das ist, in dem oben beschriebenen Fall, die Herstellung nur des L,L-Isomeren des Peptids C, ist direkt verbunden mit dem ausgewählten Enzym, dem optimalen Funktionieren der Membran, der chemischen Natur des Trägermaterials und dem pH-Wert der wäßrigen Reaktionsphase.
Eine bevorzugte Membran für die Durchführung des oben beschriebenen spezifischen Verfahrens ist ein mikroporöses Polypropylenträgermaterial, das eine darin immobilisierte Mischung aus n-Hexadecanol und n-Dodecan enthält. Diese Membran ist von Bend Research, Inc., 64550 Research Road, Bend, Oregon 97701, USA unter dem warenzeichen/der Bezeichnung "Type 1 Hollow Fiber Selective Dialysis Membrane" erhältlich und wird bei den Reaktionen der Beispiele 1-4 bevorzugt. Eine andere bevorzugte Membran benutzt Celgard®- Typ-2400-Polypropylen-Hohlfasern (Celgard® ist ein eingetragenes Warenzeichen der Celanese Corporation, 1211 Avenue of the Americas, New York, N.Y. 10036. Celgard® kann von Celanese Fibers Marketing Corporation, Charlotte, N.C. erhalten werden.) als das mikroporöse Trägermaterial, das eine Mischung aus 30% Vol./Vol. N,N-Diethyl-dodecanamid in Dodecan als die mit Wasser nicht mischbare organische Flüssigkeit enthält, die durch Kapillarwirkung in Poren einer mikroporösen Celgard®-Folie immobilisiert ist. Diese Membran wurde von Bend Research, Inc., 64550 Research Road, Bend, Oregon 97701, USA unter dem Warenzeichen/der Bezeichnung "Type 2 Hollow Fiber Selective Dialysis Membrane" erhalten und wird bei den Reaktionen der Beispiele 5-9 bevorzugt. Celgard®-Typ-2400-Polypropylen-Hohlfasern mit einer Porengröße von 0,025-0,050 um und einer Wanddicke von 25 um wurden in der Typ 2 selektiven Hohlfaserdialysemembran der Bend Research, Inc. verwendet. Wenn bei pH-Werten von etwa 5,5 gearbeitet wird, weisen diese Membranen eine hohe Selektivität auf, zum Beispiel wurde, wenn das Verfahren der Fig. 1 durchgeführt wurde, eine Selektivität im Bereich von etwa 500 : 1 (Gew./Gew.) zu Gunsten der ungeladenen Peptidspezies gemessen. Das heißt 500 Milligramm des ungeladenen Peptids (C) werden für jedes transportierte Milligramm des geladenen Reaktanten (A&spplus; oder B&supmin;) durch die Membran transportiert.
Wie oben erwähnt wird es für die Anwendung der vorliegenden Erfindung notwendig oder wünschenswert sein, verschiedene funktionelle Gruppen an den Reaktanten und den Produkten zu blockieren oder zu schützen, um unerwünschte Nebenreaktionen zu verhindern, die die Bildung des erwünschten Produktes verhindern und/oder dessen Ausbeute verringern könnten, und um elektrische Ladungen im intermediären Peptid zu unterdrücken. Tabelle I unten listet eine Reihe ausgewählter Kombinationen von Schutzgruppen und Bedingungen zur Schutzgruppen-Entfernung auf, die in Zusammenhang mit der Anwendung dieser Erfindung brauchbar sind. TABELLE I SCHUTZGRUPPEN UND REAGENZIEN ZUR SCHUTZ- GRUPPEN-ENTFERNUNG, DIE BEI DER SYNTHESE VON ASPARTAM (APM) BRAUCHBAR SIND entfernte Gruppe/Reagens Produkt β-Benzyl-APM R³/Pilzesterase N-Formyl-β-benzyl-L-aspartyl-L-phenylalanin R¹/Asparaginase L-Dihydroorotyl-L-phenylalaninmethylester R¹,R²/Hydantoinase R³/Pilzesterase N-CBZ-isoAPM R²/Penicillinacylase APM-β-methylester
Als ein Ergebnis der Enantioselektivität ausgewählter Kondensationsenzyme und der funktionellen Unterscheidung, die durch die Membran ausgeübt wird, konnte die Anwendung der Erfindung unter Verwendung von N-Formyl-L-aspartyl-βbenzylester und D,L-Phenylalanin-methylester eine 99,8%ige enantiomere Auftrennung des racemischen Phenylalaninmethylester-Reaktanten bewirken, wobei das L-Enantiomere als N-Formyl-L-aspartyl(β-benzyl)-L-phenylalaninmethylester, ein Aspartamderivat, auftritt, während das nichtabreagierte D-Enantiomere in der Reaktionsphase verbleibt.
Der D-Phenylalaninmethylester, der in der Reaktionsphase zurückbleibt, kann daraus zurückgewonnen, erneut zu der D,L-Stufe racemisiert und in den Kreislauf zu dem Edukt zurückgeführt werden. Dies ist ein vielen Verfahren, die racemische Aminosäurereaktanten verwenden, gemeinsamer Vorteil, z. B. dem oben beschriebenen '311-Verfahren.
Die ökonomischen Vorteile der vorliegenden Erfindung resultieren, wenigstens teilweise, aus der Verwendung eines Racemat-Ausgangsreaktanten anstelle eines teureren vorher aufgetrennten L-Enantiomeren. Dieser Vorteil wird ermöglicht in situ durch die Antipodentrennung des D,L- Phenylalaninmethylesters wegen: (a) der Enantioselektivität des Kondensationsenzyms und (b) der hohen Selektivität der Membran zu Gunsten der ungeladenen Spezies.
Bevorzugte Verfahren für die billige Synthese von racemischem Phenylalanin sind die, die auf der Verwendung von Benzaldehyd über 5-Benzalhydantoin, manchmal das Grace- Verfahren genannt, oder der katalytischen Carbonylisierung von Benzylchlorid zu Phenylpyruvinsäure basieren, ein Verfahren, das durch Sagami Chemical Research Center, Tokyo, Japan (manchmal bezeichnet als das Toyo-Soda-Verfahren der Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd., Yamaguchi, Japan) entwickelt wurde.
Es wird von den Fachleuten erkannt werden, daß die Praxis dieser Erfindung nicht notwendigerweise auf die Synthese von Peptidsüßstoffen wie Aspartam oder dessen Analogen und Derivaten beschränkt ist. Die Erfindung kann auch für die Synthese von anderen nützlichen Peptiden, Di-, Tri-, Tetra- und Pentapeptiden oder Peptiden höherer Komplexität verwendet werden, die fähig sind, mit einer angemessenen Geschwindigkeit durch eine permselektive Membran zu diffundieren. Man könnte zum Beispiel unter Berücksichtigung der Bindungsspezifität von Thermolysin und unter der Annahme, daß nur eine Thermolysin empfindliche Bindung (angezeigt durch den Pfeil in der Formel unten) in dem Produkt vorliegt, Met-Enkephalin (1) nach folgendem Schema synthetisieren:
Die Durchführbarkeit einer schrittweisen enzymatischen Gesamtsynthese von Met-Enkephalin unter Verwendung von α- Chymotrypsin und Papain ist in der Literatur dokumentiert worden. siehe: W. Kullmann, J. Biol. Chem 255, 8234 (1980).
Eine andere potentiell nützliche Anwendung der vorliegenden Erfindung ist die enzymatische Synthese von Gramicidin S (2) nach folgendem Schema:
Verschiedene andere Beispiele der enzymatischen Synthese nützlicher Peptidprodukte, wobei die vorliegende Erfindung Anwendung finden kann und die in der Literatur beschrieben sind, sind die Synthese von Angiotensin, Substanz P, Eledoisin, Caerulein und Leu-Enkephalin.
Die Fachleute werden erkennen, daß die vorliegende Erfindung außer für Peptide auch Anwendung für andere Systeme finden kann.
Zum Beispiel ist die Verwendung von Esterhydrolasen, wie Schweineleberestetasse [Ec 3.1.1.1], für die asymmetrische Trennung prochiraler Dicarbonsäuredieester zu chiralen Monoestern gut bekannt [C.J. Sih et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 471, 239 (1986)]. Das gleiche Enzym kann auf die in dieser Erfindung beschriebene Weise für die Trennung racemischer Carbonsäureverbindungen durch den selektiven Transport eines chiralen Esters durch die Membran und das Zurückhalten der nichtreaktiven enantiomeren Säure in der Reaktionsphase verwendet werden.
Die folgenden detaillierten Beispiele werden dargelegt, um die vorliegende Erfindung weiter zu veranschaulichen.

Beispiel 1

Ein Aspartamderivat wurde gemäß der vorliegenden Erfindung wie folgt hergestellt:
Zu einer Lösung, enthaltend 5,02 g (20 mmol) N-Formyl-L- aspartyl-β-benzylester, 4,31 g (20 mmol) L-Phenylalaninmethylester in 100 ml Wasser, eingestellt auf einen pH-Wert von 5,5, wurden 500 mg Thermolysin-Enzym (Daiwa Chem. Co., Osaka, Japan) hinzugefügt, was insgesamt 8 · 10&sup5; proteolytische Einheiten darstellt.
Die resultierende klare Reaktionsmischung wurde für 15 Stunden bei 40ºC inkubiert, wonach das Vorliegen von unlöslichem Dipeptid N-Formyl-β-benzyl-L-aspartyl-L- phenylalanin-methylester sichtbar wurde. Die resultierende Mischung wurde dann in einen 200-ml-Behälter gegeben, der mit der Reaktionsseite, in diesem Fall der Rohrseite, eines Versuchs-Hohlfaser-Separators einer Bend Research, Inc. "Type 1 Hollow Fiber Selective Dialysis Membrane" verbunden war, die 900 cm² (1 Quadratfuß) Membranfläche bereitstellte. Die Produktseite der Membran (Mantelseite des Separators) wurde mit einer Quelle einer wäßrigen (Produkt)Mischung (Gesamtvolumen = 200 ml) verbunden, die 500 mg des Enzyms Acylase I (EC 3.5.1.14) aus Aspergillus S-. (Sigma A 2156) bei einem pH-Wert von 7,5 enthielt. Es wurde gefunden, daß dieses Enzym, das gewöhnlich als eine Aminoacylase beschrieben wird, als eine C-terminale Esterase für sowohl N-Acetyl- als auch N-Formyl-β-benzyl-aspartam wirkt.
Die Reaktions- und Produktmischungen wurden bei Raumtemperatur im Gegenstrom bei einer Geschwindigkeit von 600 ml/min mit Hilfe von Rollkolbenpumpen durch den Hohlfaserseparator zirkuliert. Die Anordnung dieser Vorrichtung gleicht der, die in Fig. 2 veranschaulicht ist. Da beide Reaktionen (Kondensation und die Esterhydrolyse) protonenliefernd sind, fällt der pH-Wert sowohl in der Reaktionsals auch in der Produktmischung, während das Verfahren fortschreitet. Die Konstanz des pH-Wertes sowohl in der Reaktions- als auch in der Produktmischung wurde durch Verwendung von pH-Staten aufrechterhalten.
Die Bildung von N-Formyl-β-benzyl-L-aspartyl-L-phenylalanin wurde durch HPLC überwacht. Die chromatographische Analyse wurde auf einem Tracor-Modell-995-Instrument zusammen mit einem LDC-Spektromonitor-II-Detektor, der für die Detektion der Aminosäuren, vollständig geschützten Produktdipeptide und Dipeptide auf 254 nm eingestellt war, durchgeführt. Die Säule, die verwendet wurde, war eine NOVA-PAK-C&sub1;&sub8;-Radial- Pak-Patrone, 8mm · 10cm, die in einem Millipore-Waters-RCM- 100- Radial-Kompressionsmodul untergebracht war.
Die mobile Phase, die für die Detektion des vollständig geschützten Dipeptids verwendet wurde, war eine Vol./Vol.- Mischung aus 45% Methanol (HPLC-Güte), 5% Tetrahydrofuran (HPLC-Güte) und 50% einer 1%igen KH&sub2;PO&sub4;-Pufferlösung. Für die Detektion des Produktdipeptids bestand die mobile Phase aus einer Vol./Vol.-Mischung aus 40% Methanol und 60% einer 1%igen KH&sub2;PO&sub4;-Pufferlösung (es wurde 1 ml Triethylamin pro Liter Lösungsmittel hinzugefügt, um Tailing zu minimieren, und der pH-Wert wurde unter Verwendung von 80%iger Phosphorsäure auf 4,3 herunterreguliert). Die Flußrate wurde bei 1 ml/Minute gehalten.
Die HPLC-Daten, die sich auf die Bildung von N-Formyl-βbenzyl-L-aspartyl-L-phenylalanin beziehen, sind unten in Tabelle II zusammengefaßt und als die Gesamtmenge (mg) des Produkt-Dipeptids, das sich in der Produktlösung angesammelt hat, als Funktion der Zeit angegeben.
Es wurde gefunden, daß der Wert der Konzentration des ungeladenen Dipeptids im Gleichgewicht, der mit dessen Sättigungspunkt in Wasser bei einem pH-Wert von 5,5 übereinstimmt, bei 25ºC etwa 0,05% ist. Es wurde gefunden, daß die Menge des ungeladenen Dipeptides, die pro 900 cm² (Quadratfuß) Membran pro Stunde transportiert wird, etwa 200 mg ist, was anzeigt, daß die Aufrechterhaltung des Gleichgewichts Auflösung von unlöslichem Dipeptid und/oder Dipeptidesynthese de novo erforderte. Nahezu vollständige Auflösung des unlöslichen Dipeptids mit ungeladener Phase in der Reaktionsmischung wurde nach ungefähr 5 Stunden beobachtet, wobei zu diesem Zeitpunkt die Reaktion gestoppt wurde. Ein Diagramm der Daten der Tabelle II ist in Fig. 3 gezeigt. Die lineare Funktion zeigt an, daß der Peptid- Transfer durch die Membran in einem Gleichgewichtszustand stattfindet. Die beobachtete Bildungsrate des Produktdipeptids von ungefähr 200 mg/900 cm² (Quadratfuß)/h (Tabelle II) wurde bestätigt ähnlich dem Durchfluß des ungeladenen Dipeptids durch die Membran (190 mg/900 cm² (Quadratfuß)/h), gemessen bei 0,05% in Wasser, wie es aus theoretischen Gründen zu erwarten war.
An diesem Punkt würde man erwarten, daß das beschriebene System im Gleichgewichtszustand verbleibt, wenn kontinuierlich die zwei Aminosäurereaktanten, jeder mit einer Rate von etwa 120 mg/h, zu der Reaktionsmischung hinzugefügt würden, damit das System an ungeladenem Dipeptid gesättigt gehalten wird.
Um die Membranselektivität voll zu realisieren, kann die Zuschaltung einer zweiten Membran in Serie mit der ersten Membran vor dem Kontakt mit dem zweiten Enzym nötig sein, da die Selektivität durch eine einzige Membran, wegen der hohen Aminosäurekonzentration in der Reaktionslösung, geringer ist.
Die Produktlösung (200 ml) wurde gewonnen, auf einen pH- Wert von 2,5 eingestellt und über Nacht bei 4ºC gekühlt. Der gesammelte Niederschlag wurde gewonnen und aus MeOH:H&sub2;O umkristallisiert, um 307 mg N-Formyl-β-benzyl-L-aspartyl-L- phenylalanin [α]25ºD = -5,6º(c=1,2, EtOH) zu ergeben, das mit einer authentischen Probe, die durch diskontinuierliche Hydrolyse von N-Formyl-β-benzyl-aspartam mit Aspergillus- Esterase, [α]25ºD = -5,3º (c=1,3, EtOH) hergestellt war, identisch war (IR, ¹³C-NMR).

Tabelle II

Zeit (min) Peptidmenge/Produktlösung (mg)
30 124
60 228
120 412
180 617
240 882
300 1015

Beispiel 2

Ein dem des Beispiels 1 ähnliches Experiment wurde durchgeführt, außer daß 8,63 g D,L-Phenylalanin-methylester statt des L-Enantiomeren verwendet wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt. Isolierung des ungeladenen Peptids aus den 200 ml der Produktlösung ergab 310 mg Produkt, [α]25ºD = -6,4º (C=1,4, EtOH), das in jeder Hinsicht (IR, ¹³C-NMR) mit einer authentischen Probe N- Formyl-β-benzyl-L-aspartyl-L-phenylalanin identisch war.

Tabelle III.

Zeit (min) Peptidmenge/Produktlösung (mg)
30 166
60 258
120 475
180 686
240 996
300 1073
Ein Diagramm der in Tabelle III (Fig. 3) zusammengefaßten Daten zeigte wieder das Vorliegen eines Gleichgewichtsverfahrens, wenn der Reaktor mit D,L-Phenylalanin-methylester betrieben wurde. Die Stereospezifität von Thermolysin wird durch die ausschließliche Bildung desselben L,L-Dipeptids, das in Beispiel 1 beschrieben wurde, gezeigt. Der D- Phenylalanin-methylester, der in der Rohrphase (Reaktionsmischung) zurückgehalten wird, verhindert nicht die Gesamtkinetik der Peptidbildung.

Beispiel 3

Eine Mischung aus 1,0 g N-Formyl-β-benzyl-L-aspartyl-L- phenylalanin, hergestellt gemäß Beispiel 1, 4,0 ml Wasser, 4,0 ml Tetrahydrofuran und 1,0 ml konz. Salzsäure (12n) wurde 9 Std. unter Rückfluß erhitzt. Die Mischung wurde dann abgekühlt und der pH-Wert mit 50%iger NaOH-Lösung auf 4,0 eingestellt. Das Tetrahydrofuran wurde dann durch Abdampfen bei < 35º und 0,027 bar (20 mm Hg) entfernt. Durch Aufbewahrung für 1 h bei 5ºC wurde die Kristallisation vervollständigt, die Probe dann filtriert, mit 1 ml Eiswasser gewaschen und im Vakuum getrocknet, um 367 mg weißen Feststoff zu ergeben. Dieser Stoff war durch HPLC- und IR-Vergleich mit einer authentischen Probe L-Aspartyl- L-phenylalanin identisch. [α]25ºD = +12º (c=0,5, 0,1n HCl in 50% MeOH).
L-Aspartyl-L-phenylalanin ist durch Behandlung mit Methanol und Salzsäure, wie in G. L. Bachman und B. D. Vineyard, US- Patent Nr. 4 173 562, Beispiel Nr. 1 beschrieben, in Aspartam überführt worden.

Beispiel 4

Ein dem des Beispiels 1 ähnliches Experiment wurde durchgeführt, außer daß als Reaktanten 5,65 g (20,1 mmol) N- Carbobenzoxy-L-asparaginsäure-β-methylester und 4 , 38 g (20,3 mmol) L-Phenylalanin-methylester verwendet wurden. Die Aminosäuren wurden in 100 ml Wasser aufgelöst, der pH- Wert der Lösung auf 5,5 eingestellt, und 500 mg Thermolysin Daiwa (8 · 10&sup5; proteolytische Einheiten) wurden hinzugefügt. Die Lösung wurde 15 Stunden bei 40ºC vorinkubiert, wobei eine beträchtliche Menge N-CBZ-(β-methylester)-L-asp- L-phenylalanin-methylester ausgefällt wurde. Die Suspension wurde mit der Rohrseite einer "Type 1 Hollow Fiber Selective Dialysis Membrane" (Bend Research Inc.) verbunden, die 900 cm² (1 Fuß²) Membranoberfläche enthielt, und die Vorrichtung wurde bei Raumtemperatur für 5 Stunden gegen eine Mantelseitenphase von 200 ml Wasser betrieben, das 500 mg Acylase I (Sigma) bei einem pH-Wert von 7,5 enthielt. Die Akkumulation des Peptidprodukts in der Mantelphase wurde durch HPLC überwacht, und die Ergebnisse sind in Tabelle IV und Fig. 4 wiedergegeben.
Nach 5 Stunden Laufzeit wurde die Reaktion gestoppt, die Mantelseitenphase (200 ml) gewonnen, auf einen pH-Wert von 2,5 eingestellt und über Nacht bei 4ºC aufbewahrt. Das ausgefallene Produkt wurde gesammelt und aus CH&sub3;OH:H&sub2;O umkristallisiert, um 405 mg (86% Ausbeute) N-CBZ-(βmethylester)-L-asp-L-phenylalanin (N-CBZ-iso-APM) [α]25ºD = +6,0º (c=1,1, EtOH) zu erhalten, das mit einer authentischen Probe N-CBZ-iso-APM, [α]25ºD = +5,5º (c=1,1, EtOH), identisch (¹³C-NMR) war, die durch chemische Verknüpfung und partielle Veresterung mit Acylase I hergestellt wurde.

Tabelle IV.

Zeit (min) Peptidmenge/Produktlösung (mg)
30 177
60 214
120 333
180 381
240 459
300 470
Wie vorher in den Experimenten der Beispiele 1 und 2 beobachtet, zeigt das Diagramm der Fig. 4, daß die Akkumulation von N-CBZ-iso-APM mit einer konstanten Rate von etwa 200 mg/h abläuft.
Die Überführung von N-CBZ-iso-APM zu APM kann unter den in Beispiel 3 beschriebenen- Bedingungen ausgeführt werden.

Beispiel 5

Das Aspartamderivat, N-Formyl-(β-methyl)-asp-phe wurde gemäß der vorliegenden Erfindung wie folgt hergestellt: Zu einer Lösung, die 6,00 g (35 mmol) N-Formyl-(β-methyl)-L- asparaginsäure, 10,00 g (48 mmol) L-Phenylalanin-methylester in 100 ml Wasser enthielt und auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt war, wurden 770 mg Thermolysin-Enzym (Daiwa Chemical Co., Osaka, Japan) hinzugefügt, das insgesamt 1,2 · 10&sup6; proteolytischen Einheiten entspricht. Die resultierende klare Lösung wurde 1 h bei 40ºC inkubiert, wonach HPLC-Analyse das Vorliegen von 433,8 mg N-Formyl-(βmethyl)-asp-phe-OMe anzeigte. Die Lösung wurde auf 25ºC abgekühlt, der pH-Wert auf 5,0 eingestellt, und die Lösung in einen 200-ml-Behälter gegeben, der mit der Rohrseite des Hohlfaserseparators ("Type 2 Hollow Fiber Selective Dialysis Membrane", Bend Research Inc.) verbunden war, die 450 cm² (0,5 Fuß²) einer IFM, die aus 30% Vol./Vol. N,N- Diethyl-dodecanamid in Dodecan hergestellt war, bereitstellte. Die Mantelseite des Separators wurde mit dem Produktbehälter verbunden, der 500 mg des Enzyms Acylase I (EC 3.5.1.14) aus Aspergillus Sp (Aminoacylase AMANO, Nagoya, Japan) bei einem pH-Wert von 7,5, enthielt.
Die zwei Phasen wurden bei 25ºc mit den Geschwindigkeiten von 50 ml/min (Rohrphase) und 500 ml/min (Mantelphase) mit Hilfe von zwei Rollkolbenpumpen unter Verwendung der Anordnung, die in Fig. 2 abgebildet ist, im Gegenstrom zirkuliert. Die Konstanz des pH-Werts in beiden Phasen wurde durch die Verwendung von pH-Staten gesichert.
Die Bildung von N-Formyl-(β-methyl)-asp-phe wurde durch HPLC unter Verwendung eines Tracor-Modell-995-Instruments zusammen mit einem LDC-Spektromonitor-II-Detektor, der auf 254 nm eingestellt war, überwacht. Die verwendete Säule war eine 8 mm · 100 mm-NOVA-PAK-C18-Radial-Pak-Patrone, die in einem Millipore-Waters-RCM-100-Radial-Kompressionsmodul untergebracht war.
Die mobilen Phasen, die für die Analyse verwendet wurden, waren:
(a) für N-Formyl-(β-methyl)-asp-phe-OMe: 40% Vol./Vol. Methanol in 0,1%igem KH&sub2;PO&sub4;-Puffer, pH-Wert 4,6,
(b) für N-Formyl-(β-methyl)-asp-phe: 20% Vol./Vol. Methanol in 0,1%igem KH&sub2;PO&sub4;, pH-Wert 4,6; die verwendeten Flußraten waren für beide Analysen 1 ml/min.
Die Daten, die sich auf die Bildung von N-Formyl-(βmethyl)-asp-phe (Produkt-Dipeptid) beziehen, sind unten in Tabelle V wiedergegeben und als die Gesamtmenge (mg), die sich in der 200-ml-Mantelphase angesammelt hat, als eine Funktion der Zeit angeben.

Tabelle V

Zeit (min) Menge Peptid/Produktlösung (mg)
60 130
120 230
180 280
240 360
300 400
Eine graphische Darstellung der Daten von Tabelle V ist in Fig. 5 gezeigt.
Am Ende des Versuches zeigte HPLC-Analyse das Vorliegen von 283 mg N-Formyl-(β-methyl)-asp-phe-OMe in der Rohrphase an. Diese Werte ermöglichen es, die Peptidmenge, die während des Betriebs des Reaktors synthetisiert wurde, zu berechnen.
Ptr = in die Mantelphase transportiertes Peptid = 400· 336/322 = 417,4 mg;
Po = Ausgangspeptid in der Rohrphase = 433,8 mg;
PT = in der Rohrphase am Ende des Versuches verbleibendes Peptid = 283 mg;
Ptr = (Po - PT) + Psyn;
Psyn = Ptr - (Po - PT) = 266,6 mg und
Vsyn = 266,6/5 = 53,5 mg/h·100 ml.
Die Vsyn von 53,5 mg/h·100 ml stimmt mit der Syntheserate (500 mg/h·l) überein, die für die Geschwindigkeit der Hinreaktion in Gleichgewichtsuntersuchungen gemessen wurde, die mit N-Formyl-(β-methyl)-L-asparaginsäure und L-Phenylalanin-methylester in Gegenwart von Thermolysin durchgeführt wurden.
Die Produktlösung (200 ml) wurde gewonnen, mit 1n HCl auf einen pH-Wert von 2 eingestellt und zweimal mit 200 ml EtOAc extrahiert. Die vereinten Extrakte hinterließen nach der Verdampfung einen weißen Rückstand, der nach der Umkristallisation aus EtOAc/Hexan 100 mg N-Formyl- (βmethyl)-L-asp-L-phe ergab, [α]25ºD = +0,70º (c, 0,29, MeOH), das mit einer authentischen Probe, die durch die diskontinuierliche Hydrolyse von synthetischem N-Formyl-(βmethyl)-L-asp-L-phe-OMe mit Aspergillus-Esterase hergestellt wurde, identisch (IR, ¹³C-NMR) war, [α]25ºD = +0,80º (c, 0,29, MeOH).

Beispiel 6

Der in Beispiel 5 beschriebene Versuch wurde in einer Typ 2 Hohlfaserdialysemembran (Bend Research Inc.), die 900 cm²(1 Fuß²) flüssige Membran (30% Vol./Vol. N,N-Diethyl-dodecanamid in Dodecan) enthielt, maßstabsgetreu vergrößert. Die Rohrphase enthielt 40 g L-Phe-OMe, 24 g N-Formyl-(βmethyl)-L-asp und 3,08 g Thermolysin Daiwa (insgesamt 5 · 10&sup6; proteolytische Einheiten) in 400 ml Wasser, eingestellt auf einen pH-Wert von 7,0. Es wurde gefunden, daß nach einer Inkubationsdauer von 1 h bei 40ºC die Menge von 1,068 g (2,7 g/l) N-Formyl-(β-methyl)-L-asp-L-phe-OMe vorlag. Die Lösung wurde auf 25ºC abgekühlt, mit 1n HCl auf einen pH- Wert von 5,0 eingestellt und mit der Rohrseite des Hohlfaserseparators verbunden. Die Mantelphase bestand aus 400 ml Wasser, pH-Wert 7,5, das 2 g Aminoacylase I (Amano) enthielt. Wie in Beispiel 5 beschrieben, wurden die zwei Phasen im Gegenstrom bei 25ºC für 5 h zirkuliert. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI und Fig. 6 zusammengefaßt.

Tabelle VI

Zeit (min) Peptidmenge/Produktlösung (mg)
30 204
60 251
120 445
180 634
240 748
300 843
Am Ende des Versuchs war die Menge des N-Formyl-(β-methyl)asp-phe-OMe, das in der Rohrphase zurückblieb, 586 mg.
Der während der ersten 30 min beobachtete höchste Transportwert (404 mg/h) ist das Ergebnis der hohen Anfangspeptidkonzentration, die während der Vorinkubationsperiode hergestellt wurde. Die durch den Peptidtransport verursachte Abweichung vom Gleichgewicht, gab sich mit der Synthese von mehr Peptid und stellte so nach der ersten Stunde bei dem erwarteten Level von 200 mg/h einen Gleichgewichtszustand für den Versuch her (Fig. 6).

Beispiel 7

Ein dem des Beispiels 5 ähnlicher Versuch wurde durchgeführt, außer daß 10,00 g D,L-Phenylalanin-methylester anstelle des L-Enatiomeren verwendet wurden. Die in Tabelle VII und in Fig. 7 wiedergegebenen Ergebnisse zeigen deutlich, daß die beobachtete N-Formyl-(β-methyl)-L-asp-L- phe-Bildungsrate die Hälfte von der war, die mit L-Phe-OMe beobachtet wurde (Beispiel 5, Tabelle V), wie es durch die Enatioselektivität des Thermolysins und die obigen Ergebnisse der Beispiele 1 und 2 erwartet wird.

=Tabelle VII

Zeit (min) Peptidmenge/Produktlösung (mg)
30 10,6
60 25,5
120 33,2
180 55,3
240 59,6
300 69,1

Beispiel 8

Membranunterstützte enzymatische Trennung von D,L-Phenylalanin-methylester wurde gemäß der vorliegenden Erfindung wie folgt verwendet: Zu einer Lösung aus 1,0 g (5,6 mmol) D,L-Phenylalanin-methylester in 100 ml Wasser, pH-Wert 7,5, wurden 500 mg Aminoacylase I (Amano Pharmaceutical Co., Nagoya, Japan) hinzugefügt. Man ließ die Mischung 30 min bei 25ºC reagieren, wobei am Ende der Umsetzung durch HPLC- Analyse das Vorliegen von 266 mg hydrolysiertem Phe (1,6 mmol) und 712 mg Phe-OMe (4 mmol) beobachtet wurde. Diese Lösung wurde in die Rohr(Reaktions)seite eines Hohlfaser- Celgard®-Träger-IFM-Separators ("Type 2 Hollow Fiber Selective Dialysis Membrane", Bend Research Inc.) eingeleitet, der 450 cm² (0,5 Fuß²) eines flüssigen Films von 30% Vol./Vol. N,N-Diethyl-dodecanamid in Dodecan in sich enthielt. Die Produktseite der Membran (Mantelseite des Separators) wurde mit mit verdünnter HCl auf einen pH-Wert von 2,0 eingestellten 200 ml Wasser gefüllt. Die zwei Phasen wurden mit Hilfe von Rollkolbenpumpen im Gegenstrom mit der Geschwindigkeit von 200 ml/min durch den Separator zirkuliert (Fig. 2). Die Trennung lief durch die ständige Zugabe von D,L-Phe-OMe zu der Rohrphase ab, die mit einer Rate von etwa 1 g D,L-Phe-OMe pro Stunde erfolgte. Eine Gesamtmenge von 30 ml einer 7%igen D,L-Phe-OMe-Lösung (2,1 g, 11,7 mmol) in Wasser, pH-Wert 7,5, wurde über einen Zeitraum von 2 h hinzugefügt. Der pH-Wert beider Phasen wurde durch die Verwendung von pH-Staten konstant gehalten.
Der Ablauf der Trennung wurde durch HPLC an Proben, die alle 30 min aus beiden Phasen entnommen wurden, verfolgt. Das HPLC-Gerät und die -Verfahren sind die, die in Beispiel 5 beschrieben wurden. Die mobile Phase, die in diesem Fall verwendet wurde, war 20% Vol./Vol. Methanol in 0,1%igem KH&sub2;PO&sub4;-Puffer, pH-Wert 4,6, mit einer Flußrate von 1 ml/min. Die Ergebnisse, die in Tabelle VII wiedergegeben werden und in Fig. 8 aufgetragen sind, zeigten die Akkumulation von L-Phe in der Rohrphase und von D-Phe-OMe in der Mantelphase. Am Ende des Versuches wurden beide Phasen gewonnen und wie folgt behandelt:
a) Rohrphase: Die Inhalte (130 ml) wurden mit 1n NaOH auf einen pH-Wert von 8,5 eingestellt, dann mit 2 · 50 ml EtOAc extrahiert. Die wäßrige Phase wurde dann mit In HCl auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt, und die Lösung durch eine 2,5 · 20 cm-Dowex®50-(NH&sub4;)-Säule hindurchgeleitet. Nach Waschen mit 200 ml Wasser, wurde das Produkt mit 200 ml 10%iger NH&sub4;OH eluiert. Das Eluat wurde im Vakuum auf 50 ml konzentriert und die Lösung gefriergetrocknet. Ausbeute: 249 mg, weißer Feststoff, L-Phenylalanin, [α]25ºD = -29,2º (c, 2, H&sub2;O), Lit. (Aldrich) [α]25ºD = -35,0º (c, 2, H&sub2;O), optische Reinheit 83%.
(b) Mantelphase: (200 ml) wurde mit verdünnter NaOH auf einen pH-Wert von 8,5 eingestellt und mit 2 · 50 ml EtOAc extrahiert. Der organische Extrakt wurde über wasserfreiem Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, zur Trockene eingedampft, in mit 1n HCl auf einen pH-Wert von 3,0 angesäuerten 50 ml Wasser aufgelöst und dann gefriergetrocknet, um 989 mg (4,6 mmol) D-Phe-OMe·HCl zu ergeben, weißer Feststoff, [ ]25ºD = -21,0º (c, 2, EtOH), Lit. (Aldrich) [α]25ºD = -32,4º (c, 2, EtOH), optische Reinheit 65%.
Bezogen auf den Permeabilitätswert von 32 ug/cm²·min, der für Phe-OMe (Wasser, pH-Wert 8, 25ºC) auf dieser Membran gefunden wurde, war der erwartete Durchfluß für eine Membranfläche von 450 cm² (0,5 Fuß²) 880 mg/h. Tabelle VIII zeigt, unter der Annahme, daß der Transport unter membranlimitierenden Bedingungen durchgeführt wurde, daß die Menge des Phe-OMe, die in die Mantelphase transportiert wird, am Ende der ersten Stunde 860 mg wurde. Tabelle VIII zugegebenes Rohrphase Mantelphase
Vor kurzem ist die diskontinuierliche Trennung von D,L-Phe- OMe durch die enantioselektive Hydrolyse der Methylesterfunktion, die durch Subtilisin A (eine serinartige, alkalische Protease) katalysiert wurde, offenbart worden [Shui-Tein Chen, Kung-Tsung Wang und Chi-Huey Wong, J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1986, 1514]. Eine Hydrolase ist zur Membrantrennung racemischer Carbonsäureverbindungen erforderlich. Eine Hydrolase, die eine Esterase ist, wie Aminoacylase I, α-Chymotrypsin und Subtilisin A, kann verwendet werden, um eine D,L-Aminosäureverbindung, wie D,L-Phenylalaninmethylester, zu trennen. Die Aminoacylase I wird gewöhnlich für die Hydrolyse von Peptidmethylestern gegenüber esterolytischen Enzymen, wie Subtilisin A und α- Chymotrypsin mit starker proteolytischer Wirksamkeit, bevorzugt.
Wenn die oben beschriebene Trennung von D,L-Phenylalaninmethylester verwendet wird, um wie in der vorliegenden Erfindung beschrieben ein Peptid herzustellen, wird das hergestellte L-Phenylalanin durch Standardmittel, die in der Fachwelt bekannt sind, in den Methylester überführt.
Dieses Beispiel kann für die Trennung anderer racemischer Carbonsäuren anpaßbar sein. Zum Beispiel kann eine racemische Carbonsäureesterverbindung in einer wäßrigen Reaktionsmischung, die u. a. ein Hydrolyseenzym enthält, hydrolysiert werden, um eine geladene enantiomere Verbindung und eine ungeladene enantiomere Esterverbindung in der wäßrigen Reaktionsmischung zu bilden. Die ungeladene enantiomere Esterverbindung wird dann aus der wäßrigen Reaktionsmischung durch eine Ionen abweisende Membran der vorliegenden Erfindung transportiert, die u. a. eine Typ 1 oder Typ 2 selektive Hohlfaserdialysemembran von Bend Research, Inc. ist. In dieser Erfindung ist die racemische Carbonsäureesterverbindung eine D,L-Aminosäureesterverbindung, die geladene enantiomere Verbindung ist eine L- Aminosäureverbindung, und die ungeladene enantiomere Esterverbindung ist eine D-Aminosäureesterverbindung. Es wird anerkannt, daß die Auswahl der Enzyme und der Reaktionsbedingungen innerhalb des Verständnisses und des Wissens des Fachmannes des Gebietes der vorliegenden Erfindung ist.
Kontinuierliche oder diskontinuierliche Verfahrensmittel werden durch dieses Beispiel bereitgestellt, in dem das erwünschte Enantiomere des Reaktanten hergestellt und zu der Reaktionmischung hinzugefügt werden kann.

Beispiel 9

Die Synthese von N-Formyl-(β-methyl)-L-asp-L-phe gemäß der vorliegenden Erfindung wurde unter Verwendung von immobilisierter Aminoacylase I und Ionenaustauscherharzen zur Entfernung permeabler Produkte wie folgt durchgeführt: Zu einer Lösung aus 10,0 g (48 mmol) L-Phenylalaninmethylester und 6,0 g (35 mmol) N-Formyl-(β-methyl)-L-asparaginsäure in 100 ml deionisiertem Wasser, eingestellt auf einen pH-Wert von 7,0, wurden 770 mg Thermolysin (Daiwa Chemical Company, Osaka, Japan) hinzugefügt, die insgesamt 1,2 · 10&sup6; proteolytischen Einheiten entsprechen. Die resultierende Lösung wurde für 1 h bei 40ºC inkubiert, wonach HPLC-Analyse das Vorliegen von 383 mg N-Formyl-(β-methyl)-asp-phe-OMe anzeigte. Die Lösung wurde auf 25ºC abgekühlt, der pH-Wert auf 5,0 eingestellt, und die Lösung wurde in einen 200-ml- Behälter 40 gegeben, der mit der Rohrseite 46 des Hohlfaserseparators 44 ("Type 2 Hollow Fiber Selective Dialysis Membrane", Bend Research, Inc.) verbunden war, die 900 cm² (1 Fuß²) einer hydrophoben Flüssigmembran enthielt, die aus 30% N,N-Diethyl-dodecanamid in Dodecan hergestellt war. Die Mantelseite 48 des Separators 44 wurde als ein in Fig. 9 dargestellter geschlossener Kreislauf angeordnet, der aus einer Serie von Verbrückungsbehältern hergestellt war. Die Lösung, die zu dem Separator 44 zurückfließt, wurde auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt, um das L-Phe-OMe, das mit dem Dipeptid N-Formyl-(β-methyl)-asp-phe-OMe mitwandert, zu protonieren. Zirkulation durch eine Dowex®50- (Na&spplus;)-Säule 50 entfernte das positiv geladene L-Phe-OMe, wobei das ungeladene Dipeptid in der Lösung zurückblieb. Der Abfluß wurde auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und der Einwirkung der über DEAE-Sephadex® 52 immobilisierten Aminoacylase I ausgesetzt [T. Tosa, T. Mori und I. Chibata, Agr. Biol. Chem. 33, 1053 (1969)]. Das resultierende Dipeptid N-Formyl-(β-methyl)-asp-phe war bei diesem pH-Wert negativ geladen und wurde anschließend durch das Dowex®1-(Cl&supmin;)-Harz 54 festgehalten. Der Abfluß wurde vor der Einstellung des pH-Werts auf 4,0 zu dem Membranseparator zurückgeführt, wodurch der Kreislauf geschlossen wurde.
Die Rohr- 46 (100 ml) und Mantelphase 48 (500 ml) wurden mit den Geschwindigkeiten von 50 ml/min (Rohrphase) und 120 ml/min (Mantelphase) bei 25ºC im Gegenstrom durch den Membranseparator zirkuliert.
Periodische Probeentnahme aus der Mantelphase wurde an dem Abfluß von dem zweiten Enzym (E&sub2;) durchgeführt (Fig. 9, Probeentnahmestelle 56, vor dem Eintritt in die Dowex®1- (Cl&supmin;)-Säule 54), und die Proben wurden gemäß den in Beispiel 5 beschrieben Verfahren durch HPLC überwacht. Wie erwartet wurde an diesem Punkt des Kreislaufes (Fig. 9) kein L-Phe, das aus der enzymatischen Hydrolyse von L-Phe-OMe durchs E2 (siehe Beispiel 8) stammen könnte, gefunden; es wurde nur ein zirkulierendes Gleichgewichtsniveau des N-Formyl-(βmethyl)-asp-phe (Durchschnittskonzentration: 54 mg/l) beobachtet, das den kontinuierlichen Transfer des Dipeptides N-Formyl-(β-methyl)-APM durch die Membran und dessen anschließende Hydrolyse durch E&sub2; wiederspiegelt. Das wirkungsvolle Einfangen des geladenen Dipeptids durch das Dowex®-1-Harz wird durch dessen niedrige Konzentration angezeigt, die am Punkt A während des gesamten Versuchs beobachtet wurde. Ein ähnlicher paralleler Versuch, der ohne Dowex®-1 durchgeführt wurde, zeigte die schnelle Akkumulation von N-Formyl-(β-methyl)-asp-phe-Peptid in der Mantelphase, wie aus den Ergebnissen, die oben diskutiert wurden, erwartet werden konnte. Wieder wurde kein L-Phe in der zirkulierenden Mantelphase gefunden. Ein Vergleich der beiden Versuche ist in Fig. 10 und Tabelle IX zu sehen. Tabelle IX mg N-Formyl-(β-methyl)-asp-phe/Mantelphase Zeit (min) Bsp. 1: mit Dowex®1 ohne
Zusätzlich zur Abtrennung von Phenylalanin-Niederalkylester, der die Ionen abweisende Membran in die Produktmischung hinein mitdurchdringt, unter Verwendung von Ionenaustauscherharzen, wie in diesem Beispiel beschrieben, kann Asparaginsäure, die die Ionen abweisende Membran in die Produktmischung hinein mitdurchdringt, unter Verwendung solcher Harze abgetrennt werden. Die Spezies oder das Produkt, das nicht durch die Membran aus der Produktmischung zurückdiffundieren kann, kann unter Verwendung solcher Ionenaustauscherharze entfernt werden. Auch andere in der Fachwelt bekannte Trennverfahren können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, die Elektrophorese, Elektrodialyse und Membrantrennungen, die Äquivalente der Ionenaustauscherharztrennungen sind, umfassen, aber nicht darauf beschränkt sind.
Immobilisierung des Kondensationsenzyms ermöglicht, daß die enzymatische Umsetzung in der Rohrphase bei einem pH-Wert der Ausgangsreaktionsmischung durchgeführt wird, der für die optimale Wirksamkeit der enzymatischen Reaktion bevorzugt ist, unter Berücksichtigung der Reaktanten, des (der) Produkt(e) und Enzyms, einschließlich des erwünschten Gleichgewichts der enzymatischen Reaktion. Gegebenenfalls kann vor dem Kontakt mit der Membran der pH-Wert der Ausgangsreaktionsmischung in der Rohrphase auf einen zweiten Reaktionsmischungs-pH-Wert nachgeregelt werden, so daß der zweite Reaktionsmischungs-pH-Wert die Membranwirksamkeit für den Transport des ungeladenen Produkts aus der Rohrphase durch die Membran in die Mantelphase maximieren wird. Fig. 9 zeigt nicht, daß der pH-Wert der Ausgangsreaktionsmischung in der Rohrphase auf einen zweiten Reaktionsmischungs-pH-Wert eingestellt wird.
Ähnlich kann die Esterase in der Mantelphase immobilisiert werden, und der pH-Wert der Produktmischung in der Mantelphase kann eingestellt und nachgeregelt werden, wie es notwendig ist, um das wirksamste Verfahren zu bewirken. Beispiel 8 und das obige Beispiel stellen zusätzliche Mittel für die wirkungsvolle kontinuierliche oder diskontinuierliche Durchführung unter Verwendung der vorliegenden Erfindung zur Verfügung. Bei kontinuierlicher Durchführung kann das erwünschte Enantiomere der Reaktanten und jegliche mitwandernde Verbindungen in die Rohrphase oder Reaktionsmischung zurückgeführt werden

Industrielle Anwendbarkeit

Die vorliegende Erfindung kann verwendet werden, um Aspartam ebenso wie andere Peptide, einschließlich Peptide, die pharmakologisch wirksam sind, herzustellen.
Während spezifische Ausführungsformen der Erfindung gezeigt und im Detail beschrieben wurden, um die Anwendung der erfinderischen Prinzipien zu zeigen, wird verstanden werden, daß die Erfindung auf andere Weise ausgeführt werden kann, ohne von diesen Prinzipien abzuweichen.

Claims

1. Ein Verfahren für die enzymatische Synthese von Peptiden umfassend die Schritte:

enzymatisch erste und zweite Aminosäureverbindungen in einer wäßrigen Ausgangsreaktionsmischung unter Bildung einer ungeladenen Verbindung zu kondensieren,

die ungeladene Verbindung durch Diffusion in eine wäßrige zweite Reaktionsmischung durch eine Membran, die wesentliche Mengen der Aminosäureverbindungen nicht transportieren wird, zu transportieren, und

die transportierte ungeladene Verbindung in eine Form zu überführen die nicht durch die Membran in die Ausgangsreaktionsmischung zurücktransportiert werden kann.

2. Das in Anspruch 1 dargestellte Verfahren, worin das Produkt des Prozesses ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Met-Enkephalin, Granicidin S, Angiotensin, Substanz P, Eledoisin caerulein und Leu-Enkephalin.

3. Ein Verfahren für die enzymatische Synthese von Peptiden umfassend die Schritte:

enzyinatisch erste und zweite Aminosäureverbindungen in einer wäßrigen Ausgangsreaktionsmischung unter Bildung einer ungeladenen Verbindung zu kondensieren,

die ungeladene Verbindung durch die Diffusion in eine wäßrige zweite Reaktionsmischung durch eine Membran, die wesentliche Mengen der Aminosäureverbindungen nicht transportieren wird, zu transportieren,

die transportierte ungeladene Verbindung in eine Form zu überführen, die nicht durch die Membran in die Ausgangsreaktionsmischung zurücktransportiert werden kann, und

die Verbindungsform, die nicht durch die Membran in die Ausgangsreaktionsmischung zurücktransportiert werden kann, zu entfernen.

4. Das in Anspruch 3 dargestellte Verfahren, weiterhin umfassend den Schritt, die erste Aminosäureverbindung, die die Membran mit der ungeladenen Verbindung in die wäßrige zweite Reaktionsmischung mitdurchdringt, aus der wäßrigen zweiten Reaktionsmischung abzutrennen.

5. Das in Anspruch 3 dargestellte Verfahren, weiterhin umfassend den Schritt, die zweite Aminosäureverbindung, die die Membran mit der ungeladenen Verbindung in die wäßrige zweite Reaktionsmischung mitdurchdringt, aus der wäßrigen zweiten Reaktionsmischung abzutrennen.

6. Das in Anspruch 4 dargestellte Verfahren, weiterhin umfassend den Schritt, die erste Aminosäureverbindung, die die Membran mit der ungeladenen Verbindung mitdurchdringt, in die wäßrige Ausgangsreaktionsmischung zurückzuführen.

7. Das in Anspruch 5 dargestellte Verfahren, weiterhin umfassend den Schritt, die zweite Aminosäureverbindung, die die Membran mit der ungeladenen Verbindung mitdurchdringt, in die wäßrige Ausgangsreaktionsmischung zurückzuführen.

8. Ein Verfahren für die enzymatische Synthese von Peptiden, umfassend die Schritte:

eine N-Acyl-β-substituierte L-Asparaginsäure mit einer α-Carboxylatgruppe mit einem Phenylalanin-Niederalkylester mit einer α-Ammoniumgruppe in einer wäßrigen Reaktionsmischung, die ein Kondensationsenzym umfaßt, zu kondensieren unter Bildung von N-Acyl-L-aspartyl-(β-substituiert)-L- phenylalanin-Niederalkylester, einem ungeladenen Peptid, das ungeladene Peptid aus der wäßrigen Reaktionsmischung durch eine Ionen abweisende Membran in eine Produktmischung durch Diffusion zu transportieren, und

das ungeladene Peptid in der Produktmischung in eine Spezies zu überführen, die nicht durch die Membran zurückdiffundieren kann.

9. Das in Anspruch 8 dargestellte Verfahren, weiterhin umfassend den Schritt, die Spezies, die nicht durch die Membran zurückdiffundieren kann, aus der Produktmischung zu entfernen.

10. Das in Anspruch 8 dargestellte Verfahren, worin das Kondensationsenzym eine peptidbildende Protease ist, die in einem pH-Bereich von ungefähr 4,0 bis 9,0 wirksam ist.

11. Das in Anspruch 10 dargestellte Verfahren, worin das ungeladene Peptid in eine geladene Spezies durch Spaltung mit einem Esteraseenzym überführt wird.

12. Das in Anspruch 11 dargestellte Verfahren, worin das Esteraseenzym in einem pH-Bereich von ungefähr 6,0 bis 9,0 wirksam ist.

13. Das in Anspruch 11 dargestellte Verfahren, worin das Esteraseenzym ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Aminoacylase I, α-Chymotrypsin und Subtilisin A.

14. Das in Anspruch 11 dargestellte Verfahren, worin das Esteraseenzym Aminoacylase I ist, und der pH-Wert der Reaktionsmischung ungefähr 7,0 ist.

15. Das in Anspruch 10 dargestellte Verfahren, worin die Membran eine mit Wasser nicht mischbare organische Flüssigkeit umfaßt die durch Kapillarwirkung in Poren in einer mikroporösen Folie immobilisiert ist, wobei die organische Flüssigkeit ein Lösungsmittel für das ungeladene Peptid ist.

16. Das in Anspruch 15 dargestellte Verfahren, worin die mikroporöse Folie aus einem Material gemacht ist, das aus einer Gruppe, bestehend aus Polytetrafluorethylen und Polypropylen, ausgewählt ist, und das Lösungsmittel zumindest eine Verbindung umfaßt, die ausgewählt ist aus einer Gruppe, bestehend aus n-1-Decanol, n-Hexadecanol, n-Dodecanol, N,N-Diethyl-dodecanamid, Dodecan, 2-Undecanon und Mischungen davon.

17. Das in Anspruch 15 dargestellte Verfahren, worin die mikroporöse Folie Polypropylen-Hohlfasern umfaßt, und das Lösungsmittel N,N-Diethyl-dodecanamid und Dodecan umfaßt.

18. Das in Anspruch 15 dargestellte Verfahren, worin die Membran eine Bend, Typ 2 selektive Hohlfaserdialysemembran ist.

19. Das in Anspruch 10 dargestellte Verfahren, worin das Kondensationsenzym immobilisiert ist.

20. Das in Anspruch 19 dargestellte Verfahren, worin das Kondensationsenzym Thermolysin ist, und der pH-Wert der Reaktionsmischung ungefähr 7,0 ist.

21. Das in Anspruch 19 dargestellte Verfahren, weiterhin umfassend den Schritt der Nacheinstellung des pH-Wertes der Reaktionsmischung auf einen pH-Wert von ungefähr 5,0 vor dem Transport des ungeladenen Peptids von der Reaktionsmischung durch die Ionen abweisende Membran.

22. Das in den Ansprüchen 9 oder 10 dargestellte Verfahren, weiterhin umfassend den Schritt, die N-Acyl-β-substituierte L-Asparaginsäure, die die Ionen abweisende Membran in die Produktmischung mitdurchdringt, abzutrennen.

23. Das in den Ansprüchen 9, 10 oder 22 dargestellte Verfahren, weiterhin umfassend den Schritt, Phenylalanin- Niederalkylester, der die Ionen abweisende Membran in die Produktmischung mitdurchdringt, abzutrennen.

24. Das in Anspruch 8 dargestellte Verfahren, worin das Kondensationsenzym eine peptidbildende saure oder neutrale Protease ist, die in einem pH-Bereich von ungefähr 4,0 bis 8,0 wirksam ist.

25. Das in Anspruch 8 dargestellte Verfahren, worin das Kondensationsenzym eine Protease ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Serinproteinasen, Thiolproteinasen, Carboxylproteinasen und Metallproteinasen.

26. Das in Anspruch 8 dargestellte Verfahren, worin das Kondensationsenzym ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Chymotrypsin, Trypsin, Substilisin BNP, Achromobacter- Protease, Papain, Pepsin, Thermolysin und Prolisin, und der pH-Wert der Reaktionsmischung zwischen ungefähr 4,0 bis 8,0 ist.

27. Das in Anspruch 8 dargestellte Verfahren, worin das Kondensationsenzym Thermolysin ist, und der pH-Wert der Reaktionsmischung ungefähr 5,5 ist.

28. Das in Anspruch 26 dargestellte Verfahren, worin die Membran eine mit Wasser nicht mischbare organische Flüssigkeit umfaßt, die durch Kapillarwirkung in Poren in einer mikroporösen Folie immobilisiert ist, wobei die organische Flüssigkeit ein Lösungsmittel für das ungeladene Peptid ist.

29. Das in Anspruch 28 dargestellte Verfahren, worin die mikroporöse Folie aus einem Material gemacht ist, das ausgewählt ist aus eine Gruppe, bestehend aus Polytetrafluorethylen und Polypropylen, und das Lösungsmittel zumindest eine Verbindung ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus n-1-Decanol, n-Hexadecanol, n-Dodecanol und Mischungen davon, umfaßt.

30. Das in Anspruch 28 dargestellte Verfahren, worin die Membran eine Bend, Typ 1 selektive Hohlfaserdialysemembran ist.

31. Das in den Ansprüchen 25 oder 26 dargestellte Verfahren, worin der pH-Wert der wäßrigen Lösung zwischen ungefähr 4,0 und 6,0 ist.

32. Das in den Ansprüchen 10 oder 27 dargestellte Verfahren, worin die erste Verbindung D,L-Phenylalaninmethylester ist, und die zweite Verbindung N-Acyl-β-substituierte L-Asparaginsäure mit einer α-Carboxylatgruppe ist.

33. Das in Anspruch 32 dargestellte Verfahren, worin die N-Acyl-Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus OCH&sub2;OCO-, -CH=O und OCH&sub2;CO-, und der β-Substituent ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus OCH&sub2;O-, tert.- BuO-, CH&sub3;O-, NH&sub2;-.

34. Ein Verfahren für die enzymatische Trennung racemischer D,L-Aminosäureverbindungen, umfassend die Schritte:

eine racemische D,L-Aminosäureesterverbindung in einer wäßrigen Reaktionsmischung, die ein Hydrolyseenzym umfaßt, zu hydrolysieren unter Bildung einer geladenen enantiomeren Verbindung, die eine L-Aminosäureverbindung ist, und einer ungeladenen enantiomeren Esterverbindung, die eine D- Aminosäureesterverbindung ist, in der wäßrigen Reaktionsmischung, und

die ungeladene enantiomere Esterverbindung aus der wäßrigen Reaktionsmischung durch eine Ionen abweisende Membran in eine Produktmischung durch Diffusion zu transportieren, und umfassend den Schritt, die ungeladene D-Aminosäureesterverbindung in der Produktmischung in eine Spezies zu überführen, die nicht durch die Membran zurückdiffundieren kann.

35. Das in Anspruch 34 dargestellte Verfahren, worin der Schritt der Überführung die Einstellung des pH-Wertes der Produktmischung auf einen pH-Wert von ungefähr 2,0 ist.

36. Das in Anspruch 34 dargestellte Verfahren, worin das Hydrolyseenzym ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Aminoacylase I, α-Chymotrypsin und Subtilisin A.

37. Das in Anspruch 34 dargestellte Verfahren, worin das Hydrolyseenzym immobilisiert ist.

38. Das in Anspruch 34 dargestellte Verfahren, worin die Membran eine mit Wasser nicht mischbare organische Flüssigkeit umfaßt, die durch Kapillarwirkung in Poren in einer mikroporösen Folie immobilisiert ist, wobei die Organische Flüssigkeit ein Lösungsmittel für das ungeladene Peptid ist.

39. Das in Anspruch 38 dargestellte Verfahren, worin die mikroporöse Folie aus einem Material gemacht ist, das aus einer Gruppe, bestehend aus Polytetrafluorethylen und Polypropylen, ausgewählt ist, und das Lösungsmittel zumindest eine Verbindung umfaßt, die ausgewählt ist aus einer Gruppe, bestehend aus n-1-Decanol, n-Hexadecanol, n-Dodecanol, N,N-Diethyl-dodecanamid, Dodecan, 2-Undecanon und Mischungen davon.

40. Das in Anspruch 38 dargestellte Verfahren, worin die mikroporöse Folie Polypropylen-Hohlfasern umfaßt, und das Lösungsmittel N,N-Diethyl-dodecanamid und Dodecan umfaßt.

41. Das in Anspruch 38 dargestellte Verfahren, worin die Membran eine Bend, Typ 2 selektive Hohlfaserdialysemembran ist.

42. Das in Anspruch 34 dargestellte Verfahren, worin die D, L-Aminosäureesterverbindung D,L-Phenylalanin- Niederalkylester mit einer α-Ammoniumgruppe ist.

43. Das in Anspruch 42 dargestellte Verfahren, worin der D,L-Phenylalanin-Niederalkylester D,L-Phenylalaninmethylester ist.

44. Das in Anspruch 34 dargestellte Verfahren, weiterhin umfassend die Schritte:

enzymatisch die geladene L-Aminosäureverbindung mit einer zweiten Aminosäureverbindung in einer wäßrigen Ausgangsreaktionsmischung unter Bildung einer ungeladenen Verbindung zu kondensieren,

die transportierte ungeladene Verbindung in eine Form, die nicht durch die Membran in die Ausgangsreaktionsmischung zurücktransportiert werden kann, zu überführen.

45. Das in Anspruch 44 dargestellte Verfahren, weiterhin umfassend den Schritt, die Aminosäureverbindungen, die die Membran in die wäßrige zweite Reaktionsmischung mitdurchdringen, abzutrennen.