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Verfahren zur Trennung eines wässrigen Lösungsgemisches
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durch Elektrodialyse
Verfahren zur Trennung eines
wässrigen Lösungsgemisches durch Elektrodialyse Die Erfindung betrifft ein verbessertes
Verfahren zur Trennung von essentiellen Aminosäuren von ihren Derivaten.
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Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Trennung
von essentiellen Aminosäuren und ihrer Derivate durch Elektrodialyse, insbesondere
als Verfahrensschritt bei der Aufspaltung von optischen Stereoisomeren der Aminosäuren,
die durch stereospezifische enzymatische Hydrolyse erhalten wurden, wobei ein hoher
Reinheitsgrad jeder Trennungskomponente und hohe quantitative Ausbeute wesentlich
sind.
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Essentielle Aminosäuren sind bekanntlich für die menschliche und tierische
Ernährung wesentlich, und der Ausdruck "essentielle Aminosäuren" soll dabei in diesem
Sinne verstanden werden. Beispiele für solche Aminosäuren sind Lysin, Tryptophan,
Histidin, Phenylalanin, Leucin, Isoleucin, Threonin, Methionin, Valin und Arginin.
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Die Anwendung der Elektrodialyse zur Reinigung und Auflösung wässriger
Aminosäurelösungen ist an sich bekannt, und verschiedene Verfahren unter Anwendung
der Elektrodia-lyse für diesen Zweck sind in den US-PS 3- 051 64a, 3 231 4:85-,
3 459 650, 3 330 749 und 3 398 078 sowie in der israe11s-cl#ien
Patentschrift
16 270 beschrieben.
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Obgleich die Anwendung der Elektrodialyse für den vorstehend genannten
Zweck somit an sich nicht mehr neu ist, lassen sich die in den genannten Patentschriften
beschriebenen Verfahren in drei verschiedene Gruppen unterteilen: 1. Trennung eines
Gemisches verschiedener Aminosäuren, von Proteinhydrolysaten erhalten.
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2 Entfernung anorganischer Salze aus einer Aminosäurelösung.
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3. Reinigung von Aminosäuren von anorganischen und organischen übelriechenden
und gefärbten Verunreinigungen.
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Aus den genannten Patentschriften geht hervor, daß im Hinblick darauf,
daß am isoelektrischen Punkt eine Aminosäure die höchste Konzentration der Aminosäure
in nicht-ionischer Form vorhanden ist, Versuche angestellt worden sind, den pH-Wert
auf den spezifischen isoelektrischen Punkt einzustellen und damit die Konzentration
anderer ionischer Formen der Aminosäure zu reduzieren und dadurch die durch Auswanderung
der Ionen durch die Ionenaustauschmembranen verursachten Verluste zu verringern.
Die genannten Patentschriften, welche die Einstellung des pH-Werts in der Zufuhrkammer
als Teil des offenbarten Verfahrens beschreiben, stützen sich folglich auf die Neutralisierung
der Ladung der Aminosäure durch Einstellung des pH-Wertes der Gesamtlösung
möglichst
genau auf den isoelektrischen pH-Wert der Säure, die in der Speisezelle erhalten
bleiben soll. Es hat sich jedoch herausgestellt, daß die Entsalzung von Aminosäurelösungen
nach diesem Verfahren zu einem erheblichen Säureverlust von bis zu 20 % führt, sofern
keine spezielle pH-Fallenkammern oder andere entsprechende Einrichtungen in der
Konstruktion der Elektrodialyse-Zellenbatterie vorgesehen werden (iaraelische Patentschrift
16 270).
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Bei den bisherigen Verfahren ist der Aminosäureverlust zwei verschiedenen
Mechanismen zuzuschreiben: a) Eine Diffusion der zwitterionischen #ngeladenen) Form
der Aminosäure durch die Membranen und b) eine Elektrowanderung der geladenen Formen
der Aminosäure, die im Gleichgewicht mit der zwitterionischen Form vorliegen.
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Da in der Zufuhrkammer erhebliche Konzentrationen dieser geladenen
Formen zu finden sind, selbst wenn die Aminosäure auf ihrem isoelektrischen pH-Wert
gehalten wird, können diese geladenen Formen frei durch die Membranen hindurch wandern,
so daß sie zu den genannten Verlusten beitragen.
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Durch Abscheidung von organischen Verunreinigungen können vergleichsweise
reine Aminosäuren erhalten werden, doch
ist auch in diesem Fall
dieses letztgenannte Verfahren bezüglich der Verluste von Aminosäure zusammen mit
Verunreinigungen nur in Fällen anwendbar, in denen die Verunreinigungen nur in Spurenkonzentrationen
vorhanden sind.
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Im Gegensatz zu den oben genannten Verfahren wird erfindungsgemäß
die Abtrennung von Aminosäuren von ihren Derivaten sowie von anorganischen Salzen
von einer wesentlichen Verbesserung dahingehend begleitet, daß hochreine Produkte
mit hoher Ausbeute von einem Gemisch abgetrennt werden können, das einen großen
Überschuß an anorganischen und organischen gelösten Stoffen enthält.
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Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren beruht die Trennung der Aminosäure
von z. B. einem Esterderivat derselben auf den amphoteren Eigenschaften der Aminosäure
oder auf den amphoteren Eigenschaften des Derivats einer geladenen Aminosäure, wie
Lysin, Histidin und Arginin.
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Die Trennung beruht, genauer gesagt, auf der Tatsache, daß die Ladung
der amphoteren Komponente eines Gemisches, das eine essentielle Aminosäure und ein
Derivat derselben als Komponenten enthält und wobei die eine Komponente in geladener
Form und die andere Komponente in amphoterer Form vorliegen, von einer positiven
auf eine negative Polarität geändert werden kann, indem der pH-Wert der Lösung unter
oder über den isoelektrischen Punkt der amphoteren Komponente
eingestellt
wird. Wenn das Elektrodialysesystem mit hohen Stromdichten nahe an der Grenzs-tromdichte
betrieben wird, d.h. bei einer Stromdichte, bei welcher eine deutliche Zersetzung
von Wasser an den Elektrodialysenmembranen auftritt und hierdurch lokale pH-Wertänderungen
über die Oberflächen der Membranen hinweg hervorgerufen werden, entstehen beträchtliche
lokale pH-Wertänderungen im Bereich der Membranen aufgrund des Transports von H
und OH durch die Kation- und Anionaustauschmembranen. Auf diese Weise werden durch
Einstellung der elektrischen Stromdichte auf einen Wert nahe an der Grenzstromdichte
für die angewandte Durchflußmenge und die vorhandene Lösungskonzentrat ion Konzentrationspolarisationsbedingungen
erzeugt, wobei die Wasserzersetzung bzw. -aufspaltung im Bereich der Membranen an
letzteren eine pH-Schranke aufbaut, welche die amphotere Komponente nicht durch
die Membranen hindurchtreten läßt.
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Diese pH-Schranken können zur Erzielung einer scharfen Trennung zwischen
beispielsweise amphoteren essentiellen Aminosäuren und ihren geladenen Derivaten
oder anderen Ionen nach dem folgenden Mechanismus ausgenutzt werden: An oder nahe
einer Kationaustauschmembran f durch welche Protonen beseitigt werden, steigt der
pH-Wert an, und die Aminosäure wird negativ geladen Demzufolge wird sie durch das
elektrische Feld an die Anionaustauschmembran angezogen, an welcher sie positiv
geladen und wieder
zur Kationaustauschmembran abgestoßen wird.
Andererseits werden aufgeladene Derivate der Aminosäure durch das elektrische Feld
abgetrennt. Durch die Polarisation, die normalerweise eine Störung darstellt, wird
somit die Trennung verbessert.
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Vorhandene anorganische Salze werden aus der Zufuhrkammer gleichzeitig
mit dem Ester abgeschieden, wobei der Ester zusammen mit den Kationen des Salzes
durch die Kationenaustauschmembran hindurchtritt, während die Anionen des Salzes
durch die Anion-Austauschmembran hindurchtransportiert werden,so daß die sowohl
von Ester als auch von anorganischen Elektrolyten befreite Aminosäure zurückbleibt.
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Ein zu hoher oder zu niedriger pH-Wert in der Gesamtlösung oder in
der Nähe der Membrane kann nachteilig sein, weil dadurch die Zersetzung einiger
instabiler Derivate der Aminosäuren (Ester) hervorgerufen werden kann. Außerdem
können bei solchen extremen pH-Werten die an den Membranflächen erzeugten pH-Schranken,
die für die Zurückhaltung der Aminosäuren verantwortlich sind, möglicherweise neutralisiert
werden, wodurch die Ausbeute der Säuregewinnung verringert wird. Es ist daher wesentlich,
den pH-Wert der Gesamtmasse dicht am Neutralwert zu halten, und zwar unabhängig
von der Größe des isoelektrischen pH-Werts beispielsweise der Aminosäure oder des
amphoteren Derivats im Fall einer geladenen Aminosäure.
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Die Grenzbedingungen, bei denen die genannte Aufspaltung des Wassers
auftritt, sind in der Literatur genau definiert und können mittels der Stromdichte
sowie der Strömungshydrodynamik in eine Elektrodialysezelle gesteuert werden. Der
pH-Wert der Masse kann innerhalb der -erforderlichen Grenzen durch kontinuierliche
Zugabe einer Base oder Säure in die entsalzte Kammer eingestellt werden.
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Aufgabe der Erfindung- ist damit die Schaffung eines Verfahrens für
die durch Elektrodialyse erfolgende Trennung eines wässrigen Lösungsgemisches mit
einer essentiellen Aminosäure und einem Derivat dieser Säure als Komponenten, wobei
die eine Komponente in geladener Form und die andere Komponente in amphoterer Form
vorliegen, in mindestens zwei getrennte Produktlösungen von Säure und Derivat, von
denen mindestens eine Lösung ein in hoher quantitativer Ausbeute gewonnenes, hochreines
Produkt enthält. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß eine Elektrodialyse-Zellenbatterie
vorgesehen wird, die vorzugsweise aus einer Reihe schmaler Kammern besteht, die
abwechselnd durch Kation-und Anion-Austauschmembranen voneinander getrennt sind,
welche ihrerseits zwischen einem einzigen Elektrodenpaar angeordnet sind, daß in
die Speisezellen der Zellenbatterie kontinuierlich eine Speiselösung eingeführt
wird, die eine essentielle Aminosäure und ihr abzutrennendes Derivat enthält, daß
die Strömungs- bzw. Durchsatzmenge
und Konzentration der Lösung
sowie die Dichte des angelegten elektrischen Stroms auf Werte eingestellt werden,
bei denen Konzentrationspolarisationsbedingungen an den Membranen in den S#peisezellen
entstehen, so daß sich eine hohe lokale Konzentration von Protonen auf der Oberfläche
der Anion-Austauschmembranen und eine hohe lokale Konzentration von Hydroxylionen
an den Kation-Austauschmembranen ansammeln, und daß der pH-Wert der Gesamtlösung
in den Speisezellen unabhängig vom isoelektrischen Punkt der amphoteren Komponente
im Bereich vom 4 - 8 gehalten wird, um pH-Wertänderungen der Gesamtlösung auszugleichen,
die aufgrund ungleicher Größen der Wasseraufspaltung an den Kation- und Anion-Austauschmembran
auftreten.
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Vorzugsweise wird der pH-Wert der Gesamtlösung in der Speisezelle
dadurch innerhalb des gewünschten Bereichs gehalten, daß kleine Mengen einer Säure
oder Base in die Speisezelle eingeführt werden; besonders bevorzugt ist dabei ein
pH-Wertbereich zwischen etwa 5 und 7.
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Das erfindungsgemäße Verfahren ist zweckmäßig für die Trennung von
Aminosäuren von Estern oder Acylderivaten dieser Säuren, wie sie nachstehend noch
näher definiert werden sollen, und das Verfahren kann vorzug-sweise dann angewandt
werden, wenn die Aminosäuren und die Derivate verschiedene Stereoisomere sind, so
daß beispielsweise eine L-Aminosäure von einem D-Derivat derselben abgetrennt werden
kann und
umgekehrt.
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Nachstehend sind bevorzugte Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand
der beigefügten Zeichnung näher erläutert. Es zeigen: Figur 1 eine schematische
Darstellung einerElektrodialysezelle mit sechs Kammern zur Durchführung des erfindungsgemäßen
Verfahrens und Figur 2 eine schematische Darstellung einer eine Vielzahl von Zellenkammern
aufweisenden Elektrodialyse-Zellenbatterie zur Durchführung des erfindungsgemäßen
Verfahrens.
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Figur 1 veranschaulicht schematisch eine Elektrodialysezelle für die
in Beispiel 1 und 2 beschriebene Trennung, bestehend aus sechs Kammern bzw. Zellen,
wobei die Zellen 1 und 2 mit 0,1 M NaCl gefüllte Elektrodenzellen, die Zellen 3
mit 0,01 M Puffer (pH-Wert 7,5) zur Verhinderung eines Lösungsverlustes aus den
Anoden- und Ka2Ddenzellen gefüllte Zwischenzellen, die Zelle 4 eine Speisezelle,
welche die Speiselösung mit einer Aminosäure (A-+) und ihrem Ester (E+) enthält,
und Zelle 5 eine Durchdringungszelle für eine Durchdringungslösung (permeate solution)
die einen trasportierten bzw, überführten Ester enthält, darstellen und durch Kation-
und Anion-Austauschmembranen 6 bzw. 7 voneinander getrennt sind.
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Obgleich die Erfindung nachstehend anhand der folgenden Beispiele
und der Figuren in verschiedenen Ausführungsbeispielen erläutert ist, ist sie keineswegs
hierauf beschränkt.
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Vielmehr soll die Erfindung alle innerhalb des Schutzumfangs liegenden
Änderungen, Abwandlungen und Äquivalente mit einschließen. Die folgenden Beispiele
zur Erläuterung bevorzugter Ausführungsbeispiele sollen daher lediglich die praktische
Verwirklichung der Erfindung veranschaulichen, dabei aber die Erfindung keinesfalls
einschränken.
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Beispiel 1 Abtrennung von L-Tryptophan von L-Tryptophanmethylester
A) Die verwendete Zufuhr- bzw. Speiselösung enthielt jeweils 1o mM Phosphatpuffer
(pH = 7), Ester und Säure. An die Elektrodialysezellen gemäß Figur 1 wurde ein elektrischer
Strom mit einer Dichte von 5 mA/cm2 angelegt, und die Speiselösung wurde mit einer
linearen Strömungsges#chwindigkeit von etwa 1 cm/s umgewälzt. Während der ersten
15 Minuten konnte k#eine Änderung der Konzentration der Säure oder des Esters festgestellt
werden, während sich die Konzentration des Puffers in der Speisezelle 4 auf unter
1mM verringerte. Nach dieser Zeitspanne erfolgte eine vollständige Überführung des
Esters aus der Speisezelle 4 in die Durchdringungszelle 5 innerhalb einer Zeitspanne
von weiteren 15 Minuten, so daß in der Speisezelle eine 99,5 %
reine
Aminosäure zurückblieb. Der Säureverlust betrug weniger als 5 %.
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B) Die Trennung von L-Tryptophan und L-Tryptophanmethylester wurde
in derselben Zelle wie in Beispiel 1 wiederholt, dieses Mal jedoch ohne Zugabe eines
Puffers zur Speiselösung. Die Speisezelle enthielt eine Lösung aus 5 mM Tryptophan
und o,5 mM Tryptophanmethylester bei einem pH-Wert von 5,7 f 0,5.. Es wurde eine
vollständige Abtrennung des Esters von der Säure bei einer Säurereinheit von 99,8
% erzielt. In der Aufnahme bzw. Durchdringungszelle 5 wurde keine Säure festgestellt.
Der elektrische Widerstand des Systems-erhöhte sich während des Versuchs allmählich,
worauf eine Abnahme des Stromwirkungsgrads und eine Verringerung der Stromdichte
von der Anfangsgröße von 2,5 mA/cm2 auf etwa 0,2 mA/cm2 am Ende des Versuchs folgten.
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Beispiel 2 Trennung von L-Tryptophan von D-Tryptophanmethylester Die
Trennung und Isolierung von L-Tryptophan von D-Tryptophanmethylester geschah wie
folgt: Ein DL-Tryptophanmethylester (10 mM) in 0,02 M Phosphatpuffer (pH-Wert 7,5)
wurde durch eine Säule von Chymotrypsinsephadex-Teilchen gepreßt. Der Durchdringungsstoff
enthielt ein Gemisch von L-Tryptophan (5 mM), durch stereospezifische enzymatische
Hydrol#yse erhalten, und D-Tryptophanmethylester
(5 mM) sowie
20 mM Phosphatpuffer (pH-Wert 7,0). Dieses Gemisch wurde in eine Elektrodialysezelle
gemäß Beispiel 1 aufgetrennt. Ein elektrischer Strom mit einer Dichte von 5 mA/cm
wurde durch die Elektrodialysezelle geleitet, in welcher die Speiselösung mit einer
linearen Strömungsgeschwindigkeit von etwa 5 cm/s umgewälzt wurde.
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Am Ende des Versuchs wurde die in der Speisezelle enthaltene Säure
auf chemische und optische Reinheit untersucht. Sie wurde als eine Reinheit von
98,5 % besitzendes L-Tryptophan festgestellt.
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Die in Figur 2 schematisch dargestellte, bei den folgenden Beispielen
verwendete, eine Vielzahl von Zellen enthaltende Elektrodialyse-Zellenbatterie umfaßt
eine Anodenzelle 1 sowie eine Katbdenzelle 2 und eine Anzahl von einander abwechselnd
aufeinander folgenden Speisezellen 4 sowie Durchdringungszellen 5, die jeweils durch
Kation- und Anion-Austauschmembranen 6 bzw. 7 voneinander getrennt sind.
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Beispiel 3 Die Trennung zwischen L-Tryptophan und L-Tryptophanmethylester
wurde in der in Figur 2 schematisch dargestellten Elektrodialyse-Zellenbatterie
durchgeführt. 500 ml Speiselösung mit ungefähr 5 mM Tryptophan, ungefähr 0,5 mM
Tryptophanmethylester und 3 mM Phosphatpuffer (pH-Wert 6,5) wurden etwa 2 Stunden
lang bei einer anliegenden Stromdichte von 10 mA/cm2 durch die Zellenbatterie hindurch
umgewälzt. Die
lineare Umwälzgeschwindigkeit betrug dabei 10 cm/s.
Nach der angegebenen Zeitspanne wurden Speise- und Durchdringungslösung untersucht;
dabei wurden folgende Ergebnisse festgestellt: Esterkonzentation verringert von
0,42 mM auf 0,02 mM.
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Säurekonzentration verringert von 4,88 mM auf 4,50 mM, d.h. etwa
7,8. % Säureverlust.
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Keine anorganischen Salze am Ende des Versuchs in der Speisezelle
vorhanden.
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Chemische Reinheit des Tryptophans ist gleich 99,6 %.
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Abnahme der elektrischen Stromdichte von anfänglich 10 mA/cm2 auf
etwa 0,5 mA/cm2 bei einem konstanten Spannungsabfall von 50 V.
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Beispiel 4 Trennung von L-Methionin und N-Acetyl-D-Methionin Bei der
Elektrodialyse-Zellenbatterie gemäß Figur 2 enthielt jede Speisezelle jeweils 5
mM L-Methionin und 5 mM N-Acetyl-D-Methionin bei einem pH-Wert von ungefähr 6,5.
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Die Austreibung des negativ geladenen N-Acetyl-D-Methionins in die
Durchdringungszellen durch die anionischen Membranen hindurch wurde dadurch überwacht,
daß die Konzentration der Aminosäure mittels einer Ninhydrin-Reaktion in kleinen
Proben bestimmt wurde, die aus den Speise- und Durchdringungszellen entnommen wurden.
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Unter Einhaltung der Arbeitsbedingungen nach Beispiel 2 wurde eine
nahezu vollständige Abtrennungvon N-Acetyl-D-Methionin bei einem Stromwirkungsgrad
von 100 % erreicht.
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Die chemische Reinheit der Säure betrug 99,8 t; es wurde ein Säureverlust
von 4,5 % festgestellt.
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Beispiel 5 Trennungvon L-Histidin und D(&)-N-acetylhistidin Die
Trennung in der Elektrodialyse-Zellenbatterie erfolgte durch Füllung der Speisezelle
mit 10 mM L-Histidin, 10 mM D(#N-Acetylhistidin und 10 mM Phosphatpuffer (pH-Wert
6,0).
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Der pH-Wert wurde durch Titrieren der Speiselösung mit NaOH (0,5 M)
im Bereich von 5,0 - 6,0 gehalten. Dieser Wert liegt höher als der isoelektrische
pH-Wert von D(#>N-Acetylhistidin (PHiso = 3,91).
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2 Bei einer elektrischen Stromdichte von 10 mA/cm2 und einer Umwälzung
der Charge mit einer linearen Strömungsgeschwindigkeit von 10 cm/s wurde die positiv
geladene Aminosäure durch die Kation-Austauschmembranen aus den Speisezellen in
die Durchdringungszellen überführt, während das amphotere D(&)N-Acetylhistidin
in den Speisezellen verblieb.
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Bei vollständiger Trennung des L-Histidins aus den Speisezellen wurde
ein Verlust N-Acetylhistidin von weniger als 5 % festgestellt. Die optische Reinheit
des N-Acetylhistidins wurde mit größer als 95% ermittelt.
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Vergleichsbeispiel 6 Die in Beispiel 5 beschriebene Trennung wurde
wiederholt, wobei in diesem Falle der pH-Wert der Speiselösung nahe an den isoelektrischen
Punkt des D(&)-N-Acetylhistidins eingestellt wurde, nämlich auf 3,9. Bei einer
Stromdichte 2 von 10 mA/cm wurde die lineare Strömungsgeschwindigkeit in der Zellenbatterie
auf 10 cm/s erhöht. Eine Analyse der Durchdringungslösung ergab, daß ein Verlust
von etwa 30 % D(>)-N-Acetylhistidin aus der Speiselösung aufgetreten war.
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Obgleich vorstehend nur einige spezielle Ausführungsbeispiele der
Erfindung beschrieben sind, sind dem Fachmann selbstverständlich zahlreiche Änderungen
und Abwandlungen möglich, ohne daß vom Rahmen- und Grundgedanken der Erfindung abgewichen
wird.