CN87106791A

CN87106791A - 合成和分离肽的酶膜方法

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Publication number: CN87106791A
Application number: CN87106791.9A
Authority: CN
Inventors: 圭荚尔莫·A·亚科布奇
Original assignee: Coca Cola Co
Current assignee: Coca Cola Co
Priority date: 1986-08-18
Filing date: 1987-08-18
Publication date: 1988-05-04
Anticipated expiration: 2002-08-18
Also published as: GB8903271D0; EG18454A; KR900004070B1; GB2218991B; SG35491G; KR880701778A; CN1026498C; GR871290B; FI884359A; DK209388A; JPH06319592A; AR242264A1; WO1988001298A2; MX168598B; ES2007103A6; DE3789309D1; EP0321479A1; DE3789309T2; NZ231657A; AU7854387A

Abstract

本发明结合已知的方法，克服了中间体复合物的沉淀和/或酶迅速地减活问题。它提供了一种膜方法，适于移动化学平衡完成肽的合成。本发明公开了使用象酰化氨基酸水解酶I那样的酯酶酶转化不带电的物质。可以从产物混合物中分离出共渗反应物并且返回到反应混合物中。再者离子排斥膜也可以用来拆分包括D，L-氨基酸的外消旋羟酸对映体。

Description

本发明一般是关于使用一种对不带电的肽可渗透而对带电的肽可渗透而对带电的肽不渗透的膜合成和分离肽的酶方法，尤其是关于同时合成和纯化L，L-二肽，以及将其应用于制备L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯（天冬甜母）。

众所周知，从早期蛋白质化学以来，使用蛋白酶作缩合催化剂立体定向偶联两个氨基酸生成L，L-肽。早在1909年，Mohr和Strohschein描述了在降解酶蛋白质的木爪蛋白酶存在下，Bz-Leu-OH和H-Leu-NHz反应生成不溶于水的二肽Bz-Leu-Leu-NHz。E.Mohr和F.Strohschein Ber42，2521（1909）。Mohr和Strohschein的类型反应仅在那些形成肽键的氨基酸之间进行是可能的。这些形成的肽键对使用木瓜蛋白酶或其它酶解离敏感。的确，在氨基酸反应物和肽产物之间的缩合反应平衡很大程度上向反应的氨基酸的反应物方向移动。然而，假使二肽产物是不易溶解的，且从反应相中沉淀出来，由于质量作用能驱使缩合反应的完成。

由于某些肽商业使用的重要性以及公知的在温和条件下酶催化形成肽的事实，关于肽的酶合成，特别是简单的二肽合成进行了大量的研究。K.Oyama和K.Kihara，Kagaku Sosetsu 35.195（1982）;K.Oyama和K.Kihara，Chem Tech.14，100（1984）。

肽的衍生物天冬甜母（aspartame）合成方法在U.S.P 4，165，311中已做过介绍，此后称为“311”方法。它包括N-苄氧羰基-L-天冬氨酸与D，L-苯基丙氨酸甲酯嗜热菌蛋白酶催化缩合作用和一种中间复合物N-苄氧羰基-天冬甜母的D-苯基丙氨酸甲酯盐沉淀作用，以驱动反应到肽产物一侧。这种中间复合物进一步处理容许回收D-苯基丙氨酸甲酯，消旋后这些甲酯可重新循环使用。处理N-苄氧羰基-天冬甜母衍生物，退减N-苄氧羰基保护基团这些衍生物能转变成天冬甜母。“311”方法必须在分批基础上进行，这比较麻烦，而且使酶回收复杂化。也可参看K.Oyama，S.Irino，T.Harada和N.Hagi.Ann.N.Y.Acad.Sci 434，95（1985）。Willi Kullmann，Enzymatic Peptide Synthesis（1987）。

通过满足嗜热菌蛋白酶的活性部位施加于结构的需求并且通过促使中间复合物的不溶性而增加反应收率，在“311”方法中，N-苄氧羰基保护基团起主要的作用。在温和的条件下，可以进行从天冬甜母衍生物中消去N-苄氧羰基保护基团，即催化氢化作用防止甲基酯功能团解离。催化氢化涉及到大规模处理氢气的不便。

在化学文献中也已经描述过驱动酶缩合反应完成的其它方法。例如，已经发现有机溶剂作反应介质对增加肽产量收率有效，尽管它随酶稳定性下降已经使其不能大规模地实际运用。K.Oyama，S.Nishimura，Y.Nonaka，K.Kihara和T.Hashimato，J.Org.Chem 46，5241（1981）;H.Ooshima，H.Mori和Y.Harano，Biotechnology Ietters 7，789（1985），K.Nakanishi，T.Kamikubo和R.Matsuno，Biotechnology 3，459（1985）。

考虑到现有技术的工艺方法中用于肽的酶合成存在上述难解决的问题，特别是沉淀一种中间复合物和处理危险试剂的需要，将提供一种改进的方法避免这些困难的问题，同时安全地提供有效收率而不快速失去酶催化剂的活性。

本发明提供了一种合成和纯化一种化合物的方法，步骤包括偶联第一种反应物和第二种反应物以生成一种膜可运载的化合物;通过膜输送可运载的化合物而该膜不输送反应物，不可逆地把输送过去的化合物转变成一种通过膜无法逆向运载的形式。

本发明也提供一种酶合成和化合物纯化方法，步骤包括使用一种在含水混合物中缩合酶偶联第一种化合物和第二种化合物，第一种化合物包括一种质子化了的氨基团（铵），第二种化合物包括一种游离的羧酸酯基团，产生一种不带电（或非电离）被偶联的化合物;通过一种膜渗透从含水的混合物中持续去除不带电的被偶联的化合物，这种膜选择性地运载不带电被偶联化合物到膜的产物一侧。运载的偶联化合物最好是一种肽或其衍生物，它们转变成一种带电（或电离）的分子以致通过膜不发生逆向扩散。因而由于它不断地从中被去除，在反应混合物中有利于形成偶联的化合物产物。

本发明也提供一种肽衍生物酶的合成方法，如天冬甜母和其类似物的合成，步骤包括一种N-酰基-β-取代的-L-天冬氨酸和苯基丙氨酸低烷基酯缩合，前者有α-羧酸酯基团后者有α-铵基团，在包含一种缩合酶的含水反应混合物中缩合形成N-甲酰基-L-天冬氨酰-（β-被取代的）-L-苯基丙氨酸低烷基酯（即1-6个碳），一种不带电的肽;从含水的反应混合物中把不带电的肽通过一种选择通透膜输送到产物混合物中。

本发明也提供一种肽的酶合成方法，步骤包括在含水的初始反应混合物中缩合第一种和第二种氨基酸化合物以形成一种不带电的化合物;把这种不带电的化合物通过一种膜运载到含水的第二种反应混合物中，该膜不运载大量的氨基酸化合物;转化被运载过的不带电化合物为一种通过膜不能逆向运载到初始反应混合物的形式。被运载过的化合物，已转化成通过膜不能逆向运载的形式，可以从第二种反应混合物中除去。而且与不带电化合物共通透膜进入第二种反应混合物的第一种和第二种氨基酸化合物可从第二种反应混合物中分离出来，选择性地返回到初始反应混合物中。

本发明也提供一种氨基酸化合物酶拆分的一种方法，步骤包括：在一种水解酶在内的含水反应混合物中水解D，L-氨基酸化合物，在含水反应混合物中形成一种带电的L-氨基酸化合物和不带电的D-氨基酸化合物;把含水的反应混合物中的不带电的D-氨基酸化合物通过一种离子排斥膜运载到产物混合物中，因此促进拆分一种对映体。在产物混合物中可以积累不带电的D-氨基酸化合物并能用通常方法回收。这种氨基酸化合物酶拆分的方法可与上面讨论过的其它方法相结合。

本发明的目的之一是提供一种肽的酶合成方法，同时提供了肽产物的合成和纯化。

本发明的另一目的是提供一种肽及其衍生物，特别是天冬甜母安全、经济、有效的合成和纯化的方法。

本发明的另一目的是提供一种肽的酶合成经济方法，并提供高效利用酶和在持续的基础上进行合成的方法。

本发明还有一个目的是提供一种方法，该法尤其适用于使用D，L-苯基丙氨酸和N-保护基-β-取代基-天冬氨酸盐进行天冬甜母和其衍生物的酶合成，收率基本上定量。

通过本发明可以得到上述和另外的目的和优点，这可以在下面结合附图所做的详细介绍中清楚地看出。

图1是依据本发明天冬甜母的一种酶合成图示说明。

图2是运用本发明方法仪器图解说明。

图3是说明在例1和例2这段时间生成产物（天冬甜母衍生物）量的图。

图4是说明在例4这段时间形成产物（天冬甜母衍生物）量的图。

图5是说明在例5这段时间形成产物（天冬甜母衍生物）量的图。

图6是说明在例6这段时间形成产物（天冬甜母衍生物）量的图。

图7是说明在例7这段时间形成产物（天冬甜母衍生物）量的图。

图8是说明在例8这段时间形成产物（天冬甜母衍生物）量的图。

图9是运用本发明的仪器图解说明，它表明在例9描述产物一侧的容器。

图10是说明在例9这段时间使用或不使用离子交换树脂形成产物（天冬甜母衍生物）量的图。

此处揭示的本发明提供了一种在含水的反应混合物中驱动完成肽的酶合成，用膜的方式从反应混合物中分离不带电的肽中间体或衍生物的步骤，该膜选择性地运载反应混合物不带电的肽到产物混合物中。由于该膜对反应物（带电分子）基本上不通透，所以从反应混合物中除去肽中间体导致平衡时肽浓度降低，通过质量作用平衡把反应推向完成的方向。

本发明中使用的最好膜是固相液膜（ILM）。它包括一种在微孔载体材料中包埋的非极性液体。载体材料最好是聚合物层，基本上对酶反应和产物不可渗透。疏水的聚合物如聚丙烯是最好的载体材料。利用聚丙烯空心纤维可以制造ILM模件。Celgard，Celanese Corporation注册商标，1211 Avenue of the Americas，New york，N.Y.10036并且由Celanese Fibers Marketing Corporation，Charlotte，N.C出售，它是商业上能买到的聚丙烯空心纤维的一个例子。在现有技术中已知陶瓷制的化合物和聚氯乙烯管或试管可任意选择加工制ILM模件。加工微孔载体材料的另一种聚合物是TEFLON，一种E.I Dupont de Nemonrs & co的商标，适于氟化的烃聚合物。典型的一种微孔载体是GORE-TEX，W.C.Gore & Associates，Inc的商标。

微孔通过载体材料并依一定大小尺寸制造以至通过毛细作用束缚了固相液体，在通过膜时，受到如压差影响或处于其它正常反应条件时液体也不会逃逸。上述限制有利于使固相液体和反应混合物之间接触面积达到最大，使不带电的肽产物通过膜的运载速率（通量）最大。可以知道，最佳的孔大小根据特定的固相液，使用的反应物、生成的产物和类似因素的特性变化;本领域技术熟练的人凭经验能决定最适宜的大小孔。在U.S.P4，174，374中可以找到选择孔大小的有关讨论。在以下参考材料中介绍了固相液膜的使用和制备;S.L.Matson，J.A.Quinn，Coupling Separation and Enrichment to Chemical Conversion in a Membrane Reactor在AICHE Annual Meeting，New Orleans，Loni siana（November 8-12，1981）提出的论文和S.L.Matson and J.A.Quinn，Membrane Reactors in Bioprocessing.Ann.N.Y.Acad Sci 469，152（1986）。

在微孔载体中被毛细作用束缚的固相液体应该是与水不相溶混的并且是不带电的肽产物的一种良好溶剂。这些不带电的产物必须以合理的速率通过膜运载（扩散），即良好的运载特性/高通量，而在膜的反应一侧和产物的一侧带电的或离子化的分子，大部分通过膜不向其中任一方向运载，即良好的选择性/离子排斥。

根据本发明选择用于一种肽的酶合成载体材料和固相液体的最佳结合，部分地取决于在体系中使用特定的反应物，所需产品和溶剂的性质。

一般本发明使用的最好固相液体包括与水不相混的有机溶剂，象直链和支链上6到20碳的醇，例如正-癸醇、正-十二烷醇、正-十六烷醇及其混合物，最好是不混水的包括它的混合物的有机溶剂。这样的溶剂包括、但不限于N，N-二乙基-十二烷酰胺、正-十二烷和2-十一烷酮。

本发明实际中使用的一类有用膜包括由有机聚合物，比如聚氯乙烯等制得的疏水性固体膜。这些聚合物膜的制备在文献中已充分介绍。如O.J.Sweeting，Editor，Science and Technology of Polymer Films Interscience，New York（1968），而在S.T.HWang和K.Kammermeyer Membranes in Separations，Techniques of Chemistry，vol.Vll，（A.Weissberger，editor）John Wiley & Sons，Inc.New York（1975）中对于气液分离作用进行过这类膜广泛应用的讨论。

本发明的一个最佳实施例是使用一种膜反应器/分离器体系。这种体系提供一种在与ILM膜一侧接触时循环的含水的反应混合物或相，同时提供在膜的相反表面逆向循环的一种产物含水相或混合物。S.L.Matson和J.A.Quinn，Ann.N.Y.Acad.Sci.469，152（1986）。维持反应和产物相的PH和温度为一定值。在PH为4.0到9.0定值之间使反应物的一种形式通过膜的运载量为最小。通过在反应相中增加中性的肽或不带电的肽浓度而产生的膜该浓度梯度驱动不带电的肽中间体从反应相运载到产物相，膜的运载活性或通量，通过在产物相中，同时不可逆向运载过的肽转化成一种不能逆向扩散的方式显著地增大。例如转化后者可以生成一种不能逆向扩散极性肽，因此补充驱动力达到偶联反应的完成。适于本发明使用的一种膜反应器/分离器的一个例子可在U.S.P4，187，086中查到。

能够适于本发明使用的另一种膜反应器/分离器构型在U.K.P申请2，047，564A中描述过，它适用于本发明包括空心纤维模件的构型并且是在现有技术上熟知的通用板和框式类型过滤器装置。

除了选择性的运载不带电的肽外，这种膜提供了一种在反应相和产物相之间一个屏障，以防止不希望发生的每相成分的混合和它们之间的反应。

根据本发明，在构型最佳的膜反应器/分离器中，反应物之间化学平衡实际通过膜被“拉”，在膜产物一侧，被运载过的不带电的肽不可逆地转化成膜不可渗透的种类。这种类型膜反应器/分离器使用一种通常类型的偶联两种酶（E¹和E²）的方法：

A ⁺+ B ^{- E1}( )/() C ^E2( )/( ) D ^±

带电反应物A和B是氨基酸和/或小分子肽，它们借助于生成酶E¹肽缩合成不带电的中间体肽C，C通过膜选择性地运载到产物一侧。业已明白，在不参与所要反应的反应物中，反应官能团可以被保护或阻断。在产物中如有必要可防止不需要的副反应和/或变化。在膜产物一侧，不带电的肽是转变成通过膜不能逆向扩散的带电肽D，引起在反应混合物中的化学平衡向着产生更多C的方向移动。

图1说明了这个概念，在嗜热菌蛋白酶存在下，PH约5.5时，用（N和β-保护的）N-甲酰-β-苄基-L-天冬氨酸盐和D，L-苯基丙氨酸甲酯酶缩合作用的具体情况。

在图1说明的反应图中，反应物A⁺是D。L-苯基丙氨酸甲酯，B^-是N-甲酰基-β-苄基-L-天冬氨酸盐。通过生成不带电肽C，E¹嗜热菌蛋白酶在膜的反应物一侧缩合反应物。选择PH，保持带电状态中的反应物，从而与不带电的肽C一起通过膜渗透量最小。

虽然缩合反应的化学平衡大大有利于反应物A⁺和B^-，通过膜不带电的肽产物C渗透到产物一侧需要不断产生C，以维持在膜的反应一侧上的化学平衡。

在膜的产物一侧上，酯酶E²快速地和不可逆地把通过膜渗透的不带电的肽C转化成不能逆向渗透到反应一侧的带电肽D。因此，在反应一侧上化学平衡通过膜有效地“拉”向产生不带电产物C的方向。以后使用酸水解作用把肽D转化成天冬甜母。这个过程除去了甲酰基和苄基保护基，随后用甲醇进行C-末端的酯化。

如图2所示，以上的方法可以用于逆流膜反应器/分离器10中，在PH和温度控制的条件下进行操作，以至于一种反应混合物，包括有-游离的α-羧酸酯基基团（电负性种类）的N-酰基-β-取代的-L-天冬氨酸，即N-甲酰基-β-苄基-L-天冬氨酸盐允许与一种有游离质子化的氨基基团（电正性种类）的反应物，即D，L-苯基丙氨酸甲酯缩合，在蛋白酶活性催化作用下，PH约在4.0到9.0，生成完全被保护的不带离子化基团的L-天冬氨酰-L-苯基丙氨酸二肽（电中性种类）。在膜的反应一侧，该反应混合物从反应罐12借助于泵14，通过进料导管16，通过分离器18到出料导管20，20再回到反应罐12循环。在膜的产物一侧，包括完全保护的不带电的肽如N-甲酰基-β-苄基-L-天冬氨酰苯基丙氨酸甲酯的一种产物混合物或排气（Sweep）通过膜运载从产物反应罐22循环。用泵24通过产物吹气外导管26，通过分离器的产物一侧到产物吹气外导管30。这种产物混合物包括一种第二种酶E²的一种酯酶，或者别的合适的试剂。它至少可以解离不带电肽带有的保护基团，因此通过膜逆向扩散产生不能逃逸的一种电子带电种类。如果利用酯酶，最好的一种酯酶要有蛋白水解的本领且PH范围最好从大约6.0到9.0。酰化氨基酸水解酶I、α-胰凝乳蛋白酶枯草杆菌蛋白酶A被认为是本发明中有用的酯酶的例子。

用通常方法象离子交换树脂从产物相中可以周期性释放和/或连续除去带电产物。剩下的流出物通过体系再循环。结合到离子交换树脂上的生成产物可以用一般步骤解附和回收。

通过在反应物上象N-保护的-L-天冬氨酸，使用的保护基团的化学性质测定适当的去除保护剂的选择。如上所示，通过缩合酶的活性部位影响的结构，反过来支配着保护基团的选择。

总的来说，实施本发明使用的酶是蛋白水解酶，有时称蛋白酶，它可以分成两类。较普通的是只解离内键的肽链内切酶和只解离末端键的肽链外切酶有用的酶包括丝氨酸蛋白酶，（EC3.4.21）象胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶BNP′和Achromobacter蛋白酶;硫代蛋白酶（EC，3.4.22）象木瓜蛋白酶;羧基蛋白酶（EC，3.4.23）象胃蛋白酶和金属蛋白酶（EC，3.4.24）象嗜热菌蛋白酶、Prolisin、Tacynasen N（St.caesPitosus）和dispase把酶结合到不溶性载体时，下面的步骤对本领域专业人员是熟知的，可以结合本发明实施;尽管结合酶不是一个基本的步骤，在某种应用中它是需要的。在实施本发明可能有用的许多蛋白酶中，由于嗜热菌蛋白酶（E.C.3.4.24）显著的热稳定性、用途广、成本低及PH大约在5.0到9.0的应用宽范围，它是最好的缩合酶。其它的最好的蛋白酶包括胃蛋白酶和Penicillopepsin〔T.Hofmann和R，Shaw，Biochim、Biophys Acta 92 543（1964）〕。和来自Penicillium duponti的热稳定蛋白酶〔S.Emi，D.V.Myers和G.A.Iacobucci，Biochemistry 15，842（1976）〕期望他们在PH大约5.5时作用，在这样的PHs时它们表现出优良的稳定性，并且不需要Zn⁺⁺和Ca⁺⁺离子存在维持其活性。

对映体选择性的实际利用，也就是上面所介绍的情况中，仅肽CL，L异构体的产生，直接与被选择的酶、膜的理想功用、载体材料的化学性质和水反应相有关。

实施上面描述过的指定方法里的一种最好膜是微孔聚丙烯载体材料，包括正-十六烷醇和固相的正-十二烷的混合物。该膜从Bend Research，Inc，64550 Research Road，Bend，Oregon 97701，U.S.A、Under the tradename/designation“Type I Hollow Fiber Selective Dialysis Membrane”可以得到。最好用例1-4进行反应。另一类最好的膜用Celgard Type 2400聚丙烯空心纤维作微孔载体材料，包括一种在十二烷中含30%V/VN，N-二乙基-十二烷基酰胺（Celgard是Celanese Corporation的注册商标 1211 Avenue of Americas，New York，N.Y.10036，它可从Celanese Fibers MarKeting Corporation，Charlotte，N.C.中得到）的混合物作为在Celgard微孔板孔里通过毛细作用固定与水不相混的有机液体。这种膜从Bend Research Inc，64550 Research Road，Bend，Oregon97701，U.S.A.Under the tradename/designation“Type 2 Hollow Fiber Selective Dialysis Membrane”获得并且最好用例5-9的反应。Celgard Type 2400聚丙烯空心纤维孔的大小为0.025～0.050μm，壁厚度为25μm，用在Type 2空心纤维选择性渗透膜中，它是Bend Research，Inc制造。当PH大约在5.5时操作，这些膜选择性高。如当用实施图1的方法时，约在500∶1（w/w）范围中，有利于测量不带电肽种类中的选择性。也就是运载每毫克（A⁺或B⁺）带电的反应物，同时通过膜也运载过来500毫克不带电的肽（C）。

正如上面所述，为了应用本发明将有必要或希望阻挡或保护在反应物上的各种官能团和产品，以防止不希望有的副反应。这种副反应会阻碍所需产物的生产和/或降低产物收率同时消除中间体肽带电。下面表1列出一系列实际应用本发明方面的保护基团选择性的组合和去除保护使用的条件。

表1在天冬甜母合成中使用的保护基团和去除保护作用剂（APM）

R¹R²R³基团产物

去除的/试剂

φCH₂O- φCH₂OCO- CH₃O- R¹，R²/（pd）H₂APM

φCH₂O- -CH＝O CH₃O- R²/H₃O⁺β-苄基-APM

φCH₂O- -CH＝O CH₃O- R³/真菌酯酶 N-甲酰基-β-

苄基-L-天冬氨酰

-L-苯基丙氨酸

ter-Buo -CH＝O CH₃O- R¹，R²/H₃O⁺APM

CH₃O- -CH＝O CH₃O- R³/真菌酯酶 N-甲酰基-异APM

CH₃O- -CH＝O CH₃O- R³/α-胰凝

乳蛋白酶 N-甲酰基-异APM

NH₂- φCH₂OCO- CH₃O- R¹/天冬酰氨酶 N-CBZ-APM

L-二氢乳清基- R¹，R²/hydantoinase APM

CH₃O- φCH₂OCO- CH₃O- R³/真菌酯酶 N-CBZ-异APM

CH₃O- φCH₂CO-、CH₃O R²/青霉素酰基 APM-β-甲基酯

转移酶

由于一种选择的缩合酶对映选择性和受膜影响功能分辨的结果，应用N-甲酰基-L-天冬氨酰-β-苄基酯和D，L-苯基丙氨酸甲酯，实施本发明可以获得对映体拆分99.8%的外消旋苯基丙氨酸甲酯反应物。L-对映体表现为N-甲酰基-L-天冬氨酰（β-苄基）-L-苯基丙氨酸甲酯，一种天冬甜母的衍生物。未反应的D-对映体留在反应相中。

留在反应相中的D-苯基丙氨酸甲酯可以从中回收并再消旋回到D，L阶段，循环到原料中去。使用外消旋氨基酸反应物处理的很多方法，例如上面介绍的“311”法，都具有这种优点。

发明经济上的优点至少部分原料是应用消旋进料反应物，而不是较贵的予先拆分过的L-对映体。在原位用D，L-苯基丙氨酸甲酯旋光拆分能够产生这种优点。这是由于：（a）缩合酶的对映选择性;（b）有利于不带电的物质膜的高选择性。

较低成本合成外消旋苯基丙氨酸最好的方法是苯甲醛通过5-benzalhydantoin，有时称此为Grace方法，是基本的方法，或苄氯催化羰基化成苯丙酮酸。这是一种由Sagami Chemical Research Center，Tokyo，Japan开发的步骤（有时称为the Toyo Soda process of Toyo Soda Manufacturing Co，Ltd Yamaguchi，Japan）。

本领域的技术人员知道实施本发明不必限于肽脱硫设备（Sweeteners）的合成，象天冬甜母或其类似物和衍生物。本发明也用于合成其它类型有用的肽，二肽、三肽、四肽和五肽，或更为复杂的肽。这些肽能在适宜的比率下通过一种选择渗透膜通透。假如，考虑嗜热菌蛋白酶键的专一性并且假设在产品中只有一个嗜热菌蛋白酶敏感键存在（在下面公式中用箭头表示）则可用下面图示合成蛋白啡肽（1）

在文献中刊载有用α-胰凝乳蛋白酶和木瓜蛋白酶逐步进行整个蛋白啡肽合成的可行性。参看W.Kullmann，J.Biol.Chem 255，8234（1980）。

本发明中另外潜在的有效应用是用下面图表示的短杆菌肽S（2）酶合成：

可以找到应用本发明有用的肽产物酶合成的各种其它实施例，这在文献中已经介绍。它们是合成血管紧张素、P物质、eledoisin、两栖兰素和亮内啡肽。

本领域的技术人员将懂得，除了本发明的肽，还发现可应用于其它体系。

例如众所周知的对于不对称的拆分使用象猪肝酯酶（EC 3.1.1.1）酯水解酶前手性的二羧酸二酯变成手性单酯。〔C.J.Sih etal，Ann N.Y.Acad.Sci 471，239（1986）〕在本发明介绍的方式里可以使用样的酶拆分外消旋羧酸化合物，通过膜通过手性酯选择性的运载，在反应相中保持非反应的对映体酸。

下面举出详例，进一步说明本发明。

实施例1

根据本发明天冬甜母衍生物制备如下：

对于在500ml水中的含5.02克（20毫摩尔）N-甲酰基-L-天冬氨酰-β-苄酯，4.31克（20毫摩尔）L-苯基丙氨酸甲酯溶液调节PH到5.5，加入500mg代表总数为8×10⁵蛋白水解单位的嗜热菌蛋白酶〔Daiwa Chem，Co，Osaka，Japan〕。

当不溶性二肽N-甲酰基-β-苄基-L-天冬甜母变得明显时，在40℃对生成透明的反应混合物保温15小时。至后把生成的混合物放入200ml容器里与反应一侧相连，这是一种Bend Besearch Inc“Type I微孔纤维选择渗透膜”试验的空心纤维分离器的管子一侧，它提供有1平方英尺膜面积。膜（分离器壳侧）的产物一侧与含水（产物）混合物（总体积等于200ml）相连。这种混合物含有来自曲霉SP（Sigma A2156）的500mg酶酰基转移酶I（EC 3.5.1.14），PH约为7.5。已发现，这种通常描述的一种氨基酰基转移酶，在N-乙酰和N-甲酰-β-苄基-L-天冬甜母二者上面 C-末端作为酯酶起作用。

在室温条件下，通过空心纤维分离器，用蠕动泵帮助，反应物和产物混合物以600ml/分速率反向逆流循环。这种构型设备类似于图2说明的那种。由于这两种反应物（缩合作用和酯水解）是亲质子的，反应和产物混合物二者中的PH随反应进行而下降。通过使用PH稳定器保持反应物和产物二者中的PH不变。

HPLC监测N-甲酰-β-苄基-L-天冬氨酰-L-苯基丙氨酸的生成。在Tracor Model L 995仪器上进行色谱分析（它带有LDC分光测视器Ⅱ检测器，在254nm处测定氨基酸和二肽，）产品二肽完全被保护了。使用的色谱柱是NOVA-PAK C18 Radial-Pak夹头，8mm×10cm，封装在Millipore Waters RCM-100 Radial Compression Module内。

用于测定完全保护的二肽流动相是45%甲醇（HPLC级），5%四氢呋喃（HPLC级）和50%的1%KH₂PO₄缓冲溶液的V/V混合物。为了测定二肽流动相含40%甲醇和60% 1%的KH₂PO₄缓冲溶液的一种V/V混合物，（加入1ml三乙胺/升溶剂，使衰减为最少，用80%磷酸把PH值下调至4.3）流动速率保持1ml/分。

生成有关的N-甲酰-β-苄基-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的HPLC数据总结在下面表Ⅱ中，把产物溶液中所积累产物二肽的总量列作时间的函数。

在PH5.5的水中，在25℃时与其饱和点对应的平衡时不带电的二肽浓度值大约为0.05%。每小时通过膜每平方英尺运载的不带电的二肽量最大约为200mg，这表明保持平衡需要不溶的二肽和/或重新合成二肽的溶解。当反应停止时，5小时后观察到反应混合物中不溶的不带电的二肽相几乎全部溶解。图3表明表Ⅱ中的图表数据。线型函数说明，肽穿过膜的运载是以稳态进行的。观察大约200mg/ft²/小时（表Ⅱ）证实了产物二肽形成的速率类似于在水中在0.05%时测定的通过膜不带电的二肽流量（190mg/ft²/小时）。这个结果如同理论的予测。

在这点上，如果以约120mg/时的速率继续添加到两个氨基酸反应物的反应混合物上。为了保持不带电的二肽饱和的体系，将希望所述的体系持续在稳定态。

为了充分实现膜的选择性，与第二种酶接触前，连续地用第一种膜插入第二种膜也许是必要的。因为反应溶液中氨基酸高浓度，穿过一种单一膜选择性是比较低的。

回收产物溶液（200ml），调节PH至2.5在4℃冷却过夜。回收收集的沉淀，从甲醇∶水中重结晶，得到307mg N-甲酰-β-苄基-L天冬氨酸-L-苯基丙氨酸，〔α〕^25° _D＝-5.6°（C＝1.2;ETOH），它与用曲霉酯酶〔α〕^25° _D＝-5.3°（C＝1.3;ETOH）对N-甲酰-β-苄基-L-天冬甜母分批水解制得的可靠样品相同（IR，13C-NMR）。

表Ⅱ

时间/分肽量/产物溶液（mg）

30 124

60 228

120 412

180 617

240 882

300 1015

实施例2

按照类似于实施例1的步骤进行实验，其中用8.63克D，L-苯丙氨酸甲酯代替L-对映体，所得结果列于表Ⅲ。从200毫升产物溶液中分离不带电的肽得到310毫克产物〔α〕^25° _D＝-6.4°（C＝1.4;ETOH），从各方面（IR，13C-NMR）证实产物是可信的N-甲酰-β-苄基-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸样品。

表Ⅲ

时间（分）肽量/产物溶液（毫克）

30 166

60 258

120 475

180 686

240 996

300 1073

由表Ⅲ总结出的数据曲线（图3）再次表明，在反应器中当使用D，L-苯丙氨酸甲酯时，存在稳定态的过程。通过实施例1中描述过的L，L-二肽的生成，证实了嗜热菌蛋白质的立体定向选择性。在管相（反应混合物）保留的D-苯丙氨酸甲酯没有抑制肽生成的动力。

实施例3

根据实施例1制得的N-甲酰-β-苄基-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸1.0克和4.0毫升水、4.0毫升四氢呋喃和1.8毫升浓盐酸（12N）组成的混合物加热迴流9小时。至后冷却混合物并用50%NaoH浓液将其PH值调至4.0。在低于35℃和20mmHg的条件下蒸发除去四氢呋喃。在5℃放置1小时完成结晶。得到的样品经过过滤并用1ml冰水洗涤，在真空中干燥后得到367毫克的白色固体。经过HLPC和IR分析证实该物是可信的天冬氨酰苯丙氨酸样品。〔α〕^25° _D＝+12°（C＝0.5;0.1NHcl在50%MeoH）。

G.L.Bachman和B.D.Vineyard在U.S.P4，173，562的实施例1中描述了用甲醇和盐酸处理天冬氨酰苯丙氨酸转变成天冬甜母。

实施例4

按类似于实施例1的步骤进行实验。其中用5.65克（20.1毫摩尔）N-苄氧羰基-L-天冬氨酸-β-甲酯和4.38克（20.3毫摩尔）L-苯丙氨酸甲酯作为反应物。把氨基酸溶解在100毫升的水中并将溶液的PH值调到5.5，加入500毫克的嗜热菌蛋白酶Daiwa（8×10⁵蛋白水解单位）。该溶液在40℃予温15小时，当沉淀了大量的N-CBZ-（β-甲酯）-L-asp-L-苯丙氨酸甲酯时，该悬浮液与含有1平方英尺膜表面的“1型空心纤维选择性透析膜”（Bend Research Inc产品）的管相一侧连接。在室温下，PH为7.5的含500毫克酰基转移酶Ⅰ（Sigma）的200毫升水管际空向相中操作。用HPLC监视该相中积聚的肽产物，结果列于表Ⅳ和附图4中。

5小时以后停止反应，回收管际空向相（200毫升）将其PH值调至2.5并在4℃下放置过夜。收集沉淀的产物并从CH₃OH∶H₂O中重结晶得到405毫克（86%回收）的N-CBZ-（β-甲酯）-L-asp-L-苯丙氨酸（N-CBZ-iso-APM）〔α〕^25° _D＝+6.0°（C＝1.1 EtOH），用（¹³C-NMR）证实与N-CBZ-iso-APM〔α〕²⁵ _D＝+5.5（C＝1.1 EtOH）真实样品相同，该样品是由化学偶联以及用酰基转移酶I部分水解制备。

表Ⅳ

时间肽量/产物溶液（毫克）

30 177

60 214

120 333

180 381

240 459

300 470

如前面实施例1和2中所观察到的，图4的曲线表明了N-CBZ-iso-APM以约200毫升/小时的稳定速率积累的过程。

在实施例3描述的条件下，能够实施N-CBZ-异-APM转变成APM。

实施例5

按照本发明制备天冬甜母衍生物N-甲酰-（β-甲基）-asp-phe如下：

将在100毫升水中6.00克（35毫摩尔）的N-甲酰-（β-甲基）-L-天冬氨酸和10.00克（48毫摩尔）L-苯丙氨酸甲酯的溶液PH值调到7.0，加入770毫克表示总量为1.2×10⁶蛋白水解单位的嗜热菌蛋白酶（Daiwa化学公司，Osaka，Japan）。得到的清液在40℃予温1小时，当用HPLC分析时，表明其中含有433.8毫克和N-甲酰-（β-甲基）-asp-phe-OMe。把该液冷却到25℃，PH调到5.0然后放入与空心纤维分离器（“2型”空心纤维选择性透析膜Bend Research Inc）侧管相连的200ml容器中。分离器提供了在十二烷中由30%（V/V）的N，N-二乙基-十二酰胺混合物组成的ILM，其表面积是0.5平方英尺（450平方厘米）。分离器的壳侧与PH值为7.5的500毫克来自曲霉-SP（氨基酰基转移酶AMANO Nagoya，Japan）的酰基转移酶I（EC3，5，1，14）的产物容器相连。

上述两相在25℃通过使用构型如图2所示的两台蠕动泵以管相50毫升/分，壳相500毫升/分的速率逆向循环，通过使用PH稳定器来保证两相PH的稳定性。

通过HPLC并且使用在254nm处设置的Ⅱ型LDC光谱监视器检测仪和Tracor 995型仪器一起来监视N-甲酰-（β-甲基）-asp-phe的生成。使用的色谱柱是NOVA-PAK C18 Radial-Pak夹头8mm×100mm封装在Millipore Waters RCM-100 Radial Compression。

分析使用的流动相是：

（a）对于N-甲酰-（β-甲基）-asp-phe-OMe是在PH为4.6 0.1%的KH₂PO₄缓冲溶液中加40%（V/V）甲醇;

（b）对于N-甲酰-（β-甲基）-asp-phe是在PH为4.6 0.1%的KH₂PO₄缓冲溶液中加20%（V/V）甲醇，在分析中使用的流速是1ml/分。

有关N-甲酰-（β-甲基）-asp-phe（二肽产物）生成的数据再现于表5。将其在200ml壳相中累积的总量（mg）表示为时间的函数。

表Ⅴ

时间肽量/产物溶液（毫克）

60 130

120 230

180 280

240 360

300 400

图5表明表5的数据曲线。

反应结束时，HPLC分析表明管相中存在283毫克N-甲酰-（β-甲基）-asp-phe-OMe这些数值可以用来计算反应器操作阶段合成的肽量。

Ptr＝运载进入管际空间相中的肽＝400· 336/322 ＝417.4毫克;

PO＝在管相中最初的肽＝433.8毫克;

PT＝在管相中反应结束时的肽＝273毫克;

Ptr＝（Po-P_T）+Psyn;

Psyn＝Ptr-（Po-Pt）＝266.6毫克;

Vsyn＝ 266.6/5 ＝53.5毫克/小时 100毫升

53.5毫克/小时·100毫升的Vsyn与在平衡作用研究中对于前速度测量的合成速度（500毫克/小时·升）相符。平衡作用研究是在嗜热菌蛋白酶存在下用N-甲酰（β-甲基）-L-天冬氨酸和L苯丙氨酸甲酯处置的。

回收产物溶液（200毫升），用IN HCl将其PH调到2，并用200毫升EtoAC萃取二次。合并萃取液，经过蒸发留下白色残渣，从EtoAe/己烷混合物重结晶后产生100毫克的N-甲酰-（β-甲基）-L-asp-L-phe，〔α〕^25° _D＝+0.70°（C，0.29;MeOH）证实（±R¹³C-NMR）与用曲霉酯酶间歇水解制备的合成N-甲酰-（β-甲基）-L-asp-L-phe-OMe可靠样品相同，〔α〕^25° _D＝+0.80°（C，0.29;MeOH）

实施例6

把实施例5中描述的实验按比例扩大，其中2型空心纤维透析膜（Bend Research Inc）有一平方英尺面积的液膜（在十二烷中30%V/VN，N-二乙基-十二酰胺）。管相在400毫升水中含有40克L-phe-OMe、24克N-甲酰-（β-甲基）-L-asp和3.08克的嗜热菌蛋白酶Daiwa（总量为5×10⁶蛋白质水解单位），将其PH值调到7.0。在40℃1小时予温后，发现其中含有1.068克（2.7克/升）的N-甲酰-（β-甲基）-L-asp-L-phe-OMe。将溶液冷却到25℃，用1NHcl将PH调到5.0，然后与空心纤维分离器的管侧相连。壳相由400毫升水组成，PH为7.5并含有2克酰化氨基酸水解酶I（Amano）。如实施例5中描述的，上述两相在25℃逆向扩散5小时，结果总结于表Ⅵ和图6中。

表Ⅵ

时间（分）肽量/产物溶液（毫克）

30 204

60 251

120 445

180 634

240 748

300 843

在反应结束时留在管相中的N-甲酰-（β-甲基）-asp-phe-OMe的量为586毫克。

在前30分钟观察到的高运载量（404毫克/小时）是由于在予温期间产生了高的初始肽浓度。由于肽的运载而引起平衡偏离决定了更多肽的合成，因此在进入反应第一小时后以理想的水平200毫克/小时建立了一种稳定态条件，（图6）

实施例7

按类似于实施5进行试验，其中用10.00克D，L-苯丙氨酸甲酯代替L-对映体。表Ⅶ和图7中的结果清楚地表明观察到的N-甲酰-（β-甲基）-L-asp-L-phe的生成速率是L-phe-OMe（实施例5，表Ⅴ）的二分之一，它如同从嗜热菌蛋白酶的对映选择性和前面实施例2和1的结果予计的一样。

表Ⅶ

时间（分）肽量/产物溶液（毫克）

30 10.6

60 25.5

120 33.2

180 55.3

240 59.6

300 69.1

实施例8

按照本发明利用D，L-苯丙氨酸甲酯的酶辅助拆分如下：

将500毫克酰化氨基酸水解酶I（Amano Pharmaceutical CO.，Nagoya，Japan），加入到在100毫升水中含有1.0克（5.6毫摩尔）D，L-苯丙氨酸甲酯，PH为7.5的溶液里。混合物在25℃反应30分钟。反应结束时通过HPLC分析可以观察到其中含有266毫克的L-phe（1.6毫摩尔）和712毫克D，L-phe-OMe（4毫摩尔）。上述溶液加入到ILM分离器支持的一种空心纤维Celgard（“2型空心纤维选择性透析膜Bend Research Inc）的管（反应）侧，它在十二烷中含有30%V/V N，N-二乙基-十二酰胺的混合物组成0.5平方英尺的液膜。膜的产物端（分离器壳侧）有200毫升水，用稀Hcl把PH调至2.0。两相借助于蠕动泵（图2）以200毫升/分的速率通过分离器逆向循环。在分离过程中将D，L-phe-OMe大约以每小时1克的速率连续地加入到管相。在2小时内加入全部PH为7.5，在水中7%的D，L-phe-OMe（2.1克;11.7毫摩尔）溶液30毫升，使用PH稳定器来保持两相PH值恒定。

利用HPLC，每30分钟从两相中取一次样品追踪拆分过程。该HPLC的仪器装置和工作过程已经在实施例5中描述。在这种情况中使用流动相是PH值为4.6的在0.1%KH₂PO₄缓冲溶液20%V/V甲醇，它的流速为1毫升/分。表Ⅶ描述的并作图于图8的结果表明了L-phe在管相中的积累和D-phe-OMe在壳相中的积累。实验后回收两相设计如下：

（a）管相：容量为130毫升，用1N NaoH将PH调到8.5，然后用2×50毫升EtOAC萃取。水相用1NHcl调PH值到4.0。溶液通过2.5×20厘米Dowex 50（NH₄）交换柱。用200毫升水洗涤后，产物用200毫升10%的NH₄OH洗脱。洗脱液真空浓缩至50毫升，将其冷冻干燥后得到249毫克的白色固体L-苯丙氨酸〔α〕^25° _D＝-29.2°（C，2;H²O）光（Aldrich）〔α〕^25° _D＝-35.0°（C，2;H₂O）光学纯92%。

（b）壳相：用稀NaOH把该相中的200毫升溶液PH值调到8.5，并用2×50毫升EtOAC萃取。有机相用无水Na₂SO₄干燥并蒸发至干。而后将其溶解在50毫升水中用1NHcl酸化至PH为3.0。冷冻干燥产生989毫克（4.6毫摩尔）的D-phe-OMe Hcl白色固体，〔α〕^25° _D＝-21.0°（（C，2;EtOH），光（Aldrich）〔α〕^25° _D＝-32.4°（C，2;EtOH），光学纯83%。

基于在这种膜上发现phe-OMe（水，PH8 25℃）可渗透性值32毫克/厘米²分，对于450厘米²（0.5平方英尺）的一种膜面积希望流量是880毫克/小时。表Ⅷ表明phe-OMe在第一小时结束时运载进入壳相的量是860毫克，建议在膜限制条件下操纵运载

表Ⅷ

D，L-phe-OMe 管相壳相

L-phe D，L-phe-OMe D-phe-OMe

被加量（克）（毫克）（毫克）（毫克）

1.0 266 712 0（0分）

1.7 473 617 537（30分）

2.4 615 531 860（60分）

3.1 743 628 1154（90分）

最近揭示（Shui-Tein Chen，Kang-Tsung Wang和Chi-Huey Wong J.Chem.Soc.Chem Commun，1986 1514）通过枯草杆菌蛋白酶A催化功能经由甲基酯对映选择性水解间断拆分D，L-phe-OMe。外消旋羧酸化合物的膜拆分需要水解酶。一种酯酶的水解酶如酰化氨基酸水解酶I，α-胰凝乳蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶A能够用来拆分象D，L-苯丙氨酸甲酯这样的一种D，L氨基酸化合物，对于肽的脱甲基作用通常酰化氨基酸水解酶I要比其它的酯解酶如枯草杆菌蛋白酶A和α-胰凝乳蛋白酶有更强的蛋白水解活性。

如果上述D，L-苯丙氨酸甲酯的拆分用于本发明描述的肽的制备，则通过本领域中已知的标准甲基化作用手段甲基化L-苯丙氨酸。

该实施例也适用于其它外消旋羧酸的拆分。例如在包括水解酶的含水反应混合物中的一种外消旋羧酸酯化合物可水解生成一种带电的旋光性化合物和不带电的旋光性酯化合物。不带电的旋光性酯化合物通过一种本发明的离子排斥膜从含水的反应混合物中运载出来。该膜包括1型和2型空心纤维选择性透析膜，来自Bend Research Inc.在实施例8这种类型的实施例中，外消旋羧酸酯化合物是一种D，L-氨基酸酯化合物;带电的旋光性化合物是一种L-氨基酸化合物，不带电的旋光性酯化合物是一种D-氨基酸酯化合物。可以估计到酶和反应条件的选择是在本发明领域中熟练技术人员理解能力和知识范围之内。

通过本实施例提供了持续的或间歇的生产手段，在实施例中所要的反应物对映体能制备并且能加到反应混合物中。

实施例9

根据本发明使用固相的酰化氨基酸水解酶I和离子交换树脂去除可渗析的产物进行N-甲酰-（β-甲基）-L-asp-L-phe的合成：

将一种在100升去离子水中含10.0克（48毫摩尔）L-苯丙氨酸甲酯和6.0克（35毫摩尔）N-甲酰-（β-甲基）-L-天冬氨酸溶液的PH值调到7.0。加入770毫克的嗜热菌蛋白酶（Daiwa化学公司，Osaka，Japan）其总量表示1.2×10⁶蛋白质水解单位。所得溶液在40℃予温1小时。当用HPLC分析时表明存在有383毫克N-甲酰-（β-甲基）-aSP-Phe OMe。将溶液冷却到25℃，PH值调到5。把这溶液放入200毫升的容器40中，该容器与空心纤维分离器44（“2型空心纤维选择性渗透膜”Bend Research Inc）的管侧连接，分离器44有十二烷中30%N，N-二乙基-十二烷酰胺组成的一种疏水液膜900平方厘米（1平方英尺）。分离器48的壳侧安置成如同一种在图9表明的连接容器所组成的封闭系统。为了给与二肽N-甲酰-（β-甲基）-asp-phe-ome共渗透的L-phe-ome质子化，把返回到分离器44的溶液调到PH4.0。经过Dowe×50（Na⁺），一种交换柱50，循环除去带正电的L-phc-ome，在溶液中留下了不带电的二肽。调节渗出液到PH值为7.0并使受酰化氨基酸水解酶I作用，水解酶I固定在DEAE-Sephade 5²〔T.Tosa，T.Mori和I.Chibata，Agr.Biol.Chem.33，1053（1969）〕。在这种PH值条件下生成的二肽N-甲酰-（β-甲基）-asp-phe是负电性的，基本上都被Dowex 1（Cl^-）树脂54截留。PH值调节到4.0之前渗出液重新回到膜分离器，因此形成封闭的循环系统。

管相（100毫升）46和壳相（500毫升）48在25℃以50毫升/分（管相）和120毫升/分（壳相）速率通过膜分离器逆流循环。

在第二种酶（E₂）的渗出物上定期采集壳相样〔图9，采样口56，进入Dowex1（Cl^-）柱54之前〕，样品按实施例5描述的步骤用HPLC检测。如同予料的，在这个循环系统中（图9）没有检测到L-phe，L-phe由E₂酶水解L-phe-OMe产生，仅仅观察到N-甲酰-（β-甲基）-asp-phe（平均浓度为54毫克/升）循环稳定态水平，反映了二肽N-甲酰-（β-甲基）-APM穿过膜连续运载且随后被E₂水解。整个操作中，在A点观察浓度较低，表示带电的二肽被Dowex-1树脂充分吸收。如同从以上讨论的诸结果中予测的那样，在壳相没有Dowex-1肽时进行类似的平行实验，此外在循环壳中没有发现L-phe。两组实验的比较见图10和表Ⅸ

表Ⅸ

N-甲酰-（β-甲基）-asp-phe（毫克）/壳相

时间（分）实施1有Dowex1 实施2没有Dowex1

30 31.6 30.2

60 - 37.8

120 26.0 71.8

180 35.4 83.1

240 45.6 -

300 51.2 -

如同在这个实施例中描述过的那样，除了用离子交换树脂分离共渗透离子排斥膜进入到产物混合物的苯丙氨酸低级烷基酯外，共渗透离子排斥膜进入到产物混合物的天冬氨酸能使用这样的树脂分离。不能通过膜从产物混合物中逆向渗透的物质或产物能使用这样的离子交换树脂去除。在现有技术中已知其它的方法也能用于本发明，不只是电泳、电渗析和等当量的离子交换树脂分离的膜分离等。

在初始反应混合物的PH中，因相的缩合酶在管相中能进行酶反应，为了有效的酶反应这个PH值考虑了在所需的酶反应平衡中的反应物、产物和酶。在管相中的初始反应混合物PH与膜接触前能调节到一种第二反应混合物的PH，以使第二反应混合物的PH通过膜把不带电的产物运载进入壳相增大膜效率。在图9中没有表明在管相中把初始反应物混合物的PH值调到第二反应物的PH值。

同样，在壳相中的酯酶可被固定并且其中的产物混合物PH值也可以调节。如果有必要再调节以致使操作最有效地进行。实施例8和前述的实施例为有效地利用本发明进行连续或间歇过程提供了另外的手段。在连续过程中所需要的反应物对映体和任何共渗透化合物能重新回到管相或反应混合物中。

本发明可以来生产天冬甜母及其它具有药理活性的肽。

为了详尽地说明有创造性原理的发明申请，当显示和描述本发明特定的实施例时，应该认识到，只要不违背本发明这些原理，本发明是能实施的。

Claims

1、一种肽的酶合成方法，包括以下步骤：

带有α-羧酸酯基团的一种N-酰基-β-取代的-L-天冬氨酸和带有α-铵基团的一种苯丙氨酸低级烷基酯，在含有缩合酶的含水反应混合物中缩合，形成N-酰基-L-天冬氨酰-(β-取代的)-L-苯丙氨酸低级烷基酯，一种不带电的肽；

从含水反应混合物中穿过离子排斥膜运载不带电的肽到产物混合物。

2、根据权利要求1的方法，其中缩合酶是在PH值范围约为4.0到9.0中的一种可以产生蛋白酶活性的肽。

3、根据权利要求2的方法，还包括将产物混合物中的不带电的肽转变成一种不能穿过膜逆向渗透的物质。

4、根据权利要求3的方法，其中不带电的肽用一种酯酶解离转变成一种带电的物质。

5、根据权利要求4的方法，其中酯酶是在PH值约为6.0到9.0范围内起活性作用。

6、根据权利要求4的方法，其中酯酶选自酰化氨基酸水解酶I，α-胰凝乳蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶A。

7、根据权利要求4的方法，其中酯酶为酰化氨基酸水解酶I并且反应混合物的PH约为7.0。

8、根据权利要求3的方法，其中膜是一种通过在微孔板上细孔中的毛细作用固定的与水不相混溶的有机液体，该有机液体是不带电二肽溶剂。

9、根据权利要求8的方法，其中微孔板选自聚四氟乙烯和聚丙烯材料制成并且有机溶剂至少是一种选自正-1-癸醇、正-十六醇、正-十二醇、N，N-二乙基-十二酰胺、十二烷、2-十一烷酮的化合物及混合物。

10、根据权利要求8的方法，其中微孔板是聚丙烯空心纤维并且溶剂是N，N-二乙基-十二酰胺和十二烷。

11、根据权利要求8的方法，其中膜是一种Bend2型空心纤维选择性的通透膜。

12、根据权利要求3所说的方法，其中第一种化合物是D，L-苯丙氨酸甲酯，第二种化合物是具有α-羧酸酯基团的N-酰基-β-取代的-L-天冬氨酸。

13、根据权利要求12的方法，其中N-酰基团选自φCH₂OCO-，CH＝0和φCH₂CO;β-取代基选自φCH₃O-，叔-丁氧基（ter Buo-）、CH₃O-、NH₂-。

14、根据权利要求3的方法，其中缩合酶被固定。

15、根据权利要求14的方法，其中缩合酶是嗜热菌蛋白酶，反应混合物PH值约为7.0。

16、根据权利要求14的方法，还包括从反应混合物中穿过离子排斥膜运载不带肽前，将反应混合物PH值调到约5.0步骤。

17、根据权利要求3的方法，还包括分离共渗透离子排斥膜进入产物混合物的N-酰基-β-取代-L-天冬氨酸的步骤。

18、根据权利要求3的方法，还包括分离共渗透离子排斥膜进入产物混合物的苯丙氨酸低级烷基酯的步骤。

19、一种肽的酶合成方法，包括以下步骤：

带有α-羧酸酯基团的一种N-酰基-β-取代的-L-天冬氨酸和带有α-铵基团的一种苯丙氨酸低级烷基酯，在含有缩合酶的含水反应混合物中缩合，形成N-酰基-L-天冬氨酰-（β-取代的）-L-苯丙氨酸低级烷基酯，一种不带电的肽;

从含水反应混合物中穿过离子排斥膜运载不带电的肽到产物混合物;

将产物混合物中的不带电肽转变成经过膜不能逆向渗透的物质;

从产物混合物中去除经过膜不能逆向渗透的物质。

20、根据权利要求19的方法，它还包括分离共渗透离子排斥膜进入产物混合物的N-酰基-β-取代的-L-苯丙氨酸的步骤。

21、根据权利要求20的方法，它还包括分离共渗透离子排斥膜进入产物混合物的苯丙氨酸低级烷基酯的步骤。

22、一种肽的酶合成方法，包括以下步骤：

酶缩合在含水初始反应混合物中的第一种第二种氨基酸化合物，生成一种不带电的化合物;

将不带电的化合物经过一种膜运载到含水的第二反应混合物中，其中膜不运载大量的氨基酸化合物;

将运载过的不带电化合物转变成穿过膜不能逆向渗透到初始反应混合物中的形态;

去除上述穿过膜不能逆向运载回到初始反应混合物中的化合物。

23、根据权利要求22的方法，还包括从含水的第二种反应混合物中分离第一氨基酸化合物的步骤，该化合物与不带电的化合物一起经过膜共渗透进入含水的第二反应混合物。

24、根据权利要求22的方法，还包括从含水的第二种反应混合物中分离第二氨基酸化合物的步骤，该化合物与不带电的化合物一起经过膜共渗透进入含水的第二反应混合物。

25、根据权利要求23的方法，还包括把第一氨基酸化合物返回到含水初始反应混合物的步骤，该化合物与不带电的化合物一起经过膜共渗透。

26、根据权利要求23的方法，还包括把第二氨基酸化合物返回到含水初始反应混合物的步骤，该化合物与不带电的化合物一起经过膜共渗透。

27、一种酶拆分外消旋羧酸化合物的方法，包括以下步骤：

将一种外消旋羧酸酯化合物在一种有水解酶的含水反应混合物中水解，在这种含水反应混合物中生成一种带电的旋光性化合物和一种不带电的旋光性酯化合物;

将不带电的旋光性酯化合物从含水反应混合物中穿过离子排斥膜运载到产物混合物。

28、根据权利要求27的方法，其中外消旋羧酸酯化合物是一种DL-氨基酸酯化合物;

带电的旋光化合物是一种L-氨基酸化合物;

不带电的旋光化合物是一种D-氨基酸酯化合物;

29、根据权利要求28的方法，它还包括转化在产物混合物中的不带电D-氨基酸酯化合物成穿过膜不能逆向渗透的物质。

30、根据权利要求29的方法，其中转变步骤中将产物混合物的PH值调至约2.0。

31、根据权利要求29的方法，其中水解酶选自酰化氨基酸水解酶I，α-胰凝乳蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶A。

32、根据权利要求29的方法，其中水解酶被固定。

33、根据权利要求29的方法，其中膜是一种通过在微孔板的孔中毛细作用来固定的水不相溶有机液体，该有机液体是一种适于不带电肽的溶剂。

34、根据权利要求33的方法，其中微孔板是由选自聚四氟乙烯和聚丙烯的材料制成的，溶剂至少含有一种选自正-1-癸醇、正-十六醇、正-十二醇、N，N-二乙基-十二酰胺、十二烷、2-十一烷酮及其混合物。

35、根据权利要求33的方法，其中微孔板是聚丙烯空心纤维，溶剂是N，N-二乙基-十二酰胺和十二烷。

36、根据权利要求33的方法，其中膜是一种Bend 2型空心纤维选择性渗析膜。

37、根据权利要求29的方法，其中D，L-氨基酸酯化合物是具有α-铵基团的D，L-苯丙氨酸低级烷基酯。

38、根据权利要求37的方法，其中D，L-苯丙氨酸低级烷基酯是D，L-苯丙氨酸甲酯。

39、根据权利要求29的方法，还包括以下步骤：

在含水初始反应混合物中用一种第二氨基酸化合物将带电的L-氨基酸化合物酶缩合成一种不带电的化合物;

将不带电的化合物穿过膜运载到一种含水的第二反应混合物中，其中膜不移动大部分的氨基酸化合物;

将已运载的不带电化合物转变成穿过膜不能逆向运载到初始反应混合物的形态。

40、根据权利要求39的方法，还包括分离共渗透膜进入含水的第二反应混合物中的氨基酸化合物的步骤。

41、根据权利要求1的方法，还包括在产物混合物中把不带电的肽转变成一种穿过膜不能逆向渗透的物质。

42、根据权利要求41的方法，其中不带电的肽经过酯酶解离转变成一种带电物质。

43、根据权利要求41的方法，其中缩合酶是一种在PH值约为4.0到8.0范围产生酸性或中性蛋白酶活力的肽。

44、根据权利要求41的方法，其中缩合酶是一种选自丝氨酸蛋白酶、硫醇蛋白酶、羧基蛋白酶和金属蛋白酶的蛋白酶。

45、根据权利要求41的方法，其中缩合酶选自胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶BNP′、无色杆菌属蛋白酶和木瓜酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶和Prolisin并且反应混合物的PH值约为4.0到8.0。

46、根据权利要求41的方法，其中缩合酶是嗜热菌蛋白酶并且反应混合物的PH约为5.5。

47、根据权利要求45的方法，其中膜是一种通过在微孔板的孔中毛细作用来固定的水不相溶有机液体，该有机液体是一种适于不带电肽的溶剂。

48、根据权利要求47的方法，其中微孔板是由选自聚四氟乙烯和聚丙烯的一种材料制成并且溶剂至少含有一种选自正-1-癸醇、正-十六醇、正-十二醇的化合物及其混合物。

49、根据权利要求47的方法，其中膜是一种Bend 1型空心纤维选择性透析膜。

50、根据权利要求44的方法，其中水溶液的PH值约为4.0至6.0。

51、根据权利要求45的方法，其中水溶液的PH值约为4.0至6.0。

52、根据权利要求46的方法，其中第一化合物是D，L-苯丙氨酸甲酯，第二种化合物为含有α-羧酸酯基的N-酰基-β-取代的-L-天冬氨酸。

53、根据权利要求52的方法，其中N-酰基团选自φCH₂OCO-CH＝0和φCH₂CO-;并且β-取代基选自CH₂O-叔丁氧基（ter Buo-），φCH₃O-、NH₂-。

54、一种肽的酶合成方法，它包括以下步骤：

缩合在含水初始反应混合物中的第一和第二种氨基酸化合物生成一种不带电的化合物;

将这种不带电的化合物穿过膜运载到含水的第二种反应混合物中，其中膜不大量地运载氨基酸化合物。

将运载过的不带电化合物转变成穿过膜不能逆向运载回到初始反应混合物中的形态。