PT85548B - Processo enzimatico de membrana para a sintese e separacao de peptidos - Google Patents

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

Âmbito Técnico

A presente invenção refere-se geral mente a um processo enzimãtico para a síntese e separação de pêp tidos utilizando uma membrana permeável a péptidos não carregados mas impermeável a moléculas carregadas, e, mais particularmente, a uma síntese e purificação simultâneas de L,L-dipêptidos, e a sua aplicação ã preparação do éster metílico da L-aspartil-L-fenilalanina (aspartamo).

Técnica Anterior

A utilização de enzimas proteolíticas como catalisadores de condensação para o acoplamento estereo específico de dois L-aminoãcidos para se obterem L,L-pêptidos e • conhecida desde os primeiros dias da química das proteínas. Ja em kt

1909 Mohr e Strohschein descreveram a formação de dipêptidos insolúveis em agua Bz-Leu-Leu-NH^ fazendo reagir Bz-Leu-OH e H-Leu -ΝΗ₂ na presença de proteína degradante da enzima papaína, (E. Mohr e F. Strohschein, Ber 42, 2521 (1909)). A reacção do tipo Mohr e Strohschein ê possível apenas entre os aminoácidos que formam ligações pêptidas que são susceptíveis de clivarem pela papaína ou outro enzima utilizado. De facto, o equilíbrio da reacção de condensação entre os reagentes de aminoácidos e produto pêptido ê muito deslocado para os reagentes aminoácidos. Todavia, o reagente de condensação pode ser levado a consumo completo por acção de massas se, por exemplo, o produto dipêptido fôr fracamente solúvel e precipitar da fase da reacção.

Devido à importância comercial de certos peptidos e ao facto de se conhecerem enzimas que catalisam a formação de peptidos em condições moderadas, tem havido uma grande investigação na síntese enzimãtica de peptidos particularmente de dipêptidos simples. K. Oyama e K. Kihara, KagaKu Sosetsu 35, 195 (1982); K. Oyama e K. Kihara, ChemTech 14, 100 (1984) .

O processo para a síntese enzimãtica do derivado de pêptido aspartamo, descrito na Patente U.S. 4 165 311, daqui em diante designado por processo '311, envolve a condensação catalisada por termolisina do ãcido N-carbobenzoxi -L-aspártico com o éster metílico da D,L-fenilalanina e a precipitação de um complexo intermediário sal de éster metílico do N-carbobenzoxi-aspartamo, para deslocar a reacção para o lado do produto pêptido. O processamento adicional deste complexo intermediário permite a recuperação do éster metílico da D-fenilalani na que pode ser reciclado após essa racemização e de um derivado de N-carbobenzoxi-aspartamo que pode ser convertido em aspartamo por eliminação do grupo protector de carbobenzoxi. O processo '311 deve ser praticado em descontínuo o que ê complicado e difí cil para recuperar a enzima. Ver também: K. Oyama, S. Irino, T. Harada e N. Hagi, Ann, N.Y. Acad. Sei. 434, 95 (1985), Willi Kul lmann, Enzymatic Peptide Synthesis (1987).

O grupo protector de N-carbobenzoxi • joga um papel essencial no processo '311 por: cumprir o requisito

O estrutural imposto pelo sítio activo da termolisina, e por contribuir para a insolubilidade do complexo intermediário aumentan do assim o rendimento da reacção. A eliminação do grupo protector N-carbobenzoxi do derivado de aspartamo deve ser efectuada em condições moderadas, por exemplo, hidrogenação catalítica, pa ra evitar a clivagem da função de éster metílico. A hidrogenação catalítica envolve a inconveniência de se manusear o hidrogénio em larga escala.

Os processos alternativos para levar as reacções de condensação enzimática até ã sua totalização foram também descritas na literatura química. Por exemplo, verificou-se que a utilização de solventes orgânicos como meio de re acção era eficaz para aumentar os rendimentos de péptidos, embora, a diminuição consequente na estabilidade da enzima tenha excluído a sua utilização em larga escala. K. Oyama, S. Nishimura, Y. Nonaka, K. Kihara e T. Hashimoto, J. Org. Chem. 46, 5241 (1981); H. Ooshima, H. Mori e Y. Harano, Biotechnology Letters 7, 789 (1985); K. Nakanishi, T. Kamikubo e R. Matsuno, Biotechno logy 3, 459 (1985).

Tendo em vista as dificuldades acima mencionadas na prática dos processos da técnica anterior para a síntese enzimática de péptidos, particularmente, os requisitos para a precipitação de um complexo intermediário e manuseamento de reagentes perigosos, era desejável desenvolver um processo aperfeiçoado que evitasse essas dificuldades e que pudesse conduzir com segurança a rendimentos efectivos sem a rápida desactiva ção dos catalisadores enzimãticos.

Apresentação da Invenção

A presente invenção refere-se a um processo para a síntese e purificação de um composto, compreendendo as fases de se acoplar um primeiro reagente com um segundo reagente para produzirem um composto transportável numa membrana, transportar-se o composto transportável através de uma membrana que não transporte os reagentes, e converter-se irreversivelmente o composto transportado numa forma que não possa ser retransportada através da membrana.

A presente invenção também se refere a um processo para a síntese e purificação enzimãtica de compostos compreendendo as fases de se acoplar um primeiro composto, incluindo um grupo amino protonado (amõnio), e um segundo compos to, incluindo um grupo carboxilato livre, utilizando uma enzima de condensação numa mistura aquosa para se obter um composto aco piado não carregado (ou não-ionizado), movendo-se contínuamente o composto acoplado não carregado da mistura aquosa por difusão através de uma membrana que transporta selectivamente o composto acoplado não carregado para o lado do produto da membrana. De preferência, o composto acoplado transportado ê um pêptido ou um seu derivado que ê convertido numa molécula carregada (ou ioniza da) de modo a não se retrodifundir através da membrana. Assim, a formação do produto composto acoplado é favorecido na mistura re accional devido a ser constantemente removido dela.

A presente invenção também se refere a um processo para a síntese enzimãtica de derivados de pépti dos, como por exemplo, aspartamo e os seus análogos, compreendeu do as fases de se condensar um ãcido N-acil-^-substituído-L-aspãrtico incluindo um grupo -carboxilato com um éster de alquilo inferior da fenilalanina incluindo um grupo oC-amõnio num meie reaccional aquoso incluindo uma enzima de condensação, para se obter o éster de alquilo inferior (isto ê, 1 a 6 átomos de carbo no) da N-formil-L-aspartil (^-substituído)-L-fenilalanina, um pêptido não carregado, e transportar-se o pêptido não carregado da mistura reaccional aquosa para uma mistura de produtos através de uma membrana permselectiva.

A presente invenção também se refere a um processo para a síntese enzimãtica de péptidos compreendendo as fases de se condensarem um primeiro e segundo compostos aminoácidos numa mistura reaccional aquosa inicial para formar um composto não carregado, transportar o composto não carregado para uma segunda mistura reaccional através de uma membrana que não transporte quantidades substanciais dos compostos aminoácidos, e converter-se o composto não carregado transportado numa forma que não possa ser retransportada através da membrana para a mistura reaccional inicial. 0 composto transportado, convertido nu-

ma forma que não ê retransportada através da membrana, pode ser removido da segunda mistura reaccional. Além disso, os compostos do primeiro e segundo aminoácidos co-permeando a membrana com o composto não carregado na segunda mistura reaccional podem ser separados da segunda mistura reaccional e feitos opcionalmente regressar ã mistura reaccional inicial.

A presente invenção também apresenta um processo para a resolução enzimãtica de compostos aminoãci dos compreendendo as fases de se hidrolisar um composto D,L-aminoãcido numa mistura reaccional aquosa incluindo uma enzima hidrolisante para formar um composto L-aminoãcido carregado e um composto D-aminoácido não carregado na mistura reaccional aquosa e transportar o composto D-aminoãcido não carregado da mistura reaccional aquosa através de uma membrana de rejeição de iões pa ra uma mistura de produtos efectuando assim uma resolução enantiomêrica. 0 composto D-aminoãcido não carregado na mistura de produtos pode ser acumulado e pode ser recuperado por processos convencionais. 0 processo para a resolução enzimãtica de compostos aminoácidos pode ser combinado com outros processos acima dee critos.

Constitui um objecto da presente in venção apresentar um processo para a síntese enzimãtica de pêpti dos que resulta na síntese e purificação simultâneas do produto pêptido.

Constitui outro objecto da presente invenção apresentar um processo para a síntese e purificação segura, económica e eficiente de péptidos e seus derivados, particularmente aspartamo.

Constitui ainda outro aspecto da pre sente invenção apresentar um processo económico para a síntese enzimãtica de péptidos que resulta no uso eficiente da enzima e meios para efectuar a síntese de modo contínuo.

Constitui ainda outro objecto da pre sente invenção apresentar um processo particularmente adaptado ã síntese enzimãtica de aspartamo e dos seus derivados com D,L-fenilalanina e N-protegido-p-substituído-L-aspartato em rendimentos quantitativos substanciais.

Breve Descrição dos Desenhos

Os objectos anteriores e outros e as suas vantagens são conseguidos pela invenção, como serã aparente a partir da descrição detalhada seguinte tomada em conjunto com os desenhos anexos, em que:

A Figura 1 é uma ilustração esquema tica da síntese enzimática do espartamo de acordo com a presente invenção,

A Figura 2 é uma representação esquemática de um dispositivo para a prática do processo da presen te invenção.

A Figura 3 ê um gráfico ilustrando a quantidade de produto (derivado de aspartamo) formado com o tempo nos Exemplos 1 e 2.

A Figura 4 ê um gráfico ilustrando a quantidade de de produto (derivado de aspartamo) formado duran te o período do Exemplo 4.

A Figura 5 ê um gráfico ilustrando a quantidade de produto (derivado de aspartamo) formado no perío do do Exemplo 5.

A Figura 6 é um gráfico ilustrando a quantidade do produto (derivado de aspartamo) formado com o tempo no Exemplo 6.

A Figura 7 é um gráfico ilustrando a quantidade de produto (derivado de aspartamo) formando com o tempo no Exemplo 7.

A Figura 8 é um gráfico ilustrando a quantidade de produto (derivado de aspartamo) formado com o tem po no Exemplo 8.

A Figura 9 é uma representação esquemática de um dispositivo para a prática da presente invenção que ilustra os reactores do lado do produto como descrito no Exem pio 9.

A Figura 10 é um gráfico ilustrando a quantidade de produto (derivado de aspartamo) formada com o tem po no Exemplo 9 com e sem a utilização de uma resina permutadora de iões.

Modos mais Adequados para Realizar a Invenção

A invenção aqui apresentada descrita apresenta um procedimento para levar ã totalização a síntese enzimática de peptidos numa mistura reaccional aquosa separando o intermediário de péptido não carregado, ou seu derivado, da mistura reaccional por meio de uma membrana que transporta selec tivamente o péptido não carregado para fora da mistura reaccional para uma mistura de produtos. Dado que a membrana é substancialmente impermeável aos reagentes (moléculas carregadas) a remoção do intermediário de péptido da mistura reaccional provoca uma diminuição da concentração de péptido em equilíbrio que desloca a reacção para a sua finalização por acção de massas.

As membranas mais úteis na prática da presente invenção são as membranas líquidas imobilizadas (ILM) compreendendo um líquido não polar embebido num material de suporte microporoso preferivelmente uma folha polimêrica que ê subs tancialmente impermeável ãs enzimas, reagentes e produtos. Os po límeros hidrofõbicos como por exemplo polipropileno são os materiais de suporte preferidos. Os módulos de ILM podem ser produzi dos utilizando fibras ocas de polipropileno. Celgard, uma marca registada da Celanese Corporation, 1211 Avenida das Américas, No va Iorque, N.Y. 10036 e vendido por Celanese Fibers Marketing Corporation, Charlotte, N.C., é um exemplo de fibras ocas comercialmente disponíveis de polipropileno. Podem também opcionalmen te serem utilizados no fabrico do módulo de ILM compostos vasãveis conhecidos na técnica e também tubagem ou tubo de policlore to de vinílo. Outro polímero para o fabrico do material de supor te microporoso ê o TEFLON, uma marca registada da E. I. Dupont de Nemours & Co., para polímeros de hidrocarboneto fluorados. 0 material de suporte microporoso típico é GORE-TEX, uma marca registada de W. C. Gore & Associates, Inc.

Os microporos atravessam o material de suporte e devem ser dimensionados de modo a que se fixe neles um líquido imobilizado por capilaridade e que não se escape deles quando submetido a, por exemplo, pressões diferenciais através da membrana ou outras condições de reacção normais. Sujeito às limitações acima estabelecidas ê vantajoso maximizar a área de ϊ

contacto entre o líquido imobilizado e a mistura reaccional para maximizar a taxa de transferência (fluxo) do produto de péptido não carregado através da membrana. Deve notar-se que o tamanho de poros preferido variará com as propriedades do líquido particular imobilizado, reagentes utilizados, produtos obtidos, e fac tores semelhantes, e também que o tamanho óptimo dos poros pode ser determinado empiricamente pelos especialistas. Encontra-se na Patente U.S. NÇ. 4 174 374 uma discussão útil da escolha de tamanho de poros. 0 uso e preparação de membranas de líquidos imo bilizados são descritos nas seguintes referências, S. L. Matson, J. A. Quinn, Coupling Separation and Enrichment to Chemical Conversion in a Membrane Reactor, documento apresentado ao AICHE Annual Meeting, New Orleans, Louisiana (November 8-12, 1981) e S. L. Matson e J. A. Quinn, Membrane Reactors in Bioprocessing, Ann. N.Y. Acad. Sei. 469, 152 (1986).

líquido imobilizado retido no suporte microporoso por capilaridade deve ser imiscível com a água e ser um bom solvente para o produto péptido não carregado que deve ser transportado através da membrana (difundido) a uma taxa razoável, isto ê deve ter boas características de transporte/ele vado fluxo; embora, as moléculas carregadas ou ionizadas em ambos os lados da reacção e do produto da membrana sejam, para a maior parte dos casos, não transportáveis através da membrana em qualquer das direcções, isto ê, têm boa selectividade/rejeição de iões.

A selecção da melhor combinação de material de suporte e de líquido imobilizado para uso na síntese enzimática de um péptido de acordo com a presente invenção depen derã em parte, da natureza dos reagentes particulares utilizados, produtos pretendidos e solventes do sistema.

Os líquidos imobilizados geralmente preferidos para a prática da presente invenção incluem solventes orgânicos imiscíveis com a água, como por exemplo álcoois com 6 a 20 átomos de carbono, ramificados e não ramificados, por exemplo, n-decanol, n-dodecanol, n-hexadecanol, e suas misturas, são também preferidas misturas de solventes orgânicos imiscíveis com a água incluindo as suas misturas. Esses solventes incluem mas

I

não se limitam a Ν,Ν-dietil-dodecanamida, dodecano e 2-undecanona.

Outro tipo de membrana útil na prática da invenção compreende filmes sólidos hidrofõbicos obtidos de polímeros orgânicos como por exemplo policloreto de vinílo ou produtos semelhantes. A preparação destas membranas de polímeros está bem descrita na literatura, por exemplo, 0. J. Sweeting, Edi tor, Science and Technology of Polymer Films, Interscience, New York (1968), e aplicação extensiva dessas membranas para a separação de gases e de líquidos ê discutida em S. T. Hwang e K. Kam mermeyer, Membranes in Separations, Technlques of Chemistry, Vol. VII, (A. Weissberger, editor) John Wiley & Sons, Inc., New York (1975) .

Uma concretização preferida da invenção utiliza uma membrana de um sistema reactor/separador que tem uma mistura reaccional aquosa ou fase circulante em contacto com um dos lados de uma membrana ILM e uma fase aquosa do produto ou mistura circulante contracorrente na face oposta da membra na. S. L. Matson e J. A. Quinn, Ann, N.Y. Acad. Sei. 469, 152 (1986). 0 pH e temperatura da reacção e fases de produto são man tidos num valor que mantém os reagentes numa forma que minimiza o seu transporte através da membrana a valores de pH entre cerca de 4,0 e 9,0. 0 transporte do pétido intermediário não carregado através das referidas membranas e da fase de produto ê feita pelo gradiente de concentração através da membrana criado pelo aumento da concentração de péptido neutro ou não carregado na fase reaccional. A actividade de transporte ou fluxo através da membrana pode ser significativamente aumentado pela conversão simul tânea e irreversível do páptido transportado, na fase do produto, para uma espécie que não se possa retrodifundir. Por exemplo, a última conversão pode resultar na formação de um péptido polar que não se possa retrodifundir e assim complementa a força motriz para conseguir a finalização da reacção de acoplamento. Um exemplo de uma membrana reactor/separador que pode ser adaptada para a prática da presente invenção ê encontrada na Patente U.S. N9. 4 187 086.

As membranas alternativas reactor/ n

/separador correntemente disponíveis com as configurações que po dem ser adaptadas ã prática da presente invenção incluem módulos de fibras ocas descritos no Pedido de Patente U.K. 2 047 564 k, e filtro de placa convencionais e de tipo-quadro bem conhecidos da técnica.

Em adição ao transporte selectivo do péptido não carregado a membrana faz uma barreira entre a fase reaccional e a fase do produto que evita a mistura indesejável de, e reacções entre, os componentes de cada fase.

Numa membrana preferida reactor/separador com a configuração de acordo com a presente invenção, o equilíbrio químico entre os reagentes ê na realidade puxado através da membrana por condução de uma conversão irreversível do péptido não carregado transportado, para uma espécie impermeã vel à membrana, no lado do produto da membrana. Este tipo de mem brana de reactor/separador utiliza um processo acoplado de duas 1 2 enzimas (E e E ) do tipo geral:

Ε¹ E²

A⁺ + Ç “* D*

Os reagentes carregados k e B são aminoãcidos e/ou pequenos péptidos que são condensados com auxílio de uma enzima formadora de péptido E^ para formar o péptido intermediário não carregado C que é selectivamente transportado através da membrana para o lado do produto. Pensa-se que os grupos funcionais reactivos nos reagentes que não possam participar na reacção pretendida podem ser protegidos ou bloqueados, quando necessário, para evitar reacções laterais indesejáveis e/ou alterações nos produtos. No la do do produto da membrana o péptido não carregado C ê convertido no péptido carregado D que não se pode retrodifundir através da membrana, provocando uma deslocação do equilíbrio químico na mis tura reaccional para a produção de mais Ç.

Este conceito é ilustrado na Figura 1, para o caso específico de uma condensação enzimãtica do éster metílico da D,L-fenilalanina com (N-e ^-protegido) N-formil-p-benzil-L-aspartato, na presença de termolisina a um valor de pH de cerca de 5,5.

No esquema reaccional ilustrado na Figura 1 o reagente A⁺ ê o ester metílico da D,L-fenilalanina e B é o N-formil-B-benzil-L-aspartato. Os reagentes são condensados no lado da reacção da membrana pela enzima termolisina for mando o pêptido não carregado C. Escolhe-se o valor de pH para manter os reagentes no seu estado carregado e minimizar assim a sua difusão através da membrana juntamente com o pêptido não car regado C.

Embora o equilíbrio químico para a reacção de condensação favoreça largamente as espécies reagentes A⁺ e B , a difusão do produto pêptido não carregado C através da membrana para o lado do produto requer a produção constante de C para manter-se o equilíbrio químico no lado da reacção da membra na.

No lado do produto da membrana uma enzima de esterase E converte rapidamente e irreversivelmente o pêptido não carregado C difundido através da membrana para um pê£ tido carregado D que não se pode retrodifundir para o lado da re acção. Assim o equilíbrio químico no lado da reacção ê efectivamente puxado através da membrana para a produção do produto não carregado C. Em seguida, converte-se o pêptido D em aspartamo por hidrólise ácida, que remove os grupos protectores de formilo e benzilo, seguido pela esterificação C-terminal com metanol.

processo precedente pode ser praticado numa membrana de caudal contra-corrente reactor/separador 10, como se mostra na Figura 2, operando em condições controladas de pH e temperatura, de modo a que se permita a condensação de uma mistura reaccional compreendendo um ãcido N-acil-p-substi tuído-L-aspãrtico, por exemplo, N-formil-J3-benzil-L-aspartato, possuindo um grupo ©<-carboxilato livre (espécie electronegativa) que se deixa condensar com um reagente, por exemplo, o éster metílico da D,L-fenilalanina, possuindo um grupo oc-amino livre protonado (espécie electropositiva), sob a acção catalítica de proteases activas na gama de pH de 4,0 a 9,0, para se obter um dipêptido totalmente protegido de L-aspartil-L-fenilalinina não contendo grupos ionizados (espécie electroneutra). No lado da re acção da membrana, faz-se circular a mistura reaccional do tanque do reactor 12 auxiliado pela bomba 14, através da conduta de aliI

mentação 16 através do separador 18 para a conduta de extracção 20 que regressa ao tanque do reactor 12. No lado do produto da membrana faz-se circular uma mistura ou conjunto de produtos incluindo o péptido não carregado totalmente protegido, por exemplo, o éster metílico da N-formil-p-benzil-L-aspartil-L-fenilala nina transportado através da membrana, do tanque do reactor do produto 22, auxiliado pela bomba 24, através da recolha do produ to na conduta 26, através do lado do produto do separador 18, pa ra a conduta de extracção do produto 30. Esta mistura de produ2 tos inclui uma segunda enzima E uma asterase, ou outro reagente adequado, que pode clivar pelo menos um dos grupos protegidos transportado pelo péptido não carregado, produzindo assim uma es pécie electrocarregada que não se pode escapar do fluxo de extrac ção por retrodifusão através da membrana. Se se utiliza uma este rase, a esterase preferida terá uma actividade proteolítica e uma gama de pH preferida de cerca de 6,0 a 9,0. A aminoacilase I,X-quimotripsina e subtilisina A são exemplos de esterases conside radas úteis na presente invenção.

O produto carregado pode ser periodicamente descarregado e/ou continuamente removido da fase do pro duto por meios convencionais tais como resinas de permutação iõnica, e os efluentes remanescentes podem ser reciclados através do sistema. 0 produto resultante ligado às resinas de permutação de iões podem ser dessorvidos e recuperados utilizando procedimentos convencionais.

A selecção do(s) reagente (s) de des. protecção adequado(s) é determinada pela natureza química dos gru pos protectores utilizados nos reagentes, como por exemplo, o ãci do N-protegido-L-aspãrtico, e como acima indicado a escolha dos grupos protectores ê por sua vez ditada pelas condições estruturais impostas pelo sítio activo da enzima de condensação.

Em geral, as enzimas úteis na prãti ca da presente invenção são enzimas proteolíticas, por vezes designadas por proteases, que podem ser divididas em dois grupos. As mais vulgarmente utilizadas são as endopéptidases, que apenas clivam as ligações internas, e exopêptidases, que apenas clivam as ligações terminais. As enzimas úteis incluem serina proteína-

ses, (EC 3.4.21) como por exemplo quimotripsina, tripsina, subti lisina BNP' e Achromobacter protease; tiol proteínases (EC 3.4.

22), como por exemplo papaína, carboxil proteínases (EC 3.4.23), como por exemplo pepsina, e metaloproteínases (EC 3.4.24), como por exemplo termolisina, prolisina, Tacynasen N (St. caespitosus) e Dispase. A ligação das enzimas a suportes insolúveis, segundo procedimentos bem conhecidos pelos praticantes da técnica, pode ser incorporada na prática da presente invenção; e embora a liga ção das enzimas não seja uma fase essencial, pode ser desejável em certas aplicações. De entre as muitas proteases potencialmente úteis para a prática da presente invenção, a termolisina /È.C. 3.4.247 é a enzima de condensação mais preferida devido à sua és. tabilidade notável, grande disponibilidade, baixo custo e gama extensa de pH entre 5,0 a 9,0. Outras proteases preferidas inclu em pepsina e penicilopepsina /T. Hofmann e R. Shaw, Biochim. Bio phys. Acta 92 543 (1964)y e, a protease termoestãvel da Penicillium duponti /S. Emi, D. V. Meyers e G. A. Iacobucci, Biochemistry 15 842 (1976).7. Esperava-se que funcionassem a um pH de cerca de 5,5, apresentassem boa estabilidade a esses valores de pH, e não necessitassem da presença de Zn e Ca para manterem a sua actividade.

A realização prática da selectivida de enantiomêrica isto ê, no caso acima descrito, a produção apenas do isõmero L,L do péptido Ç, está directamente relacionada com a enzima escolhida, funcionamento óptimo da membrana, nature za química do material de suporte e pH da fase reaccional aquosa.

Uma membrana preferida para a prãti. ca do processo específico acima descrito é um material de suporte de polipropileno microporoso incluindo uma mistura de n-hexadecanol e n-dodecano nele imobilizado. Esta membrana está disponível de Bend Research Inc., 64550 Research Road, Bend, Oregon 97701, E.U.A. segundo a marca registada de Type 1 Hollow Fiber Selective Dialysis Membrane e é preferida com as reacções dos Exemplos 1-4. Outra membrana preferida utiliza as fibras ocas de polipropileno de Celgard Tipo 2400 (Celgard é uma marca registada da Celanese Corporation, 1211 Avenue of the Américas, Novalor que, N.Y. 10036. Pode obter-se Celgard de Celanese Fibers Marke ting Corporation, Charlotte, N.C.) como material de suporte microporoso incluindo uma mistura de 30% v/v de N,N-dietil-dodecanamida em dodecano como liquido orgânico imíscível com a água imo bilizado por capilaridade nos poros de uma folha microporosa de Celgard. Esta membrana foi obtida de Bend Research, Inc., 64550 Research Road, Bend, Oregon 97701, E.U.A., sob a marca registada de Type 2 Hollow Fiber Selective Dialysis Membrane e é preferi da com as reacções dos Exemplos 5-9. Utilizaram-se Celgard Type 2400, fibras ocas de polipropileno com um tamanho de poros de 0,025-0,050 um e uma parede com a espessura de 25 um, na Type 2 Hollow Fiber Selective Dialysis Membrane of Bend Research, Inc. Quando se opera a pH de cerca de 5,5, estas membranas apresentam uma elevada selectividade, por exemplo, quando praticando o processo da Figura 1, mediram-se selectividades na gama de cerca de 500:1 (p/p) a favor da espécie de péptido não carregado. Isto é, 500 miligramas de péptido não carregado (C) são transportados através da membrana por cada miligrama de reagente carregado trans

4. — portado (A ou B ) .

Tal como acima mencionado, para aplicação da presente invenção será necessário, ou desejável, blo quar ou proteger vários grupos funcionais nos reagentes e produtos para evitar reacções laterais indesejáveis que possam evitar a produção do produto desejado e/ou reduzir o seu rendimento e suprimir as cargas elêctricas no péptido intermediário. A Tabela I a seguir apresenta uma série de combinações escolhidas de grupos protectores e de condições de desprotecção úteis em ligação com a prática da presente invenção.

TABELA I. GRUPOS PROTECTORES E REAGENTES DE DESPROTECÇÃO ÚTEIS

NA SÍNTESE DO ASPARTAMO (APM).

r!	R?	R?	Grupo Removido/Reagente	Produto
0CH2O-	0CH2OCO-	ch3o-	R1,R2/(Pd)H9	APM
0CH2O-	-CH = 0	ch3o-	R /H3O	B-benzil-APM
0CH2O-	-CH = 0	ch3o-	R /esterase de fungos	N-formil-Bbenzil-Laspartil-L fenil-alanina
ter-BuO	-CH = 0	CH3O-	r1,r2/h,o+	APM
CH3O-	-CH = 0	ch30-	R /esterase de fungos	N-f0rmi1-isoAPM
ch3o-	-CH = 0	ch3o-	R /«-quimotripsina	N-formil-isoAPM
nh9-	0CH-OCO-CH	3°”	R^/asparaginase	N-CBZ-APM
Éster metílico da		1 2 R ,R /hidantoi-	APM

L-dihidroorotil- nase

L-fenilalanina

ch₃och₃o0CH₂OCO-CH₃O0CH₂CO- CH3O3

R /esterase de fungos

R /penicilina acilase

N-CBZ-isoAPM

APM-B-êster metílico

Como resultado da enantioselectividade das enzimas de condensação seleccionadas e da discriminação funcional exercida pela membrana, a prática da invenção utilizan do o éster de N-formil-L-aspartil-JB-benzilo e o éster metílico da D,L-fenilalanina podem atingir uma resolução enantiomérica de 99,8% do reagente do éster metílico da fenilalanina racémico, aparecendo o enantiõmero-L como éster metílico da N-formil-L-aspartil (p-benzil)-L-fenilalanina, um derivado de aspartamo, com o enantiõmero-D permanecendo na fase reaccional.

éster metílico da D-fenilalanina que permanece na fase reaccional pode ser recuperado a partir de la, re-racemizado para a fase—D,L, e reciclado para a matéria prima. Este facto constitui uma vantagem comum para muitos processos que utilizam reagentes aminoácidos racémicos, por exemplo o processo *311 acima descrito.

As vantagens económicas da presente invenção derivam, pelo menos em parte, do uso de um reagente de alimentação do tipo racemato em vez de um enantiõmero-L prê-resolvido mais caro. Esta vantagem ê tornada possível pela resolução óptica in situ do éster metílico da D,L-fenilalanina devida a: (a) a enantiosselectividade da enzima de condensação, e (b) da elevada selectividade da membrana a favor das espécies não car regadas.

Os processos preferidos para a síntese económica da fenilalanina racémica são os baseados na utili zação do benzaldeído através de 5-benzalhidantoína por vezes designada como processo Grace, ou a carbonilação catalítica do cio reto de benzilo para ãcido fenilpirúvico, um procedimento desenvolvido por Sagami Chemical Research Center, Tóquio, Japão (por vezes designado como processo de Toyo Soda de Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd., Yamaguchi, Japão).

Deve notar-se pelos especialistas que a prática da presente invenção não ê necessariamente restrin gida à síntese de edulcorantes péptidos, como por exemplo aspartano ou os seus análogos ou derivados. A invenção pode também ser utilizada para a síntese de outros péptidos úteis, di-, tri-, te . tra- e pentapéptidos ou péptidos de complexidade mais elevada,

Ί C i

que são susceptíveis de se difundirem através de uma membrana permselectiva a uma taxa razoável. Por exemplo, considerando a especificidade da ligação da termolisina e assumindo que a presença de apenas uma ligação sensível à termolisina no produto (in dicada pela seta na fórmula a seguir) se pode sintetizar a met-encefalina (1) pelo seguinte esquema:

(Bzl) (+0C0)-Tyr-Gly-Gly-OH + H-Phe-Met-(0+)-C(CHg)₃

Termolisina pH 5,5 (Bzl) (+0C0)-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-(0+)

H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-OH (1)

A possibilidade de uma síntese enzi mãtica total em fases da met-encefalina utilizando -quimotripsina e papaína ê documentada na literatura. Ver: W. Kullmann, J. Biol. Chem 255, 8234 (1980).

Outra aplicação potencialmente útil da presente invenção é na síntese enzimãtica da Gramicidina S (2) pelo seguinte esquema:

H-Val-Orn(CBZ)-Leu-D-Phe-Pro-OH | f Termolisina pH 5,5

Vai' (CBZ)Orn

Leu

D-Phe

Pro

Pro

Vai

D-Phe

Leu

Orn(CBZ)

Pd/H₂

Leu

(2)

Vários outros exemplos da síntese enzimãtica de produtos péptidos úteis em que a presente invenção pode encontrar aplicação e que são descritos na literatura são a síntese da angiotensina, substância P, eledoisina, caeruleína e Leu-encefalina.

Os especialistas notarão que a presente invenção também encontra aplicação em outros sistemas para além dos péptidos.

Por exemplo, o uso de éster hidrola ses como por exemplo esterase do fígado dos suínos /ÊC 3.1.1.17 para a resolução assimétrica de diesteres de ácidos dicarboxílicos proquirais em monoêsteres quirais é bem conhecida /C.J. Sih et al., Ann N.Y. Acad. Sei. 471, 239 (1986)/. A mesma enzima pode ser utilizada do modo descrito na presente invenção para a re solução dos compostos de ácidos carboxílicos racémicos, através de transporte selectivo de um éster quiral através da membrana e retenção do ãcido enantiomêrico não reactivo na fase reaccional.

Os seguintes exemplos detalhados são apresentados para ilustrarem adicionalmente a presente inven ção.

EXEMPLO 1

Preparou-se um derivado de aspartamo de acordo com a presente invenção da forma seguinte:

Adicionaram-se 500 mg de uma enzima de termolisina (Daiwa Chem. Co., Osaca, Japão) a uma solução con tendo 5,02 g (20 mmol) de éster N-formil-L-aspartil-p-benzílico, 4,31 g (20 mmol) do éster metílico da L-fenilalanina em 100 ml de agua, ajustada a pH 5,5, representando um total de 8 x 10 uni dades proteolíticas.

Incubou-se a mistura reaccional trar. parente resultante durante quinze horas a 409C, quando se tornou aparente a presença do dipêptido insolúvel éster metílico de N-formil-p-benzil-L-aspartil-L-fenilalanina. Colocou-se em seguida a mistura resultante num frasco de 200 ml, ligado ao lado da reacção, neste caso ao lado do tubo, de um separador experimental de fibras ocas de Bend Research, Inc. Type 1 Hollow Fiber Selective Dialysis Membrane que produziu 900 cm de área de mem brana. 0 lado do produto da membrana (lado da parede do separador) foi ligado a uma fonte de mistura aquosa (produto) (volume total = 200 ml) contendo 500 mg da enzima Acilase I (EC 3.5.1.14) de Aspergillus Sp. (Sigma A 2156), a pH 7,5. Esta enzima, habitu almente escrita como aminoacilase, funcionava como uma esteraseC- terminal, no N-acetil- e no N-formil-B-benzil aspartamo.

Fizeram-se circular as misturas de reacção e produto ã temperatura ambiente através do separador de fibras ôcas em contracorrente a um caudal de 600 ml/min, com a ajuda de bombas peristãlticas. A configuração desse dispositivo é como ilustrado da Figura 2. Dado que ambas as reacções (conden sação e hidrólise do éster) são protogénicas, o pH das misturas reaccional e de produto diminui à medida que progride a reacção. A constância de pH nas misturas reaccional e de produto, foi man tida por uso de substâncias estabilizantes de pH.

A formação de N-formil-p-benzil-L-aspartil-L-fenilalanina foi controlada por HPLC. A análise cromatogrâfica foi conduzida num instrumento Tracor Modelo 995 juntamente com um conjunto detector LDC Spectromonitor II controlado a 254 nm para a detecção de aminoácidos, produto dipêptido to talmente protegido e dipêptido. A coluna utilizada foi um cartucho NOVA-PAK C^g Radial-Pak, 8 mm x 10 cm, colocada no Modulo de Compressão Radial de Millipore Waters RCM-100.

A fase móvel utilizada para a detec ção do dipêptido totalmente protegido foi uma mistura v/v de 45% de metanol (qualidade HPLC), 5% de tetrahidrofurano (qualidade

HPLC), e 50% de uma solução tampão a 1% de K^PO^. Para a detecção do produto dipêptido, a fase móvel consistia numa mistura v/v 40% de metanol e 60% de uma solução tampão a 1% de KE^PO^ (1 ml de trietilamina por litro de solvente adicionado para mini mizar o produto de rejeição e ajustou-se o pH atê 4,3 com ãcido fosfórico a 80%). Manteve-se o caudal a 1 ml/minuto.

Os dados de HPLC relacionados com a formação da N-formil-p-benzil-L-aspartil-L-fenilalanina são resu midos na Tabela II a seguir apresentada, e são expressos como a quantidade total (mg) de produto dipêptido acumulado na solução de produto em função do tempo.

Verificou-se que o valor da concentração de dipêptido não carregado no equilíbrio que corresponde ao seu ponto de saturação na agua a pH 5,5 era cerca de 0,05% a 259C. A quantidade de dipêptido não carregado transportado por 2 cm da membrana por hora era de cerca de 0,222 mg, indicando que a manutenção do equilíbrio necessitava da dissolução do dipêptido insolúvel e/ou síntese de novo do dipêptido. Observou-se a dissolução quase completa da fase de dipêptido não carregado insolúvel na mistura reaccional apôs cerca de cinco horas, quando se parou a reacção. Apresenta-se na Figura 3 uma representação grãfica de dados obtidos na Tabela II. A função linear indica que a transferência de pêptido através de membrana se faz num es tado estacionário. A taxa observada de formação do produto dipêp 2 tido de cerca de 0,222 mg/cm /hr (Tabela II) foi confirmada como semelhante ao caudal de dipêptido não carregado através da membrana (0,211 mg/cm /hr) medido em 0,05% na água como estimado com base teórica.

Neste ponto o sistema descrito devia continuar estacionário se se tivesse feito adição contínua ã mistura reaccional dos dois aminoácidos reagentes, a um caudal de cerca de 120 mg/hr, para manter o sistema saturado em dipêpti^ do não carregado.

Para conseguir totalmente a selecti vidade da membrana pode ser necessário intercalar uma segunda membrana em série com a primeira membrana antes do contacto com a segunda enzima devido ao facto da selectividade através de uma ω n

única membrana ser inferior devido ã concentração elevada de ami noãcido na solução reaccional.

A solução de produto (200 ml) foi recuperada, ajustada a pH 2,5 e arrefecida para 49C durante a noite. Recolheu-se e mergulhou-se o precipitado e recristalizou-se de MeOH:H₉O para se obterem 307 mg de N-formil-B-benzil-L-ais ^z 25o partil-L-fenilalanina /c*_7_D ’ - “5,69 (C=l,2; EtOH); idêntico a (IV, 13C-RNM) para uma amostra autêntica preparada por hidrólise 25° de N-formil-p-benzil-aspartamo com Aspergillus esterase, = -5,39 (0=1,3; EtOH).

Tempo (min)

120

180

240

300

TABELA II

Quantidade de solução pêptido/produto (mG)

124

228

412

617

882

1015

EXEMPLO 2

Conduziu-se uma experiência semelhante a do Exemplo 1, com excepção de se utilizarem 8,63 g do éster metílico da D,L-fenilalanina em vez do enantiómero-L. Apre sentam-se resumidamente os resultados obtidos na Tabela III. 0 isolamento do pêptido não carregado de 200 ml da solução do pro9 RO duto produziu 310 mg do produto, /ò<7_D ’ = -6,49 (0=1,4; EtOH), idêntico em todos os aspectos (IV, 13C-RNM) de uma amostra autên tica de N-formil-^-benzil-L-aspartil-L-fenilalanina.

Tempo (min)

TABELA III

Quantidade de solução de pêptido/produto _

30	166
60	258
120	475
180	686
240	996
300	1073

Um gráfico dos dados apresentados resumidamente na Tabela III (Figura 3) mostrou de novo a existên cia de um processo de estado estacionário quando se operou o reactor com o éster metílico da D,L-fenilalanina. A estereoespecificidade da termolisina ê demonstrada pela formação exclusiva do mesmo L,L-dipéptido descrito no Exemplo 1. 0 éster metílico da D-fenilalanina retido na fase de tubo (mistura reaccional) não inibia a cinética global da formação de pêptido.

EXEMPLO 3

Aqueceu-se sob refluxo durante nove horas uma mistura de 1,0 g de N-formil-p-benzil-L-aspartil-L-fenilalanina, preparada de acordo com o Exemplo 1, 4,0 ml de água, 4,0 ml de tetrahidrofurano e 1,0 ml de ãcido clorídrico concentrado (12 N). Arrefeceu-se a seguir a mistura e ajustou-se o pH a 4,0 com uma solução de NaOH a 50%. Removeu-se em seguida o tetrahidrofurano por evaporação a T 4 359C e 2660 Pa. Completou-se a reacção por armazenamento a 59C durante uma hora, em seguida filtrou-se a amostra, lavou-se com 1 ml de água e gelo, e secou-se a pressão reduzida para se obterem 367 mg de um sólido branco. Este material era idêntico a uma amostra autêntica de aspar~ 2^C til fenilalanina determinada por comparaçao com HPLC e IV. /õ<J7_D“ = +129 (C=0,5; HC1 0,lN em 50% MeOH).

Converteu-se a aspartil fenilalani• na em aspartamo por tratamento com metanol e ãcido clorídrico, . como descrito por G.L. Bachman e B.D. Vineyard, Patente U.S. N9.

o o

173 562, Exemplo 1.

EXEMPLO 4

Conduziu-se uma experiência semelhante ã do Exemplo 1, com excepção de se utilizarem 5,65 g (20,1 mmol) do ester metílico do ãcido N-carbobenzoxi-L-aspãrtico e 4,38 g (20,3 mmol) do éster metílico da L-fenilalanina como reagentes. Dissolveram-se os aminoácidos em 100 ml de água, ajustou -se o pH da solução a 5,5, e adicionaram-se 500 mg de termolisi5 * ** na Daiwa (8 x 10 unidades proteolíticas). Prê-incubou-se a solu ção durante quinze horas a 409C, precipitando-se uma quantidade substancial de N-CBZ-(éster ^-metílico)-L-asp-L-fenilalanina. Li gou-se a suspensão ao lado, do tubo de um Type 1 Hollow Fiber Se 2 lective Dialysis Membrane (Bend Research Inc.) contendo 900 cm de superfície de membrana, e operou-se a máquina ã temperatura ambiente durante cinco horas contra uma fase do lado da parede de 200 ml de água contendo 500 mg de Acilase I (Sigma) a pH 7,5. A acumulação do produto pêptido na fase de parede foi controlada por HPLC, e os resultados são reproduzidos na Tabela IV e Figura 4.

Apõs um processamento de cinco horas parou-se a reacção, recuperou-se a fase do lado da parede (200 ml), ajustou-se a pH 2,5 e armazenou-se durante a noite a 49C. O produto precipitado foi recolhido e recristalizado de CHgOHz^O para se obterem 405 mg (uma recuperação de 86%) de N-CBZ-(éster p-metílico)-L-asp-L-fenilalamina (N-CBZ-iso-APM) ΛίΖη⁵⁹ = +6,09 (C=l,l, EtOH), idêntico (^^C-RNM) a uma amostra 25o autentica de N-CBZ-iso-APM, = +5,59 (C=l,l, EtOH), prepa rada por acoplamento químico e esterõlise parcial com Acilase I.

TABELA IV

Tempo (min)

120

180

240

300

Quantidade de solução de pêptido/produto(mg)

177

214

333

381

459

470

Tal como observado antes nas experjí ências dos Exemplos 1 e 2, o gráfico da Figura 4 indica que a acumulação de N-CBZ-iso-APM se efectuava a uma taxa constante de cerca de 200 mg/hr.

A conversão de N-CBZ-iso-APM em APM pode ser praticada nas condições prescritas no Exemplo 3.

EXEMPLO 5

Preparou-se o derivado de aspartamo, N-f ormil- (p-metil) -asp-fe de acordo com a presente invenção do modo seguinte: adicionara-se a uma solução contendo 6,00 g (35 mmol) de ácido N-formil-(p-metil)-L-aspãrtico, 10,00 g (48 mmol) de éster metílico da L-fenilalanina em 100 ml de água, ajustada a pH 7,0, 770 mg de enzima de termolisina (Daiwa Chemical Co., Osaca, Japão) representando um total de 1,2 x 10 unidades proteolíticas. Incubou-se a solução transparente resultante durante 1 hr a 409C, quando a análise de HPLC indicou a presença de 433,8 mg de N-formil-(p-metil)-asp-fe-OMe. Arrefeceu-se a solução para 259C, ajustou-se o pH a 5,0, e colocou-se a solução num frasco de 200 ml ligado a um tubo lateral e um separador de fibras ocas (Type 2 Hollow Fiber Selective Dialysis Membrane, Bend Resear2 ch Inc.) que produziu 450 cm de uma ILM feita de 30% v/v de N,N -dietil-dodecanamida em dodecano. Ligou-se o lado da parede do separador ao vaso do produto contendo 500 mg da enzima Acilase I (EC 3.5.1.14) de Aspergillus Sp. (Aminoacilase AMANO, Nagoia, Ja pão) a pH 7,5.

Fizeram-se circular as duas fases a

259C de forma contracorrente a caudais de 50 ml/min (fase de tubo) e 500 ml/min (fase de parede), com a assistência de duas bom bas peristálticas utilizando a configuração ilustrada na Figura

2. Manteve-se o pH constante em ambas as fases através da utilização dos estabilizantes de pH.

Controlou-se a formação de N-formil (B-metil)-asp-fe por HPLC, utilizando um instrumento Tracor Mode lo 995 juntamente com um detector LDC Spectromonitor II controla do a 254 nm. A coluna utilizada foi um cartucho NOVA-PAK C18 Radial-Pak, 8 mm x 100 mm colocada num Millipore Waters RCM-100 Radial Compression Module.

As fases móveis utilizadas para as análises foram:

(a) para N-formil-(p-metil)-asp-OMe: 40% v/v de metanol em tampão de 0,1% de K^PO^ a pH 4,6;

(b) para N-formil (p-metil)-asp-fe: 20% v/v de metanol em 0,1% de KH₂PO^, pH 4,6; os caudais usados foram de 1 ml/min para ambas as análises.

Os dados relacionados com a formação do produto dipéptido N-formil- (p-metil)-asp-fe são apresenta dos na Tabela V a seguir descrita com a quantidade total (mg) acumulada em 200 ml de fase de parede em função do tempo.

TABELA V

Tempo (min) Quantidade de solução de pêptido/produto(mg)

60	130
120	230
180	280
240	360
300	400

Apresenta-se na Figura 5 uma representação gráfica dos valores apresentados na Tabela V.

No final do processamento, a análise por HPLC indicou a presença de 283 mg de N-formil-(p-metil)-asp-fe-OMe na fase do tubo. Esses valores permitiram calcular a quantidade de pêptido sintetizada durante a operação do reactor.

de parede = 400 x =

322 de tubo fase de = 433,8 mg;

tubo no final do processa= 273 mg;

^PT^{) + P}sin' ^(Po ^PT^{} = 266}'⁶ = 53,5 mg/hr x 100 ml.

mg; e valor de V . de 53,5 mg/hr 100 sm ' com a taxa de sintese (500 mg/hr x 1) medida para a ml coincide velocidade directa nos estudos de equilibração feitos com o ácido N-formil-(^-metil)-L-aspártico e o éster metílico da L-fenilalanina na presença de termolisina.

Recuperou-se o produto da solução (200 ml), ajustou-se a pH 2 com HC1 1 N e extraiu-se duas vezes com 200 ml de EtOAc. Os extractos combinados deixaram um resíduo branco apos evaporaçao, que, apos recristalizaçao de EtOAc/hexa->25° no, produziram 100 mg de N-formil-(JB-metil) L-asp-L-fe, /οζ/_η ’ = ^u +0,709 (c, 0,29;MeOH), idêntico (IV, C-RNM) a uma amostra autêntica preparada de hidrólise descontínua de N-formil- (^-metil) 2 5Φ -L-asp-L-fe-OMe sintético com Aspergillus esterase, /o^/^ = +0,809 (c, 0,29;MeOH).

EXEMPLO 6

Efectuou-se a experiência descrita no Exemplo 5 numa Type 2 Hollow Fiber Dialysis Membrane (Bend

Research Inc.,), contendo 900 cm de membrana líquida (30% v/v Ν,Ν-dietil-dodecanamida em dodecano). A fase de tubo continha 40 g de L-fe-OMe, 24 g de N-formil- (^-metil)-L-asp e 3,08 g de ter/» molisina Daiwa (um total de 5 x 10° unidades proteolíticas) em 400 ml de água, e ajustou-se o pH 7,0. Após um período de incuba ção de 1 hr a 409 C, verificou-se estarem presentes 1,068 g (2,7 g/1) de N-formil-(^-metil)-L-asp-L-fe-OMe. Arrefeceu-se a solução para 259 C, ajustou-se a pH 5,0 com HC1 1 N, e ligou-se à fa se de tubo do separador de fibras ocas. Preparou-se a fase da pa

O /-

rede com 400 ml de agua, pH 7,5 contendo 2 g de aminoacilase I (Amano). Fizeram-se circular as duas fases de forma contracorren te a 259 C durante 5 hr, como descrito no Exemplo 5. Apresentam-se resumidamente os resultados obtidos na Tabela VI e Figura 6.

TABELA VI

Tempo (min)

Quantidade de solução de pêptido/produto (mg)

204

120

180

240

300

251

445

634

748

843

No final do processamento, a quanti.

dade de N-formil-(p-metil)-asp-fe-OMe que permanecia na fase de tubo era de 586 mg.

O mais elevado valor de transporte observado (404 mg/h) durante os primeiros 30 minutos é o resulta do da concentração de péptido inicial elevada produzida durante o período de pré-incubação. O afastamento do equilíbrio causado pelo transporte do péptido obtido na síntese de mais péptido, es tabelecendo assim uma condição de estado estacionário passada a primeira hora do processamento, para valores esperados de 200 mg/h (Figura 6).

EXEMPLO 7

Conduziu-se uma experiência semelhar te ã do Exemplo 5, com a excepção de se terem utilizado 10,00 g do éster metílico da D,L-fenilalanina em vez do enantiómero-L.

Os resultados obtidos, apresentados na Tabela VII e Figura 7, mos tram claramente que a taxa observada de formação de N-formil-(p-metil)-L-asp-L-fe era metade da observada com L-fe-OMe (Exemplo 5, Tabela V), como esperado para a enantiosseletividade da termo lisina e os resultados anteriores dos Exemplos 1 e 2.

TABELA VII

Tempo (min)

120

180

240

300

Quantidade de solução de péptido/produto (mg)

10.6

25.5

33.2

55.3

59.6

69.1

EXEMPLO 8

Utilizou-se a resolução enzimãtica assistida por membrana do ester metílico da D,L fenilalanina de acordo com a presente invenção da forma seguinte: Adicionaram-se a uma solução de 1,0 g (5,6 mmol) do éster metílico da D,L-fenil alanina em 100 ml de água a pH 7,5, 500 mg de aminoacilase I (Anra no Pharmaceutical Co., Nagoia, Japão). Deixou-se a mistura reagir a 259C durante 30 min, no final dos quais se observou a presença de 266 mg de L-fe (1,6 mmol) e de 712 mg de D,L-fe-OMe (4 mmol) por analise de HPLC. Introduziu-se esta solução no lado do tubo (reacção) de um separador de fibras ocas Celgard suportado com separador ILM (Type 2 Hollow Fiber Selective Dialysis Mem2 brane, Bend Research Inc.) contendo nele 900 cm de uma solução a 30% v/v de Ν,Ν-dietil-dodecanamida em dodecano líquido. Encheu -se o lado do produto da membrana (lado da parede do separador) com 200 ml de água ajustada a pH 2,0 com HC1 diluído. Fizeram-se circular as duas fases através do separador contra-corrente a um caudal de 200 ml/min, com a ajuda de bombas peristãlticas (Figura 2). A separação prosseguiu com a adição contínua de D,L-fe-CMs ã fase de tubo, efectuada a uma taxa de cerca de 1 g de D,L-fe-OMe por hora. Adicionou-se num período de duas horas um total de 30 ml de uma solução a 7% de D,L-fe-OMe (2,1 g; 11,7 mmol) em ãgua a pH 7,5. Manteve-se constante o pH em ambas as fases utilizando os estabilizantes de pH.

Seguiu-se o decurso da resolução por

HPLC, em amostras retiradas de ambas as fases em cada 30 min. A

instrumentação e procedimentos de HPLC são os descritos no Exemplo 5. A fase móvel utilizada neste caso era uma solução a 20% v/v de metanol em tampão a 0,1% KE^PO^, pH 4,6; com um caudal de 1 ml/min. Os resultados, apresentados na Tabela VII e representa dos praticamente na Figura 8, mostram a acumulação de D-fe na fa se do tubo e de D-fe-OMe na fase da parede. No final de ambas ex periências ambas as fases foram recuperadas e processadas da for ma seguinte:

(a) Fase de tubo: Ajustaram-se os conteúdos (130 ml) a pH 8,5 com NaOH 1N, em seguida extrairam-se com 2 x 50 ml de EtOAc. Ajustou-se em seguida a fase aquosa a pH 4,0 com HC1 IN e fêz-se passar a solução através de uma coluna de 2,5 x 20 cm Dowex 50 (NH^). Após lavagem com 200 ml de água, diluiu-se c produto com 200 ml de NH^OH a 10%. Concentrou-se o eluato ps ra 50 ml a pressão reduzida, e liofilizou-se a solução. Rendimento: 249 mg, solido branco,

SQ

L-fenilalanina, /çFL· - -29,29 (c, 2; H^O) , lit. (Aldrich) o Ro ~ ’ = -35,09 (c, 2; H₂O) , pureza optica 92%.

(b) Fase de parede: (200 ml) foi ajustada a pH 8,5 com NaOH di- luido e extraiu-se com 2 x 50 ml de EtOAc. Secou-se o extrac to orgânico com sulfato de sõdio anidro, evaporou-se â secura, dissolveu-se em 50 ml de agua acidificada a pH 3,0 com HC1 1N e em seguida liofilizou-se. Para se obterem 989 mg (4,6 mmol) de D-fe-OMe HC1, solido branco, /0Ç7 * = -21,09 (c, 2; EtOH) , lit. (Aldrich) ’ ⁼ 32,49 (c, 2; EtOH) , pureza optica 83%.

Com base no valor de permeabilidade 2 de 32 mg/cm . min encontrado para fe-OMe (agua, pH 8, 259 C) nes ta membrana, o fluxo esperado para uma ârea de membrana de 450 cm era de 880 mg/h. A Tabela VIII mostra que a quantidade de fe-OMe transferido para a fase de parede no final da primeira hc ra era de 860 mg, sugerindo que o transporte se operava em condi çoes de limite de membrana.

oo

TABELA VIII

D,L-Phe-OMe adicionado (g)	L-Phe	Fase de tubo	Fase de parede (mG) D-Phe-OMe (mg)
(mg)	D,L-Phe-OMe
1.0	266		712	0	(0 min)
1.7	473		617	537	(30 min)
2.4	615		531	860	(60 min)
3.1	743		628	1154	(90 min)

A resolução descontínua de D,L-fe-OMe através da hidrólise enantiosselectiva da função de éster metílico catalisada pela subtilisina A (uma protease alcalina do tipo serina) foi recentemente referida /Shui-Tein Chen, Kung-Tsung Wang e Chi-Huey Wong, J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1986, 15147. Ê necessária uma hidrolase para resolução de membrana dos compostos racêmicos de ãcido carboxílico. Uma hidrolase que ê uma esterase como por exemplo aminoacilase I, c<-quimotripsina e sub tilisina A pode ser utilizadas para resolver o composto de D,L-aminoãcido como por exemplo o éster metílico da D,L-fenilalanina. Prefere-se geralmente a Aminoacilase I para a desmetilação de péptidos sobre outras enzimas estereolíticas como por exemplo subtilisina A e o<-quimotripsina possuindo actividades proteolíticas fortes.

Se a resolução acima descrita do és ter metílico da D,L-fenilalanina é utilizada para produzir pêpti do como descrito na presente invenção, a L-fenilalanina produzida ê metilada por meios de metilação convencionais conhecidos da técnica.

Este exemplo pode ser adaptável para a resolução de outros ácidos carboxílicos racêmicos. Por exem pio, pode hidrolisar-se um composto éster de ãcido carboxílico racémico de uma mistura de reacção aquosa incluindo uma enzima de hidrólise, para formar um composto enantiómerico carregado e um composto de éster enantiomérico não carregado na mistura reac cional aquosa. 0 composto de éster enantiomérico não carregado ê em seguida transportado da mistura reaccional aquosa através de uma membrana de rejeição de iões da presente invenção incluindo o Type 1 ou Type 2 Hollow Fiber Selective Dialysis Membranes de Bend Research, Inc. Num tipo de exemplo como o Exemplo 8, o composto de éster racêmico do ãcido carboxílico é um composto do éster de D,L-aminoãcido; o composto enantiomérico carregado ê um composto de L-aminoãcido e o composto de éster enantiomérico não carregado é um composto de éster de D-aminoãcido. Deve notar-se que a escolha das enzimas e das condições de reacção estã dentro das possibilidades de compreensão dos especialistas da técnica da presente invenção.

Fornecem-se meios de processamento descontínuo neste Exemplo em que o enantiõmero pretendido do rea gente pode ser obtido e adicionado à mistura reaccional.

EXEMPLO 9

Conduziu-se a síntese de N-formil-(p-metil)-L-asp-L-fe de acordo com a presente inveção utilizando aminoacilase I imobilizada e resinas de permutação iõnica para remoção de produtos permeáveis da forma seguinte: Adicionaram -se a uma solução de 10,0 g (48 mmol) do éster metílico da L-fenilalanina e 6,0 g (35 mmol) do ãcido N-formil-(^-metil)-L-aspãr tico em 100 1 de água desionizada, ajustada a pH 7,0, 770 mg de termolisina (Daiwa Chemical Company, Osaca, Japão) representando um total de 1,3 x 10 unidades proteolíticas. Incubou-se a solução resultante durante lha 409 C, quando a análise de HPLC indicava a presença de 383 mg de N-formil- (^-metil)-asp-fe-OMe. Arrefeceu-se a solução para 259 C, ajustou-se o pH a 5,0 e colocou-se a solução num vaso de 200 ml 40 ligado ao lado do tubo 46 e um separador de fibras ocas 44 (Type 2 Hollow Fiber Selective 2

Dialisys Membrane, Bend Research, Inc.) contendo 900 cm de uma membrana do líquido hidrofõbico feita de 30% de N,N-dietil-dodecanamida em dodecano. Dispos-se o lado da parede do separador 48 como circuito fechado obtido de uma série de vasos que se ligam uns aos outros como ilustrado na Figura 9. Ajustou-se a solução que retornava ao separador 44 a um valor de pH de 4,0 para proto nar a 1-fe-OMe copermeando com o dipéptido N-formil-(B-metil)~ _ ' + -asp-fe-OMe. A circulação através de uma coluna de Dowex 50 (Na)

removeu a L-fe-OMe positivamente carregada, deixando o dipêptido não carregado na solução. Ajustou-se o efluente a pH 7,0 e submeteu-se ã acção da aminoacilase I, imobilizada sobre DEAE-Sephadex 52 /T. Tosa, T. Mori e I. Chibata, Agr. Biol. Chem. 33, 1053 (1969)_/. O dipéptido resultante N-formil- QB-metil) -asp-fe era negativamente carregado a esse pH, e foi pósteriormente capturado pela resina Dowex I (Cl ) 54. Fez-se regressar o efluente para o separador de membrana antes do ajuste a pH 4,0, fechado assim o circuito.

Fizeram-se circular as fases do tubo 46 (100 ml) e da parede 48 (500 ml) a 259 C de forma contracorrente através do separador de membrana a caudais de 50 ml/min (fase do tubo) e 120 ml/min (fase de parede).

A amostragem periódica da fase da parede foi efectuada do efluente a partir da segunda enzima (Ε₂)( (Figura 9, local da amostragem 56, antes de entrar na coluna de Dowex 1 (Cl) 54) e controlaram-se as amostras por HPLC segundo os procedimentod do Exemplo 5. Como se esperava, neste ponto do circuito (Figura 9) não se detectou L-fe que podia resultar da hidrólise enzimática de L-fe-OMe por E₂ (ver Exemplo 8); apenas se observou um nível de estado estacionário circulante de N-formil- (p-metil)-asp-fe (concentração média 54 mg/1), reflectindo a transferência contínua do dipéptido N-formil- (JB-metil) -APM através da membrana e da sua posterior hidrólise por Ε₂· A retenção eficiente do dipéptido carregado pela resina Dowex-1 ê indicada pela baixa concentração dele observada no ponto A através do pro cesso. Uma experiência semelhante paralela efectuada na ausência do pêptido Dowex-1 na fase da parede, tal como podia ser antecipado dos resultados acima discutidos. De novo, não se encontrou L-fe na fase de parede circulante. Apresenta-se na Figura 10 e na Tabela IX uma comparação de ambas as experiências.

TABELA IX mg N-formil-(B-metil)-asp-fe/fase de parede

Tempo (min) Exp.l. Dowex 1 presente Exp.2. sem Dowex 1.

30	31.6	30.2
60	—	37.8
120	26.0	71.8
180	35.4	83.1
240	45.6	—
300	51.2	—

Em adiçao ã separação do éster de alquilo inferior da fenilalanina copermeando a membrana de rejei ção de iões para a mistura de produtos utilizando a resina de permutação de iões como descrito neste Exemplo, pode separar-se o ácido aspãrtico copermeando a resina de rejeição de iões para a mistura de produtos utilizando estas resinas. As espécies ou produtos que não se podem rectro-difundir através da membrana da mistura de produtos podem ser removidos utilizando esta resina de permutação de iões. Também podem ser utilizados na presente invenção outros processos de separação conhecidos da técnica incluindo mas não limitados a electroforese, electrodiálise e sepa rações de membrana e que são equivalentes ã separações com resina de permutação iõnica.

Imobilizando a enzima de condensação permite que a reacção enzimática na fase de tubo seja conduzida a um valor de pH da mistura reaccional inicial preferido pa ra eficiência õptima da reacção enzimática considerando os reagentes, produto(s) e enzima incluindo o equilíbrio desejado da reacção enzimática. Opcionalmente, pode reajustar-se o valor de pH inicial da mistura reaccional na fase de tubo para um segundo pH da mistura reaccional antes do contacto com a membrana de modo que o segundo pH da mistura reaccional maximizará a eficiência da membrana no transporte do produto não carregado na fase de tubo através da membrana para a fase de parede. A Figura 9 • não mostra o ajuste do pH da mistura reaccional inicial na fase . de tubo para um segundo pH da mistura reaccional.

De modo semelhante, pode mobilizar-se a esterase na fase de parede e o pH da mistura de produto na fase de parede pode-se ajustar e reajustar do modo necessário pa ra efectuar o processamento mais eficiente. 0 Exemplo 8 e o Exem pio acima apresentado fornecem meios adicionais para um processa mento eficiente contínuo ou descontínuo utilizando a presente in venção. No processamento contínuo podem fazer-se regressar o enantiõmero dos reagentes desejados e quaisquer compostos coperme antes para a fase de tubo ou mistura reaccional.

Aplicabilidade Industrial

Pode utilizar-se a presente invenção para produzir aspartamo bem como outros péptidos incluindo péptidos que são farmacologicamente activos.

Embora se tenham apresentado e descrito com detalhe concretizações específicas da invenção para ilustrar a aplicação dos princípios da invenção, deve notar-se que a invenção pode incluir outras concretizações sem se afastar desses princípios.

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES

   - Processo para a síntese enzimãtica de peptidos, caracterizado por compreender as fases de: condensar-se um ácido N-acil-p-substituído-L-aspãrtico pos suindo um grupo ocT-carboxilato com ester de alquilo inferior da fenilalanina com um grupo oc-amonio, numa mistura reaccional aquosa incluindo uma enzima de condensação para se obter o ester de alquilo inferior da N-acil-L-aspartil- Q3-substituído-L-fenilalanina, um pêptido não carregado e transportar-se o pêtido não carregado da mistura reaccional aquosa através de uma membrana de rejeição de iões para uma mistura de produtos.

   - 2^ Processo de acordo com a reivindica ção 1 caracterizado por a enzima de condensação ser uma protease formadora de pêptido activa numa gama de pH de cerca de 4,0 a 9,(1

   - 3- Processo de acordo com a reivindica ção 2 caracterizado por compreender ainda a fase de se converter o pêptido não carregado na mistura de produtos numa espécie que não se possa retro-difundir através da membrana.

   O E

   -4-Processo de acordo com a reivindica ção 3 caraeterizado por se converter o pêptido não carregado numa espécie carregada por clivagem com uma enzima de esterase.

   Processo de acordo com a reivindica ção 4 caraeterizado por a enzima de esterase ser activa numa gama de pH de cerca de 6,0 a 9,0.

   - 6- Processo de acordo com a reivindica ção 4 caraeterizado por a enzima de esterase ser escolhida no grupo consistindo em aminoaciliase I, ©C-quimotripsina e subtili sina A.

   - 7- Processo de acordo com a reivindica ção 4 caraeterizado por a enzima de esterase ser aminoacilase I e o pH da mistura reaccional ser cerca de 7,0.

   - 8- Processo de acordo com a reivindica ção 3 caraeterizado por a membrana compreender um líquido orgâni co imiscivel com a agua imobilizado por capilaridade em poros nu ma folha microporosa sendo o liquido orgânico um solvente para o pêptido não carregado.

   Processo de acordo com a reivindica ção 8 caracterizado por a folha microporosa ser de um material escolhido no grupo consistindo em politetrafluoroetileno e proli popileno e o solvente compreender pelo menos um composto escolhi do no grupo consistindo em n-l-decanol_z n-hexadecanol, n-dodecanol, Ν,Ν-dietil-dodecadamida, dodecano, 1-undecanona e suas misturas .

   - 10- Processo de acordo com a reivindica ção 8 caracterizado por a folha microporosa compreender fibras ocas de polipropileno e o solvente compreender N,N-dietil-dodeca namida e dodecano.

   - 11- Processo de acordo com a reivindica ção 8 caracterizado por a membrana ser uma membrana de diâlise selectiva de fibras ocas do Tipo 2, flexível.

   - 12- O *7

   - 12- Processo de acordo com a reivindica ção 3 caracterizado por o primeiro composto ser um éster metílico da D,L-fenilalanina, e o segundo composto ser o acido N-acil-p-substituído-L-aspãrtico tendo um grupo oC-carboxilato.

   - 13- -

   Processo de acordo com a reivindica ção 12 caracterizado por o grupo N-acilo ser escolhido do grupo consistindo em CI^OCO-, -CH=O e CH₂CO- e o substituinte β ser es colhido no grupo consistindo em CH₂O-, ter BuO-, CH^O-, NH₂“.

   - 14- -

   Processo de acordo com a reivindica a enzima de condensação.

   Processo de acordo com a reivindica ção 14 caracterizado por a enzima de condensação ser a termolisji na e o pH da mistura reaccional ser cerca de 7,0.

   - 16- Processo de acordo com a reivindica

   O o ção 14 caracterizado por compreender ainda a fase de reajustamen to do pH da mistura reaccional a um valor de pH de cerca de 5,0 antes de transportar o péptido não carregado da mistura reaccional através da membrana de rejeição de iões.

   - 17- Processo de acordo com a reivindica ção 3 caracterizado por compreender ainda a fase de separação do ácido N-acil-JB-substituido-L-aspãrtico co-permeando a membrana de rejeição de iões para a mistura de produtos.

   - 18- Processo de acordo com a reivindica ção 3 caracterizado por compreender ainda a fase de separação do éster de alquilo inferior da fenilalanina co-permeando a membrana de iões para a mistura de produtos.

   - 19- Processo para a síntese enzimãtica de péptidos, caracterizado por compreender as fases de: condensar-se um ácido N-acil-^-substituído-L-aspártico pojs suindo um grupo (X-carboxilato com um éster de alquilo inferior da fenilalanina possuindo um grupo c<-amónio, numa mistura reaccional aquosa incluindo uma enzima de condensação para se obter um éster de alquilo inferior da N-acil-L-aspartil-(p-substituído -L-fenilalanina um péptido não carregado.

   transportar-se o péptido não carregado da mistura reaccional aquosa através de uma membrana de rejeição de iões para a mistura de produtos, converter-se o péptido não carregado na mistura de produtos numa espécie que não se possa retrodifundir através da membrana, e removerem-se as espécies que não se podem retrodifundir através da membrana, da mistura de produtos.

   Processo de acordo com a reivindica ção 19 caracterizado por compreender ainda a fase de separação o ãcido N-acil-p-substituído-L-aspãrtico co-permeando a membrana de rejeição de iões para a mistura de produtos.

   Processo de acordo com a reivindica ção 20 caracterizado por compreender ainda a fase de separação do éster de alquilo inferior da fenilalanina co-permeando a membrana de rejeição de iões para a mistura de produtos.

   Processo para a síntese enzimática de péptidos caracterizado por compreender as fases de: condensarem-se enzimaticamente o primeiro e segundo compos tos de aminoácidos numa mistura reaccional aquosa inicial para se obter um composto não carregado, transportar-se o composto não carregado para uma segunda mistura reaccional aquosa através de uma membrana que não transporte quantidades substanciais dos compostos aminoácidos, converter-se o composto não carregado transportado numa a n forma que não possa ser retransportada através da membrana para a mistura reaccional inicial, e remover-se o composto na forma que não possa ser retransportada através da membrana para a mistura reaccional inicial.

   - 23- Processo de acordo com a reivindica ção 22 caracterizado por compreender ainda a fase de separar-se o primeiro composto de aminoácido co-permeando a membrana com o composto não carregado para a segunda mistura reaccional aquosa a partir da segunda mistura reaccional aquosa.

   Processo de acordo com a reivindica ção 22 caracterizado por compreender ainda a fase de separar-se o segundo composto de aminoácido co-permeando a membrana com o composto não carregado para a segunda mistura reaccional aquosa a partir da segunda mistura reaccional aquosa.

   - 25- Processo de acordo com a reivindica ção 23 caracterizado por compreender ainda a fase de fazer regrei; sar o primeiro composto de aminoácido co-permeando a membrana com o composto não carregado para a mistura reaccional não aquosa inicial.

   26- Processo de acordo com a reivindica ção 23 caracterizado por compreender ainda a fase de fazer regressar o segundo composto de aminoácido co-permeando a membrana com o composto não carregado para a mistura reaccional aquosa inj. ciai.

   - 27- -

   Processo para a resolução enzimãtica de compostos racémicos de ácidos carboxílicos, caracterizado por compreender as fases seguintes:

   hidrolisar-se um composto racémico de éster de ácido carbo xllico numa mistura reaccional aquosa indluindo um enzima de hidrólise para formar um composto enantiõmerico carregado e um com posto de éster enantiomêrico não carregado na mistura reaccional aquosa, e transportar-se o composto éster enantiomêrico não carregado da mistura reaccional aquosa através da membrana de rejeição de iões para a mistura de produtos.

   - 28- -

   Processo de acordo com a reivindica ção 27 caracterizado por:

   o composto racémico de éster de ãcido carboxílico ser um composto de éster do D,L-aminoãcido, o composto enantiomêrico carregado ser um composto L-amino ãcido, e o composto enantiomêrico carregado ser um composto de éster dum D-aminoãcido.

   Λ Ω

   Processo de acordo com a reivindica ção 28 caracterizado por compreender ainda a fase de converter-se o composto éster de D-aminoãcido não carregado na mistura de produtos numa espécie que não se possa retro-difundir através da membrana.

   Processo de acordo com a reivindica ção 20 caracterizado por na fase de conversão se ajustar o pH de mistura de produtos a um valor de pH de cerca 2,0.

   Processo de acordo com a reivindica ção 29 caracterizado por se escolher a enzima de hidrólise no grupo consistindo em aminoacilase I, -quimotripsina e subtilisina.A.

   ção 29 caracterizado por

   Processo de acordo com a reivindica a enzima de hidrólise ser imobilizada.

   Processo de acordo com a reivindica ção 29 caracterizado por a membrana compreender um líquido orgânico imiscível com a ãgua imobilizado por capilaridade em poros numa folha microporosa sendo o líquido orgânico um solvente do pêptido não carregado.

   - 34- Processo de acordo com a reivindica ção 33 caracterizado por a folha microporosa ser um material escolhido no grupo consistindo em politetrafluoroetileno e polipro pileno e o solvente compreender pelo menos um composto escolhido no grupo consistindo em n-l-decanol, n-hexadecanol, n-dodecanol, Ν,Ν-dietil-dodecanamida, dodecano, 2-undecanona e suas misturas.

   - 35- Processo de acordo com a reivindica ção 33 caracterizado por a folha microporosa compreender fibras ocas de polipropileno e o solvente compreender N,N-dietil-dodeca namida e dodecano.

   - 36- Processo de acordo com a reivindica ção 33 caracterizado por a membrana ser uma membrana de diâlise selectiva de fibras ocas do tipo 2, flexível.

   Processo de acordo com a reivindica ção 29 caracterizado por o composto de éster do D,L-aminoãcido ser um éster de alquilo inferior da D,L-fenilalanina possuindo um grupo X-amónio.

   - 38- Processo de acordo com a reivindica ção 37 caracterizado por o éster de alquilo inferior da D,L-fenilalanina ser um éster metílico da D,L-fenilalanina.

   Processo de acordo com a reivindica ção 29 caracterizado por compreender ainda as fases de: condensar-se enzimaticamente o composto de L-aminoãcido carregado com um segundo composto de aminoãcido numa mistura reaccional aquosa inicial para formar um composto não carregado, transportar-se o composto não carregado para uma mistura. reaccional aquosa através de uma membrana que não transporte quar. tidades substanciais dos compostos aminoãcidos, e converter-se o composto não carregado transportado numa for ma que não possa ser retransportada através da membrana para a mistura reaccional inicial.

   Processo de acordo com a reivindica ção 39 caracterizado por compreender ainda a fase de separarem-se os compostos aminoácidos co-permeando a membrana para uma se gunda mistura reaccional aquosa.

   41Processo de acordo com a reivindica ção 1 caracterizado por compreender ainda a fase de converter-se o peptido não carregado na mistura de produtos numa espécie que não se possa retro-difundir através da membrana.

   - 42- ção 41 caracterizado por ma espécie carregada por

   Processo de acordo com a reivindica se converter o pêptido não carregado nu clivagem com uma enzima de esterase.

   - 43- Processo de acordo coroa reivindica ção 41 caracterizado por a enzima de condensação ser um pêptido formando uma protease activa ácida ou neutra numa gama de pH de cerca de 4,0 a 8,0.

   Processo de acordo com a reivindica ção 41 caracterizado por a enzima de condensação ser uma protease escolhida no grupo consistindo em serina proteinases, tiol proteinases, carboxil proteinases e metaloproteinases.

   - 45- Processo de acordo com a reivindica ção 41 caraeterizado por a enzima de condensação ser escolhida no grupo consistindo em quimotripsina, tripsina, subtilisina BNP’, Achromobacter protease, papaina, pepsina, termolisina e prolisina e o pH da mistura reaccional estar entre cerca de 4,0 a 8,0.

   - 46- -

   Processo de acordo com a reivindica ção 41 caraeterizado por a enzima de condensação ser a termolisi na e o pH da mistura reaccional ser cerca de 5,5.

   - 47- -

   Processo de acordo com a reivindica ção 45 caraeterizado por a membrana compreender um líquido orgânico imiscível com a ãgua imobilizado por capilaridade em poros numa folha microporosa sendo o líquido orgânico um solvente para o pêptido não carregado.

   - 48- -

   Processo de acordo com a reivindica ção 47 caraeterizado por a folha microporosa ser de um material

   I escolhido no grupo consistindo em politetrafluoroetíleno e polipropileno e o solvente compreender pelo menos um composto escolhido no grupo consistindo em n-l-decanol, n-hexadecanol, n-dode canol e suas misturas.

   - 49- Processo de acordo com a reivindica ção 47 caracterizado por a membrana ser uma membrana de diãlise selectiva de fibras ocas do tipo 1, flexível.

   Processo de acordo com a caracterizado por pH da solução aquosa estar

   51Processo de acordo com a reivindica caracterizado por aquosa estar entre 4,0

   52Processo de acordo com a reivindica ção 46 caracterizado por o primeiro composto ser o éster metílico da D,L-fenilalanina, e o segundo composto ser o ácido N-acil-B-substituído-L-aspártico possuindo um grupo bC -carboxilato.

   - áR 53Processo de acordo com a reivindica ção 52 caracterizado por o grupo N-acilo ser escolhido no grupo consistindo em CH₂OCO-, -CH=O e CH^CO-, e o substituinte B ser escolhido no grupo consistindo em CH₂O-, ter BuO-, CH₃O-, ΝΗ₂~.

   Processo para a síntese enzimãtica de péptidos caracterizado por compreender as seguintes fases: condensar-se os primeiro e segundo compostos aminoácidos numa mistura reaccional inicial aquosa para se obter um composto não carregado, transportar-se o composto não carregado numa segunda mistu ra reaccional aquosa através de uma membrana que não transporte quantidades substanciais dos compostos aminoácidos, e converter-se o composto não carregado transportando numa forma que não possa ser retransportada através da membrana para a mistura reaccional inicial.

   A requerente declara que os primeiros pedidos desta patente foram apresentados nos Estados Unidos da América, em 18 de Agosto de 1986 e em 28 de Julho de 1987, sob os numeros de série, respectivamente 897,679 e 078,504.