JPS61205490A - 酵素的合成法並びに装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はある化合物群、特に、２〜１０アミノ酸残基を
含んでいる低分子量ペプチドの酵素的合成法に関するも
のである。更に詳しくは、本発明は、アルファーム−ア
スパルチル−し一フェニルアラニンの低級アルキルエス
テルの合成に関スルものである。

従来技術 その様なエステル化合物の内の１つであるメチルエステ
ル（以下、ＡＰＭと呼称）は、アスパルチルム（ａｓｐ
ａｒｔａｍｅ　）　　として一般的に知られている強力
な甘味料である。この化合物は、Ｌ−フェニルアラニル
メチルエステルがＬ−アスパルチル残基に、ペプチド結
合を介して結合したものである。

ＡＰＭは、Ｌ−フェニルアラニン・メチルエステルとＮ
−保護（Ｎを保護された）アスパラギン酸無水物とを直
接反応させる、あるいは、Ｎ−保護アスパラギン酸無水
物とＬ−フェニルアラニンを酵素的に結合させる、等の
方法を含む、多くの方法によって合成されてきた。さら
に、この酵素的な方法の改良法であって、Ｎ−保護アス
パラギン酸を用いる必要のない方法が、ハラダら（Ｈａ
ｒａｄａ　ｅｔ、ａｌ、ヨーロッパ特許出願第７４，０
９５号）によって開示されている。ハラダらの方法では
、列挙されたある種の微生物の培養物を、Ｌ−アスパラ
ギン酸およびＬ−フェニルアラニンのメチルエステルと
接触させ、ＡＰＭを合成している。

実施例によると、彼らは微生物を培養し、Ｌ−アスパラ
ギン酸とフェニルアラニン・メチルエステルとを含有す
る培地に懸濁し、ＡＰＭを蓄積させ、培地から細胞を分
離した後、培地の上滑を分画した。ＡＰＭの回収量は１
．２〜７．５ｆ！〔培養培地ＩＥ当たりの換算量〕の範
囲内であった。反応混合物中に加えられたフェニルアラ
ニン・メチルエステルの量に基づくモル収率は０．５〜
１．４％であった。

この酵素触媒反応の平衡はジペプチド産物よりもアミノ
酸反応物質の方に傾き易いので、ノ１ラダらの方法によ
って得られるペプチドの収率には限界がある。合成産物
にとって有利なよう、平衡関係を改善するために広範囲
に及ぶ研究がなされている〔オヤマら（Ｏｙａｍａ　ｅ
ｔ、　ａｌ、）、１ケミチク（ｃｈｅｍｔｅｃｈ　）”
１９８４年２月、Ｚｏｏ−１０５頁〕。ペプチド産物と
しては平衡状態において難溶であることが好ましいが、
すべてのペプチドがその様な性質を持っているわけでは
なく、また、例えその様な性質を導入したとしても、導
入した性質を最終生産物から除くことが困難であり、高
価につくことになる。例えば、カルボベンゾキシル化さ
れた（Ｎ−保護された）Ｌ−アスパラギン酸とＬ−フェ
ニルアラニン・メチルエステルトラ酵素的にコンジュゲ
ートさせ、不溶性の付加化合物を得ている〔インワら（
Ｉｓｏｗａ　ｅｔ、　ａｌ、）、米国特許第４．４３６
．９２５号〕。この方法によると、発酵合成の直後にお
いて、９９．１％もの収率であったことが開示されてい
る。しかしながら、ベンゾイルカルボニル部分を除くた
めに余分な工程を必要とする上、潜在的に、Ｌ−アスパ
ラギン酸誘導体によって生成物が汚染されるおそれがあ
る。

水と混ざり合う、または混ざり合わない有機溶媒を用い
ることにより、合成的なタンパク分解酵素（プロテアー
ゼ）反応の収率を改善する試みがなされてきた。これら
の方法は、多くの有機溶媒がタンパク分解酵素の活性を
阻害すること、並びに多額の費用を要する工程を経て生
成物を分離しなければならない、という点で、不満足な
ものである。さらに、溶媒が高価であることもあり、有
効に再循環する必要がある。

汚染物質を含まない生成物の極めて効率的な合成法を確
保するために上記の如き研究がなされてきたにもかかわ
らず、当該技術分野の人々は、酵素的なペプチド合成の
ための経済的な系を組み立てることに失敗した。これま
で、技術者達は、反応生成物からの、潜在的に有毒な物
質の除去をも含めて、さらに反応生成物を処理するため
に収率を増大することが必要であるにもかかわらず、酵
素触媒工程における収率の増大をあきらめざるを得なか
った。

本発明は、通常の微生物培養から、または固定化酵素を
用いて、高収率にペプチドを合成する方法であって、後
に、生成物の置換基を除去するか、生産物ペプチドを共
有結合的に修飾するか、さらには、有機溶媒中から生産
物を精製する等のいずれの操作をも必要としない方法を
提供することを目的とするものである。これらの、そし
てその他ノ本発明の目的は、本出願の、全答を考慮する
ととにより、明らかとなるであろう。

要約 本発明の目的は、 （す１種またはそれ以上の反応物質と酵素とを接触させ
て該反応物質と１種またはそれ以上の生成物の混合物か
らなる組成物を生産しくここで、全生成物または全反応
物質のいずれか一方は実質的にＯの実効イオン電荷を持
つ。ただし、全反応物質の実効イオン電荷が実質上０で
あるときには生成物は実質的な実効イオン電荷を持って
おり、全生成物の実効イオン電荷が０であるときには反
応物質は実質的な実効イオン電荷を持っている。）；（
ｂ）工程（ａ）の組成物を電気透析して生成物を反応物
質から分離し； （ｃ）生成物を回収し；さらに、 （ｄ）分離した反応物質を再循環させて酵素と接触させ
ることからなる方法により、達成される。

この方法は、電気透析手段、電気透析手段から固定化酵
素へ反応物質を再循環させるための手段、並びに電気透
析手段から生成物を回収するための手段を有する液体伝
達系内に存在する固定化酵素を含む装置により、達成さ
れる。電気透析手段は一般に、陽極と陰極との間にはさ
まれた、スペーサーで隔てられた陰イオン交換膜と陽イ
オン交換膜とを交互に配してなる層（スタック）、並び
に膜の層を横切って電圧をかけるための手段からなる。

１つの態様では、電気透析手段内の、塩が蓄積される側
の膜に酵素を固定化する。これは、反応物質−生成物系
の荷電成分がここに局在化した濃度で存在することを利
用するものである。他の好ましい態様においては、電気
透析手段の外側であるが、該手段と直接または間接的に
液体を介して伝達されている反応室内に酵素を固定化す
る。

本発明はまた、塩蓄積セルと塩消耗セル、電荷を有する
反応試薬を塩蓄積セルに導く手段、塩消耗セルから生成
物を取り除く手段、塩蓄積セル内の、荷電イオンの濃度
が敢も高い領域に固定化されている酵素、並びに塩蓄積
セルから塩消耗セルへ液を循環させるための非電気的な
伝達手段を有する電気透析装置を提供することを目的と
するものである。

図面についての簡単な記述 第１図は、本発明方法を連続的に実施することを基本方
針とした場合に好ましい装置の１実施例を示すものであ
る。酵素の呑った反応容器が、２台の電気透析手段セッ
ト〔一方のセットの基本的な機能は蓄積した無気塩の除
去にあり、他方のそれは生成物を含む流体から反応物質
を取り除くことにある〕と流体により連結（連絡）され
ている。

この装置は、反応物質を反応容器へ再循環させる手段と
、生成物を回収する手段とを具備している。

第２図は本発明の他の実施例に係る装置を示すものであ
る。

詳しい記述 本発明方法は、生成物を所望の程度に生成させるのには
不適当な平衡を有する全ての酵素反応の実施に用い得る
ものであるが、通常、ペプチド結合を持った化合物の合
成に用いられる。カルボキシル−およびアミノ−基を有
する反応物質からペプチド結合の合成を触媒することが
できる酵素を選択する。更に、生成物と反応物質とは、
電気透析によって分離し得る様、実効イオン電荷に充分
４つ異、有しアいる必要があ９、え。上、生成♂△ または反応物質群の内、いずれか１方の群の実効電荷は
０でなければならない。これらの基準に合致する相当数
の系が報告されている（Ｍ、　　ベーゾ？７ら（Ｍ、　
Ｂｅｒｇｍａｎ　ｅｔ、ａｌ、　）　、１７トハンスド
ーエンザイモロジイ（Ａｄｖ、　Ｅｎｚｙｍａｌ、）”
に６３（１９４１）参照〕。反応物質は一般にアミノ酸
であり、選択されるアミノ酸は、通常のタンパク質の構
成成分である２１個のアミノ酸に限定されるものではな
く、そのエステル、またはその他の誘導体であってもよ
い。好適な出発物質としてのアミノ酸、および最終生成
物に関する記載は、ジカルボキシリック・アミノ酸に関
しては、アミノ基が置換されていない方が好ましい、と
いう点を除き、引用分献である米国特許第４．２５６．
８３６号にみられる。Ｌアミノ酸とＤアミノ酸との混合
物も、低価格の出発物質であるとの理由から用いられる
。

しかしながら、Ｄアミノ酸は、タンパク分解酵素を競合
的に阻害するかもしれないので、精製したＬ立体異性体
を用いることが好ましい。また、このアミン反応物質ま
たはカルボキシ反応物質は、タンパク質、あるいは低分
子量のペプチドであってもよい。この場合、最終的な合
成段階に用いる酵素は、その出発物質であるポリペプチ
ドの内因性タンパク分解的開裂に関して基質特異性を持
たないペプチダーゼであり、従って、アミノ酸付加反応
に競合してポリペプチド基質を加水分解することのない
酵素である。ジペプチド、即ち、ペプチド結合が１個の
化合物、の合成が必要とされる反応においては、酵素触
媒はエキソペプチダーゼであることが好ましい。ＡＰＭ
の合成にとって好ましい出発物質は←−アスパラギン酸
とＬ−フェニルアラニン・メチルエステルである。

反応物質をカップリング（結合）させるために用いられ
る酵素は、ペプチド結合またはアミド結合の形成を触媒
することのできる酵素である。その様な酵素は、通常、
該酵素を合成している微生物またはを推動物の細胞から
単離される。いくつかのペプチド合成系においては、反
応を進行させる上で有用な状態、即ち基質（反応剤）濃
度や溶媒の濃度が高められた状態にあるので、その様な
状態に対して抵抗し得る酵素を選択するのが望ましい。

また、前に議論した理由に基づき、酵素は、保護されて
いない基質に作用するものであることを要する。

好適な酵素類には、カルボキシル加水分解酵素類、特に
、エンドロテアーゼ、エンドプロテアーゼ、エステラー
ゼおよびプロテアーゼ等の酵素類が含まれ、それらには
、アルファーキモトリプシン、トリプシンおよびズブチ
リシンの如き、セリン（アルカリ性）プロテイナーゼ類
；パパインの如きチオールプロテイナーゼ類；ペプシン
の如きカルボキシル（酸性）プロテア−ゼ類；並びにサ
ーモリシン、プロリシン、タシナーゼＮまたはデイスパ
ーゼの如きメタロプロティナーゼ類（中性プロテア−ゼ
類）が含まれる。国際生化学連合の酵素命名委員会（Ｎ
ｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　Ｃｏｍ１ｔｔｅｅｏｆ　ｔｈ
ｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｕｎ、ｉｏａ　ｏｆ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）の分類に係る、酵素番号Ｅ
　Ｃ３，４，２１，３，４，２２，３，４，２３および
３．４．２４の酵素が有用である。ハラダら、およびイ
ソワら（共に前掲）が記載している酵素類が、ＡＰＭの
合成に好ましい。他のペプチド類の合成においては、Ａ
ＰＭの合成にとって必要とされる基質特異性とは異る特
異性を有する酵素が必要となるので、普通、荊の酵素類
が使用される。

酵素類を、使用前に精製してお（必要はなく、即ち、そ
れらは生細胞または死んだ細胞内に存在している状態で
、あるいは、細胞を含まない状態であって、所望の程度
に精製されているものであってよい。細胞または酵素成
分は干渉性の酵素類即ち、出発物質または合成された生
成物を望ましくないやり方で修飾し得る様な、エステラ
ーゼまたはプロテアーゼ等の好ましくない酵素類、を含
んでいてはならない。例えば、ＡＰＭの合成に用いる合
成酵素は、Ｌ−フェニルアラニン・メチルエステルを加
水分解し得るエステラーゼを含まないものでなければな
らない。所望の、一連の反応を触媒する酵素の混合物を
用いることも本発明の範囲内に含まれる。最終生成物の
合成に係る最後の工程より以前の、全ての初期工程で得
られる生成物は、これら中間体と最終生成物とが共０時
）電気透析されるのを避けるために、実効イオン電荷を
帯びていることが好ましい。または、反応物質が中性で
あって、最終生成物がイオン性に荷電していてもよいこ
とは明らかである。

一般に、酵素触媒による合成反応は、生成物の分離機能
を持たない反応容器内で行なわれる。この様な態様の場
合、敢も経済的であるのは、酵素を、それが生産された
微生物細胞内に止めたままにしておく方法である。細胞
を、生きた培養物のままで用いるよりも、使用前に殺し
て用いる方が好ましい。カン（Ｊ、　Ｋａｎ　）らの中
空ファイバー反応系（ｈｏｌｌｏｗ　ｆｉｂｅｒ　ｒｅ
ａｃｔｏｒ　ｓｙｓｔｅｍ）が好ましい〔バイオチクノ
ロシイ・アンド・バイオエンジニアリング（Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏ　−ｅｎｇｉｎｅｅ
ｒｉｎｇ　）、２０　：　２１７−２３０　（１９７８
））。

本発明のあらゆる実施態様において、細胞を含まない状
態で酵素を生産した後、それら酵素を支持マトリックス
または支持膜に取り込ませたり、共有結合的に交差結合
させたり、あるいはそれらへのイオン性の吸着を行なわ
せることにより、固定化する仁とができる。酵素の固定
化に関する方法は以下に記載されている二Ｂ、アボット
、”アドブ・アプリ・マイクロバイオ口（Ａｄｖ、　　
Ａｐｐｌ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）２０　：　２０３−２５７（１
９７６）　；Ｂ、シャーマら（Ｂ、　Ｓｈａｒｍａ　ｅ
ｔ、　ａｌ、　　”アンプ・ケム―イント−エド−エ７
グ（Ａｎｇｃｗ、Ｃｈｅｍ。

Ｉｎｔ、　Ｅｄ、　Ｅｎｇｌ、）”　２１　：　８３７
−８５４　（１９８２）　；Ｌ、ウィンガードら（Ｌ、
　Ｗｉｎｇａｒｄ　ｅｔ、　ａｌ、）、“アプライド・
バイオケミストシイ・アンド・バイオエンジニアリング
、１巻３２９−３５７頁（１９７６）ｉ並びにＴ、ジャ
ックら（Ｔ、Ｊａｃｋｅｔ、　ａｌ、）″アトブリくイ
オケム０エング（Ａｄｖ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｅｎｇ、　）　’　５巻−：１２５
−１４５（１９７７）。

当業者ならば、日常的なスクリーニングによって最適な
方法を選択することができるであろう。

次に、図示実施例に従って本発明を説明する。

実施例 第１図は本発明において好ましい装置の配置図を示すも
のである。

図中、（１０）は、貯蔵槽（図示せず）から、第１番目
の電気透析装置（１１）の各室（２８ａ、２８ｂ、２８
Ｃ）へ、反応物質混合物を供給するためのパイプ（導管
）である。この場合、パイプ（１０）によって供給され
る反応混合物中に緩衝液を加えるか、または、複数個の
装置（２２）を段階的に配置して用い、それら各段階の
間にｐＨ制御機能を設ける等の方法により、ｐＨのコン
トロールについて準備しておくことが望ましい。反応液
は、装置（１１）を、図示する如く透析室（２８ａ）、
（２８ｂ）および（２８Ｃ）を経て通過するが、これら
の各室（２８す、（２８ｂ）および（２８Ｃ）内におい
て、同じく装置（１１）の室（１７ａ）および（１７ｂ
）内にある生成物流液（プロダクト・ストリーム）から
除去された反応物質によって、反応物質が豊富化される
ことになる。再循環された反応物質によって豊富化され
た反応流液は、ポンプ（図示せず）により、パイプ（１
３）から、酵素反応室（１４）へ送られる。

パイプ（１５）は、ポンプ（１６）の制御下、電気透析
セル（１２）と連結されている。このパイプ（１５）は
、酵素反応室から出た溶液を輸送するものである。この
溶液（生成物を取り除く際の媒介物として作用する溶液
であるため、生成物溶液と称する）中には、この時点に
おいて、生成物と未反応の（消費されていない）反応物
質との両方が含有されている。

電気透析装置（１１）および（１２）の両者には、生成
物溶液の通り道である中室（１７ａ）および（１７ｂ）
が設けられている。これら両装置（１１）、　（１２）
には、それぞれ、ポンプ（２３）、（２４）のコントロ
ールの下で、それぞれ貯蔵タンク（２０）、（２１）か
ら、室（２７す、　（２７ｂ）並びニハイプ（２９ａ）
、（２９ｂ）を通って、希釈された塩基性溶液および酸
性溶液が循環されている。陽イオン交換膜（ｃ）および
陰イオン交換膜（Ａ）、で示されるイオン交換膜を横切
る様に、陰極（１８）奢よび陽極（１９）間に直流電圧
をかけるための供給源（図示せず）が設けらの れている。装置（１工）に詔いては、未反応イオンΔ 性に荷電した反応物質が室（２８ａ）、（２８ｂ）およ
び（２８Ｃ）に集められる一方で、相対的に非荷電性の
生成物は室（１７りおよび（１７Ｃ）内に止まり、やが
てパイプ（２５）から排出されて生成物収集部位（図示
せず）に至る。装置（１２）の目的は主に、幾分かの水
の除去並びに、系内に蓄積される無機塩の除去にある。

パイプ（２６）は、室（２２ａ）孟２２ｂ）および（２
２Ｃ）に希薄な塩溶液を供給するものであり、電気透析
された塩を含む溶液はパイプ（２８）を通って除去され
る。装置（工２）内での荷電した反応物質の損失は、例
えば約２００〜３００　ＭＷ以下のイオンが通過できる
様な、かなり小さい孔を有するイオン交換膜を用いるこ
とにより、最小に止める。反対に、装置（１１）内の膜
は、約１０００以下の分子量を有するイオンが透過し得
るので、装置（１２）では無機イオンだけが系から取り
除かれ、生成物流中の反応物質は装置（１１）内で取り
除かれる。脱塩装置（１２）は、本発明方法を好首尾に
実施すふトで訊術小り小ｉＩＪ　ｆｐ　＋　１よＩ　珈
庸両１１昇することは、反応室（工４）内の酵素に悪影
響を及ぼすおそれがあるので、この糸を長期間、連続的
に作動させるためには望ましい装置である。

第２図は、ＡＰＭの酵素的な合成と回収のための、もう
１つの実施例における好ましい系の配置図である。この
装置は、電気透析装置（３０）と、中空ファイバー酵素
反応室（１４）の、２要素からなっている。

電気透析装置は、商品名イオニッラス・メディマット１
１０（ＩｏｎｉｃｓＭｅｄｉｍａｔ　　１１０ＸＤ電気
透析機を、アスパラギン酸ナトリウム（ＳＡ）およびフ
ェニルアラニンメチルエステル（ＰＭＥ）ＨＯｚからＡ
ＰＭを分離し得る様に改良した装置である。この電気透
析装置で採用されている膜の組み合せ方（スタック）を
第２図に示した。その配列法は、陰イオン透過性膜体陽
イオン透過性膜とを交互に配し、スタックの陽イオン透
過性の面を陽極に向けて配することからなる。これには
多くのセル（イオン交換膜によって囲まれた空間）が含
まれティる。セルの数は重要でなく、また、図面に示さ
れているよりも、かなり大きくても艮い。また、陽イオ
ン交換膜と陰イオン交換膜とを交互に用いることも臨界
的ではない。陽イオン透過性膜は、イオニッラス（Ｉｏ
ｎｉｃｓ）ＣＺＬ　３Ｂ６　（塩化ビニルとアクリロニ
トリルとの共重合体で補強したスルホネート基置換膜）
である。この膜（ｃＺＬ）は、約２００〜３００の分子
量カットオフ（遮断）を有しているので、分子量２００
〜３ＱＱＭＷ以下の物質はこの膜を容易に通過する。陰
イオン透過性膜、イオニッラス（Ｉｏｎｉｃｓ）ＱＺＬ
　３８６も、４級７．／モニウム基で置換されている外
は前記と同様である。陽イオン移送膜は、陽イオンを通
過させて陰イオンを排除し、他方、陰イオン移送膜はそ
の逆の作用を行う。（２１）および（２０）はそれぞれ
、希薄な酸（Ｑ、ＩＭＨ，５０，）および塩基（０，Ｉ
　ＮＮａ０Ｈ）の貯蔵タンクであって、これらタンク（
２１）および（２０）から、ポンプ（２４）詔よび（２
３）の制御下において、パイプ（２９ｂ）および（２９
ａ）を介し、電気透析セル（３ｏ）に、酸および塩基が
供給される。各室は、イオン交換膜で区切られており、
その側面はスペーサー（図示せず）によって隔てられて
おり、その通路でパイプ（１５）、（１３）、（３１り
または（３１ｂ）に連絡している。

酵素の入った酵素反応室（１４）Ｃ点描法で示した（３
３）の領域〕は、中空ファイバー透析機の殻（シェル）
側に位置している細胞が、ハラダら（前記引用側参照）
の述べている如く、シュードモーナス・プチダ（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ　Ｐｕｔｉｄりである外は、カンら（
前掲）の記載と同様である。

電極間に電流を通じると、電場の影響で陽イオンは膜を
透過するが、反対側に移動する陰イオンは膜を横のって
通過することを大きく阻害される。

他方、陰イオン交換膜は、陰イオンを通過させるが、陽
イオンの通過に対しては大きく妨害する。

陽イオン交換膜と陰イオン交換膜の交互の配列を用いる
と、これらの膜で隔てられた一つおきの区画（コンパー
トメント）にイオンが蓄積される。

他の区画内の溶液からはイオンが除かれる（＠塩除去”
室またはセル）が、ＡＰＭの如き電荷を持たない物質は
保有される。一般に、そして具体的にはＡＰＭの場合、
処理される反応物質の流れは、塩除去（塩消耗）区画を
通過し、荷電したものが蓄積される溶液は、°塩蓄積”
区画と称される別の区画を通過する。通常、両電極と、
セルの全スタックとの間〔例えば室（２７ａ等）〕を直
接通過する溶液は処理に係る流れとは分離される。この
様に、酵素反応室から流出する流れは、生成物に富む流
れと、反応物質に富む流れとに分かれる。

反応物質に富む溶液は酵素反応室内にフィードバックさ
れ、他方、生成物に富む液流は反応系から取り出される
。かくして、反応物質が酵素反応室または細胞反応室と
、電気透析用スタックとの間を常に循環している一方で
、生成物は、常に、この複合系から取シ除かれているこ
とになる。

考察された操作法においては、装置の使用前に該装置を
ＳＡおよびＰＭＥの希薄な溶液で平衡化しておいた。定
常期における操作の間、酵素反応室（３３）からパイプ
（１３）に出る生成物の流れはｐＨが約５．６５に調節
されておシ、その中に、ＳＡ約４０ｇ／ｌＳＰＭＥ約６
６　ｇ／！およびＡＰＭ約３Ａシ９が含有されていた。

反応物質と失なわれる水とを調整する流れは、パイプ（
３５）から輸送されて貯蔵タンク（３２）内に入り、次
に：パイプ（３１ｂ）を介して装置（３０）に送られた
。パイプ（１５）内の生成物流およびパイプ（：Ｈａ）
内の塩蓄積流の流速は、１対づつのセル室（それらの内
の２つを３２１および３２ｂとして例示した）を通過す
る定常期の操作のためにセットされた。電極流の流速は
、各セルについて約５００　ｒｔｔｌ１分であった。

電極（１８）と（１９）は、直流の電源（図示せず）と
連結されていた。電圧は、約３ボルト／セル対に調節さ
れた。生成物流と塩蓄積流とは、ポンプによってそれぞ
れ、パイプ（１５）および（３１りにくみ出された。生
成物流から、まずナトリウムと塩素、次いでアスパルテ
ートとＰＭＥイオンが除かれた。連続操作の結果、得ら
れた生成物流は、実質上、ＳＡまたはＰＭＥを含まず、
濃度約７　ｇ／ｌのＡＰＭを含有していた。時々、塩浄
化を行うことが望ましい。

さらに、本発明の装置を用いると、生成物溶液が電気浸
透圧作用によって濃縮されるという利点がある。所望の
生成物が飽和に近い状態にまで濃縮されるならば、それ
を、電気透析用セルよりも下流の段階〔例えば、熱交換
体（図示せず）を通過する際に溶液を冷却する等〕で沈
澱させ、次いで、常法（例えば、連続的に遠心して回収
する）により、沈澱を分離することができる（装置は図
示せず）。

余り好ましくない方法であるが、別法として、反応容器
（１４）内の（３４）に示される様に、中空ファイバー
または他の透析用膜によって分離せずに、酵素を生成物
溶液と直接、接触する位置におくこともできる。その代
り、酵素−含有細胞または、細胞−不含酵素をジャック
ら（前掲）の方法によって固定化する（活性化したアガ
ロースに細胞を共有結合的に結合させる）か、またはウ
ィンガードら（前掲）の方法によって固定化する（例え
ば、細胞−不含酵素をジアゾ化したアリールアミノ・ガ
ラス、または、好ましくは、クロロ、ブロモまたはヨー
ド・セルロースに共有経合的に結合させる、あるいは、
酵素を、ＤＥＡＥまたはＴＥＡＥ−セルロースの如きイ
オン交換樹脂に非共有結合的に吸着させる）。出発物質
である反応物質を含む溶液は固定化細胞または固定化酵
素の間を循環して通り、酵素と直接に接触した後、電気
透析セルに向けてポンプで送られる。

さらに別の方法では、酵素を電気透析用セル内の電気透
析膜に吸着、または共有結合的に交差結合させる、ある
いは他の方法で固定化して用いる。

例えば、塩蓄積溶液電気透析室（３２ｂ）の境界にある
膜の表面は、スルホネート基や４級アンモニウム基の如
き電荷を持つ基を持っている。電荷を有する反応物質の
局所的な濃度が最も高くなっていることが見出される様
な膜の塩蓄積側の部分にイオン的に吸着されるか、ある
いは通常の交差結合剤により、共有結合的に結合される
酵素を選択する。この方法においては、電荷を帯びた反
応物質が塩蓄積セル内に入ると、そこで酵素がこの反応
物質に対して触媒的に作用し、次いで、反応溶液が、活
動ポンプ（非電気的に作動）によって生成物セルに送ら
れ、該セル門で、電荷を帯びた反応物質が取除かれて塩
蓄積セル内に戻されると共に、イオンを失った生成物が
取シ出され、回収される。

この方法においては、塩蓄積溶液の、膜と接する境界層
において反応物質イオンの局所濃度が高くなっているた
めに、平衡が生成物にとって好ましい方向に傾いており
、別個の酵素−反応容器ループを含まない。しかしなが
ら、この場合には、塩蓄積室の長さに従って調整反応液
を供給する（例えば、室の長さに合わせて分散させるチ
ューブを挿入する）ことによシ、室における反応液の流
出液の濃度が流入液のそれよシも低くならない様にする
ことが望ましい。その様な濃度の低下は、流出液中で反
応物質濃度の減少に起因する加水分解が起こり易（なる
ことから、望ましくないことである。

本発明の利点の１つは、生成物流の中に混ざシ合う、ま
たは混ざり合わない有機溶媒を加える必要性を排除する
ことができる、という点にあるが、本発明）実施に際し
て、その様な溶媒力ｉａ！＜＞、＜オン交換膜と適合し
得るものであり、以後のそれら溶媒の除去が経済的に発
展性ある事であシ、さらに、生成物を動物またはヒトに
投与することを目的としている場合には、それらが無毒
である限り、その様な溶媒の使用を全く排除するもので
はない。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の装置の配置図であり、第２図は他の実
施例に係る装置の配置図である。１０はパイプ、１１は
電気透析装置、工２はセル、１３はパイプ、１４は酵素
反応室、１５はパイプ、１６はポンプ、１７ａおよび１
７ｂは一室、１８は陰極、１９は陽極、２０および２１
は貯蔵タンク、２２ａ、２２ｂおよび２２Ｃは室、２３
および２４はポンプ、２５および２６はパイプ、２７ａ
、２７ｂ、２８ａ、２８ｂおよび２８Ｃは室、２９ａお
よび２９ｂはパイプ、３０は電気透析装置、３１ａおよ
び３１ｂはパイプ、３２は貯蔵タンク、３３は酵素反応
室。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）１種またはそれ以上の反応物質と酵素とを接
   触させて該反応物質と１種またはそれ以上の生成物の混
   合物からなる組成物を生産し（ここで、全生成物または
   全反応物質のいずれか一方は実質的に０の実効イオン電
   荷を持つ。ただし、全反応物質の実効イオン電荷が実質
   上０であるときには生成物は実質的な実効イオン電荷を
   持つており、全生成物の実効イオン電荷が０であるとき
   には反応物質は実質的な実効イオン電荷を持つている。 ）； （ｂ）工程（ａ）の組成物を電気透析して生成物を反応
   物質から分離し； （ｃ）生成物を回収し；さらに、 （ｄ）分離した反応物質を再循環させて酵素と接触させ
   ることからなる方法。 ２、生成物がポリペプチドである第１項記載の方法。 ３、生成物がジペプチドである第１項記載の方法。 ４、ジペプチドがＡＰＭであり、反応物質がアスパラギ
   ン酸とフェニルアラニン・メチルエステル、またはそれ
   らの塩である第３項記載の方法。 ５、酵素が、基質に作用してペプチド結合を形成させ得
   るものである第１項記載の方法。 ６、酵素がプロテアーゼである第５項記載の方法。 ７、プロテアーゼが、アスパラギン酸またはその塩とフ
   ェニルアラニン・メチルエステルとの間のペプチド結合
   の形成を触媒することのできるエキソプロテアーゼであ
   る第６項記載の方法。 ８、酵素が生きている、または死んだ細胞内に存在して
   いるものである第１項記載の方法。 ９、酵素が、共有結合的な結合により、あるいは、物理
   的な取り込みまたはイオン吸着により、支持体に固定化
   されている第１項記載の方法。 １０、酵素がイオン交換膜に共有結合的に固定化されて
   いる第１項記載の方法。 １１、酵素が膜上にイオン吸着されている第９項記載の
   方法。 １２、組成物がさらに有機溶媒を含んでいる第１項記載
   の方法。 １３、反応溶液中から、透過性膜によつて酵素が分離さ
   れない第１項記載の方法。 １４、電気透析手段、電気透析手段から固定化酵素へ反
   応物質を再循環させるための手段、並びに電気透析手段
   から生成物を回収するための手段と流体で連絡している
   固定化酵素を含む装置。 １５、少なくとも一部分はイオンと水透過性イオン交換
   膜によつて定められる限界を有する電気透析塩消耗室、
   この室を横切つて電圧をかけるための手段、膜の、塩消
   耗室と反対側に位置する電気透析塩蓄積室、塩消耗室と
   流体により連絡している酵素、並びに塩消耗室または塩
   蓄積室のいずれかから酵素に液体を再循環させるための
   手段を含む装置。 １６、酵素が、基質に作用してペプチド結合を形成する
   ことのできるものである第１５項記載の装置。 １７、酵素がプロテアーゼである第１６項記載の装置。 １８、さらに、酵素に反応物質を供給するための手段を
   も有する第１５項記載の装置。 １９、酵素が、支持体に共有結合的に結合することによ
   り、物理的な取り込みにより、あるいはイオン吸着によ
   り、固定化されている第１５項記載の装置。 ２０、酵素がイオン交換膜に固定化されている第１９項
   記載の装置。 ２１、酵素が、塩消耗室と流体により連絡している反応
   室内に存在している第１９項記載の装置。 ２２、酵素反応室に再循環された液体から無機塩類と水
   とを除去するための手段を含んでいる第２１項記載の装
   置。 ２３、塩消耗室から除かれた生成物を沈澱させるための
   手段を含んでいる第１５項記載の装置。 ２４、液体を再循環させるための手段が、塩蓄積室から
   の液体を酵素に導くものである第１５項記載の装置。 ２５、塩蓄積セルと塩消耗セル、荷電した反応試薬を塩
   蓄積セルに導く手段、塩消耗セルから生成物を取り除く
   手段、塩蓄積セル内の、荷電イオンの濃度が最も高い領
   域に固定化されている酵素、並びに塩蓄積セルから塩消
   耗セルへ液を循環させるための非電気的な伝達手段を有
   する電気透析装置。 ２６、導入および除去するための手段がポンプである第
   ２５項記載の装置。