JPS61108398A - 芳香族置換されたｌ‐アミノ酸の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 西ドイツ特許公開公報第２．２１５，８５３号（米国特
許第３，８１５．３１７号）の記載から、ラセミ形のモ
ノおよびジ環置換されたフェニルアラニンを初めに４個
までの炭素原子を有するアルカノールを用いてエステル
化し、このラセミ形エステルに酸性−においてキモトリ
プシンを作用させ、Ｌ−アミノ酸を沈澱により単離しそ
して場合によりＤ−アミノ酸のエステルを戸液から抽出
しそして加水分解するととＫより対応するＬ−アミノ酸
に変換することが知られている。

酵素々してはα−キモトリプシンが好ましく、酵素的分
割における好ましい一範囲は５〜６である。Ｌ−アミノ
酸の分離除去後に残留する液体はＤ−アミノ酸のエステ
ルを抽出する前にアルカリ性に調整される。

今、芳香族置換され九し−アミノ酸が、酵素的分解にお
いて得られる混合物をはじめにアルカリ性に調整し、Ｄ
−アミノ酸のエステルを抽出し、場合によりエステルの
抽出液を乾燥したのちラセミ化させそしてラセミ化合物
を工程に戻すことにより特に好都合に得られうろことが
　　　□見出された。アルカリ性残留物がらＤ−７ミノ
酸のエステルを抽出し九のち酸性化後Ｌ−アミノ酸を単
離する。

それゆえ本発明はラセミ形の低級アルキルエステルを弱
酸性水性媒体中でα−キモトリプシンを用いて分割する
ととＫより芳香族置換されたＬ−７ミノ震を製造するに
当り、反応混合物を弱アルカリ性に調整し、Ｄ−アミノ
酸のエステルを有機溶媒を用いて抽出し、このエステル
をラセミ化させ、そして再び工程に戻し、そして水性ア
ルカリ性抽出液を酸性となしたのちＬ−アミノ酸を単離
することからなる方法に関する。本発明の好ましい態様
を以下に説明する。

芳香族置換されたアミノ酸としてはなかんずくトリプト
ファン、特にフェニルアラニン、チロシンおよヒ５ｔ４
−　’）ヒドロキシ−フェニルアラニンが適当である。

ラセミ形のアミノ酸のエステル化は西ドイツ特許公開公
報第２，２１５，８５３号の記載により遂行されうる。

４個までの炭素原子を有する低級アルカノール（第三ブ
チルを除く）％にメタノール、エタノール、ｎ−プロメ
ノール、イノプロ／リールおよびｎ−ブタノールが好ま
しい。

α−キモトリプシン七好都合忙は固定された形態で使用
され、その際無機担体が好ましい。

この固定された酵素を次に固定床または流動床中にて基
質水溶液と接触させる。この反応は用いられるエステル
の如何に応じ好ましくは２０〜４５℃、好都合には５０
℃〜４０’Ｃ１およびｐ）１４．５〜６．５好都合には
一定した声値５．０−４０で遂行される。基質濃度それ
自体は決定的に重要なものではなく、好都合には５〜１
５重量％、％忙１０〜１５重ｉｓである。

酵素的分割により得られるＬ−アミノ酸およびＤ−アミ
ノ酸エステルの水溶液を弱アルカリ性、好ましくはｐＨ
７，５〜ａ５好ましくはａｏに調整しそして好都合には
２０〜４０℃、特に室温で適当な有機溶媒で抽出する。

抽出に用いられる有機溶媒としては、ラセミ化がエステ
ルを単離することなく特に好都合に行われうるのであま
り水と混和しない溶媒が選択されるのが好都合である（
ラセミ化に際して水の存在は加水分解のような副反応を
苛起しうる）つそれゆえ水と共沸混合物を形成しそして
それにより抽出液が容易に乾燥されうる溶媒が好ましい
。一般的には好ましいものでないにしても、抽出に用い
られる溶媒を完全に分離除去しそしてエステルを固形物
としてラセミ化させることも可能である。

抽出に適当な溶媒は脂肪族炭化水素例えばヘキサン、４
！に芳香族炭水化物例えばトルエンまタハキシレン、エ
ーテル特に低級ジアルキルエーテル例えばジエチルエー
テル、ジイソプロピルエーテルまたはジ−ｎ−ブチルエ
ーテル、ケトン特ＫｆＲジアルキルケトン例えばメチル
エチルケトンまたはメチルイソブチルケトン、ハロゲン
化炭化水素特に塩素化された低級脂肪族例えばメチレン
クロリド、クロロホルムまたはテトラクロロメタン、な
らびにエステル特に低級脂肪族カルボン酸の低級アルキ
ルエステル例えば酢酸エチルまたは酢酸ブチルである。

ラセミ化はそれ自体知られた方法でケト化合物および／
または酸により触媒されうる。従って溶媒が何らケトン
でない場合は、アルデヒドまたはケトンの添加はラセミ
化を相当に促進しうる。場合により酸を添加したケトン
中における光学活性なアミノ酸エステルのラセミ化は特
開昭５４−１０９９１２号公報の記載から知られている
。この知られたラセミ化反応においてはトルエン、テト
ラクロロメタンまたはメタノールのような溶媒も使用さ
れうる。アルデヒドおよび酸による遊離の、光学活性ア
ミノ酸のラセミ化は公開されたヨーロッパ特許出願第５
７，０９２号および８．　Ｙａｍａｄａ氏他のｒ　Ｊ、
　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｍ、Ｊ第４８巻第８４５〜８４６頁
（１９８３年）の記載から知られている。好都合にはこ
れらのケト化合物は触媒量好ましくはエステル１モル当
り０．００１〜ＣＬ１モルなる量にて使用される。アセ
トアルデヒドおよびサリチルアルデヒドが好ましい。

ラセミ化に際して生成するり、Ｌ−の混合物を次に軽く
酸性化した水を用いてラセミ化混合物から抽出するとエ
ステルが塩形態に変換される。

この水溶液は新しい基質を添加することにより所望の濃
度、好ましくは５〜１５、特に１０〜１５’！ｉ％に調
整しそして工程に戻す。

Ｌ−アミノ酸を含有する弱アルカリ性水性残留物から酸
性化することによりこのものを単離する。酸の溶解度の
如何に応じこのものは直接Ｋかまたは濃縮後に結晶化さ
れうる。この酸は知られ九方法で適当な溶媒を用いて抽
出するととＫよっても単離されうる。精製は知られた方
法で遂行される。

本発明方法は芳香族置換され７’ｊＬ−アミノ酸が９０
チ以上の収率でかつ９８％以上の光学純度で取得されう
ろことを許容する。酵素による分割、Ｄ−エステルの抽
出、そのラセミ化および還流の組み合せにより本方法の
連続的な態様をも許容するこれら操作工程の特に好都合
な組み合せが得られる。

以下の実゛施例において本発明の詳細な説明する。百分
率の記載は別に断わりなければ重量によるものとする。

実施例　１ α−キモトリプシンの固定 この酵素はＨａｌｖｒａｃｈｓ氏他のｒ　Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
　Ｊ第ＸＩＸ巻第１６６７〜１６７７頁（１９７７年）
の記載によりけい酸アルミニウム上べ固定されうる。し
かしなから下記の操作法が特に好ましい。

乾燥シリカゲル（粒子寸法α１〜α３ｍ）１５８Ｉをア
セトン中の３−７ミノプロピル−ト９エトキシシランの
、５．５％溶液１を中にとりそして室温で２時間聰やか
に攪拌する。次にアセトンを回転蒸発器で除去しそして
シリカゲルを真空乾燥用オープン中で１００℃で８時間
乾燥する。

生成物はシリカゲル１１Ｉ当り０．８９ミリモルのアミ
ノ基を含有する。このアミノ化されたシリカゲルを２５
％グルタルジアルデヒド水溶液４０〇−中にとりそして
室温で２時間真空下（約１３０ミリバール）に保持する
。続いて担体を濾過しそして脱イオン水で充分に洗う。

かくして活性化されたシリカゲル１３８Ｉを０．５Ｍ燐
酸塩緩衝液（ｐＨ７５）３００−中ノα−キモトリプシ
ン（Ｎｏｖｏ社製品、８００８０ｒａ１等級）ＩＡ８Ｉ
ｉの溶液中に加えそしてこの混合物を室温で４時間攪拌
する。続いて触媒を戸遇しそして脱イオン水、飽和食塩
溶液および脱イオン水の各１ｔずつで洗う。保存するＫ
は固定されたα−キモトリプシンを０１Ｍ燐酸塩緩衝溶
液（ｐＩ（７，５，０，１ミリモルのナトリウムアジド
）５０〇−中にとる。

活性を測定するＫは、固定されたα−キモトリフシン１
１ｔＤ、Ｌ−ｙエニルアラニン／？ルエステル塩酸塩の
１０％水溶液５ｏ−中に加え、ｐｉ（６，ＯＫ調整しそ
して３０℃に温度調節しそしてこの溶液を攪拌する。自
動滴下式ビニレット　　　　“からα１Ｎ水酸化ナトリ
ウム溶液を添加することにより声値を一定に保持する。

消費された水酸化ナトリウム溶液の量が測定量でありそ
してＬ−フェニルアラニンの濃度に直接比例する。

活性：３３８Ｕ／担体（乾燥）１．９−Ｌ−フェニルア
ラニン１５５に９ｉ担体ゆおよび時間（ここでＵは酵素
活性に関する国際単位、ＩＵ−１μモル／分変換）。

実施例　２ 酵素によるラセミ化合物の分割 内部攪拌器、−一電極および自動滴下式ビユレットを備
えた恒温調節しうる反応容器中にり、Ｌ−フェニルアラ
ニンメチルエステル塩ｒＲ塩ｔｏ。

、９　（Ｄ、Ｌ　−フェニルアラニンの残余量はＨＰＬ
Ｃ検出限界である０、３％以下）を加えそして脱イオン
水１を中に溶解させる。この溶液の直値を５Ｎ水酸化ナ
トリウム水溶液を用いて６．０に調整する（９．５ｉ）
。この溶液を３０℃に温度調節しそして実施例１の記載
により固定された酵素１５０−を充填したカラム（直径
５．　ＯｃｒＩＬｓ床の高さ８　ＣＩＩＬ　）に循環流
量毎時５．　ＯＬでポンプにより循環させる。

この溶液の直値は５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（３７，
８ｄ　）の添加により反応時間中＆ＯＫ保持される。２
５分間反応させたのちでＨＰＬＣ分析に！しｔｆＤ、Ｌ
−フェニルアラニンメチルエステルに基づき４９２俤の
変換が得られる。そこで反応を中止しそして酵素床を脱
イオン水３００−で洗う。

実施例　３ Ｄ−フェニルアラニンメチルエステルの抽出および続く
ラセミ化 実施例２で得られたＤ−７エニルアラニンメチルエステ
ルおよびＬ−フェニルアラニンの水溶液を攪拌下に５Ｎ
水酸化ナトリウム水溶液を添加することにより（３６，
５ｄ）ＩｌｌＨａＯに調整しそして室温で各３００−ず
つのメチルイソブチルケトンと３回振盪抽出する。３回
目の抽出後には水相中にはＨＰＬＣ分析によれば何らも
うエステルが含有されていない（検出限界０．２チ以下
）。

合一した抽出液に氷酢酸１４．　Ｏ、？を加え（Ｄ−エ
ステルに基づき０．５モル当りそして抽出液中に含有さ
れる水をビグルー（Ｖｉｇｒｅｕｘ）カラムで共沸蒸留
除去する。乾燥した抽出液をさらに２時間還流下に加熱
し、その際ラセミ化度合いは旋光計を用い溶液の旋光度
を測定することにより計測したつこの溶液を室温まで冷
却したのち０．０５　Ｎ塩酸３００−ずつを用い６回振
盪抽出する。合一した水相中には、ＨＰＬＣ分析によれ
ば用いられたエステルの９＆５％が含有される。

この水溶液にり、Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル
塩酸塩を添加することにより１０チに調整しそしてさら
に酵素的分割に用いる。

抽出剤としてｎ−ヘキサン、ジ−ｎ−ブチルエーテル、
トルエンまたはキシレンが用いられる場合は、反応を促
進するために触媒量のアセトアルデヒド、サリチルアル
デーヒトまたはベンズアルデヒドが添加される。

氷酢酸の代りＫＳ塙酸、安息香酸、クエン酸、ｐ−トル
エンスルホン酸または蟻酸も使用されうる。酸なしでは
ラセミ化は非常釦より徐々に進行しそして１０時間以上
必要とする。Ｑ、５モル当量以上の酸濃度では何らそれ
以上の速度増大をひき起さない。

実施例　４ 後処理およびＬ−フェニルアラニンの単離実施例３でメ
チルインブチルケトンを用いて抽出した後に得られる、
Ｌ−フェニルアラニン　　　　□を約五５チ含有する溶
液を濃塩酸を用いてｐＨ５，５（フェニルアラニンの等
電点）Ｋ調整しそして回転蒸発器中でＬ−フェニルアラ
ニンの含量が約１０チとなるまで濃縮する。析出したＬ
−フェニルアラニンを９０℃まで加熱することにより溶
解させそしてこの溶液を熱時Ｆ遇する。透明な溶液を室
温で放置せしめると、Ｌ−７エニルアラニンが大きい結
晶で沈澱する。母液を＋５℃で一夜保存すると白色結晶
が沈澱し、これを濾過しそして少量の冷水で洗う。この
結晶を１０５℃で３時間真空乾燥オープン中で乾燥する
。Ｌ−フェニルアラニン３５．３　Ｊ　、または用いら
れたＬ−７エニルアラニンメチルエステル塩酸塩５０Ｉ
に基づき９２チ、が得られる。光学濃度は９ａ５〜９９
．５チである。

実施例　５ ラセミ化合物の酵素による分割 り、Ｌ−フェニルアラニンエチルエステル実施例２にお
けると同様にしてり、Ｌ−フェニルアラニンエチルエス
テル硫酸水素塩１５０ＩＩを脱イオン水１を中に溶解さ
せる。この溶液の−値を５Ｎ水酸化す）Ｊｌｌラム溶液
を用いて５．５に調整する。仁の溶液を４０℃に温度調
節しそして毎時６ａｔの流量で力°ラムにポンプで循環
させ、その間５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加するこ
とにより全反応期間中ｐＨｓ、　５に保持する。

それ以後の処理は実施例３および４に相轟して行われる
。

実施例　６ ラセミ化合物の酵素による分割 り、Ｌ　−フェニルアラニン−ｎ−プロピルエステル実
施例５におけると同様にしてｖ、ｆ、　−７二二ルアラ
ニンーｎ−プロピルエステル硫酸水素塩を反応させるが
、しかしながらその際肯値は５．３に調整および保持す
る。それ以後の処理は実施例３および４と同様にして遂
行される。

Ｄ、Ｌ−フェニルアラニンのイソプロピルエステルまた
はｎ−ブチルエステルも使用でき、同じ結果が得られる
。

実施例　７ Ｌ−１リプトフアン 実施例２と同様にしてり、Ｌ　−）　！Ｊブト７アンメ
チルエステル塩酸塩５０Ｉを脱イオン水１を中に溶解さ
せそして前記したようにして酵素により分割する。かく
して得られた水溶液から実施例６の記載に従いＤ−トリ
プトファンメチルエステルを抽出しそして残る水相を実
施例４におけると同様にして濃塩酸を用いて−５，９（
）リプドアアンの等電点）に調整しそして回転蒸発器中
でＬ−ト９ブト７アンの含量が約５％となるまで濃縮す
る。分離した結晶を濾過し、冷水で洗いそして１０５℃
で３時間乾燥する。用いられたＬ−トリプトファンメチ
ルエステル塩酸塩２５ＩＩＫ基づき１９．４　Ｊ　（９
７チ）が得られる。光学純度は９ａ７ｍである。

特許出願人　　ヘキスト・アクチェンゲゼルシャフト外
２名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）低級アルキルエステルのラセミ化合物を弱酸性ｐＨ
   範囲においてα−キモトリプシンを用いて酵素的に分割
   しそしてＤ−形のエステルを抽出することにより芳香族
   置換されたＬ−アミノ酸を製造するに当り、酵素的分割
   により得られる反応混合物を弱アルカリ性に調整し、こ
   のアルカリ性溶液からＤ−アミノ酸のエステルを有機溶
   媒を用いて抽出しそしてラセミ化させ、そこでラセミ化
   合物を工程に戻し、そして抽出されたアルカリ性溶液を
   弱酸性に調整し、そこでこのものからＬ−アミノ酸を単
   離することからなる方法。 ２）α−キモトリプシンが固定された形態で使用される
   ことからなる前記特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３）α−キモトリプシンが無機担体に固定されているこ
   とからなる前記特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４）Ｄ−エステルの抽出に水との混和性の低い有機溶媒
   が用いられることからなる前出の項の１項またはそれ以
   上に記載の方法。 ５）水と共沸混合物を形成する溶媒が使用されることか
   らなる前記特許請求の範囲第４項記載の方法。 ６）Ｄ−エステルの場合により乾燥された抽出液をラセ
   ミ化にかけることからなる前出の項の１項またはそれ以
   上に記載の方法。 ７）ラセミ化されたエステルを酸性条件下に抽出しそし
   て濃縮後工程に戻すことからなる前出の項の１項または
   それ以上の項に記載の方法。 ８）エステルが第三ブチルを除く１〜４個の炭素原子を
   有するアルキルエステルであることからなる前出の項の
   １項またはそれ以上に記載の方法。 ９）エステルがフェニルアラニンまたはトリプトファン
   のメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルまたは
   ｎ−ブチルエステルであることからなる前出の項の１項
   またはそれ以上に記載の方法。