ES2211662T3 - Procedimiento para la produccion de cianohidrinas activas opticamente utilizando r-oxinitrilasa. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la producción de los (R)-enantiómeros de cianohidrinas ópticamente activas a través de reacción de un aldehído o de una cetona con un donador de grupos cianuro en presencia de (R)-oxinitrilasa, caracterizado porque se agita una mezcla de reacción compuesta por: a) un aldehído o cetona disueltos en un diluyente orgánico, no miscible o insignificantemente miscible con agua, b) una solución acuosa de (R)-oxinitrilasa y c) un donador de grupos cianuro con una energía de agitación sobre 500 W/m3, de manera que se obtiene una emulsión, que se mantiene hasta el final de la reacción enzimática, después de lo cual al término de la reacción enzimática se aísla la (R)-cianohidrina correspondiente a partir de la mezcla de reacción.

Description

Procedimiento para la producción de cianohidrinas activas ópticamente utilizando R-oxinitrilasa.

Las cianohidrinas son importantes, por ejemplo, para la síntesis de alfa-hidroxiácidos, alfa-hidroxicetonas, beta-aminoalcoholes, que encuentran aplicación para la obtención de substancias biológicamente activas, por ejemplo substancias farmacéuticas, vitaminas o también compuestos piretroides.

La producción de cianohidrinas se puede llevarse a cabo por adición de ácido prúsico (HCN) al grupo carbonilo de un aldehído o de una cetona asimétrica, resultando mezclas de enantiómeros de cianohidrinas asimétricas.

Puesto que, normalmente, en una mezcla de enantiómeros biológicamente activa solo es biológicamente activo uno de los dos enantiómeros, no han faltado ensayos para encontrar un procedimiento para la producción de los (R)-enantiómeros de una cianohidrina ópticamente activa con una pureza óptica lo más alta posible. Muchos procedimientos se basan en la adición de HCN al grupo carbonilo en presencia de un catalizador quiral, por ejemplo una oxinitrilasa.

La pureza de los enantiómeros de la cianohidrina a producir depende, en este caso, en gran medida de la medida en que se puedan suprimir la reacción de concurrencia química y la racemizado.

Como se conoce a partir de J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, páginas 6992-6996, especialmente en procedimientos que trabajan en el sistema acuoso es particularmente difícil conseguir una enantioselectividad y una enantiopureza altas en virtud de esta reacción de concurrencia.

Se indica en el documento EP-A-0 326 063 una vía para suprimir la reacción de concurrencia química y la racemizado, según el cual se obtienen (R)-cianohidrinas ópticamente activas a través de reacción de aldehídos alifáticos, aromáticos o heteroaromáticos o cetonas en medio acuoso con ácido prúsico en presencia de (R)-oxinitrilasa (EC 4.1.2.10) a partir de Prunus amygdalus, trabajando en condiciones tan ácidas, especialmente a pH \leq 4,5 y a temperaturas tales que sean insignificantes la reacción de concurrencia química y la racemizado con respecto a la síntesis enzimática. A este respecto se hace referencia a las elevadas pérdidas de actividad en estas condiciones del biocatalizador y los ejemplos permiten reconocer una preferencia de las temperaturas bajas en el intervalo de 5 a 8ºC.

Puesto que los enzimas son proteínas acuosas y los substratos son, en cambio, compuestos sólo mal solubles en agua, se ha propuesto la utilización de disolventes orgánicos miscibles con agua para la mejora de la solubilidad del substrato y del producto.

Así, por ejemplo, se ha investigado por Effenberger y col. (Angew. Chem. 99 (1987), páginas 491-492) la formación de cianohidrina enzimática en sistemas acuoso-alcohólicos variante el valor pH, la temperatura y la concentración con respecto a una supresión óptima de las reacciones de concurrencia. Sin embargo, la pureza estereoquímica de los productos finales deseados no era en este caso con frecuencia satisfactoria. Como mejora se ha propuesto realizar la reacción enzimática de compuestos oxo con ácido prúsico en disolventes orgánicos no miscibles con agua para suprimir la reacción química. En este caso se ha trabajado con preferencia con acetato de etilo y utilizando (R)-oxinitrilasa fijada en soporte. De esta manera se han obtenido productos con alta pureza óptica, pero se ha observado una pérdida considerable de actividad enzimática a través de la inmovilización del enzima. Además, se ha comprobado que la reacción no enzimática, que conduce en la fase acuosa a través de adición del ácido prúsico al compuesto de partida a cianohidrinas racémicas, provoca una disminución no deseada de la pureza de enantiómeros del producto.

En la publicación J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, páginas 6992-6996 se abordan los problemas que están relacionados con la utilización de ácido prúsico libre, a través de un transcianurado por medio de hidroxinitrilasa utilizando acetonacianohidrina en una mezcla de reacción bifásico, que consta de una solución tampón acuosa y un disolvente no miscible con agua. El inconveniente en este caso es que el volumen de disolvente orgánico y, por lo tanto, de toda la mezcla de reacción es bastante grande con respecto a la cantidad de aldehído empleada. Además, se necesita un tiempo de reacción extremadamente largo y una cantidad grande de enzima. Por último, tampoco la pureza óptica de la cianohidrina es la mayoría de las veces suficiente para la síntesis enantioespecífica de los productos objetivo.

Como mejora se propone, en el documento EP-A1-0 547 655, un procedimiento en el que se producen cianohidrinas ópticamente activas a partir de aldehídos o cetonas y ácido prúsico en un sistema bifásico, que consta de una solución acuosa homogénea de la hidroxinitrilasa y un disolvente orgánico adecuado, que no es miscible al menos esencialmente con agua, siendo tamponada la solución acuosa con un tampón de acetato en una concentración de 0,005 a 0,1 mol por litro y estando la relación entre fase orgánica y fase acuosa entre 5:1 y 1:5. El sistema de reacción se agita durante la reacción enzimática, manteniendo el sistema bifásico.

A pesar de la reacción en un valor pH de aproximadamente 4,5, sin embargo, no se puede suprimir tampoco completamente la reacción química en este sistema bifásico que consta de la solución de substrato orgánico y la solución de enzima acuosa. En este procedimiento, es un inconveniente que los valores ee de la cianohidrina solamente se han podido mejorar a través del empleo de grandes cantidades de enzima.

En el documento EP 0 927 766 Se describe un procedimiento para la producción de (S)-cianohidrinas. En este caso, se hacen reaccionar aldehídos o cetonas utilizando una (S)-hidroxinitrilliasa en una emulsión para obtener las
(S)-cianohidrinas correspondientes. La (S)-hidroxinitrilliasa y las (R)-hidroxinitrilliasas se diferencian, como se describe en Angew. Chem. 1994, 106, página 1612, de una manera significativa tanto en su estructura como también en sus propiedades catalizadoras.

El objeto de la invención era encontrar un procedimiento mejorado para la producción de cianohidrinas ópticamente activas, que garantiza una pureza de enantiómeros alta con una necesidad de enzima y de tiempo al mismo tiempo bajas.

Se ha encontrado ahora, de una manera inesperada, que la reacción de una pluralidad de compuestos carbonilo, como por ejemplo aldehídos alifáticos, alicíclicos, insaturados, alifáticos substituidos aromáticamente, aromáticos así como heteroaromáticos y cetonas para formar las cianohidrinas correspondientes es posible con alto rendimiento y alta pureza óptica en modo de funcionamiento más concentrado frente al estado de la técnica, con empleo reducido de enzima y en tiempos de reacción más cortos, cuando se realiza la reacción en una emulsión. De manera inesperada, la actividad enzimática se mantiene estable en las condiciones de una emulsión que, en muchas proteínas, conduce a desactivación, como por ejemplo con alta energía de agitación.

Por lo tanto, el objeto de la presente invención es un procedimiento para la producción de los (R)-enantiómeros de cianohidrinas ópticamente activas a través de reacción de un aldehído o de una cetona con un donador de grupos cianuro en presencia de (R)-oxinitrilasa, que se caracteriza porque se agita una mezcla de reacción compuesta por

a)

un aldehído o cetona disueltos en un diluyente orgánico, no miscible o insignificantemente miscible con agua,

b)

una solución acuosa de (R)-oxinitrilasa y

c)

un donador de grupos cianuro

con una energía de agitación sobre 500 W/m^{3}, de manera que se obtiene una emulsión, que se mantiene hasta el final de la reacción enzimática, después de lo cual al término de la reacción enzimática se aísla la (R)-cianohidrina correspondiente a partir de la mezcla de reacción.

Como materiales de partida en el procedimiento según la invención se emplean un aldehído o una cetona, un donador de grupos cianuro, una solución acuosa de una (R)-oxinitrilasa y un diluyente orgánico no miscible o insignificantemente miscible con agua.

Por aldehídos se entienden en este caso aldehídos alifáticos, aromáticos o heteroaromáticos. Por aldehídos alifáticos se entienden en este caso aldehídos saturados o insaturados, alifáticos, lineales, ramificados o cíclicos. Los aldehídos alifáticos preferidos son aldehídos lineales especialmente con 2 a 30 átomos de carbono, con preferencia de 2 a 18 átomos de carbono, que están saturados o una o varias veces insaturados. El aldehído puede presentar en este caso tanto enlaces dobles C-C como también enlaces triples C-C. Los aldehídos alifáticos, aromáticos o heteroaromáticos pueden estar, además, no substituidos o substituidos por grupos inertes en las condiciones de reacción, por ejemplo por grupos arilo o grupos heteroarilo en caso dado substituidos, como grupos fenilo, fenoxi o indolilo, por grupos halógeno, hidroxi, hidroxi-C_{1}-C_{5} alquilo, alcoxi de C_{1}-C_{5}, alquiltio de C_{1}-C_{5}, éteres, alcohol, ésteres del ácido carboxílico, nitro o azido. Ejemplos de aldehídos aromáticos o heteroaromáticos son benzaldehído o diferentes benzaldehídos substituidos, como por ejemplo 3,4-difluorobenzaldehído, 3-fenoxibenzaldehído, 4-fluoro-3-fenoxibenzaldehído, hidroxibenzaldehído, metoxibenzaldehído, además de furfural, metilfurfural, antracen-9-carbaldehído, furan-3-carbaldehído, indol-3-carbaldehído, naftalin-1-carbaldehído, ftaldialdehído, pirazol-3-carbaldehído, pirrol-2-carbaldehído, tiofen-2-carbaldehído, isoftalaldehído piridinaldehídos, tienilaldehídos, etc.

Las cetonas son cetonas alifáticas, aromáticas o heteroaromáticas, en las que el átomo de carbono del carbonilo está substituido de forma irregular. Por cetonas alifáticas se entienden cetonas saturadas insaturadas, lineales, ramificadas o cíclicas. Las cetonas pueden estar saturadas o una o varias veces insaturadas. Pueden estar no substituida, o substituidas por grupos inertes en condiciones de reacción, por ejemplo por grupos arilo o heteroarilo en caso dado substituidos, como grupos fenilo o inolilo, por grupos halógeno, éter, alcohol, éster del ácido carboxílico, nitro o azido.

Ejemplos de cetonas aromáticas o heteroaromáticas son acetofenona, indolilacetona, etc.

Los aldehídos o cetonas, que son adecuados para el procedimiento según la invención, son conocidos o se pueden producir como es habitual.

Como donador de grupos cianuro se añade ácido prúsico. El ácido prúsico se pueden liberar en este caso también poco antes de la reacción a partir de una de sus sales como por ejemplo NaCN o KCN y se puede añadir en substancia o en forma disuelta a la mezcla de reacción.

Como oxinitrilasa se contemplan (R)-oxinitrilasas, por ejemplo de Prunus amygdalus, Prunus laurocerasus o Prunus serotina. Con preferencia se emplea como oxinitrilasa (R)-oxinitrilasa de Prunus amygdalus.

La enzima se caracteriza por una alta estabilidad frente a disolventes. Por lo tanto, existe la posibilidad de emplear diferentes disolventes orgánicos para la reacción enzimática, que permiten la formación de una emulsión, lo que repercute de una manera favorable sobre la productividad del proceso respectivo. La oxinitrilasa se puede emplear purificada o no purificada, como tal o inmovilizada.

Como disolvente orgánico se pueden emplear hidrocarburos alifáticos o aromáticos no miscibles o insignificantemente miscibles con agua, que en caso dado están halogenados, alcoholes, éteres o ésteres o mezclas de ellos. Ejemplos de ellos son dietiléter, diisopropiléter, dibutiléter, metil-terc. butiléter, acetato de etilo, acetato de propilo, tolueno, xileno, ciclohexano, tricloretano, clorobenceno, etc.

Con preferencia se emplean metil-terc.-bituléter (MTBE), diisopropiléter, dibutiléter y acetato de etilo o una mezcla de MTBE y tolueno.

Se emplean por gramo de aldehído o cetona aproximadamente de 0,2 a 20 g de diluyente y de 10 a 2000 IU de actividad de oxinitrilasa, con preferencia de aproximadamente 50 a 100 IU.

Una IU (Unidad Internacional) designa aquella cantidad de un preparado de enzima que cataliza la formación de un micromol de producto por minuto. La cantidad necesaria de la oxinitrilasa respectiva se determina de una manera óptima en un ensayo de actividad, por ejemplo según el ensayo de actividad de la Fa. Sigma, de una manera similar a Jorns y col. J. Biolog. Chem. 254, páginas 12145-12152, 1979.

Se añade por mol de grupo aldehído o de grupo ceto empleado, al menos 1 mol, con preferencia de 1 a 5 moles, de manera especialmente preferida de 1 a 2 moles, de donador de grupos cianuro. En el procedimiento según la invención, el aldehído o la cetona están presentes disueltos en el diluyente orgánico. A esta solución se añade el enzima en forma de una solución tampón acuosa. El vapor pH de esta solución debe ser menor que 7, con preferencia entre 3 y 6,5.

La mezcla de reacción obtenida de esta manera se agita a temperaturas de 0ºC a aproximadamente 30ºC, con preferencia de 5ºC a 25ºC, de tal manera que se obtiene una emulsión. El número de revoluciones (N) del agitador necesario para ello depende en este caso del llamado índice de capacidad del agitador (Po) empleado, de cuyo diámetro (d), del volumen de reacción (V) así como de la densidad (\rho) del medio de reacción. A partir de estos factores se puede derivar la energía de agitación (P/V), es decir, la potencia del agitador por volumen de reacción (volumen de la mezcla de reacción, no del aparato).

P/V=\frac{P_{o}\cdot\rho\cdot N^{3}\cdot d^{5}}{V}

Con preferencia, la energía de agitación en el procedimiento según la invención es mayor que 500 W/m^{3}, de manera especialmente preferida mayor que 1000 W/m^{3}. Comparativamente en los procedimientos conocidos hasta ahora, que trabajan en el sistema acuoso, orgánico o bifásico, por ejemplo según el documento EP-A1-0 547 655, solamente se consiguen energías de agitació9n de aproximadamente 100 W/m^{3}.

Si la mezcla de reacción está presente como emulsión, entonces se añade el donador de grupos cianuro. La emulsión se mantiene hasta el final de la reacción. La curva de la reacción se puede seguir en este caso, por ejemplo, fotométricamente a través de la reducción del contenido de aldehído o de cetona.

Según el educto, se mide en la longitud de onda en la que el educto absorbe y no la cianohidrina resultante. La absorción de la mezcla de reacción se reduce, por lo tanto, proporcionalmente con el incremento de la conversión.

No obstante, también se pueden mezclar juntos en primer lugar todos los componentes y a continuación se puede agitar la mezcla de reacción obtenida de esta manera para que se obtenga una emulsión.

En el caso de utilización de una sal del ácido prúsico, se puede liberar en primer lugar el ácido prúsico de la solución de la sal a través de la adición, por ejemplo, de H_{2}SO_{4} o H_{3}PO_{4}. El vapor pH de esta solución de ácido prúsico debería ser menor que 7, con preferencia entre 4 y 6,5.

A continuación se añaden a la solución de ácido prúsico la solución acuosa de enzima, el diluyente orgánico y el aldehído o la cetona, se inicia la reacción y, en caso dado, se reajusta el valor pH. También aquí hay que procurar de nuevo que la mezcla de reacción sea agitada de tal forma que se obtenga una emulsión, que se mantiene de nuevo hasta el final de la reacción.

Para la elaboración de la mezcla de reacción y para el aislamiento de la cianohidrina formada se emplean técnicas habituales, que rompen en primer lugar la emulsión, como por ejemplo filtración, centrifugación o coalescencia. A continuación se separan las fases que se forman, en caso dado, con la adición de desemulsionantes, y se elabora la fase que contiene producto.

Para la obtención de la cianohidrina correspondiente se aplican en este caso, según el producto final, técnicas conocidas como filtración, destilación, extracción o cristalización. Las cianohidrinas obtenidas de esta manera se pueden estabilizar, en caso dado, a través de la adición de un ácido antes del procesamiento posterior.

Ejemplo 1 2-clorobenzaldehído

Se diluyeron de 0,25 a 1 ml de solución de R-oxinitrilasa (E. C. 4.1.2.10, 877 unidades / ml) con 50 mM tampón de citrato/fosfato (pH 4) en 4 ml y se ajustó el valor pH de la solución de enzima, en caso dado, con algunas gotas de solución de ácido nítrico a pH 4. A esta solución se añadió una solución de 3 ml de t.-butilmetiléter y 0,8 g (5,69 mmol) de 2-clorobenzaldehído y a continuación se añadieron 445 \mul (11,38 mmol) de ácido prúsico. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente con 500 y con 900 rpm. Cuando se agitó con 500 rpm (ensayos comparativos) se obtuvo un sistema bifásico similar al del documento EP-A1-0 547 655, mientras que a través de la agitación con 900 rpm se obtuvo una emulsión.

El rendimiento y la pureza de enantiómeros de la (R)-cianohidrina formada fue analizada por medio de GC. A tal fin se centrifugó una muestra de la solución de reacción y se diluyeron 50 \mul de la fase orgánica con diclorometano. Después de una derivación con cloruro de acetilo, se analizó por cromatografía de gas en una columna de ciclodextrina.

El rendimiento y la pureza de enantiómeros en función de la cantidad de enzima y del número de revoluciones del agitador (sistema bifásico o bien emulsión) se deducen a partir de las Tablas 1 y 2.

TABLA 1 Sistema bifásico (ensayo comparativo)

1

TABLA 2 Emulsión

2

Ejemplo 2 N-butiraldehído

Se diluyó 1 ml de solución de R-oxinitrilasa (E. C. 4.1.2.10, 877 unidades/ml) con 50 mM tampón de citrato / fosfato (pH 4) en 4 ml y se ajustó el valor pH de la solución de enzima, en caso dado, con algunas gotas de solución de ácido prúsico a pH 4. A esta solución se añadió una solución de 3 ml de t-butilmetiléter y 0,8 g (11 mmol) de
n-butiraldehído y a continuación se añadieron 860 \mul (2 mmol) de ácido prúsico. La mezcla de reacción fue agitada por medio de agitador magnético a temperatura ambiente con 900 rpm, con lo que se obtuvo una emulsión.

El rendimiento y la pureza de enantiómeros de la cianohidrina formada se analizó por medio de GC. A tal fin se centrifugó una muestra de la solución de reacción y se diluyeron 50 \mul de la fase orgánica con diclorometano. Después de una derivación con cloruro de acetilo, se analizó por cromatografía de gas en una columna de ciclodextrina. Al cabo de 5 minutos, el aldehído había reaccionado totalmente en la (R)-cianohidrina correspondiente con una pureza de enantiómeros del 98%.

Claims (9)

1. Procedimiento para la producción de los (R)-enantiómeros de cianohidrinas ópticamente activas a través de reacción de un aldehído o de una cetona con un donador de grupos cianuro en presencia de (R)-oxinitrilasa, caracterizado porque se agita una mezcla de reacción compuesta por

a)

un aldehído o cetona disueltos en un diluyente orgánico, no miscible o insignificantemente miscible con agua,

b)

una solución acuosa de (R)-oxinitrilasa y

c)

un donador de grupos cianuro

con una energía de agitación sobre 500 W/m^{3}, de manera que se obtiene una emulsión, que se mantiene hasta el final de la reacción enzimática, después de lo cual al término de la reacción enzimática se aísla la (R)-cianohidrina correspondiente a partir de la mezcla de reacción.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque se hace reaccionar un aldehído alifático, aromático o heteroaromático o una cetona asimétrica.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque se emplea ácido prúsico como donador de grupos cianuro.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque como oxinitrilasa se emplea una (R)-oxinitrilasa de Prunus amygdalus.

5. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque como diluyente se emplean hidrocarburos alifáticos o aromáticos no miscibles o insignificantemente miscibles con agua que, en caso dado, están halogenados, alcoholes, éteres o ésteres o mezclas.

6. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque como diluyente se emplean metil-terc-butiléter, diisopropiléter, dibutiléter, acetato de etilo o una mezcla de metil-terc. butiléter y tolueno.

7. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la temperatura de reacción es de 0ºC a 30ºC.

8. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque al término de la reacción enzimática para el aislamiento de la (R)-cianohidrina correspondiente a partir de la mezcla de reacción, se interrumpe en primer lugar la emulsión a través de filtración, centrifugación o coalescencia y a continuación se separan las fases que se forman, en caso dado con la adición de desemulsionantes, y se prepara la fase que contiene el producto.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque la elaboración de la fase que contiene el producto se realiza, según el producto final, a través de filtración, destilación, extracción o cristalización.