JP2812933B2 - （ｓ）−シアノヒドリンの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、一般式Ｉ：

【０００２】

【化３】

【０００３】［式中、ＲおよびＲ’はそれぞれ互いに無
関係に次の意味を表わし： − 水素； − 置換基として１個またはそれ以上のアミン基、イミ
ン基、ヒドロキシ基、Ｃ_１〜Ｃ_８−アルコキシ基、ハロ
ゲン基、カルボキシル基、Ｃ_３−Ｃ_２０−シクロアルキ
ル基および／または場合によってはＮ、Ｏ、Ｓ−ヘテロ
原子置換されている、Ｃ原子２２個までを有する芳香環
を有していてよく、この場合、環状置換基自体が１回ま
たは数回ハロゲン、ヒドロキシおよび／または線状また
は分枝鎖状Ｃ_１〜Ｃ_８−アルキルまたはＣ_２〜Ｃ_８−ア
ルケニルまたはＣ_２〜Ｃ_８−アルキニルで置換されてい
てよい、置換または非置換で、線状または分枝鎖状の、
Ｃ原子１〜１８個を有する飽和アルキル基； − 置換基として１個またはそれ以上のアミン基、イミ
ン基、ヒドロキシ基、Ｃ_１〜Ｃ_８−アルコキシ基、ハロ
ゲン基、カルボキシル基、Ｃ_３〜Ｃ_２０−シクロアルキ
ル基および／または、場合によってはＮ、Ｏ、Ｓ−ヘテ
ロ原子置換されている、Ｃ原子２２個までを有する芳香
環を有していてよく、この場合、環状置換基自体が１回
または数回ハロゲン、ヒドロキシおよび／または線状ま
たは分枝鎖状Ｃ_１〜Ｃ_８−アルキルまたはＣ_２〜Ｃ_８−
アルケニルまたはＣ_２〜Ｃ_８−アルキニルで置換されて
いてよい、置換または非置換で、線状または分枝鎖状
の、Ｃ原子２〜１８個を有する不飽和のモノまたはポリ
アルケニル基またはアルキニル基； − 環状炭素原子４個までが、Ｎ、Ｏおよび／またはＳ
によって置換されていてよく、かつこの場合、基が置換
基として１個またはそれ以上のアミン基、イミン基、ヒ
ドロキシ基、Ｃ_１〜Ｃ_８−アルコキシ基、アリールオキ
シ基、ハロゲン基、カルボキシ基および／または、線状
または分枝鎖状で、Ｃ原子２２個までを有する飽和また
は不飽和のモノまたはポリアルキル基を有していてよ
く、かつこの場合、環の少なくとも２個の置換基が１つ
の環式化合物に結合されていてよいような、置換または
非置換で、環状原子５個〜２２個を有する芳香族または
ヘテロ芳香族基；但し、Ｒ’およびＲは同時に水素を表
わすことはないことを条件とする］で示される（Ｓ）−
シアノヒドリンを、一般式ＩＩ：

【０００４】

【化４】

【０００５】［式中、ＲおよびＲ’は式（Ｉ）の場合に
記載された意味を表わす］で示されるカルボニル化合物
と、青酸、または反応のためＣＮ⁻を生じる物質とを、
反応を触媒する量の固定化された（Ｓ）−オキシニトリ
ラーゼの存在下に、酵素触媒反応させることによって製
造する方法に関する。

【０００６】

【従来の技術】光学活性化合物の多数の重要な物質群、
例えばα−アミノアルコール、α−ヒドロキシアルデヒ
ドおよびα−ヒドロキシカルボン酸はキラルのシアノヒ
ドリンから出発しており、十分に入手可能である。光学
活性（Ｓ）−シアノヒドリンを製造する方法は、文献中
に記載されている。

【０００７】光学活性シアノヒドリンを合成する化学的
方法の範囲内で、キラル触媒の存在下でのトリメチルシ
リルシアニドをエナンチオ選択的に付加することは重要
な役割を演じている。

【０００８】H.Minamikawa、S.Hayakawa、T.Yamada、N.
Iwasawa、K.Narasaka、Bull.Chem.Soc.Jpn.61 (1988),
4379およびK.Narasaka、T.Yamada、H.Minamikawa, Che
m.Lett.1987, 2073によれば、（Ｒ）−シアノヒドリン
は若干の脂肪族アルデヒドおよび芳香族アルデヒドから
出発し、良好な化学的および光学的収率（ｅ.ｅ.６１〜
９３％）で生じる。著者らは、触媒の相応する他のエナ
ンチオマーを使用する場合に（Ｓ）−シアノヒドリンが
形成されることを詳述している。

【０００９】さらにキラル触媒としては、M.Hyashi、T.
Matsuda、N.Oguni、J.Chem.Soc.Commun.1990、1364によ
ればチタンテトライソプロパノラートがＬ（＋）−ジイ
ソプロピルタルトレートまたはキラルのシッフ塩基と一
緒に使用された（M.Hayashi、Y.Miyamoto、T.Inoue、N.
Oguni. J.Org.Chem.58 (1993),1515)。使用される触媒
に応じて、芳香族ならびに脂肪族（Ｓ）−シアノヒドリ
ンもしくは（Ｒ）−シアノヒドリンが多くの場合にｅ.
ｅ.２２〜９６％の専ら不十分なエナチオマー過剰で生
じた。E.J.Corey, Z.Wang, Tetrahedron Lett. 34 (193
3), 4001によれば、キラル触媒としてのビスオキサゾリ
ン−マグネシウム錯体を用いて、複数の脂肪族（Ｓ）−
シアノヒドリンがシアノシリル化されることによって著
しく良好な化学的および光学的収率（ヘプタナールにつ
いてはｅｅ値９５％まで）で得ることができた。良好な
エナンチオマー過剰は、２（Ｒ），４（Ｒ）−ペンタン
ジオールを用いてアセタール化されたアルデヒドを、ジ
アステレオ選択的にシアノシリル化する場合にも取得さ
れることができる。この場合、J.D.Elliot、V.Choi、W.
P.Johnson、J.Org.Chem. 48 (1983), 2294によれば、
（Ｒ）−マンデロニトリルに関しては、９７％の収率の
場合に９３％のｅｅ値が達成された。相応する２
（Ｓ），４（Ｓ）−ペンタンジオールが使用される場
合、同様の方法で（Ｓ）−シアノヒドリンが生じる。

【００１０】また、保護された光学活性α−アミノアル
デヒド(M.T.Reetz、M.W.Drewes、K.Harms、W.Reif、Tet
rahedron Lett.29 (1988), 3295; J.Herranz, J.Castr
o-Pichel, T.Gracia-Lopez, Synthesis 1989, 703）も
しくはα−ヒドロキシアルデヒド（M.T.Reets, K.Kesse
ler, A.Jung, Angew. chem. 97 (1985), 989）も、ルイ
ス酸触媒下にトリメチルシリルシアニドまたはトリブチ
ル錫シアニドを用いて中程度から良好に至るまでのジア
ステレオ選択性の下に、相応するβ−アミノ−α−ヒド
ロキシニトリルもしくはα，β−ジヒドロキシニトリル
へと変換されることができる。

【００１１】F.Effenberger, U.Stelzer, Angew. Chem.
103 (1991), 866および F.Effenberger, U.Stelzer, B
er. 126 (1993), 779 からは、（Ｒ）−シアノヒドリン
から出発して（Ｓ）−シアノヒドリンを合成する他の方
法が公知である。

【００１２】この場合、（Ｒ）−シアノヒドリンはスル
ホン化され、かつその後Ｓ_Ｎ２−条件下に酢酸カリウム
と反応させられる。アセチル基は、水性酸中で除去され
る。脂肪族シアノヒドリンの場合、全工程は完全にラセ
ミ化なしで進行し、芳香族シアノヒドリンの場合だけ部
分的にラセミ化が現れる。この方法は特に、（Ｓ）−オ
キシニトリラーゼの制限された基質スペクトルのため、
従来直接には得られなかったような化合物に、使用され
ることができる。

【００１３】同様に、（Ｒ）−シアノヒドリンの位置転
換の下にミツノブー反応(Mitsunobu-Reaktion) が進行
する（E.Warmerdam, J.Brussee, C.G.Kruse, A.Van der
Gen,Tetrahedron 49 (1993), 1063）。

【００１４】しかしいずれにせよ、全体で見られるの
は、化学的方法を酵素触媒による方法で代替することに
追求の努力を払う値打ちがあることである。

【００１５】著しく異なった構造の（Ｒ）−シアノヒド
リンは、苦ヘントウからのヒドロキシニトリル−リアー
ゼ（PaHNL)[EC 4.1.2.10]を用いてアルデヒドに青酸を
触媒により付加することによって、著しく良好な光学的
収率で得られた（F.Effenberger, Angew. Chem. 1994,
106, 1609〜1619)。この酵素は工業的な量でも簡単に得
られので、この方法は（Ｒ）−シアノヒドリンへの最も
簡単に近づく道を提供している。

【００１６】しかし、酵素触媒による（Ｓ）−シアノヒ
ドリンの製造との関連性は、このことと本質的に異なっ
ている。この場合、これまで最も大きな成果をあげたの
は、触媒としてのモロコシバイカラー(Sorghum bicolo
r)からのヒドロキシニトリル−リアーゼ（SbHNL)[EC 4.
1.2.11]の使用であることが証明された（F.Effenberge
r, B.Hoersch, S.Foerster, T.Ziegler, Tetrahedron L
ett. 1990, 31, 1249〜 1252; U.Niedermeyer, M.-R.Ku
la, Agew. Chem. 1990, 102, 423 〜 425; Agew. Chem.
Int. Ed. Engl. 1990, 29, 386 〜 387; M.-R.Kula,
U.Niedermeyer,I.M.Stuertz, 欧州特許第 350908号明細
書 1990; ドイツ連邦共和国特許出願公告第3823866号明
細書（Chem. Abstr. 1990, 113, 57462h））、その間に
キビの胚から、合成の使用にも十分な量でも得ることが
できるようになっている酵素である。困難な取得性にと
もなって、PaHNLと異なって、芳香族アルデヒドおよび
ヘテロ芳香族アルデヒドだけを基質として受容するSbHN
Lの明らかに制限的な基質スペクトルは、この酵素の使
用にとって著しい欠点である。

【００１７】

【発明が解決しようとする課題】したがって、ここに挙
げられ、かつ論究された公知技術水準に関連して、本発
明の課題は、首記されたような方法を、高収量で、およ
び特に高度のエナンチオマー単位での（Ｓ）−シアノヒ
ドリンの取得を可能にするように、引き続き形成するこ
とである。さらに本発明の課題は、所望の目的化合物に
対する出発化合物のできるだけ幅広い基質スペクトルを
変換させることができる酵素的方法を提供することであ
った。

【００１８】さらに本発明のもう１つの課題は、できる
だけ簡単に十分な量および高活性で提供される酵素を使
用することに見られるべきである。

【００１９】

【課題を解決するための手段】前記課題、ならびに他の
詳細には記載されていない課題は、首記されたような方
法の場合、請求項１の特徴部によって解決される。有利
な変法は、請求項１に再度関連した従属請求項中で保護
請求される。

【００２０】本発明の範囲内で（Ｓ）−オキシニトリラ
ーゼの固定化のために担体として使用されるニトロセル
ロースは、商業的に得られる製品である。この場合、ニ
トロセルロースはセルロースの硝酸エステルであり、こ
の硝酸エステルはニトロ基を不含であるので、当業界か
ら一般に使用される呼称“ニトロセルロース”は間違い
であることが、この箇所で明確に指摘されるべきであ
る。

【００２１】本発明に適当であるようなセルロースの硝
酸エステルは、様々なエステル化度を有し、このエステ
ル化度はセルロースの窒素含量によって測定されること
ができる。本発明により使用可能なセルロースエステル
には、殊にモノニトレート、ニトレートまたはトリニト
レートならびに前記の物質の中間段階および混合物が属
する。特に適当なニトロセルロースは、例えば生化学に
おいて吸取材料として記載されているようなものである
（ H.Holtzhauer in Biochemishe Labormethoden, Arbe
itsvorschriften und Tabellen, Heidelberger Taschen
buecher, シュプリンガー社（Springer Verlag）,ベル
リン）。

【００２２】ニトロセルロースを用いて固定化された
（Ｓ）−オキシニトリラーゼによる、一般式ＩＩのカル
ボニル化合物から一般式Ｉの（Ｓ）−シアノヒドリンへ
の触媒反応は、有利に有機溶剤中で実施される。有機溶
剤の選択は本質的に重要ではなく、特に有利には、エダ
クトを溶解し、かつ生成物の簡単な単離を可能にするよ
うな溶剤である。相応する有機溶剤は、当業者に周知で
あり、特に有利には有機溶剤としてジイソプロピルエー
テルが使用されるが、しかしまた全ての他の通常使用さ
れるエーテル、例えばジエチルエーテル、テトラヒドロ
フラン、等、あるいは溶剤、例えば酢酸エステルも使用
される。

【００２３】基本的に、溶剤を高純度で使用することは
有利である。完全な無水状態は不必要であり、逆に、有
機溶剤が水の痕跡を含有する場合が特に有利である。こ
の場合、無水溶剤を使用すること、および水の僅かな残
量を固定化された酵素と一緒に反応に導入することは、
特に有利であることが判明した。

【００２４】特に好都合な変法の場合、本発明による反
応は、緩衝剤中で膨潤されたニトロセルロースに（Ｓ）
−オキシニトリラーゼを負荷することによって得られる
ような、固定化された酵素が使用されるようにして行わ
れる。

【００２５】この変法の他の態様の場合、本発明の方法
は、酸水溶液中で予め膨潤されたニトロセルロースに
（Ｓ）−オキシニトリラーゼを添加し、引続き（Ｓ）−
オキシニトリラーゼを負荷されたニトロセルロースを濾
別し、かつ負荷されたニトロセルロースから過剰の水を
遠心分離することによって得られる、ニトロセルロース
を用いて固定化された（Ｓ）−オキシニトリラーゼが使
用されることを示す。この場合、“予め膨潤されたニト
ロセルロース”とは、例えばクエン酸緩衝剤中でｐＨ
３．３で所定の時間膨潤し、次に緩衝剤からデカントさ
れ、引続き過剰の液体成分から遠心分離される担体材料
である。予め膨潤された材料はさらに真空中で乾燥され
る。

【００２６】酵素を担体材料に負荷するため、この負荷
が約３〜６の範囲内のｐＨ値で行われる場合に特に有利
であることが判明した。特に有利には３．３〜５．５の
範囲である。

【００２７】本発明によれば、様々な由来の（Ｓ）−オ
キシニトリラーゼが効果的に使用されることができる。

【００２８】特に有利な変法の場合（Ｓ）−オキシニト
リラーゼは、１０５〜１２０ｋＤａの天然分子量を有す
るホモマルチマー（Homomultimer）である。さらに有利
な（Ｓ）−オキシニトリラーゼは、（Ｓ）−オキシニト
リラーゼが、大きなサブユニット３０ｋＤａからなるホ
モマルチマーとして結合していることによって、特徴づ
けられている。

【００２９】このような酵素の有利な源はカサバ（Mani
ok）である。カサバからの酵素［E.C.4.1.2.37]の最適
ｐＨは、ほぼ５．５の範囲内である。この最適ｐＨは細
胞内に存在する５．３のｐＨ値にほとんど正確に相応す
る。カサバからの酵素の最適温度に関する試験で、活性
が４０℃まで絶えず上昇し、かつ４０〜５０℃でほとん
ど一定になることが判明する。

【００３０】さらに本発明により使用可能な（Ｓ）−オ
キシニトリラーゼの源は、ヘベア・ブラジリエンシス
（Hevea brasiliensis）（ゴムの木）を表わす。またこ
の（Ｓ）−オキシニトリラーゼも著しく広い基質スペク
トルを有し、かつ多数の脂肪族カルボニル化合物および
芳香族カルボニル化合物を反応させる。

【００３１】最後にマニホット・エスクレンタ（Maniho
t esculenta）およびヘベア・ブラジリエンシスからの
酵素とともに、これらに血清学的に関連したそれぞれの
（Ｓ）−オキシニトリラーゼも使用されることができ
る。マニホット・エスクレンタから単離された（Ｓ）−
オキシニトリラーゼの記述は、例えば “Plant Science
108 (1995) 1 〜 11”中に見出される。ヘベア・ブラジ
リエンシスから単離された（Ｓ）−オキシニトリラーゼ
の記述は、例えば Plant Science 115 (1996)25 〜31中
に挙げられている。

【００３２】既に挙げられた源とともに、本発明の範囲
内で使用可能な（Ｓ）−オキシニトリラーゼは、組換え
（Ｓ）−オキシニトリラーゼが、例えばマニホット・エ
スクレンタから使用されることによって、簡単に取得さ
れる。マニホット・エスクレンタから（Ｓ）−オキシニ
トリラーゼを遺伝子技術的に取得することによって、酵
素を解明することができ、この酵素は一方では（Ｓ）−
シアノヒドリンを取得するための幅広い基質スペクトル
を有し、かつ他方では発現クローニングに基づき簡単に
かつ十分な量で取得されることができるようにされてよ
い。

【００３３】殊にまた再結合した酵素も、多数のアルデ
ヒドおよびケトンへの青酸のエナンチオ選択的付加を触
媒する。この場合、青酸は直接の形で、または反応の条
件下に青酸を遊離する前工程の形で、使用されてよい。
ケトンへのＨＣＮの、酵素によって触媒したエナンチオ
選択的付加は、従来苦ヘントウからのヒドロキシニトリ
ル−リアーゼ（ＰａＨＮＬ）について、およびアマ（Li
num usitatissimum）からのヒドロキシニトリル−リア
ーゼについて、これらが２つとも（Ｒ）−ケトシアノヒ
ドリンの形成を触媒することが確認されることができ
た。（Ｓ）−ケトシアノヒドリンと（Ｓ）−ヒドロキシ
ニトリル−リアーゼとの合成は、まだ記述されていなか
った。（Ｓ）−ケトシアノヒドリンは初期の時代に、ラ
セミ体のケトシアノヒドリンから（Ｒ）−ヒドロキシニ
トリル−リアーゼ ＰａＨＮＬを用いてトランスシアノ
化することによって製造されることができた。注目すべ
きことは、アルキルメチルケトンと、大きさの増大する
アルキル基とが反応する場合、光学的収率が増大するこ
とである。アルキル置換基のβ位での分枝がエナンチオ
選択性に影響を及ぼさない一方、カルボニル基との隣接
位での立体障害が強い場合、光学的収率は著しく減少す
る。したがって、マニホット・エスクレンタからのヒド
ロキシニトリル−リアーゼは、全く幅広い基質スペクト
ルを有し、この場合、芳香族ケトン、例えばアセトフェ
ノンは基質として問題なく受容される。

【００３４】以下に本発明を実施例につき詳説する。

【００３５】

【実施例】

Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＭｅＨＮＬの超発現 ＭｅＨＮＬ遺伝子のコード化領域を、オリゴ（ｄＴ）プ
ライマーｃＤＮＡからＰＣＲを用いて増幅させ（“セン
ス”−プライマー：ＧＣＡ ＧＧＧ ＣＣＧＧＡＴ Ｃ
ＣＣ ＡＴＴ ＴＣＣ ＡＡＡ ＡＴＧ ＧＴＡ ＡＣ
Ｔ ＧＣＡＣＡ；“アンチセンス”−プライマー：ＧＣ
Ａ ＧＧＧ ＣＣＧ ＧＡＴ ＣＣＡ ＣＡＣ ＡＡＣ
ＧＴＧ ＧＡＡ ＣＴＣ ＴＣＣ ＣＡＴ ＡＴＴ；
下線部分はMeHNLのcDNA配列の位置16〜39もしくは933〜
910に相応する）、かつ補正読み取りスクリーンの場合
にｐＱＥ４−発現ベクター（クイアゲン(Quiagen)）中
でクローン化した。このようにして得られた発現プラス
ミド（Expressionsplasmid）ｐＱＥ４−ＭｅＨＮＬｗｔ
をＥ．ｃｏｌｉ−Ｍ１５［ｐＲＥＰ４］−細胞内でＭｅ
ＨＮＬ−発現に移入させた（Ｍ１５−ＭｅＨＮＬ）。

【００３６】８リットル培養液をＭ１５−ＭｅＨＮＬの
約１２時間古い培養液２ｍｌと一緒に、アンピシリン
（Ampicillin）（１００ ｇ ｍｌ^−１）およびカナマ
イシン（Kanamycin）（２５ ｇ ｍｌ^−１）を有する
ＬＢ−媒体中に注入した。この培養液を３７℃で１２時
間培養した後、発酵槽（Fermenter）（生体工学）１０
０ ｌを注入するために使用した。Ｍ１５−ＭｅＨＮＬ
細胞を３０℃で１時間、および発現の導入後イソプロピ
ル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）（最終濃度
１ｍＭ）を用いてさらに３．５時間培養した。次に細胞
を、０．３ ｇ−膜（０．４６ｍ^２）（フィルトロン(F
iltron)）を用いて“クロス−フロー(Cross-flow)”−
濃縮（マキシセット・システム(Maxisette System)）す
ることによって、約７．５ ｌに蒸発濃縮した。残留す
るＬＢ媒体を分離するため細胞を１００００ ｘ ｇ
で１０分間遠心分離させた。得られた細胞タブレットを
酢酸ナトリウム−緩衝剤（５０ｍＭ、ｐＨ５．４）２
ｌ中で再懸濁させ、かつ細胞を高圧均質化（５００バー
ル、３作業周期、Rannie-APV MiniLab）することによっ
て分解させた。染色体のＤＮＡを分離するため、粗製溶
解物（ＨＮＬ ４００００の全体量、比放射能２．８Ｕ
ｍｇ^−１）を、ベンゾナーゼ(Benzonase)（Ｍｅｒｃ
ｋ）（最終濃度 ５０００ Ｕ ｌ^−１）を用いて室温
で１時間消化した。１３００００ ｘ ｇ で１時間遠
心分離した後、ＭｅＨＮＬをアニオン交換クロマトグラ
フィーによって１２Ｕ ｍｇ^−１の比放射能に増量し
た。これに対して、Ｑ−セファローゼ(Sepharose)ＦＦ
１００／１２００カラムを、酢酸ナトリウム、ｐＨ
５．７、（緩衝剤Ａ）２０ｍＭを用いて平衡させ、かつ
５０ｍｌ ｍｉｎ^−１の流動率を有する緩衝剤Ａ中にＮ
ａＣｌ ０〜１Ｍの線状勾配７２００ｍｌで、結合され
た蛋白質を溶出した。MeHNLを塩勾配450 ｍｌにより溶
出させる。

【００３７】試薬 ａ）酢酸ナトリウム−緩衝剤 ２０ｍＭ：胚不含の水５
００ｍｌ中酢酸０．５７ ｍｌを、濃苛性ソーダ液を用
いて所望のｐＨに調節した。

【００３８】酢酸ナトリウム−緩衝剤 ｐＨ５．４
０．１Ｍ：胚不含の水４９７ｍｌ中酢酸２．８６ ｍｌ
（５０ミリモル）を、濃苛性ソーダ液を用いてｐＨ５．
４に調節した。

【００３９】ｐＨ３．３を有するクエン酸ナトリウム−
緩衝剤 ２０ｍＭ：胚不含の水５００ｍｌ中クエン酸一
水和物２．１ｇ（１０ミリモル）を溶解し、かつ濃苛性
カリ液を用いてｐＨ３．３に調節した。

【００４０】クエン酸０．１Ｍ中に１０％のアセトシア
ノヒドリン溶液：新たに蒸留したアセトシアノヒドリン
１ｍｌを、クエン酸溶液９ｍｌに添加する（胚不含の水
１０ｍｌ中にクエン酸一水和物０．２１ｇ） ｂ）溶剤： ジイソプロピルエーテル、ジエチルエーテル：ナトリウ
ム線材上で蒸留 塩化メチレン：カルシウムヒドリド上で蒸留： ピリジン：水酸化カリウム上で蒸留 アセト無水物：蒸留 ｃ）エダクト：出発化合物を前記の会社から入手し、も
しくは著者集団、Organikum, VEB Verlag der Wissens
chaften, ベルリン在、第１６版 （1986)により製造し
た： アルトリッヒ・ケミー(Aldrich Chemie）、シュタイン
ハイム在 フルカ・ケミカ（Fluka Chemika）、ブックス(Buchs）
在（ＣＨ） ジャンセン・キミカ（Janssen Chimica）、ベルギー国 メルック・ズッハルト（Merck-Suchhardt)、ホーエンブ
ルン在 アルデヒドおよびケトンをそのつど新たに蒸留し使用し
た。

【００４１】ラセミ体のシアノヒドリン３、５：著者集
団、Organikum, VEB Verlag der Wissenschaften, ベル
リン在、第１６版 （1986)による 無水青酸（２）：硫酸中に濃シアン化ナトリウム溶液を
滴下することによって；生成される青酸を−１２℃で縮
合し、かつドライアイス中で貯蔵する。

【００４２】（Ｓ）−／（Ｒ）−ＭＴＰＡ−Ｃｌ：J.A.
Dale, D.L.Dull, H.S.Mosher, J.Org.chem. 34 (1969),
2543 スペクトロクワント(Spectroquant)（登録商標） １４
８００ ＣＮ⁻：メルク(Merck)、ダルムシュタット在 ｄ）基質材料 アビセル−セルロース(Avicel-Cellulose)：メルク、ダ
ルムシュタット在 Ｐ１００ＰＳＣ−セルロース：デグッサ(Degussa)、フ
ランクフルト在 ニトロセルロース：吸取り膜；シュライヒャー＆シュー
ル(Schleicher & Schuell）、ダッセル在 ｅ）（Ｓ）−オキシニトリラーゼ［E.C.4.1.2.37]の単
離 （Ｓ）−オキシニトリラーゼの単離は、一方ではコロン
ビア（Kolumbien）産の凍結乾燥したカサバの葉から行
われ、他方ではE.Coliからの組換え蛋白質からイオン交
換クロマトグラフィー処理により行われる。

【００４３】酵素触媒による（Ｓ）−シアノヒドリンの
製造 担体（ニトロセルロース）５０ｍｇをクエン酸ナトリウ
ム−緩衝剤（ｐＨ３．３）３０ｍｌ ０．０２Ｍ中で３
０分膨潤させる。デカントし、遠心分離し（３０分、５
７００ ｘ ｇ）かつ高度の真空中で５時間乾燥させた
後、濃厚ＭｅＨＮＬ溶液（９００ Ｕ ｍｌ^−１）を表
中に記載した量で滴加し、かつ１５分後に遠心分離する
（−５℃、３０分 ３６５０ ｘ ｇ）。酵素負荷した
担体をフラスコ内に供給し、ジイソプロピルエーテル５
ｍｌ、一般式１または３の化合物０．３〜０．４ミリモ
ルおよびＨＣＮ １００ μｌ（２．６ミリモル）を添
加し、かつ室温で、表中に記載された時間攪拌する。担
体を吸引し、ジエチルエーテルで洗浄し、合わせた濾液
を乾燥し、かつ溶剤を留去し、および未反応のエダクト
（１ａ−ｇ、３ａ−ｆ）を留去する。アルデヒドシアノ
ヒドリン（Ｓ）−２ａ−ｊ（第１表）およびケトンシア
ノヒドリン（Ｓ）−４ａ−ｆ（第２表）は、純粋な形で
生じる。化合物（Ｓ）−２ｋ−ｏおよび（Ｓ）−４ｇの
場合、酢酸もしくはトリメチルシリルエーテルとしての
誘導体化を経て純粋に製出が行われ、この場合、ＮＭＲ
−分光分析法により測定した収率（第１、２表）が証明
される。

【００４４】第１表および反応式１：溶剤としてのジイ
ソプロピルエーテル中のアルデヒド１へのＨＣＮのＭｅ
ＨＮＬ−触媒反応の付加による（Ｓ）−シアノヒドリン
（Ｓ）−２

【００４５】

【表１】

【００４６】

【表２】

【００４７】第２表および反応式２：ジイソプロピルエ
ーテル中でメチルケトン３にＨＣＮをＭｅＨＮＬ触媒反
応で付加することによる（Ｓ）−ケトンシアノヒドリン
（Ｓ）−４

【００４８】

【表３】

【００４９】

【表４】

【００５０】［ａ］無水酢酸を用いてアセチル化し、カ
ルボン酸へと鹸化し、引続きメチルエステルへとエステ
ル化するか、またはジアステレオマーの（Ｓ）−ＭＴＰ
Ａ−エステルによりガスクロマトグラフィー処理により
β−シクロデキストリン相上で測定する［１．９］。

【００５１】［ｂ］収率を^１Ｈ−ＮＭＲ−分光分析法に
より測定する。

【００５２】担体の変形 従来使用されたセルロースＰ１００ＰＳＣと比較した利
点を明らかにするため、担体をイソブチルアルデヒド
（１ｅ）の反応の例につき比較させる。

【００５３】第３表：担体材料変形下での、イソブチル
アルデヒド（１ｃ）と（Ｓ）−オキシニトリラーゼおよ
び青酸（２）の（Ｓ）−シアノヒドリン２ｃへの変換お
よび関連する空試験

【００５４】

【表５】

【００５５】セルロースＰ１００ＰＳＣを用いた２つの
バッチを考慮する場合、遠心分離で酵素７５％が遠心分
離物となることが判明する。したがって、エナンチオマ
ー過剰は過度に少ない含水量にもかかわらず、わずかば
かり上昇するだけである。これに反して、（Ｓ）−オキ
シニトリラーゼは遠心分離の際にニトロセルロースに対
してほとんど定量的に存在する。この場合、蛋白質に対
する高い親和力のため、即ち専ら水を遠心分離する。含
水量の少ないことは、光学的収率の明白な増大にとって
決定的である。

【００５６】化学的および光学的収率に関する最良の結
果を、ｐＨ３．３のクエン酸ナトリウム緩衝剤中で膨潤
され、引続き遠心分離されるニトロセルロースを用いて
達成することができる。この場合、少ない水量および低
いｐＨ値の２つの利点が組み合わせられた。このこと
は、シアノヒドリン２ｃに対する極めて高いエナンチオ
マー過剰、ならびに空試験の比較的僅かな収率に、示さ
れている。

【００５７】第４表：濃縮酵素溶液（Ｕ／ｍｌ）を使用
する場合の担体の比較

【００５８】

【表６】

【００５９】

【発明の効果】固定化された（Ｓ）−オキシニトリラー
ゼのための担体としてニトロセルロースが使用されるこ
とによって、従来のセルロース担体材料と比較して、そ
れ以上は予見し得ないくらい、（Ｓ）−シアノヒドリン
ならびにエナンチオマー過剰の収率の明白な上昇が達成
できた。

フロントページの続き (72)発明者 ユルゲン ロース ドイツ連邦共和国 シュツットガルト フォルストシュトラーセ 148 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims (10)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一般式Ｉ： 【化１】 ［式中、ＲおよびＲ’はそれぞれ互いに無関係に次の意
   味を表わし： − 水素； − 置換基として１個またはそれ以上のアミン基、イミ
   ン基、ヒドロキシ基、Ｃ_１〜Ｃ_８−アルコキシ基、ハロ
   ゲン基、カルボキシル基、Ｃ_３〜Ｃ_２０−シクロアルキ
   ル基および／または場合によってはＮ、Ｏ、Ｓ−ヘテロ
   原子置換されている、Ｃ原子２２個までを有する芳香環
   を有していてよく、この場合、環状置換基自体が１回ま
   たは数回ハロゲン、ヒドロキシおよび／または線状また
   は分枝鎖状Ｃ_１〜Ｃ_８−アルキルまたはＣ_２〜Ｃ_８−ア
   ルケニルまたはＣ_２〜Ｃ_８−アルキニルで置換されてい
   てよい、置換または非置換で、線状または分枝鎖状の、
   Ｃ原子１〜１８個を有する飽和アルキル基； − 置換基として１個またはそれ以上のアミン基、イミ
   ン基、ヒドロキシ基、Ｃ_１〜Ｃ_８−アルコキシ基、ハロ
   ゲン基、カルボキシル基、Ｃ_３〜Ｃ_２０−シクロアルキ
   ル基および／または、場合によってはＮ、Ｏ、Ｓ−ヘテ
   ロ原子置換されている、Ｃ原子２２個までを有する芳香
   環を有していてよく、この場合、環状置換基自体が１回
   または数回ハロゲン、ヒドロキシおよび／または線状ま
   たは分枝鎖状Ｃ_１〜Ｃ_８−アルキルまたはＣ_２〜Ｃ_８−
   アルケニルまたはＣ_２〜Ｃ_８−アルキニルで置換されて
   いてよい、置換または非置換で、線状または分枝鎖状
   の、Ｃ原子２〜１８個を有する不飽和のモノまたはポリ
   アルケニル基またはアルキニル基； − 環状炭素原子４個までが、Ｎ、Ｏおよび／またはＳ
   によって置換されていてよく、かつこの場合、基が置換
   基として１個またはそれ以上のアミン基、イミン基、ヒ
   ドロキシ基、Ｃ_１〜Ｃ_８−アルコキシ基、アリールオキ
   シ基、ハロゲン基、カルボキシル基および／または、線
   状または分枝鎖状で、Ｃ原子２２個までを有する飽和ま
   たは不飽和のモノまたはポリアルキル基を有していてよ
   く、かつこの場合、環の少なくとも２個の置換基が１つ
   の環式化合物に結合されていてよいような、置換または
   非置換で、環状原子５個〜２２個を有する芳香族または
   ヘテロ芳香族基；但し、Ｒ’およびＲは同時に水素を表
   わすことはないことを条件とする］で示される（Ｓ）−
   シアノヒドリンを、一般式ＩＩ： 【化２】 ［式中、ＲおよびＲ’は式（Ｉ）の場合に記載された意
   味を表わす］で示されるカルボニル化合物と、青酸、ま
   たは反応のためＣＮ⁻を生じる物質とを反応を触媒する
   量の固定化された（Ｓ）−オキシニトリラーゼの存在下
   に酵素触媒反応させることによって、製造する方法にお
   いて、固定化された（Ｓ）−オキシニトリラーゼのため
   の基質としてニトロセルロースを使用することを特徴と
   する、（Ｓ）−シアノヒドリンの製造法。
2. 【請求項２】 酵素触媒反応を有機溶剤中で実施する、
   請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 有機溶剤としてジイソプロピルエーテル
   を使用する、請求項２記載の方法。
4. 【請求項４】 有機溶剤が水の痕跡を含有する、請求項
   ２または３記載の方法。
5. 【請求項５】 酸緩衝剤中で膨潤したニトロセルロース
   に（Ｓ）−オキシニトリラーゼを負荷することによって
   得られる、固定化された酵素を用いて酵素触媒反応を実
   施する、請求項１から４までのいずれか１項記載の方
   法。
6. 【請求項６】 酸水溶液中で予め膨潤したニトロセルロ
   ースに（Ｓ）−オキシニトリラーゼを添加し、（Ｓ）−
   オキシニトリラーゼで負荷されたニトロセルロースを濾
   別し、かつ負荷されたニトロセルロースから過剰の水を
   遠心分離することによって得られる、ニトロセルロース
   を用いて固定化された（Ｓ）−オキシニトリラーゼを使
   用する、請求項５記載の方法。
7. 【請求項７】 担体への酵素の負荷を約３〜６の範囲内
   のｐＨ値の場合に行う、請求項５または６記載の方法。
8. 【請求項８】 使用される（Ｓ）−オキシニトリラーゼ
   が、大きなサブユニット３０ｋＤａからなるホモマルチ
   マーとして結合している、請求項１から７までのいずれ
   か１項記載の方法。
9. 【請求項９】 マニホット・エスクレンタ、ヘベア・ブ
   ラジリエンシスから自体公知の方法によって単離できる
   （Ｓ）−オキシニトリラーゼ、またはこの物質と血清学
   的に関連した（Ｓ）−オキシニトリラーゼを使用する、
   請求項１から８までのいずれか１項記載の方法。
10. 【請求項１０】 マニホット・エスクレンタからの組換
    え（Ｓ）−オキシニトリラーゼを使用する、請求項１か
    ら８までのいずれか１項記載の方法。