ES2264182T3

ES2264182T3 - Proceso enzimatico para la preparacion de (s)-cian-hidrinas.

Info

Publication number: ES2264182T3
Application number: ES98124003T
Authority: ES
Inventors: Peter Pochlauer; Michael Schmidt; Irma Wirth; Rudolf Neuhofer; Antonia A. Zabelinskaja-Mackova; Herfried Griengl; Cor Van Den Broek; Raf W.E.G. Reintjens; Herman Jelle Wories
Original assignee: DSM Fine Chemicals Austria Nfg GmbH and Co KG
Current assignee: Patheon Austria GmbH and Co KG
Priority date: 1997-12-29
Filing date: 1998-12-17
Publication date: 2006-12-16
Anticipated expiration: 2018-12-17
Also published as: DE59813598D1; AT406961B; EP0927766B1; JP4372254B2; DK0927766T3; CA2257562C; JPH11243983A; EP0927766A1; ATA219297A; CA2257562A1; US6225095B1

Abstract

PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACION DE (S) - ENANTIOMEROS DE CIANHIDRINAS OPTICAMENTE ACTIVAS, MEDIANTE EL CUAL UNA MEZCLA FORMADA POR A) UN ALDEHIDO O CETONA DISUELTA EN UN DISOLVENTE ORGANICO QUE NO ES MEZCLABLE CON AGUA O MUY POCO, B) UNA SOLUCION ACUOSA DE (S) - HIDROXINITRILIASA Y C) UN DONADOR DE GRUPOS CIANURO SE AGITA DE TAL MANERA, QUE SE FORMA UNA EMULSION, QUE SE MANTIENE MEDIANTE AGITACION HASTA EL FINAL DE LA REACCION.

Description

Proceso enzimático para la preparación de (S)-cian-hidrinas.

Las cianhidrinas son importantes por ejemplo para la síntesis de alfa-hidroxiácidos, alfa-hidroxicetonas, beta-aminoalcoholes, que encuentran aplicación para la obtención de materiales biológicamente activos, v.g. principios activos farmacéuticos, vitaminas o incluso compuestos piretroides.

La preparación de una cianhidrina puede realizarse por adición de ácido cianhídrico (HCN) al grupo carbonilo de un aldehído o de una cetona asimétrica, formándose mezclas enantioméricas de cianhidrinas asimétricas.

Dado que en una mezcla de enantiómeros biológicamente activa normalmente sólo es activo uno de los dos enantiómeros, no han faltado intentos de encontrar un proceso para preparación del enantiómero (S) de una cianhidrina ópticamente activa con la pureza óptica más alta posible.

Así, por ejemplo en Makromol. Chem. 186, (1985), 1755-62 se describe un proceso para la obtención de (S)-cianhidrinas por transformación de aldehídos con ácido cianhídrico en presencia de éster metílico de benciloxicarbonil-(R)-fenilalanina-(R)-histidina como catalizador. La pureza óptica de la (S)-cianhidrina obtenida es sin embargo muy insatisfactoria.

En el documento EP-A-0 326 063 se describe un proceso enzimático para la preparación de (R)- o (S)-cianhidrinas ópticamente activas por transformación de aldehídos o cetonas alifáticos, aromáticos o heteroaromáticos con ácido cianhídrico en presencia de (R)-oxinitrilasa (EC 4.1.2.10) de Prunus amygdalis u oxinitrilasa (EC 4.1.2.11) de
Sorghum bicolor. Ejemplos de la preparación estereoespecífica de (S)-cianhidrinas alifáticas no se exponen. Esto no es de extrañar, dado que en Angew. Chemie 102 (1990), No. 4, pp. 423-425 se indica por los inventores que se citan en el documento EP-A-0 326 063 que a partir de la (S)-oxinitrilasa de Sorghum bicolor no puede prepararse ninguna (S)-cianhidrina alifática con ácido cianhídrico. Este resultado ha sido confirmado por F. Effenberger et al. en Tetrahedron Letters Vol. 31 No. 9 (1990), pp. 1249-1252.

El documento EP 0 632 130 describe adicionalmente un proceso por el cual se transforman aldehídos alifáticos o cetonas alifáticas asimétricas con ácido cianhídrico y oxinitrilasa de Hevea brasiliensis estereoespecíficamente en (S)-cianhidrinas. La transformación se realiza de acuerdo con EP 0 632 130 preferiblemente en un diluyente acuoso sin adición de disolventes orgánicos, dado que éstos, como se describe en el documento EP 0 632 130, inhiben rápidamente la actividad de la enzima.

Los documentos EP 0 547 655 y US 4.859.784 describen procesos por los cuales se preparan cianhidrinas ópticamente activas a partir de aldehídos o cetonas y ácido cianhídrico en un sistema bifásico, constituido por una solución acuosa homogénea de la hidroxinitrilasa y un disolvente orgánico apropiado, es al menos esencialmente inmiscible con agua. El sistema de reacción se agita durante la reacción enzimática, con lo cual se mantiene el sistema
bifásico.

En los procesos conocidos hasta ahora se trabajaba la mayoría de las veces en condiciones bastante diluidas, en un sistema acuoso u orgánico o en el sistema bifásico. Este procedimiento tiene sin embargo inconvenientes para muchos materiales de partida. Así, por ejemplo, 3-fenoxibenzaldehído o 4-fluoro-3-fenoxibenzaldehído o diversas cetonas son sustratos deficientes, por lo que es necesario un consumo elevado de enzima para obtener un rendimiento aceptable de cianhidrinas con pureza óptica satisfactoria.

Se ha encontrado ahora, inesperadamente, que es posible la transformación de una multiplicidad de compuestos de carbonilo, tales como por ejemplo aldehídos y cetonas alifáticos, alicíclicos, insaturados, alifáticos aromáticamente sustituidos, aromáticos y heteroaromáticos en las cianhidrinas respectivas con rendimiento elevado y alta pureza óptica en comparación con el estado de la técnica en un modo de operación más concentrado y con menor consumo de enzima, cuando la reacción se lleva a cabo en emulsión. De modo inesperado, la actividad de la enzima en condiciones de emulsión, como por ejemplo energía de agitación elevada, que conducen en el caso de muchas proteínas a la desactivación, se mantiene estable.

Objeto de la presente invención es por consiguiente un proceso para la preparación de los (S)-enantiómeros de cianhidrinas ópticamente activas por transformación de un aldehído o de una cetona con un donante de grupo cianuro en presencia de una (S)-hidroxinitrilasa natural o recombinante, que se caracteriza porque

una mezcla de reacción constituida por

a): un aldehído o cetona disuelto en un diluyente orgánico, no miscible o poco miscible con el agua,

b): una solución acuosa de (S)-hidroxinitrilasa y

c): un donante de grupo cianuro

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se agita con una energía de agitación superior a 500 W/m^{3}, formándose una emulsión que se mantiene hasta el final de la reacción por agitación, después de lo cual, una vez terminada la reacción, se aísla la (S)-cianhidrina respectiva de la mezcla de reacción por separación de fases.

Como materiales de partida en el proceso correspondiente a la invención se emplean un aldehído o una cetona, un donante de grupo cianuro, una solución acuosa de una hidroxinitrilasa (Hnl) natural o recombinante y un diluyente orgánico no miscible o poco miscible con el agua.

Bajo aldehídos deben entenderse en este contexto aldehídos alifáticos, aromáticos o heteroaromáticos. Bajo aldehídos alifáticos deben entenderse en este caso aldehídos saturados o insaturados alifáticos, de cadena lineal, ramificados o cíclicos. Aldehídos alifáticos preferidos son aldehídos de cadena lineal que tienen particularmente 2 a 18 átomos C, preferiblemente de 2 a 12, que son saturados o mono- o poliinsaturados. El aldehído puede contener en este caso tanto enlaces C-C dobles como enlaces C-C triples. El aldehído puede estar insustituido o sustituido con grupos inertes en las condiciones de reacción, por ejemplo con grupos arilo o heteroarilo opcionalmente sustituidos tales como grupos fenilo o indolilo, con grupos halógeno, éter, alcohol, acilo, ácido carboxílico, éster de ácido carboxílico, nitro o azido. Ejemplos de aldehídos aromáticos o heteroaromáticos son benzaldehído o diversos benzaldehídos sustituidos tales como por ejemplo 3,4-difluorobenzaldehído, 3-fenoxibenzaldehído, 4-fluoro-3-fenoxibenzaldehído, y adicionalmente furfural, antraceno-9-carbaldehído, furano-3-carbaldehído, indol-3-carbaldehído, naftalen-1-carbaldehído, dialdehído ftálico, pirazol-3-carbaldehído, pirrol-2-carbaldehído, tiofen-2-carbaldehído, aldehído isoftálico o piridinaldehído, etcétera.

Las cetonas son cetonas alifáticas, aromáticas o heteroaromáticas, en las cuales el átomo de carbono del carbonilo está diferentemente sustituido. Bajo cetonas alifáticas deben entenderse cetonas saturadas o insaturadas, de cadena lineal, ramificadas o cíclicas. Las cetonas pueden ser saturadas o mono- o poliinsaturadas. Las mismas pueden estar insustituidas, o sustituidas con grupos inertes en las condiciones de reacción, por ejemplo con grupos arilo o heteroarilo opcionalmente sustituidos tales como fenilo o grupos indolilo, o con grupos halógeno, éter, alcohol, acilo, ácido carboxílico, éster de ácido carboxílico, nitro o azido.

Ejemplos de cetonas aromáticas o heteroaromáticas son acetofenona, indolilacetona, etcétera.

Aldehídos y cetonas que son apropiados para el proceso correspondiente a la invención, son conocidos o pueden prepararse convencionalmente.

Como donante de grupo cianuro se añade ácido cianhídrico. El ácido cianhídrico puede liberarse en este caso poco antes de la reacción a partir de una de sus sales como por ejemplo NaCN o KCN liberarse y añadirse a la mezcla de reacción en forma pura o en forma disuelta.

Como hidroxinitrilasa (Hnl) son adecuadas (S)-hidroxinitrilasas naturales p.ej. de mandioca y Hevea brasiliensis, así como (S)-Hnl recombinantes. Como Hnl natural se emplea preferiblemente Hnl de Hevea brasiliensis o Manihot esculenta. (S)-Hnl recombinante apropiada se obtiene por ejemplo a partir de microorganismos modificados por tecnología genética tales como por ejemplo Pichia pastoris o Saccharomyces cerevisiae.

Preferiblemente se emplea (S)-Hnl de Pichia pastoris.

Por la sobreexpresión funcional en la levadura metilótrofa de Pichia pastoris puede obtenerse esta Hnl en cantidades cualesquiera. (M. Hasslacher et al., J. Biol. Chem. 1996, 271, 5884). Este sistema de expresión es particularmente apropiado para fermentaciones con alta densidad de células. De este modo es posible, por ejemplo, obtener 20 g de enzima pura por litro de medio de fermentación. Las actividades específicas alcanzables de la proteína recombinante purificada son aproximadamente el doble de las de la enzima natural, que se aislaba a partir de las hojas del árbol Hevea brasiliensis. Después de la disgregación de las células puede emplearse la fracción citosólica sin purificación adicional, con lo cual se minimiza el gasto de trabajo. La enzima no está glicosilada y no posee tampoco grupo prostético alguno, que podría conducir a desactivación por disociación de la parte proteínica.

La Hnl puede emplearse a la temperatura ambiente durante varios días sin pérdida significativa de actividad, y es suficientemente estable a largo plazo a -20ºC. Con ello se obtiene la posibilidad del empleo repetido de la misma carga de enzima. La enzima se caracteriza también por una alta estabilidad frente a los disolventes. Con ello se crea la posibilidad de emplear diversos disolventes orgánicos para la reacción enzimática, haciéndose así posible la formación de una emulsión, lo que se traduce favorablemente en la productividad del proceso respectivo.

La hidroxinitrala puede emplearse purificada o sin purificar, como tal o inmovilizada. La preparación y purificación de la hidroxinitrilasa puede realizarse por ejemplo por precipitación con sulfato de amonio y filtración subsiguiente en gel, por ejemplo según D. Selmar et al., Physiologia Plantarum 75 (1989), 97-101.

Como diluyentes orgánicos pueden emplearse hidrocarburos alifáticos o aromáticos inmiscibles o poco miscibles con el agua que están opcionalmente halogenados, alcoholes, éteres o ésteres o mezclas de los mismos.

Preferiblemente se emplean metil-terc-butiléter (MTBE), diisopropiléter, dibutiléter y acetato de etilo o una mezcla de MTBE y tolueno.

Por g de aldehído o cetona se añaden aproximadamente 0,1 a 10 g de diluyente y 10 a 10000 UI de actividad de hidroxinitrilasa, de modo preferible aproximadamente 50 a 2000 UI.

Una UI (Unidad Internacional) designa aquella cantidad de un preparado enzimático que cataliza la formación de 1 micromol de producto por minuto. La cantidad necesaria de la hidroxinitrilasa respectiva se determina muy adecuadamente en un ensayo de actividad, por ejemplo según Selmar et al., Analytical Biochemistry 166 (1987), 208-211.

Por mol de grupo aldehído o cetona empleado se añade al menos 1 mol, preferiblemente 1 a 5 moles, y de modo particularmente preferible 1 a 2 moles de donante de grupo cianuro.

En el proceso correspondiente a la invención, se añade inicialmente el aldehído o la cetona disuelto en el diluyente orgánico. Se añade a esta solución la enzima en forma de una solución tampón acuosa. El valor de pH de esta solución debe ser en este caso inferior a 7, estando comprendido preferiblemente entre 3 y 6,5.

La mezcla de reacción así obtenida se agita a temperaturas de 0º hasta aproximadamente 30ºC a fin de que se forme una emulsión. El número de revoluciones del agitador necesario para ello (N) depende en este caso del denominado índice de capacidad del agitador empleado (Po), de su diámetro (d), del volumen de reacción (V) y de la densidad (\rho) del medio de reacción. A partir de estos factores puede deducirse la energía de agitación, es decir la potencia del agitador por volumen de reacción (volumen de la mezcla de reacción, no del aparato).

P/V = \frac{P_{0} \cdot \rho \cdot N^{3} \cdot d^{5}}{V}

Preferiblemente, la energía de agitación en el proceso correspondiente a la invención es superior a 500 W/m^{3} de modo particularmente preferible superior a 1000 W/m^{3}. En comparación, en los procesos conocidos hasta ahora, que trabajan por ejemplo en sistemas acuosos, orgánicos o bifásicos, se obtienen exclusivamente energías de agitación de aproximadamente 100 W/m^{3}.

Cuando la mezcla de reacción se encuentra en forma de emulsión, se añade entonces el donante de grupo cianuro. La emulsión se mantiene hasta el final de la reacción por agitación. El transcurso de la reacción puede seguirse en este caso por ejemplo fotométricamente por la disminución del contenido de aldehído.

Dependiendo del material de partida se determina la longitud de onda, a la cual absorbe el material de partida y no lo hace la cianhidrina que se forma. La absorción de la mezcla de reacción disminuye por tanto proporcionalmente al aumento de conversión.

En el caso del empleo de una sal del ácido cianhídrico puede liberarse primeramente el ácido cianhídrico a partir de una solución de la sal por adición de, por ejemplo H_{2}SO_{4} o H_{3}PO_{4}.

El valor de pH de esta solución de ácido cianhídrico debería ser inferior a 7, estando comprendido preferiblemente entre 4 y 6,5.

A continuación se añaden a la solución de ácido cianhídrico la solución acuosa de enzima, el diluyente orgánico y el aldehído o la cetona, se inicia la reacción y se ajusta después opcionalmente el valor de pH.

En este caso debe prestarse atención nuevamente a que la mezcla de reacción se agite de tal manera que se forme una emulsión que se mantenga de nuevo hasta el final de la reacción por agitación continua.

Para el acabado de la mezcla de reacción y para el aislamiento de la cianhidrina formada se emplean técnicas habituales, que rompen en primer lugar la emulsión, como por ejemplo filtración, centrifugación o coalescencia. Seguidamente las fases que se forman se separan opcionalmente por adición de desemulsionantes y se procesa la fase que contiene el producto.

Para la obtención de la cianhidrina correspondiente se emplean en este contexto, dependiendo del producto final técnicas conocidas tales como destilación, extracción o cristalización. Las cianhidrinas así obtenidas pueden estabilizarse opcionalmente por adición de un ácido antes del tratamiento ulterior.

Ejemplo 1-8

Preparación de (S)-3-fenoxibenzaldehído-cianhidrina

Ejemplo 1

a) se disolvieron 15 g (0,0756 mol) de m-fenoxibenzaldehído en 45 ml de MTBE, se introdujeron en un recipiente de 150 ml con paredes dobles provisto de un agitador de 6 paletas y se llevó la mezcla de reacción a 15ºC.

Se mezclaron 26,4 ml de enzima (Hnl de Pichia pastoris, sobrenadante de la centrifugación del lisado de células sin diluir) en una solución de 1,5 g del sorbitol en 33,3 ml de agua desmineralizada (pH 5,8), se ajustaron con solución diluida de ácido cítrico a pH 5,5 y se introdujeron en el reactor. A continuación se añadieron 3 x 5 ml de HCN mediante una jeringuilla provista de llave de 3 vías, mientras se agitaba la solución de reacción a 600 rpm.

Durante la reacción se agitó a 800 rpm, de tal modo que la mezcla de reacción se encontraba en forma de una emulsión. El transcurso de la reacción se siguió por medio de control IP por la disminución del contenido de aldehído. (Extinción a 304 nm). Para ello se tomaron 0,5 a 1 ml de la solución de reacción después de tiempos de reacción definidos y se centrifugó. Se diluyeron 100 \mul de la fase orgánica con MTBE hasta 10 ml, de lo cual se diluyeron nuevamente 250 \mul con MTBE hasta 10 ml, de tal manera que la dilución total correspondía a un factor de 100 x 40 = 4000.

Hacia el final de la reacción (conversión > 95%) la extinción era muy pequeña, de tal modo que para el aumento de la exactitud se suprimió el segundo paso de dilución, y la extinción se dividió en este caso para el cálculo de la conversión por el segundo factor de dilución (40).

Conversión (t) = [1–(extinción(t)/extinción(comienzo))] x 100%

Se calcularon las conversiones siguientes:

Tiempo de reacción	Conversión
0	0
30	70
60	85
90	95
120	95	... extinción ya muy pequeña,

la reacción se detiene (conductividad al final de la reacción 0,8 mS).

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b) Se repitió el procedimiento de reacción anterior, pero se agitó a 1000 rpm.

Tiempo de reacción	Conversión
0	0
60	90
90	> 95
120	> 95	... extinción ya muy pequeña,

según la cromatografía en capa fina (DC), la reacción tiene lugar hasta una conversión de 98%.

(Conductividad al final de la reacción 0,7 mS).

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c) Para comparación se repitió una vez más la operación anterior, pero se agitó ya sólo a 400 rpm.

Tiempo de reacción	Conversión
0	0
30	30
60	70
90	75

(Conductividad al final de la reacción 0,8 mS).

\vskip1.000000\baselineskip

La energía de agitación de las tres operaciones se determinó de acuerdo con la fórmula siguiente:

P/V = \frac{P_{0} \cdot \rho \cdot N^{3} \cdot d^{5}}{V}

P_{0} índice de capacidad del agitador

\rho densidad [kg/m^{3}]

N número de revoluciones del Agitador [rpm]

d diámetro del agitador [m]

V volumen de reacción [m^{3}]

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Ejemplo 1	rpm	Energía de agitación [W/m^{3}]

a	800	588	P_{0} ...... 3
b	1000	1146	D ...... 0,5
c	400	73	V ...... 134 ml

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Ejemplo 2

Análogamente al Ejemplo 1, se transformaron 75 g (0,378 mol) de m-fenoxibenzaldehído en 225 ml de MTBE y 132 ml de solución enzimática con 73 ml (1,89 mol) de HCN en un recipiente de 750 ml con paredes dobles provisto de agitador de 6 paletas.

A fin de obtener una emulsión se agitó en este caso a 770 rpm, lo que correspondía a una energía de agitación de aprox. 1150 W/m^{3}.

Tiempo de reacción	Extinción	Conversión
0		0
30	0,499	80
60	0,1	> 95
90		> 98

La reacción terminó al cabo de 1,5 h.

Acabado

Se agitaron mediante sacudidas 150 ml de la mezcla de reacción con 75 ml de MTBE y se hicieron pasar a través de una columna llena con lana de vidrio (altura 9 cm, diámetro 3 cm) con una ligera presión. El producto de salida de la columna estaba constituido por una fase orgánica brillante y una fase acuosa amarilla ligeramente turbia. A continuación se hicieron pasar por la misma columna 300 ml adicionales de mezcla de reacción sin diluir, obteniéndose asimismo una separación de fases limpia. Se concentraban en la columna pequeñas cantidades de un material sólido que se separaron con agua y MTBE. Después de ello la columna pudo emplearse de nuevo para la separación de fases.

Las fases de MTBE se reunieron y se agitaron.

Residuo: (S)-3-fenoxibenzaldehído-cianhidrina (SCMB) 52,7 g (92%).

Ejemplo 3

Se disolvieron 13,8 g (0,28 mol) de NaCN en 12 ml de agua desmineralizada, se introdujeron en un matraz de fondo redondo y se lavaron posteriormente con agua (hasta 90 ml). Bajo enfriamiento con hielo se añadió H_{2}SO_{4} al 10% desde un embudo de goteo, con lo que se alcanzó un valor de pH de 5,6. La mezcla así obtenida se introdujo en un recipiente de 750 ml con paredes dobles y provisto de un agitador de 6 paletas. 26,4 ml de enzima (Hnl de Pichia pastoris sobrenadante de la centrifugación del lisado de células sin diluir, 850 UI/ml) se diluyeron con agua hasta 130 ml y se introdujeron también en el reactor. El valor de pH de la mezcla de reacción se ajustó posteriormente a 5,5, se añadieron 180 ml de MTBE y 31 g (0,156 mol) de m-fenoxibenzaldehído, y se inició la reacción. En este caso se agitó a 500 rpm (3,8 kW/m^{3}), con lo que se formó una emulsión. El transcurso de la reacción se siguió de nuevo fotométricamente.

Tiempo de reacción	Extinción	Conversión
0
60	0,129	aprox. 70
120	0,079	aprox. 85
180	0,060	aprox. 90

Ejemplo 4

Análogamente al Ejemplo 3, se transformaron 6,9 g (0,141 mol) de NaCN, 15,5 g (0,0781 mol) de m-fenoxibenzaldehído, 26,4 ml de enzima (850 UI/ml) en 45 ml de MTBE y 16,1 ml de agua a pH 5,6 (ajustado con H_{2}SO_{4} al 10%) en un recipiente de 150 ml con paredes dobles y con agitador de 6 paletas. La mezcla de reacción se agitó de tal manera que se formó una emulsión.

El número de revoluciones del agitador era inicialmente 1000 rpm. A partir de las dimensiones del agitador se calculó que la potencia nominal de la instalación de reacción se alcanza sólo a 1860 rpm, por lo que después de 2,5 h el número de revoluciones se aumentó hasta este valor.

Tiempo de reacción	Extinción	Conversión
0
60	0,49
120	0,36	60-65
180	0,20	aprox. 80
240	0,07	aprox. 90-95

Por el aumento del número de revoluciones del agitador después de 150 min, se aceleró claramente la reacción.

Ejemplo 5

Análogamente al Ejemplo 4, se transformaron 13,8 g (0,28 mol) de NaCN, 31 g de m-fenoxibenzaldehído, 26,4 ml de enzima en 45 ml de MTBE y 220 ml de agua a pH 5,6 (ajustado con H_{2}SO_{4} al 10%) a 15ºC en un recipiente de 750 ml provisto de paredes dobles con un agitador de 6 paletas. De nuevo, se agitó tan rápidamente que se formó una emulsión. El número de revoluciones del agitador era 500 rpm (5,1 kW/m^{3}, corregido para el volumen de reacción real).

Tiempo de reacción	Extinción	Conversión
0
90	0,20	aprox. 70
165	0,047	aprox. 90
210	0,041	aprox. 95

El tratamiento se realizó haciendo pasar la mezcla a través de una columna de vidrio.

El producto se obtuvo puro por destilación del disolvente. Se extrajo una muestra analítica, se acetiló de manera convencional por reacción con cloruro de acetilo en diclorometano y se determinó su contenido de aldehído residual y su exceso enantiomérico (ee) por cromatografía en una columna quiral de cromatografía de gases:

GC-analítica:

: Conversión: 97%

: e.e. 98%

Ejemplo 6

Se mezclaron 88 ml de enzima (850 U/ml) con 112 ml de agua, se ajustaron a pH 5,5 por medio de ácido cítrico al 0,1% y se introdujeron en un recipiente de 750 ml con paredes dobles provisto de un agitador de 6 paletas. Se disolvieron 50 g (0,252 mol) de m-fenoxibenzaldehído en 150 ml de MTBE y se añadieron a la solución enzimática. La mezcla de reacción se llevó a 15ºC y se agitó a 500 rpm (6 kW/m^{3}), con lo que se formó una emulsión. Se añadieron a continuación 12,3 g (0,454 mol) de HCN mediante un embudo de goteo dentro de 30 min. El transcurso de la reacción se siguió de nuevo fotométricamente.

Tiempo de reacción	Extinción	Conversión
0
30	0,795	aprox. 30 (final del goteo)
90	0,227	aprox. 75
150	0,079	aprox. 92
180	0,057	aprox. 95
240		aprox. 98 (DC)

La mezcla de reacción se trató por separación de fases en una columna llena de lana de vidrio.

Análisis GC:

: Conversión 98%

: e.e. 99%

Ejemplo 7

Se suspendieron 4 g de (S)-hidroxinitril-liasa natural (Hnl) de Hevea brasiliensis en 100 ml de tampón de citrato de sodio (5 mmol), se agitó durante 2,5 h a la temperatura ambiente, se centrifugó y se concentró el sobrenadante a 10 ml en el evaporador rotativo (30ºC, 1 mbar). Después de medir la actividad (348 UI/g), la enzima se transfirió a un matraz de fondo redondo de 25 ml, y se añadieron 1 g (5 mmol) de m-fenoxibenzaldehído y 1,5 ml de terc-butilmetiléter (MTBE).

La mezcla de reacción así obtenida se agitó a continuación a 0-5ºC mientras se agitaba con una energía de agitación de aproximadamente 1 kW/m^{3} (agitador magnético), hasta que se formó una emulsión. A continuación se añadieron gota a gota rápidamente 0,3 ml de HCN (7,7 mmol) y se agitó nuevamente durante 23 h a 0-5ºC sin disminuir la energía de agitación.

El transcurso de la reacción se siguió por medio de control IP por la disminución del contenido de m-fenoxibenzaldehído (medida fotométrica a 304 nm). La solución de reacción se centrifugó después del final de la reacción, se separó la enzima y la solución restante se diluyó con 2,5 ml de MTBE, se agitó mediante sacudidas y se centrifugó una vez más.

Como residuo en la fase orgánica quedaba (S)-3-fenoxibenzaldehído-cianhidrina. (e.e. = 90,6%, contenido 91,4%) (determinado por cromatografía de gases).

La conversión alcanzó 92,7% después de 23 h.

Ensayo comparativo

Análogamente a Tetrahedron, Vol. 52, No. 23, (1996) pp. 7833-7840, se preparó (S)-3-fenoxibenzaldehído por reacción de m-fenoxibenzaldehído con KCN en un tampón acuoso de ácido cítrico (pH = 4,0-4,5) (se forma HCN in situ) con empleo de Hnl de Pichia pastoris. La energía de agitación fue en este caso aproximadamente 100 W/m^{3}.

El (S)-3-fenoxibenzaldehído se obtuvo de hecho en este caso con una pureza óptica de e.e. = 99%, pero con un rendimiento de sólo 9%.

Ejemplo 8

Se cargaron 45,6 g (0,23 mol) de m-fenoxibenzaldehído en 12,5 ml de MTBE, 12,5 ml de tolueno y 52,9 ml de agua destilada y 12,5 ml de enzima (Hnl de Pichia pastoris, 5,2 kU/ml) en un aparato Schmizo inertizado de 100 ml con rompedores de corriente, bomba de perfusión, refrigerante, termostato y agitador KPG (3 cm), y la mezcla de reacción así obtenida se atemperó a aprox. 20ºC.

La mezcla de reacción se agitó para la obtención de una emulsión a 950 rpm (3,2 kW/m^{3} de energía de agitación).

A continuación, después de la obtención de una emulsión, se dosificaron continuamente en el transcurso de 60 min 12,6 m de ácido cianhídrico (liberado a partir de NaCN con H_{2}SO_{4}).

La emulsión se mantuvo durante 2,5 h por agitación intensa (950 rpm). El transcurso de la reacción se siguió mediante control IP por la disminución del contenido de aldehído.

Tiempo de reacción	Extinción	Contenido de aldehído
Final del goteo (1 h)	0,978	> 30%
1,5 h	0,396	10,3%
2 h	0,213	5,6%
2,5 h	0,136	3,1%

Para el acabado, se añadieron a la solución de reacción 25 ml adicionales de MTBE y 25 ml de tolueno, y se agitó durante 20 min.

La mezcla de reacción se dejó en reposo durante una noche a la temperatura ambiente. Un control IP después de 15 h de tiempo de permanencia dio un contenido de aldehído de 1,8%. La solución de reacción se centrifugó luego una sola vez durante 30 min a 3000 U/min, la fase orgánica sobrenadante se filtró con succión y se transfirió a un matraz de 250 ml con fondo redondo. (Fase orgánica 1: 83,55 g). La fase acuosa se transfirió de nuevo al reactor, se añadieron nuevamente 25 ml de MTBE y 25 ml de tolueno, y se agitó durante 20 min a 900 U/min. A continuación se centrifugó la mezcla durante 30 min. Como residuo quedaba en las frases orgánicas reunidas SCMB (e.e. 98%, conversión: 92%).

Ejemplo 9

(S)-4-Fluoro-3-fenoxibenzaldehído-cianhidrina

Análogamente al Ejemplo 8 se transformaron 10,8 g (0,05 mol) de 4-fluoro-3-fenoxibenzaldehído en 40 ml de MTBE y 20 ml de agua con 15 ml de enzima/Hnl de Pichia pastoris, 5,2 kU/ml) con 8 ml de HCN (liberado a partir de NaCN por medio de H_{2}SO_{4}) a 10-15ºC. El ácido cianhídrico se dosificó continuamente en el transcurso de 30 min. El número de revoluciones del agitador, que se ajustó para la obtención de una emulsión, era 950 rpm.

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Tiempo de la reacción	Contenido de aldehído
de dosificación	todavía sin reacción
1 h	> 50%
4 h	> 30%

Después de 4 h, se redujo el número de revoluciones del agitador a 500 U/min y la mezcla de reacción se agitó durante 15 h a 12-15ºC. Después de un total de 20 h, el contenido de aldehído era > 5,0%.

La solución de reacción se trasegó a una probeta graduada (rendimiento 68,72 g) y se centrifugó a continuación una sola vez 20 minutos a 3000 U/min. Se separó la fase orgánica (fase org. 1), y la fase acuosa se transfirió de nuevo al reactor con 20 ml de MTBE y se agitó 20 min a 9000 U/min. A continuación se centrifugó una vez más durante 20 min, se separó la fase orgánica y se reunió con la fase org. 1.

Las fases orgánicas reunidas se agitaron a continuación.

: Rendimiento: 11,45 (S)-4-fluoro-3-fenoxibenzaldehído-cianhidrina

: (Teoría: 12,11 g) 94,55%,

: e.e.: 95,43%.

Ejemplo 10

(S)-3,4-Difluorobenzaldehído-cianhidrina

Análogamente al Ejemplo 8 se transformaron 8,2 g (0,05 mol) de 3,4-difluorobenzaldehído en 40 ml de MTBE y 20 ml de H_{2}O y 15 ml de enzima (Hnl de Pichia pastoris, 5,2 kU/ml) con 9 ml de ácido cianhídrico (liberado a partir de NaCN) a 10-15ºC.

El número de revoluciones del agitador fue nuevamente 950 rpm.

El ácido cianhídrico se añadió en esta ocasión de una sola vez. El transcurso de la reacción se siguió por medio de control IP.

Después de 3,5 h de tiempo de reacción, apenas era ya detectable aldehído, y después de 4,5 h no se apreciaba ya variación alguna del contenido de aldehído.

La solución de reacción (62,5 g) se trató análogamente al Ejemplo 9.

: Rendimiento: 8,25 g (97,74%) de (S)-3,4-difluorobenz-aldehído-cianhidrina (Teoría 8,44 g)

: e.e.: 95,61%.

Ejemplo 11

Se disolvieron 8 mmol de 3-metil-2-butanona (860 \mul) en 2,4 ml de metil-t-butiléter y se enfrió a 0ºC. Después de adición de 750 UI (de Hnl acuosa de Pichia pastoris) (la relación fase org./fase ac. era 0,75:1,0), que se ajustó con ácido cítrico a pH = 4,0, el recipiente de reacción se cerró herméticamente y se agitó, con lo que se formó una emulsión. Se añadieron a 0ºC 40 mmol (1,52 ml) de ácido cianhídrico y se agitó nuevamente después de ello. El transcurso de la reacción se siguió por la disminución de la banda de C=O (1720 cm^{-1}) por espectroscopia IR. La 3-metil-2-butanona se había transformado por completo después de 2 minutos.

Se separaron las fases de la solución de reacción, se trató varias veces la fase acuosa con MTBE y se reunieron las soluciones en MTBE así obtenidas. La fase orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro y el disolvente se separó por destilación a 40ºC y 20 mbar.

Como residuo quedó (S)-2-hidroxi-2,3-dimetilbutano-nitrilo.

e.e. = 98% (determinado por cromatografía de gases)

La conversión fue 99%.

Ejemplo 12

Se disolvieron 1250 \mul de 4-metil-2-pentanona (10 mmol) en 3 ml de metil-t-butiléter con agitación y se enfrió a 0ºC. Se añadieron a ello 3,9 ml (585 IU/mmol) de solución acuosa de enzima (Hnl de Pichia pastoris). La solución enzimática se ajustó previamente con ácido cítrico a pH = 4,5. Se agitó durante 5-10 minutos. Después de la formación de una emulsión, se añadieron 50 mmol (1,9 ml) de ácido cianhídrico anhidro rápidamente de una sola vez, se cerró herméticamente el recipiente de reacción y se agitó 5 minutos a 0ºC. Se separaron a continuación las fases de la solución de reacción, se trató varias veces la fase acuosa con metil-t-butiléter y se reunieron las soluciones en MTBE así obtenidas. Se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se separó el disolvente a presión reducida.

Como residuo quedó (S)-2-hidroxi-2,4-dimetilpentano-nitrilo.

El análisis por cromatografía de gases dio un exceso enantiomérico > 99% y la espectroscopia IR dio una conversión de 86%.

Ejemplo 13

Se disolvieron 4,6 mmol de 2-pentanona (493 \mul) en 2,4 ml de metil-t-butiléter a 0ºC con agitación. Se ajustaron 3,2 ml de solución enzimática (Hnl de Pichia pastoris, 1050 IU/mmol) con ácido cítrico a pH = 4,0 y se añadieron a continuación. Después de ello se agitó durante 5 a 10 minutos y se añadieron a la emulsión formada 25 mmol (973 \mul) de ácido cianhídrico anhidro.

El recipiente de reacción se cerró herméticamente y se agitó durante 5 minutos a 0ºC (1000 U/min). El transcurso de la reacción se siguió por la disminución de la banda de C=O (1720 cm^{-1}) con ayuda de espectroscopia IR. Conforme a la espectroscopia IR, la conversión era completa al cabo de este tiempo. Se separaron una de otra las fases de la solución de reacción, se trató varias veces la fase acuosa con MTBE y las soluciones en MTBE así obtenidas se reunieron y se añadieron a la solución de reacción. La fase orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro y el disolvente se eliminó por destilación a 40ºC y 20 mbar. Como residuo quedaba (S)-2-hidroxi-2-metilpentanonitrilo.

e.e. = 74% (determinado por cromatografía de gases).

Ejemplo 14

Se disolvieron 1210 \mul de 2-hexanona (10 mmol) en 4 ml de metil-t-butiléter con agitación y se enfrió a 0ºC. Después de la adición de 3,9 ml de solución enzimática acuosa con pH = 4,0 (Hnl de Pichia pastoris, 585 IU/mmol), el recipiente de reacción se cerró herméticamente y se agitó hasta la formación de una emulsión.

Se añadieron a ello rápidamente 50 mmol (1,9 ml) de ácido cianhídrico anhidro de una sola vez y se agitó luego 5 minutos a 0ºC. Las fases de reacción se separaron una de otra, se trató varias veces la fase acuosa con metil-t-butiléter y las soluciones en MTBE reunidas se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, eliminándose el disolvente a presión reducida.

Como residuo quedaba (S)-2-hidroxi-2-metilhexano-nitrilo.

El análisis por cromatografía de gases dio un exceso enantiomérico de 98,5% y una conversión de 58,5%.

Ejemplo 15

Se disolvieron 5 mmol de acetofenona (580 \mul) en 1,9 ml de metil-t-butiléter y se enfrió a 0ºC. Se ajustaron 2,5 ml de solución enzimática (Hnl de Pichia pastoris, 750 IU/mmol) con ácido cítrico a pH = 3,75 y se añadieron a la mezcla de reacción. Después de ello se agitó durante 5 a 10 minutos. Se añadieron a la emulsión que se formó 25 mmol (973 \mul) de ácido cianhídrico anhidro. A continuación se cerró herméticamente el recipiente de reacción y se agitó 5 minutos a 0ºC. Se siguió el transcurso de la reacción por espectroscopia IR. Se separaron las fases de la solución de reacción. La fase acuosa se trató varias veces con metil-t-butiléter y se reunieron las soluciones en MTBE. La fase orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se eliminó el disolvente a presión
reducida.

\newpage

Como residuo quedaba (S)-2-hidroxi-2-metilfenil-acetonitrilo.

e.e. = 99%

La espectroscopia IR dio una conversión de 38%.

Ejemplo 16

Se disolvieron 580 \mul de acetofenona (5 mmol) en 1,9 ml de diisopropiléter con agitación y se enfrió a 0ºC. Se añadieron a ello 2,5 ml (750 IU/mmol) de solución enzimática acuosa (Hnl de Pichia pastoris), ajustando previamente la solución enzimática con ácido cítrico a pH = 5,0. Se agitó 5-10 minutos y, después de la formación de una emulsión, se añadieron rápidamente de una sola vez 25 mmol (0,95 ml) de ácido cianhídrico anhidro. Se cerró herméticamente el recipiente de reacción y la solución de reacción se agitó durante 5 minutos más a 0ºC. Se separaron las fases de la solución de reacción, se trató varias veces la fase acuosa con metil-t-butiléter y se reunieron las soluciones en MTBE así obtenidas. La fase orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se eliminó el disolvente a presión reducida.

Como residuo quedaba 2-hidroxi-2-metilfenilaceto-nitrilo.

El análisis por cromatografía de gases dio un exceso enantiomérico de 99% y la espectroscopia IR dio una conversión de 40%.

Claims

1. Proceso para la preparación de los (S)-enantiómeros de cianhidrinas ópticamente activas por transformación de un aldehído o de una cetona con un donante de grupo cianuro en presencia de una (S)-hidroxinitrilasa natural o recombinante, caracterizado porque una mezcla de reacción constituida por

b): una solución acuosa de (S)-hidroxinitrilasa y

c): un donante de grupo cianuro

con una energía de agitación superior a 500 W/m^{3}, formándose una emulsión que se mantiene hasta el final de la reacción por agitación, después de lo cual, una vez terminada la reacción, se aísla la (S)-cianhidrina respectiva de la mezcla de reacción por separación de fases.

2. Proceso según la reivindicación 1, caracterizado porque se transforma un aldehído alifático, aromático o heteroaromático o una cetona asimétrica.

3. Proceso según la reivindicación 1, caracterizado porque como donante de grupo cianuro se añade ácido cianhídrico.

4. Proceso según la reivindicación 1, caracterizado porque como hidroxinitrilasa se emplea una (S)-hidroxinitrilasa natural de Mandioca esculenta o Hevea brasiliensis o una (S)-hidroxinitrilasa recombinante derivada de ellas preparada a partir de Pichia pastoris o Saccharomyces cerevisiae.

5. Procesó según la reivindicación 1, caracterizado porque como diluyente se emplean hidrocarburos alifáticos o aromáticos no miscibles o poco miscibles con el agua, que están opcionalmente halogenados, alcoholes, éteres o ésteres o sus mezclas.

6. Proceso según la reivindicación 1, caracterizado porque como diluyente se emplea metil-terc-butiléter, diisopropiléter, dibutiléter, acetato de etilo o una mezcla de metil-terc-butil-éter y tolueno.

7. Proceso según la reivindicación 1, caracterizado porque la temperatura de reacción es 0ºC a 30ºC.