JPH0657158B2 - 複合酵素系を使用するｎ‐アシルアミノ酸エステルのエナンチオ選択性加水分解 - Google Patents
複合酵素系を使用するｎ‐アシルアミノ酸エステルのエナンチオ選択性加水分解Info
- Publication number
- JPH0657158B2 JPH0657158B2 JP60248675A JP24867585A JPH0657158B2 JP H0657158 B2 JPH0657158 B2 JP H0657158B2 JP 60248675 A JP60248675 A JP 60248675A JP 24867585 A JP24867585 A JP 24867585A JP H0657158 B2 JPH0657158 B2 JP H0657158B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acid
- group
- mixture
- hydrolysis
- catalyst
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
- C12P41/006—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures
- C12P41/007—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures by reactions involving acyl derivatives of racemic amines
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は光学活性（ＬまたはＤ−異性体のいずれかを過
剰に含む）またはラセミ混合物であることができるＬ，
Ｄ−Ｎ−アシルアミノ酸エステルの鏡像体混合物から鏡
像体のＤ−アミノ酸を実質的に含まないＬ−アミノ酸を
含む混合物を製造する方法に関する。
剰に含む）またはラセミ混合物であることができるＬ，
Ｄ−Ｎ−アシルアミノ酸エステルの鏡像体混合物から鏡
像体のＤ−アミノ酸を実質的に含まないＬ−アミノ酸を
含む混合物を製造する方法に関する。
多くの天然産α−アミノ酸は、合成生成物がＬ−および
Ｄ−異性体の混合物であることを除いて合成的に複製す
ることができる。若干の合成法はＮ−アシル−α−アミ
ノ酸エステル（すなわちα−アミノ酸エステル）を中間
体生成物として与える。１例はシュミット(schmidt)反
応であり、著書「アミノ酸の合成および利用(Synthetic
Production and Utilization of Amino Acids)」、カ
ネコ、イズミ、シバタおよびイトー、ジョン・ワイリー
・アンド・サンズ、ニューヨーク(1974)１４頁に記載さ
れ、引用される。その反応において、アミノ酸はアセト
酢酸アルキルから相当するヒドロアゾ酸を経て得られ
る。Ｎ−アミル−アミノ酸エステルが作られ、次いでα
−アミノ酸に化学的に加水分解される。また１９８３年
１１月１６日に提出された米国特許出願第552,561号で
はＮ−アシル−α−アミノ酸エステルは適当なエナミド
のヒドロカルボキシル化により製造される。
Ｄ−異性体の混合物であることを除いて合成的に複製す
ることができる。若干の合成法はＮ−アシル−α−アミ
ノ酸エステル（すなわちα−アミノ酸エステル）を中間
体生成物として与える。１例はシュミット(schmidt)反
応であり、著書「アミノ酸の合成および利用(Synthetic
Production and Utilization of Amino Acids)」、カ
ネコ、イズミ、シバタおよびイトー、ジョン・ワイリー
・アンド・サンズ、ニューヨーク(1974)１４頁に記載さ
れ、引用される。その反応において、アミノ酸はアセト
酢酸アルキルから相当するヒドロアゾ酸を経て得られ
る。Ｎ−アミル−アミノ酸エステルが作られ、次いでα
−アミノ酸に化学的に加水分解される。また１９８３年
１１月１６日に提出された米国特許出願第552,561号で
はＮ−アシル−α−アミノ酸エステルは適当なエナミド
のヒドロカルボキシル化により製造される。
本発明の目的は鏡像体Ｄ−α−アミノ酸を含まないＬ−
α−アミノ酸を製造する方法を提供することである。
α−アミノ酸を製造する方法を提供することである。
本発明の他の目的は炭素原子がキラルである天然産α−
アミノ酸の式を有するα−アミノ酸のα−Ｎ−アシルア
ミノ酸エステルのＬ−およびＤ−異性体の混合物のＬ−
異性体のみを選択的に酵素的に加水分解する方法を提供
することである。
アミノ酸の式を有するα−アミノ酸のα−Ｎ−アシルア
ミノ酸エステルのＬ−およびＤ−異性体の混合物のＬ−
異性体のみを選択的に酵素的に加水分解する方法を提供
することである。
本発明の他の目的並びに観点、特徴および利点は特定実
施例および特許請求の範囲を含め明細書の検討から明ら
かになろう。
施例および特許請求の範囲を含め明細書の検討から明ら
かになろう。
本発明によれば、アルファ炭素原子がキラルである天然
産α−アミノ酸の式を有するα−アミノ酸のＬ−異性体
を含む比較的容易に分離できる混合物で、Ｄ−異性体を
実質的に含まない前記Ｌ−異性体を含む混合物を製造す
る方法が提供され、その方法は前記α−アミノ酸のα−
アミド酸ヒドロカルビルエステル誘導体のＬ−およびＤ
−混合物を前記Ｌ−異性体のみの、前記アミド基および
前記Ｌ−エステルのエステル化カルボキシ基それぞれの
加水分解を促進するアシラーゼ触媒およびエステラーゼ
触媒の存在下に酵素的に加水分解し、前記加水分解を果
たし、前記Ｌ−α−アミノ酸異性体を前記Ｌ−α−アミ
ノ酸の鏡像体を実質的に含まない前記Ｄ−α−アミノ酸
エステル誘導体との混合物で回収することを含み、前記
ヒドロカルビルはＣ１〜Ｃ６アルキル基またはベンジル
基であり、前記アミド基のカルボキシル基に結合した基
はＣ１〜Ｃ６アルキル基、ベンジル、Ｈ、フエニル、ベ
ンジルオキシ、トリフルオロメチル、トリクロロメチル
またはトリフエニルメチル基である。
産α−アミノ酸の式を有するα−アミノ酸のＬ−異性体
を含む比較的容易に分離できる混合物で、Ｄ−異性体を
実質的に含まない前記Ｌ−異性体を含む混合物を製造す
る方法が提供され、その方法は前記α−アミノ酸のα−
アミド酸ヒドロカルビルエステル誘導体のＬ−およびＤ
−混合物を前記Ｌ−異性体のみの、前記アミド基および
前記Ｌ−エステルのエステル化カルボキシ基それぞれの
加水分解を促進するアシラーゼ触媒およびエステラーゼ
触媒の存在下に酵素的に加水分解し、前記加水分解を果
たし、前記Ｌ−α−アミノ酸異性体を前記Ｌ−α−アミ
ノ酸の鏡像体を実質的に含まない前記Ｄ−α−アミノ酸
エステル誘導体との混合物で回収することを含み、前記
ヒドロカルビルはＣ１〜Ｃ６アルキル基またはベンジル
基であり、前記アミド基のカルボキシル基に結合した基
はＣ１〜Ｃ６アルキル基、ベンジル、Ｈ、フエニル、ベ
ンジルオキシ、トリフルオロメチル、トリクロロメチル
またはトリフエニルメチル基である。
前記方法においてα−アミノ酸のヒドロカルビルエステ
ルは式： （式中、Ｘはα−アミノ酸エステルが誘導される天然産
α−アミノ酸の残基であり、Ｘに結合した炭素はキラル
であり、Ｒ′は前記ヒドロカルビル基であり、Ｒはもち
ろん前記アミド基のカルボニル基に結合した前記の基で
ある） を有する。もちろん、Ｘはまた実施例５および１０のよ
うに誘導体がまた保護された第２の酸基またはアミン基
を有するときに置換されている。例えば、所与例ではＸ
はキラル炭素に結合していないアミン基を含むことがで
き、またアミン基はそのようなアミン基のＨの１つまた
は両方を置換する−ＣＯＲ基を有することができ；同様
に追加のカルボン酸基のＨ原子はＲ′基により置換され
ることができる。たゞしＲおよびＲ′は前記のとおりで
ある。
ルは式： （式中、Ｘはα−アミノ酸エステルが誘導される天然産
α−アミノ酸の残基であり、Ｘに結合した炭素はキラル
であり、Ｒ′は前記ヒドロカルビル基であり、Ｒはもち
ろん前記アミド基のカルボニル基に結合した前記の基で
ある） を有する。もちろん、Ｘはまた実施例５および１０のよ
うに誘導体がまた保護された第２の酸基またはアミン基
を有するときに置換されている。例えば、所与例ではＸ
はキラル炭素に結合していないアミン基を含むことがで
き、またアミン基はそのようなアミン基のＨの１つまた
は両方を置換する−ＣＯＲ基を有することができ；同様
に追加のカルボン酸基のＨ原子はＲ′基により置換され
ることができる。たゞしＲおよびＲ′は前記のとおりで
ある。
Ｄ−異性体を含まないＬ−アミノ酸を製造するこの方法
には若干の利点が存在する。第１に、アシラーゼがアミ
ド基の加水分解を触媒するためにアミド基にアルファの
カルボキシル基を必要とするので、これはエステル基よ
りも非常に速い速度におけるその加水分解を自動的に妨
げ従ってＤ−およびＬ−異性体の化学的加水分解を生ず
る高い塩基性条件が妨げられる。一方エステラーゼによ
り促進される加水分解の速度がアシラーゼより非常に高
ければ、溶液は酸性になる傾向があるが、しかしpHが化
学的加水分解を触媒するのに十分低くなるはるかに前
に、pHがアシラーゼにより触媒されたアミド基の経続す
る加水分解により自動的に上がるまでpHが低すぎてエス
テラーゼが加水分解を触媒しない。もちろん理想的に
は、所与の場合にアシラーゼおよびエステラーゼの相対
量をアミド基およびエステル基の加水分解の速さが実質
的に等しいように調整することが好ましい。しかし、そ
のような場合でも、前記自動「緩衝」は小さな不均衡が
時間中非選択的化学加水解を促進する酸または塩基条件
の生ずるのを防止する。
には若干の利点が存在する。第１に、アシラーゼがアミ
ド基の加水分解を触媒するためにアミド基にアルファの
カルボキシル基を必要とするので、これはエステル基よ
りも非常に速い速度におけるその加水分解を自動的に妨
げ従ってＤ−およびＬ−異性体の化学的加水分解を生ず
る高い塩基性条件が妨げられる。一方エステラーゼによ
り促進される加水分解の速度がアシラーゼより非常に高
ければ、溶液は酸性になる傾向があるが、しかしpHが化
学的加水分解を触媒するのに十分低くなるはるかに前
に、pHがアシラーゼにより触媒されたアミド基の経続す
る加水分解により自動的に上がるまでpHが低すぎてエス
テラーゼが加水分解を触媒しない。もちろん理想的に
は、所与の場合にアシラーゼおよびエステラーゼの相対
量をアミド基およびエステル基の加水分解の速さが実質
的に等しいように調整することが好ましい。しかし、そ
のような場合でも、前記自動「緩衝」は小さな不均衡が
時間中非選択的化学加水解を促進する酸または塩基条件
の生ずるのを防止する。
前記の結果、緩衝剤を本発明の方法に使用できるけれど
も、それを使用する必要がなく、本発明の好ましい実施
において加水分解は緩衝剤の存在なく行なわれる。これ
はそれがこの方法の生成物から緩衝剤を分離する工程を
排除するので明らかに有利であろう。
も、それを使用する必要がなく、本発明の好ましい実施
において加水分解は緩衝剤の存在なく行なわれる。これ
はそれがこの方法の生成物から緩衝剤を分離する工程を
排除するので明らかに有利であろう。
もちろん本発明の主要利点はこの方法がＤ−アミノ酸の
ないＬ−アミノ酸を含む混合物を生ずることである。Ｎ
−アシル−α−アミノ酸エステルの一部もまた生成物混
合物中にあるけれども、２つの置換基の存在が溶解度、
結晶化特性および固体吸着剤に対する吸収を分離が容易
なほど異ならしめるのでこの誘導体は結晶化、溶媒抽
出、クロマトグラフなどの公知の方法により容易に分離
できる。
ないＬ−アミノ酸を含む混合物を生ずることである。Ｎ
−アシル−α−アミノ酸エステルの一部もまた生成物混
合物中にあるけれども、２つの置換基の存在が溶解度、
結晶化特性および固体吸着剤に対する吸収を分離が容易
なほど異ならしめるのでこの誘導体は結晶化、溶媒抽
出、クロマトグラフなどの公知の方法により容易に分離
できる。
本方法の他の利点はＮ−アシル−α−アミノ酸エステル
を、アミノ酸から分離した後公知方法によりラセミ化し
プロセスに再循環することができ、従って究極的に出発
物質誘導体の実質的にすべてがＬ−α−アミノ酸に転化
されることである。
を、アミノ酸から分離した後公知方法によりラセミ化し
プロセスに再循環することができ、従って究極的に出発
物質誘導体の実質的にすべてがＬ−α−アミノ酸に転化
されることである。
本発明の方法の実施において、エステラーゼは任意適当
なエステラーゼであることができる。エステラーゼはカ
ルボキシルエステラーゼ、α−キモトリプシンまたはエ
ステラーゼ活性を有する任意の他のプロテアーゼである
ことができる。アシラーゼは種々の系統のアミノアシラ
ーゼ、カルボキシルペプチダーゼまたは他のアシラーゼ
であることができる。出発物質Ｌ−およびＤ−α−アミ
ド酸エステルは通常適当な水性溶媒、水あるいは(1)０
〜５０体積％、通常０〜４０体積％の低級アルコール、
殊にメタノールまたはエタノール（あるいは両者）、あ
るいは(2)０〜４０体積％、通常０〜３０体積％のアセ
トンまたは０〜４０体積％、通常０〜３０体積％のアセ
トニトリルを含む極性有機溶媒を含有する水、中に溶解
される。好ましくは前記系のすべての下限は少くとも１
０体積％の有機溶媒が水溶液中に存在することである。
また明らかに極性溶媒の任意の混合物を水性系に使用で
きる。
なエステラーゼであることができる。エステラーゼはカ
ルボキシルエステラーゼ、α−キモトリプシンまたはエ
ステラーゼ活性を有する任意の他のプロテアーゼである
ことができる。アシラーゼは種々の系統のアミノアシラ
ーゼ、カルボキシルペプチダーゼまたは他のアシラーゼ
であることができる。出発物質Ｌ−およびＤ−α−アミ
ド酸エステルは通常適当な水性溶媒、水あるいは(1)０
〜５０体積％、通常０〜４０体積％の低級アルコール、
殊にメタノールまたはエタノール（あるいは両者）、あ
るいは(2)０〜４０体積％、通常０〜３０体積％のアセ
トンまたは０〜４０体積％、通常０〜３０体積％のアセ
トニトリルを含む極性有機溶媒を含有する水、中に溶解
される。好ましくは前記系のすべての下限は少くとも１
０体積％の有機溶媒が水溶液中に存在することである。
また明らかに極性溶媒の任意の混合物を水性系に使用で
きる。
Ｄ−およびＬ−Ｎ−アシルアミノ酸エステルの出発物質
混合物は通常溶媒中０．０５〜０．５Ｍの濃度であるけ
れども、より高い、またはより低い濃度を使用すること
ができる。
混合物は通常溶媒中０．０５〜０．５Ｍの濃度であるけ
れども、より高い、またはより低い濃度を使用すること
ができる。
バッチ反応としてプロセスを運転するとき酵素はそれぞ
れ通常反応混合物１当り１００〜５００単位の濃度で
反応混合物中に存在するが、しかしより高いおよびより
低い量を用いることができる。それらは通常技術的によ
く知られた方法により担体上に固定化されるが、しか
し、用いるアシラーゼと反応するエステラーゼが使用さ
れるときこれを防ぐためアシラーゼまたはエステラーゼ
を担体上に固定化させることを除いて必要ではない。ま
た両酵素を担体、各酵素に対して同じ担体または異なる
担体、上に固定化することが通常有利である。これは液
体反応生成物が簡単な濾過、沈降、遠心分離などにより
容易に酵素から除去される利点を有する。バッチ反応の
場合に担持酵素は洗浄して再び使用することができる。
固定化酵素を含む充てん床にα−アミド酸エステル溶液
を連続的に通すことにより加水分解を行なうときには触
媒床の洗浄が必要でもない。
れ通常反応混合物１当り１００〜５００単位の濃度で
反応混合物中に存在するが、しかしより高いおよびより
低い量を用いることができる。それらは通常技術的によ
く知られた方法により担体上に固定化されるが、しか
し、用いるアシラーゼと反応するエステラーゼが使用さ
れるときこれを防ぐためアシラーゼまたはエステラーゼ
を担体上に固定化させることを除いて必要ではない。ま
た両酵素を担体、各酵素に対して同じ担体または異なる
担体、上に固定化することが通常有利である。これは液
体反応生成物が簡単な濾過、沈降、遠心分離などにより
容易に酵素から除去される利点を有する。バッチ反応の
場合に担持酵素は洗浄して再び使用することができる。
固定化酵素を含む充てん床にα−アミド酸エステル溶液
を連続的に通すことにより加水分解を行なうときには触
媒床の洗浄が必要でもない。
反応をバッチ反応として行なうとき、反応時間は通常３
〜５０または１００時間であるが、しかし、より長いま
たはより短かい反応時間を用いることができ、反応時間
も、また反応条件の他の項目も決して発明の本質ではな
い。充てん塔中で連続的に運転するとき、適当な接触時
間は１０分〜４時間であるが、しかしまたより短かいま
たはより長い接触時間を用いることができる。
〜５０または１００時間であるが、しかし、より長いま
たはより短かい反応時間を用いることができ、反応時間
も、また反応条件の他の項目も決して発明の本質ではな
い。充てん塔中で連続的に運転するとき、適当な接触時
間は１０分〜４時間であるが、しかしまたより短かいま
たはより長い接触時間を用いることができる。
実施例１ この実施例に用いたアシラーゼ酵素の担体はOH基の酵素
により結合したジエチルアミノエチル基で置換された架
橋デキストランであった。それはシグマ・ケミカル社(S
igma Chemical Co.)、セント・ルーイス、ミゾリー州、
からＤＥＡＥセファデックス(Sephadex)樹脂、グレード
Ａ２５の名称でビーズ形態で入手した。この樹脂５ｇを
水５０ml中に懸濁した。かくはんしながら０．１Ｎ−Na
OH２５０mlを懸濁液に加えかくはんを３時間続けた。懸
濁液を濾過し、濾過ケークを脱イオン水で十分に洗浄し
た。次いで濾過ケークを０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液
（pH７．０）２５０ml中に懸濁して３時間かくはんし、
一夜放置した。
により結合したジエチルアミノエチル基で置換された架
橋デキストランであった。それはシグマ・ケミカル社(S
igma Chemical Co.)、セント・ルーイス、ミゾリー州、
からＤＥＡＥセファデックス(Sephadex)樹脂、グレード
Ａ２５の名称でビーズ形態で入手した。この樹脂５ｇを
水５０ml中に懸濁した。かくはんしながら０．１Ｎ−Na
OH２５０mlを懸濁液に加えかくはんを３時間続けた。懸
濁液を濾過し、濾過ケークを脱イオン水で十分に洗浄し
た。次いで濾過ケークを０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液
（pH７．０）２５０ml中に懸濁して３時間かくはんし、
一夜放置した。
約４０％のアシラーゼタンパク質を含むシグマ・ケミカ
ル社(Sigma Chemical Co.)、セント・ルーシイ、ミゾリ
ー州、からのアスペルギルス(Aspergillus)種からのア
ミノアシラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．５．１．１４）２００mg
を蒸留水８３mlに溶解して濾過した。前記処理したデキ
ストラン樹脂の懸濁液を濾過し、濾過ケークをアミノア
シラーゼを含む濾液中に分散した。混合物を室温で３時
間かくはんし、濾過した。濾過ケークを脱イオン水２５
０mlに分散し、１時間かくはんして濾過した。濾過ケー
クを０．２Ｍ酢酸ナトリウム２５０ml中に分散し、懸濁
液を１時間かくはんして濾過し、濾過ケークを脱イオン
水で数回洗浄した。水約１５ml中に懸濁した約５ｇの固
定化アシラーゼ（５０単位）、１０mM CoCl2 １ml、
およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）約１００
mg上に固定化したα−キモトリプシン５０単位を室温で
かくはんしながらメタノール３３体積％／水６７％の溶
液２０ml中のＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−フエニルアラニン
メチルエステル１．３２ｇの溶液に加えた。
ル社(Sigma Chemical Co.)、セント・ルーシイ、ミゾリ
ー州、からのアスペルギルス(Aspergillus)種からのア
ミノアシラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．５．１．１４）２００mg
を蒸留水８３mlに溶解して濾過した。前記処理したデキ
ストラン樹脂の懸濁液を濾過し、濾過ケークをアミノア
シラーゼを含む濾液中に分散した。混合物を室温で３時
間かくはんし、濾過した。濾過ケークを脱イオン水２５
０mlに分散し、１時間かくはんして濾過した。濾過ケー
クを０．２Ｍ酢酸ナトリウム２５０ml中に分散し、懸濁
液を１時間かくはんして濾過し、濾過ケークを脱イオン
水で数回洗浄した。水約１５ml中に懸濁した約５ｇの固
定化アシラーゼ（５０単位）、１０mM CoCl2 １ml、
およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）約１００
mg上に固定化したα−キモトリプシン５０単位を室温で
かくはんしながらメタノール３３体積％／水６７％の溶
液２０ml中のＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−フエニルアラニン
メチルエステル１．３２ｇの溶液に加えた。
ＣＭＣ上に固定化したα−キモトリプシンエステラーゼ
は前記シグマ・ケミカル社(Sigma Chemical Co.)から入
手した。
は前記シグマ・ケミカル社(Sigma Chemical Co.)から入
手した。
前記反応混合物のpHは７．５であり、pH調整は必要でな
かった。室温における加水分解反応３６時間後、反応混
合物を濾過して懸濁液から固体固定化酵素を除き、濾過
ケークをメタノール３３％、水６７％の溶液２０mlで２
回洗浄し、洗液および初めの濾液を合わせて約１５mlに
濃縮し、４℃に冷却し、その温度で一夜保持した。結晶
沈殿が生じ、濾過した。この結晶は１７０℃等温で操作
したキラルガスクロマトグラフカラム〔アルテク・アソ
シエーテス社(Alltech Associates Inc.)、デールフィ
ルド、イリノイ州、からのキラルシル(Chiralsil)−Val
III〕を用いてＮ−アセチル−Ｄ−フエニルアラニンメ
チルエステルと同定された。その結晶は９９％以上の純
度（光学純度）であった。濾液をエチルエーテル１０ml
で３回洗浄し、エーテル層を水−メタノール層から分離
し、蒸発させるとＮ−アセチルフエニルアラニンメチル
エステルの結晶（薄層クロマトグラフィーおよび旋光測
定を用いて２５％Ｌ、７５％Ｄ）が得られた。Ｄ−フエ
ニルアラニンは生成物のこの部分中に検出されなかっ
た。
かった。室温における加水分解反応３６時間後、反応混
合物を濾過して懸濁液から固体固定化酵素を除き、濾過
ケークをメタノール３３％、水６７％の溶液２０mlで２
回洗浄し、洗液および初めの濾液を合わせて約１５mlに
濃縮し、４℃に冷却し、その温度で一夜保持した。結晶
沈殿が生じ、濾過した。この結晶は１７０℃等温で操作
したキラルガスクロマトグラフカラム〔アルテク・アソ
シエーテス社(Alltech Associates Inc.)、デールフィ
ルド、イリノイ州、からのキラルシル(Chiralsil)−Val
III〕を用いてＮ−アセチル−Ｄ−フエニルアラニンメ
チルエステルと同定された。その結晶は９９％以上の純
度（光学純度）であった。濾液をエチルエーテル１０ml
で３回洗浄し、エーテル層を水−メタノール層から分離
し、蒸発させるとＮ−アセチルフエニルアラニンメチル
エステルの結晶（薄層クロマトグラフィーおよび旋光測
定を用いて２５％Ｌ、７５％Ｄ）が得られた。Ｄ−フエ
ニルアラニンは生成物のこの部分中に検出されなかっ
た。
水層を蒸発して殆んど乾固させると生成物４３０mg、約
８７％収率、が得られた。薄層クロマトグラフィーおよ
び光学純度測定によりこの沈殿の９７％以上がＬ−フエ
ニルアラニンで残部がＮ−アセチルフエニルアラニンで
残部がＮ−アセチルフエニルアラニンメチルエステルで
あることが立証された。検出できるＤ−フエニルアラニ
ンは生成物のこの部分中に存在しなかった。
８７％収率、が得られた。薄層クロマトグラフィーおよ
び光学純度測定によりこの沈殿の９７％以上がＬ−フエ
ニルアラニンで残部がＮ−アセチルフエニルアラニンで
残部がＮ−アセチルフエニルアラニンメチルエステルで
あることが立証された。検出できるＤ−フエニルアラニ
ンは生成物のこの部分中に存在しなかった。
反応の生成物のどの部分中にもＤ−フエニルアラニンは
検出されなかった。従って加水分解反応はＬ−フエニル
アラニンおよびＤ−アセチルフエニルアラニンメチルエ
ステルを含むが、しかしＤ−フエニルアラニンを含まな
い混合物を生じた。
検出されなかった。従って加水分解反応はＬ−フエニル
アラニンおよびＤ−アセチルフエニルアラニンメチルエ
ステルを含むが、しかしＤ−フエニルアラニンを含まな
い混合物を生じた。
実施例２〜３８ 実施例１と同様に、表１の第１蘭に示したラセミ−α−
Ｎ−アシル−α−アミノ酸エステル（α−アミド酸エス
テル）のそれぞれを酵素加水分解にかけるとＬ−α−ア
ミド酸エステルのみが、そのα−アミド基およびそのヒ
ドロカルビルカルボキシ基の加水分解により選択的に転
化し、従って相当するα−アミノ酸のＬ−異性体および
未変化Ｄ−α−Ｎ−アシルアミノ酸エステルを含み、Ｄ
−α−アミノ酸を含まない混合物が生ずる。これらの実
施例において用いたアシラーゼは実施例１に用いたと同
様で同じ担体上に固定化される。各実施例に用いた個々
のエステラーゼは表１の第２欄に示される。
Ｎ−アシル−α−アミノ酸エステル（α−アミド酸エス
テル）のそれぞれを酵素加水分解にかけるとＬ−α−ア
ミド酸エステルのみが、そのα−アミド基およびそのヒ
ドロカルビルカルボキシ基の加水分解により選択的に転
化し、従って相当するα−アミノ酸のＬ−異性体および
未変化Ｄ−α−Ｎ−アシルアミノ酸エステルを含み、Ｄ
−α−アミノ酸を含まない混合物が生ずる。これらの実
施例において用いたアシラーゼは実施例１に用いたと同
様で同じ担体上に固定化される。各実施例に用いた個々
のエステラーゼは表１の第２欄に示される。
これらの実施例においてα−アミド酸エステル６ミリモ
ルを体積で３０％のメタノール−７０％の水の溶液２０
ml中に分散させる。実施例３、４、１１、２２および３
４ではpHは希酢酸をそれに加えることにより約７．８に
調製する。次いですべての実施例において１０mM CoCl
2 ２mlおよびアミノアシラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．５．
１．１４）４００mgすなわち１００単位を固定化したジ
エチルアミノエチル基で置換した架橋デキストラン１０
ｇに加えて表１の第２欄に示したエステラーゼ１００単
位を加える。これらの実施例に用いたアシラーゼは実施
例１に用いたと同様である。次に反応混合物をかくはん
し、５０℃の温度に加熱し、その温度で、薄層クロマト
グラフィーが出発物質の実質的な転化が行なわれたこと
を示すまで保持する。その後反応混合物を濾過して担持
酵素を除き、加水分解から生じたＬ−α−アミノ酸をＤ
−Ｎ−アシル−α−アミノ酸エステル出発物質との混合
物で含む濾液が得られ、その混合物はＤ−α−アミノ酸
鏡像体を含まない。
ルを体積で３０％のメタノール−７０％の水の溶液２０
ml中に分散させる。実施例３、４、１１、２２および３
４ではpHは希酢酸をそれに加えることにより約７．８に
調製する。次いですべての実施例において１０mM CoCl
2 ２mlおよびアミノアシラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．５．
１．１４）４００mgすなわち１００単位を固定化したジ
エチルアミノエチル基で置換した架橋デキストラン１０
ｇに加えて表１の第２欄に示したエステラーゼ１００単
位を加える。これらの実施例に用いたアシラーゼは実施
例１に用いたと同様である。次に反応混合物をかくはん
し、５０℃の温度に加熱し、その温度で、薄層クロマト
グラフィーが出発物質の実質的な転化が行なわれたこと
を示すまで保持する。その後反応混合物を濾過して担持
酵素を除き、加水分解から生じたＬ−α−アミノ酸をＤ
−Ｎ−アシル−α−アミノ酸エステル出発物質との混合
物で含む濾液が得られ、その混合物はＤ−α−アミノ酸
鏡像体を含まない。
実施例５および１０では出発物質が第２のエステル基を
有するのでα−アミノ酸生成物はそれぞれ である。
有するのでα−アミノ酸生成物はそれぞれ である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マーク クラーク セサ アメリカ合衆国 オハイオ州 44121 サ ウス ユークリツド バーチウオールド ロード 4617
Claims (3)
- 【請求項１】アルファ炭素原子がキラルである天然産α
−アミノ酸の式を有するα−アミノ酸のα−アミノ酸ヒ
ドロカルビルエステル誘導体であって前記ヒドロカルビ
ルがＣ１〜Ｃ６アルキル基またはベンジル基であり、前
記アミド基のカルボニル炭素に結合した基がＣ１〜Ｃ６
アルキル基、ベンジル、Ｈ、フエニル、ベンジルオキ
シ、トリフルオロメチル、トリクロロメチルまたはトリ
フエニルメチル基である誘導体のＬおよびＤ混合物のＬ
−異性体を、アシラーゼ触媒およびエステラーゼ触媒の
存在下に選択的に酵素的に加水分解して前記Ｌ−エステ
ルのみの前記アルファアミド基およびエステル化カルボ
キシ基のそれぞれの加水分解を促進し、前記加水分解を
前記アシラーゼ触媒および前記エステラーゼ触媒によっ
て果たし、生じたＬ−α−アミノ酸を前記Ｄ−α−アミ
ド酸ヒドロカルビルエステル誘導体との混合物であって
前記Ｌ−α−アミノ酸のＤ−α−アミノ酸鏡像体を実質
的に含まない混合物で回収することを含む方法。 - 【請求項２】両酵素が固体担体上に固定化される、特許
請求の範囲第(1)項記載の方法。 - 【請求項３】酵素の少なくとも一つが固体担体上に固定
化される、特許請求の範囲第(1)項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/670,255 US4670395A (en) | 1984-11-13 | 1984-11-13 | Enantioselective hydrolysis of N-acylamino acid esters using a combined enzyme system |
| US670255 | 1996-06-20 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61119198A JPS61119198A (ja) | 1986-06-06 |
| JPH0657158B2 true JPH0657158B2 (ja) | 1994-08-03 |
Family
ID=24689646
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60248675A Expired - Lifetime JPH0657158B2 (ja) | 1984-11-13 | 1985-11-06 | 複合酵素系を使用するｎ‐アシルアミノ酸エステルのエナンチオ選択性加水分解 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4670395A (ja) |
| EP (1) | EP0182517B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0657158B2 (ja) |
| KR (1) | KR930006992B1 (ja) |
| BR (1) | BR8505500A (ja) |
| CA (1) | CA1236787A (ja) |
| DE (1) | DE3582016D1 (ja) |
| ES (1) | ES8706100A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102628076A (zh) * | 2012-02-27 | 2012-08-08 | 滨海瀚鸿生化有限公司 | 一种手性氨基酸的制备工艺 |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3687421T2 (de) * | 1985-04-09 | 1993-08-19 | Kuraray Co | Verfahren zur herstellung von l-phenylalanin. |
| US5037741A (en) * | 1986-08-18 | 1991-08-06 | The Coca Cola Company | Enzymatic method for the synthesis and separation of peptides |
| JPH01228488A (ja) * | 1988-03-09 | 1989-09-12 | Fuji Yakuhin Kogyo Kk | パントテン酸またはその塩の製造法 |
| US4980065A (en) * | 1989-10-18 | 1990-12-25 | Lehigh University | Separation of mixtures by aqueous two-phase systems |
| US5078886A (en) * | 1989-10-18 | 1992-01-07 | Lehigh University | Separation of mixtures by two-phase systems |
| US5275950A (en) * | 1990-05-11 | 1994-01-04 | Abbott Laboratories | Process for the preparation of a renin inhibiting compound |
| WO1999037754A2 (en) * | 1998-01-26 | 1999-07-29 | Pharm-Eco Laboratories, Inc. | Enzyme activated supports for enantiomeric separations |
| DK1148140T3 (da) * | 2000-04-19 | 2007-01-08 | Basilea Pharmaceutica Ag | Fremgangsmåde til fremstilling af D-asparaginderivater |
| KR100973710B1 (ko) | 2008-04-23 | 2010-08-04 | 엔자이텍 주식회사 | 효소적 방법에 의한 광학활성 엔-치환된 페닐글리신 알킬에스테르의 제조 방법 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE1236520B (de) * | 1965-06-11 | 1967-03-16 | Dr Habil Meinhart Hans Zenk | Verfahren zur Auftrennung von isotopmarkierten Aminosaeureazematen in ihre D- und L-Antipoden |
| US3386888A (en) * | 1965-07-15 | 1968-06-04 | Tanabe Seiyaku Co | Resolution of racemic amino acids |
| US3816254A (en) * | 1970-02-03 | 1974-06-11 | Tanabe Seiyaku Co | Optical resolution of racemic amino acids |
| CA947214A (en) * | 1971-04-02 | 1974-05-14 | Antoine D'iorio | Resolution of racemates of ring-substituted phenylalanines |
| US3878043A (en) * | 1973-01-02 | 1975-04-15 | Univ Southern Illinois | Method for preparing L-dopa and novels compounds useful therein |
| US3963573A (en) * | 1975-03-03 | 1976-06-15 | The Procter & Gamble Company | Process for producing N-acyl-L-methionine |
| JPS5332194A (en) * | 1976-09-08 | 1978-03-27 | Sumitomo Chem Co Ltd | Resolution of dl-lysine |
| DE2807286A1 (de) * | 1978-02-21 | 1979-08-23 | Bayer Ag | Stereoselektive spaltung von phenylglycinderivaten und 4-hydroxyphenylglycinderivaten mit enzymharzen |
| US4262092A (en) * | 1979-05-08 | 1981-04-14 | Ethyl Corporation | Process for producing N-acyl-D-phenylalanine ester |
| US4259441A (en) * | 1979-09-17 | 1981-03-31 | Ethyl Corporation | Process for resolving D, L-leucine |
-
1984
- 1984-11-13 US US06/670,255 patent/US4670395A/en not_active Expired - Fee Related
-
1985
- 1985-10-11 CA CA000492797A patent/CA1236787A/en not_active Expired
- 1985-10-25 EP EP85307725A patent/EP0182517B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-10-25 DE DE8585307725T patent/DE3582016D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1985-11-04 BR BR8505500A patent/BR8505500A/pt unknown
- 1985-11-06 JP JP60248675A patent/JPH0657158B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-11-12 ES ES548782A patent/ES8706100A1/es not_active Expired
- 1985-11-12 KR KR1019850008422A patent/KR930006992B1/ko active IP Right Grant
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102628076A (zh) * | 2012-02-27 | 2012-08-08 | 滨海瀚鸿生化有限公司 | 一种手性氨基酸的制备工艺 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA1236787A (en) | 1988-05-17 |
| US4670395A (en) | 1987-06-02 |
| EP0182517A2 (en) | 1986-05-28 |
| DE3582016D1 (de) | 1991-04-11 |
| KR860003996A (ko) | 1986-06-16 |
| BR8505500A (pt) | 1986-08-05 |
| EP0182517B1 (en) | 1991-03-06 |
| JPS61119198A (ja) | 1986-06-06 |
| KR930006992B1 (ko) | 1993-07-26 |
| EP0182517A3 (en) | 1987-04-29 |
| ES548782A0 (es) | 1987-06-01 |
| ES8706100A1 (es) | 1987-06-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR20110025917A (ko) | ５－메틸－３－니트로메틸－헥산산 에스테르의 입체선택적 효소 가수분해 방법 | |
| EP0089886B1 (fr) | Procédé de préparation d'un alpha-amino-acide libre L | |
| JPH0657158B2 (ja) | 複合酵素系を使用するｎ‐アシルアミノ酸エステルのエナンチオ選択性加水分解 | |
| JP3010497B2 (ja) | 光学活性α―ヒドロキシエステル類の製造方法 | |
| JP3704719B2 (ja) | 光学活性３−アミノブタン酸の製造法及びそのエステル中間体 | |
| JP3140549B2 (ja) | α−置換カルボン酸の光学異性体の分離法 | |
| US5278054A (en) | Process for the enzymatic hydrolysis of a carboxylic acid derivative | |
| JP3160879B2 (ja) | 光学活性アミノ酸誘導体の製法 | |
| KR950005425B1 (ko) | 효소를 이용한 2-아미노부탄올 광학이성질체의 분리방법 | |
| US5202260A (en) | Resolution of α-tertiary carboxylic acid esters using lipase from Candida lipolytica | |
| JP2003325195A (ja) | エナンチオマー豊富化したＮ−保護されていないβ−アミノ酸の酵素的製造方法、β−アミノ酸−ｎ−プロピルエステル及びその使用 | |
| JP3819082B2 (ja) | 光学活性３−ｎ置換アミノイソ酪酸類およびその塩ならびにそれらの製造方法 | |
| US4731476A (en) | Process for the separation of L-leucine and L-isoleucine | |
| EP0512848A2 (en) | Enzymatic resolution of alpha-tertiary carboxylic acid esters | |
| JP2939342B2 (ja) | ３，３−ジエチル−４−［（４−カルボキシ）フェノキシ］−２−アゼチジノンエステルの酵素加水分解 | |
| JPH01120298A (ja) | 光学的に純粋なホモフエニルアラニンの製法 | |
| JP3704731B2 (ja) | 光学活性３−ヒドロキシヘキサン酸類の製造方法 | |
| EP1687270A1 (en) | Method for preparing (s)-indoline-2-carboxylic acid and (s)-indoline-2-carboxylic acid methyl ester using hydrolytic enzyme | |
| EP1487990A2 (en) | Process for preparing optically active beta-aminocarboxylic acids from racemic n-acylated beta-aminocarboxylic acids | |
| JP2000023693A (ja) | 光学活性な２−アセチルチオ−３−フェニルプロピオン酸の製造方法 | |
| JPWO2009099140A1 (ja) | 光学活性インドリン−２−カルボン酸類またはその誘導体の製造方法 | |
| JP5329973B2 (ja) | リパーゼ触媒を用いるエナンチオ選択的アシル化とその後の硫酸による沈殿によって、ラセミ体の４−（１−アミノエチル）安息香酸メチルエステルから（ｒ）−および（ｓ）−４−（１−アンモニウムエチル）安息香酸メチルエステル硫酸塩を調製する方法 | |
| JP3010382B2 (ja) | （ｒ）−２−プロポキシベンゼン誘導体の製造法 | |
| HUT63658A (en) | Process for reducing the enantioselectivity of candida lipase and for producing immobilized candida lipase | |
| JP2899404B2 (ja) | （ｒ）―２―ヒドロキシ―４―フエニル酪酸の製造方法 |