JP2939342B2 - ３，３−ジエチル−４−［（４−カルボキシ）フェノキシ］−２−アゼチジノンエステルの酵素加水分解 - Google Patents
３，３−ジエチル−４−［（４−カルボキシ）フェノキシ］−２−アゼチジノンエステルの酵素加水分解Info
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- C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 ヨーロッパ特許出願公開第595,557号（1994年５月４
日公開）は、抗炎症剤及び抗変性剤として有用である、
有効なエラスターゼ阻害剤としての一般式１の新規な置
換アゼチジノンを開示している。これらの化合物は、結
合組織破壊を起こす炎症状態、例えば、慢性関節リュー
マチ、肺気腫、気管支炎、慢性気管支炎、糸球体腎炎、
変形関節症、脊椎炎、狼そう、乾せん、アテローム性動
脈硬化症、セプシス、敗血症、ショック、心筋梗塞、再
潅流性損傷（reperfusion injury）、歯周炎、膵嚢胞性
線維症及び急性呼吸障害症候群の治療に用い得る。
日公開）は、抗炎症剤及び抗変性剤として有用である、
有効なエラスターゼ阻害剤としての一般式１の新規な置
換アゼチジノンを開示している。これらの化合物は、結
合組織破壊を起こす炎症状態、例えば、慢性関節リュー
マチ、肺気腫、気管支炎、慢性気管支炎、糸球体腎炎、
変形関節症、脊椎炎、狼そう、乾せん、アテローム性動
脈硬化症、セプシス、敗血症、ショック、心筋梗塞、再
潅流性損傷（reperfusion injury）、歯周炎、膵嚢胞性
線維症及び急性呼吸障害症候群の治療に用い得る。
EP595,557号に開示されている化合物のサブクラス
は、上記式中、Ｒ及びR1がそれぞれエチルであり、R4が
カルボキサミドのようなカルボン酸誘導体であり、アゼ
チジノン環の第４炭素の絶対配置がＳ（1a）である化合
物である。
は、上記式中、Ｒ及びR1がそれぞれエチルであり、R4が
カルボキサミドのようなカルボン酸誘導体であり、アゼ
チジノン環の第４炭素の絶対配置がＳ（1a）である化合
物である。
これらの化合物の例としては式２の化合物がある。
式1aの化合物の合成には、式Ｉのキラル中間体を必要
とする。
とする。
キラル化合物Ｉは、ラセミ混合物から光学的に活性の
塩基との塩を形成し、次いで、得られたジアステレオマ
ーを例えば分別結晶して分離するような慣用の化学的方
法を用いて得ることができる。しかし、一般に化学的分
割法は単調であきあきするほど時間がかかるので、キラ
ル化合物Ｉを製造するためのより便利な方法が利用でき
れば有利であろう。
塩基との塩を形成し、次いで、得られたジアステレオマ
ーを例えば分別結晶して分離するような慣用の化学的方
法を用いて得ることができる。しかし、一般に化学的分
割法は単調であきあきするほど時間がかかるので、キラ
ル化合物Ｉを製造するためのより便利な方法が利用でき
れば有利であろう。
発明の要旨 本発明は、（4S）−3,3−ジエチル−４−［（４−カ
ルボキシ）フェノキシ］−２−アゼチジノン酸を対応エ
ステルのラセミ混合物から製造するためのエナンチオ選
択的方法を提供する。
ルボキシ）フェノキシ］−２−アゼチジノン酸を対応エ
ステルのラセミ混合物から製造するためのエナンチオ選
択的方法を提供する。
発明の詳細の説明 本発明は、高エナンチオマー過剰率で光学的に活性の
酸を製造するためのエステルの酵素加水分解に関する。
より具体的に言えば、本発明は、式I: のアゼチジノン酸の（Ｓ）−エナンチオマーの新規な製
造法を提供し、該方法は、式II: （式中、Ｒは、ベンジル及びC1−C8アルキルからなる群
から選択される） のアゼチジノンエステルのラセミ混合物を、プソイドモ
ナス属から得たリパーゼと接触させるステップ、及び前
記（Ｓ）アゼチジノン酸を回収するステップを含む。
酸を製造するためのエステルの酵素加水分解に関する。
より具体的に言えば、本発明は、式I: のアゼチジノン酸の（Ｓ）−エナンチオマーの新規な製
造法を提供し、該方法は、式II: （式中、Ｒは、ベンジル及びC1−C8アルキルからなる群
から選択される） のアゼチジノンエステルのラセミ混合物を、プソイドモ
ナス属から得たリパーゼと接触させるステップ、及び前
記（Ｓ）アゼチジノン酸を回収するステップを含む。
好ましい実施例様において、式IIの化合物のＲは、ベ
ンジル、メチル、プロピル又はヘキシルである。
ンジル、メチル、プロピル又はヘキシルである。
別の好ましい実施態様において、リパーゼは、Amano
International Enzyme Co.（Troy,Virginia、USA）
から入手し得るリポタンパク質リパーゼPSである。Ｒが
ベンジルであればなお好ましい。
International Enzyme Co.（Troy,Virginia、USA）
から入手し得るリポタンパク質リパーゼPSである。Ｒが
ベンジルであればなお好ましい。
別の好ましい実施態様において、リパーゼはプソイド
モナス MB5001（ATCC 55162）由来である。
モナス MB5001（ATCC 55162）由来である。
他の好ましい実施態様において、酵素加水分解は界面
活性剤の存在下に行われる。界面活性剤が、アルキルア
リールポリエーテルアルコールなどの非イオン性界面活
性剤、例えば、Triton Ｘ−100（Sigma Chemical C
o.から入手可能）のようなオクチルフェノキシポリエト
キシエタノールであればなお好ましい。
活性剤の存在下に行われる。界面活性剤が、アルキルア
リールポリエーテルアルコールなどの非イオン性界面活
性剤、例えば、Triton Ｘ−100（Sigma Chemical C
o.から入手可能）のようなオクチルフェノキシポリエト
キシエタノールであればなお好ましい。
本発明の方法は、高い光学純度で式Ｉの化合物を効率
的に製造する方法を提供する。
的に製造する方法を提供する。
反応対象物の製造 反応対象物である式IIのアゼチジノンエステルは、米
国特許第5,229,381号に開示されている一般法に従って
製造し得、例えばベンジルエステルの場合には以下に概
略的に示されているように製造し得る。
国特許第5,229,381号に開示されている一般法に従って
製造し得、例えばベンジルエステルの場合には以下に概
略的に示されているように製造し得る。
即ち、2,2−ジエチルビニルプロピオネートとクロロ
スルホニルイソシアネートを反応させて、3,3−ジエチ
ル−４−プロピオニルキシ−２−アゼチジノンのラセミ
混合物を得る。次いで、水酸化ナトリウムのような塩基
の存在下に、該プロピオネートを４−ヒドロキシ安息香
酸ベンジルと反応させて、3,3−ジエチル−４−［（４
−ベンジルオキシカルボニル）フェノキシ］−２−アゼ
チジノンを得る。
スルホニルイソシアネートを反応させて、3,3−ジエチ
ル−４−プロピオニルキシ−２−アゼチジノンのラセミ
混合物を得る。次いで、水酸化ナトリウムのような塩基
の存在下に、該プロピオネートを４−ヒドロキシ安息香
酸ベンジルと反応させて、3,3−ジエチル−４−［（４
−ベンジルオキシカルボニル）フェノキシ］−２−アゼ
チジノンを得る。
リパーゼ源 本発明の方法はプソイドモナス属由来のリパーゼの用
いて実施し得る。本発明者らは、式Ｉの（Ｓ）エナンチ
オマーを得るために式IIの化合物を立体選択的に加水分
解し得る２種の好ましいリパーゼを発見した。該リパー
ゼの１つは、ブダペスト条約に従ってAmerican Type
Culture Collection,12301 Parklawan Drive,Rocvil
le,MDにATCC番号55162として寄託され、Merck Culture
CellectionにMB 5001として寄託されている、Pseudo
monas aeruginosa MB5001から得られる。この微生物
からのリパーゼの産生、分離、精製及び特性決定は以下
の文献に記載されている： （１）Chartrain,M.et al“Purification and charactr
ization of a novel bioconverting lipase from Pseud
omonas aeruginosa MB 5001"Enzyme Microb.Technol.,1
993,15:575−580. （２）Katz L.et al "Screening and selection of a m
icrobial lipase for the sterespecific hydrolysis o
f Verlukast"J.Indust.Microbiology,1993,11:89−94. （３）Marcin C.et al“Optimization of lipase produ
ction by Pseudomonas aeruginosa MB 5001 in batch c
ultivation"J.Indust.Microbiology,1993,12:29−34. （４）Chartrain M.et al“Enhancement of lipase pro
duction during fedbath cultivation of Pseudomonas
aeruginose MB5001"J.Fermentation and Bioengineerin
g,1993,76:487−492. （５）Goklen,K.E.et al“Development of crossflow f
iltration processes for the commercial−soale isol
ation of a bacterial lipase"Bioprocess Engineerin
g,1994,11:49−56. 本発明の方法に有用な第２の好ましいリパーゼは、プ
ソイドモナス属由来であり、リパーゼPSとして商標Aman
o（Amano International Enzyme Co.,Inc.,Troy,Vir
ginia）の下に販売されている市販のリパーゼ製剤であ
る。
いて実施し得る。本発明者らは、式Ｉの（Ｓ）エナンチ
オマーを得るために式IIの化合物を立体選択的に加水分
解し得る２種の好ましいリパーゼを発見した。該リパー
ゼの１つは、ブダペスト条約に従ってAmerican Type
Culture Collection,12301 Parklawan Drive,Rocvil
le,MDにATCC番号55162として寄託され、Merck Culture
CellectionにMB 5001として寄託されている、Pseudo
monas aeruginosa MB5001から得られる。この微生物
からのリパーゼの産生、分離、精製及び特性決定は以下
の文献に記載されている： （１）Chartrain,M.et al“Purification and charactr
ization of a novel bioconverting lipase from Pseud
omonas aeruginosa MB 5001"Enzyme Microb.Technol.,1
993,15:575−580. （２）Katz L.et al "Screening and selection of a m
icrobial lipase for the sterespecific hydrolysis o
f Verlukast"J.Indust.Microbiology,1993,11:89−94. （３）Marcin C.et al“Optimization of lipase produ
ction by Pseudomonas aeruginosa MB 5001 in batch c
ultivation"J.Indust.Microbiology,1993,12:29−34. （４）Chartrain M.et al“Enhancement of lipase pro
duction during fedbath cultivation of Pseudomonas
aeruginose MB5001"J.Fermentation and Bioengineerin
g,1993,76:487−492. （５）Goklen,K.E.et al“Development of crossflow f
iltration processes for the commercial−soale isol
ation of a bacterial lipase"Bioprocess Engineerin
g,1994,11:49−56. 本発明の方法に有用な第２の好ましいリパーゼは、プ
ソイドモナス属由来であり、リパーゼPSとして商標Aman
o（Amano International Enzyme Co.,Inc.,Troy,Vir
ginia）の下に販売されている市販のリパーゼ製剤であ
る。
エステルの立体選択的加水分解 式IIのエステルの酵素加水分解は、リパーゼの酵素活
性に悪影響を与えない条件又は所望の最終生成物の製造
を妨げないような条件下に行う。例えば、該反応は、約
6.5〜約9.0のpHを有する緩衝溶液中のようなややアルカ
リ性の環境下に行う。典型的には、pHが約7.7のリン酸
緩衝液を用いる。反応温度は、約25〜約50℃、好ましく
は約37〜約40℃であってよい。反応混合物に界面活性剤
を添加して反応対象物を可溶化する。好ましい界面活性
剤は、アルキルアリールポリエーテルアルコールなどの
ような非イオン性界面活性剤である。より好ましい界面
活性剤はTriton Ｘ−100（Sigma Chemical Co.から
入手可能）という商標名で市販されているオクチルフェ
ノキシポリエトキシエタノールである。反応混合物を撹
拌して反応対象物と酵素を確実に接触させる。十分な量
の所望の（Ｓ）アゼチジノン酸を十分な光学純度で生成
させるのに十分な時間酵素加水分解を進行させる。該反
応時間は、典型的には約72〜約96時間、好ましくは約96
時間である。生成された所望の酸の量及び該酸の光学活
性をHPLC及びキラルHPLCでモニターし得る。
性に悪影響を与えない条件又は所望の最終生成物の製造
を妨げないような条件下に行う。例えば、該反応は、約
6.5〜約9.0のpHを有する緩衝溶液中のようなややアルカ
リ性の環境下に行う。典型的には、pHが約7.7のリン酸
緩衝液を用いる。反応温度は、約25〜約50℃、好ましく
は約37〜約40℃であってよい。反応混合物に界面活性剤
を添加して反応対象物を可溶化する。好ましい界面活性
剤は、アルキルアリールポリエーテルアルコールなどの
ような非イオン性界面活性剤である。より好ましい界面
活性剤はTriton Ｘ−100（Sigma Chemical Co.から
入手可能）という商標名で市販されているオクチルフェ
ノキシポリエトキシエタノールである。反応混合物を撹
拌して反応対象物と酵素を確実に接触させる。十分な量
の所望の（Ｓ）アゼチジノン酸を十分な光学純度で生成
させるのに十分な時間酵素加水分解を進行させる。該反
応時間は、典型的には約72〜約96時間、好ましくは約96
時間である。生成された所望の酸の量及び該酸の光学活
性をHPLC及びキラルHPLCでモニターし得る。
用いられるリパーゼの量は、約５〜約50g/L、好まし
くは約15〜25g/Lである。反応対象物の濃度は0.1〜約45
g/Lであってよい。界面活性剤は、約0.05〜約５容量
％、好ましくは約0.1〜約0.5容量％を用い得る。酵素
は、該酵素を産生する微生物から分離した市販形態の粗
製剤を用いてもよいし、固体担体上に固定化されていて
もよい。
くは約15〜25g/Lである。反応対象物の濃度は0.1〜約45
g/Lであってよい。界面活性剤は、約0.05〜約５容量
％、好ましくは約0.1〜約0.5容量％を用い得る。酵素
は、該酵素を産生する微生物から分離した市販形態の粗
製剤を用いてもよいし、固体担体上に固定化されていて
もよい。
所望の加水分解生成物、反応しなかった反応対象物の
エステル、及び酵素は、濾過、クロマトグラフィー、結
晶化又はその組合わせのような慣用の手法を用いて加水
分解混合物から回収し得る。回収した酵素はその後の加
水分解に用いることができ、回収したエステルはラセミ
化して再使用することもできる。
エステル、及び酵素は、濾過、クロマトグラフィー、結
晶化又はその組合わせのような慣用の手法を用いて加水
分解混合物から回収し得る。回収した酵素はその後の加
水分解に用いることができ、回収したエステルはラセミ
化して再使用することもできる。
本発明の酵素加水分解は、反応対象物として式IIのベ
ンジルエステルを用い、酵素としてAmano リパーゼPS
−800を用い、以下のように行う。この場合の加水分解
では、約96時間後には酵素活性が低下して酸の生成が有
意に減少する動力学的プロフィールが示される。さら
に、所望の酸の生成におけるエナンチオ選択性のプロフ
ィールは、エナンチオマー過剰率が初期の約95％から７
日間の加水分解実験後の約88％まで漸進的な低下を示
す。反応対象物と酵素の上記組み合わせを用い高エナン
チオ選択性（約93％e.e.）をもって酸を生成（約25％）
させるのに最適な加水分解の時間サイクルは約96時間で
ある。
ンジルエステルを用い、酵素としてAmano リパーゼPS
−800を用い、以下のように行う。この場合の加水分解
では、約96時間後には酵素活性が低下して酸の生成が有
意に減少する動力学的プロフィールが示される。さら
に、所望の酸の生成におけるエナンチオ選択性のプロフ
ィールは、エナンチオマー過剰率が初期の約95％から７
日間の加水分解実験後の約88％まで漸進的な低下を示
す。反応対象物と酵素の上記組み合わせを用い高エナン
チオ選択性（約93％e.e.）をもって酸を生成（約25％）
させるのに最適な加水分解の時間サイクルは約96時間で
ある。
Triton Ｘ−100の存在下に37℃で水性リン酸緩衝液
中で行われる加水分解では、ベンジルエステルと酵素は
不均一であるが、生成された酸とベンジルアルコールは
可溶化される。96時間熟成させた後の加水分解混合物
を、濾紙を敷いた粗いガラス漏斗を介して濾過すると、
ベンジルエステルが容易に除去された。次いで、混合物
をMilliporeの10キロダルトン再生セルロースフィルタ
ーカートリッジを通して濾過すると、酵素は保持され、
所望の（Ｓ）酸、リン酸緩衝液、Triton Ｘ−100及び
ベンジルアコールを含む水溶液は透過された。塩、Trit
on Ｘ−100及びベンジルアルコールを含まない酵素を
回収したが、該酵素は、オリーブ油アッセイによれば、
初期活性の＞90％を保持しており、そのまま再使用し得
るものであった。水性透過体には酵素活性がほとんど保
持されていなかった酵素を30kDのフィルターカートリッ
ジを通して濾過すると、酵素活性は保持体と透過体とに
等分に分配された。
中で行われる加水分解では、ベンジルエステルと酵素は
不均一であるが、生成された酸とベンジルアルコールは
可溶化される。96時間熟成させた後の加水分解混合物
を、濾紙を敷いた粗いガラス漏斗を介して濾過すると、
ベンジルエステルが容易に除去された。次いで、混合物
をMilliporeの10キロダルトン再生セルロースフィルタ
ーカートリッジを通して濾過すると、酵素は保持され、
所望の（Ｓ）酸、リン酸緩衝液、Triton Ｘ−100及び
ベンジルアコールを含む水溶液は透過された。塩、Trit
on Ｘ−100及びベンジルアルコールを含まない酵素を
回収したが、該酵素は、オリーブ油アッセイによれば、
初期活性の＞90％を保持しており、そのまま再使用し得
るものであった。水性透過体には酵素活性がほとんど保
持されていなかった酵素を30kDのフィルターカートリッ
ジを通して濾過すると、酵素活性は保持体と透過体とに
等分に分配された。
透過体からの（Ｓ）酸の分離は、水性相のpHを５％リ
ン酸で５に調整し、塩化ナトリウムを添加した後、酢酸
イソプロピルで抽出して行った。ｔ−ブチルメチルエー
テル（MTBE）から蒸発、結晶化して、エナンチオマー過
剰率93％で酸２を回収した（回数率90％）。
ン酸で５に調整し、塩化ナトリウムを添加した後、酢酸
イソプロピルで抽出して行った。ｔ−ブチルメチルエー
テル（MTBE）から蒸発、結晶化して、エナンチオマー過
剰率93％で酸２を回収した（回数率90％）。
回収したベンジルエステル（S:Rエナンチオマー比30:
70）を、40℃で、約15mol％の４−ヒドロキシ安息香酸
ベンジル及び約15mol％の炭酸セシウムの存在下に90％
水性アセトニトリル中の均一溶液としてラセミ化した。
分離したラセミベンジルエステルを、前回の加水分解実
験から回収した酵素を用い、再度酵素加水分解にかけ
た。通常の加水分解動力学、酸の生成及びエナンチオ選
択性が認められた。
70）を、40℃で、約15mol％の４−ヒドロキシ安息香酸
ベンジル及び約15mol％の炭酸セシウムの存在下に90％
水性アセトニトリル中の均一溶液としてラセミ化した。
分離したラセミベンジルエステルを、前回の加水分解実
験から回収した酵素を用い、再度酵素加水分解にかけ
た。通常の加水分解動力学、酸の生成及びエナンチオ選
択性が認められた。
有用性 式Ｉの（Ｓ）アゼチジノン酸は式１のエラスターゼ阻
害剤の製造に用いられる中間体である。例として式２の
化合物を用いた以下の図式は、式１の化合物を製造する
ための１つの可能な経路を示している。該反応順序は、
EP337,549号及びEP595,557号に概略的に開示されてい
る。
害剤の製造に用いられる中間体である。例として式２の
化合物を用いた以下の図式は、式１の化合物を製造する
ための１つの可能な経路を示している。該反応順序は、
EP337,549号及びEP595,557号に概略的に開示されてい
る。
即ち、トリエチルアミンのような塩基の存在下に、ア
ゼチジノン酸を適切なイソシアネートで処理して、アゼ
チジノン窒素原子にカルバモイル部分を付加する。得ら
れたβ−ラクタム尿酸を、ジシクロヘキシルカルボジイ
ミド又はそのアシル化相当物（例えば酸塩化物）に変換
したもののようなカップリング剤の存在下に、適切なア
ミン（例えばピペラジン）と反応させて最終生成物を得
る。示されている２つの反応ステップは逆の順序で行っ
てもよいものと理解されたい。即ち、先ず、カルボン酸
をアミドに変換し、第２ステップでカルバモイル部分を
付加する。
ゼチジノン酸を適切なイソシアネートで処理して、アゼ
チジノン窒素原子にカルバモイル部分を付加する。得ら
れたβ−ラクタム尿酸を、ジシクロヘキシルカルボジイ
ミド又はそのアシル化相当物（例えば酸塩化物）に変換
したもののようなカップリング剤の存在下に、適切なア
ミン（例えばピペラジン）と反応させて最終生成物を得
る。示されている２つの反応ステップは逆の順序で行っ
てもよいものと理解されたい。即ち、先ず、カルボン酸
をアミドに変換し、第２ステップでカルバモイル部分を
付加する。
以下の実施例は、クレームされている本発明をより詳
細に説明するために提供されており、本発明の範囲は該
実施例に限定されるものではない。
細に説明するために提供されており、本発明の範囲は該
実施例に限定されるものではない。
実施例１ 3,3−ジエチル−４−［（４′−ベンジルオキシカルボ
ニル）フェノキシ］−２−アゼチジノンの酵素加水分解 ラセミ混合物としてのベンジルエステル、3,3−ジエ
チル−４−［（４−ベンジルオキシカルボニル）−フェ
ノキシ］−２−アゼチジノン（43g）を、Triton Ｘ−1
00（4.5ml）の0.1M リン酸緩衝水溶液（1.5L,pH7.7）
に加え、37℃で30分間撹拌（200RPM）した。粉末状のリ
パーゼ PS−800（30g）を加え、混合物を96時間撹拌し
た。該ブイヨンのHPLCアッセイにより、約8gの酸（4S）
−3,3−ジエチル−４−［（４′−カルボキシ）フェノ
キシ］−２−アゼチジノンが生成されたことが示され
た。（HPLCアッセイ条件:Intertsil C8、アセトニトリ
ル:0.1％H3PO4、20分間で25:75→10 0:0の勾配、25
℃、2.0ml/分、242nm。保持時間：酸−7.0分；エステル
−13.5分）。
ニル）フェノキシ］−２−アゼチジノンの酵素加水分解 ラセミ混合物としてのベンジルエステル、3,3−ジエ
チル−４−［（４−ベンジルオキシカルボニル）−フェ
ノキシ］−２−アゼチジノン（43g）を、Triton Ｘ−1
00（4.5ml）の0.1M リン酸緩衝水溶液（1.5L,pH7.7）
に加え、37℃で30分間撹拌（200RPM）した。粉末状のリ
パーゼ PS−800（30g）を加え、混合物を96時間撹拌し
た。該ブイヨンのHPLCアッセイにより、約8gの酸（4S）
−3,3−ジエチル−４−［（４′−カルボキシ）フェノ
キシ］−２−アゼチジノンが生成されたことが示され
た。（HPLCアッセイ条件:Intertsil C8、アセトニトリ
ル:0.1％H3PO4、20分間で25:75→10 0:0の勾配、25
℃、2.0ml/分、242nm。保持時間：酸−7.0分；エステル
−13.5分）。
試料を種々の時間に回収し、塩化メチレンで抽出し、
キラルSFC−HPLC（SFC＝超臨界液体クロマトグラフィ
ー）によりアッセイし、加水分解のエナンチオ選択性を
測定した。
キラルSFC−HPLC（SFC＝超臨界液体クロマトグラフィ
ー）によりアッセイし、加水分解のエナンチオ選択性を
測定した。
Chiral SFC−HPLC:Chiracel OD（Ｈ）（Chiral Technologies社製）、28容量％ EtOH（20mM HClO4
を含む）、1.0ml/分、300バール、35℃。保持時間：
（Ｓ）酸−7.6分；（Ｓ）エステル−8.3分；（Ｒ）酸−
9.5分；（Ｒ）エステル−11.6分。
を含む）、1.0ml/分、300バール、35℃。保持時間：
（Ｓ）酸−7.6分；（Ｓ）エステル−8.3分；（Ｒ）酸−
9.5分；（Ｒ）エステル−11.6分。
実施例２ ベンジルエステル、（Ｓ）酸及び酵素の分離 懸濁したベンジルエステル及び酵素並びに溶解した
（Ｓ）酸（8.09g）を含む酵素加水分解混合物（実施例
１から、1.5L）を、濾紙を敷いた粗いガラス漏斗を通し
て濾過した。該エステルを水（200ml）で３回洗浄し、
脱水して、ラセミ化用にとっておき、合わせた水溶相を
10キロダルトンの膜フィルターを通して濾過した。
（Ｓ）酸（8.09g）を含む酵素加水分解混合物（実施例
１から、1.5L）を、濾紙を敷いた粗いガラス漏斗を通し
て濾過した。該エステルを水（200ml）で３回洗浄し、
脱水して、ラセミ化用にとっておき、合わせた水溶相を
10キロダルトンの膜フィルターを通して濾過した。
加水分解媒体中の酵素の水性懸濁液をMillipore PLT
K Prep/Scale−TFF 1ft210k再生セルロースフィルタ
ーカートリッジ（カタログ番号CDUF001LT 10k）を通し
て〜300ml/分で圧送（Cole−Parmer Masterflex遠心ポ
ンプ）した。透過体を〜700ml/時間で流動させるように
保持体の戻りラインを制限した。酵素スラリーを30kDの
フィルターに通して濾過すると、酵素活性の半分が透過
体に含まれて残留していた。
K Prep/Scale−TFF 1ft210k再生セルロースフィルタ
ーカートリッジ（カタログ番号CDUF001LT 10k）を通し
て〜300ml/分で圧送（Cole−Parmer Masterflex遠心ポ
ンプ）した。透過体を〜700ml/時間で流動させるように
保持体の戻りラインを制限した。酵素スラリーを30kDの
フィルターに通して濾過すると、酵素活性の半分が透過
体に含まれて残留していた。
フラスコ中の保持体容量が50mlに減少した時点で、保
持体を水（250ml）で３回稀釈し、濾過後のフィルター
カートリッジの目詰まりを防止した。最終減少容量の保
持体を水で250mlに稀釈し、酵素スラリーをフィルター
を通して再循環させた。酵素スラリーを除去し、フィル
ターを排水し、フィルターを介して新鮮な水（250ml）
を２回再循環させて酵素を回収した。合わせた水性酵素
洗浄液をアッセイ用にとっておき、次の酵素加水分解に
再使用した。回収した水性酵素懸濁液のアッセイ（オリ
ーブ油加水分解）により、酵素活性の90％が回収された
ことが示された。
持体を水（250ml）で３回稀釈し、濾過後のフィルター
カートリッジの目詰まりを防止した。最終減少容量の保
持体を水で250mlに稀釈し、酵素スラリーをフィルター
を通して再循環させた。酵素スラリーを除去し、フィル
ターを排水し、フィルターを介して新鮮な水（250ml）
を２回再循環させて酵素を回収した。合わせた水性酵素
洗浄液をアッセイ用にとっておき、次の酵素加水分解に
再使用した。回収した水性酵素懸濁液のアッセイ（オリ
ーブ油加水分解）により、酵素活性の90％が回収された
ことが示された。
透過体（3L）を５％リン酸で処理してpH5.0に調整
し、次いで、塩化ナトリウム（1.2kg）を加え、混合物
を酢酸イソプロピル（200ml）で３回抽出した。水性相
の大部分を除去し、残りをガラス漏斗を通して濾過し
て、２つの相の明確な分離を妨げる界面物質を除去し
た。
し、次いで、塩化ナトリウム（1.2kg）を加え、混合物
を酢酸イソプロピル（200ml）で３回抽出した。水性相
の大部分を除去し、残りをガラス漏斗を通して濾過し
て、２つの相の明確な分離を妨げる界面物質を除去し
た。
合わせた抽出物を水（200ml）で洗浄し、200ml容量に
なるまで蒸発させ、無水酢酸イソプロピルを加えて500m
lに稀釈した。該物質を200ml容量に再濃縮して該溶液を
共沸脱水し、次いで、濾過して無機固体を除去した。溶
液を、実施例１から回収した酵素を用い従って酵素を再
循環させる能力が証明された実施例１から得られた第２
溶液（8.8gの酸）と合わせ、合わせた溶液を蒸発させて
固定を得た。この物質を再還流メチルｔ−ブチルエーテ
ル（MTBE、20ml）に溶解し、次いで、100mlになるまで
真空蒸発させた。濃縮中に結晶化し始めた物質を、20℃
で５時間熟成させた。混合物を濾過し、MTBEで洗浄、脱
水して、13.5gの固体を得た。母液を30ml容量に濃縮
し、５時間熟成、濾過、MTBEで洗浄、脱水して、さらに
2.05gの物質を得た。これらの固体をHPLCでアッセイす
ると、それぞれ純度91重量％、96重量％であることが知
見され、合計14.2gの（4S）−3,3−ジエチル−４−
［（４−カルボキシ）フェノキシ］−２−アゼチジノン
（84％回収率、M.L.中1.78g）で、キラルSFC−HPLCアッ
セイによればエナンチオマー過剰率93％であった。
なるまで蒸発させ、無水酢酸イソプロピルを加えて500m
lに稀釈した。該物質を200ml容量に再濃縮して該溶液を
共沸脱水し、次いで、濾過して無機固体を除去した。溶
液を、実施例１から回収した酵素を用い従って酵素を再
循環させる能力が証明された実施例１から得られた第２
溶液（8.8gの酸）と合わせ、合わせた溶液を蒸発させて
固定を得た。この物質を再還流メチルｔ−ブチルエーテ
ル（MTBE、20ml）に溶解し、次いで、100mlになるまで
真空蒸発させた。濃縮中に結晶化し始めた物質を、20℃
で５時間熟成させた。混合物を濾過し、MTBEで洗浄、脱
水して、13.5gの固体を得た。母液を30ml容量に濃縮
し、５時間熟成、濾過、MTBEで洗浄、脱水して、さらに
2.05gの物質を得た。これらの固体をHPLCでアッセイす
ると、それぞれ純度91重量％、96重量％であることが知
見され、合計14.2gの（4S）−3,3−ジエチル−４−
［（４−カルボキシ）フェノキシ］−２−アゼチジノン
（84％回収率、M.L.中1.78g）で、キラルSFC−HPLCアッ
セイによればエナンチオマー過剰率93％であった。
実施例３ ベンジルエステルのラセミ化 酵素加水分解によりR:Sエナンチオマーの70:30混合物
として回収されたベンジルエステル（55.8g、92重量
％、HPLCでは51.3g）をアセトニトリル：水（90:10、16
5ml）に20℃で加え、50℃に加温して均一溶液を得た。
該溶液に、４−ヒドロキシ安息香酸ベンジル（0.38g）
及び炭酸セシウム（0.5g）を加えた。次いで、該溶液を
加熱し、50〜55℃で６時間熟成させた。
として回収されたベンジルエステル（55.8g、92重量
％、HPLCでは51.3g）をアセトニトリル：水（90:10、16
5ml）に20℃で加え、50℃に加温して均一溶液を得た。
該溶液に、４−ヒドロキシ安息香酸ベンジル（0.38g）
及び炭酸セシウム（0.5g）を加えた。次いで、該溶液を
加熱し、50〜55℃で６時間熟成させた。
反応混合物を室温に冷却した後、水（500ml）を加
え、水溶相をMTBE（100ml）で２回抽出した。合わせた
有機相を飽和水性NaCl（50ml）で洗浄し、次いで、〜80
ml容量まで真空濃縮（40℃、Hgで28インチ）した。次い
で、濃縮物をエタノール（75ml）で稀釈し、〜80mlにな
るまで蒸発させ、次いで、エタノールで150ml容量に稀
釈すると、接種後にベンジルエステルがゆっくり結晶化
し始めた。水（100ml）を１時間かけて滴下し、混合物
を１時間熟成させてから濾過した。エステルをエタノー
ル：水（100ml、2:1）で洗浄し、真空乾燥（45℃、20時
間）して、45.2gの結晶性物質を得た。該エステルをHPL
Cアッセイにより定量すると、98.7重量％、回収率87％
であった。母液をアッセイすると、3.3gのエステルを含
むことが知見された。
え、水溶相をMTBE（100ml）で２回抽出した。合わせた
有機相を飽和水性NaCl（50ml）で洗浄し、次いで、〜80
ml容量まで真空濃縮（40℃、Hgで28インチ）した。次い
で、濃縮物をエタノール（75ml）で稀釈し、〜80mlにな
るまで蒸発させ、次いで、エタノールで150ml容量に稀
釈すると、接種後にベンジルエステルがゆっくり結晶化
し始めた。水（100ml）を１時間かけて滴下し、混合物
を１時間熟成させてから濾過した。エステルをエタノー
ル：水（100ml、2:1）で洗浄し、真空乾燥（45℃、20時
間）して、45.2gの結晶性物質を得た。該エステルをHPL
Cアッセイにより定量すると、98.7重量％、回収率87％
であった。母液をアッセイすると、3.3gのエステルを含
むことが知見された。
HPLCアッセイ： Inertsil C8（250×4.6mm）、５μ、アセトニトリル:
0.1容量％の水性HClO4、20分間で勾配:25:75→100:0、
2.0ml/分、25℃、238nm。
0.1容量％の水性HClO4、20分間で勾配:25:75→100:0、
2.0ml/分、25℃、238nm。
保持時間:4−ヒドロキシ安息香酸ベンジル 10.4分 ベンジルエステル 13.4分
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ロバージ，クリストフアー アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカ ーン・アベニユー・126 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12P 41/00 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (5)
- 【請求項１】式I: の光学的に活性の（Ｓ）アゼチジノン酸を製造する方法
であって、式II: （式中、Ｒはベンジル及びC1−C8アルキルから選択され
る） のエステルのラセミ混合物を界面活性剤の存在下にシュ
ウドモナス属由来のリパーゼと接触させるステップ、及
び前記（Ｓ）−アゼチジノン酸を回収するステップを含
む方法。 - 【請求項２】前記リパーゼがシュドモナス アエルギノ
サ（Pseudomonas aeruginosa）MB5001（ATCC 55162）
由来である、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】前記リパーゼがリパーゼPSである、請求項
１に記載の方法。 - 【請求項４】式IIのエステルのＲがベンジルである、請
求項１に記載の方法。 - 【請求項５】前記界面活性剤がオクチルフェノキシポリ
エトキシエタノールである、請求項１に記載の方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/433,586 US5523233A (en) | 1995-05-03 | 1995-05-03 | Enzymatic hydrolysis of 3,3-diethyl-4-[(4-carboxy)phenoxy]-2-azetidinone esters |
| US08/433,586 | 1995-05-03 | ||
| US433,586 | 1995-05-03 | ||
| PCT/US1996/005953 WO1996034975A1 (en) | 1995-05-03 | 1996-04-29 | Enzymatic hydrolysis of 3,3-diethyl-4-[(4-carboxy)phenoxy]-2-azetidinone esters |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10507932A JPH10507932A (ja) | 1998-08-04 |
| JP2939342B2 true JP2939342B2 (ja) | 1999-08-25 |
Family
ID=23720700
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8533401A Expired - Lifetime JP2939342B2 (ja) | 1995-05-03 | 1996-04-29 | ３，３−ジエチル−４−［（４−カルボキシ）フェノキシ］−２−アゼチジノンエステルの酵素加水分解 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5523233A (ja) |
| EP (1) | EP0826065A1 (ja) |
| JP (1) | JP2939342B2 (ja) |
| AR (1) | AR001816A1 (ja) |
| AU (1) | AU694358B2 (ja) |
| CA (1) | CA2218881A1 (ja) |
| HR (1) | HRP960211A2 (ja) |
| WO (1) | WO1996034975A1 (ja) |
| YU (1) | YU25996A (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69914458T2 (de) * | 1998-02-17 | 2004-10-28 | G.D. Searle & Co., Chicago | Verfahren zur enzymatischen auflösung von laktamen |
| DE19931847A1 (de) * | 1999-07-09 | 2001-01-11 | Basf Ag | Immobilisierte Lipase |
| AT502395B1 (de) | 2005-07-27 | 2007-03-15 | Iep Gmbh | Oxidoreduktasen zur stereoselektiven reduktion von ketoverbindungen |
| AT503486B1 (de) * | 2006-04-11 | 2008-05-15 | Iep Gmbh | Verfahren zur enantioselektiven reduktion von steroiden |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5229381A (en) * | 1983-12-01 | 1993-07-20 | Merck & Co., Inc. | Substituted azetidinones as anti-inflammatory and antidegenerative agents |
| IL89835A0 (en) * | 1988-04-11 | 1989-12-15 | Merck & Co Inc | Substituted azetidinones,their preparation and pharmaceutical compositions containing them |
| US5241064A (en) * | 1989-10-02 | 1993-08-31 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | Enzymatic process for preparing optically active 3-substituted azetidinones |
| ES2230790T3 (es) * | 1992-01-15 | 2005-05-01 | E.R. SQUIBB & SONS, INC. | Procedimientos enzimaticos para la resolucion de mezclas enantiomericas de compuestos utiles como intermedios en la preparacion de taxanos. |
| TW275621B (ja) * | 1992-10-27 | 1996-05-11 | Merck & Co Inc |
-
1995
- 1995-05-03 US US08/433,586 patent/US5523233A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-04-26 YU YU25996A patent/YU25996A/sh unknown
- 1996-04-29 WO PCT/US1996/005953 patent/WO1996034975A1/en not_active Application Discontinuation
- 1996-04-29 CA CA002218881A patent/CA2218881A1/en not_active Abandoned
- 1996-04-29 AR AR33634296A patent/AR001816A1/es unknown
- 1996-04-29 EP EP96913261A patent/EP0826065A1/en not_active Ceased
- 1996-04-29 AU AU56330/96A patent/AU694358B2/en not_active Ceased
- 1996-04-29 JP JP8533401A patent/JP2939342B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1996-04-30 HR HR08/433,586A patent/HRP960211A2/hr not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0826065A1 (en) | 1998-03-04 |
| AR001816A1 (es) | 1997-12-10 |
| AU5633096A (en) | 1996-11-21 |
| HRP960211A2 (en) | 1998-02-28 |
| CA2218881A1 (en) | 1996-11-07 |
| YU25996A (sh) | 1998-11-05 |
| US5523233A (en) | 1996-06-04 |
| WO1996034975A1 (en) | 1996-11-07 |
| AU694358B2 (en) | 1998-07-16 |
| JPH10507932A (ja) | 1998-08-04 |
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