NO854127L - Fremgangsm¨te til fremstilling av aromatisk substituerte l -aminosyrer. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte til fremstilling av aromatisk substituerte L-aminosyrer.

Fra det tyske utlegningsskrift nr. 2 215 853 er det kjent å overføre racemiske mono- og di-ringsubstituerte fenyl-alaniner til de tilsvarende L-aminosyrene ved at man først forestrer racematet med en alkanol med inntil 4 karbonatomer, underkaster den racemiske esteren innvirkningen av et chymotrypsin ved en sur pH-verdi, isolerer L-aminosyren ved utfelling og eventuelt ekstraherer og forsåper esteren av D-aminosyren fra filtratet. Som enzym foretrekkes a-chymotrypsin, det foretrukne pH-området ved den enzymatiske spaltningen ligger ved 5 til 6. Væsken som oppstår etter fraskillelsen av L-aminosyren gjøres alkalisk før ekstraksjon av esteren av D-aminosyren.

Det er nå funnet at aromatisk substituerte L-aminosyrer blir spesielt lett tilgjengelige ved at man først gjør den blandingen som ved den enzymatiske spaltningen alkalisk, deretter ekstraherer esteren av D-aminosyren, eventuelt racemiserer esteren etter tørking av ekstraktet og tilbake-fører racematet i fremgangsmåten. Fra den alkaliske resten etter ekstraksjonen av esteren av D-aminosyren isoleres så

L-aminosyren etter surgjøring.

Oppfinnelsen vedrører følgelig en fremgangsmåte til fremstilling av aromatisk substituerte L-aminosyrer ved spaltning av den racemiske lavere alkylesteren med a-chymotrypsin i svakt surt vandig medium, som er kjennetegnet ved at reaksjonsblandingen gjøres svakt alkalisk, esteren av D-aminosyren ekstraheres med et organisk oppløsningsraiddel, esteren racemiseres og føres igjen tilbake i fremgangsmåten, og L-aminosyren isoleres fra det vandige alkaliske ekstraktet etter surgjøring. Foretrukne utførelser av denne fremgangsmåten beskrives nærmere i det følgende, henholdsvis defineres i patentkravene.

Som aromatisk substituerte aminosyrer, fremfor alt tryptofan, spesielt fenylalanin, tyrosin og 3,4-dihydroksy-fenylalanin i betraktning.

Forestringen av de racemiske aminosyrene kan gjennomføres som angitt i det tyske utlegningsskriftet 2 215 853. Foretrukket er lavere alkanoler med inntil 4 karbonatomer (unntatt tert.-butanol), spesielt metanol, etanol, n-propanol, isopropanol og n-butanol. .a-chymotrypsin anvendes fortrinnsvis på fiksert form, i denne forbindelse er uorganiske bærere foretrukket. Dette fikserte enzymet bringes så i fast- eller flytende seng i kontakt med den vandige substratoppløsningen. Omsetningen foregår hensiktsmessig ved 20 til 45°C, fortrinnsvis ved 30<0>C-40°C, og ved en pH-verdi i området fra 4,5 til 6,5, fortrinnsvis ved en konstant pH-verdi i området fra 5,0 til 6,0, avhengig av den anvendte esteren. Substratkonsentra-sjonen er i og for seg ikke kritisk, men er hensiktsmessig 5-15 vekt-%, spesielt 10-15 vekt-%.

Den vandige oppløsningen av L-aminosyren og esteren av D-aminosyren som oppnås etter den enzymatiske spaltningen gjøres svakt alkalisk, innstilles med fordel på en pH-verdi i området fra 7,5 til 8,5, fortrinnsvis 8,0, og ekstraheres med et egnet organisk oppløsningsmiddel med fordel ved en temperatur fra 20 til 40°C, spesielt ved romtemperatur.

Som organisk oppøsningsmiddel for ekstraksjonen anvendes med fordel et oppløsningsmiddel som er lite blandbart med vann, siden racemiseringen spesielt fordelaktig kan foregå uten isolering av esteren (nærværet av vann ved racemiseringen kan betinge bireaksjoner som hydrolyse). Fordelaktig er følgelig et oppløsningsmiddel som danner en azeotop med vann og herved muliggjør en lett tørking av ekstraktet. Det er imidlertid også mulig, om ikke generelt fordelaktig, å fraskille det oppløsningsmiddelet som er benyttet til ekstraksjonen fullstendig og racemisere esteren på stofform.

Egnede oppløsningsmidler for ekstraksjonen er alifatiske hydrokarboner som heksan, spesielt aromatiske hydrokarboner som toluol eller xylol, etere, spesielt lavere dialkyletere som dietyleter, di-isopropyleter eller di-n-butyleter, ketoner, spesielt lavere dialkylketoner som metyletylketon eller metylisobutylketon, halogenerte hydrokarboner, spesielt klorerte lavere alifater som metylenklorid, kloroform eller tetraklormetan samt estere, spesielt lavere alkylestere av lavere alifatiske karbonsyrer som etylacetat eller butylacetat.

Racemiseringen kan også katalyseres på i og for seg kjent måte ved hjelp av ketoforbindelser og/eller syrer. Dersom altså oppløsningsmiddelet ikke er et keton kan tilsats av aldehyder eller ketoner i vesentlig grad akselrere racemiseringen. Racemiseringen av optisk aktive aminosyreestere i ketoner, eventuelt under tilsats av en syre, er kjent fra den offentliggjorte japanske patentsøknaden 109 912/1979. Ved denne kjente racemiseringsreaksjonen kan det også tilsettes et oppløsningsmiddel som toluol, tetraklormetan eller metanol. Racemiseringen av frie optisk aktive aminosyrer med aldehyder og syrer er kjent fra den offentliggjorte europeiske patentsøknaden 57 092, samt fra S. Yamada et al., J. Org.Chem. 48 (1983) 843-846. Fortrinnsvis anvendes disse ketoforbindelsene i katalyttiske mengder, fortrinnsvis 0,001 til 0,1 mol pr. mol ester. Foretrukket er acetaldehyd og salisylaldehyd.

Den D-, L-blandingen som oppstår ved racemiseringen ekstraheres så ved hjelp av lett surgjort vann fra racemiserings-blandingen, herved overføres esteren på saltform. Denne vandige oppløsningen innstilles ved tilsats av nytt substrat på den ønskede konsentrasjonen, fortrinnsvis 5 til 15, spesielt 10 til 15 vekt-%, og føres tilbake i fremgangsmåten .

Fra den svakt alkaliske, vandige resten som inneholder stor L-aminosyren, isoleres denne ved surgjøring. Alt etter oppløseligheten av syren kan den krystallisere umiddelbart eller etter konsentrasjon. Syren kan også på kjent måte isoleres ved ekstraksjon med egnede oppløsningsmidler. Rensingen foregår på kjent måte.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen tillater fremstilling av aromatisk substituerte L-aminosyrer i utbytter på over 90% og med en optisk renhet på over 98%. Ved kombinasjonen av enzymatisk spaltning, ekstraksjon av D-esteren, racemisering og tilbakeføring av denne, har man oppnådd en spesielt fordelaktig kombinasjon av disse trinnene, som tillater en kontinuerlig utførelse av fremgangsmåten.

I de følgende eksemplene beskrives oppfinnelsen nærmere. Prosentangivelser gjelder vekt-% med mindre annet er angitt.

Eksempel 1

Immobilisering av a-chymotrypsin

Fikseringen av enzymet kan foregå på aluminiumsilikat ifølge Halwachs et al., "Biotechnology and Bioengineering XIX"

(1977) 1667-1677. Spesielt foretrukket er likevel følgende arbeidsmetode: 138 g tørt kiselgel (kornstørrelse 0,1 til 0,3 mm) tas opp i 1 1 3,5% acetonisk 3-aminopropyl-trietoksysilan-opplØsning og omrøres forsiktig i 2 timer ved romtemperatur. Deretter fjernes acetonet i en rotasjonsfordamper og kiselgelet tørkes i vakuum-tørkeskap i 8 timer ved 100°C. Produktet inneholder 0,89 mmol aminogrupper pr. g kiselgel. Denne arainerte kiselgelen tas opp i 400 ml 25% vandig glutar-dialdehyd-oppløsning og holdes i 2 timer ved romtemperatur under vakuum (ca. 130 mbar). Deretter frafiltreres bæreren og vaskes grundig med avsaltet vann.

138 g av denne aktiverte kiselgelen føres inn i en opp-løsning av 13,8 g a-chymotrypsin (fra firma Novo, "800 S Oral Grade") i 300 ml 0,5 m fosfatbuffer (pH 7,5) og omrøres i 4 timer ved romtemperatur. Deretter frafiltreres kata-lysatoren og vakses suksessivt med 1 1 avsaltet vann, mettet koksaltoppløsning og avsaltet vann. Til oppbevaring opptas det immobiliserte a-chymotrypsinet i 500 ml 0,1 m fosfatbuffer-oppløsning (pH 7,5, 0,1 mmol natriumazid).

For aktivitetsbestemmelse tilsetter man 1 g av det immobiliserte a-chymotrypsinet til 50 ml av en 10% vandig oppløsning av D,L-fenylalaninmetylester-hydrogenklorid, innstiller på pH 6,0 og temperaturen holdes ved hjelp av en termostat på 30°C, og oppløsningen omrøres. pH-verdien holdes konstant ved tilsats av 0,1 N natronlut ved hjelp av en automatisk byrette. Mengden for brukt natronlut er målestørrelsen og er direkte proporsjonal med konsentrasjonen av L-fenylalanin.

Aktivitet: 338 U/g bærer (tørr) =3,35 kg L-fenylalanin/kg bærer

(U = internasjonal enhet for enzymaktivitet,

1 U = 1 pinol/minutt omsetning.

Eksempel 2

Enzymatisk racematspaltning

I en reaksjonsbeholder med termostat, utstyrt med indre rør, pH-elektrode og automatisk byrette tilsettes 100 g D,L-fenylalaninmetylester-hydrogenklorid (restinhold av D,L- fenylalanin under 0,3%, påvisningsgrensen ved HPLC) og oppløses i 1 1 avsaltet vann. pH-verdien på oppløsningen innstilles på 6,0 med 5 N natronlut (9,5 ml). Oppløsningen innstilles ved hjelp av termostaten på 30°C og pumpes med en gjennomstrømningshastighet på 5,0 1 pr. time i kretsløp over en søyle som er fylt med et 150 ml fiksert enzym fremstilt som i eksempel 1 (5,0 cm tverrsnitt, 8 cm høyde).

pH-verdien på oppløsningen holdes under reasjonen på 6,0 ved tilsats av 5 N natronlut (37,8 ml).. Etter 25 minutters reaksjonstid har man ifølge HPLC-analyse oppnådd en omsetning på 49,2%, beregnet på basis av D,L-fenylalanin-metylesteren. Ved dette punktet avbrytes reaksjonen og en enzymsengen vaskes med 300 ml avsaltet vann.

Eksempel 3

Ekstraksjon av D-fenylalaninmetylester og etterfølgende racemisering

Den ved eksempel 2 fremstilte vandige oppløsningen av D-fenylalaninmetylester og L-fenylalanin innstilles under omrøring ved tilsats av 5 N natronlut (36,5 ml) på pH 8,0, og utristes ved romtemperatur tre ganger med 300 ml metylisobutylketon. Etter den tredje ekstraksjonen finnes det i den vandige fasen, ifølge HPLC-analyse, ikke lenger ester (påvisningsgrense: under 0,2%). De samlede ekstraktene blandes med 14,0 g iseddik (0,5 mol-ekvivalenter, beregnet på basis av D-ester) og vann som finnes i ekstraktet avdestilleres azeotropt over en Vigreux-kolonne. Det tørre ekstraktet oppvarmes i ytterligere 2 timer under tilbake-strøm, hvorved racemiseringsgraden fastslås ved bestemmelse av den optiske dreieverdien for oppløsningen ved hjelp av et polarimeter.Oppløsningen utristes, etter avkjøling til romtemepratur, tre ganger med 300 ml 0,01 N saltsyre. I den samlede vandige fasen finnes, ifølge HPLC-analyse, 98,5% av den anvendte esteren. Denne vandige oppløsningen innstilles ved tilsats av D,L-fenylalaninmetylester-hydrogenklorid på 10% og anvendes for en ytterligere enzymatisk spaltning.

Dersom man som ekstraksjonsmiddel anvender n-heksan, di-n-butyleter, toluol eller xylol tilsettes, for å Øke reaksjonshastigheten, katalyttiske mengder acetaldehyd, salisylaldehyd eller benzaldehyd.

I stedenfor iseddik kan også saltsyre, benzosyre, sitron-syre, p-toluolsulfonsyre eller maursyre anvendes. Uten syrer forløper racemiseringen mye langsommere og krever mer enn 10 timer. Syrekonsentrasjoner over 0,5 mol-ekvivalenter bevirker ingen ytterligere hastighetsøkning.

Eksempel 4

Opparbeidelse og isolering av L-fenylalanin

Oppløsningen som resulterer etter ekstraksjonen med metylisobutylketon ifølge eksempel 3, som inneholder ca. 3,5% L-fenylalanin, innstilles med konsentrert saltsyre på pH 5,5 (isoelektrisk punkt for fenylalanin) og inndampes i en rotasjonsfordamper til en innhold på ca. 10% L-fenylalanin. Det utfelte L-fenylalaninet bringes i oppløsning ved oppvarming til 90°C og oppløsningen filtreres i varm tilstand. Den klare oppløsningen får stå ved romtemperatur, hvorved L-fenylalaninet felles ut i store krystaller. Moderluten oppbevares over natten ved + 5°C, herved felles det ut hvite krystaller som frafiltreres og ettervaskes med litt kalt vann. Krystallene tørkes i 3 timer ved 105°C i vakuum-tørkeskap. Man får 35,3 g L-fenylalanin eller 92%, beregent på basis av 50 g anvendt L-fenylalaninmetylester-hydrogenklorid. Den optiske renheten ligger ved 98,5 til 99,5%.

Eksempel 5

Enzymatisk racematspaltning:

D,L-fenylalaninetylester

Anaogt eksempel 2 oppløses 150 g D,L-fenylalaninetylester-hydrogensulfat i 1 1 avsaltet vann. pH-verdien for opp-løsningen innstilles på 5,5 med 5 N natronlut. Oppløsningen innstilles ved hjelp av termostat på 40°C og pumpes med en gjennomstrømnigshastighet på 60 l/time i kretsløp over søylen, mens pH-verdien holdes på 5,5 under hele reaksjonen ved tilsats av 5 N natronlut.

J) en videre bearbeidelsen foregår tilsvarende eksempel 3 og 4.

Eksempel 6

Enzymatisk racematspaltning:

D,L-fenylalanin-n-propylester

Analogt eksempel 5 omsettes D,L-fenylalanin-n-propylester-hydrogensulfat, bortsett fra at pH-verdien innstilles og holdes på 5,3. Den videre opparbeidelsen foregår analogt eksempel 3 og 4.

Med tilsvarende gusntig resultat kan også isopropyl- eller n-butylesteren av D,L-fenylalaninet benyttes.

Eksempel 7

L-tryptofan

Analogt eksempel 2 oppløses 50 g D,L-tryptofanmetylester-hydrogenklorid i 1 1 avsaltet vann og spaltes enzymatisk som beskrevet. Fra den fremstilte vandige oppløsningen ekstraheres D-tryptofanmetylesteren ved fremgangsmåten ifølge eksempel 3, og den resterende vandige fasen innstilles analogt eksempel 4 med konsentrert saltsyre til pH 5,9 (isoelektrisk punkt for tryptofan) og inndampes i en rotasjonsfordamper til et innhold til ca. 5% L-tryptofan. De utfelte krystallene frafiltreres, vaskes med kalt vann og tørkes ved 105°C i 3 t. Man får 19,4 g eller 91%, beregnet på basis av 25 g anvendt L-tryptofanmetylester-hydrogen-klorid. Den optiske renheten ligger ved 98,7%.

Claims (9)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av aromatisk substituerte L-aminosyrer ved enzymatisk spaltning av racematet av den lavere alkylesteren med a-chymotrypsin i svakt surt pH-område og ekstraksjon av esteren av D-formen, karakterisert ved at man gjør reaksjonsblandingen som oppnås ved den enzymatiske spaltningen svakt alkalisk, fra denne alkaliske oppløsningen ekstraheres og racemiseres .esteren av D-aminosyren med et organsik oppløsningsmiddel, hvorpå racematet føres tilbake i fremgangsmåten, og den ekstraherte alkaliske oppløsningen gjøres svakt sur, hvorpå L-aminosyren isoleres fra denne.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man anvender a-chymotrypsinet på fiksert form.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2,. karakterisert ved at a-chymotrypsinet er festet til en uorganisk bærer.

4. Fremgangsmåte ifølge ett eller flere av de foregående krav, karakterisert ved at' det anvendes et organsik oppløsningsmiddel som er lite blandbart med vann til ekstraksjon av D-esteren.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at det anvendes et oppløsningsmiddel som danner en azeotropblanding med vann.

6. Fremgangsmåte ifølge ett eller flere av de foregående krav, karakterisert ved at det eventuelt tørkede ekstraktet av D-esteren underkastes racemisering.

7. Fremgangsmåte ifølge ett eller flere av de foregående krav, karakterisert ved at den racemiserte esteren ekstraheres i sur tilstand og etter forsterkning føres tilbake i fremgangsmåten.

8. Fremgangsmåte ifølge ett eller flere av de foregående krav, karakterisert ved at esteren er en alkylester med 1 til 4 karbonatomer, unntatt tert.-butyl.

9 . Fremgangsmåte ifølge ett eller flere av de foregående krav, karakterisert ved at esteren er en metyl-, etyl-, n-propyl-, isopropyl- eller n-butylester av fenylalanin eller tryptofan.