JPH025898A - 特定鋳型による光連結 - Google Patents

特定鋳型による光連結

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JPH025898A JP1007525A JP752589A JPH025898A JP H025898 A JPH025898 A JP H025898A JP 1007525 A JP1007525 A JP 1007525A JP 752589 A JP752589 A JP 752589A JP H025898 A JPH025898 A JP H025898A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はターゲット鋳型上で実質的に隣接する２つのリ
ガンド０を一緒に連結させるための方法、試薬、組成物
、キットおよび装置に関する。特に、本発明はデオキシ
リボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）ハイプリ
ダイゼーシ目ン検定を実施するための方法、試薬、組成
物およびキットに関する。
（従来の技術、発明が解決しようとする課題）以下の定
義は本発明を理解しやすくするために提供される。
“ターゲット“または“ターゲット分子”なる用語は対
象となる分子、すなわちその存在を知りたいと思う分子
を意味する。ターゲットは生物学的結合対の一員である
。
本明細書中で用いる”生物学的結合対”なる用語は相互
親和性または結合症を示す分子対を意味する。本明細書
において、１リガンド９“とは生物学的結合対の一方の
分子を意味し、モして“抗リガンド９“または１受容体
“は生物学的結合対の他方の分子を意味するであろう。
例えば、制限するものではないが、本発明の態様は生物
学的結合対が２本の相補的核酸鎖である核酸ハイブリダ
イゼーション検定に適用される。一方の鎖はりガントと
呼ばれ、他方の鎖は抗リガンドまたは受容体と呼ばれる
。一方の鎖はまたターゲット分子であり得る。リガンド
または抗リガンドという呼び方はその場の都合により選
ばれる。生物学的結合対には抗原と抗体、薬物と薬物受
容体部位、酵素と酵素基質などが含まれる。生物学的結
合対は結合条件下で複合体を形成することがで昶る。
°プローブ”なる用語はターゲット抗リガンド９または
受容体と選択的に結合し得る既知債のりガントを意味す
る。核酸に適用する場合、゛プローブ”はターゲット鎖
に相補的な塩基配列を有する核酸鎖な意味する。プロー
ブとターゲットは結合条件下でプローブ／ターゲット複
合体を形成できる。
“標識“なる用語は、例えば、制限するものではないが
、アイソトープ、酵素、化学発光剤、沈殿剤、染料など
を含めた検出可能な分子を意味する。′剤“とけ検出可
能な応答へ導く反応に関与する分子を含めて広義に解釈
される。１補助因子゛は標識との反応に関与するあらゆ
る分子を含むよう広く解釈される。
”増幅する”なる用語は、例えば、追加のターゲット分
子またはターゲット分子のように櫓卵しつるターゲット
様分子、もしくはターゲット分子の代わりに検出を受け
る分子であって試料中のターゲット分子の存在によって
生成される分子、を含めた増幅産物の形成を意味するた
めに広義に用いられる。ターゲットがポリヌクレオチド
である場合、追加のターゲットまたはターゲット様分子
もしくは検出を受ける分子はＤＮＡまたはＲＮＡポリメ
ラーゼを用いて酵素的につくられる。
１反応性官能基“なる用語は反応位置に置かれた２つの
リガンド９の間に、活性化されな際く、共有結合を形成
し得る官能基を意味する。活性化とは環境の化学的また
は物理的変化を包含する。
１光反応性官能基”なる用語は、放射エネルギーによっ
て光活性化された際に、反応位置に置かれｆＣ２つのり
ガントの間に共有結合を形成し得る反応性官能基を意味
する。
光反応性官能基の例と、しては、制限するものではｔｒ
いが、オレフィン、共役オレフィン、ケトン、α、β−
不飽和ケトン、アジド、共役二重結合およびケトン官傭
価により特徴づけられる共役ポリオレフィン、および芳
香族化合物が洋げられる。光反応性官能基はさらにクマ
リン、プンラレン、アントラセン、ヒレン、カロチン、
トロポン、クロモン、キノン、無水マレイン酸、アルキ
ルマレイミド９およびそれらの誘導体として特徴づけら
れる。
光反応性官能基の別の例はカルバート（、Ｔ、Ｇ。
Ｃａ１ｖｅｒｔ）、ピｙ　ッ（Ｊａｍｅｓ　Ｎ、　Ｐｉ
ｔｔｓ、Ｊｒ、）、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｐ
、　５３６−４８　＋ジｌン・ウィリー・ソンズ社（１
９６６）（この文献は参照によりここに引用される）に
記載されている。
１隣接する“なる用語は境界を接する分子域を意味する
。例えば、第一リガンドが受容体ターゲット分子に結合
する生物１学的結合対の場合に、第一リガンドを取り囲
みそれに隣接する領域が開放されており、第一リガンド
に隣接する第二リガンドと結合することができる。第一
プローブがポリヌクレオチドターゲット分子のある領域
に結合するポリヌクレオチドの場合には、ターゲット分
子の長さに沿って隣接しな相互に排他的な領域が第二プ
ローブと結合し、その第二プローブは第一プローブに隣
接するであろう。ターゲット分子は第一プローブと第二
プローブの位置を指図する鋳型として作用する。”実質
的に隣接する゛なる用語は接触−！たけ隣接することが
ないが重なり合っていてもよい空間的配置であって、反
応性の共有結合官能基を反応位置に誘導するように作用
する空間的配置を含む機能的意味で用いられる。
”捕獲リガンド９“なる用語は支持体と会合した捕獲抗
リガンド９と特異的に結合し得るリガンドを意味する。
”回収可能な支持体”とは媒体中に実質的に分散でと且
つその媒体から固足化、濾過、分配などＫより除去また
は分離で縫る物体を説明するために広義に解釈される。
０支持体゛は、単種で用いる場合、フィルターや膜のよ
うな慣用支持体、並びに回収可能な支持体を包含する。
リガンド９および抗リガンド９の結合に関して゛可逆的
”とは、リガンド９および抗リガンドの全体的な化学的
性質を永久に変えることのない変化を課したと六に結合
またはＭＩＩａシ得ろことを意味する。
例えば、制限するものではないが、可逆的結合はリガン
ド９または抗リガンド０を破壊しないｐＨ，温度および
イオン強度の変化によって制御される結合および解離を
よむであろう。
遺伝情報は生存細胞中に糸せのＤＮＡ分子として貯えら
れる。ｔｎ　Ｖｉｖｏにおいて、ＤＮＡ分子は６鎖がヌ
クレオチド鎖から成る二重鎖らせん禰造をしている。各
ヌクレオチドは４種の塩基：アデニン（Ａ）、グアニン
（Ｇ）、チミンα）、およびシトシン（Ｃ）のうちの１
つによって特徴づけられる。塩基は、官能基の配向によ
り、ある一定の塩基対が引きつけてあって水素結合およ
びπ−積み重ね相互作用（π−８ｔａｃｋｉｎｇｉｎｔ
ｅｒａｃｔｔｏｎ）によって互いに結合しているという
意味で相補的である。−本領ＤＮＡ中のアデニンは相補
鎖中のチミンと対をなし、−本領ＤＮＡ中のグアニンは
相補鎖中のシトシンと対合する。ＲＮＡにおいては、チ
ミン塩基がウラシル（Ｕ）で置換されており、ウラシル
は相補鎖中のアデニンと塩基対を形成する。
生物の遺伝暗号はＤＮＡ鎖に塩基対配列として刻まれて
いる。ＤＮＡはデオキシリボヌクレオチド９の共有結合
鎖から成り、ＲＮＡはリボヌクレオチドの共有結合鎖か
ら成る。
それぞれの核酸は１つのヌクレオチド９の糖の５′−ヒ
ドロキシル基と隣接ヌクレオチドの糖の３′−ヒドロキ
シル基との間をホスホジエステル結合により連結される
。自然界に存在するＤＮＡまたはＲＮＡの線状鎖は遊離
５′−ヒドロキシル基をもつ末端と遊離３′−ヒドロキ
シル基をもつもう１つの末端を有する。ｄｆ　ＩＪヌク
レオチドの両末端はそれぞれの遊離ヒドロキシル基に関
連させてしばしば５′扁または３′末端と呼ばれている
。天然ポリヌクレオチ白よ５′末端にリン酸基をもつこ
ともある。
ＤＮＡおよびＲＮＡの相補鎖は、一方の鎖の３′末端が
他方の鎖の５′末端に配向して結合する逆平行複合体を
形成している。
核酸ハイブリダイゼータ１ン検定は、２本の核酸鎖がそ
れらの相補領域において対合する傾向にあることを基礎
としている。現在、核酸ハイブリダイゼーション検足は
完全なりＮＡ分子、核酸混合物または核酸フラグメント
混合物に含まれる特定のＤＮＡまたはＲＮＡ塩基配列も
しくは遺伝子を検出し同定するために用いられている。
組織または培養試料から抽出した全ＤＮＡまたはＲＮＡ
に含まれる特定のＤＮＡま九はＲＮＡ配列もしくは遺伝
子の同定は生理学的または病理学的症状の存在を示す。
特に、ヒトまなは動物組織から抽出した全ＤＮＡまたは
ＲＮＡに含まれる特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列もしく
は遺伝子の同定は、鎌状赤血球性貧血１組織適合性、が
んおよび前がん状態、または細菌やウィルスの感染症の
ような遺伝症もしくは症状の存在を示唆することがでと
る。細菌培養物から抽出し六全ＤＮＡまたはＲＮＡに含
まれる特定のＤＮＡま六は沿仏配列もしくは遺伝子の同
定は、抗生物質耐性、毒物、ウィルスまたはプラスミド
によって生ずる疾患の存在を示し、また細菌の種類の同
定をもたらす。
従って、核酸ハイブリダイゼーション検定は病スの診断
および検出において非常に有用である。
゛さらに、Ａ％業や食品カロエの面でも有用であり、そ
の場合核酸ハイブリダイゼーション検定は植物病原菌ま
たは毒物産生菌乞検出するために用いられる。
最も広く用いられるポリヌクレオチドハイプリダイゼー
シジン検冗法の１つにサザン・プロット・フィルター・
ハイブリダイゼーション法または単にサザン去として知
られるものがある（Ｓｏｕｔｈθｒｎ。
Ｆｊ、、；ｆ、　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｘ、、　９８．５０３
．１９７５）。サザン法はターゲットＤＮＡま穴はＲＮ
Ａ配列を同定するのに用いられる１、この方法は一般に
対象のターゲット配列を含む可仲性のある、生物から単
離したＲＮＡまたはＤＮＡ試料を、制限エンドヌクレア
ーゼ消化にかけてＤＮＡフラグメントを形成させろこと
により実施される。そのイ憂、ＤＮＡフラグメント試料
はアガロースやポリアクリルアミドのようなゲル上で電
気泳動にかけてＤＮＡフラグメントなその長へに基づい
て分類する。各フラグメント群はターゲット配列の有無
について調Ｒられる。ＤＮＡはニトロセルロースシート
への移行を可能にするためにゲルの内部で変性する６Ｄ
ＮＡフラグメント含有ゲルはニトロセルロースフィルタ
ーまたはジアゾ化紙（ＤＮＡフラグメントが移行して、
結合または固芦化される）の上に接触（プロットした）
状態で直く。矛の後、ＤＮＡフラグメントを保有するニ
トロセルロースシートを約８５℃に加熱してＤＮＡを固
定化する。次に、ニトロセルロースシートは変性済（−
本領）放射能標識ＤＮＡプローブを含む溶液で処理する
。放射能標識プローブはターゲット配列に相補的な塩基
配列を有し１つ検出可能な放射性成分を有するＤ１１ｉ
Ａ鎖を含んでいる。
プローブとＤＮＡフラグメント試料との間でハイブリダ
イゼーションを行わしめる。ハイブリダイゼーション段
階で、固ず化ＤＮＡ試料は標識ＤＮＡプローブと組み合
わされて、再び二本鎖構造を形成する。
ハイブリダイゼーション法は非常に特異的である。標は
プローブは、ＤＮＡ試料とプローブとが実質的に相補性
の＃ｉｉ基対機構を共有しない限り、そのＤＮＡ試料と
結合しないであろう。ハイブリダイゼーションは所足の
条件に応じて３〜４８時間を要する。
ハイブリダイズしなかったＤＮＡプローブはその後洗い
流す。ニトロセルロースシートは絖いてＸ線フィルムの
シート上にのせて露光させる。ｘＨフィルムを現像して
、ＤＮＡプローブにノ・イブリダイズし大、それ故に対
象の塩基対配列を有するＤＮＡフラグメントを同定する
。
核酸ハイブリダイゼーション検定の使用は、ターゲット
の存在を示すプローブからの信号を、非ターゲット物質
へのプローブの非特異的結合によって生ずるノ之ツクグ
ラウンド９に対して、検出することが困難であるために
妨げられる。信号対ノイズ比は他の細胞破片から核酸を
分離することによりてバックグラウンドノイズを減少さ
せることにより改善で縫る。パックグラウンド３ノイズ
は対象の核酸を含むと思われる試料（プローブを添加し
たもの）を、非特異的に結合したプローブを除去するス
トリンジェント（厳密な）洗浄に付すことにより往々に
して軽減される。しかしながら、実際のこととして、洗
浄のたびに、特にストリンジエンシーが高まるにつれて
、少量のプローブがターゲットから解離する。研究者は
バックグラウンドノイズを制限することと、ターゲット
を検出するのに十分な信号を保持することの間で均衡を
保たねばならない。
信号対ノイズ比はまた、単一のターゲット分子から発生
される信号を増大または増幅きせることによシ改善され
る。実際のこととして、バックグラウンドノイズは通常
信号と共にある糧度まで増幅される。研究者は信号を増
幅させることと、ターゲットを検出できるしはルにバッ
クグラウンドノイズを保つことの間でバランスをとらね
ばならない。
核酸検定系における信号対ノイズ比を改善するために用
いる手法は、その検定系が用いられる全体的環境と適合
しなければならない。検索目的のためには、時間は信号
対ノイズ比を最大限にすることほど重要ではない。しか
しながら、医療用途および食品試砿においては、時間は
極めて重要なファクターである。例えば、時間の問題は
免疫診断や核酸診断を放射症標識から非アイソトープ系
へ移行させつつある。非アイソトープ系はＸ線フィルム
に必要な長い現像時間を必要としない。時間の問題はま
た医療および食品診断を培養法から他の検出系へ変換さ
せつつある。
有用かつ信頼で般る信号対ノイズ比を生じさせる問題は
いくつかの技術へ導いた。“核酸ハイブリダイゼーシ璽
ン検定“と題するヤプサキ（Ｙａｂｕｓａｋｔ）らのＰ
ＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ　８４１０２０２４、国際公
開番号ＷＯ３５１０２６２８は、プローブをターゲット
ＤＮＡへ結合させるために光反応性架橋反応を利用する
ことを報告している。しかしながら、ヤプサキの文献は
信号を増幅させる手段、またはターゲット鋳型上で隣接
するリガンド間に共有結合を光反応により形成させる手
段を示唆していない。”特定の核酸配列の検出“と題す
るバンカピラー（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌθｒ）らの欧州特
許出願第８５３０８９１０．０号は、２つの隣接するプ
ローブが酵素により一緒に連結されて検出可能な単位を
形成し得ることを開示している。しかしながら、酵素連
結反応は動車が悪く、とりわけ分析用途において通常出
くわす低いターゲット濃度において非効率的である。酵
素連結反応は多くの複雑な段階を必要とし、酵素活性の
変化を受けやすい。酵素は適当なインキエは−シ冒ンの
ために２時間またはそれ以上を要する。試料の調製、ハ
イプリダイゼーシッン、検出を含めた他の検定段階に加
えて、２時間のインキエベーシ冒ンは検定系の全継続時
間を長引かせ、それにより多くの臨床面でのその使用が
制限される。
（課題を解決するための手段） 本発明はターゲット鋳型上で実質的に隣接する２つのり
ガントを互いに連結させるための方法、試薬１組成物、
キットおよび装置を提供する。本発明の態様は対象とな
るターゲ７）ポリヌクレオチド９鎖の検定を行うのに適
している。別の態様は大きい分子の鋳型に基づいた構築
に適している。
要約すると１本発明の態様は共通のターゲットに結合す
る実質的に隣接しｆｃ２つのりガントを連′結させる方
法を包含する。この方法はターゲットを第一リガンドお
よび第二リガンドと接触させることを含む。第一リガン
ド９と第二リガンドの少なくとも一方は、それらが反応
位置に置かれたとき、活性化されて、第一および第二リ
ガンド９の間に共有結合を形成し得る反応性官能基を有
する。第一リガンドおよび第二リガンドは反応位置にお
いてターゲットに同時に結合して、受容体／第一・第二
リガンド複合体を形成することがで練る。次Ｋ、この、
方法は反応性官能基を活性化して第一リガンドと第二リ
ガンドの間に共有結合を形成させ、それによりリガンド
０反応生成物をつくる段階を包含する。
本発明の好適な態様は光反応性官能基を含む。
光反応性官能基は放射エネルギーにより活性化される。
本発明の態様は個々のセグメントから大舞い分子を構築
するのに用いられる。例えば、制限するものではないが
、本発明の態様は犬舞いＤＮＡまたはＲＮＡ分子の構築
に応用される。
本発明の態様はまた試料中のターゲット分子の存在を検
出する診断法に適用される。
１つの実施態様において、反応性官能基を活性化した後
に、ターゲットの存在を示すリガンド反応生成物の存在
について試料が監視される。
好適な態様は少なくとも１つの光反応性官能基を有する
第一リガンド９および第二リガンドを含む。
第一リガンドおよび第二リガンド９はターゲット分子上
で一緒になる。光反応性官能基が放射エネルギーにより
活性化されると、いずれのりガントからも区別できる検
出可能な特性を有するリガンド９−リガンド反応生成物
が形成される。リガンド−リガンド反応生成物の検出は
ターゲット受容体分子の存在を示す。
本発明の態様はポリヌクレオチドターゲット分子を検出
する検定系に通している。従って、本方法の別の態様は
第一プローブおよび第二プローブがポリヌクレオチド鎖
である検定法を包含する。
少なくとも１つのプローブは第一および第二プローブを
一緒に結合し得る光反応性基を有し、その′光反応性官
能基が活性化され且つ第一および第二プローブが反応位
置に存在するととプローブ反応生成物が形成される。第
一プローブと第二プローブはターゲットポリヌクレオチ
ドの実質的に１◆接する部分に結合するとき反応位置に
つくことができる。光反応性官能基は活性化されるとい
ずれのプローブからも別々に区別できる検出可能な性質
を有するプローブ反応生成物を形成する。プロープ反応
生成物の検出はターゲット分子の存在を示すものである
。
臨床試料、農業試料または産業試料を調堅る場合、好適
な態様は無関係の破片からターゲットを捕獲・分離する
試料処理段階、パラフグ２ウンＰを下げる段階、および
ターゲットを増幅する段階を含むであろう。
ターゲットポリヌクレオチド９について試料を検足する
好適な方法は、試料を第一プローブ、第二プローブおよ
び支持体と結合条件下で接触させることを含む。第一プ
ローブおよび第二プローブはそれらを一緒に結合し得る
少なくとも１つの光反応性官能基Ｆ基を有し、それによ
り第一および第二プローブが反応位１ｎに置かれると線
放射エネルギーの存在下でプローブ反応生成物が形成さ
れる。第一オよび第二プローブはターゲットポリヌクレ
オチドと結合して、第一および第二プローブが反応位置
にあるターゲット／第一・第二プローブ複合体を形成す
ることがで練る。少な（とも１つのプローブは捕獲リガ
ンげを含む、支持体は捕獲抗リガンドを含み、そのプロ
ーブと支持体とを会合させる。第二プローブは検出しつ
る標識成分を含む。
試料を第一プローブおよび第二プローブと接触させた後
で、この方法は官能基を活性化してプローブ反応生成物
を形成させる段階を包含する。この方法はプローノ反応
生成＃／支持体複合体（ターゲットと会合していてもよ
い）？形成させる段階を包含する。捕獲会合がｏＪ逆的
で必る掴合に、プローブ反応生成物および／またはター
ゲットは試料処理中に放出水れた細胞破片？よび非ター
ゲットポリヌクレオチビを含まない新しい媒体中に放出
される。捕獲リガンド−抗リガンド会合が不可逆的であ
る場合は、支持体をストリンジェント洗浄およびパージ
にかけてにＩＩＩ　Ｍ破片左よび非ターゲットポリヌク
レオチビを除去することかできる。
プローブ反応生成物は増幅および検出段階な宮む後続の
処理のために利用される。
本発明の１つの態様において、第一プローブまたはプロ
ーブ反応生成物は別の光反応性官能基によって捕獲支持
体と不可逆的に会合外れる。好ましくけ、支持体は回収
可能であシ、捕獲リガンドと共にプローブを含む媒体中
に実質的に均一に分倣で練るものである。
＃鎖成分をもつ第二プローブが第二捕獲リガンド９（該
リガンド１は第二プローブがターゲットに結合入れてい
るか又はプローブ反応生成物の一部であると六実質的に
弱められる）を含む場合、第二挿獲抗リガンド３をもつ
第二支持体が、ターゲットに結合していない又はプロー
ブ反応生成物の一部でｆｒい第二プローブをｔｔｑ獲す
るために用いられる。
ターゲットまたはプローブ反応生成物から解離している
筺ニブロープの捕獲はパックゲララント９ノイズを減少
させる。
好ましくは、第一プローブおよび第二プローブは両方と
も放射エネルギーにより活性化された際に相互作用して
プローブ反応生成物を形成しうる光反応性官能基を含む
。
好ましくは、１つの光反応性官能基は第一ポリヌクレオ
チドプローブの３′末端またはその付近に配置して、第
二プローブの５′末帰またはその付近に配置された第二
光反応性官能基と相互作用で弾るようにする。こうして
、第一プローブおよび第二プローブは、光反応性官能基
をもつ第一プローブの３′末端が第二光反応性官能基を
もつ第二プローブの５′末端に実質的に隣接しｆｃ反応
位１Ｋをポリヌクレオチドターゲット分子上にとるであ
ろう。
好ましくは、光反応性官ＭＱＹ活性化し、ＤＮＡの光化
学ｗＲｔ小眼に抑え、かつ形成されたプローブ反応生成
物の分解を最小限に抑えるために波長が選ばれる。クマ
リン様光反応性官能基の場合は、約３００〜３８０ナノ
メートルの波長が好適である。さらに、好適な光反応性
官能基は反応エネルギーレベルへ励起させるために１０
００　ｍｏ〕ｅ　　・１・１以上の吸光係数、最も好ま
しくは約１０，０００ｍｏｌｅ　・１・ｃｒｒＬ−１の
吸光係数ンもつ。
好適な光反応性官能基にはベンゾ−α−１−′ロン（慣
用名クマリン）が含まれる、ベンゾ−α−ピロン、クマ
リン、は欠の構造式で表される：好ましくは、そのクマ
リン誘導体はα、β−不飽和ラクトン官能価と共に５位
または７位にヒドロキシ基あるいはメトキシ基を含み、
約３２０ナノメートルで顕著な吸光度を示す５−ヒドロ
キシ−クマリンまたは７−メドキシークマリンでありう
る。
さらに、ベンゼン環上の置急基はクマリン誘導体のアミ
ン官Ｈｒ化ＤＮＡへの結合を可能にする。従って、５−
ヒドロキシ−クマリンおよび７−ヒドロキシスクシンは
水溶液中で脂肪瑛アミノ基と反応することが知られてい
るＮ−ヒドロキシスクシン−イミ＋：エステル基をオキ
シメチレン結合鎖の末・ン５旧て付加するととにより誘
導体化さｆする。好ましくは、クマリンメチレン鎖は１
〜】０個の原子を含み、最も好ましくはメチレン鎖は長
さが３個の原子から成る。メチレン鎖は炭？ＭＩ＋χ子
以外の原子オＳよび官能基（例えば酸素原子や窒素原子
）７會むことかで般る、 好ましくは、官能化ＤＮＡもメチレン鎖を含む。
ＤＮＡメチレン鎖はクマリンメチレン鎖と反応する官能
基を含む。ＤＮＡメチレン鎖上の好適な官能基はアミン
である。ＤＮＡメチレン鎖は好ましくは長さが１〜１０
個の原子から成り、最も好ましくは４原子の長さであっ
てその末端原子がアミンである。
ＤＮＡメチレン鎖は炭素原子以外の原子および官能基（
例えば酸素や窒素原子）を含んでいてもよい。
ＤＮＡメチレン鎖とクマリンメチレン鎖はＤＮＡ　−ク
マリン結合鎖を形成する。この結合鎖はクマリン誘導体
を以下に示すような２プラス２シクロ付加反応に適した
位１身につかせるために運動の自由を可能にする： ターゲットプローブ 好ましくは、その結合は長さが１〜１０個の原子から成
る。好適なりマリン誘導体を以下に示す：次の構造式で
表されるプソラレンである：好ましくは　Ｒ１〜Ｒ６は
−Ｊ　−Ｃ）１３　、−ＣＨ２（Ｊ　、　−ＣＨ２Ｂｒ
　。
−ＣＨ２Ｉ　、　−ＣＦ１２　Ｆ　、　−Ｃｌ　Ｃ１２
、−ＣＨＢｒ　２　、−　ＣＨＩ　２　ｍ　−ＣＨＦ’
　２　ｅ−ＣＨ２０Ｈｊ−ＣＨ２ＱＣ）１３．−Ｃ）１
２ＮＨ２，−Ｎ３．−ＣＯＯＨ。
−ＣＯＯＣＨ３、−Ｃｏｏ　ＣＨ２ＣＨ３、−ＮＨ２、
−ＮＯ２、−ＣＢ　ｒ　３　＊−Ｃ１！　ａ　＊　−〇
Ｆ′３＋　−ＣＣＩ　ａ　＊　−ＣＨ（ＣＨａ　）　２
１−　Ｃ（ＣＨ３）　ａ　＋−Ｃ１、−Ｂｒ　、　−Ｉ
　、　−Ｆ　、および−〇（ＣＨ２）ｎＣＨ３（ｎ＝０
〜１０）より成る群から選ばれ、その際Ｒ１〜Ｒ６のう
ち１つは官能化ＤＮＡ分子へ結合するための反応性基を
含む。好ましくは、ＤＮＡ分子はアミノ基で官能化され
る。
光反応性官能基はアルキル化、縮合ま穴は付加のような
化学反応によりプローブ分子に共有結合されるであろう
。
光反応性官能基として適した他の化合物の例は上記のよ
うに、Ｒ１−Ｒ６はそれぞれ例えば、−Ｈ、−ＣＨ３，
−Ｃ１２Ｃｌ、　−ＣＨ２Ｂｒ　ｊ−Ｃ１２工、−ＣＨ
ＣＯ２゜−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨＢｒ２．−ＣＨＩ２．−Ｃ
ＨＦ２．−ＣＨ２０Ｈ，−ＣＨ２ＮＨ２゜−Ｎ３．−Ｃ
ＯＯＩ（、−ＣＯＯＣ）１３．−ＣＯＯＣＨ２（Ｊ１３
．−ＮＨ２，−Ｎｏ２゜−Ｃｅ　３　、−ＣＢｒ　３．
−ＣＦ’　３．−ＣＣｌ　３　、−ＣＨ（Ｃｌ　ａ　）
　２　、−Ｃ（ＣＨ３）３　。
−Ｃ１，−Ｂｒ、−Ｉ、−Ｆ、および−〇（ＣＨ２）ｎ
ＣＨ３（ｎ＝０〜１０）より成る群から選ばれ、その際
Ｒ１〜Ｒ６のうちの１つは官能化ＤＮＡ分子に結合する
ための反応性基を含む。好ましくは、ＤＮＡ分子はアミ
ン基により官能化される。
光反応性を示す別の官能基にはオレフィン、共役オレフ
ィン、ケトン、α、β−不飽和ケトン、アジド、共役二
重結合およびケトン官能基により特徴づけられる共役ポ
リオレフィン、無水マレイン酸、アルキルマレイミド、
トロポン、クロモン、キノンなどが含まれる。
本発明の態様は、ターゲット分子にプローブをハイブリ
ダイズすることにより生ずる信号を増幅する方法に特徴
がある。本方法は、実質的に不可逆的方法で２つのプロ
ーブを共有結合させてプローブ反応生成物を形成するこ
とによりノ１イブリット９化法のメモリーを作る。共有
結合に続いて、プローブ反応生成物をターゲット分子か
ら除くことかでと、別の第一および第二のプローブ分子
が同じターゲット分子の反応性部位をハイブリダイズし
モしてこの部位を得る。新しい第一および第二プローブ
分子は光連結されて、同一ターゲットからさらに別のハ
イプリダイゼーシッンを記録する。
未反応プローブ分子とターゲット分子とのハイブリダイ
ゼーシヲンの繰り返しおよび光連結されたプローブ反応
生成物の形成は必要に応じて継続され（光連結法の効率
によってのみ制限される）、ターゲット分子の存在に基
づいた信号の更なる増幅をもたらす。
従って、本発明の１つの態様は単一のターゲット分子か
ら生じる信号を増幅させる方法を包含する。この方法は
第一プローブと第二プローブを含有する過剰のプローブ
試薬の存在下で、対象のターゲット分子を含む可能性の
ある試料に結合条件を与える段階を含む。第一プローブ
と第二プローブは、光反応性官能基が活性化され且つこ
れらのプローブが反応位置に存在すると昶、第一プロー
ブを第二プローブへ結合し得る少なくとも１つの光反応
性官能基を含む。別の段階は光反応性官能基を放射エネ
ルギーで活性化して、検出可能なプローブ反応生成物を
形成させることを包含する。
さらに別の段階は、プローブ反応生成物をターゲット分
子から解離させ、それにより別の第一プローブと別の第
二プローブをターゲット分子上のプ・ロープ反応生成物
の位置につかせることを包含する。さらに別の段階は、
光反応性官能基を活性化して単一のターゲット分子から
多数のプローブ反応生成物をつ（す、それにより追加の
信号を発生させることを包含する。このサイクルは必要
に応じて繰＃）返すことができるが、光反応の効率によ
り制限を受ける。
ターゲット分子がポリヌクレオチーである場合、結合お
よび解離条件は一般にｐＨ、イオン強度ま六は温度を調
節することにより与えられる。上記の調節はすばて時間
がかかり、処理量の多い診断装置の場合には都合が悪い
。
驚いたことに意外にも、す堅ての用途において。
ターゲット上のプローブ反応生成物の位置に新しい組の
第一・第二プローブをつかせるために、プローブ反応生
成物／ターゲット複合体を解離条件に付す必要性がない
。ある条件のもとでは、光反応性官能基の光反応はプロ
ーブ反応生成物がターゲット分子を去るようＫＭ導して
、未反応の過剰の第一および第二プローブをターゲット
分子鋳型上の反応位置につかせる。放射エネルギーのパ
ルスまたは連続供給は単一のターゲット分子に対して複
数のプローブ反応生成物をもたらすであろう。
Ｎいたことに、隣接するプローブに光反応性官能基を用
いると、単一のターゲット分子から発生する信号が３０
倍まで増幅された。信号の増幅は一般にターゲット鋳型
に共有結合するプローブ分子間に副反応が生じることに
よシ制限される。
ターゲット分子鋳型への結合を立体的に妨害される光反
応性官能基はプローブのターゲットへの架橋を制限し、
更なる増幅を起こさせるであろう。
好適な光反応性官能基であるクマリン−５−オキシ酪酸
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルはターゲット分
子鋳型と容易に反応することはない。
さらに、ポリヌクレオチド９ターゲツト分子の場合、光
反応性ヌクレオチドをほとんど含まない領域をもつター
ゲット分子を選択すると、ＤＮＡ鋳型に対する架橋反応
の発生がさらに制限されるであ゛ろう。一般に、比較的
高濃度のピリミジンを含むＤＮＡ領域はプローブとＤＮ
Ａ鋳型の間の架橋副反応の比率を高める一因となる。
さらに、ＰＨ、イオンまたは熱循環なしにＤＮＡターゲ
ット鋳型を去るポリヌクレオチド９プローブの能力は、
光反応性共有結合性官能基同士の光反応による熱エネル
ギーの発生に関係しており、またある程度まで放射エネ
ルギーや立体エネルギーの吸収の際にＤＮＡ分子により
て発生されるエネルギーに関係している。本発明の態様
は、放射エネルギーを吸収してプローブ反応生成物／タ
ーゲット複合体に局在化された熱効果を誘発し得る発色
団をプローブまたはターゲットの近傍に導入することケ
包含する。
その後の処理はプローブ反応生成物の検出を含む。プロ
ーブ反応生成物の検出のために、本発明の１つの態様は
、第一および第二プローブの少なくとも一方が検出口■
能な標識成分をもつこれらのプローブの使用を伴う。好
ましくは、標識成分はバックグラウンドを下げるために
、ターゲット捕獲またはプローブ反応生成物捕獲用の捕
獲リガンド手段をもたないプローブに結合される。捕獲
手段をもつプローブは第一および第二プローブをプロー
ブ反応生成物へ光連結する段階の後に捕獲され、こうし
てプローブ反応生成物に結合された標識成分のみが捕獲
され、その結果パックグラウンド９ノイズが制限される
。
その後の処理はま六、追加のプローブ反応生成物を形成
するターゲット鋳型上でのプローブの循環を越えた更な
る増幅を包含する。従って、本発明の１つの態様は、そ
の後検出されるプローブ反応生成物の酵素的増幅を伴う
。こうして、第一および第二プローブがＲＮＡボリヌク
レオチビである場合、酵素Ｑβレプリカーゼを用いて、
プローブ反応生成物の存在に基づいて多量の酵素反応生
成物をつくることかで芦る。第一およびレニプローブが
ＤＮＡポリヌクレオチド９である場合は、酵素ＤＮＡポ
リメラーゼを用いて多量の酵素反応生成物をつくること
ができる。酵素反応生成物はその後プローブ反応生成物
よりも多量に存在するために比較的簡単に検出できる。
また、鋳型としてプローブ反応生成物を用いる場合、第
一プローブおよび第二プローブに対しアンチセンスの第
二群のプローブを利用して増幅させることもできる。第
二群のプローブは酵素により又は反応性官能基を介して
連結される。第二群のプローブの少なくとも一方は検出
可能な標識成分を含む。
本発明の別の態様は、共通のターゲットに結合する実質
的に隣接した２つのりガントを連結させるための装置を
包含する。この装置はターゲットおよび第一・第二リガ
ンドを受け入れるための封入容器を含む。第一および第
二リガンＰの少なくとも一方はこれらのリガンド０が反
応位置に置かれたとと活性化されて第一および第二リガ
ンドの間に共有結合を形成し得る反応性官能基を有する
。
１−ＩＪガント９および第二リガンド９はターゲットの
反応位置に同時に結合することかでキ、それによりター
ゲット／ｍ−−第二リガンド株合体を形成させる。この
装置はさらに第一および第二リガンド０のＩｆｆに共有
結合を形成させるｆＣぬに反応性官能基な活性化する手
段を包含する。
本発明の態様は特にターゲット分子の存在を検出する診
断法に適用される。本装置の１つの態様において、容器
はｍ−ＩＪガントおよび第二リガンドを試料からのター
ゲット分子と共に受け入れるのに適したものである。、
＄、−リガンドおよび第二リガンド９は第一プローブな
第二プローブへ共有結合させることができる反応性官能
基を有し、その反応性官能基が活性化され且つ第一プロ
ーブと第二プローブが反応位置に存在するときプローブ
反応生成物を形成する。この装置はさらに第一リガンド
１および第二リガンドをターゲット分子と結合状態にす
るための手段を含む。Ｘ−リガンドおよび第二リガンド
はいずれのリガンド９からも別々に区別される検出可能
な特性を有するリガンド反応生成物を形成し得る。この
装置は反応性官能基を活性化するための活性化手段を含
む。活性化手段はｐｆＡ　１１１Ｊ御、光源、補助因子
の注入などでありうる。
この装置はさらにリガンド反応生成物の存在（り・−ゲ
ット分子の存在を示す）を検出するための検出手段を含
む。
好適な態様は放射エネルギーにより活性化される反応性
官能基を含む。活性化手段は好ましくは光反応性官能基
の活性化波長に相当する実質的に制御された波長をもつ
光源を包含する。従って、光反応性官能基が約３００〜
３８０　ｎｍの活性化エネルギーをもつ場合、好適な活
性化手段はへリウムーカビミウムレーザー、窒素レーザ
ー、水銀アーク灯、または適当なフィルターヶ備えた他
の光源でありうる。
本装置の態様は、粗製試料を受け入れ且つその試料を処
理してターゲット受容体分子を放出させるのに適してい
る。別の態様はターゲット受容体分子を捕獲する手段お
よびバックグラウンドノイズを捕獲する手段に特徴があ
る。さらに別の態様は信号を増強させるためにプローブ
反応生成物またはターゲットを増幅する手段に特徴があ
る。
”粗製試料“なる用語は例えば生検試料や組織試料、痰
、血液、排泄物、スワブ、培養物などを含め７’（臨床
試料；植物土壌試料を含めた農業試料；および発酵試料
、食品および植物材料などを含めた産業試料を意味する
ために用いられる。
従って、本装置の１つの態様は試料処理のために組型試
料を受け入れる手段を含む。試料処理はカオトロピック
（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ）溶液中での試料の溶解、アル
カリ処理、または細胞構成成分からポリヌクレオチビタ
ーゲット分子を放出させるための超音波処理などを伴う
。この装置はさらに第一グローブおよび第二プローブを
受け入れる手段を含む。第一および第二プローブの少な
くとも一方はこれらのプローブが反応位１直に貢がれた
とき放射エネルギーの存在下で第一グローブと第二プロ
ーブの間に共有結合を形成させて、プローブ反応生成物
を形成し得る光反応性官能基を有する。第一グローブと
第二プローブはポリヌクレオチビターゲット分子の反応
位置に同時に結合してターゲット／第一・第二プローブ
複合体を形成する。この装［直はさらにこれらのプロー
ブが反応位置につくように、これらのプロープンターゲ
ット分子と結合状態にするための手段を含む。この装置
はさらにグローブが反応位置にあるとき放射エネルギー
で光反応性官能基を活性化するための光連結手段を包含
する。この装置はさらにプローブ反応生成物を捕獲する
支持体手段を含む、これらのプローブの少なくとも一方
は固体支持体へ結合させるための捕獲リガンドを有する
。この装置はさらにターゲット分子から細胞破片を分離
する手段を含む。ターゲットから細胞破片を分離する手
段は例えば洗浄手段およびプローブ反応生成物を妨げる
ことなく細胞破片に向けられる他のパージ手段を伴う。
この装置はまたターゲット分子の存在７示すプローブ反
応生成物の検出手段を包含する。
本装置の１つの態様は反応性官能基を（Ｉｆ１獲する捕
獲リガンドに特徴がある。活性化されると、捕ψ文応性
官能基は固体支持体とプローブ反応生成物の間に共有結
合ケ形成する。固体支持体とプローブ反応生成物との共
有結合は一層ストリンジェントな洗浄および・２−：）
を可能にする。プローブ反応生成物からの細胞破片の更
なる除去はバックグラウンド１ノイズを減少させるであ
ろう。
本発明の別の態様は回収可能な支持体に特徴がある。回
収可能な支持体は第一または第二プローブの一方と補獲
りガントを介して会合しているか、または会合すること
がでとる。回収可能な支持体は試料媒体中に実質的に均
一に分散され、溶液動力学によく似ている。支持体は例
えば粒子形体にＬ＆ニトロセルロース、ビーズまたは他
の粒状物質のような多くの形体をとることができる。ニ
トロセルロースはニトロセルロース支Ｎ体Ｙ含む試料媒
体馨篩に通すことにより回収できる。ニトロセルロース
はまな磁場をかけた際に試料媒体中を移動できろように
磁性粒子ン含浸させてもよい。
ビーズや粒子は試料を篩にかけることにより濾過される
。ビーズや粒子はまた磁場ンかけた際に試料媒体中での
ビーズや粒子の移動を可能にする電磁性ン示す。ポリス
チレンビーズのようなビーズはそれらの密度に応じて水
性媒体の表面に分配される。
未標識プロープン捕嫌するのに適した回収可能な支持体
は、ターゲット捕獲またはプローブ反応生成物捕獲２行
わしめる大めに用いられる。標識プローブを捕獲するの
に適した回収可能な支持体は、プローブ反応生成物の一
部′？：構成しない標識プローブの形のバックグラウン
ドノイズを捕獲するために用いられる。
本発明の別の態様は光反応性官能基としての用途をもつ
組成物を包含する。好適な組成物はクマリン誘導体を合
有する。好ましくは、そのクマリン誘導体は約３２０ナ
ノメートルに有意な吸光度をもつ５−ヒト９０キシまた
はメトキシ−クマリンもしくは７−ヒドロキシまたはメ
トキシ−クマリンを与えるように、α、β−不砲和ラク
トン官能基と共に５位ま六は７位にヒＰロキシ基もしく
はメトキシ基を含んでいる。
好ましくは、クマリン誘導体はりガントの反応性官能基
と反応するｔｔ換基ンベンゼン環上に有する。従って、
５−ヒドロキシ−クマリンおよび７−ヒドロキシクマリ
ンはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基（水溶液
中で脂肪族アミノ基と反応することが知られている基）
をもつメチレン鎖でアルキル化することにより誘導体化
される。
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルハリガンドの脂
肪族アミノ基と反応することが−ｄｑる。他のアミン反
応性基には例えばイソチオシアネート。
スルホン酸クロライド９、カルボン酸、ブロモアルキル
、ジクロロトリアジン、アルデヒ）”、ｐ−二トロフェ
ニルエステル、ペンタクロロフェニルエステルおよびイ
ミデートが含まれる。
好ましくは、メチレン鎖は１〜１０個の原子ケ含み、最
も好ましくは原子数３の鎖長である。メチレン鎖は炭素
以外の原子（例えば酸素や９累）を含んでいてもよい。
クマリンのメチレン鎖は官能化ＤＮＡと反応して結合鎖
を形成で練る。この結合鎖は先に示した光付加反応に適
した方向にクマリン誘導体が向くように十分な運動の自
由を可能にする。
本発明の別の態様はベンゾ−α−ピロン、プンラレン、
アントラセン、ピレン、カロチン、共役二重結合とマト
ン官能基により特徴づけられる共役ポリオレフィン、お
よびそれらの誘導体より成る群から選ばれる光反応性官
能基をもつポリヌクレオチビを包含する。
好ましくは、クマリンは次の構造式で表されるクマリン
群から選ばれる： 式中、Ｒ’−Ｒ’バーＨ、−ＯＲ，−ＣＨ３，−ＣＨ２
Ｃ１。
−ＣＨ２Ｂｒ　、−ＣＨ２Ｉ　、　−ＣＨ２Ｆ　、　−
ＣＨＢｒ　２　、−ＣａＣｌ２　、−（］ａＦ’２　。
−ＣＨ工２．−ＣＨ２０Ｈ，−ＣＨ２ＮＲ２，−Ｎ３Ｃ
ＯＯＨ，−ＣＯＯＣＨ３゜−Ｃｏｏ（ＪＩ２　ＣＨ３、
−ＮＲ２、−ＮＯ２、−ＣＢｒ　３　、−Ｃ１３、−Ｃ
Ｆ　３　。
−Ｃ（Ｊ３．−ＣＭ（ＣＨ３）２．−０（ＣＨ２）ｎＣ
Ｈ３（ｎ＝ｏ〜１０）　１−Ｃ（ＣＨａ）ａ＋−（Ｊ、
−Ｂｒ、−Ｉ、および−Ｆより成る群から選ばれる。
好ましくは、プソラレンは次の一般式を有する：Ｏ 式中、Ｒ１−Ｒ６はそれぞれ例えば−Ｂ、−ａＨ３゜−
Ｃ１２Ｃｌ、　−ＣＨ２Ｂｒ　、　−Ｃ１３Ｉ　、　−
ＣＢ２Ｆ’、−ＣＨＢｒ２．−ＣＨＣ６２゜−ＣＨＦ’
２．−ＣＨ工２．−〇）１２０Ｈ，−ＣＨ２０ＣＲ３，
−ＣＨ２ＮＨ２゜−４３Ｃｏｏｎ、−ＣＯＯＣＨ３，−
ＣＯＯＣｆｉ２ＣＨ３，−０（Ｃ２Ｈ４）　ｎＣＨ３（
ｎ＝　０〜１０　）　、　−ＮＲ２、−ＮＯ２、−ＣＢ
ｒ３　、−Ｃ１３＋　−ＣＦ３　ｍ−ＣＣ５，−ＣＨ（
ＣＨ３）２．−Ｃ（Ｃｌ、）３．−Ｃｌ、−：Ｂｒ、−
工、−ｒより成る群から選ばれる。
好適なりマリン誘導体にはクマリン−７−オ千シ８ＨＮ
−ヒト９０キシスクシンイきビニステル、４−メチルク
マリン−７−オキシ酪酸Ｎ−ヒト０ロギシスクシンイミ
ドエステル、７−ノドキシクマリン−６−オキシ酪酸Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミドエステル、およびクマリ／
−６−インチオシアネートが含まれる。本発明の別の態
様は、それぞれの鎖の３′および５′末端で光反応性官
能基の誘導体により共有結合され７’（２本のポリヌク
レオチド鎖の反応生成物から成る組成物ン包合する。
本発明の別の態様は、それぞれ３′末端と５′末端？も
つ第一鎖および第二鎖ケ有し、一方の鎖の３′末端が光
反応性モノマーから形成され六ダイマーｌ介して他方の
鎖の５′末端に結合されている修飾ポリヌクレオチドか
ら成る組成物ン包含する。
本発明の別の態様は、隣接する２つのリガンド９をター
ゲット分子へ光連結させるためのキットを包含する。タ
ーゲット分子がポリヌクレオチＰである診断法に適用す
る場合、キットは対象のターゲット分子を含む可能性の
ある試料に接触させるための試薬を含んでいる。その試
薬は第一プローブと第二プローブから成り、ここで第一
プローブおよび第二プローブは、それらのプローブが反
応位置に置かれたと診、放射エネルギーの存在下で第一
プローブと第二プローブを共有結合させてプローブ反応
生成物を形成しつる、少なくとも１つの光反応性官能基
を有する。第一プローブおよび第二プローブはターゲッ
ト分子に結合することによって反応位置につくことがで
とる。プローブ反応生成物は第一プローブまたは第二プ
ローブのどちらからも個々に識別でとる検出可能な特性
を有する。
本発明の態様は構成および方法の点で単純である。本発
明の態様は特にＤＮＡプローブ診断および非放射性プロ
ーブ標識に適用される。さらに、光反応性官能基を用い
て実質的に隣接する複数のプローブを共有結合させる方
法はいろいろな段階および操作に応用できるだろう。
本発明の他の特徴および利点は、本発明およびその原理
の好適な態様を例示し且つ現在これらの原理を適用する
ための最良の形態であると考えられる以下の説明から明
らかになるであろう。
本発明はＤＮＡプローブ診断装置に関連させてポリヌク
レオチドターゲット分子へ隣接するポリヌクレオチドプ
ローブ類を連結させるための方法および装置として詳細
に説明される。この説明は本発明の原理乞例示′１−る
ためのものであって、本発明をこれらの例示した態様に
限定するものでないことを理解すべきである。本発明は
２つの１壜接するリガンド分子ヶ共有結合させて鋳型抗
リガンド１上にリガンビ反応生成物を形成することが必
要な場合にいつでも使用できる。例えば、本発明方法粘
よび装置は免疫診断、ヌクレオチド０合成および塩基配
列決定に適用される。
第１図を参照すると、そこには人質的に隣接するリガン
ド類を光連結させる方法および装置が開示されておシ、
ポリヌクレオチドターゲット分子を検出する診断目的の
ために特に適用される。
第１図には接足を行うための方法および装置が模式図で
示されており、検定装廿虻は一般に数字１１で表される
。装ｊｌｌｌは次の主な構成部品を含む：封入容器１３
、二重矢印で概略的に示される運搬手段、ターゲットポ
リヌクレオチドの変性手段１７゜ターゲットポリヌクレ
オチドおよび第一プローブと第二プローブにハイプリダ
イゼーシッン条件を付与する手段１９、封入容器内に放
射エネルギーケ発生させる手段２１、および検出手段２
３゜第１図に示すように、この装置は７段階に分けられ
る。、第１図の段階１において、封入容器１３はポリヌ
クレオチド１ターゲツト分子を含む可能性のある細胞を
含有する臨床試料を受け取る。細胞は病原体、遺伝的疾
患および望ましい遺伝子特性を示す対象の塩基配列を有
するターゲット核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ　）を保有し
つる。ポリヌクレオチド配列は次の呼吸器感染症、下痢
、性病、敗血症および食品衛生について同定することが
できる。
呼吸器感染症： （／Ｊ）細菌＝β型溶血連細球菌（Ａ群）、インフルエ
ンザ菌、肺炎球菌、マイコプラズマ肺炎、ミコバクテリ
ア； （ｂ）　　ウィルス：インフルエンザＡ型、インフルエ
ンザＢ型、パラインフルエンザ（１，２オヨヒ３型）、
ＲＳウィルス、アデノウィルス、コロナウィルス、リノ
ウイルス。
下痢： （ａ）細菌：サルモネラ菌、赤痢菌、エルジニア・エン
テロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎａ　ｅｎｔｅｒｏｃ−ｏｌ
ｌｔｉｃａ）、大腸菌、クロストリジウム・ディフィシ
ル（Ｃｌｏｓｔｒｌｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、キ
ャンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）　；
＜ｂ＞　　ウイルス二ロタウイルス、パルボウイルス、
アテノウイルス、エンテロウィルス。
性病： （ａ）細−：淋菌、梅毒トレボネーマ、トラコーマクラ
ミジア； （ｈ）　　ウィルス：単純庖疹ウィルス、後天性免疫不
全症（ＡＩＤＳ）ウィルス； （Ｃ）酵母：カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｌａａ
ｌ＋１ｃａｎａ）　； （ｃｔ）原生動物：膣トリコモナス。
敗血症： （ａ）細菌＝β型溶血連鎖球菌（Ａ群）、肺炎球菌、腸
内細菌； 食品衛生： （ａ）細菌：サルモネラ菌、ウェルチ菌。
臨床試料は排泄物または生理学的液体、例えば、便、尿
、唾液、膿、血清、血漿、眼液、を髄液、リンパ液、性
器洗浄液などから得られる。当業者は当分野で知られた
方法により生検試料を単細胞懸濁液または小さい塊に変
えることを望むかもしれない。例えば、固体組織の生検
試料はその試料を０．５Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩
化マグネシウム、０．１４　Ｍ　ＩＪ　ンＬｖＩＲｍ溶
液（ＰＨ６，８）オヨヒ２５Ｗ９／ｍＡ！シクロヘキサ
ミド９の混合物中で攪拌することＫより、単細胞懸濁液
または小さい細胞塊に有利に変えることができる。分画
遠心、密度勾配遠心のような当分野で確立された方法を
用いて特定の細胞型を分離することもこの段階で行われ
る。
細胞はその後それらのＤＮＡおよび／またはＲＮＡを遊
離させるイく処理される。化学的細胞溶解は当分野でよ
（知られている。化学的溶解は希薄アルカリ水浴液、例
えば０．１〜ＩＭ水酸化ナトリウムを用いて行われる。
アルカリはま７’ｉ　ＤＮＡやＲＮＡを変性するのにも
役立つ。細胞俗解剤中でのその他の変性には昇温、有機
試薬（例えばアルコール。
アミド９、アミン、尿素、フェノールおよびスルホキシ
ド）、または無機イオン（例えばトリフルオロ酢酸ナト
リウム、トリクロロ酢酸ナトリウム。
過塩素酸ナトリウム、グアニジニウムイソチオシアネー
ト、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、イソチオシア
ン酸ナトリウムおよびインチオシアン酸カリウムのよう
なカオトロピック塩）が合まれる。
臨床試料はまｆｃ収扱いがよＶ簡単な別々のセグメン）
　Ｋ　ＤＮＡまたはＲＮＡを分割するために制限エンＰ
ヌクレアーゼ消化に付される。試料処理段階の完了時点
で、臨床試料は核酸試料、細胞破片および不純物を含ん
でいる。
別の試薬として第一プローブおよび第二プローブが含ま
れる。第一プローブおよび第二プローブは、それらが反
応位置に存在するとｔ光活性化されると第一および第二
プローブを一緒に共有結合させてプローブ反応生成物を
形成しうる光反応性官能基を有する。第一プローブおよ
び第二プローブは、ターゲット分子に結合してターゲッ
ト／第−命第二プロープ複合体を形成するとき反応位置
につくことになる。ターゲット分子が存在しない場合、
プローブは反応位置につかないであろう。
従って、プローブ反応生成物の形成はターゲット分子の
存在を示唆するものである。
当業者は、溶媒および第一プローブと第二プローブの試
料への添加順序が任意であることを認めるであろう。し
かしながら、第一および第二プローブが細胞物質を可溶
化するために用いる剤と適合しうるように注意しなけれ
ばならｔ、ｃい。
段階１の完了時に、ポリヌクレオチド９ターゲツト分子
を遊離させるべく処理された試料は運搬手段によって段
階２へ送られる。ここで用いる運搬手段にはエンド９レ
スベルト、ターンテーブル、または本方法の異なる段階
を実施する場所への手動移送が含まれる。段階２では１
本発明の１つの態様は捕獲プローブと会合した又は会合
しうる支持体によりターゲット核酸を捕獲する段階およ
び装置を包含する。ターゲット捕獲段階は必ずしも必要
でなく、任意である。
捕獲プローブは別個のプローブであってもよく、またも
う１つのプローブと共同して反応に関与するプローブの
特徴ケ備えていてもよ（、第一まｋは第二プローブとし
てターゲットと一緒に存在することかできる。従って、
捕りプローブは光の存在下で第二プローブに共有結合し
つる光反応性官能基ｌ含むことかできる。
プローブ成分はプローブ成分と回収可能な支持体との間
の共有結合により、プローブ成分の回収可能な支持体へ
のアフィニティ会合により、プローブ成分の回収可能な
支持体への氷菓結合により。
ま次はプローブ成分の回収可能な支持体への非特異的会
合により、支持体と会合しているか、あるいは会合する
ことができる。本明細書中で述ばたように、第一プロー
ブは回収可能な支持体と会合したホモポリマー尾部に結
合し得る相補的ホモポリマー尾部を含み、また第二プロ
ーブとの光反応にも関与するであろう。
回収可能な支持体はいろいろな形をとることができ、例
えば支持体を含む試料媒体ヲ簡に通すことによシ回収で
きる粒子形状にし六ニトロセルロース；磁性粒子ン含浸
させることにより磁場をかけ穴際に試料媒体内乞移動で
芦るようにしたニトロセルロースまなは類似の物質；濾
過しうるかまたは電磁性を示すビーズもしくは粒子；お
よび水性媒体の表面に分配されるポリスチレンビーズで
あり得る。
本発明の好適な態様は、試料媒体中に実質的に均一に分
散しうる能力により特徴づけられる磁性ビーズから成る
回収可能な支持体を包含する。好ましくは、磁性ビーズ
はその磁性支持体粒子へのホモ、）？　＋７マ一尾部の
共有結合を促進する第一アミン官能基を含む。
好ましくは、磁性ビーズ支持体は単磁区磁石であって、
残留磁気を示さない超常磁性のものである。その粒子ま
たはビーズは磁石型粒子から成るが、それらは反応性表
面をもち且つ磁場に反応する能力を示す限り、他の磁性
金属または金属嘴化物であり得、純粋でない形１合金あ
るいは複合形体であってもよい。単独で又は鉄との組合
せで用いられる他の材料には、限定するものではないが
。
コバルト、ニッケルおよびシリコンが含まれる。
磁性粒子または金属酸化物粒子の製法はヴアンデンパー
ダ（Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ）ら、′超微ｊｇＪＪ　
コ／Ｚ　ルト７エライトの製法および磁性”　、　Ｊ、
ｏｆ　ＭａｇｎｅｔｉｓｍａｔｏＬ　Ｍａ　ｎｅｔｉｃ
　Ｍａｔｅｒｉａｌ　、　１５−１８　：１１１７−１
８（１９８０）；−ｒチジェビック（Ｍａｔｉｊｅｖｉ
ｃ）、″単分散金属（含水）酸化物−一コロイド９科学
の魅力的分野”　、　Ａｃｃ、Ｃｈｅｔｎ、Ｒｓｓ、、
　１４：２２−２９（１９８１）に記載されている（こ
れらの技術内容は参照によシここに引用され心０本発明
で使用するのに適した磁性ビーズはＡｄｖａｎｃｅｄ　
Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ社からＢｉｏ　−Ｍａｇの商標名で
市販されている第一アミン官能基χ含む磁性ビーズであ
る。
好適な磁性粒子は非多孔質であり、しかもまだプローブ
成分と会合し得るものである。プローブ成分の会合に関
与しない反応性部位は他の試薬、不純物および細胞物質
の非特異的結合を阻止するためにブロックするのが好ま
しい。磁性粒子は実質的にコロイド９状の懸濁液として
存在する６粒子の表面と会合したプローブ成分はその粒
子を取りまく溶液中に直接砥在している。プローブ成分
は溶液中の溶解試薬および溶解物質と、溶液中での反応
に特徴的な速度および収率で反応する。さらに、粒子の
大きさが小さ（なるにつれて、粒子の表面積対体積比は
増加し、それにより磁性粒子の単位１債あたりより多く
の官能基およびプローブが結合できるようになる。
反応性アミン官能基をもつビーズはポリヌクレオチドを
共有結合させて固定することがでとる。
ビーズは１０％グルタルアルデヒドおよびリン酸ナトリ
ウム緩衝液と反応させ、続いてリン酸緩衝液中でリン酸
化ポリヌクレオチドのエチレンジアミン付加物と反応さ
せる。
ホモポリマー捕獲抗リガンド３と会合した回収可能な支
持体は処理済み試料および第一プローブと接触させ、結
合条件を付与する。第一プ目−プは対象のターゲットに
特異的であシ、臨床試料中に存在するターゲット鎖と結
合する。試料および試薬媒体中に分散された回収ｉＪ能
支持体は、第一プローブとターゲット、および第一プロ
ーブのホモポリマー尾部と支持体のホそポリマー尾部ン
、あたかもそれらが溶液中に遊離状態で存在するかのよ
うにハイブリダイズさせる。
プローブとターゲットとのハイブリダイゼーシ曹ンは約
１５分で達成される。対照的に、媒体中に分散する能力
をもたない支持体上にプローブま′たはターゲットが固
定されるハイプリダイゼーシ璽ンでは３〜４８時間もか
かる。無関係のＤＮＡ、ＲＮＡ、細胞破片および不純物
は支持体と特異的に結合しない。しかしながら、実際の
こととして、少量の無関係のＤＮＡ、　ＲＮＡ、細胞破
片および不純物が回収可能支持体を含めた反応容器内の
あらゆる物体に非特異的に結合することができ、現に結
合する。
本発明の１つの態様において、支持体は磁場の導入によ
って封入容器内で不動化される。捕獲プローブおよびタ
ーゲットを保有する支持体は無関係のＤＮＡ、ＲＮＡ、
細胞破片および不純物を含む残りの試料から分離される
。
その後、ターゲット分子は同一の封入容器１３内で、あ
るいは光連結反応用試薬（第一および第ニブローブがま
だ加えらｈていない場合にはこれらの試薬を含む）を受
入れるのに適した新しい封入容器で段階３に移される。
第一プローブおよび第二プローブは、それらが反応位置
に置かれなと救光新１の存在下で第一および第二プロー
プケ共有結合させてプローブ反応生成物を形ｈ’＜　シ
得る少なくとも１つの光反応性官能基を有する。第一お
よび第二プローブは反応位置でターゲット分子に結合し
てターゲット／第一・第ニブローブ複合体を形成できる
。
ターゲット試料と第一および第二プローブは、支持体に
担持され大ポリヌクレオチドおよび光連結試薬’ｒ　／
ＩＪＯＭ部材１７によって変性することにより段階３で
結合条件を付与される。ターゲット試料を段階３で変性
した後、非特異的に結合した無関係のＤＮＡ、　ＲＮＡ
、　細胞破片および不純物を保有すると思われる支持体
を除去する。
次に、封入容器１３を運搬手段によって段階４に運び、
冷却することによ多結合条件を付与する。
当業者は段階３および４に示した加熱および冷却がｐＨ
ｍ１６１１、イオン強度、および第一および第二プロー
ブと共にターゲラ）　ＤＮＡを変性および再生し得る他
の手段によってもノ＊成できることを認めるであろう。
第一および第二プローブ（共有結合してプローブ反応生
成物を形成しうる少なくとも１つの光反応性官能基を含
む）に結合したターゲットは、もし存在するとすれば、
段階５へ送られる。
段階５において、反応位ｆ虻で結合した第一および第二
プローブと（もし存在するとすれば）ターゲット分子は
水銀アーク灯、９累レーザーまたはヘリウムカドミウム
レーザーを含めた光源からの放射エネルギーにあてられ
る。放射エネルギーの存在下でプローブ反応生成物が形
成される。
十分なエネルギーがプローブ反応生成物によって吸収さ
れ、その結果プローブ反応生成物はターゲット鋳型を去
るであろう。ターゲット鋳型は別の第一および第二プロ
ーブと結合することができ、そしてこのような追加の第
一および第二プローブは別のプローブ反応生成物を形成
することができる。こうして、本発明の態様は単一のタ
ーゲット分子から追加のプローブ反応生成物を形成させ
、単一のターゲラ分子から発生される信号を増幅させる
。
別法として、プローブ反応生成物はターゲット／プロー
ブ反応生成物複合体を変性することによってもターゲッ
ト鋳型から分離することができる。
過剰の第一および第二プローブの存在下で、追加の第一
および第二プローブはターゲット上の反応位置につくこ
とがでとる。再生および活性化の際に、別のプローブ反
応生成物が単一のターゲット分子から形成される。この
サイクルは所望により繰り返すことができる。
第二プローブは検出可能な標識成分を含む。好適な螢光
標識成分には、例えば、限定するものではないが、フル
オレセインインチオシアネート、スルホローダミン１０
１スルホン酸クロライド９（テキサスレッ）Ｆ）、Ｎ−
ヒＰロキシスクシンイミジルビレンプタノエート、エオ
シンインチオシアネート、エリトロシンインチオシアネ
ートおよびそれらの誘導体が含まれる。好適な化学発光
剤および補助因子にはルミノール、マイクロにルオキシ
ダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アクリジニウムエス
テル、ルシゲニン、ルシフエラーセオよびそれらの誘導
体が含まれる。好適な発色剤にはビ′オチンーアビジン
ー西洋ワサビはルオキシターゼ系が含まれる。段階６は
プローブ反応生成物の分離および、心安に応じて、検出
系の信号対ノイズ比を改善するためのバックグラウンド
捕獲をも九らす。プローブ反応生成物の分離は支持体上
への第一プローブリガンドの捕獲、ゲル濾過などによっ
て達成できる。プローブ反応生成物の精製は、プローブ
反応生成物の支持体上への捕獲および支特休からの放出
を繰り返すことにより達成される。
好ましくは、段階６は光連結プローブ反応生成物の一部
ではない。標識第二プローブを捕獲する手段を提供する
。連結されていない標識プローブを除去するのに適した
手段は、例えば、制限するものではないが、プローブ反
応生成物から離れている標識プローブの酵素的破壊、プ
ローブ反応生成物から離れている標識プローブに対して
特異的なりガンｒを有する支持体上への標識プ筒−プの
物理的分離などが含まれる。
段階６から、プローブ反応生成物は運搬手段によって段
階７に送られ、そこでプローブ反応生成物の一部である
標識プローブ上の標識成分が検出される。いくつかの検
出系では、プローブ反応生成物を支持体から分離するの
が有利である。標識成分が螢光団である場合、検出手段
は標識成分の１つを励起する手段、例えば、標識成分の
励起スペクトルに相当する適当な発光ス４クトルを有す
るレーザー、ま穴は適当なフィルターを備えた光源など
である。標識成分が化学発光剤である場合、その励起手
段は発光反応を生じさせるのに適した補助因子を封入容
器１３に注入する手段を含むであろう、化学発光標識成
分や螢光標識成分のような光信号を発する標識成分の場
合１段階７は封入容器からの螢光または化学発光を受信
するように配置されたフォトンカウンターの形の信号検
出器２３を含む。フォトンカウンターはフォトン信号を
発生し、この信号はアナライザーによって受信、増幅お
よび処理される。アナライザーはフォトン信号を図式的
に表示できる値または他の形態で表示できる値に処理し
、その結果をオペレーターに送る。
標識成分が比色定量標識成分（例えば、ハイブリダイズ
されたビオチニル化プローブが酵素によシ検出されるビ
オチン−アビジン系）である場合、検出はビオチンのス
トレプトアビジンへの結合に基づいている（一般に、予
め形成されたストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキ
シダーゼ複合体がＤＮＡプローブと会合したビオチン成
分を認識してそれに結合するために用いられる）。ビオ
チニル化プローブの存在は、着色沈殿物をもたらすペル
オキシダーゼ基質の添加によシ決定される。
対象のターゲット分子検出用の本装置の態様は、段階５
と段階３の間を繰シ返してさらに多量のプローブ反応生
成物を作るのに適合しうる。繰り返しは第二組のプロー
ブの添加を伴う。第一プローブ反応生成物に結合して第
二プローブ反応生成物を形成する第二組のプローブが用
いられる。第二組のプローブは検出可能な標識成分を含
む。変性および第二組のプローブとのハイブリダイゼー
ションの繰り返しは全体的に検出可能信号を増強させる
。それぞれの組のプローブの光連結生成物は、ターゲッ
ト分子の存在によりて開始される他の組のプローブの連
結反応のための鋳型として役立つ。
本装置はさらに他の増幅手段とも適合しつる。
他の増幅手段にはＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラ
ーゼおよび他の酵素によるターゲット分子の酵素的合成
が含まれる。最終目的がウィルスや細菌のような病原体
を検出することである場合、比較的高いコピー数によシ
ゲノムＤＮＡからターゲット分子を選別することが有利
である。従って１本発明の態様は、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ
ｎ　Ｉｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　（１９７９）＊６０：６２
８に示されるようなＱβレプリカーゼを用いてさらに増
幅しつるリボソームＲＮＡまたはメツセンジャーＲＮＡ
の検索に使用するのに適している。
Ｑβレプリカーゼによって生じる複製産物は、ＲＮＡタ
ーゲットをつくる酵素のための別の鋳型となりうる。
本発明は好適な態様の特徴を示す以下の実施例において
さらに詳しく説明することにする。
実施例　１ Ａ、概要 実施例１はプローブ分子、特にポリヌクレオチド、と反
応して光反応性官能基をもつポリヌクレオチド９プロー
ブを形成し得る光反応性分子の好適な合成を説明するも
のである。光反応性分子は発色団と反応性基ヲ宮む。好
ましくは、反応性基はプローブとしてのその働きに不可
欠な特性を破壊しない化学的方法によってポリヌクレオ
チド９プローブと反応するものである。適当な反応性基
は脂肪族アミン基と反応することが知られているＮ−ヒ
ト９０キシスクシンイミビエステル、インチオシアネー
ト、スルホン酸クロ２イド、カルボン酸。
ブロモアルキル、ジクロロトリアジン、アルデヒド９、
ｐ−ニトロフェニルエステル、はンタクロロフェニルエ
ステル、およびイミデートなどである。
好ましくは、プローブ分子は光反応性分子の反応性基と
反応しつる反応性メチレン鎖を含む。好適な反応性メチ
レン鎖は１〜１０個の原子から成る脂肪族鎖である。プ
ローブメチレン鎖は炭素以外の原子、例えば酸素や窒素
、を含むことができる。末端原子は好ましくはアミンで
ある。プローブメチレン鎖は光反応性分子の反応性基と
結合鎖を形成する。
結合鎖の長さは２＋２シクロ付加反応の位置を定める光
反応性基の能力に影響を及ぼすであろう。
さらに、プローブへの共有結合鎖の長さは光反応性基と
ハイブリダイズしなヌクレオチド０塩基との相互作用を
立体的に妨害しつる。
好ましくは、光反応性基は２＋２シクロ付加反応に従う
ものである。好適な光反応性基は放射エネルギー源と一
致する励起エネルギーを有する。
好適な励起エネルギーはへリウムーカドミウムレーザー
および窒素ガスレーザーからの波長にそれぞれ相当する
３２５ａｍおよび３３７ｎｍ、水銀アーク灯の３００〜
４００ｎｍ領域などである。好適な光反応性基は効果的
な励起７可能にするために１０００ｍｏ１００Ｏ・１・
ｃＭ−’より大きい有意な吸光係ａンもつ。
好ましくは、光反応性基はｔｈｉの光反応性基と選択的
に反応し、ヌクレオチド塩基とは反応せず。
それにより共有結合の不可逆的二肴体化をもたらす。好
適な光反応性基にはクマリン誘導体、例えば、制限する
ものではないが、クマリン−７−オキシ酪ＭＮ−ヒドロ
キシスクシンイミド９エステル、４−メチルクマリン−
７−オキシ酪酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド３エステ
ル、７−ノドキシクマリン−６−オキシ４ＭＮ−ヒドロ
Φシスクシンイミトエステル、クマリン−５−オキシ酪
酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、６−メトキ
シクマリン−７−オキシ酪醐Ｎ−ヒト９０キシスクシン
イミド９エステル、およびクマリン−６−イソ′チオシ
アネートが含まれる。
以下に示す反応式１は、官能化ＤＮＡと反応し得る光反
応性分子の合成を表すものである：反応式　１ 上記式中ｎは整数１〜１０でありうる。しかしながらｎ
が１であるとき、官能性ＤＮＡの中で反応しつる光反応
性分子の安定性は制限される。好適な整数は３である。
クマリン−７−オキシＩＷ＃Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミｒエステルの合成の場合、ｎは３であり、Ｒ１は水素
である。４−メチルクマリン−７−オキシ酪酸Ｎ−ヒト
１０キシスクシンイミド３エステルの合成の場合、ｎは
３であり、Ｒ１はメチルである。
反応式ｌにおいて、クマリンまたはクマリン誘導体は初
めに強塩、Ｔ；、（例えばＮ１．Ｎ１．Ｎ３．Ｎ３−テ
トラメチルグアニジン）の存在下にＪｔ流流上セトニト
リル溶液中適当な炭素数の脂肪族基？もつアルキル化剤
でアルキル化してエチルエステル訪導体を形成させる。
エチルエステル肋導体はその仮アセトン中で塩酸のよう
な水性強酸を用いて加水分解する。
以下に示す反応式２は、酸化された６位に遮断基をもつ
７−ヒト９０キシクマリン誘榊体から始まる７−メドキ
シクマリン誘専体の合成を表す：反応式 反応式 以下に示す別の反応式３は、クマリン誘導体をインチオ
シアネート官能基を介して６位でポリヌクレオチドの反
応性脂肪族アミンへ結合させて、クマリン誘導体とポリ
ヌクレオチドの間に比較的短い脂肪族鎖を形成させるた
めに用いられる：インチオシアネート誘導体はクマリン
誘み体の６位をニトロ化し、そのニトロ基をアミンへ還
元し、そのアミノ誘導体音チオホスゲンと反応させるこ
とにより製造される。
アミン誘導体化ポリヌクレオチドと反応しつるクマリン
誘導体のその他の合成には、以下の反応式４に示すよう
なヒビロキシル化クマリン誘導体とブロモアセトニトリ
ルとの反応が含まれる：反応式 環に８造へ得かれたクマリン誘導体の合成は以下の反応
式５に示される： 反応式　５ Ｂ、物質および方法 前記実施例において、７−ヒト０ロキシクマリン（アン
ベリ７　！　０７　：　ｕｍｂｅｌｉｆｅｒｏｎｓ、　
（９３−３５−６））、７−ヒド９０キシ−４−メチル
クマリン（９０−３３−５）、エスクリン−水和物（５
３１−７５−９）、７−ヒｒロキシー６−メトキシクマ
リン（′スコポレチン：　５ｃｏｐｏｌｅｔｉｎ　、　
（９２−６１−５））、６−ヒド９０キシ−７−メトキ
シクマリン（イソスコポレチン：　１ｓｏｓｃｏｐｏｌ
ｅｔｉｎ　、　（７７Ｂ−８６−３）　）、およびクマ
リン（９１−６４−５）はウィスコンシン州ミルウォー
キーのＡｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社から購入し
虎。
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）はＭｅｒｋシリカゲ
ル６０Ｆ’　−２５４ガラス裏付プレート上で行った。
次の溶媒系を使用し７’ｌ＝　：　（Ａ）クロロホルム
−メタノール（１９：Ｌｖ／ｖ）　；ＣＢ））クロロホ
ルム−メｐ）　−ル（９：　ｘ、ｖ／ｖ）　；　（Ｃ）
クロロホルム−メタノール（４：ｔ、ｖ／ｖ）。展開後
、物質はＵＶ光線で検出し。
た。フーリエ変換ＮＭＲスペクトルは、特に指定しない
限シ、３００　ＭＨｚでＮ１ａｏｌｅｔ装置により得ら
れた。
定１１ＵＶスイクトルはヒエーレットノソツカート９８
４５１Ａダイオード０アレイ分光光度計により得られた
。
クマリン−７−オキシ酪酸Ｎ−ヒト９０ヤシスクシンイ
ミビエステルは、７−ヒドロキシクマリンを４−ブロモ
酪酸エチルと反応させてクマリン−７−オキシ酪酸エチ
ルエステルを形成させ、次に、そのエチルエステルを酸
と反応させてクマリン−７−オキシ酪酸を形成させ、ク
マリン−７−オキシ酪酸をＮ−ヒドロキシクマンイミｒ
と反応させてＮ−ヒドロキシスクシンイミド９エステル
ヲ形成させることにより、上記反応式１に従って製造し
穴。
アセトニトリル１５〇−中の７−ヒドロキシクマリン８
．ＩＮ（５０ミリモル）および４−ブロモ酪酸エチル８
．Ｏｍ／（５５ミＩＪモル）の混合物を電磁攪拌機で攪
拌し、この混合物ＫＮ１．Ｎ１．Ｎ３．Ｎ３−デトラメ
チルグアニジン（ＴＭＧ）　７．０ｍ（５５ミリモル）
を少量ずつ加えた。その深黄色溶液を還流下で４時間加
熱し、その時点でＴＬＣ（溶媒系Ｂ）はＲｆがよシ高い
新しい物質への部分凶変ＩＬＬＹ示し六。４−ブロモ酪
酸エチ＃２，９１ｍ１および’Ｉ’ＭＧ　２．５５　ｍ
Ｊヲａ加Ｌ、この混合物をさらに２時間または反応が完
了する（ＴＬＣ）まで還流下で加熱した。溶媒ｌ真空蒸
発させ、残留物をり四ロホルム１５０−中に溶解し、飽
和炭酸水素ナトリクム溶液２×１５０ＩＩＩｌで抽出し
、乾燥しくＭｙｓｏ４）、蒸発させて濃厚な油状物を得
、これをゆっくりと固化させた。その固体をメタノール
２５ｍ／、次に水性メタノールから再結晶した。
′収量１２．５９　（９ｌチ）。
’　ＥＩ　ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ａ　ａ　）　：　７．９
９　（１、Ｊ＝９．６　Ｈｚ　、Ｉ　Ｈ）　。
７．６２　（ｄ　、　Ｊ＝８Ｈｚ　、　１）ｌ）　、　
６．９８（ｄ、　Ｊ＝２．４Ｈｚ　、　１Ｂ）　。
６．９４（ｄｄ、Ｊ＝８．２．４Ｈ２，ＩＢ）、６．２
９（ｄ、Ｊ＝９．６Ｈ２゜ＩＨ）、４．０８（ｍ、４Ｈ
）、２．４７（ｔ、、Ｔ＝８Ｈｚ、２Ｈ）、１．９９（
ｇ　ｅ　Ｊ＝８　Ｈｚ　、２　Ｈ）　−１−１９（ｔ　
＊　Ｊ＝８　Ｈｚ　ｅ　３　Ｈ）　Ｍ　−ｐ　−６６−
７０℃、ＵＶ（メタノール）：λｍａｘ　３２４ｎｍ（
１４７００）＋２９０ｎｍ（肩）、λｗｉｎ　２６０　
（１３００）クマリン−７−オキシ酪酸エチルエステ＃
　１２．５９をアセトン２００＠ｔに完全に溶解し、５
Ｍ塩酸水溶液２００−を加えた。この溶液を室温で２０
時間ま六は反応が完了する（ＴＬＣ，溶媒系Ｂ）まで攪
拌した。溶液から分離したクマリン−７−カルボン酸の
結晶をガラス沖過器で濾過して集め、水で十分に洗い最
後にエタノールで洗い、Ｐ２０＋５　上で一晩乾燥し虎
。収量１ｏ、１ｘ、ｐ（９ｏチ）。
Ｍ、Ｐ、１９８−２００℃、Ｒｆ（溶媒系Ｂ　）０．０
５．’ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）ニア、９９（ｄ、Ｊ
＝９Ｈｚ、　１１）　、　７．６２（ａ、Ｊ＝８）１２
．　ＩＨ）、６．９８（ｍ、２Ｈ）、６．２８（ｄ、、
Ｔ＝９Ｈｚ、ＩＨ）。
４．１０（ｔ、Ｊ＝５Ｈｚ、　２Ｈ）　、　２．４０（
ｔ、Ｊ＝５Ｈｚ、　ＩＨ）　。
１．９７（ｍ、　２Ｂ）　。
エタノール／ト０ライアイス浴を用いて一３５℃に冷却
し六無水ピリジン１５−中のり下りンー７−オキシ酪酸
１．３９　Ｎ　（５ミリモル）およびＮ−ヒト９０キシ
スクシンイミド１．０８１１　（５，２５ミリモル、１
．０５当量）の溶液にジシクロへキシルカルポジイミＹ
　（ＤＯＧ）１．０８，９（５，２５ミリモル、１．０
５当量）の溶液を滴下し、この混合物を一晩室温へ温め
六、ＴＬＣ（溶媒系Ｂ）はＲｒがより高い新しい物質へ
の部分的変換を示した。この反応ン完結させるなめに、
混合物を一３５℃に再冷却し、追加のＤＣＣＯ，５１１
１（０，５当量）およびＮＨ８Ｏ，２９ｇ（０，５当量
）を加えた。５時間後反応は完了し、過剰のＤＣＣＹ３
滴または４百の氷酢酸の添刀口によシネ活性化し、沈殿
したジシクロヘキシル尿素’＆Ｆ去し７’（、戸液を真
空蒸発させ。
残留物娑トルエン４Ｘ３０ｄと共蒸発させ、クロロホル
ム５０−に溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム２Ｘ４０−
で抽出し、最後に真空乾固させて無色の固体ｌ得た。こ
の固体ケトルエンと共にさらに２回共蒸発させて痕跡量
のピリジンを除き、最後にトルエンから再結晶して無色
針状晶の生成物を得た。収量１．７４　＃　（１００チ
）。Ｍ、Ｐ、１４４−１４６覧’ＨＮ　ＭＲ（ＤＭＳＯ
−ａ　ｓ　）　ニア、９８　（６、Ｊ＝ｓ　ｈ　Ｚ　−
Ｉ　Ｈ）　、７Ｓ３ｄ、Ｊ＝７＆、　ＩＨ）１６．９９
（ｍ、２Ｈ）　、　６．２９（ｄ、、Ｔ＝７Ｈｇ。
ＩＨ）、４．１７（ｔ、ｔＴ＝６Ｈｚ、２Ｈ）、２．８
８（ｔ、Ｊ−６Ｈｚ、２Ｈ）。
２．８３（幅ａ、４Ｂ）、２．１１（五重線１．７＝６
Ｈｚ　１２ＦＡ）　−２，８３に見られる４個のプロト
ン−電線はＮＥｉＳエステルに特徴的であった。
Ｎ−ヒト９０中シスクシンイミドエステルノ活性は、５
′−アミノプロピル−Ｔ１ｏオリゴマーヲ溶液中で下記
のように標識する対照実験により調べた。
オリゴマー（５光学密度学位）を０．２Ｍ　　ＭＯＰＳ
緩衝液（ｐＨ７，２）　ｏ、５ｒｎｌＫｉ解し、ＤＭＦ
中のＮＨＳエステルの溶液０．０５ｍ／！（０，２２Ｉ
ｎｔＤＭＦ’中３．９７７９．６０当・敬）を加えた。
この混合物を３７℃で２２時間インキエベートし、この
時点でイオン交換ＨＰＬＣでの分析はクマリン標識ＴＩ
Ｏオリゴマーへの８０％変換を示した。
４−メチルクマリン−７−オキシ酪Ｗ！Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミドエステルは、クー＝ｒリンー７−オキシ
酪醗Ｎ−ヒト９０キシスクシンイミド９エステルを製造
するのに用いた方法と類似した反応順序で７−ヒドロキ
シ−４−メチルクマリンから製造した。
トルエンから再結晶し死後の収率３８チ。Ｍ、Ｐ。
１７６−１８０℃、　’　ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ａ、、
　）　：　７．７０　（６、、Ｔ＝８Ｈｚ　。
ＩＨ）、６．９９（ｍ、２Ｂ）、６．２１（ｄ、Ｊ＝２
Ｈｚ、ＩＨ）、４．１７（ｔ、Ｊ＝６Ｈｚ、２Ｂ）、２
．８７（ｔ、Ｊ＝６Ｈｚ、２Ｈ）、２．８２（ｓ、　４
Ｈ）　、２．１１（ｔ、Ｊ＝６Ｈｚ、２Ｈ）、　Ｒｆ　
（溶媒系Ｂ）＝　０．６５　。
７−ノドキシクマリン−６−オキク酪酸Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミド９エステルは反応式２に示し７２．２つ
のノクートから成る反応式に従って製造した。
パート１６−ヒトロキシー７−メトキシクマリン（イソ
スコポレチン）の製造 ヨウ化メチル３．Ｑａｇ（４８，４ミリモル、３．４４
当婿）？含むアセトニトリル１５０ｄ中のエスクリン−
水和物５．０９　（１３，９５ミリモル）の懸濁液にＴ
ＭＧ　３．２２Ｎ（２８ミリモル）を加えた。還流温度
に加熱すると、ガム状混合物が溶解して淡黄色の溶液と
なシ、この溶液は徐々に脱色され、反応混合物中に結晶
が形成された。３時間後この混合物を室温まで冷却して
結晶Ｚ濾過により集め、アセトニトリル２×２５−で洗
い、自然乾燥した。収量３．８１　Ｎ、　　この反応生
成物は同定しないで次の工程で直接使用した。こうして
、この反応生成物３．８１　ｇ（１０，７ミリモル）ン
硫′酸水溶液（Ｈ２０／Ｈ２ＳＯ４９ｓ　：　ｓ　、　
ｖ／’ｖ　）６０ｍｌ中に懸濁し、この混合物を攪拌し
ながら還流した。２０分後反応混合物中に結晶が析出し
始めた。還流下で１時間後、この混合物を室温へ冷却し
、結晶を戸数し、水２Ｘ５０１ｎｌで洗い、最後に自然
乾燥した。この結晶質生成物は６−ヒド９０キシ−７−
メチルクマリンとして同定され六。収量１．８７１　（
７０チ）。Ｍ、Ｐ、１８５−１９０℃（文献１１４０％
酢酸からのｍ、ｐ、１８５℃）。ＵＶスペクトル（メタ
ノール）：λｍａｘ　２３２（ｇ）、２　ｓ　ｅ　（ｗ
）、３４８（ｓ）。
パート２６−ヒトロキシー７−メトキシクマリン　Ｎ−
ヒト０ロキシスクシンイミビエステルの製造７−ノドキ
シクマリン−６−オキシ酪酸Ｎ−ヒビロキシスクシンイ
ミドエステルハクマリン−７−オキシ酪酸エステルにつ
いて先に記載した方法に従って製造した。初めに、７−
ノドキシクマリン−６−オキシ酪酸エチルエステルをク
マリン−７−オキシ酪酸エチルエステルに関して先に記
載し六方法と類似した方法で６−ヒド９０キシ−７−メ
ドキシークマリンから製造した。この反応生成物７−ノ
ドキシクマリン−６−オキシ酪酸エチルエステルは同定
し、次の特性ヶ有していた：１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ
６）ニア、９３（ａ、Ｊ＝９ｈｚ、　ＩＨ）　、７．２
５（ｓ。
１Ｈ）　、７．０７ＣＢ、　ＩＨ）　、６．２９（ａ、
Ｊ＝９）１ｇｌ、　ＩＨ）、４．０７（四重線、　Ｊ＝
７Ｈ２，２Ｈ）　、４．０１　（ｔ、Ｊ＝６Ｈｚ、　２
！（）　ｅ３．８６９（ａ、３Ｈ）、２．５０（ｔ、、
Ｔ＝６Ｈｚ、２Ｈ）、１．９９（ｔ。
Ｊ＝７Ｈｚ　、　３Ｈ）　、　ＵＶ　（エタノール）λ
ｍａｘ：２３２（１７６００）、　２９６（５８００）
、３４４（１１７００）ｎｍ、　Ｍ、Ｐ。
９３−９５℃（エタノールから２回再結晶）。収車８５
チ。
反応生成物７−ノドキシクマリン−６−オキシ酪酸エチ
ルエステルをクマリン−７−オキシ酪酸に関して先に記
載した方法と類似した方法で酸と反応させて、７−ノド
キシクマリン−６−オキシ酪酸を形成した。このカルボ
ン酸は次の特性を有シティ７’（：　　”ＨＮＭＲ（Ｄ
ＭＳＯ−ｄ６）ニア、９３（ｄ、Ｊ＝９ｈｚ。
１Ｂ）　、７．２７　（ｓ　、ＩＨ）　−７，０７（ｓ
　、１Ｂ）　ｖ　６．２９　（ｄ　、に９Ｈｚ。
ＩＨ）、４．０Ｏ（ｔ、Ｊ−７Ｈｚ、２Ｈ）、３．８７
（ｓ、３Ｈ）、２．４０（ｔ。
Ｊ＝７Ｈｚ、２Ｈ）、１．９６（五重線、Ｊ＝７Ｈｚ、
２１（）、Ｍ、Ｐ。
１８ｇ−１９１℃、収率８８％。
反応生成物７−ノドキシ−クマリン−６−オキシ酪酸は
クマリン−７−オキシ酪酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ド９エステルを製造する方法と頌似した方法（但し反応
溶媒はＤＭＥ’／ピリジン１：１混合溶媒を用いた）で
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させて、７−ノド
キシクマリン−６−オキシ酪ｒ９Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル”＆１１した。Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステルは次の特性を有してイｆｃ：　　”Ｈ
ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄａ　）　”　７−９３　（ｄ−Ｊ
＝９　ｈ　Ｚ　ｌＩ　Ｈ）　−７，２８（８＃　Ｉ　Ｈ
）　ｅ　７．０９（ｓ、　ＩＨ）　、　６．３０（ｄ、
Ｊ＝９Ｈｚ、　ＩＨ）　、　４．０８（ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ
。
２Ｈ）　、　３．８７９（ｓ　、　３Ｂ）　、　２．８
７（ｔ、　Ｊ＝７Ｈｚ　、　２Ｈ）　、　２．８２（ｅ
＝４Ｈ）ｅ２．０９（五重線、　Ｊ＝７Ｈ２，２Ｈ）、
　　Ｍ、Ｐ、１６３−１６６℃（熱濾過を用いてトルエ
ンから、その後酢酸エチルから再結晶）。収率４７チ。
６−メトキシクマリン−７−オキシ酪酸Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミドエステルは位置異性体の７−ノドキシク
マリン−６−オキシ酪咳Ｎ−スクシンイミド９エステル
と類似した方法で製造した。
このエチルエステルは次の特性を有してい′ｆｃ：’）
Ｉ　ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ａ６）　ニア、９５（ｄ、Ｊ＝
９Ｈｚ、　ＩＨ）　、７２６（８，Ｉ　Ｈ）　＋　７−
０６　（ｓ　、Ｉ　Ｈ）　、６．２９　（ｄ　＊　Ｊ＝
９　Ｅｌ　ｚ　−Ｉ　Ｈ）　。
４．０９（ｔ、Ｊ＝６Ｈｚ、２Ｈ）、４．０７（四重ｐ
９．Ｊ＝６Ｈ２，２Ｂ）。
３．８１（ｓ、３Ｈ）、２．４９（ｔ、Ｊ＝６Ｈｚ　、
２）ｉ）、２．０１（五重線、　Ｊ＝６Ｈｚ、２Ｈ）、
１．１９（ｔ、Ｊ＝６Ｈｚ、３Ｈ）、　Ｍ、Ｐ。
９２−９６℃（エタノールから２回再結晶）。
６−メトキシクマリン−７−オキシ酪酸は次の特性を有
していた：　　”ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ａ６）ニア、９
５（（１，Ｊ＝９Ｈ２，１Ｂ）、７．２６（ｓ、ＩＨ）
、７．０６（ｓ、　ｔｕ）。
６．３０　（ａ、　Ｊ＝９Ｈｚ　、　ｔＲ）　、　４．
０９（ｔ　、Ｊ＝７Ｈｚ　、　２Ｂ）　。
３Ｊ３１２（ｓ、３Ｈ）、２．４０（ｔ、、Ｔ＝７Ｈｚ
、２Ｈ）、１．９７（五重線、　Ｊ＝７Ｈｚ　、　２Ｂ
）　、　Ｍ、Ｐ、　１８２−１８６℃。
６−メトキシクマリン−７−オキシ酪１１１′Ｎ−ヒト
０ロキシスクシンイミト９エステルは次の特性を有して
いｆｃ：　　１１　ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−４６）　：　７
．９４（ａ、Ｊ＝９　Ｈｒ２−　Ｉ　Ｈ）　−７，２６
（ｓ　−Ｉ　Ｈ）　＃　７．０５　（ｓ　＊　Ｉ　Ｈ）
　−６，３０（６＊Ｊ＝９Ｈ１１１，ｔＨ）、４．１０
（ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ、　ＩＨ）３．８１（ｓ、　ａＨ）　
ｅ２．８２（ｓ、４Ｈ）、２．４０（ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ、
２Ｈ）、１．９８（五踵線。
Ｊ＝　Ｈｓｓ　、　２Ｈ）　− Ｇ、クマリン−６−イツチオシアネートの製造クマリン
−６−イツチオシアネートは上記反応式３に従って製造
し７’ｌ：。初めに、クマリンはＤｅｌａｌａｎｄｅ、
Ａｎｎａｌｎ、　４５　ｐ、　３３７（１８４３）の教
示に従ってニトロ化して６−ニトロクマリンを製造し大
。次に、６−ニトロクマリンは６−アミノクマリンに還
元した。そのｖ；、６−アミノクマリンはチオホスゲン
と反応させてクマリｙ−６−イツチオシアネートを製造
した。
より詳細には、クマリン１０．９（６８ミリモル）を上
記文献に記載されるように過剰の発煙硝酸を用いて室温
で一晩二トロ化して唯一の主要生成物として６−ニトロ
クマリンを得々。６−ニトロクマリンは次の特性を示し
ｆｃ＝収率８５％。
”ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）　：　８．７４　（（１
、Ｊ＝３Ｈｚ　、　ＩＨ）　。
８．４２（（１（１，Ｊ＝３．９Ｈ２，１Ｂ）、８．２
４（ｄ、Ｊ＝１０Ｈｚ、ＩＨ）。
７．６３（（１，Ｊｓ＝９Ｈｚ、ＩＨ）−６，７０（ｄ
、Ｊ−１０Ｈｚ、１Ｂ）。
次に、６−ニトロクマリン生成物の一部３．３５　ＩＩ
（１７，５４ξリモル）を、酢酸水溶液（１：１ｖ／ｖ
）６０−中に懸濁した鉄粉ｓ、ｏ、ｐ（過剰）の電磁攪
拌混合物に加え穴。数分後発熱反応が起こり１反応混合
物が淡黄色に変わった。この反応を冷却せずに続行し、
還流冷却器を用いて蒸発による損失を防いだ。１０〜１
５分後この反応混合物を水浴で室温へ冷却し、真空蒸発
させて濃Ｊ撃な緑色スラリーを得た。反応剤の起泡性に
注意しながら、残留物に飽和炭酸水素ナトリウム溶液２
００！ｔｔｌを加え、十分に攪拌しながら酢酸エチルｌ
Ｘ２５０ｍＪ、ｌＸ１００ｍで′抽出した０合わせた酢
酸エチル抽出物を蒸発乾固させて淡黄色粉末２．５．ｐ
（ａ９ｓ）を得り。この固体に水１５０１１１を加え、
還流させ、活性炭２〜３ｇを加えて速やかにひだ付きＦ
紙を通して濾過し、冷却した。淡黄色の針状生成物を集
め、水で洗い。
Ｐ２Ｏ５上で一晩乾燥して６−アミノクマリン２．１４
ｇを得た。Ｍ、Ｐ、１６１−１６３℃。
反応生成物６−アミノクマリンの他の特性は次の通りで
ある：　　”ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ａ６）　ニア、ｓｇ
（ａ、Ｊ−９，５Ｈ２，ＩＨ）、７．１０（ｄ、Ｊ＝８
．８Ｈｚ、ＩＨ）、６．８５（（１，Ｊ＝８．８，２．
７Ｈｚ、１Ｂ）、６．７３（ｄ、Ｊ＝２．７Ｈｚ、ＩＨ
）、６．７３（ｄ。
、Ｔ＝２．７Ｈ２、ＩＩ（）　、　０．３５　（ｄ　、
　Ｊ＝９．５Ｈｚ　、　ＩＨ）　、　５．２５　（幅ａ
　、　２Ｈ）　、　（ｆｆ（メタノール）λＭａｘ　：
　２４６（ｗ）、　２８２（ｍ）−３７０（ｗ）。
６−アミノクマリン０．３２０５１　（２，０ミリモル
）、トリエチルアミンｌ、Ｑｍｌ（過榊１）およびクロ
ロホルム１５ｔｈｔの攪拌溶液に５分間にわたってチオ
ホスゲン０．２２ｍｌ　（２，４ミリモル）を滴下し穴
、チオホスゲンの滴下が完了しｆｃ　１’！この反応を
終らせた。クロロホルム５０ｍ１・を追加し、このｆ’
＆’を夜を飽和炭酸水素ナトリウムｋ）液２ｘ５０ｍｌ
で抽出し、次に水１×５０ｒｎｌで抽出し、その後蒸発
させて橙色の固体を得た。
この固体をイソプロパツールから、最後にトルエン（熱
濾過、活性炭なし）から再結晶して！Ｍ黒色の不溶性残
留物を除いた。得られた淡黄色結晶はクマリン−６−イ
ンチオシアネートとして固定された。Ｍ、Ｐ、１８９−
１９１− この反応生成物クマリン−６−インチオシアネートの他
の特性は次の通りである：　　ＩＨＮＭＲ（ＣＤＣＩ！
ａ）　ニア、６４（ｄ、Ｊ＝１０Ｈｇｌ、　１Ｂ）、７
．３０−７．４１（ｍ。
３）１）、６．４９（ｄ、Ｊ＝１０Ｈｚ、ＩＨ）、ＵＶ
（ｌＩ／−ｋ）：２２６（３１７００）、２６８（２９
９００）、３３４（４７００）ｎｍ。
ＴＩＲスイクトｙ（ＫＢｒ錠）　：　３１００，２１１
８＠イ、　Ｎ＝Ｃ＝ｓ）　、　１７２４　（強い、　Ｃ
＝８）　、　１５８４．１４９９．１２８８゜１１８Ｂ
、　１１２０．８８８．８２２湿クマリン−５−オキシ
酪酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド１エステルは上記反
応式５に従って製造した。２．６−シメトキシベンズア
ルデヒト９をジエチルホスホノ酢酸メチルおよびｎ−ブ
チルリチウムと反応させて２．６−ジメトキシ桂皮酸メ
チルエステルを製造した。このメチルエステルを三臭化
ホウ素と反応させて５−ヒドロキシクマリンを形成すせ
、５−ヒドロキシクマリンを酸と反応させてクマリン−
５−オキシ酪酸を製造した。この酸をＮ−ヒト９０キシ
スクシンイミドと反応させてＮ−ヒト０ロキシスクシン
イミドエステルを製造した。
より詳細には、無水テトラヒト９０フラン５０ｗＬｌ中
のジエチルホスホノ酢酸メチル６．３１１　（３０ミリ
モル）の冷却しｆｃ（−７８℃）、電磁攪拌溶液に、２
０分にわたって少しずつ、ヘキサン中のｎ−ブチルリチ
ウム溶液（１，３Ｍ溶液）２０ｍｊを加え穴。得られた
淡黄色溶液にテトラヒト９０フランｄＱａｕ中の２．６
−シメトキシベンズアルデヒ）；”　４．９８．ｌ／　
（３０ｉリモル）の溶液を滴下した。この反応混合物を
一晩室温へ温め、この時点でＴＬＣは新しい主要生成物
の形成を示した。２Ｍｊ’ｌ：酸水溶液５０−を加えて
反応を止め、ジエチルエーテル２００１／を加え、続い
て水２００−を加えた。有機相を分離し、飽和炭酸水素
す）　ＩＪウム溶液２００−で抽出し、乾燥しくＭ、５
ｏ４）、蒸発させて濃厚な油状物（結晶化しない＞５．
２９を得た。
この反応生成物は２．６−：）メトキシ桂皮酸メチルエ
ステルとして固定された。　　’ＨＮＭＲ（ＣＤＣ／３
）　：８．１４（ｄ、Ｊ＝１６．１Ｈｚ、　ＩＨ）　、
７．２６（ｔ、Ｊ−８，４Ｂｇ、　１）１）　。
６．８９（ｄ、Ｊｅ１６．２Ｈｚ、　ＩＢ）　、　６．
５５（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｓｙ、　２Ｈ）　。
３．８８（ａ、６Ｈ）、３．８０（ｓ、３Ｂ）。
クロロホルム２５０１ｔ／中の２，６−ジメトキシ桂皮
酸メチルエステル５．２．９　（２３，４ミリモル）の
冷却（−３０℃）溶液に三臭化ホウ素（１Ｍ塩化メチレ
ン溶液）８０−を加えた。この混合物を無水条件下で攪
拌し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液４００−に注入し
た〔起泡に注意〕。有機相を酢酸エチル２５０ｒｎｌで
希釈し、この混合物を分液漏斗に移して十分に抽出した
。有機相を分離し、乾燥しくＭ。
５０４）、真空蒸発させて暗赤色の油状物（結晶化しな
い）を得た。この油状物をシリカゲルでのクロマトグラ
フィーで８判して淡黄色の結晶質粉末として５−ヒドロ
キシクマリン３．４　ｇ（８９％）を得た。Ｍ、Ｐ、２
２６−２２９℃（Ｄａａ　ＧｕｐｔａらＪ・Ｃｈｅｗ、
　Ｓｏｃ　、（ａ）、　２Ｌ　１９６９によればｍ、ｐ
、２２４−２２５℃）。”ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｃ１６
）　：　８．１１　（ａｄ　、　Ｊ＝９゜６．０．６Ｈ
２，ＩＨ）　、　７．４０（ｔ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、　Ｉ
Ｈ）　、６．７８（ｍ。
２Ｈ）　、６．３４（ｄ、Ｊ＝９．６Ｈｚ、　ＩＨ）　
。
５−ヒト９０キシクマリンは異性体７−ヒト９０キシク
マリンについて記載し７’（３段法によってクマリン−
５−オキシ酪酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
に変換しな。
クマリン−５−オキシ酪ｆｉＮ−ヒト１０キシスクシン
イミド９エステルは油状物として得られ、結晶化しなか
つ穴。ＩＨ／ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６　）　：　８．１
９　（ｄｄ　。
Ｊ＝９．６，０．６Ｈ虐、ＩＨ）、７．５５（ｔ、ａＴ
＝８．４Ｈｚ、ＩＨ）、６．９７（（Ｌ　、　Ｉ＝８．
４Ｈ２、ＩＨ）　、　６．９３（ａｄ、　Ｊ−８，４、
０，６Ｈｓｇ　、　ｉｎ）　。
６．３９（（１，、Ｔ＝９．６Ｈ２，１）１）、４．２
１（ｔ、、Ｔ＝６．６Ｈｚ、２Ｂ）　。
２．９６（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、　２Ｈ）　、　２．８
２（ｓ、　４Ｈ）　、２．１７（ｑ。
Ｊ＝７．２Ｈｚ　、　２Ｈ）　・ 実施例２−　ＤＮＡ合成 化学的に合成し７’（ＤＮＡはすＲてＡｐｐｌｉθｄＢ
ｉｏ　ｓｙｓ　ｔｅｍｓ社から供給された試薬およびホ
スホ／Ｉ／７ミダイトを用いてＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍａ３７０Ｂ合成機により製造した。粗製の
合成りＮＡはＰｈａｒ＋ｎａｃｉａ高速夕／／署り質液
体クロマトグラフィー（Ｆ’ＰＬＯ）装置で、液体クロ
マトグラフィーコントローラーＬＣＣ−５００，ポンプ
Ｐ　−５００，単路モニター１ｆｆ−１：ｌ’ｄｉ、Ｊ
ｌ、ヒ画分コレクターＦ’ＲＡＣ−１００ヲ用いて逆相
カラムにより稍判した。上記合成機から得られ、水０５
−に溶解した粗製の脱トリチル化ＤＮＡ　（８０〜１０
０ＯＤ単位）はＰＥＰ　ＲＰＣｃｔｓ　　カラムにかけ
て１０ｃｏＭ酢酸トリエチルアンモニウム−アセトニト
リル（１：１．ｖ／ｖ）を補給した（分あたり０．７５
〜１．００チ）１０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウムで
溶出することにより精製した。浴離剤はｌ　ａｔ　７分
の流速でポンプ輸送し、２ｍｌの両分を集めた。適当な
画分をプールし、５ａｖａｎｔ遠心真空良縮機を用いて
蒸発乾固させた。試料の均一性はｃ−４カラムを用いる
）ｉｅｗｌｅｔｔ　−Ｐａｃｋａｒｄ　１０９０液体ク
ロマトダラムにかけて、アセトニトリルを補給した（分
あたり０．５　％　）　０．１　Ｍ酢酸トリエチルアン
モニウムで溶出することにより、ＨＰＬＣで分析した。
回収され７’（ＤＮＡの収率は一般に約５０係であった
。
大ｆｉ％菌（Ｅ、Ｃｏ１１）のエンテロトキシン遺伝子
の３０−ｍａｒ配列がターゲットとして選ばれた。その
ターゲット配列を以下に示す： ターゲット−５／　ＴＴＧ　ＧＴＧ　ＡＴＣＣＧＧ　Ｔ
ＧＧ　ＧＡＡＡｃｅ　ＴＧＣＴＡＡ　ＴＣＴ　３’ は化学的に合成した。以下に示す塩基配列を有する第一
プローブおよび第二プローブも化学的に合成したニ プローブｌ−ｓ’ＧＧＡ　ＴＣＡ　ＣＣＡ　Ａ　３’プ
ローブ２−５／ＡＧＡ　ＴＴＡ　ＧＣＡ　ＧＧＴ　ＴＴ
ＣＣＣＡ　ＣＣ３’第一プロープはクマリン誘導体の１
つで５′末端を標識し、３２ｐで３′末端を標識した。
第二プローブはクマリン誘導体の１つで３′末端を標識
した。
第一および第二プローブはターゲット分子の隣接部分に
結合することができる。
より詳細には、第一プローブは初めに（３−（Ｎ−）リ
フルオロアセチルアミノプロピル））メチル−Ｎ、Ｎ−
ジイソプロピルホスホルアミダイト（ＴＦ’ＡＡＭＤＩ
ＩＰＰ）で５′末端標識しｆｃ９−ｍａｒオリゴマー（
上記配列から３′末端塩基を除いたもの）を合成するこ
とにより製造した。ホスホルアミダイトの合成から始ま
る以下の方法は代表的な方法である。
攪拌棒および還流冷却器を備えた乾い７’）１．１００
＋ａ／三つ口丸底フラスコに無水メタノールｌＱｍｌと
トリフルオロ酢酸エチル１２．５９　（０，１７モル）
を加えた。
この混合物を室温で攪拌し、３−アミノ−１−プロパツ
ール１２゜５Ｆ（０，１７モル）を徐々に加えた。
この反応混合物は３−アミノ−１−プロパぐノールの添
加直後に沸騰し始めた。１８時間後、この混合物を減圧
下で蒸発させて透明な粘Ｎｆｆ：油状物を得た。この生
成物を真空蒸留により精製した。収量＝２４゜Ｏｇ（８
５チ）（ＢＰ＝８５〜８６℃、　０．２５閣Ｈｇ）。
乾い７’ｃ２００＋ｎｇ三つ口丸底フラスコに電磁撹拌
棒を備え、ゴム隔膜で密閉し、乾燥窒素ガスで／ξ−ジ
した。このフラスコに３−（Ｎ−）リフルオロアセチル
アミノ）−１−プロパツール６．０６．９　（３５ミリ
モル）、ジイソプロピルエチルアミン３６．１ｇ（２８
０ミリモル、５０Ｉｎｔ）および乾燥ＴＨＦ’３ＱｍＪ
を加えた。この混合物を攪拌して０℃に冷却した。その
後、テトラヒドロフラン５０　ｍｌ中のジイソプロピル
メチルホスホンアミシッククロライト９（ａｔｉｓｏｐ
ｒｏｐｙｌｔｏｅｔｈｙｌ　ｐｈｏｓｐｈｏｎａｍｉｄ
ｉｃ　ｃｈｌｏｒ−１ｅ）　５．５．９（２８ミ’）モ
ル）の溶液を冷却反応混合物に滴下した。数分後白色沈
殿物が観察された。ｌ？拌を合計１．５時間続行し、そ
の後塩酸塩を真空戸過ニより取り出し、５　％　ＮａＨ
ＣＯ３３Ｘ　５０１１１７で洗った。有機相を集め、硫
酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、その後減圧下で蒸発多
せた。得られた生成物を酢酸エチル／トリエチルアミン
９／１　（ｖ／ｖ　）混合溶媒１Ｑａｌに溶解し、シリ
カゲルのカラム（１−％インチ×８インチ）にかけた。
このカラムを同じ混合酸媒で溶出した。３０＋＋ｊの画
分を集めた。
目的生成物を含む両分（８−１３）をプールし、分液漏
斗に移し、５４　ＮａＨＣＯ３２Ｘ　１００ｒＩＩｌで
洗りた。
その後有機部分を硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させて
わずかに黄色の油状物を得、これをトルエンｚｘｘｏｕ
ｔζ共蒸発させて精製生成物９．２５ｇ（５５チ）を得
た。この生成物は（３−（Ｎ−）リフルオロアセチルア
ミノプロピル））メチル−Ｎ、Ｎ　−ジイソプロピルホ
スホルアミダイトとして同定された。
Ａｐｐｌｉｅｃｌ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３７０Ｂ　
ＤＮＡ合成機に対し■準Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙａ
ｔｅｍａ　ＤＮＡ合成プロトコルを用いた。この合成プ
ロトコルは標準的な酸膜プロッキング工程、リン酸化工
程、キャッピング工程および酸化工程を含んでいた。ひ
とたび希望するプローブ核酸配列が合成されると、保護
オリゴヌクレオチド鎖のダ末端に保護アミノプロピル基
を付加するために、新しいホスホルアミダイトの（３−
（−Ｎ−トリフルオロアセチルアミノプロピル））メチ
ル−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミメイトを用い
る追加サイクルが実施された。得られたオリゴヌクレオ
チドはＡｐｐｌｉｅｃＬ　Ｂｉｏｓｙａｔｅｍａ社によ
って提供される慣用方法に従ってチオフェノールおよび
／または水酸化アンモニウムで脱ブロッキングした後回
収した。鞘層は一般にＣ−４またはＣ−１８カラムを用
いるＨＰＬＣＫかけてアセトニ）　＋）ル１０．１Ｍ酢
ｔｌｌ　）　リエチルアンモニウムの勾配で溶出するこ
とにより行った。
初めに１９−ｍａｒオリＩマー（上記配列から３′末端
塩基を除曹・大もの）として合成され危篤ニブロープは
、Ｎ４−アミノプロピル−ジデオキシシチジン−５′−
三リン酸の酵素的付加により３′末端を標識した。以下
にＮ４−アミノプロピルージデオキシシチジンーダー三
リン酸の一般的合成を示す。
固体のメタ重亜硫酸ナトリウムの添加によりＰＨ７，０
８〜７．１２に調整しく約２．３５　Ｆが必要）且つ最
終容重を１０１Ｒ１に調整し大、水中の１．３′−プロ
パンジアミン０．７４０．９（１０，０ミリモ／Ｉ／）
を含む重亜硫酸塩反応溶液を調装した。重亜硫酸塩反応
溶液ＩＱｍｌに１，３′−デオギシシチジンーダー三リ
ン酸１００７１１！ｉを那え、この混合物を密閉容器中
３７℃で６０時間インキエベートし次。反応溶液のｐＨ
は少縫のメタ重亜流峻ナトリウムの添加によりｐＨ７，
ｌに維持した。反応の進行は高圧液体クロマトグラフィ
ー（ＨＰＬＣ）により監視しｆｃ、生成物を単離するた
めに、反応混合物を脱イオン水で２．７５１　Ｋ希釈し
、ＤＥＡＪセフ了デックスＡ−２５カラム（２，６Ｘ６
Ｂ／６０Ｃ＃ｌ）にかけた。重炭酸トリエチルアンモニ
ウム緩衝液の直線勾配＜ＰＨ７，８、０，０５−−０，
６Ｍ）で溶出し、その後適当な両分を凍結乾燥してＮ４
−（３−アミノプロピル）　＋　２７　、３／−ジデオ
キシシチジン−５−三リン酸を得た。この固体はＨＰＬ
Ｃ（ＲＴ　＝　２０．０２分、　Ｒ’ｒ（ａａｃ’ｒｐ
）　＝　２１．０８分）で均一であり、Ｕｖλｍａｘ　
（Ｈ２Ｏ＝＝　２７２．５　ｎｍ　）により同定し大。
アミン標１１２０−ｍａｒプローブは、初めＫ　１９−
ｍｅｒオリゴマーを合成し、その後ターミナル　デオキ
シヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴａＴ）を用い
てＮ４・−アミノプロピル−ジデオキシシチジン−５′
−三リン酸（ＡＰａａＯＴＰ）を付加することにより製
造した。初めに、０．８５０Ｄ単一位（’）　１９−ｍ
ａｒプローブを滅菌水２０４μｌに溶解した。その後１
０ｍＭ　ＡＰ　（Ｌ（ｌ　ＣＴＰ　５．０μｇを加え、
続いてＩＭカコジル酸カリウム４８μｍ、　１０　ｍＭ
　Ｃ０ＣＡ’２４０μ／、５００μ、９／−ウシ血清ア
ルブミン８０μｇ、および１５ｍＭジチオトレイトール
１６μｅを加えた。この反応混合物を３７℃で１０分間
温め、その後これに５ｕｐｅｒｔｅ、ｃｈｓ社（メリー
ランド州ベセスダ）から得られｆｅ１０５０単位のＴａ
Ｔ酵素を加え大。酵素的末端付加（ｔａｉｌｉｎｇ）反
応は３７℃で２時間進行させた。その後この酵素を６５
℃で１０分間加熱することによ−り失活させた。末端付
加済みプローブ（今や２０−ｍａｒ）をＮＡＰ−１０カ
ラム（二＝−−シャーシー州ビスカタウェー、Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ社）に装填し、水で溶出して緩衝液成分を全
部除去した。約１．２５　ｍｌの水中に回収されたプロ
ーブは高速真空濃縮機にニーヨーク州ファーミンＩ−７
’−ル、５ａｖａｎｔ社）で乾燥した。
未標識プローブからの標識クマリンプローブの分離はＰ
ｈａｒｍａｃｉａ社農の高速タンパク質液体クロマトグ
ラフ（ＦＰＬＣ）を用いて行った。クマリンプローブは
逆相（１５μｍ）カラムに装填し、２．ＯＭｇ２分で０
．７５％／分のアセトニトリル勾配を用いて溶出した。
アセトニトリルおよび］；’ＰＬＣ緩衝系（ＴＥＡ−酢
醒、７）Ｈ７，０）の他の成分は両方とも揮発性である
ので、回収し六プローブは残渣のない状態で菟燥できた
。
一般に、注入し六プローブの５０〜７０％が回収され六
。
放射能−３′末端標識クマリンプローブの製造放射性Ｉ
Ｑ−ｆｆ１８ｒプローブは９−ｍａｒクマリン標識プロ
ーブの３′末端にジデオキシアデノシン−５′−三リン
酸−〔α”Ｐ）　（ａａＡＴＰ−（ａ３２Ｆ））を酵素
により付加することによりて製造した。−殻内反応は滅
菌水１７５μｌ！に１単位未満のプローブを溶解するこ
とから成ってい穴。その後Ａｍｅｒａｈａｍ社（イリノ
イ州アーリントンハイツ）から得られｆｃ２５０μＣ１
のｄｃｌＡＴＰ　−（ａ３２Ｐ〕を加え、続いて１Ｍカ
コジル酸カリウム（ｐＨ−７）４８μｅ　、　１０　ｍ
Ｍ　ＣｏＣｌ２４０μｇ、５００　／’、９７ｍｌウシ
血清アルブミン８０μｌ。
および１５　ｍＭレジチオレイトール１６μｇを加えた
。
３７℃で１０分間加温した後、３００単位のＴａＴを加
えた。この末端付加反応混合物を３７℃で２時間インキ
ＳＲ−トし、その後６５℃で１０分加熱して反応を止め
た。この反応混合物をＮＡＰ−１０カラムにかけて水で
溶出することによりプローブをｉｔ４’ＨＪした。得ら
れた放射性１０−ｍａｒは高速真空濃縮機で乾燥して一
２０℃で貯蔵した。トリチウム標識プローブはａａＡ’
ｒｐ−（ａ３２Ｐ〕の代わりに、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ
　Ｎｕｃｌｅａｒ社（マサチューセーｔツ州ボストン）
から得られるＡＴＰ　−（３Ｈ）を用いて、同じ方法で
製造し六。
放射能−５′末端標ＲＤＮＡの壊造 ３Ｑ　−ｍａｒターゲットＤＮＡおよび２０−ｍａｒプ
ローブは、同じキナーゼ反応によってその５′末端を放
射能標識し次。約０．２５単位のＤＮＡを滅菌水５μｌ
に溶解した。これに５ｘ前反応緩衝液（０，２５Ｍ）リ
ス：　ＨＣ／！（７）Ｈ７，６）、５０ｍＭＭｇＣ１２
，２５ｍＭジチオトレイトーｖ、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ）
　４μｌ、Ｎｅｗ　Ｅｎｇ３ａｎｄＮｕｃ’１ｅａｒ社
から得られ７１２　ＡＴＰ　−（：γ−３２ｐ）　６μ
ｇ、およびＴ４キナーゼ５μｅ（５０単位）を加え、３
７℃でインキユベートした。３時間後、１ｘ　ＳＤＳ　
緩衝液（０，５％）”デー／Ａ／硫酸ナトリウム、５　
ｎＭ　ＥＤＴＡ、０．１Ｍ　　ＮａＣｅ、１０ｍＭ　ト
リス、ＰＦ１７．４）８０μｌ　を加えて反応を止めた
。その後、この反応混合物をフェノール／クロロホルム
で２回、クロロホルムで１回抽出した。水性部分を予め
充填しておい六Ｇ−２５カラム（ペンシルバニア州／ソ
オリ、５′ｔ。
３′社）にかけて精製した。
反応性アミン官能基をもつ竿−桔よび第二プローブはク
マリン誘導体のＮ−ヒドロキシスクシンイミ）Ｉエステ
ルと反応させ穴。次のプロトコルが一般的である。標準
的な円錐′形プラスチックチェープの中で、約１０ｎＭ
のＤＮＡな０，１Ｍ３−（Ｎ−モルホリノ）フロパンス
ルホンｆＩＩ（ＭＯＰＳ）緩衝液（ｐＨ７，２）中３７
℃で過剰の１２００ｎＭノＮ−ヒｌ”ロキシスクシンイ
ミト１エステルクマリン誘導体と混合しｆｃ、この反応
混合物を１６〜３６時間インキュイードした。
実施例３−ハイブリダイゼーションおよびレーザー照射 一般的な光連結方法において、プローブおよびターゲッ
トＤＮＡを１００　ｍＭ　ＮａＣ１，１０ｍＭ　ＮａＨ
２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ７，２）に溶解した。プローブと
ターゲットを含む溶液を同じ緩衝液で希釈した。連結溶
液は両方のクマリン標識プローブと３Ｏ−ｒｎθｒター
ゲットから成っていた。照射前に、この溶液は水溶中６
５℃で５分間加熱してプローブとターゲットを変性し、
その後４５分な℃・し１時間かけて室温まで冷却した。
この溶液を５℃の水浴に移し、その場に１０分間保持し
た。
ハイブリダイズし六プローブとターゲットを含む溶液１
００μｇを、２面がマスクされた路長１．Ｏｃｍのセミ
マイク四キーばットにューヨーク州ジャマイカ、Ｈｅ’
１ｍａ　Ｃｏ〕１ｓ社）に移ｔ、ｆｃ、　コノ、＋。
ベットを励起源のビーム路に整列させ且つ５℃に平衡化
しておいたサーモジャケット付セルホルダー中に固足し
た。セルホルダーは窒素でノ々−ジした試料室の中に入
れ、キシベット壁土での湿分の凝縮を防いだ。連結反応
用の励起源は連続ビームへリウムーカト３ミウムレーザ
ー（カリフォルニア州すニーベール、Ｌｔｃｏｎｉｘ）
または、４ルス化ビーム窒素ガスレーザーに瓢−ジャー
ジー州プリンストン、ＥＧ＆Ｇ　Ｍｏｄｅｌ　２１００
）であッｆｔ−。セルに入射するＨｅ　−Ｃｄレーザー
の入射エネルギーは７、ＯｍＷであり、Ｎ２レーザーの
入射エネルギーは０．２　ｍＪ　／　Ａルスであった。
窒素レーザーのパルス数は１０Ｈｚに調整した。
また、照射は３００４ｍ以下の光線を除く大めに、２つ
のＣｏｒｎｉｎｇ　／１６０−５４フイルターでｐ光し
六２００Ｗ水鏝アーク灯（日本、ウシオＯ８Ｈ−ＺＯＯ
ＤＰ型）を用いて行っ六。
試料中に溶存している酸素は、照射前に０．２標準立方
フイ一ト／時でアルビンガス流をキシベットに供給する
ことによりて除いた。ガス抜きは照射前の６分間と照射
の間中行った。照射時間はＨｅ−Ｃ（Ｌレーザーに対し
１〜１０００秒、まｆｅＮｚレーザーを用いた時はパル
ス数ＩＱＨｚで１４〜１４０００パルス継続した。
照射済み試料の一部は高速真空製ａ３ｉ１ｍに入れて乾
燥し穴。その後、乾燥した試料をホルムアミド９：水８
：２０の溶液に再溶解し、２０チポリアクリルアミド、
５チビスアクリルアミビ、７Ｍ尿素変性用ケル上ニノセ
、５０℃、５００Ｖ　テ１．５時１’ｄｌ１２を泳動に
かけた。その後Ｘａｌフィルムをゲルに重ねて置き、１
時間露光後現像しｆｃ１次に、注意しながらフィルムを
もとの位置でゲルに亀ねて社き、放射能を含むゲル領域
を切り出した。放射能の測定に先立ってゲルからＤＮＡ
を取り出すｋめに、ゲル切片を０．１Ｍ）リス、０．１
Ｍホウ酸、０．２ｍＭ１ｉ１：ＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７，
２）　２ｍｌと混合し、小片に切断した。その後ゲル小
片を一晩抽出した。翌日この混合物を０．４５μアクロ
デイスク（ミシガン州アンプーパー、Ｇｅｌｍａｎ社）
に通して濾過し、炉液をシンチバース■シンテレーシ嘗
ンカクテル（二ニーシャーシー州フェアローム、ｌ’１
ｓｈｅｒ社）１０１Ｒ１に加えた。その後、これをＢｅ
ｃｋｍａｎ　ＬＳ　８１００シンチレーシ嘗ンカウンタ
ーで計数した。１秒の照射後に”Ｐ　１０−ｍａｒのみ
がゲル上に検出されたが、本実験を１０，１００および
１０００秒継続すると、２本の新しい放射能パント９が
現れ、そのうちの主要ノ之ント３は分子量標準と比較し
て大体３０−　ｍａｒであり、少量のバントは大体４０
−　ｍａｒである。
これらのデータは２つのプ目−プの光連結反応により３
０−　ｍａｒが形成され、副反応として１〇−ｍａｒの
３０−　ｍａｒターゲットへの光架橋により４０−　ｍ
ａｒが形成され六ことを示唆している。オートラジオダ
ラムからのＤＮＡバント０の切り出しおよびシンチレー
シ冒ン計数により得られ六光連結生成物の収率は”Ｐ−
１０−ｍａｒの変換に基づいて約３０％であり六。
ターゲットの不在下において、３０−　ｍａｒはポリア
クリルアミＰゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）　（鋳型に基づ
く光連結の証拠を与える）によって検出されなかった。
同様に、１０−　ｍｅｒおよび２０−　ｍｅｒの両方に
対して４０チの塩基対ミスマツチ（誤対合）を含む３０
−　ｍａｒ配列が相補的ターゲットの代わりに使用され
た場合、プローブ光反応生成物は検出できなかった。同
様に、　Ｐ−１０−ｍａｒおよびターゲットが存在する
が、２０−ｍａｒが全く存在しない場合、プローブ光反
応生成物は検出されなかッｆｅ。同ｍＫ、　　３２Ｐ−
１０−ｍａｒ、ターゲットおよび非りマリン標＠　２０
−　ｍａｒが存在する（すなわち、クマリンのうち一方
が欠損している）場合、プローブ光反応生成物は検出さ
れなかった。さらＫｓｌＯ−ｍａｒまたは２Ｇ　−ｍａ
ｒがクマリン標識されず（ｌＱ−ｍａｒは３２ｐ標識さ
れる）、ターゲットが存在する場合、プローブ光反応生
成物は検出されなかった。
ターゲット３０−　ｍｅｒが３２ｐで標識され且つ１０
−ｍ。ｒと２０−ｍａｒの両方がクマリンを含む場合、
３０−ｍａｒプローブ光反応生成物はオートラジオグラ
フィーによって検出されなかっｆｃ（シかし存在してい
り）、これらのデータはターゲットが３０−ｍａｒ光連
結生成物のバント９の形成に関与していないことを示唆
している。
別の方法において、第一の１０−ｍａｒプローブの代わ
りに第二２０−ｍａｒプローブを３２Ｐテｆｌｆｌ＆し
た。ターゲットへのハイブリダイゼーション、クマリン
誘導体の光活性化、および試料成分のＰＡＧＥ　ＩＡ−
離の後に、プローブ光反応体のバンドを切り出して監視
した。プローブ３０−ｍａｒ光反応生成物の、６ンドは
いつものように現れた。
さらに別の方法において、第−ＩＱ−ｍａｒプローブを
３２ｐで標識し、第二２０−ｍａｒプローブを３Ｈで標
識した。ターゲットへのハイブリダイゼーション、クマ
リン誘導体の光活性化、および試料成分のＰＡＧＥ分離
の後に、プローブ光反応体のゲルバント９を切り出して
監視した。マルチ−チャンネルシンチレーション計数は
、両方のアイソトープが３０−　ｍａｒバンドに組み込
まれたことを示した。
別の方法において、光反応体ノ２ンドをゲルから切り出
してＭａｙａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ塩基配列決定塩基配列
穴定法基配列決定はプローブ反応生成物について予測さ
れた順序で１０−ｍａｒおよび２０−ｍａｒプロー７’
が存在することを明らかにした。
本発明の態様は、ターゲット分子あたり１より多い信号
が発生される増幅技術によく適合する。
従って、１つのターゲット分子は追加の第一および第二
プローブの鋳型となって光活性化後に多数のプローブ反
応生成物を形成できる。こうして、変性、再生および光
活性化サイクルにより、１より多いプローブ反応生成物
が単一のターゲット分子から生成されるだろう。
別の方法において、ターデー）　ＤＮＡに対し１０倍過
剰のプローブを使用し、そして変性／再生サイクルを２
度の照射期間の間に行った。変性は第−光反応生成物を
ターゲットＤＮＡから解離させて、新しいプローブ対を
ターゲットにハイブリダイズさせるために必要であると
考えられた。新しいプローブは２度目の照射期間中に光
連結されることになっていた。この方法によれば、最高
２つの連結プローブが１度目の変性／再生サイクルに続
く照射の後に生成されるであろう。以前の実験において
約３０％の連結効率が観察されたので、ターゲットあた
り０．６の連結が２度の照射期間の後で期待された。驚
いたことに、光反応生成物の分析はターゲット分子あた
り３つのプローブ連結が達成されたことを示す。さらに
驚いたことは同情の元連結が変性／再生段階を完全に省
いた対照実験においても起こったという事実であった。
ターゲットＤＮＡの不在下では光連結が観察されず、た
った１回の２３分の照射が最大効果にとって十分である
と分かった。
明らかに、プローブ反応生成物は過剰のプローブによっ
て、または局部的な熱効果によって、あるいは立体効果
によって、全体的な試料条件を物理的に変える必要なし
にターゲット分子から脱ハイブリダイズすなわち解離さ
れる。７−ノドキシ−クマリン−６−オキシ酪酸Ｎ−ヒ
ト９０キシスクシンイミド１エステルを用いる増幅実験
のデータを下記の表■に示す。
表　　Ｉ 反応剤 光反応生成物 １ＨＭ　　　　１／’Ｍ　　Ｏ，４８μＭ　　　　Ｏ，
４８０，１１１ＨＭ　　　　Ｏ，Ｉ　ＰＭ　　　Ｏ，３
２μＭ　　　　３．２　　　　０．６９１ＨＭ　　　Ｏ
，０１μＭ　　Ｏ，２６μＭ　　　２６　　　　　４．
９１ＨＭ　　　　１ＨＭ　　　３７ＨＭ　　　３７　　
　　　６．５１ＨＭ　　　　Ｏ３，６ｎＭ １０／ｊＭ　　　　０　　　　０．３７μＭ１μＭのプ
ローブを使用すると、１０および１　ｎＭ　　のターゲ
ットを含む試料は試料中に存在するターゲラ）　ＤＮＡ
のレベルの約３０倍以上のレベルで連結プローブをもた
らした。増幅の陽を制限しうる１つの要因は、プローブ
をターゲラ）　ＤＮＡに架橋させてターゲットの触媒特
性を破壊する削反応の量であると考えられる。０．１Ｈ
Ｍのターゲットにおいて、そのターゲットは実験の終り
までにほとんど完全に消費される。１０および１ＨＭの
ターゲット検定では、起こりうる廿よりも多い架橋ター
ゲットが見出され穴。これらの試料の場合、ポリアクリ
ルアミド９ゲルから集められた放射能の借は低（、それ
故にそれらの値は他のゲル領域における高レベルの放射
能によって汚染を受けやすい。
光反応性官能基を選択することは望ましくない架橋反応
を制限することができる。種々のクマリン誘導体を光反
応プロトコルに適用して、架橋生成物とプローブ反応生
成物の数を調（た。クマリン−７−オキシ酪１９Ｎ−ヒ
ト１０キシスクシンイミビエステル、クマリン−５−オ
キシ酪Ｆ、？Ｎ−ピビロキシスクシンイミト１エステル
、４−メｆルクマリンー７−オキシ酪１９Ｎ−ヒト９０
キシスクシンイミド０エステル、７−ノドキシクマリン
−６−オキシｆｉ７４　ｐ　Ｎ−ヒト９０キシスクシン
イミド１エステル、およびクマリン−６−インチオシア
ネートで標識し穴プローブについて、それらの結果を表
Ｈに要約する。
表■ ７−オキシ酪酸” クマリン−５− オキシ酪酸７ クマリン−６− イソチオシアネート ０．９７ ５．１ １４．６ ローメトキシクマリン−２１２，０６，１７−オキシ酪
酸９ ０．９１ （−は読み取らなかったことを示す） ＊　　Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル。
料　２．ＢＪから５．６Ｊへ照射を２倍にすることによ
って得られたデータ。
０＊予備データを表し、あとのデータは′帛に高い架橋
値を示した。
これらのデータは、クマリン−５−オキシ酪酸Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミドエステルがプローブとターゲット
との架橋副反応生成物をほとんど形成せず、単一のター
ゲット分子から追加のプローブ反応生成物を形成させる
のに有利であることを示唆している。
本発明の態様は、単一のターゲット分子から１より多い
プローブ反応生成物をつくる増幅法に特徴がある。好適
な態様は、全体的な試料栄件を物理的に変えることなく
増幅させることが可能であり、例えば多量の信号を発生
させるのに多くの時間を要する温度の上げ下げ、ｐＨの
変更、塩濃度の変更などを行う必要がない。
本発明の態様は、限られた時間内に検定を完了しなけれ
ばならない臨床用途によく適合する。従って、本発明の
好適な実施態様を説明してき六が、本発明は変更や修飾
が可能であり、それ故に本発明は前述の細部にとられれ
るｋきでなく、特許請求の範囲内に含まれる変更および
修飾を包含すばきである。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明の態様に従う段階的方法および装置の特
許を示す模式図である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）ターゲットを第一リガンドおよび第二リガン
    ドと接触させ、その際第一および第二リガンドの少なく
    とも１つはそれらが反応位置に存在するとき活性化され
    ると第一リガンドと第二リガンドの間に共有結合を形成
    し得る反応性官能基を有し、そして前記第一リガンドお
    よび第二リガンドは反応位置で同時にターゲットに結合
    してターゲット／第一・第二リガンド複合体を形成し得
    るものであり； （ｂ）第一リガンドおよび第二リガンドが反応位置に存
    在する間に、その反応性官能基を活性化して、第一リガ
    ンドと第二リガンドの間に共有結合を形成させる； 各段階から成る共通のターゲットに結合する第一リガン
    ドおよび第二リガンドを連結する方法。 ２、前記の第一および第二リガンドは反応位置において
    実質的に隣接している、請求項１記載の方法。 ３、前記の第一リガンドおよび第二リガンドはターゲッ
    トポリヌクレオチドに結合し得るポリヌクレオチド鎖で
    ある、請求項１記載の方法。 ４、前記反応性官能基は少なくとも１つの光反応性基を
    含む、請求項２記載の方法。 ５、前記第一リガンドは光反応性官能基を含み、前記第
    二リガンドも光反応性基を含み、これらの光反応性基は
    相互作用して第一リガンドと第二リガンドの間に共有結
    合を形成することができる、請求項２記載の方法。 ６、前記の第一リガンドおよび第二リガンドはポリヌク
    レオチド鎖であり、前記第一リガンドは光反応性基を含
    み且つ前記第二リガンドも光反応性基を含み、これらの
    光反応性基はそれぞれ３′末端および５′末端に存在す
    る、請求項３記載の方法。 ７、前記の光反応性官能基は約３００ｎｍ〜３８０ｎｍ
    の波長をもつ光子により励起されると光化学反応を受け
    る、請求項５記載の方法。 ８、前記の光反応性官能基は反応エネルギーレベルへ励
    起させるために１，０００ｍｏｌｅ＾−＾１・１・ｃｍ
    ＾−＾１以上の吸光係数を有する、請求項５記載の方法
    。 ９、前記の光反応性官能基はクマリン、プソラレン、ア
    ントラセン、ピレン、カロチン、トロポン、クロモン、
    キノン、無水マレイン酸、アルキルマレイミド、オレフ
    ィン、ケトン、アジド、共役二重結合およびケトン官能
    基により特徴づけられるポリオレフィン、およびそれら
    の誘導体より成る光反応性官能基群から選ばれる、請求
    項１記載の方法。 １０、前記の光反応性官能基はクマリン誘導体である、
    請求項９記載の方法。 １１、前記クマリンは次の構造式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ＾１〜Ｒ＾６は−Ｈ、−ＣＨ＿３、−ＣＨ＿
    ２Ｃｌ、−ＣＨ＿２Ｂｒ、−ＣＨ＿２Ｉ、−ＣＨ＿２Ｆ
    、−ＣＨＣｌ＿２、−ＣＨＢｒ＿２、−ＣＨＩ＿２、−
    ＣＨＦ＿２、−ＣＨ＿２ＯＨ、−ＣＨ＿２ＯＣＨ＿３、
    −ＣＨ＿２ＮＨ＿２、−Ｎ＿３、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ
    ＣＨ＿３、−ＣＯＯＣＨ＿２ＣＨ＿３、−ＮＨ＿２、−
    ＮＯ２、−ＣＢｒ＿３、−Ｃｌ＿３、−ＣＦ＿３、−Ｃ
    Ｃｌ＿３、−ＣＨ（ＣＨ＿３）＿２、−Ｃ（ＣＨ＿３）
    ＿３、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ｆ、および−Ｏ（ＣＨ
    ＿２）＿ｎＣＨ＿３（ｎ＝０〜１０）より成る群から選
    ばれる、但しＲ＾１〜Ｒ＾６のうち１つはポリヌクレオ
    チドに結合するための官能基を含む〕 で表される、請求項１０記載の方法。 １２、前記プソラレンは次の構造式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ＾１〜Ｒ＾６は−Ｈ、−ＣＨ＿３、−ＣＨ＿
    ２Ｃｌ、−ＣＨ＿２Ｂｒ、−ＣＨ＿２Ｉ、−ＣＨ＿２Ｆ
    、−ＣＨＣｌ＿２、−ＣＨＢｒ＿２、−ＣＨＩ＿２、−
    ＣＨＦ＿２、−ＣＨ＿２ＯＨ、−ＣＨ＿２ＯＣＨ＿３、
    −ＣＨ＿２ＮＨ＿２、−Ｎ＿３、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ
    ＣＨ＿３、−ＣＯＯＣＨ＿２ＣＨ＿３、−ＮＨ＿２、−
    ＮＯ＿２、−ＣＢｒ＿３、−Ｃｌ＿３、−ＣＦ＿３、−
    ＣＣｌ＿３、−ＣＨ（ＣＨ＿３）＿２、−Ｃ（ＣＨ＿３
    ）＿３、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ｆ、および−Ｏ（Ｃ
    Ｈ＿２）＿ｎＣＨ＿３（ｎ＝０〜１０）より成る群から
    選ばれる、但しＲ＾１〜Ｒ＾６のうち１つはポリヌクレ
    オチドに結合するための官能基を含む〕 で表される、請求項９記載の方法。 １３、（ａ）結合条件下で試料を第一プローブおよび第
    二プローブと接触させ、その際前記第一プローブおよび
    第二プローブはそれらが反応位置にあるとき活性化され
    ると第一プローブと第二プローブを共有結合させてプロ
    ーブ反応生成物を形成し得る少なくとも１つの光反応性
    官能基を有し、そして前記第一および第二プローブはタ
    ーゲット分子に反応位置において結合してターゲット／
    第一・第二プローブ複合体を形成し得るものであり； （ｂ）前記試料を第一プローブおよび第二プローブの存
    在下で放射エネルギーにあてて前記のプローブ反応生成
    物を形成させ；そして （ｃ）プローブ反応生成物の存在について試料を監視す
    る ことから成る、ターゲット分子について試料を検定する
    方法。 １４、前記の第一プローブおよび第二プローブはターゲ
    ット分子に結合し得るポリヌクレオチド鎖である、請求
    項１３記載の方法。 １５、前記第一プローブは光反応性官能基を含み、前記
    第二プローブも光反応性官能基を含み、これらの光反応
    性官能基は相互作用して第一および第二プローブ間に共
    有結合を形成し得る、請求項１３記載の方法。 １６、前記の第一および第二プローブはポリヌクレオチ
    ド鎖であり、前記第一プローブの光反応性官能基および
    前記第二プローブの光反応性官能基はそれぞれ３′末端
    および５′末端に存在する、請求項１５記載の方法。 １７、前記の光反応性官能基は約３００ｎｍ〜３８０ｎ
    ｍの波長を有する光子により励起されると光化学反応を
    受ける、請求項１５記載の方法。 １８、前記の光反応性官能基は反応エネルギーレベルへ
    励起させるために１，０００ｍｏｌｅ＾−＾１・１・ｃ
    ｍ＾−＾１以上の吸光係数を有する、請求項１５記載の
    方法。 １９、前記の光反応性官能基はクマリン、プソラレン、
    アントラセン、ピレン、カロチン、トロポン、クロモン
    、キノン、無水マレイン酸、アルキルマレイミド、オレ
    フィン、ケトン、アジド、共役二重結合およびケトン官
    能基により特徴づけられるポリオレフィン、およびそれ
    らの誘導体より成る光反応性官能基群から選ばれる、請
    求項１５記載の方法。２０、前記の光反応性官能基はク
    マリン誘導体である、請求項１９記載の方法。 ２１、前記クマリンは次の構造式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ＾１〜Ｒ＾６は−Ｈ、−ＣＨ＿３、−ＣＨ＿
    ２Ｃｌ、−ＣＨ＿２Ｂｒ、−ＣＨ＿２Ｉ、−ＣＨ＿２Ｆ
    、−ＣＨＣｌ＿２、−ＣＨＢｒ＿２、−ＣＨＩ＿２、−
    ＣＨＦ＿２、−ＣＨ＿２ＯＨ、−ＣＨ＿２ＯＣＨ＿３、
    −ＣＨ＿２ＮＨ＿２、−Ｎ＿３、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ
    ＣＨ＿３、−ＣＯＯＣＨ＿２ＣＨ＿３、−ＮＨ＿２、−
    ＮＯ＿２、−ＣＢｒ＿３、−Ｃｌ＿３、−ＣＦ＿３、−
    ＣＣｌ＿３、−ＣＨ（ＣＨ＿３）＿２、−Ｃ（ＣＨ＿３
    ）＿３、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ｆ、および−Ｏ（Ｃ
    Ｈ＿２）＿ｎＣＨ＿３（ｎ＝０〜１０）より成る群から
    選ばれる、但しＲ＾１〜Ｒ＾６のうち１つはポリヌクレ
    オチドに結合するための官能基を含む〕 で表される、請求項２０記載の方法。 ２２、前記プソラレンは次の構造式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ＾１〜Ｒ＾６は−Ｈ、−ＣＨ＿３、−ＣＨ＿
    ２Ｃｌ、−ＣＨ＿２Ｂｒ、−ＣＨ＿２Ｉ、−ＣＨ＿２Ｆ
    、−ＣＨＣｌ＿２、−ＣＨＢｒ＿２、−ＣＨＩ＿２、−
    ＣＨＦ＿２、−ＣＨ＿２ＯＨ、−ＣＨ＿２ＯＣＨ＿３、
    −ＣＨ＿２ＮＨ＿２、−Ｎ＿３、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ
    ＣＨ＿３、−ＣＯＯＣＨ＿２ＣＨ＿３、−ＮＨ＿２、−
    ＮＯ＿２、−ＣＢｒ＿３、−Ｃｌ＿３、−ＣＦ＿３、−
    ＣＣｌ＿３、−ＣＨ（ＣＨ＿３）＿２、−Ｃ（ＣＨ＿３
    ）＿３、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ｆ、および−Ｏ（Ｃ
    Ｈ＿２）＿ｎＣＨ＿３（ｎ＝０〜１０）より成る群から
    選ばれる、但しＲ＾１〜Ｒ＾６のうち１つはポリヌクレ
    オチドに結合するための官能基を含む〕 で表される、請求項１９記載の方法。 ２３、前記の光反応性官能基はクマリン−７−オキシ酪
    酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、４−メチル
    クマリン−７−オキシ酪酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
    ドエステル、クマリン−５−オキシ酪酸Ｎ−ヒドロキシ
    スクシンイミドエステル、６−メトキシクマリン−７−
    オキシ酪酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、お
    よびクマリン−６−イソチオシアネートより成る群から
    選ばれる、請求項１５記載の方法。 ２４、前記プローブ反応生成物を前記ターゲットから分
    離し、別の第一プローブおよび第二プローブを前記ター
    ゲット上の反応位置につかせ、前記別の第一プローブお
    よび第二プローブに放射エネルギーをあてて別のプロー
    ブ反応生成物を形成させる追加段階を含む、請求項１５
    記載の方法。 ２５、第二組のプローブを前記プローブ反応生成物と共
    に結合条件に至らせ、前記第二組のプローブは前記プロ
    ーブ反応生成物が結合した反応位置につくことのできる
    第三プローブおよび第四プローブを含み、前記第三プロ
    ーブおよび第四プローブは、それらが反応位置にあり且
    つ光反応性官能基が活性化されるとき、前記の第三およ
    び第四プローブを一緒に共有結合させて第二のプローブ
    反応生成物を形成し得る少なくとも１つの光反応性官能
    基を含み、そして前記第三および第四プローブの少なく
    とも一方は検出可能な標識成分を含む、請求項１３記載
    の方法。 ２６、前記の第一プローブおよび第二プローブは前記第
    二のプローブ反応生成物上の反応位置につくことができ
    る、請求項２５記載の方法。 ２７、受容体と第一リガンドおよび第二リガンドとを受
    け取るための封入容器（前記第一および第二リガンドは
    それらが反応位置に存在するとき活性化されると第一リ
    ガンドと第二リガンドの間に共有結合を形成し得る少な
    くとも１つの反応性官能基を有し、前記第一リガンドお
    よび第二リガンドは反応位置において同時に受容体に結
    合して受容体／第一・第二リガンド複合体を形成し得る
    ものである）；および前記反応性官能基を活性化して前
    記第一および第二リガンド間に共有結合を形成させる手
    段；から成るリガンド連結用装置。 ２８、ターゲット分子を含む可能性のある試料と第一プ
    ローブおよび第二プローブとを受け取るための封入容器
    （前記第一および第二プローブはそれらが反応位置に存
    在するとき活性化されると第一プローブと第二プローブ
    の間に共有結合を形成し得る少なくとも１つの反応性官
    能基を有し、前記第一プローブおよビ第二プローブは反
    応位置において同時にターゲットに結合してターゲット
    ／第一・第二プローブ複合体を形成し得るものである）
    ；前記第一プローブと第二プローブの間に共有結合を形
    成させるべく前記反応性官能基を活性化する手段（前記
    第一および第二プローブはプローブ反応生成物を形成す
    る）；および前記ターゲットの存在を示すプローブ反応
    生成物を検出する検出手段；から成るターゲット分子を
    含む可能性のある試料の検定装置。 ２９、前記ターゲットはポリヌクレオチドである、請求
    項２８記載の装置。 ３０、次の構造式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ＿３およびＲ＿５は−ＯＨまたは−ＯＣＨ＿
    ３から選ばれ、Ｒ＿１、Ｒ＿２、Ｒ＿４およびＲ＿６は
    水素、脂肪族アミンと反応し得る反応性基、リガンド、
    または抗リガンドである〕 により特徴づけられる、光活性化の際にダイマーを形成
    させるのに有用な組成物。 ３１、前記反応性基はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエ
    ステルである、請求項３０記載の組成物。 ３２、前記リガンドまたは抗リガンドはポリヌクレオチ
    ドである、請求項３０記載の組成物。 ３３、前記ポリヌクレオチドは原子数１〜１０の結合鎖
    を含む、請求項３２記載の組成物。 ３４、クマリン、プソラレン、アントラセン、ピレン、
    カロチン、トロポン、クロモン、キノン、無水マレイン
    酸、アルキルマレイミド、オレフィン、ケトン、アジド
    、共役二重結合およびケトン官能基により特徴づけられ
    るポリオレフィン、およびそれらの誘導体より成る官能
    基群から選ばれる少なくとも１つの光反応性官能基を３
    ′末端または５′末端にもしくはその近傍に有するポリ
    ヌクレオチド。 ３５、３′末端と５′末端を有する第一鎖および３′末
    端と５′末端を有する第二鎖から成り、一方の鎖の３′
    末端が他方の鎖の５′末端に、反応性官能基から形成さ
    れたダイマーを介して結合されていることを特徴とする
    ポリヌクレオチド。 ３６、前記反応性官能基は光反応性である、請求項３５
    記載のポリヌクレオチド。 ３７、対象の受容体分子を含む可能性のある試料を接触
    させるための試薬を含む、隣接するリガンド類を光連結
    させるためのキットであって、前記試薬は第一プローブ
    および第二プローブを含み、ここで第一プローブおよび
    第二プローブはそれらが反応位置に置かれるとき、放射
    エネルギーの存在下で第一プローブと第二プローブを共
    有結合させてプローブ反応生成物を形成し得る少なくと
    も１つの光反応性官能基を有し、前記第一プローブおよ
    び第二プローブは反応位置につくためにターゲット分子
    に結合することができ、そして前記プローブ反応生成物
    は第一プローブまたは第二プローブから別々に区別し得
    る検出可能な特性を有する、キット。
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