JP5711441B2 - 多能性幹細胞に由来する肝細胞系譜細胞 - Google Patents
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Description
本発明は一般に、胚細胞および肝細胞の細胞生物学の分野に関する。より詳細には、本発明は、特定の培養条件下におけるヒト多能性幹細胞の肝細胞系譜細胞への定方向分化に関する。
本出願は、2000年4月27日に提出された米国仮特許出願第60/200,095号、および2000年11月20日に提出された米国実用特許出願第09/718,308号に対する優先権を主張するものである。米国における遂行を目的として、これらの優先出願はその全体が参照として本明細書に組み入れられる。
世界中の何百万もの人々が肝疾患に罹患している。劇症肝炎は肝機能の即時的かつ破局的な停止を意味する臨床医学用語であり、これは通常、数時間以内に死に至る。慢性肝炎および肝硬変などの他の形態の肝疾患では、肝機能が潜在的かつ進行性に不全に陥り、生理的健康度および長期予後に深刻な悪影響を及ぼす。米国では毎年、肝疾患による入院が300,000件に上り、30,000人が死亡している。その一方で、移植が可能なドナー肝臓の数は約4,500に過ぎない。
本発明は、多能性細胞から肝細胞系譜の細胞に分化した霊長類細胞の効率的な作製のためのシステムを提供する。未分化細胞および他の組織型への分化が決定された細胞と比べて肝細胞に典型的な特徴を相対的に多く備える、このような細胞の培養物が得られた。
本発明は、霊長類由来の多能性幹細胞から肝細胞系譜の分化した細胞を調製するためのシステムを提供する。
「肝細胞系譜」細胞、「肝芽細胞様」細胞および「胚様体様」細胞という用語は、記載する手法で多能性細胞を分化させることによって得られる本発明の分化細胞を指して用いうる。分化細胞は、本開示において後に提示するような、既知の肝細胞前駆細胞、肝芽細胞および肝細胞に顕著なさまざまな表現型特徴のうち少なくとも1つを有する。明示的に要求する場合を除き、これらの用語を用いることにより、細胞表現型、細胞マーカー、細胞機能または増殖能に関して特定の制限が課せられることはない。
本発明の実施に有用な一般的な技法のさらに詳細な説明に関して、実施者は細胞生物学、組織培養および発生学の標準的な教科書および総説を参照することができる。これに含まれるものには、「奇形腫および胚性幹細胞:実践的アプローチ(Teratocarcinomas and embryonic stem cells:A practical approach)」(E.J. Robertson編、IRL Press Ltd. 1987);「マウスの発生における技法の手引き(Guide to Techniques in Mouse Development)」(P.M. Wassermanら編、Academic Press 1993);「胚性幹細胞のインビトロ分化(Embryonic Stem Cell Differentiation in Vitro)」(M.V. Wiles, Meth. Enzymol. 225:900, 1993);「胚性幹細胞の特性および用途:ヒト生物学および遺伝子治療への応用の可能性(Properties and uses of Embryonic Stem Cells:Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy)」(P.D. Rathjenら、Reprod. Fertil. Dev. 10:31, 1998)が含まれる。肝細胞系譜の細胞に関する一般的な情報および方法は、「肝幹細胞(Liver Stem Cells)」(S. SellおよびZ. Ilic, R.G. Landes Co., 1997)、「幹細胞生物学(Stem cell biology)」(L.M. Reid, Curr. Opinion Cell Biol. 2:121, 1990)ならびに「肝幹細胞(Liver Stem Cells)」(J.W. Grisham, pp 232〜282、幹細胞(Stem Cells)、Academic Press, 1997)に記載がある。薬学研究における肝細胞様細胞の使用は、「薬学研究におけるインビトロの方法(In vitro Methods in Pharmaceutical Research)」(Academic Press, 1997)に記載されている。
pPS細胞の単離および増殖のための培地は、得られる細胞が望ましい特徴を有していてさらに増殖可能である限り、いくつかの異なる処方のうち任意のものでありうる。適した供給元は以下の通りである:ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)、Gibco # 11965-092;ノックアウト・ダルベッコ変法イーグル培地(KO DMEM)、Gibco # 10829-018;200mM L-グルタミン、Gibco # 15039-027;非必須アミノ酸溶液、Gibco 11140-050;β-メルカプトエタノール、Sigma # M7522;ヒト組換え塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、Gibco # 13256-029。代表的な血清含有ES培地は、80%DMEM(典型的にはKO DMEM)、20%規定ウシ胎仔血清(FBS)(熱非働化を行っていないもの)、1%非必須アミノ酸s、1mM L-グルタミンおよび0.1mMβ-メルカプトエタノールから構成される。無血清ES培地は、80%KO DMEM、20%血清代替物、1%非必須アミノ酸、1mM L-グルタミンおよび0.1mMβ-メルカプトエタノールから構成される。すべての血清代替物が使えるとは限らず、有効な血清代替物の1つにGibco # 10828-028がある。多能性幹細胞の増殖における無血清培地に関する情報は、国際公開特許・国際公開公報第97/47734号(Pedersen, U. California)および国際公開公報第98/30679号(Priceら、Life Technologies)に公開されている。培地は濾過して4℃で保存するが、2週間を過ぎないようにする。使用の直前に、ヒトbFGFを最終濃度4ng/mLとなるように添加する(Bodnarら、Geron Corporation、国際公開特許・国際公開公報第99/20741号)。
胚性幹細胞を霊長類種に属する生物の胚盤胞から単離することができる(Thomsonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844、1995)。ヒト胚性幹(hES)細胞は、トムソン(Thomson)ら(米国特許第5,843,780号;Science 282:1145、1998;Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff.、1998)に記載された技法を用いてヒト胚盤胞細胞から調製可能である。
胚性幹細胞は、栄養培地中にてフィーダー細胞の層の上で培養することができる。ES細胞は通常、1〜2週間毎に、短時間のトリプシン処理、ダルベッコPBS(カルシウムまたはマグネシウムを含まず、2mM EDTAの入ったもの)に対する曝露、ディスパーゼもしくはIV型コラゲナーゼ(1mg/ml;Gibco)に対する曝露により、または個々のコロニーをマイクロピペットで選別することによって分割する。約50〜100個の細胞からなる集塊が最適である。または、プロテアーゼとともにインキュベートした後に培養物を剥離し、小さな塊に解離させた上で、1:3〜1:30の分割率で新たなフィーダー細胞の上に再び播く。
本発明の分化細胞は、pPS細胞を肝細胞分化誘導物質の存在下で培養することによって作製しうる。選択的には、細胞を肝細胞成熟因子の存在下でも培養するが、分化誘導物質とともに培養する場合にはそれと同時でもその後でもよい。以下の項で説明するように、その結果得られる細胞は肝細胞系譜の表現型特徴を有する。
n-酪酸は肝細胞分化誘導物質のモデルであり、以下の実施例に例示している。類似の作用を有し、本発明の実施において代替物として用いうるn-酪酸のさまざまな同族体を容易に同定しうることを当業者は容易に認識すると考えられる。
肝細胞分化誘導物質を用いた分化細胞の濃縮を、必要に応じて、肝細胞成熟因子として作用する別個の化合物または化合物の混合物を用いることによって補うことができる。このような作用物質は、分化誘導物質によって促される表現型変化を増強する、またはより成熟した細胞の方向に分化経路をさらに押し進める、または肝細胞系譜の細胞を選別する一助となる(例えば、それらの生存を選好的に補助することにより)、または望ましい表現型を備えた細胞のより迅速な増殖を促進する、という可能性がある。
細胞はさまざまな表現型基準に従って特徴づけることができる。基準には、発現された細胞マーカーの検出または定量化、および酵素活性、および形態的特徴の特徴分析および細胞内シグナル伝達が非制限的に含まれる。
* 24時間培養ヒト肝細胞において測定した、酵素活性の平均±標準偏差。
† シトクロムP450含有量を細胞タンパク質1mg当たりのピコモル数として表している。
‡ NADPH-C、UDPG-tおよびGSH-tの活性は1mg、1分当たりのナノモル数として表している。
§ CYP酵素活性は1mg、1分当たりのピコモル数として表している。
ある種の薬物スクリーニングおよび治療的応用においては、肝細胞系譜の細胞に複製能があることが望ましい。選択的には、本発明の細胞を、その複製能力を高めるために、発生的に限定された発生系譜細胞または最終分化細胞へと進行する前または後に、テロメラーゼ導入処理を行うことが可能である。テロメラーゼ導入処理を行ったpPS細胞を前記の分化経路の下流に進ませてもよく、分化細胞にテロメラーゼ導入処理を直接行うこともできる。
本発明は、肝細胞系譜の多数の細胞を作製することができる方法を提供する。これらの細胞集団は、さまざまな重要な研究、開発および販売の目的に用いることができる。
本発明の分化細胞を、他の系譜由来の細胞において選好的に発現されるcDNAが比較的混入していないcDNAライブラリーを調製するために用いることもできる。例えば、細胞を1000rpm、5分間の遠心処理によって収集し、続いてペレットから標準的な技法(Sambrookら、前記)によってmRNAを調製する。逆転写によってcDNAにした後、調製物を以下の細胞種:未分化pPS、胚線維芽細胞、近位内胚葉、類洞内皮細胞、胆管上皮、または望ましくない特異性を有する他の細胞のいずれかまたはすべてに由来するcDNAとのサブトラクションにかけ、それにより、成熟肝細胞、肝細胞前駆細胞またはその両方の代表的な発現パターンを反映する限定されたcDNAライブラリーを得ることができる。
分化したpPS細胞は、肝細胞前駆細胞に特異的な転写物および新たに合成されたタンパク質の発現パターンを同定する目的に関心がもたれ、分化経路の方向づけまたは細胞間の相互作用の促進にも役立つ可能性がある。分化細胞の発現パターンを入手し、未分化pPS細胞、分化能が決定された前駆細胞(他の系譜の方向に分化したpPS細胞、造血幹細胞、他の中胚葉由来組織の前駆細胞、内皮もしくは胆管上皮の前駆細胞、成体組織から得た肝細胞幹細胞、または別の試薬もしくは手法を用いて肝細胞系譜の方向に分化したpPS細胞)などの対照細胞と比較する。
本発明の分化したpPS本発明は、分化肝細胞系譜の細胞の特徴に影響を及ぼす因子(溶媒、低分子薬、ペプチド、ポリヌクレオチドなど)または環境条件(培養条件または操作など)のスクリーニングに用いることができる。
本発明は、肝機能の程度を回復させるための分化したpPS細胞の使用であって、肝機能の急性、慢性または遺伝性障害があると考えられるためにこのような治療法を必要とする対象における使用も提供する。
実験手順
本節には、以下の実施例の項で用いる技法および試薬のいくつかに関する詳細を示す。
hES細胞は、無血清培地中にて初代マウス胚線維芽細胞上で維持した。hES細胞を、照射したマウス胚線維芽細胞の上に細胞約40,000個/cm2の密度で小さな塊として播いた。これらの培養物を、80%KO DMEM(Gibco)および20%血清代替物(Gibco)から構成され、1%非必須アミノ酸、1mMグルタミン、0.1mM β-メルカプトエタノールおよび4ng/mLヒトbFGF(Gibco)を補充した培地中で維持した。細胞をESコロニーの連続継代によって増やした。これはESコロニーの単層培養物を1mg/mLコラゲナーゼにより37℃で5〜20分間処理することによって行った。続いて培養物を丁寧に剥離して細胞を採取した。塊を丁寧に分離し、小さな塊として新たなフィーダー細胞の上に再びプレーティングした。
フィーダー細胞の存在下または非存在下にある集密化したhES細胞の単層培養物を、コラゲナーゼ中で15〜20分間インキュベートした後に細胞をプレートから剥離することによって収集した。続いて細胞を塊に分離し、80%KO DMEM(Gibco)および熱非働化を行っていない20%FBS(Hyclone)から構成され、1%非必須アミノ酸、1mMグルタミン、0.1mMβ-メルカプトエタノールを補充した培地を入れた非接着性細胞培養プレート(Costar)中にプレーティングした。細胞は1ウェル(6ウェルプレート)当たり2mLの培地中に1:2の比で播いた。EBには1ウェル当たり2mLの培地を1日置きに添加することによって栄養分を与えた。培地の容積が4mL/ウェルを上回った時点でEBを収集し、新たな培地中に再懸濁した。4〜8日間の懸濁培養の後、EBを基質上にプレーティングし、さらに分化させた。
ウェルをマトリゲル(登録商標)により、製造者の指示に従ってコーティングした。簡潔に述べると、通常のマトリゲル(登録商標)または増殖因子減少型のマトリゲル(登録商標)(Collaborative Biosciences)を4℃で少なくとも3時間かけて解凍した。これをhES細胞培養物の場合は冷KO DMEMで1:10または1:20に希釈し、肝細胞培養物の場合は1:30に希釈した。冷却しておいたプレートおよびピペットチップを用いて0.75〜1mLのマトリゲル溶液を各ウェル(9.6cm2)に添加した。プレートを室温で1時間、または4℃で一晩インキュベートし、続いて冷KO DMEMで1回洗浄した後に細胞を添加した。
チェンバースライド上で増殖している細胞を、3.5%パラホルムアルデヒド中に室温で5分間置き、続いて-20℃のメタノール中に20分間置くことによって固定した。固定した細胞をPBSで2回すすぎ洗いし、10%ヤギ血清(PBS中)中に1時間おいてブロックした。それらを次に10%ヤギ血清およびPBS中に希釈した一次抗体とともに2時間インキュベートした。アルブミン、α-フェトプロテイン(AFP)(Sigma)およびα1-抗トリプシン(QEB Biosciences Inc.)に対する抗体は1:500に希釈し、サイトケラチン8、18および19、デスミン(NeoMarkers)、ビメンチン(Dako)およびSMA(Sigma)に対する抗体は1:200に希釈した。続いて細胞をPBSで3回洗い、1:100希釈したFITC結合抗マウスIgGである二次抗体ともにインキュベートし、5%ヤギ血清(PBS中)で1:1000希釈したヘキスト(Hoechst)HH33258(Sigma)とともに1時間インキュベートした。染色した細胞をPBSで3回洗浄し、ベクタシールド(Vectashield)(商標)(Vector Labs)中にマウントした。10倍および40倍の画像を、エピフルオレセンスおよびスポット式CCDカメラを装着したニコン・ラボフォト(Nikon Labophot)(商標)で撮影した。
過ヨウ素酸-シッフ染色液(PAS)は、アメリカンマスターテックサイエンティフィック社(American Master Tech Scientific Inc.)から入手した。細胞をチェンバースライド上で増殖させ、-20℃のアセトン:メタノール1:1中に20分間置いて固定した。固定した細胞を水道水で、続いて蒸留水ですすぎ洗いした。続いて細胞を0.5%過ヨウ素酸溶液中で室温にて4分間インキュベートし、蒸留水ですすぎ洗いした。それらを次にシッフ溶液とともに室温で10分間インキュベートし、水道水で数回すすぎ洗いした。続いて細胞をファストグリーン染色液中で2分間インキュベートし、100%アルコールで2回すすぎ洗いして、DPXマウント用媒体中にマウントした。10倍および40倍の画像を、エピフルオレセンスおよびスポット式CCDカメラを装着したニコン・ラボフォト(商標)で撮影した。
細胞を表記の増殖培地中にてチェンバースライド上で増殖させ、10μM BrdUにより24時間かけて標識した。続いて細胞を3:1メタノール:酢酸で30分間固定し、時下に一晩おいて風乾させた。固定した細胞をPBSで1回すすぎ洗い、0.07N NaOH中に2分間おいて変性させた後、pH 8.5およびpH7.4のPBSによる短時間のすすぎ洗いを数回行った。次にそれらを1.5%ヤギ血清(Vector Labs)を15分間用いてブロックし、1.5%ヤギ血清および0.05%Tween(商標) 20中に1:500に希釈した抗BrdU抗体(Sigma)とともに2時間インキュベートした。試料をPBSで2回洗った後、1.5%ウマ血清中に10μg/mLに希釈したビオチン化ヤギ抗マウス免疫グロブリン(Vector Labs)である二次抗体とともに30分間インキュベートした。試料を再びPBSで3回洗浄した後、10mM HEPES緩衝液および0.15M NaCl pH 8.5中に30μg/mLに希釈した染色用結合物であるテキサスレッド(Texas Red)標識ストレプトアビジン(Vector Labs)とともに20分間、暗下でインキュベートした。すべての核を染色するために、ストレプトアビジン溶液にヘキスト(Hoechst)HO33258染色剤(ビスベンズイミド、Sigmaカタログ番号B2883)を最終濃度2.5μMとなるように混合した。染色した細胞を再びPBSで3回洗い、ベクタシールド(商標)(Vector Labs)中にマウントした。10倍および40倍の画像を、エピフルオレセンスおよびスポット式CCDカメラを装着したニコン・ラボフォト(商標)で撮影した。
転写レベルでの発現に関するRT-PCR分析を以下の通りに行った:RNAイージーキット(RNAeasy Kit)(商標)(Qiagen)を製造者の指示に従って用いて、RNAを細胞から抽出した。続いて、混入したゲノムDNAを除去するために最終産物をDNA分解酵素で消化した。RNAを、10mM Tris pH 7.5、10mM MgCl2および5mM DDTを含む緩衝液中にて、RNAガード(Pharmacia Upjohn)およびDNA分解酵素I(Pharmacia Upjohn)とともに37℃で30〜45分間インキュベートした。タンパク質を試料から除去するために、フェノール-クロロホルム抽出を行い、3M酢酸ナトリウムおよび100%冷エタノールでRNAを沈殿させた。RNAを70%エタノールで洗浄し、ペレットを風乾させた上でDEPC処理水中に再懸濁した。逆転写酵素(RT)反応に関しては、500ngの全RNAを最終濃度が1倍の第一鎖緩衝液(Gibco)、20mM DDTおよび25μg/mLのランダムヘキサマー(Pharmacia Upjohn)と混ぜ合わせた。70℃に10分間おいてRNAを変性させた後、室温に10分間おいてアニーリングを行わせた。dNTPを0.5μLのスーパースクリプトII RT(Superscript II RT)(Gibco)とともに最終濃度1mMとなるように添加し、42℃で50分間インキュベートした後に、80℃に10分間おいて熱失活させた。その後はPCR分析に用いるまで試料を-20℃で保存した。標準的なポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、関心対象のマーカーに対して特異的なプライマーを用いて、以下の反応混合液中で行った:cDNA 1.0μL、10×PCRバッファー(Gibco)2.5μL、10×MgCl2 2.5μL、2.5mM dNTP 3.0μL、5μM 3'-プライマー1.0μL、5μM 5'-プライマー、1.0μL、Taq 0.4μL、DEPO水 13.6μL。選択したマーカーおよび反応条件を表3に示す。
胚様体(EB)を前の節で説明した通りに調製した。5日間の懸濁培養の後にそれらを収集し、増殖因子減少型のマトリゲル(登録商標)をコーティングしたプレート上およびチェンバースライド(Nunc)中にプレーティングした。以下の3つの条件の1つずつを平行して用いた:
・20%ウシ胎仔血清(FBS)を含む培地;
・20%FBSおよび5mM酪酸ナトリウム(Sigma)を含む培地;
・20%FBS、0.5%DMSO(ATOC)、4μMデキサメタゾン(Sigma)、150ng/mlインスリン、10ng/ml EGF、600nMグルカゴン(Sigma)を含む培地。
hES細胞から派生した胚様体を4日または5日間の懸濁培養後に収集し、20%FBSおよび5mM n-酪酸ナトリウムを含む培地を入れたマトリゲル(登録商標)でコーティングした、6ウェルプレート(RNA抽出のため)およびチェンバースライド(免疫細胞化学のため)上にプレーティングした。培地は毎日または隔日に交換した。第1日に多数の細胞死がみられ、その後の数日間は細胞死が減少した。
n-酪酸を用いて分化させた細胞におけるさまざまな肝細胞成熟因子の候補による影響を検討した。hESを5mM n-酪酸ナトリウム中で4日間培養した後に、異なる培地に交換した。以下の代替物を検討した:
1.クロネティクス(Clonetics)の「HCM」培地;
2.インスリン、上皮増殖因子(EGF)、デキサメタゾンおよびグルカゴンを補充した10%ウシ胎仔血清(FBS);
3.インスリン、EGF、デキサメタゾンおよびグルカゴンを補充した10%ウシ血清(CS);
4.インスリン、EGF、デキサメタゾンおよびグルカゴンを補充した20%FBS。
酪酸ナトリウムでhESを分化させてから数日後に、細胞に対して、テロメラーゼ逆転写酵素のヒト相同体(hTERT)をコードするレトロウイルスによる形質導入を行う。本ベクターは、pGRN145と命名されたプラスミド由来のhTERTコード配列が、市販のpBABEピューロマイシン作製物のEcoRI部位に挿入されたものを含む。hTERTコード配列はレトロウイルスLTRプロモーターの制御下に置かれている。対照およびhTERT pBABEレトロウイルス上清を、PA317パッケージング細胞系を用いて調製し、4μg/mLポリブレンと組み合わせる。
以下の通りに、フィーダー細胞を用いない条件下で未分化hESコロニーを連続継代した。培養物を1mg/mLコラゲナーゼ中にて37℃で約5分間インキュベートした。続いて、表面から細胞を剥離することによって細胞を収集し、小さな塊に分離した。細胞を1:3または1:6に分け、ほぼ細胞55,000個/mL(17,000細胞/cm2)とした。再プレーティングの翌日に、未分化細胞のコロニーを再び同定できた。コロニー間にある単細胞が分化していた。その後数日にわたって未分化細胞の増殖が認められ、コロニーは大きくなって稠密化した。コロニー間の分化細胞もより稠密になった。細胞は馴化培地を毎日与えたところ4〜7日間で集密化した。細胞が集密に達した時点でそれらをさらに分割した。
本実験では、肝細胞成熟因子DMSOの存在下で、肝細胞分化誘導物質である酪酸の効果を調べた。
・ゼラチンでコーティングしたプレート、5mM酪酸ナトリウムの存在下
・ゼラチンでコーティングしたプレート、5mM酪酸ナトリウムおよび1%DMSOの存在下
・マトリゲル(登録商標)でコーティングしたプレート、5mM酪酸ナトリウムの存在下
・マトリゲル(登録商標)でコーティングしたプレート、5mM酪酸ナトリウムおよび1%DMSOの存在下
未分化hES細胞をフィーダー細胞を用いない条件(マトリゲル(登録商標)上、MEF-CM中)で維持した。この方法は、肝細胞成熟因子であるDMSOまたはレチノイン酸(RA)をサブコンフルエント培養物に添加することにより、全体的な分化過程を開始させる目的で行った。続いて、酪酸ナトリウムの添加により、肝細胞様細胞を形成するように細胞を誘導する。
フィーダー細胞を用いない条件下でhES細胞からEBを作製した。4日間の懸濁培養の後に、5mM酪酸ナトリウムまたは5mM酪酸ナトリウムおよび1%DMSOを補充した20%FBS培地中にEBをプレーティングした。EBは以下のマトリックス上にプレーティングした:
1.コラーゲンI(0.03mg/mLを37℃で一晩コーティング)
2.増殖因子減少型マトリゲル(登録商標)(1:10、室温で1時間コーティング)
3.ゼラチン(1%を37℃で2時間コーティング)
以前に詳細に説明した直接分化プロトコールを行うhES細胞に関して、表12に示した培養条件に調整を加える。肝細胞培地はクロネティクスから購入する;ストローム培地はルンゲ(Runge)ら、Biochm. Biophys. Res. Commun. 265:376、1999に記載された通りに調製する。得られた細胞集団を免疫細胞化学および酵素活性により評価する。
直接分化プロトコールによって生じたhES由来の肝細胞系譜細胞をシトクロムP450活性に関して検討した。
Claims (4)
- インビトロで培養可能な分化した肝細胞系譜細胞を得るために、ヒト多能性幹(hPS)細胞を処理する方法であって:
a)ヒト多能性幹細胞の培養物を提供する段階;
b)肝細胞系譜細胞の濃縮(enrichment)をもたらす条件下で、n−ブチラート、n−酪酸、イソ酪酸、プロピオン酸及びイソ吉草酸からなる群から選択される肝細胞分化誘導物質を含む培養培地中の基質上で、細胞を培養する段階
を含む方法。
- 以下の特徴の1つまたは複数を有する、請求項1に記載の方法:
・胚様体が形成される条件下で細胞を培養する段階;
胚様体を細胞外マトリックス上にプレーティングする(plate)段階;
胚様体のプレーティングと同時にまたはその後に、肝細胞分化誘導物質を培地に添加する段階;および
次に、分化細胞の濃縮が可能となる条件下で、プレーティングした細胞を肝細胞分化誘導物質とともに培養する段階
によって、hPS細胞の培養物を産生する;
・細胞外マトリックスを含むがフィーダー細胞を本質的に含まないhPS細胞の培養物に、肝細胞分化誘導物質を添加し;かつ次に、分化細胞の濃縮が可能となる条件下で、hPS細胞を肝細胞分化誘導物質とともに培養する;
・細胞が、肝細胞分化誘導物質との培養と同時にまたはその後に、1つまたは複数の肝細胞成熟因子とともに培養され、ここで肝細胞成熟因子の少なくとも1つが、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ジメチルアセトアミド(DMA)、ヘキサメチレンビスアセトアミド、及び他のポリメチレンビスアセトアミドから選択される有機溶媒、またはグルココルチコイド、上皮増殖因子(EGF)、インスリン、TGF−α、TGF−β、線維芽細胞増殖因子(FGF)、ヘパリン、肝細胞増殖因子(HGF)、IL−1、IL−6、IGF−I、IGF−II、及びHBGF−1から選択されるサイトカインもしくはホルモンである。
- 肝細胞分化誘導物質がn−ブチラートであり;細胞外マトリックスが、ラミニン、コラーゲン、またはエンゲルブレス−ホルム−スワーム(Engelbreth−Holm−Swarm)細胞由来のマトリックスである、請求項2に記載の方法。
- hPS細胞がヒト胚性幹(hES)細胞である、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
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