JP4876334B2 - ヒアルロン酸産生能増強剤およびその用途 - Google Patents
ヒアルロン酸産生能増強剤およびその用途 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定のホスフェート誘導体（環状リン酸エステル）を用いる動物細胞におけるヒアルロン酸の産生増強能作用を有する産生増強剤、ヒアルロン酸合成酵素の遺伝子の発現促進剤及び皮膚外用組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒアルロン酸は、脊椎動物のあらゆる組織に認められ、コラーゲンやエラスチンなどとともに細胞外にマトリックスを構築している。その役割は十分に解明されていないが、組織の弾力性や伸縮性の他に細胞増殖や遊走性の制御（Ｒ．Ｋｏｓａｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５９，５，１１４１−５頁，１９９９年）やヒアルロン酸と結合するコンドロイチンやフィブリノーゲン、Ｉ型・ＶＩ型コラーゲンとの会合状態の制御（Ｃ．Ａ．ＭｃＤｅｖｉｔｔ，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２９４，３，１６７−７０頁，１９９１年）など多彩で生理的にも重要な役割を担っていることが知られている。
暦的加齢において強調される皮膚の硬化あるいは弾力性の低下なども皮膚の真皮線維芽細胞によるヒアルロン酸などのグリコサミノグリカン量の低下がその原因の一つとして挙げられる（Ｌ．Ｊ．Ｍｅｙｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１０２，３，３８５−９頁，１９９４年）。そのような観点から、これまで、皮膚の暦的加齢を軽減する手段として、皮膚のヒアルロン酸産生能を回復させる細胞賦活剤の開発が試みられてきた。
【０００３】
これまで、インターロイキン類やプロスタノイド類などがヒアルロン酸産生能を増強する物質として報告されているが、炎症系のメディエーターでもあることから安全性などの面で実際に前記の化合物を使用することは困難となっていた。また、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）や血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）などの成長因子もヒアルロン酸の産生を増強させることが報告されている（Ｐ．Ｈｅｌｄｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２５８，３，９１９−２２頁，１９８９年）。しかし、これらの成長因子は、一般に調製および精製が困難な上に安定性にも乏しく、分子量の点から無傷皮膚内へ浸透することも期待できず、実用性の点からは問題が多い。
そのため、皮膚の暦的加齢を軽減する他の手段として、卵白酵素分解物（特開平５−２７１０４９号公報）やリゾリン脂質（特開平８−６７６１９号公報、特開平８−６７６２０号公報、特開平８−６７６２１号公報）、シソ科植物（特開平１０−９５７３５号公報）、クワ科植物（特開平１１−６０４９６号公報）あるいはデヒドロアンドロステロン（特開平１１−１９３２３６号公報）が開示されてきた。しかしながら、皮膚においてヒアルロン酸産生能を増強する可能性および機序については依然として未解明な部分もある。したがって、安全で、より効果的なヒアルロン酸産生を亢進する新規な化合物が望まれている。
【０００４】
ヒアルロン酸の減少は、前述したように暦的加齢に伴って認められるが、ヒアルロン酸含有率の著しく高い胎児や幼児では皮膚の創傷治癒後の瘢痕形成は極めて軽微であり、この原因の一つとしてヒアルロン酸の関与が広く認められている。ヒアルロン酸の減少は、皮膚の暦的加齢以外にステロイドの反復投与などによっても引き起され、皮膚の萎縮などの外観上好ましくない問題を伴う（Ｒ．Ｍ．Ｌａｖｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，２６，４，５３５−４４頁，１９９２年）。したがって、美容上の観点から成人皮膚の創傷治療の際に瘢痕の形成を回避するため、あるいはステロイドの反復投与による皮膚の萎縮の軽減のため、皮膚細胞によるヒアルロン酸産生を増強させる何らかの手段が望まれている。このために例えば、リゾホスファチジン酸を使用することが考えられ、顕著なヒアルロン酸産生増強作用が確認されているが、これは、細胞培養実験において腸間膜由来の中皮細胞への腹水肝がんの浸潤を亢進する恐れがあることが報告されている（Ｆ．Ｉｍａｍｕｒａ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９３，２，４９７−５０３頁，１９９３年）。したがって、このような問題のないヒアルロン酸産生増強能を有するアナログ体が望まれていた。
【０００５】
一方、リゾホスファチジン酸環状リン酸エステルは、ＤＮＡポリメラーゼα阻害剤（特開平７−２５８２７８号公報）やがん転移抑制剤（特開平９−２５２３５号公報）として開示されているが、ヒアルロン酸産生能を増強させる細胞賦活剤としての働きは全く知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の第１の目的は、皮膚の暦的加齢やステロイドの反復投与などによる皮膚の萎縮および創傷治癒後の瘢痕形成を防止するため、細胞を賦活化しヒアルロン酸の産生分泌を亢進させる特定のリン化合物であるヒアルロン酸産生増強剤を提供することにある。
また本発明の第２の目的は、従来のヒアルロン酸産生増強剤より使用が簡便かつ、より優れた効果を有する特定のリン化合物であるヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進剤を提供することにある。
さらに本発明の第３の目的は、皮膚の萎縮および瘢痕形成を防止する皮膚外用剤組成物を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題に鑑み、動物細胞においてヒアルロン酸の産生能を増強する物質について検討した結果、特定の構造のリゾホスファチジン酸の環状リン酸エステルが動物細胞におけるヒアルロン酸の産生を効果的に促進することを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明によれば、下記式［Ｉ］
【０００８】
【化７】
【０００９】
（式中ＲＯは、炭素数１６〜２２のアルコール残基または脂肪酸残基を示す。Ｍはアルカリ金属原子を表す。）で表されるホスフェート誘導体を有効成分とする動物細胞培養用のヒアルロン酸産生能増強剤が提供される。
また本発明によれば、下記式［Ｉ］
【００１０】
【化８】
【００１１】
（式中ＲＯは、炭素数１６〜２２のアルコール残基または脂肪酸残基を示す。Ｍはアルカリ金属原子を表す。）で表されるホスフェート誘導体を有効成分とする動物細胞培養用のヒアルロン酸合成酵素の遺伝子の発現促進剤が提供される。
更に本発明によれば、組成物１００ｇ当り、下記式［Ｉ］
【００１２】
【化９】
【００１７】
（式中ＲＯは、炭素数１６〜２２のアルコール残基または脂肪酸残基を示す。Ｍはアルカリ金属原子を表す。）で表されるホスフェート誘導体０．１ｍｇ以上と、塩基性繊維芽細胞成長因子０．００１ｍｇ以上とを含む皮膚外用組成物が提供される。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明で用いられるホスフェート誘導体は、下記式［Ｉ］で表されるリゾホスファチジン酸環状リン酸エステル（以下、ｃＰＡ誘導体と略す。）である。
【００２１】
【化１３】
【００２２】
式中ＲＯは、炭素数１６〜２２のアルコール残基、炭素数１６〜２２の脂肪酸残基を示す。ここで、炭素数１６〜２２のアルコール残基、炭素数１６〜２２の脂肪酸残基としては、いかなる基でもよいが、好ましくは、（１）炭素数１６〜２２の直鎖状の飽和アシル残基、（２）炭素数１６〜２２の分岐鎖状の飽和アシル残基、（３）炭素数１６〜２２の直鎖状で１〜６個の不飽和結合を有する不飽和アシル残基、（４）炭素数１６〜２２の直鎖状の飽和アルキル残基、（５）炭素数１６〜２２の分岐鎖状の飽和アルキル残基、（６）炭素数１６〜２２の直鎖状で１〜６個の不飽和結合を有する不飽和アルキル残基である。前記（１）の炭素数１６〜２２の直鎖状の飽和アシル残基としては、パルミチン酸（C１６：０）、マルガリン酸（C１７：０）、ステアリン酸（C１８：０）、ノナデカン酸（C１９：０）、アラキジン酸（C２０：０）、ヘネイコサン酸（C２１：０）、ベヘニン酸（C２２：０）等に由来する残基が挙げられる。前記（２）の炭素数１６〜２２の分岐鎖状の飽和アシル残基としてはイソバレリアン酸、イソ酸、アンテイソ酸等に由来する残基が挙げられる。前記（３）の炭素数１６〜２２の直鎖状で１〜６個の不飽和結合を有する不飽和アシル残基としては、パルミトレイン酸（C１６：１）、オレイン酸（C１８：１）、エライジン酸（C１８：１）、バクセン酸（C１８：１）、リノール酸（C１８：２）、リノレン酸（C１８：３）、アラキドン酸（C２０：４）、イコサペンタエン酸（C２０：５）、エルカ酸（C２２：１）、ドコサヘキサエン酸（C２２：６）等の不飽和脂肪酸に由来する残基が挙げられる。前記（４）の炭素数１６〜２２の直鎖状の飽和アルキル残基としては、ヘキサデカノール（C１６：０）、ヘプタデカノール（C１７：０）、オクタデカノール（C１８：０）、ノナデカノール（C１９：０）、イコサノール（C２０：０）、ヘネイコサノール（C２１：０）、ドコサノール（C２２：０）等のアルコール類に由来する残基が挙げられる。前記（５）の炭素数１６〜２２の分岐鎖状の飽和アルキル残基としてはイソバレリアノール、イソノール、アンテイソノール等のアルコール類に由来する残基が挙げられる。前記（６）の炭素数１６〜２２の直鎖状で１〜６個の不飽和結合を有する不飽和アルキル残基としては、ヘキサデセノール（C１６：１）、オクタデセノール（C１８：１）、イコセノール（C２０：１）、ドコセノール（C２０：１）、リノール（C１８：２）、リノレノール（C１８：３）、エイコセノール（C２０：４）、イコサペンタエノール（C２０：５）、エルカノール（C２２：１）、ドコサヘキサノール（C２２：６）等に由来する残基が挙げられる。これらのうち、炭素数１６〜２２の炭化水素基としては、ホスフェート誘導体としての取扱いのしやすさ、および活性の強さなどの点からパルミチン酸（C１６：０）、ミリストレイン酸（C１４：１）、パルミトレイン酸（C１６：１）、オレイン酸（C１８：１）、エライジン酸（C１８：１）、リノール酸（C１８：２）、リノレン酸（C１８：３）、アラキドン酸（C２０：４）、イコサペンタエン酸（C２０：５）、ドコサヘキサエン酸（C２２：６）に由来する残基が最も好ましい。
【００２３】
式中Ｍは、アルカリ金属原子を表す。前記アルカリ金属原子としてはナトリウム、カリウム等が挙げられる。
【００２４】
前記式［Ｉ］で表されるホスフェート誘導体は、リゾホスファチジン酸環状リン酸エステルとして総称される化合物である。本発明に用いる前記式［Ｉ］で表されるリゾホスファチジン酸環状リン酸エステルは、通常、１−アシル−グリセロ−２，３−ホスフェート誘導体または１−Ｏ−アルキル−グリセロ−２，３−ホスフェート誘導体とも呼ばれる物質である。
【００２５】
本発明で使用する前記式［Ｉ］で表されるホスフェート誘導体としては、いかなる手段によって入手されてもよいが、例えば、１−アシル−グリセロ−２，３−ホスフェート誘導体は市販のものであってよく、あるいは市販のホスファチジルコリンやフォスファチジン酸などのリン脂質を酵素処理して入手することもできる。また、１−アシル−グリセロ−２，３−ホスフェート誘導体は種々の生物資源を原料とし、抽出などの処理により得ることができる。また、１−アシル−グリセロ−２，３−ホスフェート誘導体を、ジシクロヘキシルカルボジイミド存在下に脂肪酸と２，３−イソプロピリデン−ｓｎ−グリセロールから化学合成して得る方法が、特開平６−２２８１６９号公報、特開平７−２５８２７号公報、特開平９−２５２３５号公報に示されており、それらの方法で合成して得ることもできる。
また、１−Ｏ−アルキル−グリセロ−２，３−ホスフェート誘導体は市販のものであってもよく、あるいは合成あるいは生体より抽出した血小板活性化因子、プラスマローゲンあるいはその他の１−Ｏ−アルキルリゾリン脂質をホスホリパーゼＤやホスホリパーゼＡ２で酵素処理して得ることもできる。あるいは１−Ｏ−アルキル−２，３−ホスフェート誘導体は市販の１−Ｏ−アルキル−グリセロールをピリジン溶媒中でオキシ塩化リンと化学反応させて得る方法が、ＵＳ００５２３８９６５Ａに示されており、それらの方法で合成して得ることもできる。
【００２６】
本発明で使用する前記式［Ｉ］で表されるホスフェート誘導体は、これを有効成分とすることにより、動物細胞培養用のヒアルロン酸産生能増強剤として使用することができる。また、本発明で使用する前記式［Ｉ］で表されるホスフェート誘導体は、これを有効成分とすることにより、動物細胞培養用のヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進剤としても使用することができる。即ち、前記式［Ｉ］で表されるホスフェート誘導体は、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進剤として働くことにより、動物細胞のヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現を促進してヒアルロン酸産生を増強することができるものである。
【００２７】
本発明のヒアルロン酸産生能増強剤、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進剤は、培養動物細胞に適用されるが、この対象となる培養動物細胞としては、いかなる培養動物細胞であってよく、好ましくはヒト、牛、馬、豚、綿羊、山羊、犬、猫、猿、モルモット、鼠、ウサギ、鶏などの動物細胞が挙げられる。ヒアルロン酸産生能増強剤、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進剤は、それぞれの効果が十分発揮される程度の濃度で培養動物細胞に適用することにより、ヒアルロン酸産生増強剤、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進剤として作用するものである。本発明の化合物の使用量は、化合物の種類および細胞培養条件や培養動物細胞の組織など条件により最適量が異なるので限定できないが、例えば、培養液１００ｍｌ当り１０μｇ以上が好ましく、さらに好ましくは０．１ｍｇ〜０．５ｍｇ含有させるとよい。
【００２８】
本発明のヒアルロン酸産生能増強剤、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進剤は、前記式［Ｉ］で表されるホスフェート誘導体を、単独で使用してもよいし、また２種類以上を配合しても使用してもよい。
【００２９】
前記ｃＰＡは、細胞成長因子およびその他の成分とあわせて、動物細胞におけるヒアルロン酸産生の促進に十分な濃度で含有されることにより、皮膚外用組成物、皮膚萎縮改善用組成物、または皮膚の瘢痕形成防止用組成物とすることができる。前記ｃＰＡを皮膚外用組成物、皮膚萎縮改善用組成物、または皮膚の瘢痕形成防止用組成物に配合して含有させる場合、皮膚外用組成物、皮膚萎縮改善用組成物、または皮膚の瘢痕形成防止用組成物１００ｇ当り、ｃＰＡを０．１ｍｇ以上好ましくは１ｍｇ〜１０ｇ含有させるとよい。組成物中、ｃＰＡの含有率が０．１ｍｇ未満ではヒアルロン酸産生増強の目的を十分には発揮しえず、１０ｇを大幅に越える含有率においては使用量に見合う著しい効果が期待できない。また、細胞成長因子の配合量は適宜選択されてよいが、製剤１００ｇ当り、０．００１ｍｇ以上含有させるのが好ましく、さらに好ましくは０．０１ｍｇ〜５ｇ含有させるとよい。
【００３０】
本発明に用いられる細胞成長因子は、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）である。他の基礎生物学領域や臨床医学領域で細胞成長因子としては、例えば、上皮成長因子、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、インシュリン様成長因子、ＶＥＧＦ、トランスフォーミング成長因子、肝細胞成長因子、神経成長因子等の成長因子類が挙げられる。本発明の皮膚外用組成物、皮膚萎縮改善用組成物、または皮膚の瘢痕形成防止用組成物は、細胞成長因子を添加するのに加え、本発明の効果を損なわない範囲において、当該分野で既知の他の成分を併用してもよい。本発明の皮膚外用組成物、皮膚萎縮改善用組成物、または皮膚の瘢痕形成防止用組成物は、水溶液、油液、その他の溶液、乳液、クリーム、ゲル、懸濁液、マイクロカプセル、粉末、顆粒、固形などの形態をとることができる。また、皮膚外用組成物、皮膚萎縮改善用組成物、または皮膚の瘢痕形成防止用組成物は、前記形態にそれ自体既知の方法で調製した上で、ローション製剤、乳液剤、クリーム剤、軟膏剤、硬膏剤、ハップ剤、エアゾール剤等として、身体に塗布、貼付、噴霧することができる。これらの製剤形の中でもローション製剤、乳液剤、クリーム剤、軟膏剤、硬膏剤、ハップ剤、エアロゾール剤、固形物等の形態が、本発明の皮膚外用組成物、皮膚萎縮改善用組成物、または皮膚の瘢痕形成防止用組成物に適する製剤形である。本発明の皮膚外用組成物、皮膚萎縮改善用組成物、または皮膚の瘢痕形成防止用組成物は、医薬品、医薬部外品、化粧料として使用できる。
【００３１】
本発明の皮膚外用組成物、皮膚萎縮改善用組成物、または皮膚の瘢痕形成防止用組成物には、それらを調製する際に常用されている賦形剤、香料等をはじめ、油脂類、界面活性剤、防腐剤、金属イオン封鎖剤、水溶性高分子、増粘剤、粉末成分、紫外線防御剤、保湿剤、薬効成分、酸化防止剤、ｐＨ調整剤、洗浄剤、乾燥剤、乳化剤等を適宜配合できる。
【００３２】
本発明の効果を損なわない範囲内で、前記組成物に油脂類を配合してもよい。前記油脂類としては、液体油脂、固体油脂、ロウ類、炭化水素油、リン脂質、スフィンゴ脂質、高級脂肪酸、高級アルコール、合成エステル油、シリコーン類がある。具体的には、液体油脂として、例えば、アボガド油、ツバキ油、月見草油、タートル油、マカデミアナッツ油、トウモロコシ油、ミンク油、オリーブ油、ナタネ油、卵黄油、ゴマ油、パーシック油、小麦胚芽油、サザンカ油、ヒマシ油、アマニ油、サフラワー油、綿実油、エノ油、大豆油、落花生油、茶実油、カヤ油、コメヌカ油、シナギリ油、日本キリ油、ホホバ油、胚芽油、トリグリセリン、トリオクタン酸グリセリン、トリイソパルミチン酸グリセリン等が挙げられる。固体油脂としては、例えば、カカオ脂、ヤシ油、馬脂、硬化ヤシ油、パーム油、牛脂、羊脂、硬化牛脂、パーム核油、豚脂、牛骨脂、モクロウ核油、硬化油、牛脚脂、モクロウ、硬化ヒマシ油等が挙げられる。ロウ類としては、例えば、ミツロウ、キャンデリラロウ、綿ロウ、カルナウバロウ、ペイベリーロウ、イボタロウ、鯨ロウ、モンタンロウ、ヌカロウ、ラノリン、カポックロウ、酢酸ラノリン、液状ラノリン、サトウキビロウ、ラノリン脂肪酸イソプロピル、ラウリン酸へキシル、還元ラノリン、ジョジョバロウ、硬質ラノリン、セラックロウ、ＰＯＥ（以下、ポリオキシエチレンを同様に略す。）ラノリンアルコールエーテル、ＰＯＥラノリンアコールアセテート、ＰＯＥコレステロールエーテル、ラノリン脂肪酸ポリエチレングリコール、ＰＯＥ水素添加ラノリンアルコールエーテル等が挙げられる。炭化水素油としては、例えば、流動パラフィン、オゾケライト、スクワレン、プウスタン、パラフィン、セレシン、スクワレン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックス等の油分が挙げられる。リン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、フォスファチジン酸やこれらを酵素処理したもの等が挙げられる。スフィンゴ（糖）脂質としてはスフィンゴシン、セラミド、スフィンゴミエリン、セレブロシド等が挙げられる。
【００３３】
高級脂肪酸としては、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、べへン(べヘニン)酸、オレイン酸、１２−ヒドロキシステアリン酸、ウンデシレン酸、トール酸、イソステアリン酸、リノール酸、リノレイン酸、イコサペンタエン酸（ＩＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）が挙げられ、さらに置換基を有する高級脂肪酸としては、α−ヒドロキシ酸（例えば、２−ハイドロキシデカン酸、２−ハイドロキシドデカン酸、２−ハイドロキシテトラデカン酸、２−ハイドロキシヘキサデカン酸、２−ハイドロキシオクタデカン酸、２−ハイドロキシイコ酸）、分岐鎖α−ヒドロキシ酸（例えば、メチル２−ハイドロキシデカン酸、メチル２−ハイドロキシドデカン酸、メチル２−ハイドロキシテトラデカン酸、メチル２−ハイドロキシヘキサデカン酸、メチル２−ハイドロキシオクタデカン酸、メチル２−ハイドロキシイコ酸）等が挙げられる。
高級アルコールとしては、例えば、ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、ベヘニルアルコール、ミリスチルアルコール、オレィルアルコール、セトステアリルアルコール等の直鎖アルコール；モノステアリルグリセリンエーテル(バチルアルコール)、２−デシルテトラデシノール、ラノリンアルコール、コレステロール、フイトステロール、ヘキシルドデカノール、イソステアリルアルコール、オクチルドデカノール等の分岐鎖アルコール等が挙げられる。
【００３４】
合成エステル油としては、例えば、ミリスチン酸イソプロピル、オクタン酸セチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸プチル、ラウリン酸へキシル、ミリスチン酸ミリスチル、オレイン酸デシル、ジメチルオクタン酸ヘキシルデシル、乳酸セチル、乳酸ミリスチル、酢酸ラノリン、ステアリン酸イソセチル、イソステアリン酸イソセチル、１，２−ヒドロキシステアリル酸コレステリル、ジ−２−エチルヘキシル酸エチレングリコール、ジペンタエリスリトール脂肪酸エステル、モノイソステアリン酸Ｎ−アルキルグリコール、ジカプリン酸ネオペンチルグリコール、リンゴ酸ジイソステアリル、ジ−２−ヘプチルウンデカン酸グリセリン、トリ−２−エチルヘキシル酸トリメチロールプロパン、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン、テトラ−２−エチルヘキシル酸ペンタンエリスリトール、トリ−２−エチルヘキシル酸グリセリン、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン、セチル２−エチルヘキサノエート、２−エチルヘキシルパルミテート、トリミリスチン酸グリセリン、トリ−２−ヘプチルウンデカン酸グリセライド、ヒマシ油脂肪酸メチルエステル、オレイン酸オイル、セトステアリルアルコール、アセトグリセライド、パルミチン酸２−ヘプチルウンデシル、アジピン酸ジイソプチル、Ｎ−ラウロイル−Ｌ−グルタミン酸−２−オクチルドデシルエステル、アジピン酸ジ−２−ヘプチルウンデシル、エチルラウレート、セバチン酸ジ−２−エチルヘキシル、ミリスチン酸２−へキシルデシル、パルミチン酸−２−ヘキシルデシル、アジピン酸−２−ヘキシルデシル、セバチン酸ジイソプロピル、コハク酸−２−エチルヘキシル、酢酸エチル、酢酸プチル、酢酸アミル、クエン酸トリエチル等が挙げられる。
シリコーン類としては、例えば、ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、メチルハイドロジエンポリシロキサン等の鎖状ポリシロキサン；デカメチルポリシロキサン、テトラメチルポリシロキサン、テトラメチルテトラハイドロジェンポリシロキサンなどの環状ポリシロキサン、３次元網目構造を形成しているシリコーン樹脂、シリコーンゴム等が挙げられる。
【００３５】
本発明で使用する前記式［Ｉ］で表される化合物は、それら自体界面活性を示すが、組成物によって他のアニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤を併用してもよい。
アニオン界面活性剤としては、例えば、ラウリン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム、ミリスチン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、さらに混合脂肪酸等の塩（やし脂肪酸セッケン、牛脂脂肪酸セッケン）あるいは前記脂肪酸のカリウム塩；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸等の高級アルキル硫酸エステル塩；ＰＯＥラウリル硫酸トリエタノールアミン、ＰＯＥラウリル硫酸ナトリウム等のアルキルエーテル硫酸エステル塩；ラウロイルサルコシンナトリウム等のＮ−アシルサルコシン酸、Ｎ−ミリストイル−Ｎ−メチルタウリンナトリウム、ヤシ油脂肪酸メチルタウリッドナトリウム、ラウリルメチルタウリッドナトリウム等の高級脂肪酸アミドスルホン酸塩；ＰＯＥオレイルエーテルリン酸ナトリウム、ＰＯＥステアリルエーテルリン酸等のリン酸エステル塩；ジ−２−エチルヘキシルスルホコハク酸ナトリウム、モノラウロイルモノエタノールアミドポリオキシエチレンスルホコハク酸ナトリウム、ラウリルポリプロピレングリコールスルホコハク酸ナトリウム等のスルホコハク酸塩；リニアドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、リニアドデシルベンゼンスルホン酸トリエタノールアミン、リニアドデシルベンゼンスルホン酸等のアルキルベンゼンスルホン酸塩；Ｎ−ラウロイルグルタミン酸モノナトリウム、Ｎ−ステアロイルグルタミン酸ジナトリウム、Ｎ−ミリストイル−Ｌ−グルタミン酸モノナトリウム等のＮ−アシルグルタミン酸塩；硬化ヤシ油脂肪酸グリセリン硫酸ナトリウム等の高級脂肪酸エステル硫酸エステル塩、ロート油等の硫酸化油；ＰＯＥアルキルエーテルカルボン酸、ＰＯＥアルキルアリルエーテルカルボン酸塩、α−オレフインスルホン酸塩、高級脂肪酸エステルスルホン酸塩、二級アルコール硫酸エステル塩、高級脂肪酸アルキロールアミド硫酸エステル塩、ラウロイルモノエタノールアミドコハク酸ナトリウム、Ｎ−パルミトイルアスパラギン酸ジトリエタノールアミン、カゼインナトリウム等が挙げられる。
【００３６】
カチオン界面活性剤としては、例えば、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ラウリルトリメチルアンモニウム等のアルキルトリメチルアンモニウム塩、塩化ジステアリルジメチルアンモニウムジアルキルジメチルアンモニウム塩、塩化ポリ（Ｎ，Ｎ’−ジメチル−３，５−メチレンピペリジニウム）、塩化セチルピリジニウム等のアルキルピリジニウム塩；アルキル四級アンモニウム塩、アルキルジメチルベンジルアンモニウム塩、アルキルイソキノリニウム塩、ジアルキルモリホニウム塩、ＰＯＥアルキルアミン、アルキルアミン塩、ポリアミン脂肪酸誘導体、アミルアルコール脂肪酸誘導体、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム等が挙げられる。
両性界面活性剤としては、例えば、２−ウンデシル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−(ヒドロキシエチルカルボキシメチル)−２−イミダゾリンナトリウム、２−ココイル−２−イミタゾリニウムヒドロキサイド−１−カルボキシエチロキシ−２−ナトリウム塩等のイミダゾリン系両性界面活性剤；２−へプタデシル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン、アルキルベタイン、アミドベタイン、スルホベタイン等のベタイン系界面活性剤等が挙げられる。
【００３７】
親油性非イオン界面活性剤としては、例えば、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノイソステアレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンセスキオレエート、ソルビタントリオレエート、ペンタ−２−エチルヘキシル酸ジグリセロールソルビタン、テトラ−２−エチルへキシル酸ジグリセロールソルビタン等のソルビタン脂肪酸エステル類；モノ綿実油脂肪酸グリセリン、モノエルカ酸グリセリン、セスキオレイン酸グリセリン、モノステアリン酸グリセリン、α，α’−オレイン酸ピログルタミン酸グリセリン、モノステアリン酸グリセリン、リンゴ酸等のグリセリンポリグリセリン脂肪酸類；モノステアリン酸プロピレングリコール等のプロピレングリコール脂肪酸エステル類；硬化ヒマシ油誘導体、グリセリンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン−メチルポリシロキサン共重合体等が挙げられる。
親水性非イオン界面活性剤としては、例えば、ＰＯＥ−ソルビタンモノオレエート、ＰＯＥ−ソルビタンモノステアレート、ＰＯＥ−ソルビタンモノオレエート、ＰＯＥ−ソルビタンテトラオレエート等のＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル類；ＰＯＥ−ソルビットモノラウレート、ＰＯＥ−ソルビットモノオレエート、ＰＯＥ−ソルビットペンタオレエート、ＰＯＥ−ソルビットモノステアレート等のＰＯＥソルビット脂肪酸エステル類；ＰＯＥ−グリセリンモノステアレート、ＰＯＥ−グリセリンモノイソステアレート、ＰＯＥ−グリセリントリイソステアレート等のＰＯＥグリセリン脂肪酸エステル類；ＰＯＥモノオレエート、ＰＯＥジステアレート、ＰＯＥモノジオレエート、システアリン酸エチレングリコール等のＰＯＥ脂肪酸エステル類；ＰＯＥラウリルエーテル、ＰＯＥオレイルエーテル、ＰＯＥステアリルエーテル、ＰＯＥベへニルエステル、ＰＯＥ−オクチルドデシルエーテル、ＰＯＥコレスタノールエーテル等のＰＯＥアルキルエーテル類；ＰＯＥオクチルフェニルエーテル、ＰＯＥノニルフェニルエーテル、ＰＯＥジノニルフェニルエーテル等のＰＯＥアルキルフェニルエーテル類；プルロニツク等のプルアロニツク型類、ＰＯＥ− ＰＯＰ（ポリオキシプロピレンの略、以下同じ。）セチルエーテル、ＰＯＥ−ＰＯＰ２−デシルテトラデシルエーテル、ＰＯＥ−ＰＯＰモノブチルエーテル、ＰＯＥ−ＰＯＰ水添ラノリン、ＰＯＥ−ＰＯＰグリセリンエーテル等のＰＯＥ−ＰＯＰアルキルエーテル類；テトロニツク等のテトラＰＯＥ−テトラＰＯＰエチレンジアミン縮合物類；ＰＯＥヒマシ油、ＰＯＥ硬化ヒマシ油、ＰＯＥ硬化ヒマシ油モノイソステアレート、ＰＯＥ硬化ヒマシ油トリイソステアレート、ＰＯＥ硬化ヒマシ油モノピログルタミン酸モノイソステアリン酸ジエステル、ＰＯＥ硬化ヒマシ油マレイン酸等のＰＯＥヒマシ油硬化ヒマシ油誘導体；ＰＯＥソルビットミツロウ等のＰＯＥミツロウ−ラノリン誘導体、ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド、ラウリン酸モノエタノールアミド、脂肪酸イソプロパノールアミド等のアルカノールアミド；ＰＯＥプロピレングリコール脂肪酸エステル、ＰＯＥアルキルアミン、ＰＯＥ脂肪酸アミド、ショ糖脂肪酸エステル、ＰＯＥノニルフェニルホルムアルデヒド縮合物、アルキルエトキシジメチルアミンオキシド、トリオレイルリン酸等が挙げられる。
【００３８】
前記防腐剤としては、メチルパラベン、エチルパラベン、ブチルパラベン等が挙げられる。
前記金属イオン封鎖剤としては、エデト酸ナトリウム塩等が挙げられる。
前記水溶性高分子としては、天然の高分子、半合成の高分子、合成の高分子、無機の高分子が挙げられる。
天然の水溶性高分子としては、アラビアガム、トラガカントガム、ガラクタン、グアガム、キヤロブガム、カラヤガム、カラギーナン、タマリンドガム、キサンタンガム、ペクチン、カンテン、クインスシード（マルメロ）、アルゲコロイド（カッソウエキス）、デンプン（コメ、トウモロコシ、バレイショ、コムギ）、グリチルリチン酸等の植物系高分子、キサンタンガム、デキストラン、サクシノグルカン、プルラン、コレステリルプルラン等の微生物系高分子および誘導体；コラーゲン、カゼイン、アルブミン、ゼラチン等の動物系高分子等が挙げられる。 半合成の水溶性高分子としては、デキストリン、カルボキシメチルデンプン、メチルヒドロキシプロピルデンプン等のデンプン系高分子；メチルセルロース、ニトロセルロース、エチルセルロース、メチルヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、硫酸セルロースジメチルジアルキル（１２〜２０）アンモニウム、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）、結晶セルロース、セルロース未等のセルロース系高分子；アルギン酸ナトリウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル等のアルギン酸系高分子等が挙げられる。
【００３９】
合成水溶性高分子としては、ポリビニルアルコール、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルキル変性カルボキシビニルポリマー等のビニル系高分子；ポリエチレングリコール２０００、ポリエチレングリコール４０００、ポリエチレングリコール６０００等のポリオキシエチレン系高分子；ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体系高分子；ポリアクリル酸ナトリウム、ポリエチレンアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）等の（メタ）アクリル系高分子；ポリエチレンイミン、カチオンポリマー等が挙げられる。
【００４０】
無機の水溶性高分子としては、べントナイト、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、ラボナイト、ヘクトライト、無水ケイ酸等が挙げられる。
前記粉末成分としては、タルク、カオリン、雲母、絹雲母（セリサイト）、白雲母、金雲母、合成雲母、紅雲母、黒雲母、リチア雲母、バーミキュライト、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、ケイ酸アルミニウム、ケイ酸バリウム、ケイ酸カルシウム、ケイ酸マグネシウム、ケイ酸ストロンチウム、タングステン酸金属塩、マグネシウム、シリカ、ゼオライト、硫酸バリウム、焼成硫酸カルシウム（焼セッコウ）、リン酸カルシウム、弗素アパタイト、ヒドロキシアパタイト、セラミックパウダー、窒化ホウ素等の無機粉末；金属石鹸（ミリスチン酸亜鉛、パルミチン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム）、ポリアミド樹脂粉末（ナイロン粉末）、ポリエチレン粉末、ポリメタクリル酸メチル粉末、ポリスチレン粉末、スチレンとアクリル酸の共重合体樹脂粉末、ベンゾグアナミン樹脂粉末、ポリ四弗化エチレン粉末、セルロース粉末等の有機粉末；二酸化チタン、酸化亜鉛等の無機白色顔料、酸化鉄（ベンガラ）、チタン酸鉄等の無機赤色系顔料、γ−酸化鉄等の無機褐色系顔料、黄酸化鉄、黄土等の無機黄色系顔料、黒酸化鉄、カーボンブラック、低次酸化チタン等の無機黒色系顔料、マンゴバイオレット、コバルトバイオレット等の無機紫色系顔料、酸化クロム、水酸化クロム、チタン酸コバルト等の無機緑色系顔料、群青、紺青等の無機青色系顔料、酸化チタンコーテッドマイカ、酸化チタンコーテッドオキシ塩化ビスマス、酸化チタンコーテッドタルク、着色酸化チタンコーテッドマイカ、オキシ塩化ビスマス、魚鱗箔等のパール顔料、アルミニウムパウダー、カッパーパウダー等の金属粉末顔料、赤色２０１号、赤色２０２号、赤色２０４号、赤色２０５号、赤色２２０号、赤色２２６号、赤色２２８号、赤色４０５号、橙色２０３号、橙色２０４号、黄色２０５号、黄色４０１号、青色４０４号、赤色３号、赤色１０４号、赤色１０６号、赤色２２７号、赤色２３０号、赤色４０１号、赤色５０５号、橙色２０５号、黄色４号、黄色５号、黄色２０２号、黄色２０３号、緑色３号、青色１号などのジルコニウム、バリウムまたはアルミニウムレーキ等の有機顔料、クロロフィル、β−カロチン等の天然色素等、チタンイエロー、カーサミン、紅花赤等の色剤等が挙げられる。
【００４１】
前記紫外線防御剤としては、化学的に紫外線を吸収する物質である「紫外線吸収剤」と、物理的作用によって紫外線を散乱および反射させる物質である「紫外線遮断剤」の両者を含む。
前記紫外線吸収剤の長波長紫外線（ＵＶＡ）吸収剤としては、具体的には例えば、メチルアントラニレート、ホモメンチル−Ｎ−アセチルアントラニレニト等のアントラニル酸系紫外線吸収剤；２，４−ジヒドロキシベンゾフェノン、２，２−ジヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン、２，２’−ジヒドロキシ−４，４’−ジメトキシベンゾフェノン、２，２’，４，４’−テトラヒドロキシベンゾフェノン、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン、２−ヒドロキシ−４−メトキシ−４’−メチルベンゾフェノン、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン−５−スルホン塩酸、４−フェニルベンゾフェノン、２−エチルへキシル−４’−フェニル−ベンゾフェノン−２−カルボキシレート、２−ヒドロキシ−４−ａ−オクトキシベンゾフェノン、４−ヒドロキシ−３−カルボキシベンゾフェノン等のベンゾフェノン系紫外線吸収剤；２，２’−ヒドロキシ−５−メチルフェニルベンゾトリアゾール、２− (２’−ヒドロキシ−５’−ｔｅｒｔ−オクチルフェニル) ベンゾトリアゾール、２ (２’−ヒドロキシ−５’−メチルフェニル) ベンゾトリアゾール等のベンゾトリアゾール系紫外線吸収剤；ジアニソイルメタン、４−メトキシ−４’−ｔｅｒｔ−ブチルジベンゾイルメタン等が挙げられる。
これらの長波長紫外線吸収剤の中でも、４−メトキシ−４’−ｔｅｒｔ−ブチルジベンゾイルメタン、２−ヒドロキシ−４’メトキシベンゾフェノン、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン誘導体、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン−５−スルホン酸塩が安全性および有効性に優れた長波長紫外線吸収剤であり、好ましいものとして挙げられる。
【００４２】
またさらに、前記紫外線吸収剤の中波長紫外線(ＵＶＢ)吸収剤としては、パラアミノ安息香酸(以下、ＰＡＢＡという。)、ＰＡＢＡモノグリセリンエステル、Ｎ，Ｎ−ジプロポキシＰＡＢＡエチルエステル、Ｎ，Ｎ−ジエトキシＰＡＢＡエチルエステル、 Ｎ，Ｎ−ジメチルＰＡＢＡエチルエステル、Ｎ，Ｎ−ジメチルＰＡＢＡブチルエステル、Ｎ，Ｎ−ジメチルＰＡＢＡアミルエステル等の安息香酸系紫外線吸収剤；ジプロピレングリコールサリシレート、エチレングリコールサリシレート、ミリスチルサリシレート、メチルサリシレート、アミルサリシレート、メンチルサリシレート、ホモメンチルサリシレート、オクチルサリシレート、フェニルサリシレート、ベンジルサリシレート、ｐ−イソプロパノールフェニルサリシレート等のサリチル酸系紫外線吸収剤；オクチルシンナメート、エチル−４−イソプロピルシンナメート、メチル−２， ５−ジイソプロピルシンナメート、エチル−２，４−ジイソプロピルシンナメート、メチル−２，４−ジイソプロピルシンナメート、プロピル−ｐ−メトキシシンナメート、イソプロピル−ｐ−メトキシシンナメート、イソアミル−ｐ−メトキシシンナメート、オクチル−ｐ−メトキシシンナメート（２−エチルヘキシル−ｐ−メトキシシンナメート）、２−エトキシエチル−ｐ−メトキシシンナメート、シクロヘキシル−ｐ−メトキシシンナメート、エチル−α−シアノ−β−フェニルシンナメート、２−エチルヘキシル−α−シアノ−β−フェニルシンナメート、グリセリルモノ−２−エチルヘキサノイルージパラメトキシシンナメート、メトキシケイ皮酸オクチル、３，４，５−トリメトキシケイ皮酸−３−メチル−４−［メチルビス（トリメチルシロキシ）シリル］ブチル、ｐ−ジメトキシケイ皮酸モノエチルエステル等のケイ皮酸系紫外線吸収剤；３−（４’−メチルベンジリデン）−ａ，１−カンフアー、３−ベンジリデン−ｄｌ−カンフアー、５− (３，３−ジメチル−２−ノルボルニリデン) −３−ペンチン−２−オン等のカンフアー誘導体、ウロカニン酸、ウロカニン酸エチルエステル、２−フェニル−メチルベンゾオキサゾール、ジベンザラジン等を挙げることができる。
【００４３】
さらに、紫外線遮断剤としては、例えば、酸化チタン（ＴｉＯ2）、タルク（ＭｇＳｉＯ2）、カルミン（ＦｅＯ2）、ベントナイト、カオリン、酸化亜鉛（ＺｎＯ）等を挙げることができる。
前記保湿剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、１，３−ブチレングリコール、へキシレングリコール、キシリトール、ソルビトール、マルチトール、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ムコイチン硫酸、カロニン酸、アテロコラーゲン、コレスチリル−１２−ヒドロキシステアレート、乳酸ナトリウム、胆汁酸塩、ｄｌ−ピロリドンカルボン酸塩、短鎖可溶性コラーゲン、ラミニン、ジグリセリン（ＥＯ）ＰＯ付加物、イザヨイバラ抽出物、セイヨウノコギリソウ抽出物、メリロート抽出物等を挙げることができる。
【００４４】
前記薬効成分としては、アルブチン、ビタミンＣおよびその誘導体、コウジ酸、胎盤抽出物、グルタチオン、ユキノシタ抽出物等の美白剤；グリチルリチン酸誘導体、グリチルレチン酸誘導体、サリチル酸誘導体、ヒノキチオール、酸化亜鉛、アラントイン等の消炎剤；ローヤルゼリー、感光素、コレステロール誘導体、幼牛血液抽出物、牛脳抽出物、胎盤抽出物等の賦活剤；ノニル酸ワレニルアミド、ニコチン酸ベンジルエステル、ニコチン酸β−ブトキシエチルエステル、カプサイシン、ジンゲロン、カンタリスチンキ、イクタモール、カフェイン、タンニン酸、α−ボルネオール、ニコチン酸トコフェロール、イノシトールへキサニコチネート、シクランデレート、シンナリジン、トラゾリン、アセチルコリン、ベラパミル、セファランチン、γ−オリザノール等の血行促進剤；硫黄、チアントール等の抗脂漏剤；多様な目的から、アケビ抽出物、キッピ抽出物、ブナ抽出物、あんず抽出物、れんげ草抽出物、コンフリー抽出物、タイム抽出物、ラベンダー抽出物、マジョラム抽出物、テンチャ抽出物、バラ抽出物、オオバク抽出物、オウレン抽出物、シソ抽出物、サルビア抽出物、エンメイ草抽出物、オウゴン抽出物、シコン抽出物、シヤクヤク抽出物、センブリ抽出物、バーチ抽出物、セージ抽出物、ビワ抽出物、ニンジン抽出物、アロエ抽出物、ゼニアオイ抽出物、アイリス抽出物、ブドウ抽出物、ヨクイニン抽出物、ヘチマ抽出物、ユリ抽出物、サフラン抽出物、センキュウ抽出物、ショウキョウ抽出物、オトギリソウ抽出物、オノニス抽出物、ローズマリー抽出物、ニンニク抽出物、トウガラシ抽出物、木通抽出物、桑抽出物などの植物抽出物；アオサ抽出物、オゴノリ抽出物、テングサ抽出物、コンブ抽出物、ホンダワラ抽出物、ヒバマタ抽出物、アオサイン抽出物などの海草抽出物；アガリスク抽出物、ケロウジ抽出物、マンネンタケ抽出物、イボタケ抽出物、タモギタケ抽出物、ハラタケ抽出物などのきのこ類抽出物；チンピ、トウキ等；レチノール、酢酸レチノール等のビタミンＡ類；リボフラビン、酪酸リボフラビン、フラビンアデニンヌクレオチド等のビタミンＢ2類；ピリドキシン塩酸塩、ピリドキシンジオクタノエート等のビタミンＢ6類；Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸ジパルミチン酸エステル、Ｌ−アスコルビン酸−２−硫酸ナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステル、ＤＬ−α−トコフェロ−ル−Ｌ−アスコルビン酸リン酸ジエステルジカリウム等のビタミンＣ類；パントテン酸カルシウム、Ｄ−パントテニルアルコール、パントテニルエチルエーテル、アセチルパントテニルエチルエーテル等のパントテン酸類；エルゴカルシフェロール、コレカルシフェロール等のビタミンＤ類；ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ニコチン酸ベンジル等のニコチン酸類、α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、ニコチン酸ＤＬ−α−トコフェロール、コハク酸ＤＬ−α−トコフェロール等のビタミンＥ類；ビタミンＰ、ビオチン等のビタミン類；デヒドロエピアンドロステロンやデヒドロエピアンドロステロン硫酸などのステロイド類；プロスタグランジンＦ2α、プロスタグランジンＥ1、ロイコトリエンＢ4などプロスタノイド類；エストロジェン、デヒドロ（エピ）アンドロステロン等のホルモン類を挙げることができる。
【００４５】
なお、その薬剤成分に関しては、本発明の効果が損なわれない範囲において、広く配合することができる。
本発明の皮膚外用組成物、皮膚萎縮改善用組成物、または皮膚の瘢痕形成防止用組成物の製造方法は、通常の方法により前記のような成分を適宜配合する。
【００４６】
次に皮膚外用剤の製造方法の一例を記載する。
＜皮膚外用剤の製造方法＞
白色ワセリン（２５０ｇ）、ステアリルアルコール（２００ｇ）、プロピレングリコール（１３０ｇ）、パラオキシ安息香酸エチル（０．２３ｇ）、パラオキシ安息香酸プロピル（０．１２ｇ）等の油性成分を秤取り、加熱溶解した。一方、ラウリン酸ナトリウム（１８ｇ）、リゾホスファチジン酸環状エステル（２ｇ）精製水（残分：全量１０００ｇから他の成分を除いた残分）とを配合して、水性成分として、これに前記の油性成分を徐々に加温下に加えて均一とした。その後冷却して前記の組成の軟膏を得る。
このようにして得られた本発明の皮膚外用組成物、皮膚萎縮改善用組成物、または皮膚の瘢痕形成防止用組成物は、動物細胞におけるヒアルロン酸の産生を促進し、他の増殖因子に対する反応性を亢進するなど、動物細胞の賦活化を促進する作用を有する。
【００４７】
次にそれぞれの用法について記載する。
＜皮膚外用剤の用法＞
本発明の皮膚外用組成物の用量は、有効成分の種類や組成、性状、用法、患者の年齢、性別やその他の条件、意図する疾患の種類や程度などにより必ずしも限定されないが、通常、皮膚外用剤として使用する場合、製剤１００ｇ当り、ｃＰＡを１ｍｇ以上配合することが好ましく、１０ｍｇ〜５０ｇに調節することがさらに好ましい。患部に直接または間接的に塗布、スプレーすることによりｃＰＡ量として１ｃｍ2および1日当り０．１μｇ〜１０ｍｇ、好ましくは１μｇ〜１ｍｇであり、この量を１日１回または２回〜４回使用することが好ましい。
【００４８】
【発明の効果】
本発明のヒアルロン酸産生能増強剤、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進剤は、単独で動物細胞を賦活化し、炎症に関与するヒアルロン酸合成酵素１ではなくヒアルロン酸合成酵素２の発現が顕著に亢進し、ヒアルロン酸の産生が顕著に増強される。さらにｃＰＡと線維芽細胞成長因子の共存で相乗的な効果が得られる。また、本願発明によればヒアルロン酸産生の増強はステロイドによるヒアルロン酸産生の抑制を部分的に回復させることから、ステロイドの反復使用による皮膚の萎縮を改善することができる。本発明によれば、ヒアルロン酸含量の低下を回復させ、創傷治癒後の瘢痕形成するような病態を改善することができる。
【００４９】
【実施例】
以下、具体例に基づいて、本発明をさらに詳細に説明する。
次に用いた試料および測定方法を示す。
合成例１；１６：１−ｃＰＡの合成
アルゴン雰囲気下にトリアゾール（０．２ｇ、３ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（８ｍｌ）に溶解させ、０℃でオキシ塩化リン（０．１ｍｌ、１．１ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．７１ｍｌ、５．１ｍｍｏｌ）を加え、さらに５分間攪拌し、ホスホリルトリストリアゾリドを調製した。さらに１−Ｏ−ヘキサデカノイルグリセロール（０．３ｇ、０．９ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（５．５ｍｌ）を加え、室温下に２０分間攪拌した後、反応液を氷冷した２％塩酸（５０ｍｌ）に注ぎ、エーテルで抽出した。エーテル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。別途、水素化ナトリウム（６０％鉱油、０．０７ｇ、０．９ｍｍｏｌ）をペンタンで洗浄して鉱油を除き、エーテルに懸濁したものを上記エーテル溶液に加えた。蒸留水（８ｍｌ）で１−ヘキサデカノイルグリセロール−２，３−ホスフェートのナトリウム塩（０．２５ｇ）を得た。
得られた化合物は、1Ｈ−ＮＭＲ、ＩＲ、化学分析などにより目的の構造であることを確認した。
【００５０】
合成例２〜５；各種ｃＰＡの合成
以下同様にして表１に示した実施例２〜５に用いた各種の１−Ｏ−アシル−グリセロ−２，３−フォスフェートを得た。
【００５１】
合成例６；１６：０−Ｏ−ｃＰＡの合成
アルゴン雰囲気下にトリアゾール（０．２ｇ、３ ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（８ｍｌ）に溶解させ、０℃でオキシ塩化リン（０．１ｍｌ、１．２ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．８５ｍｌ、６．１ｍｍｏｌ）を加え、さらに５分間攪拌し、ホスホリルトリストリアゾリドを調製した。さらに１−Ｏ−ヘキサデシルグリセロール（０．２９ｇ、０．９ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（５．７ｍｌ）を加え、室温下に２０分間攪拌した後、反応液を氷冷した２％塩酸（５０ｍｌ）に注ぎ、エーテルで抽出した。エーテル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。別途、水素化ナトリウム（６０％鉱油、０．０７ｇ、０．９ｍｍｏｌ）をペンタンで洗浄して鉱油を除き、エーテルに懸濁したものを上記エーテル溶液に加えた。蒸留水（８ｍｌ）で１−Ｏ−ヘキサデシルグリセロール−２，３−ホスフェートのナトリウム塩（０．２３ｇ）を得た。
得られた化合物は、1Ｈ−ＮＭＲ、ＩＲ、化学分析などにより目的の構造であることを確認した。
【００５２】
合成例７〜１０；各種１−Ｏ−ｃＰＡの合成
以下同様にして表１に示した実施例２〜５に用いた各種の１−Ｏ−アシル−グリセロ−２，３−フォスフェートを得た。
実施例および比較例に用いた構造名を表１に示す。また化学式を以下に示す。
【００５３】
【化１４】
【００５４】
【化１５】
【００５５】
【化１６】
【００５６】
【化１７】
【００５７】
【化１８】
【００５８】
【化１９】
【００５９】
【化２０】
【００６０】
【化２１】
【００６１】
【化２２】
【００６２】
【化２３】
【００６３】
【表１】
【００６４】
次にこれらのリゾホスファチジン酸環状リン酸エステル類を用いて、その効果を評価する実験を次のように行った。
（Ｉ）ヒアルロン酸産生増強効果
実施例１；１６：０−ｃＰＡ
（１）リゾホスファチジン酸環状リン酸エステルとして１−Ｏ−ヘキサデカノイルグリセロール２，３−ホスフェートのナトリウム塩（以下１６：０−ｃＰＡと略）を用いて行った。
（２）ヒアルロン酸産生能の評価
（２−１）細胞培養：ヒアルロン酸産生増強評価に使用した細胞は、ヒト新生児皮膚線維芽細胞ＮＢ １ＲＧＢで、理研細胞銀行から入手した。この細胞は、従来からこの種の試験で多用されており、ヒアルロン酸産生増強評価試験に用いる細胞として適するものである理由から選択し、試験に用いた。また、本試験では、ヒト由来の細胞を用いることから、人体への応用を考慮した薬物評価法としてもより適当である。当該細胞を牛胎児血清（ＦＣＳ）を１０％添加したダルベッコ改変イーグル培地 （ＤＭＥＭ）にて培養した。細胞はサブコンフルーエントになるまで培養後、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ処理によって接着細胞を浮遊させ、均ーな細胞懸濁液を得た。遠心分離によって細胞を集め、ＤＭＥＭ−１０％ ＦＣＳに再懸濁後、底面積２ｃｍ2の２４穴培養プレートに１０5個／ウェルとなるように播種した。３７℃で培養を２日継続し、十分に稠密とした上で、ＤＭＥＭ−０．５％ ＦＣＳに培地交換後、さらに１日培養した。この培養液中に培地中濃度が１０μＭとなるようにリゾホスファチジン酸環状リン酸エステルを添加し、６、１２、２４および４８時間目に、培養液をサンプリングした。
【００６５】
（２−２）サンドイッチＥＬＩＳＡによるヒアルロン酸の定量：
体外診断用ヒアルロン酸プレート（商品名 体外診断用ヒアルロン酸プレート「中外」、中外製薬社製）を用いて、固相にヒアルロン酸結合タンパク質を用い、液相にパーオキシダーゼを標識したヒアルロン酸結合タンパク質を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ分析法により前記（２−１）で得られた培養液中のヒアルロン酸を測定した。得られた結果を表２に示す。
【００６６】
実施例２〜１０；
（１）リゾホスファチジン酸環状リン酸エステルとして表１に示した各種のｃＰＡ；１−Ｏ−ヘキサデケニオイルグリセロール２，３−ホスフェートのナトリウム塩（実施例２；以下１６：１−ｃＰＡと略）、１−Ｏ−オクタデケニオイルグリセロール２，３−ホスフェートのナトリウム塩（実施例３；以下１８：１−ｃＰＡと略）、１−Ｏ−エイコサペンタエニルグリセロール２，３−ホスフェートのナトリウム塩（実施例４；以下２０：５−ｃＰＡと略）、１−Ｏ−ドコサヘキサエニオイルグリセロール２，３−ホスフェートのナトリウム塩（実施例５；以下２２：６−ｃＰＡと略）、１−Ｏ−ヘキサデカノイルグリセロール２，３−ホスフェートのナトリウム塩（実施例６；以下１６：０−Ｏ−ｃＰＡと略）、１−Ｏ−ヘキサデケニルグリセロール２，３−ホスフェートのナトリウム塩（実施例７；以下１６：１−Ｏ−ｃＰＡと略）、１−Ｏ−オクタデケニルグリセロール２，３−ホスフェートのナトリウム塩（実施例８；以下１８：１−Ｏ−ｃＰＡと略）、１−Ｏ−エイコサペンタエニルグリセロール２，３−ホスフェートのナトリウム塩（実施例９；以下２０：５−Ｏ−ｃＰＡと略）、１−Ｏ−ドコサヘキサエニルグリセロール２，３−ホスフェートのナトリウム塩（実施例１０；以下２２：６−Ｏ−ｃＰＡと略）を用いて実施例１と同様にして細胞培養し、ヒアロン酸産生能の評価を行った。
【００６７】
比較例１
（１）ヒアルロン酸産生能の評価
（２−１）細胞培養：リゾホスファチジン酸環状リン酸エステルを用いない以外は実施例１と同様にして培養を行い、所定時間に培養液を得た。
（２−２）サンドイッチＥＬＩＳＡによるヒアルロン酸の定量： 実施例１と同様にして培地中のヒアルロン酸を測定した。その結果を表２に示す。
【００６８】
比較例２
リゾホスファチジン酸として１−Ｏ−オクタデセノイル−ｓｎ−グリセロール３−フォスフォニックアシド（以下１８：１−ＬＰＡと略）のナトリウム塩（シグマ社製）を用いて、ヒアルロン酸産生能の評価を行った。
（２）ヒアルロン酸産生能の評価
（２−１）細胞培養：リゾホスファチジン酸として１０μＭの１８：１−ＬＰＡを用いた以外は実施例１と同様にして培養を行い、所定時間に培養液を得た。
（２−２）サンドイッチＥＬＩＳＡによるヒアルロン酸の定量を実施例１と同様にして培地中のヒアルロン酸を測定した。その結果を表２に示す。
【００６９】
比較例３
ヒアルロン酸産生を著しく亢進することが知られている成長因子として塩基性線維芽細胞成長因子（シグマ社製）を用いて、ヒアルロン酸産生能の評価を行った。
（２）ヒアルロン酸産生能の評価
（２−１）細胞培養は産生促進因子として塩基性線維芽細胞成長因子１０ｎｇ／ｍｌを用いた以外は実施例１と同様にして培養を行い、所定時間に培養液を得た。
（２−２）サンドイッチＥＬＩＳＡによるヒアルロン酸の定量を実施例１と同様にして培地中のヒアルロン酸を測定した。その結果を表２に示す。
【００７０】
【表２】
【００７１】
なお、表２の（ ）内の数値は、比較例１の４８時間培養後のヒアルロン酸産生量を１．０とした時の倍率である。
以上の結果、表２より１−Ｏ−アシル−グリセロ−２，３−ホスフェート類および１−Ｏ−アルキル−グリセロ−２，３−ホスフェート類によりヒアルロン酸量産生が著しく促進されたことがわかる。また、４８時間後の数値より、このヒアルロン酸の蓄積量はヒアルロン酸の合成促進作用が知られるＬＰＡやｂＦＧＦと比較しても２倍近いヒアルロン酸の蓄積が認められ、著しい効果があることがわかる。
以上の結果をグラフ化したのが、図１、２である。
図１および２の縦軸はヒアルロン酸産生量、横軸はサンプリングした時間を示す。
図１および２より、各種のｃＰＡを用いた実施例１〜１０は、比較例１〜３に比べて、ヒアルロン酸産生量が著しく高くなることがわかる。
【００７２】
（ＩＩ）デキサメタゾンのヒアルロン酸産生抑制に対するリゾホスファチジン酸環状リン酸エステルの回復効果
実施例１１
（１）ヒアルロン酸産生能の評価
（１−１）細胞培養：デキサメタゾンのヒアルロン酸合成抑制に対するリゾホスファチジン酸環状リン酸エステル（ｃＰＡ）の回復効果を確認するためＤＭＥＭ−０．５％ ＦＣＳに培地交換した後に０、１、１０ｎＭのデキサメタゾンとリゾホスファチジン酸環状リン酸エステルとして実施例３で用いたＣ１８：１−ｃＰＡを１００μＭで共存させた以外は実施例１と同様にして培養を行い、２４時間目に培養液を得た。
（１−２）サンドイッチＥＬＩＳＡによるヒアルロン酸の定量：実施例１の（２−２）と同様に実施した。
【００７３】
比較例４
１）ヒアルロン酸産生能の評価
（１−１）細胞培養：リゾホスファチジン酸環状リン酸エステルを用いない以外は、実施例１１と同様にして培養を行い、２４時間目に培養液を得た。
（１−２）サンドイッチＥＬＩＳＡによるヒアルロン酸の定量：実施例１の（２−２）と同様に実施し、得られた測定結果を表３に示す。
なおこの数値を図３に示す。ここで、縦軸はヒアルロン酸産生量、横軸はデキサメタゾン量を示す。−（黒塗り四角印）−は、Ｃ１８：１−ｃＰＡを１００μＭの共存の実施例１１の場合、−□(白抜き四角印）−は、デキサメタゾンのみの場合である。
【００７４】
【表３】
【００７５】
なお、表３の（ ）内の数値は、比較例４のデキサメタゾン添加なしの時のヒアルロン酸産生量を１．００とした時の倍率である。
以上の結果、表３の比較例４のヒアルロン酸産生量がデキサメタゾン１０ｎＭ添加ではブランクの０．７２倍に抑制されたことがわかる。また、ヒアルロン酸産生がリゾホスファチジン酸環状エステルの共存している系（デキサメタゾン１ｎＭ共存）である実施例１１の２４時間後のデータでは、デキサメタゾンを加えていない比較例４のブランクに比べて１．１６倍（デキサメタゾン１ｎＭ共存）、１．１８倍（デキサメタゾン１０ｎＭ共存）になっており、デキサメタゾンによるヒアルロン酸の産生抑制を改善していることがわかる。
【００７６】
（ＩＩＩ）塩基性線維芽細胞成長因子との相乗効果の確認
実施例１２
（１−１）細胞培養：細胞培養：ＤＭＥＭ−０.５％ＦＣＳに培地交換した後に塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）０、１、１０ｎｇ／ｍｌ共存下にリゾホスファチジン酸環状リン酸エステルとして実施例３で用いた１８：１−ｃＰＡを１０μＭ加えた以外は実施例１の（２）と同様に培養した。
（１−２）サンドイッチＥＬＩＳＡによるヒアルロン酸の定量：実施例１の（２）と同様に実施した。測定結果を表４に示す。
【００７７】
比較例５
（１−１）細胞培養：細胞培養：ＤＭＥＭ−０.５％ ＦＣＳに培地交換した後にリゾホスファチジン酸環状リン酸エステルを加えず塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）０、１、１０ ｎｇ／ｍｌを単独で添加した以外は実施例１２と同様に培養した。
（１−２）サンドイッチＥＬＩＳＡによるヒアルロン酸の定量：実施例１の（２）と同様に実施した。測定結果を表４に示す。なおこの数値を図４に示す。ここで、縦軸はヒアルロン酸産生量、横軸はｂＦＧＦ量を示す。
【００７８】
【表４】
【００７９】
なお、表４の（ ）内の数値は、比較例５のｂＦＧＦ添加なしの時のヒアルロン酸産生量を１．００とした時の倍率である。
以上の結果、ｂＦＧＦ単独で１０ｎｇ／ｍｌ添加した場合のヒアルロン酸の産生量が２２１４ｎｇ／ｍｌ（無添加時に比較して１．６５倍）であるのに対して、また、ｃＰＡ単独の場合のヒアルロン酸の産生量が、１８０７ｎｇ／ｍｌ（実施例１１のｂＦＧＦ ０）に対して、ｃＰＡを共存させた実施例１２のｂＦＧＦ１ｎｇ／ｍｌでは産生量が３２７５ｎｇ／ｍｌ（２．４４倍）、ｂＦＧＦ １０ｎｇ／ｍｌでは産生量が３７４１ｎｇ／ｍｌ（２．７９倍）と２倍を上回っており相乗的に亢進していることがわかる。
【００８０】
（ＩＶ）リゾホスファチジン酸環状リン酸エステル（ｃＰＡ）によるヒアルロン酸合成酵素発現の誘導
実施例１３
（１−１）細胞培養：ヒアルロン酸合成酵素（ＨＡＳ２）発現の評価にも上述のＮＢ１ＲＧＢ細胞を使用した。牛胎児血清（ＦＣＳ）を１０％添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用い、直径９ｃｍのシャーレ中でコンフルーエントになるまで培養後、ＤＭＥＭ−０．５％ＦＣＳに培地交換後さらに１日培養した。リゾホスファチジン酸環状リン酸エステルとして実施例３で用いた１８：１−ｃＰＡを培地中濃度が２５μＭとなるように添加し、８時間培養を継続した。
（１−２）ＲＴ−ＰＣＲ法によるヒアルロン酸合成酵素発現量の半定量：培養液を吸引除去後、商品名アイソジェン（ニッポンジーン社製）２ｍｌを添加し、添付プロトコールにしたがって全ＲＮＡ画分を回収した。このＲＮＡを０．２〜２０μｇ／μｌとなるように希釈、調製済みＲＴ−ＰＣＲ試薬（商品名 Ｒｅａｄｙ・Ｔｏ・Ｇｏ、アマシャムファルマシアバイオテク社製）用いて５'−ＴＣＧＣＴＴＣＧＴＡＧＧＴＣＡＴＣＣＡＣ−３'および５'−ＡＴＧＴＡＣＡＣＡＧＣＣＴＴＣＡＧＡＧＣ−３'をＨＡＳ２のプライマー、５'−ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ−３'および５'−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３'をハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨのプライマーとして抽出した全ＲＮＡ中の目的遺伝子産物の増幅を行った。ＲＴ−ＰＣＲの反応条件：４２℃で３０分逆転写反応後、９５℃、５分加温して一旦反応停止し、９５℃で１分、５５℃で１分、７２℃で１分の増幅操作を３５回くり返し、最後に７２℃で１０分処理した。このＰＣＲ反応産物を分析するため、反応液を正確に１μｌとり、エチジウムブロミド含有２％アガロース電気泳動にかけた。ＵＶトランスイルミネータで泳動後のパターンを検出した結果を図５に示す。
【００８１】
比較例６
（１−１）細胞培養：培地に１８：１−ｃＰＡを添加しない以外は実施例１３と同様に培養した。
（１−２）ＲＴ−ＰＣＲ法によるヒアルロン酸合成酵素発現量の半定量：実施例１３と同様に半定量を行った。ＵＶトランスイルミネータで泳動後のパターンを検出した。結果を図５に示す。図５の右３個がＧＡＰＤＨの量についての半定量の結果であり、左３個がＨＡＳ２の量についての半定量の結果である。
【００８２】
以上の結果から、発現量が一定と考えられるグリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のバンドが一定に観察される電気泳動条件下において、１−Ｏ−オクタデケニオイルグリセロール２，３−ホスフェート（１−オレイルグリセロール２，３−ホスフェート）を用いた実施例１３では、いずれのリゾホスファチジン酸誘導体をも用いない比較例６や１−Ｏ−オクタデケニル−グリセロホスフェート（１−オレイルグリセロール３リン酸）を用いた比較例７に比べ、ヒアルロン酸合成酵素２（ＨＡＳ２）のバンドが濃く観察されることからその発現がより強力に亢進していることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 リゾホスファチジン酸環状リン酸エステルアシル誘導体によるヒアルロン酸合成促進効果を示す図である。
【図２】 リゾホスファチジン環状リン酸エステルアルキル誘導体によるヒアルロン酸合成促進効果を示す図である。
【図３】 デキサメタゾンのヒアルロン酸合成抑制に対する回復効果を示す図である。
【図４】 ｂＦＧＦとの相乗効果を示す図である。
【図５】 ヒアルロン酸合成酵素２の発現亢進効果を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定のホスフェート誘導体（環状リン酸エステル）を用いる動物細胞におけるヒアルロン酸の産生増強能作用を有する産生増強剤、ヒアルロン酸合成酵素の遺伝子の発現促進剤及び皮膚外用組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒアルロン酸は、脊椎動物のあらゆる組織に認められ、コラーゲンやエラスチンなどとともに細胞外にマトリックスを構築している。その役割は十分に解明されていないが、組織の弾力性や伸縮性の他に細胞増殖や遊走性の制御（Ｒ．Ｋｏｓａｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５９，５，１１４１−５頁，１９９９年）やヒアルロン酸と結合するコンドロイチンやフィブリノーゲン、Ｉ型・ＶＩ型コラーゲンとの会合状態の制御（Ｃ．Ａ．ＭｃＤｅｖｉｔｔ，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２９４，３，１６７−７０頁，１９９１年）など多彩で生理的にも重要な役割を担っていることが知られている。
暦的加齢において強調される皮膚の硬化あるいは弾力性の低下なども皮膚の真皮線維芽細胞によるヒアルロン酸などのグリコサミノグリカン量の低下がその原因の一つとして挙げられる（Ｌ．Ｊ．Ｍｅｙｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１０２，３，３８５−９頁，１９９４年）。そのような観点から、これまで、皮膚の暦的加齢を軽減する手段として、皮膚のヒアルロン酸産生能を回復させる細胞賦活剤の開発が試みられてきた。
【０００３】
これまで、インターロイキン類やプロスタノイド類などがヒアルロン酸産生能を増強する物質として報告されているが、炎症系のメディエーターでもあることから安全性などの面で実際に前記の化合物を使用することは困難となっていた。また、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）や血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）などの成長因子もヒアルロン酸の産生を増強させることが報告されている（Ｐ．Ｈｅｌｄｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２５８，３，９１９−２２頁，１９８９年）。しかし、これらの成長因子は、一般に調製および精製が困難な上に安定性にも乏しく、分子量の点から無傷皮膚内へ浸透することも期待できず、実用性の点からは問題が多い。
そのため、皮膚の暦的加齢を軽減する他の手段として、卵白酵素分解物（特開平５−２７１０４９号公報）やリゾリン脂質（特開平８−６７６１９号公報、特開平８−６７６２０号公報、特開平８−６７６２１号公報）、シソ科植物（特開平１０−９５７３５号公報）、クワ科植物（特開平１１−６０４９６号公報）あるいはデヒドロアンドロステロン（特開平１１−１９３２３６号公報）が開示されてきた。しかしながら、皮膚においてヒアルロン酸産生能を増強する可能性および機序については依然として未解明な部分もある。したがって、安全で、より効果的なヒアルロン酸産生を亢進する新規な化合物が望まれている。
【０００４】
ヒアルロン酸の減少は、前述したように暦的加齢に伴って認められるが、ヒアルロン酸含有率の著しく高い胎児や幼児では皮膚の創傷治癒後の瘢痕形成は極めて軽微であり、この原因の一つとしてヒアルロン酸の関与が広く認められている。ヒアルロン酸の減少は、皮膚の暦的加齢以外にステロイドの反復投与などによっても引き起され、皮膚の萎縮などの外観上好ましくない問題を伴う（Ｒ．Ｍ．Ｌａｖｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，２６，４，５３５−４４頁，１９９２年）。したがって、美容上の観点から成人皮膚の創傷治療の際に瘢痕の形成を回避するため、あるいはステロイドの反復投与による皮膚の萎縮の軽減のため、皮膚細胞によるヒアルロン酸産生を増強させる何らかの手段が望まれている。このために例えば、リゾホスファチジン酸を使用することが考えられ、顕著なヒアルロン酸産生増強作用が確認されているが、これは、細胞培養実験において腸間膜由来の中皮細胞への腹水肝がんの浸潤を亢進する恐れがあることが報告されている（Ｆ．Ｉｍａｍｕｒａ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９３，２，４９７−５０３頁，１９９３年）。したがって、このような問題のないヒアルロン酸産生増強能を有するアナログ体が望まれていた。
【０００５】
一方、リゾホスファチジン酸環状リン酸エステルは、ＤＮＡポリメラーゼα阻害剤（特開平７−２５８２７８号公報）やがん転移抑制剤（特開平９−２５２３５号公報）として開示されているが、ヒアルロン酸産生能を増強させる細胞賦活剤としての働きは全く知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の第１の目的は、皮膚の暦的加齢やステロイドの反復投与などによる皮膚の萎縮および創傷治癒後の瘢痕形成を防止するため、細胞を賦活化しヒアルロン酸の産生分泌を亢進させる特定のリン化合物であるヒアルロン酸産生増強剤を提供することにある。
また本発明の第２の目的は、従来のヒアルロン酸産生増強剤より使用が簡便かつ、より優れた効果を有する特定のリン化合物であるヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進剤を提供することにある。
さらに本発明の第３の目的は、皮膚の萎縮および瘢痕形成を防止する皮膚外用剤組成物を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題に鑑み、動物細胞においてヒアルロン酸の産生能を増強する物質について検討した結果、特定の構造のリゾホスファチジン酸の環状リン酸エステルが動物細胞におけるヒアルロン酸の産生を効果的に促進することを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明によれば、下記式［Ｉ］
【０００８】
【化７】
（式中ＲＯは、炭素数１６〜２２のアルコール残基または脂肪酸残基を示す。Ｍはアルカリ金属原子を表す。）で表されるホスフェート誘導体を有効成分とする動物細胞培養用のヒアルロン酸産生能増強剤が提供される。
また本発明によれば、下記式［Ｉ］
【００１０】
【化８】
（式中ＲＯは、炭素数１６〜２２のアルコール残基または脂肪酸残基を示す。Ｍはアルカリ金属原子を表す。）で表されるホスフェート誘導体を有効成分とする動物細胞培養用のヒアルロン酸合成酵素の遺伝子の発現促進剤が提供される。
更に本発明によれば、組成物１００ｇ当り、下記式［Ｉ］
【００１２】
【化９】
（式中ＲＯは、炭素数１６〜２２のアルコール残基または脂肪酸残基を示す。Ｍはアルカリ金属原子を表す。）で表されるホスフェート誘導体０．１ｍｇ以上と、塩基性繊維芽細胞成長因子０．００１ｍｇ以上とを含む皮膚外用組成物が提供される。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明で用いられるホスフェート誘導体は、下記式［Ｉ］で表されるリゾホスファチジン酸環状リン酸エステル（以下、ｃＰＡ誘導体と略す。）である。
【００２１】
【化１３】
式中ＲＯは、炭素数１６〜２２のアルコール残基、炭素数１６〜２２の脂肪酸残基を示す。ここで、炭素数１６〜２２のアルコール残基、炭素数１６〜２２の脂肪酸残基としては、いかなる基でもよいが、好ましくは、（１）炭素数１６〜２２の直鎖状の飽和アシル残基、（２）炭素数１６〜２２の分岐鎖状の飽和アシル残基、（３）炭素数１６〜２２の直鎖状で１〜６個の不飽和結合を有する不飽和アシル残基、（４）炭素数１６〜２２の直鎖状の飽和アルキル残基、（５）炭素数１６〜２２の分岐鎖状の飽和アルキル残基、（６）炭素数１６〜２２の直鎖状で１〜６個の不飽和結合を有する不飽和アルキル残基である。前記（１）の炭素数１６〜２２の直鎖状の飽和アシル残基としては、パルミチン酸（C１６：０）、マルガリン酸（C１７：０）、ステアリン酸（C１８：０）、ノナデカン酸（C１９：０）、アラキジン酸（C２０：０）、ヘネイコサン酸（C２１：０）、ベヘニン酸（C２２：０）等に由来する残基が挙げられる。前記（２）の炭素数１６〜２２の分岐鎖状の飽和アシル残基としてはイソバレリアン酸、イソ酸、アンテイソ酸等に由来する残基が挙げられる。前記（３）の炭素数１６〜２２の直鎖状で１〜６個の不飽和結合を有する不飽和アシル残基としては、パルミトレイン酸（C１６：１）、オレイン酸（C１８：１）、エライジン酸（C１８：１）、バクセン酸（C１８：１）、リノール酸（C１８：２）、リノレン酸（C１８：３）、アラキドン酸（C２０：４）、イコサペンタエン酸（C２０：５）、エルカ酸（C２２：１）、ドコサヘキサエン酸（C２２：６）等の不飽和脂肪酸に由来する残基が挙げられる。前記（４）の炭素数１６〜２２の直鎖状の飽和アルキル残基としては、ヘキサデカノール（C１６：０）、ヘプタデカノール（C１７：０）、オクタデカノール（C１８：０）、ノナデカノール（C１９：０）、イコサノール（C２０：０）、ヘネイコサノール（C２１：０）、ドコサノール（C２２：０）等のアルコール類に由来する残基が挙げられる。前記（５）の炭素数１６〜２２の分岐鎖状の飽和アルキル残基としてはイソバレリアノール、イソノール、アンテイソノール等のアルコール類に由来する残基が挙げられる。前記（６）の炭素数１６〜２２の直鎖状で１〜６個の不飽和結合を有する不飽和アルキル残基としては、ヘキサデセノール（C１６：１）、オクタデセノール（C１８：１）、イコセノール（C２０：１）、ドコセノール（C２０：１）、リノール（C１８：２）、リノレノール（C１８：３）、エイコセノール（C２０：４）、イコサペンタエノール（C２０：５）、エルカノール（C２２：１）、ドコサヘキサノール（C２２：６）等に由来する残基が挙げられる。これらのうち、炭素数１６〜２２の炭化水素基としては、ホスフェート誘導体としての取扱いのしやすさ、および活性の強さなどの点からパルミチン酸（C１６：０）、ミリストレイン酸（C１４：１）、パルミトレイン酸（C１６：１）、オレイン酸（C１８：１）、エライジン酸（C１８：１）、リノール酸（C１８：２）、リノレン酸（C１８：３）、アラキドン酸（C２０：４）、イコサペンタエン酸（C２０：５）、ドコサヘキサエン酸（C２２：６）に由来する残基が最も好ましい。
【００２３】
式中Ｍは、アルカリ金属原子を表す。前記アルカリ金属原子としてはナトリウム、カリウム等が挙げられる。
【００２４】
前記式［Ｉ］で表されるホスフェート誘導体は、リゾホスファチジン酸環状リン酸エステルとして総称される化合物である。本発明に用いる前記式［Ｉ］で表されるリゾホスファチジン酸環状リン酸エステルは、通常、１−アシル−グリセロ−２，３−ホスフェート誘導体または１−Ｏ−アルキル−グリセロ−２，３−ホスフェート誘導体とも呼ばれる物質である。
【００２５】
本発明で使用する前記式［Ｉ］で表されるホスフェート誘導体としては、いかなる手段によって入手されてもよいが、例えば、１−アシル−グリセロ−２，３−ホスフェート誘導体は市販のものであってよく、あるいは市販のホスファチジルコリンやフォスファチジン酸などのリン脂質を酵素処理して入手することもできる。また、１−アシル−グリセロ−２，３−ホスフェート誘導体は種々の生物資源を原料とし、抽出などの処理により得ることができる。また、１−アシル−グリセロ−２，３−ホスフェート誘導体を、ジシクロヘキシルカルボジイミド存在下に脂肪酸と２，３−イソプロピリデン−ｓｎ−グリセロールから化学合成して得る方法が、特開平６−２２８１６９号公報、特開平７−２５８２７号公報、特開平９−２５２３５号公報に示されており、それらの方法で合成して得ることもできる。
また、１−Ｏ−アルキル−グリセロ−２，３−ホスフェート誘導体は市販のものであってもよく、あるいは合成あるいは生体より抽出した血小板活性化因子、プラスマローゲンあるいはその他の１−Ｏ−アルキルリゾリン脂質をホスホリパーゼＤやホスホリパーゼＡ２で酵素処理して得ることもできる。あるいは１−Ｏ−アルキル−２，３−ホスフェート誘導体は市販の１−Ｏ−アルキル−グリセロールをピリジン溶媒中でオキシ塩化リンと化学反応させて得る方法が、ＵＳ００５２３８９６５Ａに示されており、それらの方法で合成して得ることもできる。
【００２６】
本発明で使用する前記式［Ｉ］で表されるホスフェート誘導体は、これを有効成分とすることにより、動物細胞培養用のヒアルロン酸産生能増強剤として使用することができる。また、本発明で使用する前記式［Ｉ］で表されるホスフェート誘導体は、これを有効成分とすることにより、動物細胞培養用のヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進剤としても使用することができる。即ち、前記式［Ｉ］で表されるホスフェート誘導体は、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進剤として働くことにより、動物細胞のヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現を促進してヒアルロン酸産生を増強することができるものである。
【００２７】
本発明のヒアルロン酸産生能増強剤、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進剤は、培養動物細胞に適用されるが、この対象となる培養動物細胞としては、いかなる培養動物細胞であってよく、好ましくはヒト、牛、馬、豚、綿羊、山羊、犬、猫、猿、モルモット、鼠、ウサギ、鶏などの動物細胞が挙げられる。ヒアルロン酸産生能増強剤、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進剤は、それぞれの効果が十分発揮される程度の濃度で培養動物細胞に適用することにより、ヒアルロン酸産生増強剤、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進剤として作用するものである。本発明の化合物の使用量は、化合物の種類および細胞培養条件や培養動物細胞の組織など条件により最適量が異なるので限定できないが、例えば、培養液１００ｍｌ当り１０μｇ以上が好ましく、さらに好ましくは０．１ｍｇ〜０．５ｍｇ含有させるとよい。
【００２８】
本発明のヒアルロン酸産生能増強剤、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進剤は、前記式［Ｉ］で表されるホスフェート誘導体を、単独で使用してもよいし、また２種類以上を配合しても使用してもよい。
【００２９】
前記ｃＰＡは、細胞成長因子およびその他の成分とあわせて、動物細胞におけるヒアルロン酸産生の促進に十分な濃度で含有されることにより、皮膚外用組成物、皮膚萎縮改善用組成物、または皮膚の瘢痕形成防止用組成物とすることができる。前記ｃＰＡを皮膚外用組成物、皮膚萎縮改善用組成物、または皮膚の瘢痕形成防止用組成物に配合して含有させる場合、皮膚外用組成物、皮膚萎縮改善用組成物、または皮膚の瘢痕形成防止用組成物１００ｇ当り、ｃＰＡを０．１ｍｇ以上好ましくは１ｍｇ〜１０ｇ含有させるとよい。組成物中、ｃＰＡの含有率が０．１ｍｇ未満ではヒアルロン酸産生増強の目的を十分には発揮しえず、１０ｇを大幅に越える含有率においては使用量に見合う著しい効果が期待できない。また、細胞成長因子の配合量は適宜選択されてよいが、製剤１００ｇ当り、０．００１ｍｇ以上含有させるのが好ましく、さらに好ましくは０．０１ｍｇ〜５ｇ含有させるとよい。
【００３０】
本発明に用いられる細胞成長因子は、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）である。他の基礎生物学領域や臨床医学領域で細胞成長因子としては、例えば、上皮成長因子、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、インシュリン様成長因子、ＶＥＧＦ、トランスフォーミング成長因子、肝細胞成長因子、神経成長因子等の成長因子類が挙げられる。本発明の皮膚外用組成物、皮膚萎縮改善用組成物、または皮膚の瘢痕形成防止用組成物は、細胞成長因子を添加するのに加え、本発明の効果を損なわない範囲において、当該分野で既知の他の成分を併用してもよい。本発明の皮膚外用組成物、皮膚萎縮改善用組成物、または皮膚の瘢痕形成防止用組成物は、水溶液、油液、その他の溶液、乳液、クリーム、ゲル、懸濁液、マイクロカプセル、粉末、顆粒、固形などの形態をとることができる。また、皮膚外用組成物、皮膚萎縮改善用組成物、または皮膚の瘢痕形成防止用組成物は、前記形態にそれ自体既知の方法で調製した上で、ローション製剤、乳液剤、クリーム剤、軟膏剤、硬膏剤、ハップ剤、エアゾール剤等として、身体に塗布、貼付、噴霧することができる。これらの製剤形の中でもローション製剤、乳液剤、クリーム剤、軟膏剤、硬膏剤、ハップ剤、エアロゾール剤、固形物等の形態が、本発明の皮膚外用組成物、皮膚萎縮改善用組成物、または皮膚の瘢痕形成防止用組成物に適する製剤形である。本発明の皮膚外用組成物、皮膚萎縮改善用組成物、または皮膚の瘢痕形成防止用組成物は、医薬品、医薬部外品、化粧料として使用できる。
【００３１】
本発明の皮膚外用組成物、皮膚萎縮改善用組成物、または皮膚の瘢痕形成防止用組成物には、それらを調製する際に常用されている賦形剤、香料等をはじめ、油脂類、界面活性剤、防腐剤、金属イオン封鎖剤、水溶性高分子、増粘剤、粉末成分、紫外線防御剤、保湿剤、薬効成分、酸化防止剤、ｐＨ調整剤、洗浄剤、乾燥剤、乳化剤等を適宜配合できる。
【００３２】
本発明の効果を損なわない範囲内で、前記組成物に油脂類を配合してもよい。前記油脂類としては、液体油脂、固体油脂、ロウ類、炭化水素油、リン脂質、スフィンゴ脂質、高級脂肪酸、高級アルコール、合成エステル油、シリコーン類がある。具体的には、液体油脂として、例えば、アボガド油、ツバキ油、月見草油、タートル油、マカデミアナッツ油、トウモロコシ油、ミンク油、オリーブ油、ナタネ油、卵黄油、ゴマ油、パーシック油、小麦胚芽油、サザンカ油、ヒマシ油、アマニ油、サフラワー油、綿実油、エノ油、大豆油、落花生油、茶実油、カヤ油、コメヌカ油、シナギリ油、日本キリ油、ホホバ油、胚芽油、トリグリセリン、トリオクタン酸グリセリン、トリイソパルミチン酸グリセリン等が挙げられる。固体油脂としては、例えば、カカオ脂、ヤシ油、馬脂、硬化ヤシ油、パーム油、牛脂、羊脂、硬化牛脂、パーム核油、豚脂、牛骨脂、モクロウ核油、硬化油、牛脚脂、モクロウ、硬化ヒマシ油等が挙げられる。ロウ類としては、例えば、ミツロウ、キャンデリラロウ、綿ロウ、カルナウバロウ、ペイベリーロウ、イボタロウ、鯨ロウ、モンタンロウ、ヌカロウ、ラノリン、カポックロウ、酢酸ラノリン、液状ラノリン、サトウキビロウ、ラノリン脂肪酸イソプロピル、ラウリン酸へキシル、還元ラノリン、ジョジョバロウ、硬質ラノリン、セラックロウ、ＰＯＥ（以下、ポリオキシエチレンを同様に略す。）ラノリンアルコールエーテル、ＰＯＥラノリンアコールアセテート、ＰＯＥコレステロールエーテル、ラノリン脂肪酸ポリエチレングリコール、ＰＯＥ水素添加ラノリンアルコールエーテル等が挙げられる。炭化水素油としては、例えば、流動パラフィン、オゾケライト、スクワレン、プウスタン、パラフィン、セレシン、スクワレン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックス等の油分が挙げられる。リン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、フォスファチジン酸やこれらを酵素処理したもの等が挙げられる。スフィンゴ（糖）脂質としてはスフィンゴシン、セラミド、スフィンゴミエリン、セレブロシド等が挙げられる。
【００３３】
高級脂肪酸としては、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、べへン(べヘニン)酸、オレイン酸、１２−ヒドロキシステアリン酸、ウンデシレン酸、トール酸、イソステアリン酸、リノール酸、リノレイン酸、イコサペンタエン酸（ＩＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）が挙げられ、さらに置換基を有する高級脂肪酸としては、α−ヒドロキシ酸（例えば、２−ハイドロキシデカン酸、２−ハイドロキシドデカン酸、２−ハイドロキシテトラデカン酸、２−ハイドロキシヘキサデカン酸、２−ハイドロキシオクタデカン酸、２−ハイドロキシイコ酸）、分岐鎖α−ヒドロキシ酸（例えば、メチル２−ハイドロキシデカン酸、メチル２−ハイドロキシドデカン酸、メチル２−ハイドロキシテトラデカン酸、メチル２−ハイドロキシヘキサデカン酸、メチル２−ハイドロキシオクタデカン酸、メチル２−ハイドロキシイコ酸）等が挙げられる。
高級アルコールとしては、例えば、ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、ベヘニルアルコール、ミリスチルアルコール、オレィルアルコール、セトステアリルアルコール等の直鎖アルコール；モノステアリルグリセリンエーテル(バチルアルコール)、２−デシルテトラデシノール、ラノリンアルコール、コレステロール、フイトステロール、ヘキシルドデカノール、イソステアリルアルコール、オクチルドデカノール等の分岐鎖アルコール等が挙げられる。
【００３４】
合成エステル油としては、例えば、ミリスチン酸イソプロピル、オクタン酸セチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸プチル、ラウリン酸へキシル、ミリスチン酸ミリスチル、オレイン酸デシル、ジメチルオクタン酸ヘキシルデシル、乳酸セチル、乳酸ミリスチル、酢酸ラノリン、ステアリン酸イソセチル、イソステアリン酸イソセチル、１，２−ヒドロキシステアリル酸コレステリル、ジ−２−エチルヘキシル酸エチレングリコール、ジペンタエリスリトール脂肪酸エステル、モノイソステアリン酸Ｎ−アルキルグリコール、ジカプリン酸ネオペンチルグリコール、リンゴ酸ジイソステアリル、ジ−２−ヘプチルウンデカン酸グリセリン、トリ−２−エチルヘキシル酸トリメチロールプロパン、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン、テトラ−２−エチルヘキシル酸ペンタンエリスリトール、トリ−２−エチルヘキシル酸グリセリン、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン、セチル２−エチルヘキサノエート、２−エチルヘキシルパルミテート、トリミリスチン酸グリセリン、トリ−２−ヘプチルウンデカン酸グリセライド、ヒマシ油脂肪酸メチルエステル、オレイン酸オイル、セトステアリルアルコール、アセトグリセライド、パルミチン酸２−ヘプチルウンデシル、アジピン酸ジイソプチル、Ｎ−ラウロイル−Ｌ−グルタミン酸−２−オクチルドデシルエステル、アジピン酸ジ−２−ヘプチルウンデシル、エチルラウレート、セバチン酸ジ−２−エチルヘキシル、ミリスチン酸２−へキシルデシル、パルミチン酸−２−ヘキシルデシル、アジピン酸−２−ヘキシルデシル、セバチン酸ジイソプロピル、コハク酸−２−エチルヘキシル、酢酸エチル、酢酸プチル、酢酸アミル、クエン酸トリエチル等が挙げられる。
シリコーン類としては、例えば、ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、メチルハイドロジエンポリシロキサン等の鎖状ポリシロキサン；デカメチルポリシロキサン、テトラメチルポリシロキサン、テトラメチルテトラハイドロジェンポリシロキサンなどの環状ポリシロキサン、３次元網目構造を形成しているシリコーン樹脂、シリコーンゴム等が挙げられる。
【００３５】
本発明で使用する前記式［Ｉ］で表される化合物は、それら自体界面活性を示すが、組成物によって他のアニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤を併用してもよい。
アニオン界面活性剤としては、例えば、ラウリン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム、ミリスチン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、さらに混合脂肪酸等の塩（やし脂肪酸セッケン、牛脂脂肪酸セッケン）あるいは前記脂肪酸のカリウム塩；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸等の高級アルキル硫酸エステル塩；ＰＯＥラウリル硫酸トリエタノールアミン、ＰＯＥラウリル硫酸ナトリウム等のアルキルエーテル硫酸エステル塩；ラウロイルサルコシンナトリウム等のＮ−アシルサルコシン酸、Ｎ−ミリストイル−Ｎ−メチルタウリンナトリウム、ヤシ油脂肪酸メチルタウリッドナトリウム、ラウリルメチルタウリッドナトリウム等の高級脂肪酸アミドスルホン酸塩；ＰＯＥオレイルエーテルリン酸ナトリウム、ＰＯＥステアリルエーテルリン酸等のリン酸エステル塩；ジ−２−エチルヘキシルスルホコハク酸ナトリウム、モノラウロイルモノエタノールアミドポリオキシエチレンスルホコハク酸ナトリウム、ラウリルポリプロピレングリコールスルホコハク酸ナトリウム等のスルホコハク酸塩；リニアドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、リニアドデシルベンゼンスルホン酸トリエタノールアミン、リニアドデシルベンゼンスルホン酸等のアルキルベンゼンスルホン酸塩；Ｎ−ラウロイルグルタミン酸モノナトリウム、Ｎ−ステアロイルグルタミン酸ジナトリウム、Ｎ−ミリストイル−Ｌ−グルタミン酸モノナトリウム等のＮ−アシルグルタミン酸塩；硬化ヤシ油脂肪酸グリセリン硫酸ナトリウム等の高級脂肪酸エステル硫酸エステル塩、ロート油等の硫酸化油；ＰＯＥアルキルエーテルカルボン酸、ＰＯＥアルキルアリルエーテルカルボン酸塩、α−オレフインスルホン酸塩、高級脂肪酸エステルスルホン酸塩、二級アルコール硫酸エステル塩、高級脂肪酸アルキロールアミド硫酸エステル塩、ラウロイルモノエタノールアミドコハク酸ナトリウム、Ｎ−パルミトイルアスパラギン酸ジトリエタノールアミン、カゼインナトリウム等が挙げられる。
【００３６】
カチオン界面活性剤としては、例えば、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ラウリルトリメチルアンモニウム等のアルキルトリメチルアンモニウム塩、塩化ジステアリルジメチルアンモニウムジアルキルジメチルアンモニウム塩、塩化ポリ（Ｎ，Ｎ’−ジメチル−３，５−メチレンピペリジニウム）、塩化セチルピリジニウム等のアルキルピリジニウム塩；アルキル四級アンモニウム塩、アルキルジメチルベンジルアンモニウム塩、アルキルイソキノリニウム塩、ジアルキルモリホニウム塩、ＰＯＥアルキルアミン、アルキルアミン塩、ポリアミン脂肪酸誘導体、アミルアルコール脂肪酸誘導体、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム等が挙げられる。
両性界面活性剤としては、例えば、２−ウンデシル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−(ヒドロキシエチルカルボキシメチル)−２−イミダゾリンナトリウム、２−ココイル−２−イミタゾリニウムヒドロキサイド−１−カルボキシエチロキシ−２−ナトリウム塩等のイミダゾリン系両性界面活性剤；２−へプタデシル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン、アルキルベタイン、アミドベタイン、スルホベタイン等のベタイン系界面活性剤等が挙げられる。
【００３７】
親油性非イオン界面活性剤としては、例えば、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノイソステアレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンセスキオレエート、ソルビタントリオレエート、ペンタ−２−エチルヘキシル酸ジグリセロールソルビタン、テトラ−２−エチルへキシル酸ジグリセロールソルビタン等のソルビタン脂肪酸エステル類；モノ綿実油脂肪酸グリセリン、モノエルカ酸グリセリン、セスキオレイン酸グリセリン、モノステアリン酸グリセリン、α，α’−オレイン酸ピログルタミン酸グリセリン、モノステアリン酸グリセリン、リンゴ酸等のグリセリンポリグリセリン脂肪酸類；モノステアリン酸プロピレングリコール等のプロピレングリコール脂肪酸エステル類；硬化ヒマシ油誘導体、グリセリンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン−メチルポリシロキサン共重合体等が挙げられる。
親水性非イオン界面活性剤としては、例えば、ＰＯＥ−ソルビタンモノオレエート、ＰＯＥ−ソルビタンモノステアレート、ＰＯＥ−ソルビタンモノオレエート、ＰＯＥ−ソルビタンテトラオレエート等のＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル類；ＰＯＥ−ソルビットモノラウレート、ＰＯＥ−ソルビットモノオレエート、ＰＯＥ−ソルビットペンタオレエート、ＰＯＥ−ソルビットモノステアレート等のＰＯＥソルビット脂肪酸エステル類；ＰＯＥ−グリセリンモノステアレート、ＰＯＥ−グリセリンモノイソステアレート、ＰＯＥ−グリセリントリイソステアレート等のＰＯＥグリセリン脂肪酸エステル類；ＰＯＥモノオレエート、ＰＯＥジステアレート、ＰＯＥモノジオレエート、システアリン酸エチレングリコール等のＰＯＥ脂肪酸エステル類；ＰＯＥラウリルエーテル、ＰＯＥオレイルエーテル、ＰＯＥステアリルエーテル、ＰＯＥベへニルエステル、ＰＯＥ−オクチルドデシルエーテル、ＰＯＥコレスタノールエーテル等のＰＯＥアルキルエーテル類；ＰＯＥオクチルフェニルエーテル、ＰＯＥノニルフェニルエーテル、ＰＯＥジノニルフェニルエーテル等のＰＯＥアルキルフェニルエーテル類；プルロニツク等のプルアロニツク型類、ＰＯＥ− ＰＯＰ（ポリオキシプロピレンの略、以下同じ。）セチルエーテル、ＰＯＥ−ＰＯＰ２−デシルテトラデシルエーテル、ＰＯＥ−ＰＯＰモノブチルエーテル、ＰＯＥ−ＰＯＰ水添ラノリン、ＰＯＥ−ＰＯＰグリセリンエーテル等のＰＯＥ−ＰＯＰアルキルエーテル類；テトロニツク等のテトラＰＯＥ−テトラＰＯＰエチレンジアミン縮合物類；ＰＯＥヒマシ油、ＰＯＥ硬化ヒマシ油、ＰＯＥ硬化ヒマシ油モノイソステアレート、ＰＯＥ硬化ヒマシ油トリイソステアレート、ＰＯＥ硬化ヒマシ油モノピログルタミン酸モノイソステアリン酸ジエステル、ＰＯＥ硬化ヒマシ油マレイン酸等のＰＯＥヒマシ油硬化ヒマシ油誘導体；ＰＯＥソルビットミツロウ等のＰＯＥミツロウ−ラノリン誘導体、ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド、ラウリン酸モノエタノールアミド、脂肪酸イソプロパノールアミド等のアルカノールアミド；ＰＯＥプロピレングリコール脂肪酸エステル、ＰＯＥアルキルアミン、ＰＯＥ脂肪酸アミド、ショ糖脂肪酸エステル、ＰＯＥノニルフェニルホルムアルデヒド縮合物、アルキルエトキシジメチルアミンオキシド、トリオレイルリン酸等が挙げられる。
【００３８】
前記防腐剤としては、メチルパラベン、エチルパラベン、ブチルパラベン等が挙げられる。
前記金属イオン封鎖剤としては、エデト酸ナトリウム塩等が挙げられる。
前記水溶性高分子としては、天然の高分子、半合成の高分子、合成の高分子、無機の高分子が挙げられる。
天然の水溶性高分子としては、アラビアガム、トラガカントガム、ガラクタン、グアガム、キヤロブガム、カラヤガム、カラギーナン、タマリンドガム、キサンタンガム、ペクチン、カンテン、クインスシード（マルメロ）、アルゲコロイド（カッソウエキス）、デンプン（コメ、トウモロコシ、バレイショ、コムギ）、グリチルリチン酸等の植物系高分子、キサンタンガム、デキストラン、サクシノグルカン、プルラン、コレステリルプルラン等の微生物系高分子および誘導体；コラーゲン、カゼイン、アルブミン、ゼラチン等の動物系高分子等が挙げられる。 半合成の水溶性高分子としては、デキストリン、カルボキシメチルデンプン、メチルヒドロキシプロピルデンプン等のデンプン系高分子；メチルセルロース、ニトロセルロース、エチルセルロース、メチルヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、硫酸セルロースジメチルジアルキル（１２〜２０）アンモニウム、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）、結晶セルロース、セルロース未等のセルロース系高分子；アルギン酸ナトリウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル等のアルギン酸系高分子等が挙げられる。
【００３９】
合成水溶性高分子としては、ポリビニルアルコール、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルキル変性カルボキシビニルポリマー等のビニル系高分子；ポリエチレングリコール２０００、ポリエチレングリコール４０００、ポリエチレングリコール６０００等のポリオキシエチレン系高分子；ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体系高分子；ポリアクリル酸ナトリウム、ポリエチレンアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）等の（メタ）アクリル系高分子；ポリエチレンイミン、カチオンポリマー等が挙げられる。
【００４０】
無機の水溶性高分子としては、べントナイト、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、ラボナイト、ヘクトライト、無水ケイ酸等が挙げられる。
前記粉末成分としては、タルク、カオリン、雲母、絹雲母（セリサイト）、白雲母、金雲母、合成雲母、紅雲母、黒雲母、リチア雲母、バーミキュライト、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、ケイ酸アルミニウム、ケイ酸バリウム、ケイ酸カルシウム、ケイ酸マグネシウム、ケイ酸ストロンチウム、タングステン酸金属塩、マグネシウム、シリカ、ゼオライト、硫酸バリウム、焼成硫酸カルシウム（焼セッコウ）、リン酸カルシウム、弗素アパタイト、ヒドロキシアパタイト、セラミックパウダー、窒化ホウ素等の無機粉末；金属石鹸（ミリスチン酸亜鉛、パルミチン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム）、ポリアミド樹脂粉末（ナイロン粉末）、ポリエチレン粉末、ポリメタクリル酸メチル粉末、ポリスチレン粉末、スチレンとアクリル酸の共重合体樹脂粉末、ベンゾグアナミン樹脂粉末、ポリ四弗化エチレン粉末、セルロース粉末等の有機粉末；二酸化チタン、酸化亜鉛等の無機白色顔料、酸化鉄（ベンガラ）、チタン酸鉄等の無機赤色系顔料、γ−酸化鉄等の無機褐色系顔料、黄酸化鉄、黄土等の無機黄色系顔料、黒酸化鉄、カーボンブラック、低次酸化チタン等の無機黒色系顔料、マンゴバイオレット、コバルトバイオレット等の無機紫色系顔料、酸化クロム、水酸化クロム、チタン酸コバルト等の無機緑色系顔料、群青、紺青等の無機青色系顔料、酸化チタンコーテッドマイカ、酸化チタンコーテッドオキシ塩化ビスマス、酸化チタンコーテッドタルク、着色酸化チタンコーテッドマイカ、オキシ塩化ビスマス、魚鱗箔等のパール顔料、アルミニウムパウダー、カッパーパウダー等の金属粉末顔料、赤色２０１号、赤色２０２号、赤色２０４号、赤色２０５号、赤色２２０号、赤色２２６号、赤色２２８号、赤色４０５号、橙色２０３号、橙色２０４号、黄色２０５号、黄色４０１号、青色４０４号、赤色３号、赤色１０４号、赤色１０６号、赤色２２７号、赤色２３０号、赤色４０１号、赤色５０５号、橙色２０５号、黄色４号、黄色５号、黄色２０２号、黄色２０３号、緑色３号、青色１号などのジルコニウム、バリウムまたはアルミニウムレーキ等の有機顔料、クロロフィル、β−カロチン等の天然色素等、チタンイエロー、カーサミン、紅花赤等の色剤等が挙げられる。
【００４１】
前記紫外線防御剤としては、化学的に紫外線を吸収する物質である「紫外線吸収剤」と、物理的作用によって紫外線を散乱および反射させる物質である「紫外線遮断剤」の両者を含む。
前記紫外線吸収剤の長波長紫外線（ＵＶＡ）吸収剤としては、具体的には例えば、メチルアントラニレート、ホモメンチル−Ｎ−アセチルアントラニレニト等のアントラニル酸系紫外線吸収剤；２，４−ジヒドロキシベンゾフェノン、２，２−ジヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン、２，２’−ジヒドロキシ−４，４’−ジメトキシベンゾフェノン、２，２’，４，４’−テトラヒドロキシベンゾフェノン、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン、２−ヒドロキシ−４−メトキシ−４’−メチルベンゾフェノン、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン−５−スルホン塩酸、４−フェニルベンゾフェノン、２−エチルへキシル−４’−フェニル−ベンゾフェノン−２−カルボキシレート、２−ヒドロキシ−４−ａ−オクトキシベンゾフェノン、４−ヒドロキシ−３−カルボキシベンゾフェノン等のベンゾフェノン系紫外線吸収剤；２，２’−ヒドロキシ−５−メチルフェニルベンゾトリアゾール、２− (２’−ヒドロキシ−５’−ｔｅｒｔ−オクチルフェニル) ベンゾトリアゾール、２ (２’−ヒドロキシ−５’−メチルフェニル) ベンゾトリアゾール等のベンゾトリアゾール系紫外線吸収剤；ジアニソイルメタン、４−メトキシ−４’−ｔｅｒｔ−ブチルジベンゾイルメタン等が挙げられる。
これらの長波長紫外線吸収剤の中でも、４−メトキシ−４’−ｔｅｒｔ−ブチルジベンゾイルメタン、２−ヒドロキシ−４’メトキシベンゾフェノン、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン誘導体、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン−５−スルホン酸塩が安全性および有効性に優れた長波長紫外線吸収剤であり、好ましいものとして挙げられる。
【００４２】
またさらに、前記紫外線吸収剤の中波長紫外線(ＵＶＢ)吸収剤としては、パラアミノ安息香酸(以下、ＰＡＢＡという。)、ＰＡＢＡモノグリセリンエステル、Ｎ，Ｎ−ジプロポキシＰＡＢＡエチルエステル、Ｎ，Ｎ−ジエトキシＰＡＢＡエチルエステル、 Ｎ，Ｎ−ジメチルＰＡＢＡエチルエステル、Ｎ，Ｎ−ジメチルＰＡＢＡブチルエステル、Ｎ，Ｎ−ジメチルＰＡＢＡアミルエステル等の安息香酸系紫外線吸収剤；ジプロピレングリコールサリシレート、エチレングリコールサリシレート、ミリスチルサリシレート、メチルサリシレート、アミルサリシレート、メンチルサリシレート、ホモメンチルサリシレート、オクチルサリシレート、フェニルサリシレート、ベンジルサリシレート、ｐ−イソプロパノールフェニルサリシレート等のサリチル酸系紫外線吸収剤；オクチルシンナメート、エチル−４−イソプロピルシンナメート、メチル−２， ５−ジイソプロピルシンナメート、エチル−２，４−ジイソプロピルシンナメート、メチル−２，４−ジイソプロピルシンナメート、プロピル−ｐ−メトキシシンナメート、イソプロピル−ｐ−メトキシシンナメート、イソアミル−ｐ−メトキシシンナメート、オクチル−ｐ−メトキシシンナメート（２−エチルヘキシル−ｐ−メトキシシンナメート）、２−エトキシエチル−ｐ−メトキシシンナメート、シクロヘキシル−ｐ−メトキシシンナメート、エチル−α−シアノ−β−フェニルシンナメート、２−エチルヘキシル−α−シアノ−β−フェニルシンナメート、グリセリルモノ−２−エチルヘキサノイルージパラメトキシシンナメート、メトキシケイ皮酸オクチル、３，４，５−トリメトキシケイ皮酸−３−メチル−４−［メチルビス（トリメチルシロキシ）シリル］ブチル、ｐ−ジメトキシケイ皮酸モノエチルエステル等のケイ皮酸系紫外線吸収剤；３−（４’−メチルベンジリデン）−ａ，１−カンフアー、３−ベンジリデン−ｄｌ−カンフアー、５− (３，３−ジメチル−２−ノルボルニリデン) −３−ペンチン−２−オン等のカンフアー誘導体、ウロカニン酸、ウロカニン酸エチルエステル、２−フェニル−メチルベンゾオキサゾール、ジベンザラジン等を挙げることができる。
【００４３】
さらに、紫外線遮断剤としては、例えば、酸化チタン（ＴｉＯ2）、タルク（ＭｇＳｉＯ2）、カルミン（ＦｅＯ2）、ベントナイト、カオリン、酸化亜鉛（ＺｎＯ）等を挙げることができる。
前記保湿剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、１，３−ブチレングリコール、へキシレングリコール、キシリトール、ソルビトール、マルチトール、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ムコイチン硫酸、カロニン酸、アテロコラーゲン、コレスチリル−１２−ヒドロキシステアレート、乳酸ナトリウム、胆汁酸塩、ｄｌ−ピロリドンカルボン酸塩、短鎖可溶性コラーゲン、ラミニン、ジグリセリン（ＥＯ）ＰＯ付加物、イザヨイバラ抽出物、セイヨウノコギリソウ抽出物、メリロート抽出物等を挙げることができる。
【００４４】
前記薬効成分としては、アルブチン、ビタミンＣおよびその誘導体、コウジ酸、胎盤抽出物、グルタチオン、ユキノシタ抽出物等の美白剤；グリチルリチン酸誘導体、グリチルレチン酸誘導体、サリチル酸誘導体、ヒノキチオール、酸化亜鉛、アラントイン等の消炎剤；ローヤルゼリー、感光素、コレステロール誘導体、幼牛血液抽出物、牛脳抽出物、胎盤抽出物等の賦活剤；ノニル酸ワレニルアミド、ニコチン酸ベンジルエステル、ニコチン酸β−ブトキシエチルエステル、カプサイシン、ジンゲロン、カンタリスチンキ、イクタモール、カフェイン、タンニン酸、α−ボルネオール、ニコチン酸トコフェロール、イノシトールへキサニコチネート、シクランデレート、シンナリジン、トラゾリン、アセチルコリン、ベラパミル、セファランチン、γ−オリザノール等の血行促進剤；硫黄、チアントール等の抗脂漏剤；多様な目的から、アケビ抽出物、キッピ抽出物、ブナ抽出物、あんず抽出物、れんげ草抽出物、コンフリー抽出物、タイム抽出物、ラベンダー抽出物、マジョラム抽出物、テンチャ抽出物、バラ抽出物、オオバク抽出物、オウレン抽出物、シソ抽出物、サルビア抽出物、エンメイ草抽出物、オウゴン抽出物、シコン抽出物、シヤクヤク抽出物、センブリ抽出物、バーチ抽出物、セージ抽出物、ビワ抽出物、ニンジン抽出物、アロエ抽出物、ゼニアオイ抽出物、アイリス抽出物、ブドウ抽出物、ヨクイニン抽出物、ヘチマ抽出物、ユリ抽出物、サフラン抽出物、センキュウ抽出物、ショウキョウ抽出物、オトギリソウ抽出物、オノニス抽出物、ローズマリー抽出物、ニンニク抽出物、トウガラシ抽出物、木通抽出物、桑抽出物などの植物抽出物；アオサ抽出物、オゴノリ抽出物、テングサ抽出物、コンブ抽出物、ホンダワラ抽出物、ヒバマタ抽出物、アオサイン抽出物などの海草抽出物；アガリスク抽出物、ケロウジ抽出物、マンネンタケ抽出物、イボタケ抽出物、タモギタケ抽出物、ハラタケ抽出物などのきのこ類抽出物；チンピ、トウキ等；レチノール、酢酸レチノール等のビタミンＡ類；リボフラビン、酪酸リボフラビン、フラビンアデニンヌクレオチド等のビタミンＢ2類；ピリドキシン塩酸塩、ピリドキシンジオクタノエート等のビタミンＢ6類；Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸ジパルミチン酸エステル、Ｌ−アスコルビン酸−２−硫酸ナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステル、ＤＬ−α−トコフェロ−ル−Ｌ−アスコルビン酸リン酸ジエステルジカリウム等のビタミンＣ類；パントテン酸カルシウム、Ｄ−パントテニルアルコール、パントテニルエチルエーテル、アセチルパントテニルエチルエーテル等のパントテン酸類；エルゴカルシフェロール、コレカルシフェロール等のビタミンＤ類；ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ニコチン酸ベンジル等のニコチン酸類、α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、ニコチン酸ＤＬ−α−トコフェロール、コハク酸ＤＬ−α−トコフェロール等のビタミンＥ類；ビタミンＰ、ビオチン等のビタミン類；デヒドロエピアンドロステロンやデヒドロエピアンドロステロン硫酸などのステロイド類；プロスタグランジンＦ2α、プロスタグランジンＥ1、ロイコトリエンＢ4などプロスタノイド類；エストロジェン、デヒドロ（エピ）アンドロステロン等のホルモン類を挙げることができる。
【００４５】
なお、その薬剤成分に関しては、本発明の効果が損なわれない範囲において、広く配合することができる。
本発明の皮膚外用組成物、皮膚萎縮改善用組成物、または皮膚の瘢痕形成防止用組成物の製造方法は、通常の方法により前記のような成分を適宜配合する。
【００４６】
次に皮膚外用剤の製造方法の一例を記載する。
＜皮膚外用剤の製造方法＞
白色ワセリン（２５０ｇ）、ステアリルアルコール（２００ｇ）、プロピレングリコール（１３０ｇ）、パラオキシ安息香酸エチル（０．２３ｇ）、パラオキシ安息香酸プロピル（０．１２ｇ）等の油性成分を秤取り、加熱溶解した。一方、ラウリン酸ナトリウム（１８ｇ）、リゾホスファチジン酸環状エステル（２ｇ）精製水（残分：全量１０００ｇから他の成分を除いた残分）とを配合して、水性成分として、これに前記の油性成分を徐々に加温下に加えて均一とした。その後冷却して前記の組成の軟膏を得る。
このようにして得られた本発明の皮膚外用組成物、皮膚萎縮改善用組成物、または皮膚の瘢痕形成防止用組成物は、動物細胞におけるヒアルロン酸の産生を促進し、他の増殖因子に対する反応性を亢進するなど、動物細胞の賦活化を促進する作用を有する。
【００４７】
次にそれぞれの用法について記載する。
＜皮膚外用剤の用法＞
本発明の皮膚外用組成物の用量は、有効成分の種類や組成、性状、用法、患者の年齢、性別やその他の条件、意図する疾患の種類や程度などにより必ずしも限定されないが、通常、皮膚外用剤として使用する場合、製剤１００ｇ当り、ｃＰＡを１ｍｇ以上配合することが好ましく、１０ｍｇ〜５０ｇに調節することがさらに好ましい。患部に直接または間接的に塗布、スプレーすることによりｃＰＡ量として１ｃｍ2および1日当り０．１μｇ〜１０ｍｇ、好ましくは１μｇ〜１ｍｇであり、この量を１日１回または２回〜４回使用することが好ましい。
【００４８】
【発明の効果】
本発明のヒアルロン酸産生能増強剤、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進剤は、単独で動物細胞を賦活化し、炎症に関与するヒアルロン酸合成酵素１ではなくヒアルロン酸合成酵素２の発現が顕著に亢進し、ヒアルロン酸の産生が顕著に増強される。さらにｃＰＡと線維芽細胞成長因子の共存で相乗的な効果が得られる。また、本願発明によればヒアルロン酸産生の増強はステロイドによるヒアルロン酸産生の抑制を部分的に回復させることから、ステロイドの反復使用による皮膚の萎縮を改善することができる。本発明によれば、ヒアルロン酸含量の低下を回復させ、創傷治癒後の瘢痕形成するような病態を改善することができる。
【００４９】
【実施例】
以下、具体例に基づいて、本発明をさらに詳細に説明する。
次に用いた試料および測定方法を示す。
合成例１；１６：１−ｃＰＡの合成
アルゴン雰囲気下にトリアゾール（０．２ｇ、３ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（８ｍｌ）に溶解させ、０℃でオキシ塩化リン（０．１ｍｌ、１．１ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．７１ｍｌ、５．１ｍｍｏｌ）を加え、さらに５分間攪拌し、ホスホリルトリストリアゾリドを調製した。さらに１−Ｏ−ヘキサデカノイルグリセロール（０．３ｇ、０．９ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（５．５ｍｌ）を加え、室温下に２０分間攪拌した後、反応液を氷冷した２％塩酸（５０ｍｌ）に注ぎ、エーテルで抽出した。エーテル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。別途、水素化ナトリウム（６０％鉱油、０．０７ｇ、０．９ｍｍｏｌ）をペンタンで洗浄して鉱油を除き、エーテルに懸濁したものを上記エーテル溶液に加えた。蒸留水（８ｍｌ）で１−ヘキサデカノイルグリセロール−２，３−ホスフェートのナトリウム塩（０．２５ｇ）を得た。
得られた化合物は、1Ｈ−ＮＭＲ、ＩＲ、化学分析などにより目的の構造であることを確認した。
【００５０】
合成例２〜５；各種ｃＰＡの合成
以下同様にして表１に示した実施例２〜５に用いた各種の１−Ｏ−アシル−グリセロ−２，３−フォスフェートを得た。
【００５１】
合成例６；１６：０−Ｏ−ｃＰＡの合成
アルゴン雰囲気下にトリアゾール（０．２ｇ、３ ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（８ｍｌ）に溶解させ、０℃でオキシ塩化リン（０．１ｍｌ、１．２ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．８５ｍｌ、６．１ｍｍｏｌ）を加え、さらに５分間攪拌し、ホスホリルトリストリアゾリドを調製した。さらに１−Ｏ−ヘキサデシルグリセロール（０．２９ｇ、０．９ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（５．７ｍｌ）を加え、室温下に２０分間攪拌した後、反応液を氷冷した２％塩酸（５０ｍｌ）に注ぎ、エーテルで抽出した。エーテル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。別途、水素化ナトリウム（６０％鉱油、０．０７ｇ、０．９ｍｍｏｌ）をペンタンで洗浄して鉱油を除き、エーテルに懸濁したものを上記エーテル溶液に加えた。蒸留水（８ｍｌ）で１−Ｏ−ヘキサデシルグリセロール−２，３−ホスフェートのナトリウム塩（０．２３ｇ）を得た。
得られた化合物は、1Ｈ−ＮＭＲ、ＩＲ、化学分析などにより目的の構造であることを確認した。
【００５２】
合成例７〜１０；各種１−Ｏ−ｃＰＡの合成
以下同様にして表１に示した実施例２〜５に用いた各種の１−Ｏ−アシル−グリセロ−２，３−フォスフェートを得た。
実施例および比較例に用いた構造名を表１に示す。また化学式を以下に示す。
【００５３】
【化１４】
【化１５】
【化１６】
【化１７】
【化１８】
【化１９】
【化２０】
【化２１】
【化２２】
【化２３】
【表１】
次にこれらのリゾホスファチジン酸環状リン酸エステル類を用いて、その効果を評価する実験を次のように行った。
（Ｉ）ヒアルロン酸産生増強効果
実施例１；１６：０−ｃＰＡ
（１）リゾホスファチジン酸環状リン酸エステルとして１−Ｏ−ヘキサデカノイルグリセロール２，３−ホスフェートのナトリウム塩（以下１６：０−ｃＰＡと略）を用いて行った。
（２）ヒアルロン酸産生能の評価
（２−１）細胞培養：ヒアルロン酸産生増強評価に使用した細胞は、ヒト新生児皮膚線維芽細胞ＮＢ １ＲＧＢで、理研細胞銀行から入手した。この細胞は、従来からこの種の試験で多用されており、ヒアルロン酸産生増強評価試験に用いる細胞として適するものである理由から選択し、試験に用いた。また、本試験では、ヒト由来の細胞を用いることから、人体への応用を考慮した薬物評価法としてもより適当である。当該細胞を牛胎児血清（ＦＣＳ）を１０％添加したダルベッコ改変イーグル培地 （ＤＭＥＭ）にて培養した。細胞はサブコンフルーエントになるまで培養後、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ処理によって接着細胞を浮遊させ、均ーな細胞懸濁液を得た。遠心分離によって細胞を集め、ＤＭＥＭ−１０％ ＦＣＳに再懸濁後、底面積２ｃｍ2の２４穴培養プレートに１０5個／ウェルとなるように播種した。３７℃で培養を２日継続し、十分に稠密とした上で、ＤＭＥＭ−０．５％ ＦＣＳに培地交換後、さらに１日培養した。この培養液中に培地中濃度が１０μＭとなるようにリゾホスファチジン酸環状リン酸エステルを添加し、６、１２、２４および４８時間目に、培養液をサンプリングした。
【００６５】
（２−２）サンドイッチＥＬＩＳＡによるヒアルロン酸の定量：
体外診断用ヒアルロン酸プレート（商品名 体外診断用ヒアルロン酸プレート「中外」、中外製薬社製）を用いて、固相にヒアルロン酸結合タンパク質を用い、液相にパーオキシダーゼを標識したヒアルロン酸結合タンパク質を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ分析法により前記（２−１）で得られた培養液中のヒアルロン酸を測定した。得られた結果を表２に示す。
【００６６】
実施例２〜１０；
（１）リゾホスファチジン酸環状リン酸エステルとして表１に示した各種のｃＰＡ；１−Ｏ−ヘキサデケニオイルグリセロール２，３−ホスフェートのナトリウム塩（実施例２；以下１６：１−ｃＰＡと略）、１−Ｏ−オクタデケニオイルグリセロール２，３−ホスフェートのナトリウム塩（実施例３；以下１８：１−ｃＰＡと略）、１−Ｏ−エイコサペンタエニルグリセロール２，３−ホスフェートのナトリウム塩（実施例４；以下２０：５−ｃＰＡと略）、１−Ｏ−ドコサヘキサエニオイルグリセロール２，３−ホスフェートのナトリウム塩（実施例５；以下２２：６−ｃＰＡと略）、１−Ｏ−ヘキサデカノイルグリセロール２，３−ホスフェートのナトリウム塩（実施例６；以下１６：０−Ｏ−ｃＰＡと略）、１−Ｏ−ヘキサデケニルグリセロール２，３−ホスフェートのナトリウム塩（実施例７；以下１６：１−Ｏ−ｃＰＡと略）、１−Ｏ−オクタデケニルグリセロール２，３−ホスフェートのナトリウム塩（実施例８；以下１８：１−Ｏ−ｃＰＡと略）、１−Ｏ−エイコサペンタエニルグリセロール２，３−ホスフェートのナトリウム塩（実施例９；以下２０：５−Ｏ−ｃＰＡと略）、１−Ｏ−ドコサヘキサエニルグリセロール２，３−ホスフェートのナトリウム塩（実施例１０；以下２２：６−Ｏ−ｃＰＡと略）を用いて実施例１と同様にして細胞培養し、ヒアロン酸産生能の評価を行った。
【００６７】
比較例１
（１）ヒアルロン酸産生能の評価
（２−１）細胞培養：リゾホスファチジン酸環状リン酸エステルを用いない以外は実施例１と同様にして培養を行い、所定時間に培養液を得た。
（２−２）サンドイッチＥＬＩＳＡによるヒアルロン酸の定量： 実施例１と同様にして培地中のヒアルロン酸を測定した。その結果を表２に示す。
【００６８】
比較例２
リゾホスファチジン酸として１−Ｏ−オクタデセノイル−ｓｎ−グリセロール３−フォスフォニックアシド（以下１８：１−ＬＰＡと略）のナトリウム塩（シグマ社製）を用いて、ヒアルロン酸産生能の評価を行った。
（２）ヒアルロン酸産生能の評価
（２−１）細胞培養：リゾホスファチジン酸として１０μＭの１８：１−ＬＰＡを用いた以外は実施例１と同様にして培養を行い、所定時間に培養液を得た。
（２−２）サンドイッチＥＬＩＳＡによるヒアルロン酸の定量を実施例１と同様にして培地中のヒアルロン酸を測定した。その結果を表２に示す。
【００６９】
比較例３
ヒアルロン酸産生を著しく亢進することが知られている成長因子として塩基性線維芽細胞成長因子（シグマ社製）を用いて、ヒアルロン酸産生能の評価を行った。
（２）ヒアルロン酸産生能の評価
（２−１）細胞培養は産生促進因子として塩基性線維芽細胞成長因子１０ｎｇ／ｍｌを用いた以外は実施例１と同様にして培養を行い、所定時間に培養液を得た。
（２−２）サンドイッチＥＬＩＳＡによるヒアルロン酸の定量を実施例１と同様にして培地中のヒアルロン酸を測定した。その結果を表２に示す。
【００７０】
【表２】
なお、表２の（ ）内の数値は、比較例１の４８時間培養後のヒアルロン酸産生量を１．０とした時の倍率である。
以上の結果、表２より１−Ｏ−アシル−グリセロ−２，３−ホスフェート類および１−Ｏ−アルキル−グリセロ−２，３−ホスフェート類によりヒアルロン酸量産生が著しく促進されたことがわかる。また、４８時間後の数値より、このヒアルロン酸の蓄積量はヒアルロン酸の合成促進作用が知られるＬＰＡやｂＦＧＦと比較しても２倍近いヒアルロン酸の蓄積が認められ、著しい効果があることがわかる。
以上の結果をグラフ化したのが、図１、２である。
図１および２の縦軸はヒアルロン酸産生量、横軸はサンプリングした時間を示す。
図１および２より、各種のｃＰＡを用いた実施例１〜１０は、比較例１〜３に比べて、ヒアルロン酸産生量が著しく高くなることがわかる。
【００７２】
（ＩＩ）デキサメタゾンのヒアルロン酸産生抑制に対するリゾホスファチジン酸環状リン酸エステルの回復効果
実施例１１
（１）ヒアルロン酸産生能の評価
（１−１）細胞培養：デキサメタゾンのヒアルロン酸合成抑制に対するリゾホスファチジン酸環状リン酸エステル（ｃＰＡ）の回復効果を確認するためＤＭＥＭ−０．５％ ＦＣＳに培地交換した後に０、１、１０ｎＭのデキサメタゾンとリゾホスファチジン酸環状リン酸エステルとして実施例３で用いたＣ１８：１−ｃＰＡを１００μＭで共存させた以外は実施例１と同様にして培養を行い、２４時間目に培養液を得た。
（１−２）サンドイッチＥＬＩＳＡによるヒアルロン酸の定量：実施例１の（２−２）と同様に実施した。
【００７３】
比較例４
１）ヒアルロン酸産生能の評価
（１−１）細胞培養：リゾホスファチジン酸環状リン酸エステルを用いない以外は、実施例１１と同様にして培養を行い、２４時間目に培養液を得た。
（１−２）サンドイッチＥＬＩＳＡによるヒアルロン酸の定量：実施例１の（２−２）と同様に実施し、得られた測定結果を表３に示す。
なおこの数値を図３に示す。ここで、縦軸はヒアルロン酸産生量、横軸はデキサメタゾン量を示す。−（黒塗り四角印）−は、Ｃ１８：１−ｃＰＡを１００μＭの共存の実施例１１の場合、−□(白抜き四角印）−は、デキサメタゾンのみの場合である。
【００７４】
【表３】
なお、表３の（ ）内の数値は、比較例４のデキサメタゾン添加なしの時のヒアルロン酸産生量を１．００とした時の倍率である。
以上の結果、表３の比較例４のヒアルロン酸産生量がデキサメタゾン１０ｎＭ添加ではブランクの０．７２倍に抑制されたことがわかる。また、ヒアルロン酸産生がリゾホスファチジン酸環状エステルの共存している系（デキサメタゾン１ｎＭ共存）である実施例１１の２４時間後のデータでは、デキサメタゾンを加えていない比較例４のブランクに比べて１．１６倍（デキサメタゾン１ｎＭ共存）、１．１８倍（デキサメタゾン１０ｎＭ共存）になっており、デキサメタゾンによるヒアルロン酸の産生抑制を改善していることがわかる。
【００７６】
（ＩＩＩ）塩基性線維芽細胞成長因子との相乗効果の確認
実施例１２
（１−１）細胞培養：細胞培養：ＤＭＥＭ−０.５％ＦＣＳに培地交換した後に塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）０、１、１０ｎｇ／ｍｌ共存下にリゾホスファチジン酸環状リン酸エステルとして実施例３で用いた１８：１−ｃＰＡを１０μＭ加えた以外は実施例１の（２）と同様に培養した。
（１−２）サンドイッチＥＬＩＳＡによるヒアルロン酸の定量：実施例１の（２）と同様に実施した。測定結果を表４に示す。
【００７７】
比較例５
（１−１）細胞培養：細胞培養：ＤＭＥＭ−０.５％ ＦＣＳに培地交換した後にリゾホスファチジン酸環状リン酸エステルを加えず塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）０、１、１０ ｎｇ／ｍｌを単独で添加した以外は実施例１２と同様に培養した。
（１−２）サンドイッチＥＬＩＳＡによるヒアルロン酸の定量：実施例１の（２）と同様に実施した。測定結果を表４に示す。なおこの数値を図４に示す。ここで、縦軸はヒアルロン酸産生量、横軸はｂＦＧＦ量を示す。
【００７８】
【表４】
なお、表４の（ ）内の数値は、比較例５のｂＦＧＦ添加なしの時のヒアルロン酸産生量を１．００とした時の倍率である。
以上の結果、ｂＦＧＦ単独で１０ｎｇ／ｍｌ添加した場合のヒアルロン酸の産生量が２２１４ｎｇ／ｍｌ（無添加時に比較して１．６５倍）であるのに対して、また、ｃＰＡ単独の場合のヒアルロン酸の産生量が、１８０７ｎｇ／ｍｌ（実施例１１のｂＦＧＦ ０）に対して、ｃＰＡを共存させた実施例１２のｂＦＧＦ１ｎｇ／ｍｌでは産生量が３２７５ｎｇ／ｍｌ（２．４４倍）、ｂＦＧＦ １０ｎｇ／ｍｌでは産生量が３７４１ｎｇ／ｍｌ（２．７９倍）と２倍を上回っており相乗的に亢進していることがわかる。
【００８０】
（ＩＶ）リゾホスファチジン酸環状リン酸エステル（ｃＰＡ）によるヒアルロン酸合成酵素発現の誘導
実施例１３
（１−１）細胞培養：ヒアルロン酸合成酵素（ＨＡＳ２）発現の評価にも上述のＮＢ１ＲＧＢ細胞を使用した。牛胎児血清（ＦＣＳ）を１０％添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用い、直径９ｃｍのシャーレ中でコンフルーエントになるまで培養後、ＤＭＥＭ−０．５％ＦＣＳに培地交換後さらに１日培養した。リゾホスファチジン酸環状リン酸エステルとして実施例３で用いた１８：１−ｃＰＡを培地中濃度が２５μＭとなるように添加し、８時間培養を継続した。
（１−２）ＲＴ−ＰＣＲ法によるヒアルロン酸合成酵素発現量の半定量：培養液を吸引除去後、商品名アイソジェン（ニッポンジーン社製）２ｍｌを添加し、添付プロトコールにしたがって全ＲＮＡ画分を回収した。このＲＮＡを０．２〜２０μｇ／μｌとなるように希釈、調製済みＲＴ−ＰＣＲ試薬（商品名 Ｒｅａｄｙ・Ｔｏ・Ｇｏ、アマシャムファルマシアバイオテク社製）用いて５'−ＴＣＧＣＴＴＣＧＴＡＧＧＴＣＡＴＣＣＡＣ−３'および５'−ＡＴＧＴＡＣＡＣＡＧＣＣＴＴＣＡＧＡＧＣ−３'をＨＡＳ２のプライマー、５'−ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ−３'および５'−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３'をハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨのプライマーとして抽出した全ＲＮＡ中の目的遺伝子産物の増幅を行った。ＲＴ−ＰＣＲの反応条件：４２℃で３０分逆転写反応後、９５℃、５分加温して一旦反応停止し、９５℃で１分、５５℃で１分、７２℃で１分の増幅操作を３５回くり返し、最後に７２℃で１０分処理した。このＰＣＲ反応産物を分析するため、反応液を正確に１μｌとり、エチジウムブロミド含有２％アガロース電気泳動にかけた。ＵＶトランスイルミネータで泳動後のパターンを検出した結果を図５に示す。
【００８１】
比較例６
（１−１）細胞培養：培地に１８：１−ｃＰＡを添加しない以外は実施例１３と同様に培養した。
（１−２）ＲＴ−ＰＣＲ法によるヒアルロン酸合成酵素発現量の半定量：実施例１３と同様に半定量を行った。ＵＶトランスイルミネータで泳動後のパターンを検出した。結果を図５に示す。図５の右３個がＧＡＰＤＨの量についての半定量の結果であり、左３個がＨＡＳ２の量についての半定量の結果である。
【００８２】
以上の結果から、発現量が一定と考えられるグリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のバンドが一定に観察される電気泳動条件下において、１−Ｏ−オクタデケニオイルグリセロール２，３−ホスフェート（１−オレイルグリセロール２，３−ホスフェート）を用いた実施例１３では、いずれのリゾホスファチジン酸誘導体をも用いない比較例６や１−Ｏ−オクタデケニル−グリセロホスフェート（１−オレイルグリセロール３リン酸）を用いた比較例７に比べ、ヒアルロン酸合成酵素２（ＨＡＳ２）のバンドが濃く観察されることからその発現がより強力に亢進していることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 リゾホスファチジン酸環状リン酸エステルアシル誘導体によるヒアルロン酸合成促進効果を示す図である。
【図２】 リゾホスファチジン環状リン酸エステルアルキル誘導体によるヒアルロン酸合成促進効果を示す図である。
【図３】 デキサメタゾンのヒアルロン酸合成抑制に対する回復効果を示す図である。
【図４】 ｂＦＧＦとの相乗効果を示す図である。
【図５】 ヒアルロン酸合成酵素２の発現亢進効果を示す図である。
Claims (5)
- 下記式［Ｉ］
- 下記式［Ｉ］
- 組成物１００ｇ当り、下記式［Ｉ］
- 皮膚萎縮改善用である請求項３記載の皮膚外用組成物。
- 皮膚の瘢痕形成防止用である請求項３記載の皮膚外用組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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