JP5978699B2

JP5978699B2 - マトリックスメタロプロテアーゼ−２阻害剤およびそれを含有する皮膚外用剤

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Inventors: 伸二林; 幸二飯盛
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Description

本発明は、特定の植物抽出物（ネコノヒゲ抽出物）からなるマトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）阻害剤に関する。さらに、前記ＭＭＰ−２阻害剤と特定の物質を含有し、肌の弾力・張りの向上作用、シワ改善作用、肌荒れ改善作用、毛穴収縮作用、肌のキメを整える作用および化粧のりを改善する作用にも優れている皮膚外用剤に関する。

皮膚は繊維性タンパク質（Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、エラスチン等）や、非繊維性タンパク質（ＩＶ型コラーゲン、ＶＩＩ型コラーゲン等）、細胞接着性タンパク質（グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニン等）など多くの種類の細胞外マトリックスを含んでいる。例えば、皮膚の真皮にはＩ型コラーゲンが非常に多く含まれ皮膚の強さを生み出し、皮膚の基底膜にはＩＶ型コラーゲンが多く含まれ平面的な網目状のネットワークを形成し基底膜の構造を支えている。

これら細胞外マトリックスを分解するプロテアーゼ群として構造中に金属原子を持ったマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）群があり、基質タンパク質の種類の違いによって多くの種類のＭＭＰが知られている。ＭＭＰは単に細胞外マトリックスを分解するにとどまらず、サイトカインなどの生理活性ペプチドの活性化、骨リモデリングや創傷治癒などの生理現象、慢性関節リウマチや変形性関節症などの関節疾患、炎症や癌の進行などの病的過程にも関与している。

ＭＭＰ群の中でもマトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）は、皮膚の表皮と真皮の境に位置する基底膜の成分であるＩＶ型コラーゲンやラミニン、および真皮細胞外マトリックス成分のエラスチンを分解する。ＩＶ型コラーゲンやラミニンはプロテオグリカン等と共同で網目構造を構築し皮膚の基底膜を形成していることから、ＭＭＰ−２の作用によりこれら基底膜成分が分解されると、基底膜の立体構造を構築している組織の細網線維が破壊され、表皮と真皮との間の情報伝達に支障をきたし、表皮環境が悪化することで肌の外観に悪影響が表れ、肌荒れやシワ等の肌老化が引き起こされる。また、エラスチンは真皮に含まれる弾力線維で、ＭＭＰ−２の作用によりエラスチンが分解されると真皮の形態的機能の喪失つまりは肌の張りや弾力性が失われ、シワの発生につながる。

ところで、ＭＭＰ−２は、紫外線への曝露（非特許文献１参照）や活性酸素への曝露（非特許文献２参照）によってその遺伝子発現が増加すること、さらに、加齢による更年期時の女性ホルモンの急激な減少によっても皮膚中のＭＭＰ−２が増加する（非特許文献３参照）ことが明らかとなっている。したがって、ＭＭＰ−２阻害剤は種々の細胞外マトリックスの減少を抑制し、肌の弾力・張りの向上、シワや肌荒れの防止・改善につながると考えられている。

一方、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）は真皮結合組織の主要な線維成分であるＩ型コラーゲンを主に分解する酵素である。Ｉ型コラーゲンは加齢とともにヒスチジノヒドロキシリジノノルロイシンのようないわゆる老化架橋が形成されるため、ＭＭＰ−１はコラーゲンの分解と合成による代謝回転を回すために働いていると考えられている。

そこで、本発明者らは、ＭＭＰ群の中でもＭＭＰ−２の阻害作用を有する薬剤の開発を行ってきた。従来のＭＭＰ−２阻害剤としては、例えば、クスノハガシワ抽出物やオニイチゴ抽出物（特許文献１参照）などの植物抽出物が提案されているが、上述のように紫外線、活性酸素および加齢等による複雑に絡み合った要因によって増加したＭＭＰ−２活性を阻害するには十分満足がいくような効果は得られておらず、十分な効果を得るべく配合量を増量すれば製剤の安定性が悪くなることがあった。さらに、皮膚にシワが発生する原因は細胞外マトリックスの分解だけでなく、例えば、角質層の乾燥により皮膚の弾力性が失われて生じる乾燥ジワや繰返し同じ表情をすることにより固定化して生じる表情ジワ等があり、これら特許文献に記載の植物抽出物によるＭＭＰ−２阻害剤を配合した皮膚外用剤を皮膚に適用しても、使用者が感じるシワの改善効果は必ずしも十分に満足がいくものではなかった。

特開２００６−１１７５９２号公報

Nature, 379, 25, 335-339, 1996年 Arch. Dermatol. Res., 288, 39, 1996年日本皮膚科学会雑誌、111、3、532、2001年

本発明はこのような状況下においてなされたもので、紫外線や活性酸素への曝露および加齢によりＭＭＰ−２活性が亢進することで生じる肌の弾力・張りの低下、シワおよび肌荒れ等の肌老化を予防・改善するためのＭＭＰ−２阻害剤を提供することを目的とする。

肌のキメとは肌表面を拡大して観察した場合、縦横斜めに走っている溝（皮溝）とその皮溝に囲まれた丘（皮丘）のことで、肌のキメが良好な状態とはその皮溝皮丘が細かく整っている状態をいい、透明感のある綺麗な肌に影響する。肌のキメは加齢によって失われていく上に、肌荒れによっても悪化する。また、肌のキメの悪化は長期的にはシワの形成を促し、化粧のりを悪くさせると考えられている。肌のキメを改善するにはグリセリンなどの低分子水溶性化合物やヒアルロン酸などの高分子水溶性化合物からなる保湿剤の適用が考えられるが、加齢によって失われた肌のキメまで回復させるのに十分な効果が得られていなかった。本発明は、肌のキメを整え、肌の化粧のりを改善する作用を有する皮膚外用剤を提供することを目的とする。

このような状況を鑑みて、本発明者らは、様々な植物抽出物についてＭＭＰ−２の阻害作用を調べた結果、シソ科ネコノヒゲの抽出物が顕著なＭＭＰ−２阻害作用を有することを見出した。さらに、該ＭＭＰ−２阻害剤による肌の弾力・張りの向上作用、シワ改善作用および肌荒れ改善を期待した皮膚外用剤を鋭意研究していた中で、意外にも、ネコノヒゲ抽出物からなるＭＭＰ−２阻害剤に式［Ｉ］で表される１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸誘導体を組み合わせて配合した皮膚外用剤は肌の弾力・張りの向上作用、シワ改善作用および肌荒れ改善作用が増強され、その上、毛穴収縮作用、肌のキメを整える作用および肌の化粧のりを改善する作用にも優れていることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち本発明は、
［１］シソ科ネコノヒゲの抽出物からなるマトリックスメタロプロテアーゼ−２阻害剤、
［２］（Ａ）［１］に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−２阻害剤を０．００１〜１質量％、および
（Ｂ）式［Ｉ］：

（式中、Ｒは炭素数８〜２２のアシル基を表す。Ｍは水素原子、アルカリ金属、アンモニウムまたは有機アンモニウムを表す）
で表される１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸誘導体を０．００１〜１０質量％含有することを特徴とする皮膚外用剤、
［３］肌の弾力・張りの向上用、シワの改善用、肌荒れ改善用あるいは皮膚の老化の予防または改善用である［２］記載の皮膚外用剤、
［４］毛穴収縮用、肌のキメを整えるためまたは肌の化粧のりの改善用である、［２］記載の皮膚外用剤、
である。

本発明のＭＭＰ−２阻害剤によれば、肌の弾力・張りの向上作用、シワ改善作用および肌荒れ改善作用が得られる。さらに、該ＭＭＰ−２阻害剤と特定の成分を含有することで、肌の弾力・張りの向上作用、シワ改善作用および肌荒れ改善作用が増強され、毛穴収縮作用、肌のキメを整える作用および化粧のりを改善する作用にも優れている皮膚外用剤を提供することができる。

以下、本発明の実施形態を説明する。本発明のＭＭＰ−２阻害剤は、ネコノヒゲ抽出物からなる。まず、ネコノヒゲ抽出物について説明する。

本発明に使用されるネコノヒゲは、シソ科の植物で学名はOrthosiphon aristatus (Blume) Miq.またはOrthosiphon stamineus Benth.で示される。ネコノヒゲの原産地はインドからマレーシアで、日本では沖縄で栽培されている。日本では、和名であるネコノヒゲよりもマレー語に由来する名称であるクミスクチンの方がよく知られている。

本発明に使用されるネコノヒゲは、また、上記Orthosiphon aristatus (Blume) Miq.またはOrthosiphon stamineus Benth.以外のシソ科ネコノヒゲ属(Orthosiphon属)の植物であって、抽出物がＭＭＰ−２阻害活性を有する植物であり得る。

ネコノヒゲの使用部位は植物全体を使用することができるが、特に収穫が容易な地上部が好ましい。収穫したネコノヒゲは乾燥してから使用する。また、ネコノヒゲは細断して使用することもできる。抽出工程は乾燥した植物体を特定の抽出溶媒に浸漬することで行われる。抽出に用いられる溶媒としては、炭化水素、エステル、ケトン、エーテル、ハロゲン化炭化水素、水溶性のアルコール類および水などがあげられる。中でも好ましくは水、低級アルコール、多価アルコールの１種または２種以上を用いて得られる抽出物であり、更に好ましくは水、エタノール、１，３−ブチレングリコールの１種または２種以上を用いて得られる抽出物である。抽出方法は、ネコノヒゲに抽出溶媒を加えて１時間以上浸漬し、ろ過することで抽出液を得ることができる。得られた抽出液は、そのまま用いてもよく、あるいは溶媒留去により濃縮したり、カラムクロマトグラフィーや溶媒分画等の処理により精製したりしてもよい。

ネコノヒゲ抽出物は、例えば特開２００７−３２０８６２号公報に記載された方法により製造することができる。ネコノヒゲ抽出物のより具体的な製造方法としては、以下のような方法が挙げられる。

上記ネコノヒゲ抽出物の抽出方法は、例えば、ネコノヒゲを１，３−ブチレングリコールを５０〜７０質量％含む水溶液に浸漬して抽出する工程、得られる抽出物をろ過する工程、および得られるろ液を０〜−５０℃にて４日間以上静置した後、さらにろ過する工程を包含する。

ネコノヒゲの使用部位は、特に制限されず、葉、茎、花、根などの各部分、または植物全体、あるいは培養細胞、培養組織、培養器官、再生植物体等を使用することができる。また当該使用部位は、本発明のＭＭＰ−２阻害剤の効果を妨げない限り、突然変異体または形質転換体由来のものであってもよい。収穫が容易な点から、地上部が特に好適に使用される。収穫したネコノヒゲは、通常、乾燥してから使用する。乾燥後、必要に応じて、当業者が通常用いる方法により粉砕してから使用してもよい。

上記ネコノヒゲを、１，３−ブチレングリコールを５０〜７０質量％含む水溶液（以下、単にブチレングリコール含有水溶液という）に浸漬して抽出する。上記水溶液中の１，３−ブチレングリコールの含有量は、好ましくは５５〜６５質量％である。１，３−ブチレングリコールの含有量が５０質量％未満の場合、あるいは７０質量％を超える場合、得られる抽出液は安定性が悪く、沈殿物を生じ易くなる。

上記ブチレングリコール含有水溶液の使用量は、ネコノヒゲを完全に浸漬できる量であればよく、特に制限されない。通常、ネコノヒゲの乾燥質量の５〜５０倍量である。

抽出条件は、ネコノヒゲから十分に成分が抽出される条件であればよい。通常、常温、例えば、１５〜２５℃にて２日間以上、好ましくは４〜７日間に設定される。

上記抽出により得られる抽出物を、次いでろ過する。ろ過により植物体残渣などの固形分が除去され、ろ液が回収される。上記ろ紙としては、公知のものを用いることができる。ろ紙の素材は特に限定されないが、セルロース、ガラス繊維、フッ素樹脂、シリカ繊維等からなるものを用いることができ、セルロースが好ましい。具体的には例えば、湿潤強度を高めたろ紙（５Ｃろ紙、ウェットストレングスろ紙（アドバンテック東洋社製））等が挙げられる。上記ろ紙の保留粒子径は、生体試料中の異物を除去するため、３μｍ以下であることが好ましい。

次いで、上記ろ液を０〜−５０℃にて４日間以上、好ましくは４〜１０日間静置する。この静置保存温度および静置保存期間は、一般に静置保存温度に応じて、静置保存期間を適宜設定すればよい。即ち静置保存温度が高ければ静置保存期間を長く設定し、静置保存温度が低ければ静置保存期間を短く設定すればよい。例えば、０℃の場合、７〜１０日間が好ましく、−５０℃の場合、４〜５日間が好ましい。より好ましくは−５〜−２０℃にて６〜７日間である。この０〜−５０℃にて４日間以上静置する処理によって、ろ液中に沈殿物（澱）が生じる。この沈殿物（澱）をろ過により除去することによって、所望のネコノヒゲ抽出液が得られる。

上記静置保存温度が０℃を超える場合、長期間静置して生じる沈殿物をろ過により除去したとしても、得られる抽出液にさらに沈殿を生じる場合があり、所望の抽出液が得られない場合がある。−５０℃より低い場合、静置中にろ液が凍結する場合があり、所望の抽出液が得られない場合がある。そして静置保存期間が４日未満の場合、さらにろ過して得られる抽出液において沈殿物の発生が認められる。

「ＭＭＰ−２」はマトリックスメタロプロテアーゼのアイソザイムであり、そのアミノ酸配列等も公知である。本発明の阻害剤によって阻害されるＭＭＰ−２は、通常ヒト由来である。「ヒト由来」とは、ＭＭＰ−２のアミノ酸配列がヒトの配列であることを意味する。ヒト以外の生物（例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等の哺乳動物）のＭＭＰ−２も本発明の阻害剤によって阻害される。

本発明のＭＭＰ−２阻害剤の阻害効果は、公知のＭＭＰ−２活性測定法によって確認することができる。具体的には、ＭＭＰ−２を含む生体組織・細胞等あるいはそれらを培養した培養液から電気泳動またはクロマトグラフィー等によって部分精製または単離したＭＭＰ−２を、基質であるＩＶ型コラーゲンやゼラチン等と反応させる際、反応系に本発明のＭＭＰ−２阻害剤を添加して活性測定し、本発明のＭＭＰ−２阻害剤を添加しないコントロール反応系における活性レベルと比較することにより、確認することができる。

本発明のＭＭＰ−２阻害剤は、肌の弾力・張りの向上、シワ改善、肌荒れの改善、皮膚の老化を防止・改善すること、あるいは、ＭＭＰ−２活性が亢進している疾患や症状を予防・改善することを目的として、医薬品、医薬部外品、化粧品および食品に配合することができる。

本発明の皮膚外用剤は、（Ａ）ネコノヒゲ抽出物からなるＭＭＰ−２阻害剤、および（Ｂ）１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸誘導体を含有することを特徴とする。ここで、（Ｂ）成分の１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸誘導体について説明する。

本発明に使用される（Ｂ）成分は、式［Ｉ］：

で表される１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸誘導体である。式［Ｉ］においてＲはアシル基であり、好ましくは、炭素数８〜２２の直鎖状もしくは分岐鎖状の脂肪酸のアシル基である。脂肪酸としては、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸等の飽和脂肪酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸等の不飽和脂肪酸、およびこれらの混合物であるヤシ油脂肪酸、パーム核油脂肪酸、牛脂脂肪酸、硬化牛脂脂肪酸、大豆リン脂質由来脂肪酸、卵黄リン脂質由来脂肪酸のアシル基が挙げられる。

式［Ｉ］中のＭは、水素原子、アルカリ金属、アンモニウムまたは有機アンモニウムを表す。前記アルカリ金属としては、例えば、ナトリウム、カリウムが挙げられる。前記有機アンモニウムとしては、例えば、ブチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、テトラメチルアンモニウムが挙げられる。

式［Ｉ］の１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸誘導体の製造方法は特に限定されない。例えば、リゾホスファチジルコリンやリゾホスファチジン酸等のリゾリン脂質をホスホリパーゼＤで酵素処理する方法や、特開平６−２２８１６９号公報に記載されているように化学合成して得る方法が示されている。また、商業的には、式［Ｉ］のＲが大豆リン脂質由来脂肪酸のアシル基、Ｍが水素原子とした、１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸（日油株式会社製「ＣｙＰＡ−ＥＴ」）を入手することができる。

本発明の皮膚外用剤は、上記の（Ａ）シソ科ネコノヒゲ抽出物からなるＭＭＰ−２阻害剤を０．００１〜１質量％(好ましくは０．０５〜０．２質量％、より好ましくは０．１〜０．２質量％）、式［Ｉ］で表される１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸誘導体を０．００１〜１０質量％(好ましくは０．１〜０．４質量％、より好ましくは０．１〜０．２質量％）含有するものである。本発明の皮膚外用剤にネコノヒゲ抽出物を配合する場合、０．００１質量％未満の配合量では十分な効果が得られず、１質量％を越えた配合量では効果の増強は得られず経済的に不利である上に、組成物の安定性を低下させる。なお、本発明におけるネコノヒゲ抽出物の質量は、抽出溶媒を除去した固形分の質量を意味する。

また、本発明の皮膚外用剤に式［Ｉ］で表される１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸誘導体を配合する場合、０．００１質量％未満の配合量では十分な効果が得られず、１０質量％を越えた配合量では効果の増強は得られず経済的に不利である上に、組成物の安定性を低下させる。

上記の通り、本発明のＭＭＰ−２阻害剤は、特に皮膚外用剤に配合して好適に使用でき、肌の弾力・張りの低下、シワおよび肌荒れ等の肌老化を予防・改善し、更に毛穴収縮作用、肌のキメを整える作用および肌の化粧のりを改善する作用をも有する化粧料、医薬品等の皮膚外用剤を構成し得る。

なお、本発明の皮膚外用剤においては、化粧料や医薬品等の皮膚外用剤に常用されている添加剤を本発明の性能を損なわない範囲で配合することも可能である。例えば、流動パラフィン、流動イソパラフィン、スクワラン、ワセリン、固形パラフィン等の炭化水素系油、牛脂、豚脂、魚油等の天然油脂、エステル油、ロウ、直鎖および環状のジメチルポリシロキサン、ポリエーテル変性ジメチルポリシロキサン、アミノ変性ジメチルポリシロキサン等のシリコーン誘導体、セラミド、コレステロール、蛋白誘導体、ラノリン、ラノリン誘導体、レシチン等の油性基剤；ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリプロピレングリコール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ひまし油、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、グリセリンモノ脂肪酸エステル、アルキルポリグルコシド、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマー、アルカノールアミド等の非イオン性界面活性剤；せっけん、アルキル硫酸エステル塩、アルキルエーテル硫酸エステル塩、α−オレフィンスルホン酸塩、アシルメチルタウリン塩、アシルグルタミン酸塩、アシルグリシン塩、アシルザルコシン塩、アシルイセチオン酸塩、アルキルエーテルカルボン酸塩、アミドエーテル硫酸エステル塩、アルキル燐酸エステル塩等の陰イオン性界面活性剤；アルキルジメチルアミノ酢酸ベタイン、アミドプロピルジメチルアミノ酢酸ベタイン、アミドアミノ酸塩、アルキルイミノジ酢酸塩等の両性界面活性剤；アルキルアミンオキシド、ポリオキシエチレンアルキルアミンオキシド等の半極性界面活性剤、塩化アルキルトリメチルアンモニウム、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム等の陽イオン性界面活性剤；アルキルアミン、アミドアミン等の塩酸塩または酢酸塩；無機顔料、パール顔料、金属粉末顔料、有機顔料、ジルコニウム等の顔料；クロロフィル、β−カロチン等の天然色素、アルギン酸、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、キサンタンガム、ヒアルロン酸等の水溶性高分子；硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ピロリドンカルボン酸ナトリウム等の無機塩または有機塩；ｐＨ調製剤である酸およびアルカリ；殺菌剤、キレート剤、抗酸化剤、抗炎症剤、紫外線吸収剤、動植物由来の天然エキス、香料等を配合できる。

本発明の皮膚外用剤の剤型は特に限定されず、例えば、溶液、乳液、分散液、ジェル、クリーム、軟膏などの任意の剤型を採ることができる。また、その製法は各剤型での定法に従えばよい。

本発明の皮膚外用剤の投与量は、活性成分であるネコノヒゲ抽出物の種類および使用量、使用者の体重、肌、体調の状態などに応じて適宜設定することができ、適量を患部に１日あたり１回〜数回適用することができる。本発明における成分の成人への１回の適用量としては、固形分の質量にして１μｇ〜５０ｍｇ／ｃｍ^２程度を投与することができ、好ましくは２μｇ〜１０ｍｇ／ｃｍ^２程度を投与することができる。

本発明の皮膚外用剤の使用期間は特に限定されないが、例えば１週間以上、好ましくは２週間以上、より好ましくは３週間以上、更により好ましくは４週間以上である。

本発明の皮膚外用剤の適用対象は特に限定されないが、通常はヒトであり、他の投与対象としては、例えばラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等の非ヒト哺乳動物が挙げられる。

本発明の皮膚外用剤は、肌の弾力・張りの向上用、シワの改善用、肌荒れ改善用、皮膚の老化の予防・改善用、毛穴収縮用、肌のキメを整えるため、または肌の化粧のり改善用の化粧料、医薬品、医薬部外品として有用である。

実施例によって本発明を更に詳細に説明する。まずは、ＭＭＰ−２阻害剤の実施例１と比較例１および２の調製方法とＭＭＰ−２活性阻害効果試験を以下に説明する。

実施例１（ＭＭＰ−２阻害剤）
ネコノヒゲの地上部を乾燥、細断したもの１００ｇを抽出溶媒である６０質量％の１，３−ブチレングリコール水溶液１０００ｇに室温で５日間浸漬した後、ろ紙（アドバンテック東洋社製、５Ｃ）を用いてろ過し、ろ液を得た。このろ液を−２０℃にて７日間静置保存した後、さらに５Ｃろ紙を用いてろ過してネコノヒゲ抽出液を得た。このネコノヒゲ抽出液中の抽出溶媒を除いた固形分の含有量は２．０質量％であり、これを６０質量％の１，３−ブチレングリコール水溶液で希釈して固形分を１．０質量％に調整したものをネコノヒゲ抽出物として試験に用いた。

比較例１
クスノハガシワの樹皮を乾燥、細断したもの１００ｇを抽出溶媒である６０質量％の１，３−ブチレングリコール水溶液１０００ｇに室温で５日間浸漬した後、ろ紙（アドバンテック東洋社製、５Ｃ）を用いてろ過し、ろ液を得た。このろ液を−２０℃にて７日間静置保存した後、さらに５Ｃろ紙を用いてろ過してクスノハガシワ抽出液を得た。このクスノハガシワ抽出液中の抽出溶媒を除いた固形分の含有量は１．２質量％であり、これを６０質量％の１，３−ブチレングリコール水溶液で希釈して固形分を１．０質量％に調整したものをクスノハガシワ抽出物として試験に用いた。

比較例２
オニイチゴの根を乾燥、細断したもの１００ｇを抽出溶媒である６０質量％の１，３−ブチレングリコール水溶液１０００ｇに室温で５日間浸漬した後、ろ紙（アドバンテック東洋社製、５Ｃ）を用いてろ過し、ろ液を得た。このろ液を−２０℃にて７日間静置保存した後、さらに５Ｃろ紙を用いてろ過してオニイチゴ抽出液を得た。このオニイチゴ抽出液中の抽出溶媒を除いた固形分の含有量は２．４質量％であり、これを６０質量％の１，３−ブチレングリコール水溶液で希釈して固形分を１．０質量％に調整したものをオニイチゴ抽出物として試験に用いた。

〔ＭＭＰ−２活性阻害効果試験〕
ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ株）を１０ｃｍ径の培養皿に、培地としてダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）に牛胎児血清（ＦＢＳ）を終濃度１０％になるように添加し、さらに終濃度１００Ｕ／ｍＬのペニシリン・ストレプトマイシンを添加したものを使用し、３７℃、５％炭酸ガス下で培養した。細胞がコンフルエント状態になったところで、低血清培地（１％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ）に置換し、２４時間培養した後、培養液を回収した。その培養液を遠心分離（８００ｒｐｍ、５℃、５分）した後の上清液に５倍濃度のサンプルバッファー（５ｍＬの０．５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ６．８］に１ｇのＳＤＳ、５ｍｇのブロモフェノールブルー、５ｍＬのグリセロールを加えた液）を５：１の容量比で添加したものをＭＭＰ−２酵素液とし、ゼラチンザイモグラフイ一法によりＭＭＰ−２活性阻害率を測定した。すなわち、０．２％ゼラチンを含むＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（分離ゲル：１０％Ｔ、２．７％Ｃ、ｐＨ８．８；濃縮ゲル：５％Ｔ、２．７％Ｃ、ｐＨ６．８）を調製し、上記ＭＭＰ−２酵素液２０μＬをゲルの各レーンにアプライし、電気泳動を行った。泳動後のゲルを２．５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００で３時間洗浄した後、各レーンを短冊状に切断したゲルを所定濃度（０．１、０．３、１．０ｍｇ／ｍＬ）になるように試料を添加した各インキュベーションバッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ、５ｍＭＣａＣｌ_２、５μＭＺｎＣｌ_２、ｐＨ８．０）に浸し、３７℃で１晩インキュベーションした。ゲルを精製水で洗浄し、ＣＢＢ溶液（０．２５％クーマジーブリリアントブルー、４０％メタノール、１０％酢酸）に３０分間浸して染色した後、脱色液（１０％メタノール、１０％酢酸）にて透明な６２ｋＤに相当するバンドが現れるまで洗浄した。ゲルの脱色後に観察される透明なバンドはＭＭＰ−２のゼラチン分解活性と一致する。この透明なバンドをスキャナでパソコンに取り込み、定量的画像解析法（ＩｍａｇｅＪ）により定量化した。試料無添加の反応系（コントロール）でのバンドの値に対する、試料添加の反応系でのバンドの減少値を求め、各試料のＭＭＰ−２活性阻害率（％）を算出した。結果を表１に示した。ＭＭＰ−２阻害作用の効力評価をＭＭＰ−２活性阻害率７５％以上を「◎」、５０％以上７５％未満を「○」、２５％以上５０％未満を「△」、そして２５％未満を「×」と評価し、表１に記載した。

表１の結果から明らかなように、ネコノヒゲ抽出物（実施例１）はクスノハガシワ抽出物（比較例１）オニイチゴ抽出物（比較例２）よりもＭＭＰ−２活性阻害効果が優れていた。

次に、本発明の皮膚外用剤の評価試験について以下に説明する。

〔皮膚外用剤の評価試験〕
実施例２、３および比較例３〜５
表２に示す化粧水（皮膚外用剤）を調製し、男女１０人（３９〜４８才）を対象に４週間の使用試験を行った。使用後に下記の５項目の評価項目について被験者にアンケート調査を行った。その評価結果を表２に示した。

（１）肌の弾力・張りの向上効果
使用後の肌の弾力・張りについて使用前と比較して下記のように評価点を被験者に自己採点してもらい、１０人の評価点の平均値を算出し、平均値１．５点以上を肌の弾力・張りの向上効果に優れた皮膚外用剤であると判定した。
２点：肌の弾力・張りが明らかに向上したと感じた場合。
１点：肌の弾力・張りがやや向上したと感じた場合。
０点：肌の弾力・張りが変わらないあるいは後退したと感じた場合。

（２）シワ改善効果
使用後のシワについて使用前と比較して下記のように評価点を被験者に自己採点してもらい、１０人の評価点の平均値を算出し、平均値１．５点以上をシワの改善効果に優れた皮膚外用剤であると判定した。
２点：シワが明らかに少なくなったと感じた場合。
１点：シワがやや少なくなってきたと感じた場合。
０点：シワが減少しない、あるいは増えたと感じた場合。

（３）肌荒れ改善効果
使用後の肌荒れ状態について使用前と比較して下記のように評価点を被験者に自己採点してもらい、１０人の評価点の平均値を算出し、平均値１．５点以上を肌荒れ改善効果に優れた皮膚外用剤であると判定した。
２点：肌荒れが明らかに治ってきたと感じた場合。
１点：肌荒れがやや治ってきたと感じた場合。
０点：肌荒れ改善効果が全く見られないと感じた場合。

（４）毛穴収縮効果
使用後の毛穴収縮の程度について使用前と比較して下記のように評価点を被験者に自己採点してもらい、１０人の評価点の平均値を算出し、平均値１．５点以上を毛穴収縮効果に優れた皮膚外用剤であると判定した。
２点：毛穴のサイズが明らかに小さくなったと感じた場合。
１点：毛穴のサイズがやや小さくなったと感じた場合。
０点：毛穴のサイズに変化がない、あるいは大きくなったと感じた場合。

（５）肌のキメを整える効果
使用後の肌のキメの状態について使用前と比較して下記のように評価点を被験者に自己採点してもらい、１０人の評価点の平均値を算出し、平均値１．５点以上を肌のキメを整える効果に優れた皮膚外用剤であると判定した。
２点：肌のキメが明らかに整ってきたと感じた場合。
１点：肌のキメがやや整ってきたと感じた場合。
０点：肌のキメに変化がない、あるいは悪化したと感じた場合。

（６）化粧のりの改善効果
使用後の化粧のりについて使用前と比較して下記のように評価点を被験者に自己採点してもらい、１０人の評価点の平均値を算出し、平均値１．５点以上を化粧のりを改善する効果に優れた皮膚外用剤であると判定した。
２点：化粧のりが明らかに良くなってきたと感じた場合。
１点：化粧のりがやや良くなってきたと感じた場合。
０点：化粧のりに変化がない、あるいは悪化したと感じた場合。

実施例２および３と比較例３〜５の対比より、Ａ成分とＢ成分を併用配合した実施例２および実施例３はＢ成分単独で配合した比較例３よりも肌の弾力・張りの向上効果、シワ改善効果、肌荒れ改善効果、毛穴収縮効果、肌のキメを整える効果および化粧のりを改善する効果の全ての効果において優れていることが分かる。それらの効果は、実施例２のＡ成分とＢ成分の併用の総量と同じ量のＢ成分を単独で配合した比較例３よりも顕著に高いので、実施例２の効果はＡ成分とＢ成分の相乗効果によるものであることが分かる。さらに、実施例２は、実施例２のＡ成分をクスノハガシワ抽出物に替えた比較例４およびオニイチゴ抽出物に替えた比較例５よりも全ての効果において優れていることが分かる。

特に、実施例２および３の毛穴収縮効果、肌のキメを整える効果および化粧のりの向上効果は、比較例３〜５と比較して分かる通り、Ａ成分とＢ成分との併用により顕著な効果が得られており、これらの効果は予想もしていなかった効果である。

以下に、本発明の皮膚外用剤の処方例を実施例として記載する。

実施例４（乳液）
常法にしたがって、表３に示す組成の乳液を調製した。

実施例５（クリーム）
常法にしたがって、表４に示す組成のクリームを調製した。

本発明により提供されるＭＭＰ−２阻害剤は、医薬品、医薬部外品、化粧品および食品に配合され、好適に用いられる。本発明により提供される皮膚外用剤は、肌の弾力・張りの低下、シワおよび肌荒れ等の肌老化を予防・改善し、更に毛穴収縮作用、肌のキメを整える作用および肌の化粧のりを改善する作用をも有する化粧料、医薬品等として好適に用いられる。

Claims

（Ａ）シソ科ネコノヒゲの抽出物を０．００１〜１質量％、および（Ｂ）式［Ｉ］で表される１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸誘導体を０．００１〜１０質量％含有することを特徴とする皮膚外用剤。
（式中、Ｒは炭素数８〜２２のアシル基を表す。Ｍは水素原子、アルカリ金属、アンモニウムまたは有機アンモニウムを表す）
肌の弾力・張りの向上用、シワの改善用、肌荒れ改善用あるいは皮膚の老化の予防または改善用である請求項１記載の皮膚外用剤。
毛穴収縮用、肌のキメを整えるためまたは肌の化粧のりの改善用である、請求項１記載の皮膚外用剤。