JP6362138B2 - 皮膚外用剤、皮膚角化促進剤、タイトジャンクション強化剤、皮膚バリア機能強化剤、トランスグルタミナーゼ遺伝子発現促進剤、ロリクリン遺伝子発現促進剤、フィラグリン遺伝子発現促進剤、インボルクリン遺伝子発現促進剤、ケラチン遺伝子発現促進剤、クローディン遺伝子発現促進剤、オクルディン遺伝子発現促進剤。 - Google Patents

Description

本発明は、トランスグルタミナーゼ、ロリクリン、フィラグリン、インボルクリン、ケラチン、クローディン、オクルディンの遺伝子の産生を促進し、皮膚角化促進、タイトジャンクション強化、皮膚バリア機能強化等に有効な製剤に関する。

皮膚は体の最も外側に存在しており、細菌などの外界からの刺激に対するバリアとしての役割を有している。皮膚においては、表皮細胞が基底細胞から有棘細胞、顆粒細胞、さらには角層細胞へと約４週間かけて角化し、これらの細胞中で細胞間脂質やＮＭＦ（天然保湿因子）、さらにはコーニファイドエンベローブを形成することによってバリア機能を成し遂げている。
皮膚の加齢や外部環境の変化への不完全な角層の対応によって、シワの形成、肌理の不正常、荒れ肌等が起こるが、角層水分量の低下が重要な因子になっている。
角質の水分保持には天然保湿因子が関わっているがこの天然保湿因子の多くの部分がタンパク質の分解によって生じたアミノ酸が関わっている。
この天然保湿成分の主成分であるアミノ酸は、ケラトヒアリン顆粒に由来するフィラグリンが角質層内で分解することによって産生する。このフィラグリンは、表皮ケラチノサイトにおいてプロフィラグリンとして発現し、直ちにリン酸化し、ケラトヒアリン顆粒に蓄積する。その後脱リン酸、加水分解を経てフィラグリンへと分解され、角質層へと移行し、ケラチンフィラメントの凝集効率を高め、角質細胞の内部構築に関与する。近年、このフィラグリンが皮膚の水分保持に非常に重要かつ必要不可欠であること、及び乾燥などの条件によりフィラグリンの合成力が低下し、角質層におけるアミノ酸量が低下することが明らかになっている。
表皮細胞の角化過程において表皮顆粒層に存在するケラトヒアリン顆粒を構成するプロフィラグリンが角化する時に、脱リン酸化とプロテアーゼの作用で分解され、フィラグリンというタンパク質を遊離し、そのフィラグリンのアルギニン残基がペプチジルアルギニンデイミナーゼという酵素によってシトルリン残基になる等の修飾を受けて、フィラグリンが徐々にケラチン繊維の間からはずれ、分解されてＮＭＦ成分が作り出される。
また、フィラグリンの分解によって生じたヒスチジンからヒスチダーゼの作用によってtrans-ウロカニン酸が産生され、紫外線から皮膚を守る。
このようにフィラグリンの合成促進が角質の水分保持や紫外線からの防御機能に重要な役割を果たしている。

また、表皮は、角化細胞の分裂とその後の分化により、常に新しい角質細胞を作り出すことで、外界からの種々の刺激から皮膚を守る防御機能を有する。特に、角化細胞の分化過程において、有棘層から顆粒層にかけてインボルクリン、ケラチン、トランスグルタミナーゼ等のタンパク質が発現し、角化細胞を包み込む不溶性の細胞膜様構造体であるコーニファイドエンベロープを形成し、角質細胞の細胞骨格及び構造の安定性に寄与する。
しかし、様々な要因で表皮におけるインボルクリン、ケラチン、トランスグルタミナーゼの産生量が減少すると、コーニファイドエンベロープ形成が不完全な状態となり、角化が正常に行われなくなる。その結果、角質バリア機能及び皮膚の保湿機能が低下し、肌荒れや乾燥肌等の皮膚症状を呈するようになると考えられる。
このようなことから、角化細胞の表皮におけるインボルクリン、ケラチン、トランスグルタミナーゼの産生を高め、コーニファイドエンベロープの形成を促進して角化を正常化することによれば、乾燥や紫外線等の外部刺激に伴う皮膚バリア機能の低下を抑制し、肌の乾燥や肌荒れなど、様々な皮膚症状を予防・改善することができると考えられる。

また、ロリクリンはコーニファイドエンベロープの主要成分でありその発現はケラトヒアリン顆粒より始まり次第に周辺帯に組み込まれていく、周辺帯の構成タンパク質の重要な１つであり、天然保湿因子の形成をはじめ種々の角層機能に関わり、シワの形成、肌理の不正常、荒れ肌等の発生を抑制する。
しかし老化等によってこの角化の速度が低下すると、皮膚のくすみや肌荒れなどを引き起こすことが知られている。そのためこの角化を改善する原料や皮膚外用剤が積極的に開発されてきた。

さらに研究が進み、皮膚のバリア機能は角層のみが担っていると考えられていたのが、表皮顆粒層に存在するタイトジャンクションの構成タンパク質を遺伝子レベルで欠損させると皮膚のバリア機能が崩壊することから、近年、タイトジャンクションも皮膚のバリア機能に重要な役割を担うと考えられてきている（非特許文献１参照）。

タイトジャンクションは、細胞間結合のひとつで、密着結合あるいはタイト結合とも呼ばれ、隣り合う上皮細胞をつなぎ、細胞と細胞の隙間をシールすることで物質の透過を制御する結合装置である。したがって、クローディンやオクルディンなどのタイトジャンクション構成タンパク質が何らかの原因で減少した場合、タイトジャンクションの構造的な破壊が起こり、物質の透過バリアとして機能が低下し、乾燥肌、荒れ肌、アトピー性皮膚炎や各種感染症などの皮膚症状が引き起こされる。
クローディンやオクルディンの産生を促進することにより、タイトジャンクション機能強化し、皮膚のバリア機能及び水分保持機能を高め、乾燥肌、荒れ肌、アトピー性皮膚炎や各種感染症などの皮膚症状を予防する。
これらの用途でいくつかの物質が知られている。（特許文献１〜４参照）

psoriasin(ソラヤシン、ソリアシン、プソリアシン) は、乾癬の皮膚に過剰発現している分泌タンパク質として、最初に同定された。また、後に psoriasin は S100A7 と呼ばれ、正常な人間の表皮でケラチノサイトの細胞質に分布し、最終分化したケラチノサイトの細胞周辺部に存在していることが報告されている。ソラヤシンは乾癬のマーカーと考えられているが、アトピー性皮膚炎、菌状息肉腫、ダリエ病、炎症性硬化性萎縮性苔癬などの多くの上皮の炎症性疾患においてもその過剰発現が観察されている。
また、ソラヤシンは選択的に大腸菌に対して抗菌性を発揮することが知られている。

特開２００７−２１０９４８号公報 特開２００９−２５６２４４号公報 特開２００９−２６９９００号公報 特開２０１０−０６５００７号公報 Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １５６：１０９９−１１１１（２００２）

本発明の目的はトランスグルタミナーゼ、ロリクリン、フィラグリン、インボルクリン、ケラチン、クローディン、オクルディンの遺伝子の産生を促進し、皮膚角化促進、タイトジャンクション強化、皮膚バリア機能強化等に有効な製剤を得ることにある。

本発明者らが鋭意検討した結果、ソラヤシン（タンパク質）が上記目的を達することがわかった。
ソラヤシンは、生体より分離しても、遺伝子組み換え等の技術を用いてもよく、また、試薬としても販売されているので、必要な精製を行ったソラヤシンを用いればよい。
本発明者らは、ソラヤシンがトランスグルタミナーゼ−１、トランスグルタミナーゼ−３、ロリクリン、フィラグリン、インボルクリン、ケラチン−１、ケラチン−１０、クローディン−１、クローディン−３、クローディン−４、クローディン−７、クローディン−９、クローディン−１４、オクルディンの各遺伝子の発現を増強することを確認し、皮膚角化促進、タイトジャンクション強化、皮膚バリア機能強化に有効であることを見出した。

本発明の製剤は、経口、注射、外用のいずれでも薬効を発現するが、皮膚外用剤として用いるのが好ましい。皮膚外用剤には、皮膚化粧料、外用医薬部外品、医療用皮膚外用剤が含まれる。

また、本発明の製剤には、上記成分の他に医薬品や化粧品の各種製剤において使用されている界面活性剤、油性成分、保湿剤、高分子化合物、紫外線吸収剤、抗炎症剤、殺菌剤、酸化防止剤、金属イオン封鎖剤、防腐剤、ビタミン類、色素、香料、水等を配合することができる。

上記界面活性剤としては、アニオン性、カチオン性、非イオン性、天然、合成のいずれの界面活性剤も使用できるが、皮膚に対する刺激性を考慮すると非イオン性のものを使用することが好ましい。非イオン性界面活性剤としては、例えばグリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、アルキルグリコシド等が挙げられる。

油性成分としては、油脂類、ロウ類、炭化水素類、高級脂肪酸類、高級アルコール類、エステル類、精油類、シリコーン油類などを挙げることができる。油脂類としては、例えば大豆油、ヌカ油、ホホバ油、アボガド油、アーモンド油、オリーブ油、カカオ油、ゴマ油、パーシック油、ヒマシ油、ヤシ油、ミンク油、牛脂、豚脂等の天然油脂、これらの天然油脂を水素添加して得られる硬化油及びミリスチン酸グリセリド、２−エチルヘキサン酸トリグリセリド等の合成トリグリセリド等が；ロウ類としては、例えばカルナバロウ、鯨ロウ、ミツロウ、ラノリン等が；炭化水素類としては、例えば流動パラフィン、ワセリン、パラフィンマイクロクリスタリンワックス、セレシン、スクワラン、プリスタン等が；高級脂肪酸類としては、例えばラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ラノリン酸、イソステアリン酸等が；高級アルコール類としては、例えばラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、ラノリンアルコール、コレステロール、２−ヘキシルデカノール等が；エステル類としては、例えばオクタン酸セチル、オクタン酸トリグリセライド、乳酸ミリスチル、乳酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸ミリスチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、パルミチン酸イソプロピル、アジピン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、オレイン酸デシル、イソステアリン酸コレステロール、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル等が；精油類としては、例えばハッカ油、ジャスミン油、ショウ脳油、ヒノキ油、トウヒ油、リュウ油、テレピン油、ケイ皮油、ベルガモット油、ミカン油、ショウブ油、パイン油、ラベンダー油、ベイ油、クローブ油、ヒバ油、バラ油、ユーカリ油、レモン油、タイム油、ペパーミント油、ローズ油、セージ油、メントール、シネオール、オイゲノール、シトラール、シトロネラール、ボルネオール、リナロール、ゲラニオール、カンファー、チモール、スピラントール、ピネン、リモネン、テルペン系化合物等が；シリコーン油類としては、例えばジメチルポリシロキサン等が挙げられる。これら上述の油性成分は一種又は二種以上を組み合わせて使用することができる。本発明においては、このうち特にミリスチン酸グリセリド、２−エチルヘキサン酸トリグリセリド、ラノリン、流動パラフィン、ワセリン、パラフィンマイクロクリスタリンワックス、スクワラン、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、イソステアリン酸、セチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、コレステロール、オクタン酸セチル、オクタン酸トリグリセライド、ミリスチレン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、イソステアリン酸コレステロール、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル、ハッカ油、トウヒ油、ケイ皮油、ローズ油、メントール、シネオール、オイゲノール、シトラール、シトロネラール、ゲラニオール、ピネン、リモネン、ジメチルポリシロキサンを使用することが好ましい。

本発明の製剤には、さらに下記のような成分を配合することができるが、その成分もこれらに限定されるものではない。
色素類；黄色４号、青色１号、黄色２０２号等の厚生省令に定められたタール色素別表Ｉ及びIIの色素、クロロフィル、リボフラビン、クロシン、紅花、アントラキノン等の食品添加物として認められている天然色素等。
ビタミン類；ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ等。
その他；殺菌剤、防腐剤、その他製剤上必要な成分等。

本発明の製剤は、前記必須成分に必要に応じて前記任意成分を加え、常法に従って製造することができ、クリーム、乳液、化粧水等の形態とすることができる。
なお、ソラヤシンの製剤への配合量は特に限定はないが０．０００００１重量％以上、好ましくは０．０００１重量％以上である。

確認試験
初代のヒト包皮由来ケラチノサイト（クラボウ）をＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地で培養後、トータルRNA抽出用に12ウェルプレートで増殖添加剤なしのＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地でソラヤシンを加えて培養した。（対照として、ソラヤシンを添加しない系でも試験した）
また、経上皮細胞電気抵抗値（ＴＥＲ）測定試験では細胞をコンフルエント後、カルシウム濃度の高い培地を使用し、０．７２×１０⁵個をトランスウェルフィルター上に播種し、ケラチノサイト層を作成した。
なお、ソラヤシンは、株式会社サイクレックス社製、CY-R2257を用いた。

＜ＲＮＡの抽出＞
細胞からの Ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出は、RNeasy mini kit(QIAGEN)を用い、添付マニュアルに従い調製した。ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用い算出した。

＜ＲＴ反応およびリアルタイムＰＣＲ＞
１．０μｇのＴｏｔａｌ ＲＮＡを使い、ReverTra Ace qPCR RT Kit（東洋紡社）を用い、添付マニュアルに従いＲＴ反応を行った。
リアルタイムＰＣＲは、StepOneplus リアルタイムＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、以下のように実施した。Taqman Fast Advanced Master Mix（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびトランスグルタミナーゼ−１、トランスグルタミナーゼ−３、ロリクリン、フィラグリン、インボルクリン、ケラチン−１、ケラチン−１０、クローディン−１、クローディン−３、クローディン−４、クローディン−７、クローディン−９、クローディン−１４、オクルディンのTaqmanプライマー（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ＣＴ（△△ＣＴ）法（ｎ＝８）により遺伝子発現比較を実施した。内部標準としてβ−Actin（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。
＜経上皮細胞電気抵抗値（ＴＥＲ）試験＞
細胞リアルタイムモニタリングシステム（商品名cellZscope、nanoAnalytics社製）を用いて０．６cm²のトランスウェルフィルター上に成長したケラチノサイト層の電気抵抗値をソラヤシン添加後０〜３６時間の間、測定した。ブランク値を減算したのち、結果をΩ×cm²の値で示した。

確認試験を行った結果を図１〜１５に示す。ソラヤシンは低濃度で、トランスグルタミナーゼ−１、トランスグルタミナーゼ−３、ロリクリン、フィラグリン、インボルクリン、ケラチン−１、ケラチン−１０、クローディン−１、クローディン−３、クローディン−４、クローディン−７、クローディン−９、クローディン−１４、オクルディンの各遺伝子の発現を増強することを確認した。
また、濃度依存的にケラチノサイト層の電気抵抗を高めた。これはケラチノサイト層すなわち、ソラヤシンは皮膚のバリア機能を増強することを表している。

また、ソラヤシンを配合した外用剤を作成し、実際に使用してみた結果、乾燥肌、荒れ肌等に改善がみられた。

確認試験でトランスグルタミナーゼ−１の遺伝子の発現量を試験した結果を示す。横軸にソラヤシンの最終濃度、縦軸にソラヤシン無添加の遺伝子発現を１とした遺伝子発現量を示す。 確認試験でトランスグルタミナーゼ−３の遺伝子の発現量を試験した結果を示す。横軸にソラヤシンの最終濃度、縦軸にソラヤシン無添加の遺伝子発現を１とした遺伝子発現量を示す。 確認試験でロリクリンの遺伝子の発現量を試験した結果を示す。横軸にソラヤシンの最終濃度、縦軸にソラヤシン無添加の遺伝子発現量を１とした遺伝子発現量を示す。 確認試験でフィラグリンの遺伝子の発現量を試験した結果を示す。横軸にソラヤシンの最終濃度、縦軸にソラヤシン無添加の遺伝子発現を１とした遺伝子発現量を示す。 確認試験でインボルクリンの遺伝子の発現量を試験した結果を示す。横軸にソラヤシンの最終濃度、縦軸にソラヤシン無添加の遺伝子発現を１とした遺伝子発現量を示す。 確認試験でケラチン−１の遺伝子の発現量を試験した結果を示す。横軸にソラヤシンの最終濃度、縦軸にソラヤシン無添加の遺伝子発現を１とした遺伝子発現量を示す。 確認試験でケラチン−１０の遺伝子の発現量を試験した結果を示す。横軸にソラヤシンの最終濃度、縦軸にソラヤシン無添加の遺伝子発現を１とした遺伝子発現量を示す。 確認試験でクローディン−１の遺伝子の発現量を試験した結果を示す。横軸にソラヤシンの最終濃度、縦軸にソラヤシン無添加の遺伝子発現を１とした遺伝子発現量を示す。 確認試験でクローディン−３の遺伝子の発現量を試験した結果を示す。横軸にソラヤシンの最終濃度、縦軸にソラヤシン無添加の遺伝子発現を１とした遺伝子発現量を示す。 確認試験でクローディン−４の遺伝子の発現量を試験した結果を示す。横軸にソラヤシンの最終濃度、縦軸にソラヤシン無添加の遺伝子発現を１とした遺伝子発現量を示す。 確認試験でクローディン−７の遺伝子の発現量を試験した結果を示す。横軸にソラヤシンの最終濃度、縦軸にソラヤシン無添加の遺伝子発現を１とした遺伝子発現量を示す。 確認試験でクローディン−９の遺伝子の発現量を試験した結果を示す。横軸にソラヤシンの最終濃度、縦軸にソラヤシン無添加の遺伝子発現を１とした遺伝子発現量を示す。 確認試験でクローディン−１４の遺伝子の発現量を試験した結果を示す。横軸にソラヤシンの最終濃度、縦軸にソラヤシン無添加の遺伝子発現を１とした遺伝子発現量を示す。 確認試験でオクルディンの遺伝子の発現量を試験した結果を示す。横軸にソラヤシンの最終濃度、縦軸にソラヤシン無添加の遺伝子発現を１とした遺伝子発現量を示す。 確認試験で経上皮細胞電気抵抗値（ＴＥＲ）を測定した結果を示す。横軸に培養時間（時）、縦軸に電気抵抗値（Ω×cm²）である。

Claims (9)

1. ソラヤシンを有効成分とする皮膚角化促進剤。
2. ソラヤシンを有効成分とするタイトジャンクション強化剤。
3. ソラヤシンを有効成分とするトランスグルタミナーゼ遺伝子発現促進剤。
4. ソラヤシンを有効成分とするロリクリン遺伝子発現促進剤。
5. ソラヤシンを有効成分とするフィラグリン遺伝子発現促進剤。
6. ソラヤシンを有効成分とするインボルクリン遺伝子発現促進剤。
7. ソラヤシンを有効成分とするケラチン遺伝子発現促進剤。
8. ソラヤシンを有効成分とするクローディン遺伝子発現促進剤。
9. ソラヤシンを有効成分とするオクルディン遺伝子発現促進剤。