JP3241717B2 - 核酸配列増幅法 - Google Patents

核酸配列増幅法

Info

Publication number
JP3241717B2
JP3241717B2 JP51151890A JP51151890A JP3241717B2 JP 3241717 B2 JP3241717 B2 JP 3241717B2 JP 51151890 A JP51151890 A JP 51151890A JP 51151890 A JP51151890 A JP 51151890A JP 3241717 B2 JP3241717 B2 JP 3241717B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
sequence
dna
rna
primer
target
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP51151890A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH04500759A (ja
Inventor
カシィアン，ダニエル・ルイス
フルツ，ティモシー・ジェイ
Original Assignee
ジェン―プローブ インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ジェン―プローブ インコーポレイテッド filed Critical ジェン―プローブ インコーポレイテッド
Publication of JPH04500759A publication Critical patent/JPH04500759A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3241717B2 publication Critical patent/JP3241717B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6865—Promoter-based amplification, e.g. nucleic acid sequence amplification [NASBA], self-sustained sequence replication [3SR] or transcription-based amplification system [TAS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
    • C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本出願は1989年７月11日出願の出願番号第379501号の
継続出願である。
発明の分野 本発明は、単独でまたは核酸のホモジーニアスまたは
ヘテロジーニアスな混合物の大きなまたは小さな成分と
して存在し得る「標的配列」または特定の核酸配列のコ
ピー数を増加させる方法に関するものである。この核酸
の混合物は、診断用の検査、環境検査、学術研究、クロ
ーニングのような別の操作のための試薬または材料の調
製、またはその他の目的のために採取される試料中に見
いだされるものであり得る。
特定の核酸配列の選択的増幅は、特異性を維持し、様
々な研究方法の感受性、簡便性、正確さおよび信頼性を
増し、かつ種々の目的のための特定のオリゴヌクレオチ
ドの十分な供給を可能にしつつ、診断上のおよび環境に
関わる検定の感受性を増すという点で貴重である。
本発明は、その実施の際の簡便性の故に、とりわけ環
境および診断用検査における使用に好適である。
発明の背景 特定の核酸配列の検出および／または定量は、微生物
の同定および分類、感染症の診断、遺伝的異常の発見お
よび性格決定、癌に伴う遺伝子の変化の同定、遺伝的易
罹患性の研究、および種々の型の処置に対する応答の測
定のためにますます重要になりつつある技術である。さ
らにこのような方法は、食物、環境からの試料、種、お
よび特定の微生物の存在が監視される必要のあるその他
の型の物質中で微生物を検出および定量する際の使用へ
と用途が広がることがわかった。その他、犯罪の容疑者
の同定、父親捜しの論争の解決、家系図および系統発生
樹の作成、および様々な生命形態の分類を助けるために
核酸配列の関連性の測定が用いられる、法医学、人類
学、考古学および生物学における適用性が見いだされて
いる。
特定の核酸配列の検出および定量のための一般的方法
は核酸のハイブリダイゼーションである。この方法は、
総補的または本質的に相補的な配列を含む二本の核酸鎖
が適当な条件の下で特異的に結合して二本鎖構造を形成
する能力に基づくものである。特定の核酸配列（「標的
配列」として知られる）を検出および／または定量する
ために、その標的配列に対し相補的な配列を含む標識オ
リゴヌクレオチド（「プローブ」として知られる）を調
製する。このプローブを、標的配列の含有が疑われる試
料と混合し、ハイブリッド形成のために適当な条件を作
りだす。試料中に標的配列が存在すれば、プローブは標
的配列とハイブリダイズする。次いでこのプローブ−標
的ハイブリッドを様々な手段のうちの一つを用いて一本
鎖プローブから分離する。このハイブリッドに付随した
標識の量を測定する。
核酸ハイブリダイゼーション検定の感度は、主として
プローブの特異活性、ハイブリダイゼーション反応の割
合および程度、ハイブリッド形成および非ハイブリッド
形成プローブの分離方法の挙動、および標識の検出され
る感度によって制限を受ける。最良の条件下において上
記のような直接ハイブリダイゼーション法は約1x105な
いし1x106の標的分子を検出することができる。最も鋭
敏な方法は、日常の臨床および環境検査に必要とされる
速さ、簡便性、および経済性というような多くの特徴を
欠く場合がある。そのうえ、その感度は多くの望ましい
適用に対して十分でないことがある。感染症は、血液ま
たは他の試料10mlにつきわずか１個の病原性微生物に伴
って起こり得る。法医鑑識官は犯罪現場から微量の組織
しか得られないということもある。研究者は、生体の遺
伝子材料中または一群の細胞のメッセンジャーRNA群中
に存在する全配列の中にごく小さな断片として存在する
特定の遺伝子配列を検出および／または定量する必要が
あるかも知れない。
この型の検定の様々な構成因子および操作工程間の相
互作用の結果として、感度および特異性の間には殆ど常
に逆の関係が存在する。即ち、その検定の感度を高める
ための工程（例えばプローブの特異活性を高める）を取
り入れた結果、偽陽性の試験結果の比率がより高くなり
得る。感度および特異性のつながりは、ハイブリダイゼ
ーション検定の感度を高める上での重大な障壁であっ
た。この問題に対する一つの解決は、増幅方法を用いて
標的配列の存在量を特異的に増加させることである。試
料の残りの配列にコードされている情報のかなりの部分
の増幅を必要とすることなくただ一個の標的配列部分を
増幅することにより、感度が向上し、一方同時に特異性
は低下しない。例えば長さ25塩基の核酸配列は、この配
列中の25の位置の各々が４種の異なるヌクレオチドのう
ちの１個によって占められているため、425分の１また
は1015の１の確率で存在する可能性がある。
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「PCR」と呼ばれる
核酸配列の特異的増幅法はミュリス等によって記載され
ている（米国特許第4683195号、4683202号および480015
9号ならびに欧州特許出願第86302298.4号、86302299.2
号および87300203.4号ならびにメソッズ・イン・エンザ
イモロジー第155巻、1987、335−350頁参照）。この方
法は、鋳型として相補的配列の各鎖を用いる、同時に起
こるプライマー依存核酸合成の反復サイクルを使用して
いる。増幅される配列は、合成を開始させるプライマー
分子の位置によって規定される。プライマーは標的配列
またはその相補体の3'末端部分に対して相補的であり、
かつ核酸合成を開始させるためにはこの部位と結合せね
ばならない。伸長産物の合成後、次の合成工程の前にこ
の鎖を通常熱変性により分離する。PCR法の場合、相補
的配列の両方の鎖が合成される。
PCRにおいてPCR反応の各サイクルの終わりに新たに合
成される鎖を分離するのに用いられる鎖の分離工程は、
しばしば熱変性である。その結果、熱安定性酵素が必要
となるか、または熱変性工程とDNA合成の次のサイクル
の開始の間に新たな酵素が添加されねばならないかのい
ずれかとなる。幾つかの異なる且つ極端な反応温度のサ
イクルを反復する必要があるということは、PCR法の不
利な点である。PCRを簡便にするためには高価なプログ
ラム可能な温度サイクル機器が必要である。
PCR反応に使用されるプライマーの１個にプロモータ
ー配列を組み込み、次いで数サイクルのPCR法により増
幅した後、この二本鎖DNAを一本鎖RNAの転写のための鋳
型として使用することにより、PCR法がRNA転写と組み合
わせられた（例えばムラカワ等、DNA第７巻287−295頁
（1988）参照）。
特定の核酸配列を増幅するその他の方法は、プライマ
ーの使用によりプロモーター配列を含む中間体二本鎖DN
A分子を供給するための一連のプライマーハイブリダイ
ゼーション、伸長および変性工程を含む。この二本鎖DN
Aを標的配列のRNAコピーを多数生成させるのに使用す
る。得られたRNAコピーをさらにコピーを生成させるた
めの標的配列として使用し、多数のサイクルを実施する
ことができる（例えばバーグ等、WO89/1050およびジン
ジェラス等、WO88/10315参照）。
特定の配列の比較的大量のDNAをインビトロで化学的
に合成する方法は当業者に良く知られており、この方法
によるDNAの生成は今や常套である。しかしながらこれ
らの方法は時間がかかり、また長さ約100塩基よりずっ
と大きなオリゴヌクレオチドの合成には容易に用いるこ
とができない。さらに、合成すべきDNAの全塩基配列が
わかっていなければならない。これらの方法は、一度に
ただ１種の配列しか合成できない高価な機器を必要とす
る。この機器の操作にはかなりの訓練と専門知識が必要
である。RNAの化学合成法は開発がより困難であった。
核酸は、微生物の遺伝子材料中に特定の核酸配列をク
ローニングまたは挿入し、その結果この微生物が複製を
行なう時に挿入された配列が複製されることを含む技術
によって合成することができる。適当なプロモーター配
列の下流に隣接してこの配列が挿入されれば、この配列
のRNAコピーまたはこの配列によりコードされる蛋白生
成物が生成し得る。クローニングは事実上無制限の量の
特定の核酸配列を産み出せるが、含まれる操作の数のた
め、これは診断用、環境、または法医学用の検査におけ
る使用には適していない。クローニング技術の使用には
かなりの訓練と専門知識を要する。１個の配列のクロー
ニングには数人月またはそれ以上の労力が費やされ得
る。
RNA指向ポリメラーゼ、好ましくはＱβレプリカーゼ
の結合のための認識配列を有する組み替え一本鎖RNA分
子を用いて、比較的大量の特定のRNAを作ることができ
る（例えばクレーマー等の米国特許第4786600号参
照）。特定の配列を異なった分子のDNAコピー中に挿入
し、これを発現ベクターにクローニングし、それをRNA
に転写し、次いでＱβレプリカーゼをもって複製するた
めに、多くの工程が必要である。
発明の要約 本発明は標的（ターゲット）核酸配列の多数のコピー
を合成する新規な自触（自動触媒）的（即ち、温度、p
H、またはイオン強度のような反応条件を修飾する必要
なしに、１つのサイクルの生成物を次のサイクルに使用
して自動的に循環することができる）方法を目的とする
ものである。
本方法は、（ａ）オリゴヌクレオチド／標的配列複合
体が作られDNA合成が開始し得る条件下で、RNA標的配列
を、標的の3'末端部分に対してこれと複合体を作るに十
分相補的な複合体形成配列を有し、且つ所望によりRNA
ポリメラーゼのためのプロモーターを含むプライミング
配列の5'側配列を有する、第一プライマーを含む第一の
オリゴヌクレオチドで処理し、（ｂ）RNA標的に対し相
補的な第一のDNAプライマー伸長産物を与える鋳型とし
て該標的を使用する伸長反応において第一プライマーを
伸長し、（ｃ）RNA標的を選択的に減成（分解）する酵
素を用いてDNA伸長産物をRNA標的から分離し、（ｄ）DN
Aプライマー伸長産物を、プライマーまたはスプライス
の鋳型を含み、そしてオリゴヌクレオチド／標的配列複
合体が作られDNA合成が開始し得る条件下でDNAプライマ
ー伸長産物の3'末端部分に対しこれと複合体を作るに十
分相補的な複合体形成配列を有する第二のオリゴヌクレ
オチドで処理し（ただし、もし第一のオリゴヌクレオチ
ドがプロモーターを持たなければ、第二のオリゴヌクレ
オチドがRNAポリメラーゼのためのプロモーターを含む
複合体形成配列の5'側配列を有するスプライスの鋳型で
ある）、（ｅ）DNA伸長反応において、第二のオリゴヌ
クレオチドまたは第一プライマー伸長産物のいずれかの
3'末端を伸長してRNAポリメラーゼのための鋳型を生成
し、そして（ｆ）この鋳型を用い、プロモーター配列を
認識するRNAポリメラーゼを使用して標的配列のRNAコピ
ーを多数生成させる、ことを含む。オリゴヌクレオチド
およびRNAコピーは、標的配列のコピーを多数自触的に
合成するために使用できる。
本発明の一側面において、概括的方法は、（ａ）オリ
ゴヌクレオチド／標的複合体が作られDNA合成が開始し
得る条件下で、RNA標的配列を、標的の3'末端部分に対
してこれと複合体を作るに十分相補的な複合体形成配列
を有し、且つRNAポリメラーゼのためのプロモーターを
含む5'から複合体形成配列に至る配列を有する、第一プ
ライマーを含む第一のオリゴヌクレオチドで処理し、
（ｂ）鋳型として該標的を使用する伸長反応において第
一プライマーを伸長して、RNA標的に対し相補的な第一
のDNAプライマー伸長産物を得、（ｃ）RNA標的を選択的
に減成（分解）する酵素を用いて第一のDNAプライマー
伸長産物をRNA標的から分離し、（ｄ）DNAプライマー伸
長産物を、オリゴヌクレオチド／標的複合体が作られDN
A合成が開始し得る条件下でDNAプライマー伸長産物の3'
末端部分に対しこれと複合体を作るに十分相補的な複合
体形成配列を有する第二プライマーで処理し、（ｅ）第
二のDNAプライマー伸長産物を与えるDNA伸長反応におい
て第二プライマーの3'末端を伸長し、これによりRNAポ
リメラーゼのための鋳型を生成し、そして（ｆ）この鋳
型を用いて、プロモーター配列を認識するRNAポリメラ
ーゼを使用して標的配列のRNAコピーを多数生成させ
る、ことを含む。オリゴヌクレオチドおよびRNAコピー
は標的配列のコピーを多数自触的に合成するために使用
することができる。この側面は、さらに、（ｇ）工程
（ｆ）からのRNAコピーを、オリゴヌクレオチド／標的
配列複合体が生成しDNA合成が開始し得る条件下で、第
二プライマーによって処理し、（ｈ）RNAコピーを鋳型
として用いるDNA伸長反応において第二プライマーの3'
末端を伸長して第二のDNAプライマー伸長産物を得、
（ｉ）RNAコピーを選択的に減成する酵素を用いて第二
のDNAプライマー伸長産物をRNAコピーから分離し、
（ｊ）第二のDNAプライマー伸長産物を、オリゴヌクレ
オチド／標的配列複合体が生成しDNA合成が開始し得る
条件下で、第一プライマーによって処理し、（ｋ）DNA
伸長反応において第二プライマー伸長産物の3'末端を伸
長してRNAポリメラーゼのための鋳型を生成し、そし
て、（ｌ）工程（ｋ）の鋳型を用い、プロモーターを認
識するRNAポリメラーゼを使用して標的配列のコピーを
多数生成させる、ことを含む。工程（ｌ）、工程（ｇ）
ないし（ｋ）のRNAコピーの使用は自触的に反復されて
標的配列のコピーを多数合成する。工程（ｋ）において
スプライスの鋳型として挙動する第一プライマーもまた
工程（ｋ）のDNA伸長反応において伸長され得る。
本発明に係る概括的方法のもう１つの側面は、（ａ）
オリゴヌクレオチド／標的配列複合体が作られDNA合成
が開始し得る条件下で、RNA標的配列を、標的配列の3'
末端部分に対してこれと複合体を作るに十分相補的な複
合体形成配列を有する第一プライマーで処理し、（ｂ）
鋳型として該標的を使用する伸長反応においてプライマ
ーの3'末端を伸長して、RNA標的に対し相補的なDNAプラ
イマー伸長産物を得、（ｃ）RNA標的を選択的に減成す
る酵素を用いてDNA伸長産物をRNA標的から分離し、
（ｄ）オリゴヌクレオチド／標的配列複合体が作られDN
A合成が開始し得る条件下で、DNAプライマー伸長産物
を、プライマー伸長産物の3'末端に対しこれと複合体を
作るに十分相補的な複合体形成配列、およびRNAポリメ
ラーゼのためのプロモーターを含む5'から複合体形成配
列に至る配列、を有するスプライスの鋳型を含む第二の
オリゴヌクレオチドで処理し、（ｅ）DNAプライマー伸
長産物の3'末端を伸長してこれにプロモーターに対し相
補的な配列を加え、それによりRNAポリメラーゼのため
の鋳型を生成し、（ｆ）この鋳型を用い、プロモーター
配列を認識するRNAポリメラーゼを使用して標的配列のR
NAコピーを多数生成させ、そして、（ｇ）工程（ｆ）の
RNAコピーを用いて工程（ａ）ないし（ｆ）を自触的に
反復させて標的配列を増幅する、ことからなる方法を提
供する。所望により、工程（ｄ）のスプライスの鋳型を
プライマーとしても機能させ、これを工程（ｅ）におい
て第一のプライマー伸長産物を鋳型として使用して伸長
し、第二プライマー伸長産物を得ることもできる。
さらに、本発明の別の側面において、増幅させたい配
列がDNAとして存在する場合、適当な「予備操作」を使
用するとRNAコピーが生成し、次いでこれを本発明の
「概括的方法」に従って増幅することができる。
したがって別の側面においては本発明は、増幅すべき
存在するコピーの数を増加させるばかりでなく、増幅の
ためのDNA配列のRNAコピーを提供し得る、本発明の増幅
方法に関連して使用するための「予備操作」を目的とす
るものである。
本発明は、試料中の特定の標的核酸配列のコピー数を
増加させる方法を目的とするものである。１つの側面に
おいて本発明は、それ自身追加の生成物の生成に使用さ
れることができ、その結果、例えば温度循環のような反
応条件の操作を必要とせずに自触的反応を引き起こす生
成物を産生する酵素的ハイブリッド−分離工程を伴う、
DNAポリメラーゼ（例えば逆転写酵素）およびDNA依存RN
Aポリメラーゼ（転写酵素）の共同作用を含む。「予備
操作」を含む本発明方法の幾つかの態様においては、
「予備操作」の最初の工程を除く全ての工程を１種類の
温度で実施する。
本発明方法は、臨床上の、環境の、法医学用の、およ
び類似の試料における特定の核酸標的配列を検出および
／または定量する検定の構成因子として、または、様々
な使用のための特定の標的配列のDNAおよび／またはRNA
のコピーを多数生成させるために使用できる。さらにこ
れらの方法は、クローニングのためのDNA標的配列のDNA
コピーを多数生成させるため、またはプローブを産み出
すため、または配列決定のためのRNAおよびDNAコピーを
生成させるためにも使用できる。
典型的な検定の一例の場合、増幅すべき試料を、緩衝
液、塩、マグネシウム、ヌクレオチド三燐酸、プライマ
ーおよび／またはスプライスの鋳型、ジチオトレイトー
ル、およびスペルミジンを含有する緩衝液濃縮物と混合
する。次いで所望によりこの反応物を100℃付近で２分
間インキュベートして二次構造を変性させる。室温まで
冷却した後、もし標的が、確定した3'末端の無いDNA標
的ならば、逆転写酵素を加え反応混合物を42℃で12分間
インキュベートする。反応物を、今回はプライマー伸長
産物をDNA鋳型から分離するために、再度100℃付近で変
性させる。冷却後、逆転写酵素、RNAポリメラーゼ、お
よびRNアーゼＨを加え、反応物を37℃で２ないし４時間
インキュベートする。次いで、生成物を変性させ、プロ
ーブ溶液を加え、60℃で20分間インキュベートし、ハイ
ブリダイズしていないプローブを選択的に加水分解する
溶液を加え、反応物を60℃で６分間インキュベートし、
そして残留する化学ルミネセンスをルミノメーターで測
定することにより、この反応物を検定することができる
（例えばアーノルド等、PCT US88/02746号（1988年９
月21日出願、1989年３月29日公告）参照。この内容は引
用して本明細書の一部とし、「HPA」と呼称する）。本
発明方法の生成物は当業者に知られる他の多くの検定系
で使用することができる。
もし標的が確定した3'末端を有する、または標的がRN
Aであるならば、典型的な検定は、標的を前記の緩衝液
濃縮物と混合し、二次構造を変性させることを含む。冷
却後、逆転写酵素、RNAポリメラーゼ、およびRNアーゼ
Ｈを加え、この混合物を37℃で２ないし４時間インキュ
ベートする。次いで反応物を前記のごとく検定し得る。
本発明方法およびこの中で用いられる材料は、診断操
作における使用のための診断キットの一部として組み入
れることができる。
定義 本明細書中使用される以下の語は、特に別途記載のな
い限り以下の意義を有する。
1.鋳型 「鋳型」は、核酸ポリメラーゼにより複製される核酸
分子である。鋳型はそのポリメラーゼにより、一本鎖、
二本鎖または部分的二本鎖であり得る。合成されたコピ
ーは鋳型に対し、または二本鎖もしくは部分的二本鎖の
鋳型の少なくとも一本の鎖に対し相補的である。RNAお
よびDNAの両者は常に5'から3'の方向へと合成され、二
本鎖核酸の二本の鎖は常に二本の鎖の5'末端がその二本
鎖の反対の端にあるように並んでいる（そしてその場合
必然的に3'末端もまた同様である）。
2.プライマー、スプライスの鋳型 「プライマー」は、鋳型と複合体を形成（水素結合ま
たはハイブリダイゼーションによる）してDNAポリメラ
ーゼによる合成の開始のためのプライマー／鋳型複合体
を与える、鋳型に対し相補的なオリゴヌクレオチドであ
って、これはDNA合成の過程で、鋳型に対し相補的な3'
末端に連なった共有結合により結合した塩基の添加によ
り、伸長する。この結果がプライマー伸長産物である。
事実上、既知の全てのDNAポリメラーゼ（逆転写酵素を
含む）はDNA合成の開始のためにオリゴヌクレオチドの
一本鎖鋳型への結合（プライミング）を必要とするが、
これに対してRNAの複製および転写（DNAからRNAの複
製）は一般にプライマーを必要としない。適当な状況下
ではプライマーがスプライスの鋳型としても働き得る
（以下の「スプライスの鋳型」の定義を参照された
い）。
「スプライスの鋳型」は一本鎖の核酸と複合体を作る
オリゴヌクレオチドであって、特定の配列を付加するた
めに標的核酸の3'末端を伸長する鋳型として使用され
る。スプライスの鋳型は標的核酸分子の3'末端に対し十
分相補的であり、この3'末端はスプライスの鋳型と複合
体を作らせるために伸長させる。次いでDNA−またはRNA
−依存DNAポリメラーゼを使用して、スプライスの鋳型
の5'から相補領域に至る配列を鋳型として用いて標的核
酸分子を伸長する。伸長した分子の伸長産物は、スプラ
イスの鋳型の5'末端の配列に相補的な特異的配列を3'末
端に有する。
もしスプライスの鋳型の3'末端がブロックされておら
ず、且つ標的核酸に対し相補的であれば、これはプライ
マーとしても働き、鋳型として標的核酸分子を用いてDN
Aポリメラーゼにより伸長される。スプライスの鋳型の
3'末端は、3'末端のジデオキシヌクレオチドの存在また
は標的に対し非相補的3'末端配列の存在を含む種々の形
で、または当業者に知られるその他の形でブロックでき
る。
プライマーまたはスプライスの鋳型のいずれかが一本
鎖の核酸と複合体を形成し、DNAポリメラーゼのための
プライミング機能を果たすことができる。
3.標的核酸、標的配列 「標的核酸」は増幅されるべき「標的配列」を有し、
一本鎖または二本鎖のいずれかであることができ、標的
配列の外に増幅されるべきでない他の配列を含むことが
ある。
「標的配列」という語は増幅されるべき標的核酸の特
定のヌクレオチド配列を意味する。「標的配列」は、本
発明の工程の最中にオリゴヌクレオチド（プライマーお
よび／またはスプライスの鋳型）が複合体を形成する複
合体形成配列を含む。標的核酸が本来一本鎖である場
合、「標的配列」という語は標的核酸中に存在する「標
的配列」に相補的な配列をも意味することになろう。
「標的核酸」が本来二本鎖である場合、「標的配列」と
いう語は（＋）および（−）鎖の両者を意味する。
4.プロモーター／プロモーター配列 「プロモーター配列」は、その核酸に結合し、特定の
位置でRNAの転写を開始させる信号としてDNA依存RNAポ
リメラーゼ（転写酵素）により認識される特定の核酸配
列である。結合のためには、このような転写酵素は一般
にプロモーター配列およびその相補体を含む部分におい
て二本鎖であるDNAが必要であり、鋳型部分（転写され
るべき配列）は二本鎖である必要がない。個々のDNA依
存RNAポリメラーゼは、転写を進める効率の点で著しく
異なる様々な異なったプロモーター配列を認識する。RN
Aポリメラーゼが転写を開始するためにプロモーター配
列に結合するとき、そのプロモーター配列は転写される
配列の一部ではない。したがってこれにより生成するRN
A転写物は、その配列を含まないであろう。
5.DNA依存DNAポリメラーゼ 「DNA依存DNAポリメラーゼ」は、DNA鋳型から相補的D
NAコピーを合成する酵素である。例として大腸菌由来の
DNAポリメラーゼＩおよびバクテリオファージT7 DNAポ
リメラーゼがある。既知のDNA依存DNAポリメラーゼはす
べて合成の開始に相補的プライマーを必要とする。適当
な条件下ではDNA依存DNAポリメラーゼがRNA鋳型から相
補的DNAコピーを合成できることが知られている。
6.DNA依存RNAポリメラーゼ（転写酵素） 「DNA依存RNAポリメラーゼ」または「転写酵素」は、
プロモーター配列（通常二本鎖）を有する二本鎖または
部分的二本鎖のDNA分子から多数のRNAコピーを合成する
酵素である。このRNA分子（「転写物」）はプロモータ
ーのすぐ下流の特定の位置から始まって5'→3'の方向へ
合成される。転写酵素の例には大腸菌およびバクテリオ
ファージT7、T3、およびSP6由来のDNA依存RNAポリメラ
ーゼがある。
7.RNA依存DNAポリメラーゼ（逆転写酵素） 「RNA依存DNAポリメラーゼ」または「逆転写酵素」は
RNA鋳型から相補的DNAコピーを合成する酵素である。知
られている全ての逆転写酵素はDNA鋳型から相補的DNAコ
ピーを作り出す能力をも有する。したがってこれらはRN
A−およびDNA−依存性のDNAポリメラーゼである。合成
を開始するためにはRNAおよびDNA鋳型の両者にプライマ
ーが必要である。
8.RNアーゼＨ 「RNアーゼＨ」はRNA:DNA二本鎖のRNA部分を減成させ
る酵素である。RNアーゼＨはエンドヌクレアーゼまたは
エキソヌクレアーゼであり得る。殆どの逆転写酵素は普
通それらのポリメラーゼ活性に加えてRNアーゼＨ活性を
有する。しかし、付随するポリメラーゼ活性のないRNア
ーゼＨの他の供給源も利用できる。減成の結果RNA:DNA
複合体からRNAが分離し得る。これとは別にRNアーゼＨ
はRNA部分が融解または酵素にRNA部分の巻戻しをさせる
ように、様々な位置で単にRNAを切断することもでき
る。
9.プラス／マイナス鎖 核酸合成の議論は、核酸二本鎖の二本の相補的鎖を命
名する語を採用することにより著しく単純化且つ明確化
する。伝統的に、蛋白または構造的RNAを生成するため
に使用される配列をコードする鎖は「プラス」鎖、そし
てその相補体は「マイナス」鎖と称した。現在では、多
くの場合両方の鎖が機能的であり、よって一方を「プラ
ス」とし他方を「マイナス」とする命名の割り振りは任
意であることがわかっている。にもかかわらずこの語は
核酸の配列の方向を指定するのに非常に有用であるの
で、本明細書においてこの目的のためにこれを用いる。
10.ハイブリダイズ、ハイブリダイゼーション 「ハイブリダイズ」および「ハイブリダイゼーショ
ン」という語は、ワトソン・クリックの塩基対形成によ
り複合体を形成するに十分相補的なヌクレオチド配列間
の複合体形成を意味する。プライマー（またはスプライ
スの鋳型）が標的（鋳型）と「ハイブリダイズ」する
時、このような複合体（またはハイブリッド）はDNAポ
リメラーゼがDNA合成を開始するのに要するプライミン
グ機能を果たすのに十分安定である。
11.プライマー配列 本明細書中で言及するプライマーの配列を以下に開示
する。
12.特異性 核酸配列の特性であって、これは配列および検定条件
により標的および非標的配列を識別する能力を意味す
る。
図面の簡単な説明 第1Aないし10図は本発明の概括的方法を表わす。
第2Aないし2E図は、予備操作Ｉと称される本発明の態
様を表わす。
第３図は、予備操作IIと称される本発明の態様を表わ
す。
第4Aないし4D図は改良増幅法を表わす。
第５図は、AMVおよびMMLVおよび大腸菌由来のRNアー
ゼＨが特異的RNA開裂サイトを有するという仮説を確認
する実験の結果を示す。
第６図は、増幅中の32P−標識プライマーの取り込み
の結果を示す。
発明の詳細な説明 本発明によれば、特定の核酸標的配列の検出および／
または定量用の検定における使用のため、または様々な
用途の特定の標的配列のDNAおよび／またはRNAの多数の
コピーを生成するための、特定の核酸標的配列の増幅の
ための新規な方法および組成物が提供される。
I.概括的方法 好ましい側面において、本発明はRNA標的配列のDNAお
よびRNAコピーを多数合成する自触的増幅方法を提供す
る。標的核酸は、増幅されるべき標的配列を含む。標的
配列は、どちらかの端がプライマー、スプライスの鋳
型、および／または天然の標的核酸の末端によって規定
される標的核酸の領域であって、（＋）および（−）の
両鎖を含む。
ある側面においてこの方法は、オリゴヌクレオチド／
標的配列複合体が作られDNA合成が開始し得る条件下
で、RNA標的配列を含む標的核酸を、標的配列の3'末端
部分に対してこれと複合体を作るに十分相補的な複合体
形成配列を有し、且つ所望によりRNAポリメラーゼのた
めのプロモーター配列を含む5'から複合体形成配列に至
る配列を有する、第一プライマーを含む第一のオリゴヌ
クレオチドで処理する事からなる。第一のオリゴヌクレ
オチドプライマーは、5'からプライミング配列に至る他
の配列を有することもある。第一プライマーの3'末端は
適当なDNAポリメラーゼにより、RNAを鋳型として用いる
伸長反応において伸長され、RNA鋳型に対し相補的な第
一のDNAプライマー伸長産物が得られる。この第一プラ
イマー伸長産物を、RNA鋳型を選択的に減成させる酵素
を用いてRNA鋳型から分離（少なくとも部分的に）す
る。好適な酵素はRNA−DNA複合体のRNA鎖に選択的に働
く酵素であって、RNアーゼＨを含む酵素を包含する。幾
つかの逆転写酵素はRNアーゼＨ活性を含むが、大腸菌RN
アーゼＨのような外性のRNアーゼＨを添加するのが好ま
しい。
オリゴヌクレオチド／標的配列複合体が作られDNA合
成が開始し得る条件下で、一本鎖の第一プライマー伸長
産物を、第一プライマー伸長産物中に含まれる標的配列
の3'末端部分に対しこれと複合体を作るに十分相補的な
複合体形成配列を有する第二プライマーまたはスプライ
スの鋳型を含む第二のオリゴヌクレオチドで処理する。
第一プライマーがプロモーターを持たないときは、第二
のオリゴヌクレオチドが、RNAポリメラーゼのためのプ
ロモーターを含む5'から複合体形成領域の配列を有する
スプライスの鋳型である。所望によりこのスプライスの
鋳型はその3'末端においてブロックされ得る。第二のオ
リゴヌクレオチドおよび／またはプライマー伸長産物の
3'末端はDNA伸長反応において伸長してRNAポリメラーゼ
のための鋳型を生成する。作られたRNAコピーまたは転
写物は、さらに操作をすることなく自触的に増幅でき
る。
オリゴヌクレオチドがスプライスの鋳型として機能す
る場合、そのプライマー機能は必要ない。したがって、
このスプライスの鋳型の3'末端はブロックされていても
いなくてもよい。得られる反応混合物の構成因子（即
ち、確定した3'末端を有する第一プライマー伸長産物を
生成させるRNA標的、第一プライマー、およびブロック
されたまたはブロックされていないスプライスの鋳型）
は大量のRNAおよびDNAを自触的に合成するよう機能す
る。
本発明の一側面において、第一および第二のオリゴマ
ーは共にプライマーである。第一プライマーはRNAポリ
メラーゼのためのプロモーターを含む5'から複合体形成
配列に至る配列を有し、また他の配列をも含み得る。第
二プライマーもまたRNAポリメラーゼのためのプロモー
ターを含み得る5'から複合体形成配列に至る配列を含
み、所望により他の配列を含む。両方のプライマーがプ
ロモーター配列を有する場合、クローニングのような他
の目的のための第二のプロモーターを導入する意図でな
い限り、両方の配列が同じRNAポリメラーゼにより認識
されるのが好ましい。第二プライマーの3'端は、適当な
DNAポリメラーゼにより伸長反応において伸長され、第
一プライマー伸長産物に対し相補的な第二のDNAプライ
マー伸長産物を生成する。第一プライマーが標的配列の
一方の端を規定し、第二プライマーはここで多端を規定
することに留意されたい。第二の伸長反応の二本鎖生成
物は、RNAポリメラーゼによるRNAの生成のための好適な
鋳型である。もし第二プライマーもまたプロモーター配
列を有するときは、二本鎖鋳型の両方の鎖に相補的な転
写物が自触反応中に生成するであろう。この時点でRNA
転写物は標的核酸とは異なる末端を持ち、しかしながら
第一プライマーと第二プライマーの間の配列は損なわれ
ずに残っている。こうして生成したRNA転写物は、さら
に操作を行なうことなく上の系を自動的に再循環させる
ことができる。したがってこの反応は自触的である。
もし第二プライマーの複合体形成配列が第一プライマ
ー伸長産物の3'末端と複合体を作るならば、第二プライ
マーはスプライスの鋳型として働き、第一プライマー伸
長産物は伸長して5'からプライミング配列に至る第二プ
ライマーの任意の配列を第一プライマー伸長産物に付加
することができる。（例えば第1Eおよび1G図参照）もし
第二プライマーがスプライスの鋳型として働き、且つ5'
から複合体形成配列に至るプロモーター配列を含むなら
ば、プロモーター配列を付加する第一プライマー伸長産
物の伸長はRNAポリメラーゼのためのさらなる鋳型を産
み、これが転写されていずれかの鎖のRNAコピーを生成
することができる。（第1Eおよび1G図参照）両方のプラ
イマーにプロモーターが含まれていることにより、合成
される標的配列のコピー数が増加する。
本発明の概括的方法のもう一つの側面は、プライマー
を含む第一のオリゴヌクレオチド、およびスプライスの
鋳型を含みそれ自身プライマーとして働くことのできる
またはできない（プライマー伸長反応においてそれ自体
が伸長しないという点において）第二のオリゴヌクレオ
チドの使用を含む。この概括的方法の側面は、オリゴヌ
クレオチド／標的配列複合体が作られDNA合成が開始し
得る条件下で、RNA標的配列を含む標的核酸を、標的配
列の3'末端部分に対してこれと複合体を形成するに十分
相補的な複合体形成配列を有する第一のオリゴヌクレオ
チドプライマーで処理することからなる。この第一プラ
イマーは、プロモーターを含む5'から複合体形成配列に
至る他の配列を有していてもよい。第一プライマーの3'
端を、適当なDNAポリメラーゼにより、RNAを鋳型とする
伸長反応で伸長して、このRNA鋳型に対し相補的な第一
プライマー伸長産物を得る。第一プライマー伸長産物
を、RNA鋳型を選択的に減成させる酵素を用いてRNA鋳型
から分離する。好適な酵素はRNA−DNA複合体のRNA鎖に
選択的に働くものであって、RNアーゼＨ活性を含む酵素
を包含する。幾つかの逆転写酵素はRNアーゼＨ活性を含
むが、大腸菌RNアーゼＨのような外性のRNアーゼＨを添
加するのが好ましい。オリゴヌクレオチド／標的配列複
合体が作られDNA合成が開始し得る条件下で、一本鎖の
第一プライマー伸長産物を、プライマー伸長産物の3'末
端部分に対しこれと複合体を作るに十分相補的な複合体
形成配列、およびRNAポリメラーゼのためのプロモータ
ーを含む5'から複合体形成配列に至る配列、を有するス
プライスの鋳型で処理する。スプライスの鋳型の3'末端
は、ブロックされている（例えばジデオキシヌクレオチ
ドの添加により）か、または標的核酸に対し非相補的で
ある（その結果これはプライマーとして機能しない）
か、または別法によりブロックされていないか、のいず
れかである。第一プライマー伸長産物の3'末端は適当な
DNAポリメラーゼを用いてDNA伸長反応において伸長さ
れ、第一プライマー伸長産物の3'末端にプロモーターを
含む5'から複合体形成配列に至るスプライスの鋳型の配
列に対し相補的な配列が付加される。もし3'末端がブロ
ックされていなければ、スプライスの鋳型が伸長して第
一プライマー伸長産物に対して相補的な第二プライマー
伸長産物が得られる。スプライスの鋳型を伴う伸長反応
の生成物（ブロックされていようとなかろうと）は、プ
ロモーターを認識するRNAポリメラーゼを用いるRNA合成
のための鋳型として機能することができる。上に述べた
ように、このように生成したRNA転写物はさらに操作を
行なうことなく自動的に前記の系を再循環させることが
できる。即ちこの反応は自触的である。
幾つかの態様においては、増幅すべき標的配列は、使
用するプライマー（またはスプライスの鋳型）に対して
相補的な特定の配列の位置によって両端が規定される。
他の態様においては、標的配列は、使用するプライマー
分子に対し相補的な特定の配列の位置が一個、そして特
異的制限エンドヌクレアーゼにより、または他の適当な
手段により切断される、天然3'末端を含み得る特定の配
列の位置により、反対の端が規定される。他の態様にお
いては、標的配列は、１またはそれ以上の特異的制限エ
ンドヌクレアーゼにより切断される特定の配列の位置に
より、両端が規定される。
本発明の好ましい態様においては、RNA標的配列を決
定し、次いでRNアーゼＨの減成がどこで二本鎖からRNA
部分の切断または除去を起こすのかを決定する。AMV逆
転写酵素およびMMLV逆転写酵素中に存在するRNアーゼ
Ｈ、大腸菌RNアーゼＨまたは他の供給源およびこれらの
組合せによって分析を行ない、標的配列のRNアーゼ減成
の効果を決定する。
プライマーの組を選択するにあたり、プライマーのう
ち１個を、反応混合物中に存在するRNアーゼＨにより実
質上減成されないRNAの部分とハイブリダイズするよう
に選択するのが好ましい。もし実質的な減成が起こる
と、プライマーの領域におけるRNA鎖の切断により、DNA
合成の開始が阻害されプライマーの伸長が妨げられ得
る。したがって、RNAがRNアーゼＨの作用を受ける場
合、プライマー伸長産物の生成を妨げる実質的減成の無
いように配置されたRNA標的の配列とハイブリダイズす
るプライマーを選択することが好ましい。
プロモーター−プライマーのハイブリダイゼーション
の部位は、プロモーター−プライマーがハイブリダイズ
するDNA鎖の部分にハイブリダイズしたRNA鎖部分を除去
するに十分なRNA鎖の減成が起こるように選択する。典
型的には、RNアーゼＨ減成によりRNAの一部分のみがRN
A:DNA二本鎖から除去され、このRNA鎖の実質的部分は二
本鎖に残る。
RNA合成のためのプロモーター含有二本鎖生成物の形
成を第４図に示す。第４図に示すように、標的RNA鎖
は、反応混合物中に存在するRNアーゼＨにより実質上減
成されないRNA鎖の領域とハイブリダイズするよう選択
されたプライマーとハイブリダイズする。次いでこのプ
ライマーを伸長してRNA鎖に対し相補的なDNA鎖を生成す
る。この後、反応混合物中に存在するRNアーゼＨにより
RNA鎖を様々な位置で切断または減成する。この切断ま
たは減成は、この時点でまたは反応工程中の他の時点で
起こり得ることを理解されたい。次いで重要な切断また
は減成が起こる領域でこのRNAフラグメントをDNA鎖から
分離する。次にこのプロモーター−プライマーを、RNA
鎖が実質的に減成されDNA鎖から分離されたその3'末端
でDNA鎖にハイブリダイズする。次いでこのDNA鎖を伸長
して二本鎖DNAプロモーター配列を作り、これによりRNA
合成用の鋳型を生成する。この鋳型は二本鎖DNAプロモ
ーター配列を含むことがわかる。この鋳型をRNAポリメ
ラーゼで処理するとRNAの多重鎖ができる。
RNアーゼＨで引き起こされるRNAの減成の正確な性質
はわかっていないが、RNA:DNAハイブリッドのRNA鎖上の
RNアーゼＨ減成の結果、ハイブリッドからRNAの小片が
分離する事がわかった。さらに、RNアーゼＨ減成の後
に、小フラグメントの除去された領域でDNAと結合する
であろうプロモーター−プライマーを選択できるという
事もわかった。
描かれた第１図および第２図にはRNアーゼＨ減成の後
に残り得るRNAは示していない。これらの図は一般にDN
A:RNA二本鎖からのRNAの完全な除去を示しているが、好
ましい条件下では第３図に示すように部分的脱離のみが
起こることが理解されるべきである。第1A図を参照する
ことにより、第１図のRNA鎖の実体部分が減成されずに
残り、その結果第二プライマーのハイブリダイゼーショ
ンまたはプロモーター配列に対し相補的なDNA鎖を作る
ためのハイブリダイズされた第二プライマーの伸長が妨
げられると、提唱される機構は起こらないであろう事が
理解できる。しかしながら本出願において発見され開示
される合成の原理に基づいて、当業者は本発明の教示に
従い、常套的改良を施してRNAの増幅のための効果的且
つ効率的な方法を提供することができる。
本明細書中の記載および第1Aないし1O図からわかるよ
うに、本発明は選択可能な変法を包含している。
第1A図は、標的核酸が3'から標的配列に至る余分の配
列を有する場合の本発明に係る方法を描いている。第一
のオリゴヌクレオチドは、3'から標的配列の末端に至る
余分の配列を有する標的核酸（RNA）の標的配列の3'末
端部分と複合体を作る、5'からその複合体形成配列に至
るプロモーターを有する第一プライマーを含む。第二の
オリゴヌクレオチドは第二プライマーを含み、これは、
第一プライマー伸長産物の3'末端と位置を同じくして第
一プライマー伸長産物の3'末端部分と複合体を作る。工
程（１）において第一プライマーは3'から標的配列に至
る余分の配列のためにスプライスの鋳型としては働かな
い。しかしながら工程（10）においては、第二プライマ
ー伸長産物が3'から標的配列に至る余分の配列を持たな
いため、第一プライマーはスプライスの鋳型として働く
ことができる。
第1B図は、標的核酸（RNA）が5'および3'の両方から
標的配列に至る余分の配列を有する場合の本発明に係る
方法を描いている。第一のオリゴヌクレオチドは第1A図
に示す通りである。第二のオリゴヌクレオチドは、3'か
ら標的配列に至る余分の配列を有する第一プライマー伸
長産物の標的配列の3'末端部分と複合体を作るプライマ
ーを含む。
第1C図は、確定した5'および3'末端を持ち、したがっ
て5'または3'のいずれから標的配列に至る余分の配列も
持たない標的核酸（RNA）を描いている。第一のオリゴ
ヌクレオチドは第1A図および第1B図に示す通りである
が、これは標的核酸の3'末端と複合体を作るため、工程
１においてプライマーおよびスプライスの鋳型の両者と
して働く。第二のオリゴヌクレオチドは第1A図に示す通
りである。
第1D図は、確定した3'端を持ち、したがって3'から標
的配列に至る余分の配列は持たないが、5'から標的配列
に至る余分の配列を有する標的核酸（RNA）を描いてい
る。第一のオリゴヌクレオチドは第1C図に示す通りであ
り、プライマーおよびスプライスの鋳型の両者として機
能する。第二のオリゴヌクレオチドは第1B図に示す通り
である。
第1E図は、確定した5'端を持つが3'から標的配列に至
る余分の配列を有する標的核酸（RNA）を描いている。
第一のオリゴヌクレオチドは第1A図に示す通りである。
第二のオリゴヌクレオチドは第二プライマーを含み、こ
れは第一プライマー伸長産物の3'末端と複合体を作るの
で、スプライスの鋳型をも含む。第二のオリゴヌクレオ
チドはさらに5'からその複合体形成配列に至るプロモー
ターをも有する。
第1F図は5'および3'の両者から標的配列に至る余分の
配列を有する標的核酸（RNA）を描いている。第一のオ
リゴヌクレオチドは第1A図に示す通りである。第二のオ
リゴヌクレオチドは、第一プライマー伸長産物が3'から
標的配列に至る余分の配列を有するため工程（４）でス
プライスの鋳型として働けない外は、第1E図に示す通り
である。
第1G図は、確定した5'および3'端の両者を持ち、標的
配列以外に配列を持たない標的核酸（RNA）を描いてい
る。第一のオリゴヌクレオチドは第1C図に示す通りであ
り、第二のオリゴヌクレオチドは第1E図に示す通りであ
る。この標的は余分の配列を持たないので、両方のオリ
ゴヌクレオチドがスプライスの鋳型としても働く。
第1H図は、3'から標的配列に至る配列の無い確定した
3'端を持ち、5'から標的配列に至る余分の配列を持つ標
的核酸（RNA）を描いている。第一のオリゴヌクレオチ
ドは第1C図および第1G図に示す通りであり、プライマー
およびスプライスの鋳型の両者として働く。第二のオリ
ゴヌクレオチドは第1F図に示す通りである。
第1I図は、確定した5'末端を持ち5'から標的配列に至
る余分の配列を持たないが、3'から標的配列に至る余分
の配列を有する標的核酸（RNA）を描いている。第一の
オリゴヌクレオチドはプロモーターなしのプライマーを
含んでいる。第二のオリゴヌクレオチドは、5'から複合
体形成配列に至るプロモーターを有する、ブロックされ
ていないスプライスの鋳型を含む。
第1J図は、確定した5'および3'端の両者を持ち、標的
配列以外に配列を持たない標的核酸（RNA）を描いてい
る。第一のオリゴヌクレオチドはプロモーターなしのプ
ライマーを含んでいる。第二のオリゴヌクレオチドは第
1I図に示す通りである。
第1K図は、5'から標的配列に至る余分の配列を持たな
い確定した5'末端を持ち、3'から標的配列に至る余分の
配列を有する標的核酸（RNA）を描いている。第二のオ
リゴヌクレオチドは5'からその複合体形成配列に至るプ
ロモーターを有するスプライスの鋳型を含むが、これは
その3'末端がブロックされている。第二のオリゴヌクレ
オチドはプライマーとして働くことはできない。
第1L図は、確定した5'および3'端を持ち、標的配列以
外に余分の配列を持たない標的核酸（RNA）を描いてい
る。第一のオリゴヌクレオチドはプライマーおよびスプ
ライスの鋳型の両者として働く。第二のオリゴヌクレオ
チドはブロックされたスプライスの鋳型であり、第1K図
に示す通りである。
第1M図は、確定した5'末端を持ち、したがって5'から
標的配列に至る余分の配列を持たないが、3'から標的配
列に至る余分の配列を有する標的核酸（RNA）を描いて
いる。第一のオリゴヌクレオチドは第1I図に示すプライ
マーである。第二のオリゴヌクレオチドは、第1K図およ
び第1L図に示す、プロモーターを有するブロックされた
スプライスの鋳型である。
第1N図は、標的配列以外に余分の配列を持たない確定
した5'および3'配列の両者を持つ標的核酸（RNA）を描
いている。第一のオリゴヌクレオチドは、第1J図に示す
ように、プロモーターなしのプライマーを含む。第二の
オリゴヌクレオチドは、第1K図、第1L図および第1M図に
示すように、プロモーターを有するブロックされたスプ
ライスの鋳型を含む。
第1O図は、5'から標的配列に至る余分の配列を持たな
い確定した5'末端を持ち、3'から標的配列に至る余分の
配列を有する標的核酸（RNA）を描いている。１個のオ
リゴヌクレオチドが第一のおよび第二のオリゴヌクレオ
チドの両方に使用される。このオリゴヌクレオチドは、
工程（１）に示すように標的配列の3'末端部分と複合体
を作る3'プライマー配列、および、工程（４）に示すよ
うにプライマー伸長産物の3'末端と複合体を作るプロモ
ーターを持つ5'スプライスの鋳型の配列を有する。
要約すると本発明方法は、温度、イオン強度およびpH
のような反応条件の反復操作をすることなく標的核酸配
列の多数のコピーを自触的に合成するための方法を提供
するのであって、この方法は、（ａ）反応混合物中に、
RNA標的配列を含む標的核酸;2個のオリゴヌクレオチド
プライマー、即ちRNA標的配列（例えば（＋）鎖）の3'
末端部分に対しこれと複合体を形成するに十分相補的な
複合体形成配列を有する第一のオリゴヌクレオチド、お
よび相補体（例えば（−）鎖）の標的配列の3'末端部分
に対しこれと複合体を形成するに十分相補的な複合体形
成配列を有する第二のオリゴヌクレオチド（ここで、第
一のオリゴヌクレオチドは、所望によりプロモーターを
含む5'から複合体形成配列に至る配列を有する第一プラ
イマーを含み、第二のオリゴヌクレオチドはプライマー
またはスプライスの鋳型を有する。但し、もし第一のオ
リゴヌクレオチドがプロモーターを持たない場合は、第
二のオリゴヌクレオチドはRNAポリメラーゼのためのプ
ロモーターを含む5'からプライミング配列に至る配列を
有するスプライスの鋳型である。）;DNAポリメラーゼ;R
NA−DNA複合体のRNA鎖を選択的に減成する酵素活性（例
えばRNアーゼＨ）；およびプロモーターを認識するRNA
ポリメラーゼ、を混合することからなる。反応混合物の
構成因子は順次または一度に合することができる。反応
混合物をオリゴヌクレオチド／標的配列が形成される条
件下で、そしてDNAプライミングおよび核酸合成条件
（リボヌクレオチド三燐酸およびデオキシリボヌクレオ
チド三燐酸を含む）のもとで標的配列の多数のコピーが
作られるに十分な一定時間インキュベートする。この反
応は、構成因子である酵素のような反応因子の安定性を
維持するのに好適な条件の下で、そして増幅反応過程の
間反応条件の修飾または操作を要することなく、有利に
起こる。したがってこの反応は、実質的に等温の条件下
で起こり得、実質的に一定のイオン強度およびpHを含
む。
この反応は、第一のDNA伸長反応により生成するRNA−
DNA複合体を分離する変性工程を必要としない。こうし
た工程は、反応混合物の温度の実質的上昇（一般に周囲
温度ないし約80℃から約105℃まで）、そのイオン強度
の減少（一般に10Xまたはこれ以上）、またはpHの変化
（通常pHを10またはこれ以上に上げる）によるような反
応条件の操作を必要とする。このような反応条件の操作
はしばしば酵素活性に有害に作用して余分の酵素の添加
を要し、また、これをさらなる核酸合成に好適な条件に
戻すためさらに反応混合物の操作が必要にもなる。
好適なDNAポリメラーゼは逆転写酵素を包含する。特
に好適なDNAポリメラーゼはAMV逆転写酵素およびMMLV逆
転写酵素を包含する。
本発明方法に使用されるプライマーおよび／またはス
プライスの鋳型への組み込みに好適なプロモーターまた
はプロモーター配列は、その配列を認識し且つこれに結
合するRNAポリメラーゼによって特異的に認識され、転
写の工程を開始させ、これによりRNA転写物を生成させ
る核酸配列（天然に存在するか、合成により作られる
か、または制限消化の産物のいずれか）である。この配
列は所望によりRNAポリメラーゼのための実際の認識部
位を越えて伸長しているヌクレオチド塩基を含んでよ
く、これが安定性または減成工程に対する感受性の増加
または転写効率の向上を与え得る。開始配列を認識でき
る既知の且つ利用可能なポリメラーゼのあるプロモータ
ー配列は、使用にとりわけ好適である。典型的な既知の
且つ有用なプロモーターは、バクテリオファージT3、T7
またはSP6由来のもののように、ある種のバクテリオフ
ァージポリメラーゼにより認識されるもの、または大腸
菌由来のプロモーターを包含する。
本発明方法での使用に好適ないくつかの逆転写酵素
は、例えばAMV逆転写酵素のようにRNアーゼＨ活性を有
するが、大腸菌RNアーゼＨのような外性RNアーゼＨを添
加するのが好ましい。実施例に示すように、外性RNアー
ゼＨの添加が必要でなくとも、ある条件下ではAMV逆転
写酵素中に存在するRNアーゼＨ活性が、反応混合物中に
存在する因子によって阻害されることがある。このよう
な状況においては外性RNアーゼの添加が望ましい。比較
的大量の異種DNAが反応混合物中に存在する場合、AMV逆
転写酵素の本来のRNアーゼＨ活性は多少阻害され（例え
ば実施例８参照）、したがって、生成する標的配列のコ
ピー数はその結果減少する。標的配列が、存在するDNA
のうちわずかな部分しか含まない場合（例えば試料が有
意な量の異種DNAを含有するとき）、外性RNアーゼＨを
添加するのが特に好ましい。このような好ましいRNアー
ゼＨの１つは大腸菌RNアーゼＨである。このような外性
RNアーゼＨの添加が大量のDNAにより引き起こされる阻
害を克服することが示された（例えば実施例８参照）。
これらの方法により生成したRNA転写物は、前記の機
作により標的配列のさらなるコピーを生成する鋳型とし
て働くことができる。この系は自触的であり、本発明方
法による増幅は、温度、pH、イオン強度などのような反
応条件を繰り返し修飾または変化させる必要なしに自触
的に起こる。この方法は高価な温度循環装置を要せず、
増幅反応工程の最中に酵素または他の試薬を何回も添加
する必要もない。
本発明方法は、臨床上、環境の、法医学、および類似
の試料中の特定の核酸標的配列を検出および／または定
量するため、または種々の用途のために特定の標的配列
のDNAおよび／またはRNAの多数のコピーを生成させるた
めの検定の一因子として使用できる。
典型的な検定においては、増幅すべき試料を、緩衝
液、塩、マグネシウム、三燐酸、プライマーおよび／ま
たはスプライスの鋳型、ジチオトレイトール、およびス
ペルミジンを含有する緩衝液濃縮物と混合する。この反
応物を所望により100℃付近で２分間インキュベートし
て核酸中の二次構造を変性させる。冷却後、もし標的が
確定した3'末端を持たないDNA標的ならば、逆転写酵素
を加え、反応混合物を約42℃で12分間インキュベートす
る。今回はDNA鋳型からプライマー伸長産物を分離する
ために反応物を100℃付近で再度変性させる。冷却後、
逆転写酵素、RNAポリメラーゼ、およびRNアーゼＨを加
え、反応物を37℃で２ないし４時間インキュベートす
る。次いで生成物を変性させ、プローブ溶液を加え、60
℃で20分間インキュベートし、ハイブリダイズしていな
いプローブの標識を選択的に加水分解する溶液を加え、
反応物を60℃で６分間インキュベートし、そしてルミノ
メーターで残っている化学ルミネセンスの標識を測定す
ることにより、反応物を検定することができる。上記に
引用したHPA適用の方法をここに記載してある。溶液内
プローブハイブリダイゼーションの代わりに、生成物を
測定する幾つかの他の方法を用いることができる。
標的が確定した3'末端を持ち、且つ一方のオリゴヌク
レオチドが、3'末端に対しこれと複合体を作るに十分相
補的な複合体形成配列、および5'から複合体配列に至る
プロモーター配列を有するスプライスの鋳型である場
合、または標的がRNAである場合、典型的な検定は、標
的を前記の緩衝液濃縮物と混合し二次構造を変性させる
ことを含む。冷却後、逆転写酵素、RNAポリメラーゼ、
および所望ならばRNアーゼＨを加え、混合物を37℃で２
ないし４時間インキュベートする。次いで反応物を前記
のように検定することができる。
II.予備操作 以下の記載は、所望により本発明の好ましい方法と共
に使用できる予備操作の幾つかの態様である。幾つかの
標的核酸は自触的増幅に先立ち修飾を要するため、これ
らの操作を用いて修飾を行なう。標的核酸（および標的
配列）が本来DNAである場合、これらの操作を用いて概
括的方法で使用するための標的配列のRNAコピーを作る
ことができる。これらの予備操作は自身反復でき、故に
それ自身増幅方法として使用できることが理解されるべ
きである。
予備操作Ｉ この方法は、確定した3'末端を有する１本（一本鎖）
のDNAからなる標的核酸の標的配列のRNAコピーを与える
ものである。予備操作Ｉは２個の核酸構成因子、即ち標
的核酸分子およびオリゴヌクレオチドスプライスの鋳型
を使用する。この操作は確定した3'端を有するDNA標的
核酸を要する。もし本来の3'末端が未知または何らかの
理由で不十分な場合は、制限ヌクレアーゼの使用、別の
配列へのライゲーション、または他の何らかの手段によ
って新たな確定3'末端を作り出すことができる。
以下の記述において、（第2A図ないし第2C図参照）標
的核酸は自由裁量により「マイナス」の意義を有するも
のとする。したがってスプライスの鋳型は標的に対しこ
れと複合体を作るに十分相補的であるような「プラス」
の意義を有することになる。このスプライスの鋳型は標
的の3'末端に対しこれと複合体を作るに十分相補的な複
合体形成配列を有する。さらにスプライスの鋳型は、RN
Aポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む5'から
複合体形成配列に至る配列を有する。スプライスの鋳型
は所望により、5'からプロモーターに至る、プロモータ
ーおよび複合体形成配列の間、および／または3'から複
合体形成配列に至る、他の配列を有していてよい。スプ
ライスの鋳型はさらに3'末端でブロックされるよう修飾
されていてもよく、その結果これは伸長反応において余
分のヌクレオチドを添加しても伸長できず、またスプラ
イスの鋳型として働くのに加えてプライマーとして働く
ことができなくなる。
予備操作Ｉは２種の酵素活性、即ちDNA依存DNAポリメ
ラーゼおよびDNA依存RNAポリメラーゼを使用する。
標的核酸を、オリゴヌクレオチド／標的配列複合体が
作られDNA合成が開始し得る条件下でスプライスの鋳型
で処理する。適当なDNAポリメラーゼを使用するDNA伸長
反応においては、5'から複合体形成配列に至るスプライ
スの鋳型の配列に対し相補的な配列を標的DNAの3'末端
に付加する。スプライスの鋳型は、もし3'末端でブロッ
クされていなければDNAポリメラーゼのためのプライマ
ーとしても働き、伸長してプライマー伸長産物を与え
る。この伸長反応の産物、即ち二本鎖または部分的二本
鎖のいずれかである標的／スプライスの鋳型複合体は、
プロモーターを認識するRNAポリメラーゼを用いるRNA転
写物の合成のための鋳型として働く。次いでRNA転写物
を、概括的方法用に使用、または以下のごとくRNAのDNA
コピーの生成に使用することができる： 標的配列を含むRNA転写物（「プラス」意義を有す
る）を、オリゴヌクレオチド／標的配列複合体が形成さ
れDNA合成が開始し得る条件下で、RNA転写物の標的配列
の3'端に対しこれと複合体を作るに十分相補的な複合体
形成配列を有するプライマー（名目上「マイナス」意義
を有する）で処理する。次いでこのプライマーを、標的
配列を有するDNAプライマー伸長産物を作り出す鋳型と
してRNA転写物を用いるDNA伸長反応で伸長させる。DNA
標的配列を、RNAの変性または減成のいずれかによりRNA
転写物から分離し、スプライスの鋳型で始まるサイクル
を反復させる。所望によりプライマーは5'からプライミ
ング配列に至る余分の配列をも有していてよい。さらに
スプライスの鋳型もまた3'から複合体形成配列に至る余
分の配列を有していてよい。
ある態様において、上の方法を、3'からスプライスの
鋳型を含む配列に至るプライマーを含む配列を有するオ
リゴヌクレオチドを使用することにより、１個のオリゴ
ヌクレオチドを用いて実施することができる（例えば第
2C図参照）。
予備操作Ｉをさらに第2A図ないし第2E図を参考にして
説明する。第2A図は、確定した3'末端を持ち、3'から標
的配列に至る余分の配列を持たない標的核酸（DNA）を
示している。第一のオリゴヌクレオチドはプライマーお
よびスプライスの鋳型の両者を含み、5'から複合体形成
配列に至るプロモーターを有する。
第2B図は第2A図に示されるような標的核酸（DNA）を
示している。第一のオリゴヌクレオチドは、3'端でブロ
ックされ、したがってプライマーとして働くことのでき
ないスプライスの鋳型を含んでいる。
第2C図は第2A図および第2B図に示されるような標的DN
Aを示している。第2C図は、5'からその3'端のプライマ
ー配列に至るスプライスの鋳型（プロモーターを有す
る）の配列を有する一個のオリゴヌクレオチドの使用を
示している。即ちこのオリゴヌクレオチドは、工程
（１）および（７）ではブロックされたスプライスの鋳
型として、そして工程（４）ではプライマー（およびス
プライスの鋳型）として働く。
第2D図は、確定した5'端、ならびに、前述の複合体形
成、プライマー伸長および分離工程（工程１および２）
受けて確定した3'末端を有する相補的DNA標的を作り出
す、3'から標的配列に至る余分の配列を有する標的核酸
（DNA）を示している。工程（１）および（７）のオリ
ゴヌクレオチドは、最初の標的DNAの標的配列（ここで
は名目上（＋））の3'末端部分と複合体を作るプライマ
ーを含む。他のオリゴヌクレオチド（工程（４）および
（10））は、最初の標的に対する相補体の3'端と複合体
を作る、ブロックされていないスプライスの鋳型を含
む。
第2E図は、確定した5'端、ならびに、前述の複合体形
成、伸長および分離工程（工程（１）および（２））を
受けて確定した3'末端を有する相補的DNA標的を作り出
す、3'から標的配列に至る余分の配列を有する標的核酸
（DNA）を示している。工程（１）および（７）のオリ
ゴヌクレオチドは、最初の標的DNAの標的配列（ここで
は名目上（＋））の3'末端部分と複合体を作るプライマ
ーを含む。工程（４）および（10）のオリゴヌクレオチ
ドは、最初の標的に対する相補体の標的配列の3'末端部
分と複合体を作るブロックされたスプライスの鋳型を含
む。
スプライスの鋳型は、標的／スプライスの鋳型複合体
が形成されDNA合成が開始し得るような複合体形成条件
下で、標的核酸の3'末端と複合体を作る。（工程１）適
当なDNAポリメラーゼを用いて標的核酸の3'末端を伸長
し、5'から複合体形成配列に至るスプライスの鋳型の配
列に対し相補的な配列を付加する。もしスプライスの鋳
型の3'末端がブロックされておらず、標的核酸に対し十
分相補的であるならば、このスプライスの鋳型はプライ
マーとして働き、その結果スプライスの鋳型の3'末端も
また伸長され得る。（第2A図）得られた標的／スプライ
スの鋳型複合体は部分的または完全に二本鎖である。
（第2A図対第2Bおよび2C図参照）最小限この二本鎖領域
は標的核酸と複合体を形成したプロモーター配列および
プライミング配列を含む。
工程２の鋳型は適当なRNAポリメラーゼにより転写さ
れる。このRNAポリメラーゼは各鋳型につき約５−1000
のRNAコピーを生成する。第2A図ないし2C図において、
生成したRNAは名目上「プラス」意義であり、プロモー
ターの3'端から標的核酸の5'端に至る配列を含む。
工程３のRNA産物は概括的方法にしたがって標的配列
を自触的に増幅させるために使用でき、または、別法と
して、このRNA中の標的配列の3'末端部分に対しこれと
複合体を形成するに十分相補的な複合体形成配列を3'末
端に持ち、且つ所望により5'から複合体形成配列に至る
他の配列を含むプライマーと複合体を形成且つプライミ
ングする条件下で処理することができる。このプライマ
ーを、プライマー伸長反応において、RNAを鋳型として
使用してRNA依存DNAポリメラーゼにより、伸長する。こ
れにより少なくとも部分的に二本鎖の生成物が作られ、
そしてこれは例えばRNアーゼＨによる（工程５）RNA部
分の減成または変性のような他のなんらかの方法によっ
て、さらなる合成のために少なくとも部分的に一本鎖と
しなければならない。
工程６で生成したDNAは工程１のための標的分子とし
て使用でき、前記のごとくスプライスの鋳型で処理し
て、より多くのRNAおよびDNAを生産させる。これらの工
程を、所望の増幅レベルが生成するまで循環させること
ができる。スプライスの鋳型およびプライマーの適当な
選択により、この新たな標的分子（工程６）が最初の分
子とは異なる末端を持つことができることにも留意され
たい。さらに、もしRNA由来のプライマー伸長産物が5'
から複合体形成配列に至るプロモーター配列を有するな
らば、「プラス」意義の複合体形成配列を持ち、所望に
より5'から複合体形成配列に至る他の配列をも有する第
二プライマーを、伸長したプライマー産物の複製に使用
してRNAポリメラーゼのための二本鎖鋳型を生成するこ
とができる。このように作られた鋳型はRNAポリメラー
ゼが「マイナス」意義のRNAを作ることを可能にし、こ
のRNAを、概括的方法を用いて増幅、または本明細書中
の操作を用いてさらに増幅することができる。
予備操作II 予備操作IIは、自触的反応種を生み出す方法の点で予
備操作Ｉと異なる。DNA標的核酸は確定した3'末端を持
つ必要が無い。ある側面においては、スプライスの鋳型
の代わりに5'から複合体形成配列に至るプロモーター配
列を含んでいるプライマーを使用して、このプロモータ
ー配列をRNAポリメラーゼのための鋳型へと導入する。
このプライマーは、標的配列の3'末端部分に対しこれと
複合体を作るに十分相補的な複合体形成配列、および、
5'から複合体形成配列に至るRNAポリメラーゼのための
プロモーターを含む配列を有する。このプライマーをDN
Aポリメラーゼで伸長させてプライマー伸長産物を得
る。
通常熱変性により鎖を分離した後、標的分子と同じ意
義の第二のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い
て、第一プライマー伸長産物に対するDNA相補物を合成
する。第二プライマーは、プロモーターを含み得る5'か
ら複合体形成領域に至る余分の配列を持ち得る。第二プ
ライマー中にプロモーター配列が含まれることにより増
幅が促進される。第二プライマーはスプライスの鋳型で
もあり得る。
予備操作IIを第３図を参考にしてさらに説明する。第
３図は、5'および3'の両方から標的配列に至る余分の配
列を有する標的DNAを示している。第一プライマーはそ
の3'末端に複合体形成配列、そしてプロモーター配列を
含む5'から複合体形成配列に至る配列を持ち、標的と十
分複合体を形成してプライミング機能を発揮しDNA合成
を開始させる。適当なDNAポリメラーゼがこのプライマ
ーを伸長してプライマー伸長産物を与える。この鎖を変
性または他の手段により分離して、プライマー伸長産物
を含む一本鎖のプロモーターを生成する。
第一プライマー伸長産物の標的配列の3'末端部分に対
し十分相補的な複合体形成配列をその3'末端に持ち、そ
して所望により、プロモーター配列を含み得る5'から複
合体形成配列に至る他の配列を持つ、第二プライマーを
使用する。第二プライマーは工程３からのプライマー伸
長産物と十分複合体形成してプライミング機能を発揮し
DNA合成を開始させる。DNAポリメラーゼは第二プライマ
ーを伸長させて第二プライマー伸長産物を与える。得ら
れた二本鎖DNA分子はこの時点でRNAポリメラーゼのため
の鋳型として働き、概括的方法のためのRNA転写物を産
むことができる。第３図に示すように、生成されたRNA
分子は名目上「プラス」意義であり、本発明に係る概括
的方法を用いて増幅することができる。
第二プライマーの複合体形成配列が工程３からの第一
プライマー伸長産物の3'末端に対し相補的であり、第二
プライマーが5'から複合体形成配列に至るプロモーター
配列を含んでいる場合、第二プライマーはスプライスの
鋳型として働き、その結果工程３からの第一プライマー
伸長産物の3'末端がさらに伸長してプロモーター配列を
付加し、両意義のRNA転写物を生成するRNAポリメラーゼ
のための鋳型ができる。このようにして作られたRNA分
子は概括的方法を用いて増幅することができる。
本発明の他の側面においては、第二プライマーがスプ
ライスの鋳型として働き、且つ5'から複合体形成配列に
至るプロモーターを有し、その結果第一プライマーはプ
ロモーターを有する必要が無い。この場合、工程２から
の第一プライマー伸長産物はさらに伸長してプロモータ
ー配列に対する相補体を生成し、こうして「マイナス」
意義のRNAを生産するための鋳型がRNAポリメラーゼによ
って作られる。
上記の工程を反復することにより、さらなる標的配列
のRNAおよびDNAコピーを生産することができる。
実施例 序文 前述の方法に対する以下の実施例は本発明方法の機作
および用途を説明するものである。これらは本発明を限
定するものではなく、そのように解してはならない。
１またはそれ以上の実施例において用いられる多くの
物質は類似している。実施例の記載を単純にするために
幾つかの物質を略記し、ここに説明する。
「frag1」と称する鋳型は、Ｂ型肝炎ゲノム由来のDNA
の一部分と相同性の二本鎖DNAセグメントである。これ
は制限ヌクレアーゼ消化によりプラスミドから切り取ら
れ、クロマトグラフィー法によって残りの核酸から精製
された。精製に続いてこのフラグメントは制限エンドヌ
クレアーゼで切断し、フェノール抽出を経て精製し、エ
タノール沈澱により所望の標的を得た。
「M13L（−）」と称する鋳型は、全配列のうちの小断
片としてマイナス鎖標的配列を含む精製された一本鎖DN
A標的である。
本明細書に記載される実施例においては幾つかの異な
るプライマーおよびスプライスの鋳型を使用した。T7pr
o（＋）と称するオリゴヌクレオチドは、5'末端付近にT
7RNAポリメラーゼのプロモーター、そして3'末端付近に
は、上記２種の鋳型に対するマイナス鎖標的配列の3'末
端に対して相補的な配列を含む。さらにT7pro（＋）は
その働きを促進するための他の配列情報をも含んでい
る。T7pro（＋）の配列は、5'−AATTT AATAC GACTC
ACTAT AGGGA GAGGT TATCG CTGGA TGTGT CTGCG G
CGT3'である。
T7proに類似のもう一つのオリゴヌクレオチドはddT7p
ro（＋）である。これは、3'末端が末端デオキシヌクレ
オチジルトランスフェラーゼを用いてジデオキシヌクレ
オチドで伸長されている点でT7pro（＋）と異なる。T7p
ro（＋）と異なりddT7pro（＋）は、逆転写酵素によるD
NA合成のためのプライマーとして働くことはできない
が、スプライスの鋳型として働くことができる。
HBV（−）Prは、frag1鋳型のプラス鎖とハイブリダイ
ズしM13L（−）の内部の配列と相同的なプライマーであ
る。［HBV（−）Prは3'からT7pro（＋）に対し相同的な
プラス鎖配列に至る配列に対して相補的である。］HBV
（−）Prに相当する配列は、5'−GAGGA CAAAC GGGCA
ACATA CCTTG−3'である。
プロモーター領域を含むもう一つのオリゴヌクレオチ
ドはT7pro（−）である。このプロモーター−プライマ
ーはT7pro（＋）と同一の配列を含むが、マイナス標的
に対して相補的な配列がプラス標的に対して相補的な配
列で置き変わっている。T7pro（−）の3'末端はfrag1の
プラス鎖の3'末端に対して相補的である。T7pro（−）
に相当する配列は、5'−AATTT AATAC GACTC ACTAT
AGGGA GATCC TGGAA TTAGA GGACA AACGG GC−3'で
ある。ddT7pro（＋）と同様に、ddT7pro（−）は、末端
デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて3'
末端をジデオキシヌクレオチドで伸長することによって
作られた3'がブロックされたオリゴヌクレオチドであ
る。ddT7pro（−）はプライマーとして働くことはでき
ないが、他の点ではT7pro（−）と類似している。
これらの実施例で用いられる鋳型は、プライマーに対
して相同的または相補的な領域および前記のスプライス
の鋳型の間の実質的な配列を含む。オリゴヌクレオチド
間の配列が本発明の結果として増幅されるのであるか
ら、この配列の定量化は増幅を測定する特異的手段を提
供する。この生成物は、オリゴヌクレオチドプライマー
とスプライスの鋳型の間にコードされた配列に特異的な
DNAプローブを用いるハイブリダイゼーション技術によ
って検定するのが簡便である。以下に示す実施例では２
個のプローブ、即ちプローブ（＋）およびプローブ
（−）を使用する。プローブ（＋）はマイナス意義の生
成物に対して相補的であり、プローブ（−）はプラス意
義の生成物に対して相補的である。プローブ（＋）に相
当する配列は5'−CCTCT TCATC CTGCT GCTAT GCCTC
−3'であり、プローブ（−）に相当する配列は5'−GAGC
ATAGC AGCAG GATGA AGAGG−3'である。本明細書中
で使用されるプローブは化学ルミネセンスの標識で標識
した。検定において、ハイブリダイズしたプローブ上の
標識はルミノメーターで測定される光を放出する。
以下の実施例において、相対的増幅を以下のように測
定した。増幅反応混合物の試料（通常10μｌ）を10mMト
リス−HCl（pH8.3）で50μｌに希釈し、95℃で２分間変
性させた。氷上で冷却した後、およそ75fmolのプローブ
（＋）またはプローブ（−）、0.2M琥珀酸リチウム（pH
5.2）、21％（w/v）ラウリル硫酸リチウム、2mMEDTA、
および2mMEGTAを含有するプローブ溶液50μｌを試料に
加え、混合した。次いで反応物を60℃で20分間インキュ
ベートし冷却した。各ハイブリダイゼーション反応物
に、飽和ほう酸ナトリウム溶液を塩酸でpH8.5に調節
し、次いでこのほう酸の最終濃度が0.8Mとなるよう希釈
し、トリトンＸ−100を最終濃度５％（v/v）まで加える
ことにより調製した溶液500μｌを添加した。次にこの
反応物を混合し、60℃で６分間インキュベートして、ハ
イブリダイズしていないプローブの化学ルミネセンス標
識を破壊した。このハイブリダイズしていないプローブ
の化学ルミネセンス標識の破壊方法は非常に特異的であ
って、ハイブリダイズしていないプローブのうちほんの
わずかな部分のみに化学ルミネセンスが残るだけであ
る。反応物を冷却し、残留する化学ルミネセンスを、1.
5M水酸化ナトリウム200μｌ、0.1％（v/v）過酸化水素
を加えてルミノメーターで定量した。この検定におい
て、ハイブリダイズしたプローブはルミノメーターで測
定される光を放出する。ハイブリダイズしていないプロ
ーブの化学ルミネセンス標識を破壊する反応は100％有
効ではないため、一般に約300ないし1300相対光単位（R
LU）の範囲で存在する信号のバックグラウンドがある。
同位体で標識したプローブとのハイブリダイゼーショ
ン、ブロッティング技術および電気泳動を使用する検定
を含む他の多くの検定法もまた利用可能である。
以下の実施例において使用される酵素は、セイカガク
・アメリカ、Inc.の鳥の骨髄芽球症ウイルス逆転写酵
素、ニュー・イングランド・バイオラブズまたはエピセ
ンターのT7RNAポリメラーゼ、ならびにベセスダ・リサ
ーチ・ラボラトリーズのモロニー・ネズミ白血病ウイル
ス（MMLV）逆転写酵素および大腸菌RNアーゼＨである。
類似の活性を持つ他の酵素および他の供給源からの酵素
もまた使用でき、また、異なったプロモーター特異性を
有する他のRNAポリメラーゼもまた使用に適している。
別途記載のない限り以下の実施例において使用する反
応条件は、容量100μｌ中、40mMトリス−HCl、25mMNaC
l、8mMMgCl2、5mMジチオトレイトール、2mMスペルミジ
ン三塩酸塩、1mMrATP、1mMrCTP、1mMrGTP、1mMrUTP、0.
2mMdATP、0.2mMdCTP、0.2mMdGTP、0.2mMdTTP、0.15μＭ
の各プライマーまたはスプライスの鋳型、および特記し
た量の鋳型および酵素である。
これらの反応条件は必ずしも最適のものではなく、い
くつかの系では記したように変更されている。これらの
および他の標的配列のために他の配列が使用されてお
り、使われているオリゴヌクレオチド配列は一例であっ
てこれを限定する意図ではない。
実施例１ 予備工程Ｉ 本システムが機能することを説明するために、上記の
４つのプロモーター含有オリゴヌクレオチドを各々別々
に4fモルのターゲット（フラッグ１）を含有あるいは非
含有の反応液に加えた。反応液を95℃で２分間インキュ
ベートしてターゲットを変性させ、ついで冷却して該オ
リゴヌクレオチドをターゲットにアニーリングさせた。
逆転写酵素13単位とT7RNAポリメラーゼ100単位を加え、
反応液を37℃で30分間インキュベートした。反応液の10
分の１をハイブリディゼーション法で検定した。表１に
示した結果（相対光単位（Relative Light Unitある
いはRLU（ｓ）とｆモルで表示している）はブロックし
たあるいはブロックしていないオリゴヌクレオチドがス
プライス鋳型として作用し、生成物を生成することを示
している。ターゲット非存在下の反応液で測定した信号
はこのタイプのアッセイに於ける信号の典型的なバック
グラウンドを示している。
実施例２ 予備工程Ｉのサイクリング 増幅システムをddT7pro（＋）とT7pro（＋）でサイク
ルした。この実験で、標準反応液では4aモルのフラッグ
Ｉ、HBV（−）PrおよびddT7pro（＋）あるいはT7pro
（＋）を混合し95℃でインキュベートした。冷却後、逆
転写酵素13単位とT7RNAポリメラーゼ100単位を加え、混
合物を37℃で30分間インキュベートした。反応物の10分
の１を測定のため除き、残りでサイクルを繰り返した。
３回サイクルを繰り返した後、その10μリットル部をハ
イブリディゼーション法にてプローブ（−）により測定
した。表２に示した結果は生成物がブロックしたスプラ
イス鋳型あるいは非ブロックしたスプライス鋳型いずれ
ともサイクリングすることにより増幅することを示して
いる。
実施例３ 予備工程Ｉの感度 この実施例では非ブロックスプライス鋳型、T7pro
（＋）とプライマー、HBV（−）Prを用い増幅法の感度
を調べた。予備工程Ｉの６サイクルを実施例２と同様に
フラッグ１の量を減少しながら行った。増幅後、生成物
を発明の詳細な説明の欄で述べたハイブリディゼーショ
ン法を用いて測定した。この方法を用いて４×10-21モ
ルのフラッグ１が検知され得た（表３参照）。
表３ 予備工程Ｉの６サイクルを用いた感度 ターゲット（モル） 検体（μｌ） 生成物（RLU's） ４×10-18 5 328390 ４×10-19 20 105364 ４×10-20 20 3166 ４×10-21 20 1927 ０ 20 806 実施例４ 予備工程Ｉを含む増幅 下記実施例では、増幅されるターゲットはフラッグ１
であった。反応液の最初のセットでは、ターゲットとス
プライス鋳型の種々の組み合わせを95℃で２分間インキ
ュベートし、ついで冷却し逆転写酵素13単位とT7RNAポ
リメラーゼ100単位を加えた。反応混合物を37℃で30分
間インキュベートしついで５μｌ部の反応混合物を両プ
ローブと測定して生成物を定量した。この測定の後、反
応液を５μｌの反応液１および２、およびＴ（−）スプ
ライス鋳型を用いて調製した。混合物を95℃で２時間イ
ンキュベートし、冷却しついで逆転写酵素13単位T7RNA
ポリメラーゼ100単位を加えた。新しい反応物を混合し3
7℃で２時間インキュベートした。その10μｌ部を下記
表４に示した時間で氷浴に除いた。生成物を前記のハイ
ブリディゼーション方法を用い測定した。データは両ス
プライス鋳型がいずれもフラッグ１からRNAを生成せし
めたことを示している。データはまたRNAとそのRNAに相
補のスプライス鋳型を含有した反応液中でより多くのマ
イナスおよびプラスセンス生成物が生成されたことを有
意に示している。最後に、反応液1Bの反応速度論は生成
物の幾何学的増加を示し、一方反応液2Bの速度論はもっ
と直線である。この違いは1B反応液での生成物はさらに
生成物を生成する為の基質として作用していることを示
し、つまりこの反応は自触反応である。
実施例５ 予備工程Ｉを含む増幅の反応速度論 下記の実施例は本発明方法のこの態様の可能性を示
す。フラッグ１の少量（10aモル）をT7pro（＋）、T7pr
o（−）およびHBV（−）Prの種々の組み合わせと反応に
用いた。反応混合物を95℃で２分間インキュベートして
DNAターゲットを変性し、冷却しついで逆転写酵素とT7R
NAポリメラーゼを加えた。混合後、反応液を37℃で30分
間インキュベートした。その15μｌ部を種々の時間で除
き、０℃で測定まで保存した。反応生成物を定量するた
めにハイブリディゼーションアッセイを用いた。表５に
示したデータは本発明が１つのスプライス鋳型と１つの
プライマーを必要とすることを示している。しかしなが
ら第２のスプライス，鋳型は有利である。１つのみのプ
ライマーあるいはスプライス鋳型で得た結果は本アッセ
イの測定限界以下であった。先の実施例のように、反応
速度論は幾何学的であり自触反応を示唆している。
我々の次の研究は先行技術の方法より実質的に優れて
いる、5.0時間以上にわたる生成物合成の継続を示し
た。我々はさらに感度の向上をも示した。
実施例６ 予備工程IIを含む増幅 この実施例ではプライマーの種々の組み合わせを用い
て決定した末端のないDNAターゲットの500aモルを増幅
する。ターゲットは先に引用したM13L（−）であった。
反応物調製にあたって、サンプルを95℃で２分間インキ
ュベートし、冷却しついで逆転写素13単位を加えた。反
応物をついで42℃で12時間インキュベートした。次に、
反応物を再び95℃で２分間インキュベートし冷却した。
逆転写酵素とT7RNAポリメラーゼを加え、37℃で２分間
インキュベートした。反応物の10μｌ部をプローブ
（＋）およびプローブ（−）と測定した。表６に示した
結果は大量の核酸の合成が２つのプライマーを用いた時
のみ起こることを示している。また２つのプロモーター
プライマーが１つのプロモータープライマーと１つのプ
ライマーに比べて有利なことを示している。反応液４お
よび５における低レベル合成は元の鋳型から約１コピー
のDNAの合成に符合する。本システムを初期95℃変性工
程を要し、この工程は二重鎖ターゲットあるいは一本鎖
ターゲットの二重鎖領域を変性し同時にまた不活性の望
まれないヌクレアーゼやプロテアーゼ活性をも変性す
る。
実施例７ RNAseHの作用 外因性RNAseHの添加が本発明の自触反応システムでの
増幅を向上し得ることを示すために、いくつかの反応物
を種々の量のターゲット、M13L（−）および外因性RNAs
eHを０あるいは２単位用いて調製した。用いた外因性RN
AseHはE.coli.由来であった。すべての反応物はT7pro
（＋）とT7pro（−）と調製した。反応物を95℃変性処
理に処し、冷却し逆転写酵素を加えた。42℃で12分間イ
ンキュベート後、反応物を再び95℃で変性した。冷却
後、逆転写酵素、T7RNAポリメラーゼおよび必要な場合
は（表７参照）RNAseHを加え、37℃で３時間インキュベ
ートした。その10μｌ部を各反応混合物からハイブリデ
ィゼーション法によるアッセイのために１時間毎に除い
た。表７のデータは外因性RNAseHが有意に反応速度を促
進し本発明の感度を上昇させることを示している。600R
LU's以下の信号は典型的なバックグラウンドレベルとみ
なした。
実施例８ 外因性DNAの作用 外因性DNAの添加が有意に本自触増幅システムを阻害
し得ることを示した。外因性RNAseHの添加の有利性をさ
らに示すために、増幅反応液を２μｇの子牛胸腺DNAの
添加あるいは不添加で調製しこの阻害を示した。子牛胸
腺DNA添加の反応液では、逆転写酵素を２濃度で用い、
さらにAMV RNAseHがこの阻害を克服するかどうかを調べ
た。また、E.coli.由来のRNAseHを同様の理由によりい
くつかの反応液に加えた。反応液は標準反応液とは各リ
ボヌクレオチドの濃度が2.5mMまで上昇し、塩化マグネ
シウムの濃度が12.8mMまで上昇している点において異な
る。反応液をターゲットとして100aモルのM13L（−）
を、およびT7pro（＋）とT7pro（−）を用いて調製し
た。95℃で２分間変性後、反応液を冷却し逆転写酵素を
13単位あるいは39単位加え、さらに反応物を37℃で12分
間インキュベートした。反応液を再び95℃で変性し冷却
しついで逆転写酵素13単位あるいは39単位、T7RNAポリ
メラーゼ100単位あるいは300単位およびE.coli.RNAseH
を０単位あるいは２単位加えた。37℃で１時間インキュ
ベート後、各反応液の10μｌ部をハイブリディゼーショ
ンアッセイを用いて測定した。表８に示した結果は子牛
胸腺DNAが外因性DNAの無い反応システムに比べ反応を90
％阻害し、逆転写酵素の追加（RNAseHを伴う）は生成物
増幅を有意に影響しないことを示した。さらにT7RNAポ
リメラーゼの追加は生成物収量に有意な影響を示すが、
それは外因性RNAseHの追加による増加にほとんど関係し
なかった。阻害が除去されるだけではなくまた増幅も子
牛胸腺DNAとE.coli.RNAseHの無い反応に関係して５倍以
上も増加した。高濃度のE.coli.RNAseHとの反応でみら
れた信号はハイブリディゼーションアッセイで用いたプ
ローブ量を飽和していた。これらのサンプルを正確に定
量するために、増幅生成物は測定の前に希釈する必要が
あった。
実施例９ 総括方法による増幅 このシステムは初期転写と変性を要しない。つまりタ
ーゲットのDNA補体が作られ元のターゲットはRNAseHで
除かれる。DNAは次に第２プライマーあるいはプロモー
タープライマーにアニーリングしDNA合成を通してRNAポ
リメラーゼのための鋳型を作る。RNAseHが活性でない場
合は、始めに生成したDNA:RNAハイブリッドはRNAポリメ
ラーゼのための鋳型を生成することなく反応を終結させ
るであろう。本発明方法を説明する試みの中で、RNAポ
リメラーゼプロモーターとターゲット核酸を含有したプ
ラスミドを用い他の配列の中にターゲット配列を含有し
た大量の一本鎖RNA転写体を生成した。２つの同様な反
応液もまた調製した。つまりRNAポリメラーゼ不含のプ
ラスミド含有を１つ、他方はプラスミド不含でRNAポリ
メラーゼ含有の反応液である。これらの反応液の希釈物
を生成物定量のため測定した。３反応液すべての等希釈
物を２つのプロモータープライマー、T7pro（＋）およ
びT7pro（−）含有の増幅反応物を調製するために用い
た。表９の反応液１は60aモルのRNAと0.6aモルの原料プ
ラスミドを含有していた。反応液２は0.6aモルの原料プ
ラスミドを含有していたがRNAは含有していなかった。
反応液３はターゲットを全く含有しなかった。各反応液
は95℃で変性せず、かわりに逆転写酵素とT7RNAポリメ
ラーゼを加え37℃で４時間インキュベートした。ハイブ
リディゼーション法による後のアッセイのために１時間
毎に反応液の１部を除いた。表９に示したように、プラ
スミドとプラスミドから調製したRNAを含有した反応液
は大きなハイブリディゼーション信号を示した。つまり
プラスミドのみを含有した反応液はT7RNAポリメラーゼ
がプラスミドからRNAをつくることができるので重要な
生成物を生成し、これは総括方法により両センスの核酸
をさらに生成すめために利用できた。最後にターゲット
を含有しない対照（反応液３）は何も生成しなかった。
実施例10 総括方法による増幅 下記の実験は他の初期化方法が本発明において第１プ
ライマーの伸展と決定した末端の無いDNAターゲットの
変性工程の必要性を緩和しうることが可能かどうかを決
定するために行った。この実験では既知量のターゲット
を表10に示したよう第１逆転写酵素の存在下あるいは非
存在下で増幅した。一度にすべての酵素を加える増幅時
間は４時間であった。使用したターゲットは正常生理食
塩水に希釈したM13（＋）であった。T7pro（＋）とT7pr
o（−）を使用した。25μｌの各希釈液に25μｌの0.1N
KOHを加えた。サンプルを98℃で10分間インキュベート
しついで冷却した。各サンプルを100μｌにして、最終
濃度を50mMトリズマ（Trizma）塩基、40mMグルタミン
酸、25mM水酸化カリウム、12.8mM塩化マグネシウム、5m
Mジチオスレイトール、2mMスペルミジン三塩酸塩、2.5m
M各リボヌクレオチドトリホスフェート、0.2mM各デオキ
シリボヌクレオチドトリホスフェート、および0.15μＭ
各プライマーとした。標準プロトコール管に13単位の逆
転写酵素を入れ42℃で12分間、ついに95℃で２分間イン
キュベートし冷却した。ついですべての試験管に13単位
の逆転写酵素、100単位のT7RNAポリメラーゼおよび0.5
単位のRNAseHを加えた。反応液を37℃で４時間インキュ
ベートしその10μｌ部をケミルミネッセンスプローブア
ッセイにて測定した。表10の結果は短縮プロトコールを
用いた場合にいくらかの増幅は明らかであることを示し
ている。観察された増幅のレベルは有意に標準プロトコ
ールを用いた場合よりも低度であるが、これは同程度に
有効になるように開発され得るし、あるいは有意なレベ
ルのターゲット核酸が存在する場合には有用になり得
る。
これらのデータのもっとも予想される説明はT7RNAポ
リメラーゼが完全には特異的ではないということであ
る。ターゲット領域の少数のRNAコピーを生じる低レベ
ルのでたらめなRNA合成が存在する。これらのコピーは
標準方法により増幅される。
我々の初期の研究はある種のプライマーセットとター
ゲットで外因性RNAseHなしで優れた増幅を示した。反応
のメカニズムを明らかにする我々の次の研究で、広範囲
のターゲットに本方法を有効的に適用することが可能に
なった。我々はここに増幅に外因性RNAseHを用い、また
逆転写酵素を伴うRNAseH活性に呼応する方法を開示しそ
の権利を主張する。
我々はE.coli.RNAseは常に増幅を改良するわけではな
いので日常的に添加されるべきではないことを発見し
た。我々はRNAseHのいくつかの形態はRNA:DNAハイブリ
ッドのRNAのどこを切断するかについての特異的な配列
であることを確定した。増幅反応において、我々は完全
な長さの生成物DNA中のプロモーター含有プライマーを
検出しなかった。２つのプロモータープライマーを用い
た態様ではプロモータープライマーうちただひとつのみ
が完全な長さの生成物DNAに測定可能な限りにおいてと
り込まれている。本分野の技術者により自明なすべての
他のメカニズムは両プライマーを含有する完全な長さの
生成DNAを示唆している。これらの発見はRNAseHが増幅
の間に合成された主要RNA種を十分には分解していない
という可能性に因ると思われる。これらの発見に基づい
て、RNAseH配列特異性に関する我々の発見を組み入れた
新しい増幅メカニズムがここに開示される。新規で有用
なプロモータープライマー設計標準を開示する。さらに
は、ターゲット核酸配列の複数コピーを合成する新規な
方法をここに主張し、これは １）選択されたRNAseHによる分解にさらされた後にプラ
イマー伸展生成物を形成する能力を残すように位置して
いるRNAターゲットの部分と複合化するRNAターゲット配
列の部分に相補であるプライマーを選択し； ２）すべてのメッセンジャーRNAが実質的にRNAseHの分
解を通して二重鎖から除かれる領域においてDNAと複合
化するプライマーの伸展により得られるDNAの部分に相
関であるプロモータープライマーを選択し； ３）RNAターゲットとプライマー、プロモータープライ
マー、RNAseH、逆転写酵素をコンバインし、RNAの複数
コピーとそのRNAに相補のDNAの複数コピーを形成するこ
とを特徴とする。ここで開示の新規な方法はRNAターゲ
ット配列と同じ極性（あるいはセンス）のDNAの実質的
に等数のコピーを作らない。
この工程は新規なターゲットのための優れたプロモー
タープライマーとプライマーの設計を可能にする方法を
提供する。我々はプロモータープライマーとプライマー
のそのような組み合わせおよびそのための設計標準をこ
こに開示し主張する。ここで開示のメカニズムはRNA鎖
の転写のための新規な反応中間体を包含する。この中間
体は二重鎖DNAプロモーター領域を含むRNAとDNAの二重
鎖複合体である。我々の知る限りこのようにものはかつ
て文献に記載された事はない。実にどの先行技術システ
ムも、特にグアテリ、J.C.らの87PNAS1874〜1878（199
0）もまたジンゲラス、T.R.らのPCT出願番号88/10315号
のいずれもRNAseH分解サイトの位置に基づいてプライマ
ーとプロモータープライマー配列を適切に選択していな
い。このように、本方法は新規でありどの先行開示に対
しても自明なものはない。
RNAseH配列特異性の重要さと反応メカニズムの理解の
認識は本ターゲット増幅法を広範囲のターゲット配列に
有効的に適用ための鍵である。さらに、従来同業者はRN
AseHは十分にまた組織的にRNA:DNA複合体のRNA鎖を分解
しているとしていた。
I:増幅法のメカニズム 増幅効率を両先行方法と調べると使用したプライマー
セットでのわずかな変動を伴う増幅効率に大きな変異が
明らかとなった。先行技術が一般に受け入れている反応
方法は我々の見るところでは、なぜ１つのプライマーセ
ットが他よりずっと優れて作用するのか合理的な説明を
していない。
先行技術方法を用いて増幅法を改良する試みでは満足
出来る結果が得られなかった。DNA鎖を初期化する能力
での差がプライマーセット効率でみられた差の原因かど
うか知るためにプライミングの有効性を調べた。プライ
ミング効率と総体的増幅の間に相関性はみられなかっ
た。プライマーセットの自己相補構造と交差相補構造を
形成する能力の分析によりプライマー効率に於ける差は
これらのファクターに単に原因があるのでないと判明し
た。
我々はまたE.coli.RNAseHの添加が均一に増幅を改良
するのではないことを発見した。ここで提示するたデー
タが示すように、得られた結果はターゲットからターゲ
ットで、またプライマーセットからプライマーセットで
変化する。添加するE.oli.RNAseHの量は非常に重要であ
り狭い特定の範囲内に保たなければならない。与えられ
たターゲットとプライマーセットと共に、E.coli.RNAse
Hの添加は逆転写酵素がトリ骨髄芽球細胞症ウイルス（A
MV）由来のものでありモロニーマウス白血病ウイルス
（MMLV）でない場合には有利である。これらの結論を示
すデータを下記に記す。
初期の研究ではAMV逆転写酵素はウイルス複製の間に
形成されたRNA:DNAハイブリッドからRNAを消化する時に
比較的大きなフラグメントを残すことが示唆された。こ
れらのフラグメントはプライマーとして第2DNA鎖の合成
を初期化する。我々はAMVとMMLV RNAseH活性の配列特異
性の証拠があるという発見をここに報告するものであ
る。
反応メカニズムを明確にするために、個々のプライマ
ーの末端を32Pで標識し、各プライマーのDNA生成物への
とり込むをポリアクリルアミドゲル電気泳動により調べ
た。一般的に受け入れられている先行技術メカニズムに
よれば、両プライマーは完全な長さのDNA生成物にとり
込まれていることになる。しかしながら我々の実験では
増幅の間に合成された主要RNA種に相補するプライマー
のみが完全な長さの生成物にとり込まれていた。主要RN
A鎖と同じ極性を持つプライマーは決して完全な長さのD
NA生成物にとり込まれなかった。事実、それは全く小さ
いままで残った。これらの結果は多数の異なるターゲッ
トとプライマーセットで確認された。
プライマーの一つの伸展を検出出来なかったことか
ら、完全な二重鎖DNA中間体は増幅の間に蓄積しないこ
と、また自触増幅には要しないことが示唆された。これ
らの観察はRNAseHの可能な配列特異性を考慮した本発明
の増幅システムのメカニズムを示唆する。本メカニズム
を大まかに図４に示す。
実験により酵素がRNA:DNAハイブリッドのRNAを特殊な
切片に切断することが判明した。さらに、切断サイトの
位置は特異な領域にあることが判明した。メカニズムを
確認するために、我々のT7pro+/T7pro-ターゲットとプ
ライマーセットの組み合わせから生じたプラス鎖RNAを
含有したRNA:DNAハイブリッドを調製した。32P標識RNA
をメッセンジャーDNAにハイブリッドし、AMV逆転写酵素
（付随するRNAseH活性を含有している）とインキュベー
トし反応生成物をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分
析した（図５）。フラグメントの大きさから数個の小さ
な切片が生成しこれらは１つあるいは両方の末端の近く
を切断して生成したことが判明した。分子の内部部分は
切断されなかった。この実験は酵素が使用した反応条件
下で配列あるいは構造特異性を持つことを示している。
結果は図４の反応メカニズムと完全に一致する。
切断サイトがどこで起こるかを決定するためにさらに
実験を行った。複数切断サイトはプロモーター含有プラ
イマーと一致する領域にあり他のプライマーを結合する
領域には無いことが望ましい。RNA末端を個々に標識し
消化生成物を分析することにより、使用した条件下で切
断はRNAの5'末端のみに検出されることが判明した。こ
れは図４のメカニズムと一致する。
AMVおよびMMLV逆転写酵素のRNAseH活性が切断する配
列を調べるために配列決定実験を行った。特異的に各々
の酵素で切断されることにより配列は識別される。予測
通り、２つの酵素の配列特異性は異なりこれはあるプラ
イマーセットは一つの酵素とまた別のプライマーはもう
一つの酵素とより機能することを説明すると思われる。
我々の反応条件下でMMLV酵素で得た配列特異性は文献に
記載の別の反応条件下でのものと一致しない。これは特
異性は反応条件により影響され得ることを示唆してい
る。
増幅メカニズムに於けるRNAseHの役割の詳細に調べる
とcDNAコピーからの転写を指示するプロモーターの完全
な除去は必要でなく、あるいは新規の転写活性鋳型の形
成に望ましいという我々の発見に達した。つまりいくつ
かの適用に於いては、もしRNAseHがプロモータープライ
マーが第１鎖cDNA生成物にアニーリングする上でさらに
サイトに選択的であれば、またもし他のプライマーが転
写物にアニーリングするのにもっと阻害しなければ、逆
転写酵素固有のRNAseH由来の非常に低レベルのRNAseH活
性でさえ効果的な増幅に十分であろう。
E.coli.RNAseHはレトロウイルス酵素よりも伝えられ
るように特異的でないので、特にもしこのプライマー、
ターゲット、E.coli.RNAseH、および酵素活性に影響を
及ぼす成分の濃度が慎重に釣り合っていない場合には、
非プロモーター含有プライマーが結合している領域に割
って入るかもしれない。我々の見るところ、これらの結
果はE.coli.RNAseHの使用を商業的な分野での適用に適
しなくしている。逆転写酵素RNAseHが所望の領域で切断
しない場合や適した条件下で切断しない場合には、異な
る特異性を持つ他のRNAseH活性の添加は有効である。例
えば、MMLV逆転写酵素での研究により、この酵素はAMV
酵素よりもサンプルDNAによる阻害に敏感でないことが
判明した。多くのシステムに於いてこれは最良の様式で
ある。
新しいプライマーセットが設計され、模型と我々が今
までに得たRNAseH配列特異性情報に基づいて開示され
る。メカニズムや配列特異性の知識がない以前に設計さ
れたもので得たものよりも、有意に優れた合成がこれら
のプライマーセットから得られた。ここに記載の本発明
は特異的なターゲット領域の為の機能的なプライマーセ
ットの設計を可能にする。
我々が開示する新しいメカニズムはRNA鎖の転写の為
の新規な反応中間体を包含する。この中間体はRNAとDNA
の二重鎖複合体であり、これはまた二重鎖DNAプロモー
ター領域を包含する。我々の知識ではこの反応は述べた
通りどの先行技術とも異なる。
反応メカニズムを理解することはこれらのターゲット
増幅工程を使用する上で重要である。RNAseH配列特異性
の重要性を認識することは本ターゲット増幅法を広範囲
のターゲット配列に有効的に適用する上での鍵である。
一方、プロモータープライマー設計の実験的研究は困難
で経費がかかり、また成功の頻度も低くて本発明をこの
分野での貴重な進歩とする。
A.RNAseH活性濃度の狭範囲 E.coli.RNAseHを用いた増幅システムは、先に述べた
ように大量の合成が特殊なターゲットとプライマーセッ
トで得られるために当初は好ましい態様とみなされてい
た。またE.coli.RNAseHはサンプルDNAによる阻害を克服
するのを助長する上で有用であると発見された。しかし
ながら、反応の分析によりE.coli.RNAseHの添加は多く
の場合に増幅に不利益であることが判明した。さらに過
剰量あるいは過小量のE.coli.RNAseHの存在は有害なの
でその添加量は狭い範囲内だ注意深く調整されなければ
ならない。本方法を実用的に商業上適用するにあたって
は、特に酵素が保存にあたって完全に安定でないかも知
れないためにこれは重大な障害である。さらにE.coli.R
NAseHの使用によりこのシステムに過大な経費と煩雑さ
が加わる。経費は多くの商業的適用にとっては禁制であ
る。E.coli.RNAseHの使用はアッセイをさらに複雑に
し、その代わりに研究開発経費を上昇せしめこのアッセ
イを広範囲の商業的適用にとって繊細すぎるものとして
しまう。このようにアッセイメカニズムに対する我々の
説明は技術的に実行可能（ターゲットサイトへの適用
性）でまたより安価でより丈夫な工程である点において
広範囲の使用に適した方法に帰着した。初期の実験でE.
coli.RNAseHの添加が増幅上昇を起こすことが判明した
ので、血清やヒトDNAを含有したサンプルでの増幅シス
テムの実行に及ぼすE.coli.RNAseHの効果をいくつかの
実験で調べた。
実施例11 E.coli.RNAseH濃度の最適化 血清での最適増幅に必要なE.coli.RNAseH量を決定す
るために実験を行った。下記の実験はT7pro+/T7pro-プ
ライマー対での０、0.25、0.5および１単位のRNAseH存
在下で増幅を比べた。HBV-ヒト血清のレベルまで希釈し
たHBV＋血漿あるいはHBV-血清を単独で調べた。
10μｌの血清を当量の0.1N KOHに加え蒸発を防ぐため
に油層で覆った。サンプルを混合し95℃で加熱し室温ま
で放冷した。サンプルを90μｌの反応容積にして最終濃
度を50mMトリス酢酸pH7.6、20.8mMMgCl2、5mMジチオス
レトール、2mMスペルミジン塩酸塩、0.15μＭ各プライ
マー、6.25mM GTP、6.25mM ATP、2.5mM UTP、2.5mM CT
P、0.2mMの各dTTP、dATP、dGTP、dCTP、および13単位の
AMV逆転写酵素とした。サンプルを混合し37℃で12分間
加熱しついで95℃まで加熱してさらに室温まで冷却し
た。13単位のRTと100単位のT7RNAポリメラーゼを加え反
応混合物を37℃で３時間インキュベートする。25μｌの
各反応混合物を測定した。
データよりE.coli.RNAseHの濃度はこのシステムの各
反応毎に0.25単位のE.coli.RNAseH付近を中心とした狭
い最適範囲にあることが判明した。E.coli.RNAseHは使
用が困難ではあるけれどもいくらかのRNAseH活性の添加
はこの実験で有用である。
表11 ターゲット（モル） RNAseH（単位） 実測RLU ５×10-20 0 567809 ５×10-22 18041 ５×10-23 2938 ０ 1634 ５×10-20 0.25 1153366 ５×10-22 732109 ５×10-23 5566 ０ 1423 ５×10-20 0.5 1001904 ５×10-22 29596 ５×10-23 1793 ０ 1898 ５×10-20 1.0 610485 ５×10-22 13026 ５×10-23 4062 ０ 1662 実施例12 つぎにHIVプライマー対の最適増幅に必要なE.coli.RN
AseHの量を８μｇのヒトDNAを含有した溶解産物の存在
下または非存在下で測定した。２×10-18モルのウイル
スターゲットが各反応混合物に存在した。DNAターゲッ
トは50pモルの各プライマーと40mMトリス塩酸pH8.3、25
mM NaCl、20.8mM MgCl2、5mMジチオスレイトール、2mM
スペルミジン塩酸塩および表11に示したヌクレオチドト
リホスフェートの存在下混合し、95℃まで加熱し室温ま
で冷却した。13単位の逆転写酵素を加え反応混合物を42
℃まで12分間加熱し、95℃まで加熱し再び室温まで冷却
した。13単位のAMV逆転写酵素と100単位のT7RNAポリメ
ラーゼを加え37℃で3.5時間加熱した後測定した。
表12 溶解産物 RNAseH RLU − 0 単位 8,400 − 0.5 239,000 − 1.0 468,000 − 1.5 498,000 − 2.0 439,000 − 3.0 20,100 − 4.0 5,806 ＋ 0 1,667 ＋ 0.5 924 ＋ 1.0 6,635 ＋ 1.5 579 ＋ 2.0 13,400 ＋ 3.0 17,800 ＋ 4.0 9,152 これらの結果はE.coli.RNAseHレベルは過剰量のE.col
i.RNAseHが増幅に有害なので注意深く調整されなければ
ならないことを示している。さらに最適濃度は非特異ヒ
トDNAの存在により変化し、ヒトDNAによる阻害はすべて
のRNAseHレベルで重大であった。
実施例13 大腸菌RNAseHの、HIV領域２と称する第２領域の増幅
への効果を調べた。以下のデータは大腸菌RNAseHが狭い
濃度範囲で増幅を促進することを証明している。HIV領
域２プライマーは表12に関して述べたように、種々の濃
度の大腸菌RNAseHの存在下で増幅された。各反応混合物
10μｌを分析し、必要に応じて希釈した。生成した標的
（ターゲット）を定量するために、シグナルを標準曲線
と比較した。RNAseH 標的（pmol） 生成物（pmol） 増幅の観測値 − ０ 0 0 − 1.67×10-10 2.14 1.3×1010 0.2U 1.67×10-10 0.17 1.0×109 0.4U 1.67×10-10 0.18 1.1×109 1.2U 1.67×10-10 0.012 7.6×107 − 1.67×10-8 16.0 9.6×108 0.2U 1.67×10-8 20.6 1.2×109 0.4U 1.67×10-8 0.14 8.5×106 1.2U 1.67×10-8 0.15 9.0×106 これらのデータは、ガテリら（Guatelli,87 PNAS 187
4−1878）の説とは逆に、大腸菌RNAseHを加えなくとも
増幅が達成され得ることを示している。
本発明者らは幾つかの標的領域で大腸菌RNAseHとMMLV
逆転写酵素とを用いて調べた。実施例12に記載の条件
下、ヒトDNA8μｇの存在下または非存在下、３時間の自
己触媒工程の反応を行った。HIV領域１、３および４か
らのプライマーセットを試験した。使用するウイルス性
鋳型は、ハイブリダイゼーションアッセイでRLUが直線
領域にあるよう選択した。MMLV逆転写酵素を、開始時40
0U、増幅期800Uで用いた。T7RNAポリメラーゼも含有さ
せ、大腸菌RNA 1Uを指示の通り加えた。最上欄の＋RNA
seH、−RNAseHの項の下の値はアッセイ反応液10μｌに
関して得たRLU値である。
DNAの存在下、大腸菌RNAseHは明らかにHIV領域４プラ
イマーによる増幅を刺激した。試験した大多数の場合、
MMLV逆転写酵素単独使用の場合の増幅は、少なくとも、
MMLV逆転写酵素と大腸菌RNAseHの併用時と同様に良好で
あった。ガテリら（Guatelli,87 PNAS 1874−1878）の
説とは逆に、効率的な増幅は大腸菌RNAseHを必要としな
かった。
逆転写酵素の配列特異性 本発明者らは、あるプライマーセットは、AMV逆転写
酵素と併用するとその作用が最良となるのに対し、他は
MMLV逆転写酵素との併用、またはいずれか１つの逆転写
酵素に大腸菌RNAseHを添加した時その作用が最良となる
ことをも見いだした。プロモータープライマーおよびプ
ライマーまたは大腸菌RNAseHの起源を少し変化した場合
の、増幅効率の変動の観測値は本発明機構を支持してい
る。これらの発見を支持する詳細なデータを以下に記載
する。
MMLV逆転写酵素はクローン化されており、300単位／
μｌ以上の高濃度でBRL（Bethesda Research Labs）や
U.S.Biochemicalsから購入することができる。注意すべ
き点は、MMLV逆転写酵素の天然の核酸鋳型に対するDNA
合成活性は、AMV逆転写酵素との比較で、約10倍高い単
位濃度で得られることである。単位活性における類似性
の欠如は、ホモポリマー鋳型（単位活性アッセイに使
用）を用いた場合と、ヘテロ重合核酸鋳型を用いた場合
に酵素が異なる相対活性を示すことによる。本発明にお
ける増幅反応において、種々の濃度のMMLV逆転写酵素を
用いて試験した。これらの結果の例を以下の表に示し
た。AMV逆転写酵素試料の場合、開始段階で逆転写酵素
を14U用い、増幅段階で56U用いた。開始段階および増幅
段階におけるMMLV逆転写酵素量を測定した。HIV領域２
プライマー各15pmolを用い,NaClの代わりに25mM KClを
用いる外は、実施例12記載のインキュベーション条件を
用いた。T7ポリメラーゼ400Uを増幅期間中に用いた。ヒ
トDNA8μｇの存在下または非存在下に行った結果を以下
の表に示す。AMVまたはMMLVで示した欄は、それぞれAMV
逆転写酵素またはMMLV逆転写酵素による増幅作用の結果
を示す。数字は開始、および自己触媒期間のそれぞれに
おいて用いた値（単位）を示している。表中の値はRLU
である。増幅生成物は希釈されておらず、用いた条件下
で約250,000RLUを与えるに十分な濃度のハイブリダイゼ
ーション標的でシグナルが飽和するので、＞200,000RLU
の値では増幅程度が有意に低く見積もられているかもし
れない。
ヒトDNAの非存在下におけるMMLV逆転写酵素の指令に
よる増幅の感度はAMV指令による増幅よりも有意に低い
が、外因性DNAの存在下ではMMLVは非常に有効であっ
た。
HIV領域２の高レベル増幅を観察した後、本発明者ら
はAMV逆転写酵素を用いてヒトDNAの存在下、他の標的領
域を試験した結果、これらの領域の最良の増幅には大腸
菌RNAseHがなお必要であることを見いだした。次いで、
大腸菌RNAseHの非存在下、MMLV逆転写酵素を用いて各領
域の増幅を試験し、AMV逆転写酵素＋大腸菌RNAseHを含
有する反応での増幅と比較した。これらの結果の幾つか
を以下の表に示した。実施例12の記載に従ってHIV領域
３および４プライマーを用いた（50pmol/反応）。AMV逆
転写酵素を用いる反応では開始に際して14U用い、増幅
に際して逆転写酵素56U＋大腸菌RNAseH1Uを用いた。MML
V逆転写酵素を用いる反応では開始に際して400U加え、
増幅に際して800Uを加えた。４時間の増幅インキュベー
ション期間中、全反応混合物中にT7ポリメラーゼ400Uを
存在させた。表中の値は増幅反応混合物10μｌを用いて
行った。ホモジーニアスプロテクションアッセイで得た
RLU値である。アッセイ前に反応混合物を希釈した場合
もある。
HIV領域２で観察されたように、ヒトDNAの非存在下で
はMMLVによる増幅はAMV逆転写酵素＋大腸菌RNAseHによ
る増幅よりも有意に低いが、DNAの存在下ではMMLVによ
る増幅は少なくともAMV逆転写酵素＋RNAseH.42によって
達成される増幅と同じく良好であった。
実施例14 HBVゲノムの第２領域のためのプライマー 以下の実験はHBVゲノムの２つの領域に向けたプライ
マーセットを用いて行われた。データはプライマーセッ
トがAMV RTと同程度には増幅しないことを示してい
る。実験はHBV陰性血清で希釈した陽性血漿を用い、実
施例11記載のごとくに行った。増幅反応混合物10μｌを
ハイブリダイゼーションアッセイに付した。
これらの結果を標準的なプロトコールを用いる追加実
験で確認した。領域１プライマーはこれらの実験でも高
いRLUであり一致した結果を示した。
対照的に、同じ２つのプライマー対の増幅にMMLV酵素
800Uを用いると、下記表に示すように反対の効果が認め
られた。
この実験では、各反応混合物中に血清５μｌが含有さ
れていた。
このように、各プライマー対の増幅能力は増幅期間中
存在する逆転写酵素の影響を受けた。鋳型配列の利用可
能性等のファクター、プライマーの特異的ハイブリダイ
ゼーション能力、およびRNA合成の効率に対する逆転写
酵素の影響は有意でない。RNAseHの特異性や活性、およ
びDNAのポリマー化活性にも影響しないであろう。
下記のデータは、適当な条件下でプロモーター−プラ
イマーを組合せて用いると増幅が増大することを例示し
ている。
この実験は、全増幅反応をハイブリダイゼーション法
で分析したことを除き、表11の項で述べたと同様に行っ
た。 表21 標的分子 標的（mol） RLU観測値 1200 ２×10-21 1,094,177 120 ２×10-22 442,137 12 ２×10-23 24,053 1.2 ２×10-24 8,654 0 ０ 1,828 実施例15 AMV逆転写酵素とMMLV逆転写酵素の比較 以下の実験はMMLV（300単位）またはAMV（39単位）を
用いてCML患者の染色体に発見されたBCL−２染色体転座
主要ヒト染色体ブレイクポイントｔ（14;18）のための
プライマーの増幅に関する比較実験である。各酵素につ
いて、大腸菌RNAseHの作用を評価した。増幅は24mM Mg
Cl2およびプライマー各50pmolを用いる外は実施例12記
載の方法に従って増幅を行った。溶解液（リゼート）を
含有する反応液には白血球由来のDNA4μｇが存在してい
た。全反応混合物はT7RNAポリメラーゼ300単位とインプ
ット２本鎖DNA標的10amolを含有していた。
結果はMMLVおよびAMV RTが、特に大腸菌RNAseHの非
存在下では、同程度にこのプライマーセットを増幅しな
いことを示すものである。AMV逆転写酵素を含有する反
応混合物に大腸菌RNAseHを加えると増幅が顕著に増大す
る。このことはこれらの反応ではRNAse活性が制限され
ていることを示唆するものである。逆に、MMLV RTを含
有する反応混合物に大腸菌RNAseHを加えても増幅は促進
されなかった。これらのデータによっても、以前に、MM
LV RTには、大量の非特異的ヒトDNAの存在下での有意
な増幅を維持する能力があるという指摘が確認された。
C.1つのプライマーは完全長さの生成物には取り込まれ
ない 本発明者らの最も重要な発見の１つは、主RNA種と同
じ極性を持つプライマーが検出可能な程度には完全長さ
の生成物に取り込まれないということであった。このこ
とを証明するために、個々のプライマーを32Pで末端ラ
ベルし、各プライマーのDNA生成物への導入をポリアク
リルアミドゲル電気泳動で調べた。本発明者らは、当
初、両プライマーが共に完全長さのDNA生成物に取り込
まれると予測していた。しかしながら、プロモーターを
含有するプライマーは完全長さのDNA生成物中に見い出
すことができなかった。実際、それは非常に小さいまま
であった。これらの結果は多くの異なる標的およびプラ
イマーセットによって確認された。本発明者らの方法を
以下に説明する。
自己触媒期間に蓄積されたcDNAの種を同定するために
プライマーの5'末端をT4ポリヌクレオチドキナーゼで32
Pラベルし、増幅反応混合物に打ち込んだ（スパイクし
た）。以下の実施例は、１つの極性のプライマーが増幅
の間に優先的に蓄積され、その蓄積される鎖は常に、自
己触媒中に合成された優勢なRNA種と相補的な鎖である
ことを示している。図５は増幅期間中に32PラベルHIV領
域２が取り込まれたという結果を示す。このプライマー
セットから、（＋）センスの214塩基からなるRNAが得ら
れた。RNAに相補的なプライマーは、標的配列の存在
下、235および214塩基の主バンドに取り込まれた（レー
ン３）。標的非存在下では完全長さの断片は見られなか
った（レーン４）。214塩基の断片はRNAと同長のcDNAを
表しているが、235塩基断片はRNA＋T7プロモーター配列
（21塩基）を表している。逆に、このプロモータープラ
イマーは標的存在下、または非存在下における完全長さ
DNA生成物には観察されなかった（それぞれレーン１お
よび２）。
図５のレーン５−８は増幅期間中の32PラベルHBV領域
１プライマーの導入結果を示している。これらはT7pro+
およびT7pro-として知られている。このプライマーセッ
トは２極性を有する132塩基RNAを産生し得るが（＋）鎖
RNAが優勢である。優勢なRNAに相補的なT7pro-は本発明
で提供した機械の通り、132塩基および153塩基の断片に
取り込まれた（レーン７、（＋）標的；レーン８、
（−）標的）。153塩基断片はT7pro+のRNA＋T7プロモー
ター配列（21塩基）を表している。逆に、32PラベルT7p
ro+プライマーはいずれの長さの断片にも取り込まれな
かった（レーン５、（＋）標的；レーン６、（−）標
的）。
ゲル電気泳動で分析した反応混合物をHPAによって分
析し、優勢なRNAと同じ極性のcDNAを別の方法でも検出
できるかを調べた。作成された鎖の相対比率を決定する
ためにプラスおよびマイナス鎖プローブを用い、各反応
混合物の一部をRNAseAで処理してRNAとDNAの比率を求め
た。結果を以下に示す。
これらの結果は完全長さの生成物がプロモータープラ
イマー観察されない場合でも増幅が十分に作動していた
ことを示すものである。これらの結果は従来の研究にお
いて観察されたこと、即ち、１個のセンスプローブで観
察されるシグナルの大多数はRNAに由来していること、
そして相補的な鎖シグナルは予測通りDNAに由来する、
ということに関連している。両極性のRNAから作成され
たHBV領域１プライマーセットについてさえ、このこと
は正しい。
D.酵素がRNA/DNAハイブリッドの特異的部位を切断する
ということを示す機構の確認 上記の実験および観察結果に基づいて、RNAseH中にあ
り得る配列特異性を考慮した増幅システムを図４に示し
た。この機構をサポートする上で重要な要素はRNAseH配
列特異性であることから、酵素が実際にRNA:DNAハイブ
リッドを特異的な部位で切断するということを示す必要
がある。しかもこの切断部位は、良好な増幅のために
は、モデルにしたがって、特異領域内に存在していなけ
ればならない。この疑問を解くために、既知の標的とプ
ライマーセットの組み合わせで生成されるRNA:DNAハイ
ブリドを調製した。RNAを32PでラベルしAMV逆転写酵素
（その関連RNAseH活性を含有する）と一緒にいインキュ
ベーションし、反応生成物をポリアクリルアミドゲル電
気泳動で分析した。結果は、新規な反応機構と完全に一
致していた。即ち、断片のサイズは、数個の小片が生成
しこれらは１方または両方の端付近で切断されて生成し
たものであることを示していた。分子の内部領域は切断
されていなかった。この実験で、用いた反応条件下で酵
素が配列または構造特異性を有することを確認した。
提供した機構においてはプロモーター含有プライマー
が結合する領域で複数の切断が起きることを必要とする
ので、切断の起きる位置を決定するためにさらに実験を
行った。個別にRNAの末端ラベルし、消化生成物を分析
することで、それらの切断がRNAの5'末端においてのみ
起きることが示された。これはまた提供した機構と一致
することである。
実施例16 図６は特異的RNAseH開裂部位における、AMV、MMLVお
よび大腸菌切断由来のRNAseH活性を示す。図中の矢印は
完全長さRNAの位置を示す。
図６は32Pで内部標識したHIV領域２を１本鎖配列とハ
イブリダイゼーションしAMV由来RNAseHで45分間（レー
ン２）、MMLV由来RNAseHで５、15、45または120分間
（レーン３−６）、または大腸菌由来RNAseHで５分間
（レーン７）ニックトランスレーションしたものであ
る。生成した断片のサイズは各酵素によって異なり、酵
素開裂の特異性およびこの鋳型についての特異性が酵素
間で異なることを示している。最も急速な分解は大腸菌
RNAseHの存在下で観察され、この酵素の切断が、特異性
においてより低いことあるいは活性がより高いことを示
唆している。
図6bはHBV領域1RNAを合成標的配列とハイブリダイゼ
ーションし、AMV逆転写酵素由来のRNAseHで５、30、60
または120分間（レーン２−５）または大腸菌由来RNAse
Hで１、３、15または60分間（レーン６−９）、ニック
トランスレーションした結果を示す。２個の酵素により
異なるサイズの断片が生成し、開裂の特異性を示した。
HBV RNAの3'末端をラベルし、AMV逆転写酵素でニック
トランスレーションすると同じサイズの断片が観察さ
れ、開裂部位がRNAの5'末端に近いことを示した。
これらのデータは特異的な部位がAMV由来RNAseH、MML
V由来RNAseHおよび大腸菌由来RNAseHで開裂されるこ
と、およびこれら３酵素における部位の幾つかは異なっ
ていることを示している。増幅される領域内に特異的な
部位が存在することはRNA:DNAハイブリッドのRNAを開裂
させ、能率的な自己触媒作用がもたらされる。切断部位
情報を用いて設計されたプライマーは増幅効率を改善す
る。このことは、あるプライマーセットの増幅程度がRN
AseHの供給源に依存して様々な程度に変化するという本
発明者らの観察と一致している。
E.MMLV RNAseHおよびAMV RNAseH切断部位の同定 実施例17 AMV RNAseHによる消化部位を同定するためにRNAを相
補的配列とハイブリダイゼーションし、AMV RNAseHで
ニックトランスレーションした。変性後、配列決定すべ
き領域の3'末端に相補的なプライマーとハイブリダイゼ
ーションし、サンガーの配列決定法に従い、ジデオキシ
ヌクレオチドの存在下で伸長した。cDNA合成の終結、こ
れはRNA開裂を示すが、はHBV RNAの以下の部位で観察
された。
MMLV RNAseHによる消化部位を同定するためにRNAと
相補配列とをハイブリダイゼーションし、MMLV RNAseH
でニックトランスレーションした。変性後、配列決定す
べき領域の3'末端に相補的なプライマーとハイブリダイ
ゼーションし、サンガーの配列決定法に従い、ジデオキ
シヌクレオチドの存在下で伸長した。cDNA合成の終結は
HBV RNAの以下の部位で観察された。
以下の部位は第２のHBV RNA配列と同定された。
以下の部位はHIV RNA配列と同定された。
大多数の開裂部位はCAまたはUGジヌクレオチドの近く
に存在する。開裂部位の検出に用いた方法では開裂反応
の間に蓄積された部位が同定されたにすぎない。使用し
た方法で認識された部位以外の部位でも開裂が起きると
予測される。
F.増幅システムのためのプライマー 種々のRNAseH酵素が配列特異性を有するという知見に
基づいて本発明者らは様々なプライマー／標的の組み合
わせを試験しそれらの増幅システムにおける動向を適正
化することを試みた。今日までに得られたデータは生成
したRNA断片の各片のサイズが比較的大きく、断片はお
そらく２本鎖から自然発生的に解離したものではないこ
とを示唆している。このことは、AMV逆転写酵素を用い
て行ったAMV RNAまたはポリオウイルスRNAの複写実験
において、最初に合成されたcDNA鎖からのcDNAの合成に
おけるプライムに、RNAseHによって産生されたRNA断片
を酵素が用いることが分かったことから、予想外なこと
ではない。
RNAseH酵素が配列特異性を有するならば、増幅反応は
以下のごとくに進行するであろう（反応混合物中のRNA
中間体から開始して）。
増幅中に生成した主プライマー種に相補的なプライマ
ーがRNAの3'末端に結合する。反応混合物中のプライマ
ー濃度は高いので、過剰のプライマーにより生成された
RNA:DNA2本鎖は合成を開始し得る前にRNAseH活性によっ
て開裂されるであろう。従って、プライマー結合領域
は、反応に用いるRNAseHが認識する配列を多数含有しな
いことが好ましい。
切断部位が頻繁に存在するので、認識された切断部位
を含まないRNA相補プライマーを実際に設計し得ない場
合もあるかもしれない。そのような場合、プライマーの
3'末端部位をRNAとのアニーリングのために保持するた
めに切断部位はできるだけ5'末端に近くすべきである。
プライマーを適当なDNAポリメラーゼで伸長すると、R
NAポリメラーゼプロモーターを含有する第２プライマー
の結合部位が現れるはずである。逆転写酵素によって仲
介されるプライマーの結合と合成の開始のためには、プ
ライマーがDNAにハイブリダイズする際にヌクレーショ
ン（nucleation）とジッパーリング（zippering）が可
能なようRNAの一部を除去する、あるいは単にRNAをニッ
クし生成したRNAを排除するだけで十分である。本発明
者らのデータはかなり大きいRNA片が生成し、またプロ
モーター含有プライマーが完全長さのDNAに取り込まれ
ないことを示していることから、以下の事象が起きてい
ると考えられる。
1.プロモーター−プライマー結合を可能ならしめるに十
分なニックがRNAに含まれている。適当な部位の１つの
ニックによって、単に、消失させるに十分な小さいRNA
断片が生成しプライマー結合部位またはその一部が露出
されるのか、または１つのニックが１またはそれ以上の
酵素の巻戻し作用を促しRNA断片が追い出されるのか
は、現時点では不明である。
2.逆転写酵素でcDNA3'末端が伸長されプロモーター領域
の２本鎖DNAが作られる。
3.このようにして生成した複合体からRNAが合成され
る。この複合体はRNAに結合したcDNAからなり、２本鎖D
NAプロモーターを含有する。
このように、反応物には、RNAポリメラーゼプロモー
ターを含有するプライマーの結合部位の内部または近辺
のどこかに、RNAseH活性が認識する配列が存在する必要
がある。
幾つかの適用例では、標的配列それ自身の内部にはRN
AseH認識部位のないことも望ましい。標的内の部位は開
裂され２本鎖cDNA領域の合成のためのRNAプライマーの
生産に用いられるであろう。この酵素作用の可能性を消
滅することが好ましい。
本発明者らが得たモデルおよびRNAseH配列特異性情報
に基づいて新規なプライマーセットが企画された。本発
明者らの企画は以下の通りである。
T7プロモーター−プライマー用 １）プライマー領域は10塩基あたり１またはそれ以上の
切断部位を有する。
２）プライマー領域はその5'末端の近くに切断部位を有
する。
３）プライマー領域はその3'末端の近く、および可能な
ら3'末端の一部に切断部位を有する。
４）プライマーの長さは＞18塩基である。
５）Tmestは約55−65℃である。
他のプライマー用 １）プライマーはRNAseH切断部位を殆ど持たないか、全
く持たない。
２）プライマー内に存在する切断部位はすべて5'末端付
近に存在する。
３）プライマーの長さは約18−28塩基である。
４）Tmestは55−65℃である。
明らかに、これらの基準および機構、ならびに配列特
異性に関する知識に従って設計されたプライマーを用い
て、より良好な合成が達成された。このことは本発明に
よれば、特異的な標的領域のための機能的なプライマー
セットの製造が可能であることを示すものである。これ
らを以下により詳細に説明する。
実施例18 RNAseHの特異性に関する発見を効率的なプロモーター
−プライマーの組合せを設計するのに利用した。従来技
術の方法はプロモーターを非選択的にプライマーに付加
したものにすぎない。本発明者らは増幅産物の収率を高
めるのに最適なプロモーター−プライマーの組み合わせ
を設計することができた。以下に示す実験はプロモータ
ー−プライマー配列を少し変化させることで増幅効率が
大きく変化することを示している。
以下の例では同一領域からのプライマーを、RNAseH開
裂部位およびGP−III増幅効率に関して比較したもので
ある。各試料について、被検プライマー以外は同一の試
薬を用いて２回、増幅を行った。
1.非プロモータープライマー 最初の例では、CML主要ｔ（14;18）ブレイクポイント
増幅領域のための非プロモータープライマー部位を15塩
基移動することにより、４塩基認識配列と仮定して推定
のRNAseH切断部位内の数を４から１に、３塩基認識配列
と仮定して５から２に減少した。2.5mm ATP、16.5mm M
gCl2、および50mM KClを用いるほかは実施例15と同様
に反応させた。このプライマー配列における変化は増幅
効率にとって極めて積極的な影響を及ぼした。第２の例
では、４塩基認識部位と仮定される推定のRNAseH部位の
みを除去するためにHBV領域１の非プロモータープライ
マー内に意図的に不適合を配した。３塩基切断部位の場
合は、当業者ならば、不適合により3'末端に最も近い切
断部位が除去されたことが分かるであろう。この変化も
また、増幅効率に極めて積極的な影響を及ぼした。デー
タは、プライマーの位置を変化する方法または不適合を
導入する方法の２方法のいずれも増幅の促進に利用し得
ることを示している。おそらく非プロモータープライマ
ーからのRNAseH切断部位の除去の方が、より能率的に自
己触媒期間のcDNA合成を開始させるであろう。
2.プロモーター−プライマー 以下の例は同じ領域を起源とするが推定のRNAseH切断
部位の数が異なるプロモータープライマーを示す。最初
の例ではHIV領域５のための２つのプロモータープライ
マーが10塩基移動して４塩基認識部位と仮定して推定の
RNAseH切断部位を２から３に変化させるか、３塩基認識
部位と仮定して３から５に変化させた。これは増幅効率
に正の影響を及ぼした。第２の例では推定のRNAseH切断
部位を含有する配列を主要ブレイクポイントｔ（14;1
8）転座のためのプロモータープライマーの上流に挿入
し、標的に対する１つの不適合を含有させてプライマー
領域内に切断部位を生成させた。これも増幅効率に正の
影響を及ぼした。これは増幅効率の上昇に、プロモータ
ープライマーへのRNAseH切断部位の挿入を利用すること
ができることを示すものである。おそらく、RNAseH切断
部位の挿入がRNA鎖の移動を助け、プロモーター領域の
複製効率を増大し、その結果、能率的な自己触媒が達成
される。
プライマー名称 RLU 例３ Ａ 45,466 Ｂ 908,147 例４ Ｃ 64,601 Ｄ 2,946,706 上記プライマーの配列を以下に示す。
上記の例で、非プロモータープライマーからのRNAseH
切断部位の除去は、切断部位の除去が元の標的に不適合
を導入するとしても、増幅効率を増大した。付加的なRN
AseH切断部位を含有させるためのプロモーター含有プラ
イマーの設計もまた、それが切断部位の導入が元の標的
に不適合を導入するとしても、増幅を増大した。推定の
RNAseH切断部位の数、分布、および位置が、一部では、
特定のプライマーの有用性を決定する。
意図的な不適合の導入またはプロモーターおよびプラ
イマー間への配列の挿入による増幅の増大は増幅法にお
ける自明の改善ではない。
本発明の好ましい実施態様では、RNA標的配列を決定
し、次いでRNAseH分解が２本鎖からのRNA切片の切断ま
たは除去を起こす場所を決定する。AMV逆転写酵素およ
びMMLV逆転写酵素中に存在するRNAseH、大腸菌RNAseHま
たはこれらの組み合わせによる、標的配列のRNAse分解
の効果を決定するために実験を行うことができる。
プライマーを選択するに際し、反応混合物中に存在す
るRNAseHによって実質上分解されないRNAセクションと
ハイブリダイズするようにプライマーを選択することが
好ましい。実質的な分解があるとプライマー領域内での
RNA鎖の切断によってDNA合成が停止または阻害されプラ
イマーの伸長が阻止される。このように、RNA標的の配
列とハイブリダイズするプライマーであって、RNAがRNA
seHに供されたとき、プライマー伸長生成物の形成を阻
止する実質的な分解がないような位置にあるプライマー
を選択することが望ましい。
プロモーター−プライマーがハイブリダイズするであ
ろうDNA部分にハイブリダイズしたRNA鎖部分を除去する
に十分なRNA鎖の分解が起きるように、プロモーター−
プライマーのハイブリダイゼーション部位を選択する。
通常は、RNAseH分解によってRNA:DNA2本鎖のRNAの幾つ
かの部分だけが除去され、RNA鎖の実質的な部分は２本
鎖に残存する。２本鎖DNAプロモーターを含有するRNA:D
NA2本鎖１つが得られる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 C12Q 1/68 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (34)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】RNA標的配列の多数のコピーを合成する方
    法であって、 （ａ）オリゴヌクレオチド／標的配列ハイブリッドが作
    られ、DNA合成が開始し得る条件下で、該標的配列を含
    有するRNAを、該標的配列の3'末端部分に対してこれと
    ハイブリダイズするに十分相補的なハイブリダイズ配列
    を有し、所望により該ハイブリダイズ配列の5'側にRNA
    ポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む配列を有
    していてもよい第一オリゴヌクレオチドプライマーで処
    理し、 （ｂ）該標的を鋳型とし、逆転写酵素を用いる伸長反応
    において該プライマーを伸長させて該RNA標的と相補的
    なDNAプライマー伸長産物を得、 （ｃ）RNアーゼＨ活性を有する酵素を用いて工程（ｂ）
    で形成されたRNA−DNA二本鎖のRNA鎖を選択的に分解
    し、 （ｄ）オリゴヌクレオチド／標的配列ハイブリッドが作
    られ、DNA合成が開始し得る条件下で、該DNAプライマー
    伸長産物を、該標的配列の3'末端部分に対してこれとハ
    イブリダイズするに十分相補的なハイブリダイズ配列を
    有する第二オリゴヌクレオチドプライマーまたはスプラ
    イスの鋳型で処理し（ただし、第一オリゴヌクレオチド
    がプロモーター配列を持たない場合は、第二オリゴヌク
    レオチドはハイブリダイズ配列の5'側にRNAポリメラー
    ゼのためのプロモーター配列を含む配列を有するスプラ
    イスの鋳型である）、 （ｅ）DNA伸長反応において該第二オリゴヌクレオチ
    ド、該第一プライマー伸長産物、または該第二オリゴヌ
    クレオチドと第一プライマー伸長産物両方の3'末端を伸
    長させて二本鎖プロモーター領域と結合したRNAポリメ
    ラーゼのための鋳型を得、 （ｆ）工程（ｅ）で形成された二本鎖プロモーター領域
    と結合した鋳型、および該鋳型と結合したプロモーター
    配列を認識するRNAポリメラーゼを用いて標的配列の多
    数のRNAコピーを生産する工程を含み、 実質的に一定の温度、イオン強度、およびpHの条件下で
    実施され、工程（ｂ）において使用する逆転写酵素がRN
    アーゼＨ活性を有する逆転写酵素であり、該逆転写酵素
    は単独で工程（ｃ）のためのRNアーゼＨ活性を与えるこ
    とを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】使用する逆転写酵素がトリ骨髄芽球細胞症
    ウイルスの逆転写酵素（AMV逆転写酵素）である請求項
    １に記載の方法。
  3. 【請求項３】使用する逆転写酵素がモロニーネジミ白血
    病ウイルスの逆転写酵素（MMLV逆転写酵素）である請求
    項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】第一オリゴヌクレオチドがRNAポリメラー
    ゼのためのプロモーター配列を含むプライマーであり、 （ａ）オリゴヌクレオチド／標的配列ハイブリッドが作
    られ、DNA合成が開始し得る条件下で該RNAを該第一オリ
    ゴヌクレオチドで処理し、 （ｂ）該標的を鋳型とし、該逆転写酵素を用いる伸長反
    応において第一プライマーを伸長させることにより該RN
    A標的と相補的な第一DNAプライマー伸長産物を得、 （ｃ）単独で所望のRNアーゼ活性を生じる該逆転写酵素
    を用いて工程（ｂ）において形成されたRNA−DNA二本鎖
    のRNA鎖を選択的に分解し、 （ｄ）該第一DNAプライマー伸長産物を、オリゴヌクレ
    オチド／標的配列ハイブリッドが作られ、DNA合成が開
    始し得る条件下で、標的配列の3'末端部分に対してこれ
    とハイブリダイズするに十分相補的なハイブリダイズ配
    列を有する第二プライマーである該第二オリゴヌクレオ
    チドで処理し、 （ｅ）DNA伸長反応において第二プライマーの3'−末端
    を伸長させて第二DNAプライマー伸長産物を得ることに
    より、二本鎖プロモーター領域と結合したRNAポリメラ
    ーゼのための鋳型を生成し、 （ｆ）工程（ｅ）において形成される二本鎖プロモータ
    ー領域と結合した鋳型、および該鋳型と結合したプロモ
    ーター配列を認識するRNAポリメラーゼを用いて標的配
    列の多数のRNAコピーを生成することを含む請求項１に
    記載の方法。
  5. 【請求項５】第二プライマーも、第一オリゴヌクレオチ
    ドのプロモーター配列と異なるかまたは同一である、RN
    Aポリメラーゼのためのプロモーター配列をハイブリダ
    イズ配列の5'側に含む配列を有するものである請求項４
    に記載の方法。
  6. 【請求項６】（ｇ）オリゴヌクレオチド／標的配列ハイ
    ブリッドが作られ、DNA合成が開始し得る条件下で、工
    程（ｆ）のRNAコピーを該第二プライマーで処理し、 （ｈ）DNA伸長反応において第二プライマーの3'−末端
    を伸長させて該RNAコピーと相補的な第二DNAプライマー
    伸長産物を得、 （ｉ）単独で所望のRNアーゼＨ活性をもたらす逆転写酵
    素を用いて工程（ｈ）で形成されたRNA−DNA二本鎖のRN
    A鎖を選択的に分解し、 （ｊ）オリゴヌクレオチド／標的配列ハイブリッドが作
    られ、DNA合成が開始し得る条件下で、第二DNAプライマ
    ー伸長産物を第一プライマーで処理し、 （ｋ）DNA伸長反応物において第一プライマーの3'末端
    を伸長させて第一DNAプライマー伸長産物および第二DNA
    プライマー伸長産物の3'−末端を得ることにより、二本
    鎖プロモーター領域と結合したRNAポリメラーゼのため
    の鋳型を得、 （ｌ）工程（ｋ）において形成された二本鎖プロモータ
    ー領域および該鋳型と結合したプロモーター配列を認識
    するRNAポリメラーゼを用いて標的配列の多数のRNAコピ
    ーを生成することを含む請求項４に記載の方法。
  7. 【請求項７】（ｇ）ハイブリダイズする条件下で、工程
    （ｆ）のRNAコピーを該第一および第二プライマーで処
    理し、 （ｈ）該RNAコピーを鋳型に用い、DNA伸長反応において
    該プライマーを伸長させてDNAプライマー伸長産物を
    得、 （ｉ）単独で所望のRNアーゼＨ活性をもたらす逆転写酵
    素を用いて工程（ｈ）で形成されるRNA−DNA二本鎖のRN
    A鎖を選択的に分解し、 （ｊ）ハイブリダイズする条件下で、該DNAプライマー
    伸長産物を該プライマーで処理し、 （ｋ）DNA伸長反応において該プライマーを伸長させて
    相補性プライマー伸長産物を得ることにより、二本鎖プ
    ロモーター領域と結合したRNAポリメラーゼのための鋳
    型を得、 （ｌ）工程（ｋ）において形成された二本鎖プロモータ
    ー領域と結合した鋳型、およびRNAポリメラーゼまたは
    該鋳型と結合したプロモーター配列を認識するRNAポリ
    メラーゼを用いて、標的配列の多数のRNAコピーを生成
    させることを含む請求項５に記載の方法。
  8. 【請求項８】（ｍ）工程（１）のRNAコピーを用い、工
    程（ｇ）〜（ｌ）を反復することにより標的配列の多数
    のコピーを自触的に合成することを含む請求項６に記載
    の方法。
  9. 【請求項９】（ａ）オリゴヌクレオチド／標的配列ハイ
    ブリッドが作られ、DNA合成が開始し得る条件下で、該R
    NAを、標的配列の3'末端部分に対してこれとハイブリダ
    イズするに十分相補的なハイブリダイズ配列を有する該
    第一オリゴヌクレオチドプライマーで処理し、 （ｂ）該標的を鋳型とし、逆転写酵素を用いる伸長反応
    において第一プライマーの3'末端を伸長させて該RNA標
    的と相補的なDNAプライマー伸長産物を得、 （ｃ）単独で所望のRNアーゼＨ活性をもたらす逆転写酵
    素を用いて工程（ｂ）で形成されるRNA−DNA二本鎖のRN
    A鎖を選択的に分解し、 （ｄ）オリゴヌクレオチド／標的配列ハイブリッドが作
    られ、DNA合成が開始し得る条件下で、該DNAプライマー
    伸長産物を、第一プライマー伸長産物の3'末端部分に対
    してこれとハイブリダイズするに十分相補的なハイブリ
    ダイズ配列を有し、該ハイブリダイズ配列の5'側にRNA
    ポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む配列を有
    する第二オリゴヌクレオチドで処理し、 （ｅ）第一プライマー伸長産物の3'末端を伸長させ、ス
    プライスの鋳型のプロモーター配列と相補的な配列を加
    えることにより二本鎖プロモーター領域と結合したRNA
    ポリメラーゼの鋳型を生成させ、 （ｆ）工程（ｅ）で形成された二本鎖プロモーター領域
    と結合した鋳型、および該鋳型と結合したプロモータ配
    列を認識するRNAポリメラーゼを用いて、標的配列の多
    数のRNAコピーを生成させることを含む、第二オリゴヌ
    クレオチドがスプライスの鋳型である請求項１に記載の
    方法。
  10. 【請求項１０】（ｇ）工程（ｆ）のRNAコピーを用い、
    工程（ａ）〜（ｆ）を反復して標的配列の多数のコピー
    を自触的に合成することを含む請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】第二オリゴヌクレオチドスプライス鋳型
    の3'末端がブロックされている請求項10に記載の方法。
  12. 【請求項１２】工程（ｅ）において、第二オリゴヌクレ
    オチドスプライス鋳型が第二プライマーとして作用し、
    該スプライスの鋳型の3'−末端がDNA伸長反応において
    伸長され、第一プライマー伸長産物と相補的な第二プラ
    イマー伸長産物が得られる請求項10に記載の方法。
  13. 【請求項１３】第一オリゴヌクレオチドプライマーがRN
    Aポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む配列を
    ハイブリダイズ配列の5'側に含んでおり、該プロモータ
    ー配列が第二オリゴヌクレオチドスプライス鋳型のプロ
    モーター配列と同一または異なるものである請求項10に
    記載の方法。
  14. 【請求項１４】第一オリゴヌクレオチドプライマーおよ
    び第二オリゴヌクレオチドスプライス鋳型が、スプライ
    スの鋳型配列がプライマー配列の5'側にある単一のオリ
    ゴヌクレオチドを構成している請求項10に記載の方法。
  15. 【請求項１５】工程（ａ）のRNA標的配列と相補的な、
    規定された3'−末端を有するDNA標的配列を含む一本鎖D
    NAを用いて出発する予備操作によって工程（ａ）のRNA
    が生成され、該予備操作が、 （ｉ）該一本鎖DNAを、オリゴヌクレオチド／標的配列
    ハイブリッドが作られ、DNA合成が開始し得る条件下
    で、該DNA標的配列の3'−末端部分に対してこれとハイ
    ブリダイズするに十分相補的なハイブリダイズ配列、お
    よびRNAポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む
    配列をハイブリダイズ配列の5'側に有する第二オリゴヌ
    クレオチドスプライス鋳型で処理し、 （ii）該DNA標的配列の3'−末端を伸長させ、スプライ
    スの鋳型のプロモーター配列と相補的な配列を加えるこ
    とにより、二本鎖プロモーター領域と結合したRNAポリ
    メラーゼのための鋳型を得、 （iii）工程（ii）において形成された二本鎖プロモー
    ター領域と結合した鋳型、および該鋳型と結合したプロ
    モーター配列を認識するRNAポリメラーゼを用いて標的
    配列の多数のRNAコピーを生成させることを含む請求項
    ９〜14のいずれかに記載の方法。
  16. 【請求項１６】（ａ）該DNA、該第一および第二オリゴ
    ヌクレオチド、（ｉ）DNA指向性DNAポリメラーゼ活性、
    （ii）RNA指向性DNAポリメラーゼ活性、および（iii）R
    NアーゼＨ活性を有する逆転写酵素および該プロモータ
    ーを認識するRNAポリメラーゼを混合し、 （ｂ）該標的配列の多数のコピーを生成させるための実
    質的に一定の温度、イオン強度、およびpHを含むDNAプ
    ライミングおよび核酸合成条件下で、上で得られた混合
    物をインキュベーションする操作工程によって行われる
    ものである請求項15に記載の方法。
  17. 【請求項１７】（ｉ）オリゴヌクレオチド／標的配列ハ
    イブリッドが作られ、DNA合成が開始し得る条件下で、
    該DNAを、該標的配列の3'−末端部分に対してこれとハ
    イブリダイズするに十分相補的なハイブリダイズ配列お
    よびRNAポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む
    配列を有する第二オリゴヌクレオチドで処理し、 （ii）該標的を鋳型に用いるDNA伸長反応において該第
    二オリゴヌクレオチドの3'末端を伸長させることにより
    DNA標的配列と相補的な第一DNAプライマー伸長産物を
    得、 （iii）工程（ii）において形成されるプライマー伸長
    産物を標的から分離し、 （iv）オリゴヌクレオチド／標的配列ハイブリッドが作
    られ、DNA合成が開始し得る条件下で、分離したプライ
    マー伸長産物を、標的配列の3'末端部分に対してこれと
    ハイブリダイズするに十分相補的なハイブリダイズ配列
    を有する第一オリゴヌクレオチドプライマーで処理し、 （ｖ）DNA伸長反応において第一オリゴヌクレオチドプ
    ライマーの3'末端を伸長させて第二DNAプライマー伸長
    産物を得ることにより、二本鎖プロモーター領域と結合
    したRNAポリメラーゼのための鋳型を得、 （vi）工程（ｖ）において形成された二本鎖プロモータ
    ー領域と結合した鋳型および該鋳型と結合したプロモー
    ター配列を認識するRNAポリメラーゼを用いて標的配列
    の多数のRNAコピーを生成させることを含む予備操作に
    より、RNA標的配列と相補的なDNA標的配列を含む一本鎖
    DNAから工程（ａ）のRNAを生成させるものである請求項
    9,10,12および13のいずれかに記載の方法。
  18. 【請求項１８】第一オリゴヌクレオチドプライマーが、
    RNAポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む配列
    をハイブリダイズ配列の5'側に含んでおり、該プロモー
    ター配列が第二オリゴヌクレオチドスプライス鋳型のプ
    ロモーターと同一または異なるものである請求項17に記
    載の方法。
  19. 【請求項１９】（ｉ）オリゴヌクレオチド／標的配列ハ
    イブリッドが作られ、DNA合成が開始し得る条件下で、
    該DNAを、標的配列の3'−末端部分に対してこれとハイ
    ブリダイズするに十分相補的なハイブリダイズ配列を有
    する第一オリゴヌクレオチドプライマーで処理し、 （ii）該標的を鋳型に用いる伸長反応において該プライ
    マーの3'末端を伸長させることにより該標的と相補的な
    DNAプライマー伸長産物を得、 （iii）工程（ii）において形成されるプライマー伸長
    産物を標的から分離し、 （iv）オリゴヌクレオチド／標的配列ハイブリッドが作
    られ、DNA合成が開始し得る条件下で、分離したプライ
    マー伸長産物を、標的配列の3'末端部分に対してこれと
    ハイブリダイズするに十分相補的なハイブリダイズ配
    列、および該ハイブリダイズ配列の5'側にRNAポリメラ
    ーゼのためのプロモーター配列を含む配列を有する、ス
    プライスの鋳型である第二オリゴヌクレオチドで処理
    し、 （ｖ）プライマー伸長産物の3'末端を伸長させ、それに
    スプライスの鋳型のプロモーター配列と相補的な配列を
    加えることにより、二本鎖プロモーター領域と結合した
    RNAポリメラーゼの鋳型を得、 （vi）工程（ｖ）において形成される二本鎖プロモータ
    ー領域と結合した鋳型、および該鋳型と結合したプロモ
    ーター配列を認識するRNAポリメラーゼを用いて標的配
    列の多数のRNAコピーを生産する工程を含む予備操作に
    より、該RNA標的配列と対応するDNA標的配列を含む一本
    鎖DNAから工程（ａ）のRNAを生成させる請求項９〜14の
    いずれかに記載の方法。
  20. 【請求項２０】（ａ）該一本鎖DNA、該第一および第二
    オリゴヌクレオチド、および逆転写酵素を混合し、 （ｂ）標的配列と相補的な第一DNAプライマー伸長産物
    が標的配列を鋳型に用いて合成される、DNAプライミン
    グおよび合成条件下で、工程（ａ）の混合物をインキュ
    ベーションし、 （ｃ）工程（ｂ）の反応混合物を加熱してDNA二本鎖のD
    NA鎖を分離し、 （ｄ）非酵素変性条件下で、工程（ｃ）の反応混合物
    に、RNAポリメラーゼまたはプロモーター配列を認識す
    るRNAポリメラーゼ、および逆転写酵素の第二の量を加
    え、 （ｅ）標的配列の多数のコピーを生産するための、実質
    的に一定の温度、イオン強度およびpHを含むDNAプライ
    ミングおよび核酸合成条件下で工程（ｄ）の混合物をイ
    ンキュベーションする操作工程によって行われるもので
    ある請求項17に記載の方法。
  21. 【請求項２１】（ａ）該一本鎖DNA、該第一および第二
    オリゴヌクレオチド、および逆転写酵素を混合し、 （ｂ）標的配列と相補的な第一DNAプライマー伸長産物
    が標的配列を鋳型に用いて合成される、DNAプライミン
    グおよび合成条件下で、工程（ａ）の混合物をインキュ
    ベーションし、 （ｃ）工程（ｂ）の反応混合物を加熱してDNA二本鎖のD
    NA鎖を分離し、 （ｄ）非酵素変性条件下で、工程（ｃ）の反応混合物
    に、RNAポリメラーゼまたはプロモーター配列を認識す
    るRNAポリメラーゼ、および逆転写酵素の第二の量を加
    え、 （ｅ）標的配列の多数のコピーを生産するための、実質
    的に一定の温度、イオン強度およびpHを含むDNAプライ
    ミングおよび核酸合成条件下で工程（ｄ）の混合物をイ
    ンキュベーションする操作工程によって行われるもので
    ある請求項19に記載の方法。
  22. 【請求項２２】実質的に一定の温度、イオン強度および
    pHの増幅条件下で、 （ａ）RNA標的配列を含むRNA、 （ｂ）標的配列の3'末端部分に対してこれとハイブリダ
    イズするに十分相補的なハイブリダイズ配列を有し、所
    望により、該ハイブリダイズ配列の5'側にRNAポリメラ
    ーゼのプロモーター配列を含む配列を有する第一オリゴ
    ヌクレオチドプライマー、 （ｃ）第二オリゴヌクレオチドプライマー、または相補
    性標的配列の3'末端部分に対してこれとハイブリダイズ
    するに十分相補的なハイブリダイズ配列を有するスプラ
    イスの鋳型（ただし、第一オリゴヌクレオチドがプロモ
    ーター配列を持たない場合は、第二オリゴヌクレオチド
    は該ハイブリダイズ配列の5'側に該プロモーター配列を
    含む配列を有するスプライスの鋳型である）、 （ｄ）（ｉ）DNA指向性DNAポリメラーゼ活性、（ii）RN
    A指向性DNAポリメラーゼ活性および（iii）RNアーゼＨ
    活性を有する逆転写酵素、 （ｅ）該プロモーターを認識するRNAポリメラーゼ、 （ｆ）デオキシヌクレオシド３リン酸基質、およびリボ
    ヌクレオシド３リン酸基質を含む混合物（ただし、該混
    合物は該逆転写酵素によりもたらされる以外のRNアーゼ
    活性を有する酵素を含まない）をインキュベーションす
    る工程を含むRNA標的配列の多数のコピーの合成方法。
  23. 【請求項２３】（ａ）RNA:DNAプライマーハイブリッド
    の形成、およびRNアーゼＨ活性への曝露後も依然として
    DNAプライマー伸長産物を形成させることができる該プ
    ライマーの能力を最大にするように、該RNA標的配列お
    よび第一オリゴヌクレオチドプライマーを選択し、 （ｂ）工程（ｄ）のDNAプライマー伸長産物の3'部分と
    第二オリゴヌクレオチドプライマーを、RNA:DNAプライ
    マー伸長産物二本鎖に存在するRNA標的配列の5'末端部
    分から、RNAを選択的に消化するためのRNアーゼＨ活性
    の能力を最大にするように選択し、該第二オリゴヌクレ
    オチドプライマーとDNAプライマー伸長産物とのハイブ
    リダイゼーションを促進する、請求項１に記載の方法。
  24. 【請求項２４】RNA標的配列の多数のコピーを合成する
    ための改良された方法であって、（ａ）DNA合成が開始
    し得る条件下で、該RNA標的配列を含む核酸を、該RNA標
    的配列の3'末端部分とハイブリダイズするプライマーを
    含む第一オリゴヌクレオチドと接触させ（ここで、RNA
    標的配列の3'末端部分および第一オリゴヌクレオチドの
    プライマー配列は、RNA:DNAプライマーハイブリッドの
    形成およびRNアーゼＨ活性に曝露後も依然としてRNAプ
    ライマー伸長産物を形成することができる該プライマー
    の能力を最大にするように選ばれる）、 （ｂ）該RNA標的配列を鋳型に用いる伸長反応において
    該プライマーの3'末端を伸長することにより該RNA標的
    配列と相補的なDNAプライマー伸長産物を得、 （ｃ）該RNA標的配列の5'末端部分をRNアーゼＨ活性で
    選択的に消化し、 （ｄ）DNA合成が開始し得る条件下で、該DNAプライマー
    伸長産物を、プロモーター配列を含み、該DNAプライマ
    ー伸長産物の3'末端部分とハイブリダイズするヌクレオ
    チド配列を有する第二オリゴヌクレオチドと接触させ
    （ここで、該DNAプライマー伸長産物の3'末端部分の配
    列、および第二オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列
    は、RNA:DNAプライマー伸長二本鎖中に存在するRNA標的
    配列5'末端部分から、RNAを選択的に消化するRNアーゼ
    Ｈ活性の能力を最大にすることにより、該第二オリゴヌ
    クレオチドのハイブリダイゼーションを促進するように
    選ばれる）、 （ｅ）DNA伸長反応において該DNAプライマー伸長産物の
    3'末端を伸長させることによりプロモーター配列を認識
    するRNAポリメラーゼの鋳型を得、 （ｆ）工程（ｅ）の鋳型を用い、該RNAポリメラーゼを
    用いて標的配列の多数のRNAコピーを合成することを含
    む方法。
  25. 【請求項２５】RNアーゼＨ活性が逆転写酵素によって提
    供されるものである請求項23または24に記載の方法。
  26. 【請求項２６】熱循環工程を欠く、転写介在増幅法を用
    いて標的核酸配列を自触的に増幅させる請求項１に記載
    の方法に使用するキットであって、 逆転写酵素、 該標的核酸配列の3'末端部分とハイブリダイズし、伸長
    させることにより相補性標的核酸配列を含むプライマー
    伸長産物を生成するプライマー、ならびに 該相補性標的核酸配列の3'末端部分とハイブリダイズす
    る3'領域、およびRNAポリメラーゼによって認識され
    る、該3'領域の5'側に位置するプロモーター配列を含む
    オリゴヌクレオチドを含み、該逆転写酵素、該プライマ
    ー、該オリゴヌクレオチド、および該RNAポリメラーゼ
    を用いて転写に基づく増幅を行う指示を与え、熱循環工
    程なしに該標的核酸を自触的に増幅し、該逆転写酵素に
    よってもたらされる以外のRNアーゼＨ活性を含まないキ
    ット。
  27. 【請求項２７】RNAポリメラーゼを含む請求項26に記載
    のキット。
  28. 【請求項２８】rATP、rCTP、rGTP、rUTP、dATP、dGTP、
    dCTPおよびdTTPを含む請求項27に記載のキット。
  29. 【請求項２９】オリゴヌクレオチドが、プライマーによ
    る伸長を阻止するようにその3'末端でブロックされてい
    る請求項27に記載のキット。
  30. 【請求項３０】該標的核酸配列とハイブリダイズする核
    酸プローブを含む請求項27に記載のキット。
  31. 【請求項３１】第一核酸領域が第二核酸領域の3'側に位
    置し、その3'末端からのDNAポリメラーゼによるプライ
    マー伸長が阻害されるようにその3'末端でブロックされ
    ており、該第二領域がRNAポリメラーゼによって認識さ
    れるプロモーター配列を含むものである、請求項11の方
    法で使用される該第一および第二核酸領域を含むブロッ
    クされたオリゴヌクレオチド。
  32. 【請求項３２】請求項11の方法に従って標的核酸配列を
    増幅するためのキットであって、 該標的配列の3'末端部分とハイブリダイズさせ、伸長さ
    せることにより、相補性標的配列を含むプライマー伸長
    産物を生成することができるプライマー、および 第一核酸領域が第二核酸領域の3'側に位置し、相補性標
    的配列の3'末端部分とハイブリダイズすることができる
    ヌクレオチド配列を含み、その3'末端からのDNAポリメ
    ラーゼによるプライマー伸長が阻害されるようにその3'
    末端でブロックされており、該第二領域がRNAポリメラ
    ーゼによって認識されるプロモーター配列を含むもので
    ある、該第一領域および該第二領域を含むブロックされ
    たスプライスの鋳型を含むキット。
  33. 【請求項３３】該RNAポリメラーゼを含む請求項32に記
    載のキット。
  34. 【請求項３４】逆転写酵素を含む請求項33に記載のキッ
    ト。
JP51151890A 1989-07-11 1990-07-10 核酸配列増幅法 Expired - Lifetime JP3241717B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US37950189A 1989-07-11 1989-07-11
US379,501 1989-07-11

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP00560798A Division JP3445131B2 (ja) 1989-07-11 1998-01-14 オリゴヌクレオチド検出プローブ

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH04500759A JPH04500759A (ja) 1992-02-13
JP3241717B2 true JP3241717B2 (ja) 2001-12-25

Family

ID=23497522

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP51151890A Expired - Lifetime JP3241717B2 (ja) 1989-07-11 1990-07-10 核酸配列増幅法
JP00560798A Expired - Lifetime JP3445131B2 (ja) 1989-07-11 1998-01-14 オリゴヌクレオチド検出プローブ
JP2000143544A Expired - Lifetime JP3350511B2 (ja) 1989-07-11 2000-05-16 オリゴヌクレオチド検出プローブ
JP2002073674A Pending JP2002355099A (ja) 1989-07-11 2002-03-18 Ｈｂｖ核酸配列の増幅法および検出方法

Family Applications After (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP00560798A Expired - Lifetime JP3445131B2 (ja) 1989-07-11 1998-01-14 オリゴヌクレオチド検出プローブ
JP2000143544A Expired - Lifetime JP3350511B2 (ja) 1989-07-11 2000-05-16 オリゴヌクレオチド検出プローブ
JP2002073674A Pending JP2002355099A (ja) 1989-07-11 2002-03-18 Ｈｂｖ核酸配列の増幅法および検出方法

Country Status (15)

Country Link
US (1) US5480784A (ja)
EP (3) EP0731174B1 (ja)
JP (4) JP3241717B2 (ja)
KR (1) KR100242252B1 (ja)
AT (2) ATE282716T1 (ja)
AU (2) AU650622B2 (ja)
DE (2) DE69034177T2 (ja)
DK (1) DK0408295T3 (ja)
ES (1) ES2091225T3 (ja)
FI (1) FI911152A0 (ja)
GR (1) GR3021704T3 (ja)
IE (1) IE902539A1 (ja)
NO (1) NO910902D0 (ja)
PT (1) PT94662A (ja)
WO (1) WO1991001384A1 (ja)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1964920A1 (en) 2007-03-01 2008-09-03 Hitachi High-Technologies Corporation Instrument and method for nucleic acid isolation
WO2009001737A1 (ja) 2007-06-22 2008-12-31 Tosoh Corporation 改良されたノロウイルスｒｎａ検出方法
WO2009044773A1 (ja) 2007-10-04 2009-04-09 Tosoh Corporation レジオネラ属菌ｒＲＮＡ増幅用プライマー、検出方法および検出キット
WO2010041755A1 (ja) 2008-10-06 2010-04-15 東ソー株式会社 サバイビンｍＲＮＡの測定方法
WO2014051076A1 (ja) 2012-09-28 2014-04-03 株式会社Ｂｎａ Ｂｎａクランプ法

Families Citing this family (286)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5817797A (en) * 1988-06-01 1998-10-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Sequencing DNA; a modification of the polymerase chain reaction
US6589734B1 (en) * 1989-07-11 2003-07-08 Gen-Probe Incorporated Detection of HIV
US5766849A (en) * 1989-07-11 1998-06-16 Gen-Probe Incorporated Methods of amplifying nucleic acids using promoter-containing primer sequence
US5856088A (en) * 1989-07-11 1999-01-05 Gen-Probe Incorporated Detection of human immunodeficiency virus type 1
CA2020958C (en) * 1989-07-11 2005-01-11 Daniel L. Kacian Nucleic acid sequence amplification methods
US5780219A (en) * 1989-07-11 1998-07-14 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid amplification oligonucleotides and probes to human hepatitis B virus
US7009041B1 (en) 1989-07-11 2006-03-07 Gen-Probe Incorporated Oligonucleotides for nucleic acid amplification and for the detection of Mycobacterium tuberculosis
ZA918965B (en) * 1990-11-13 1992-08-26 Siska Diagnostics Inc Nucleic acid amplification by two-enzyme,self-sustained sequence replication
DE69128077T2 (de) * 1990-12-31 1998-02-26 Promega Corp., Madison, Wis. Nuklein-säure amplifikation mit dns abhängigen rns polymerasen aktivität von rns-replikasen
DE4106473C2 (de) * 1991-03-01 1994-03-10 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur Herstellung in vitro replizierbarer Nukleinsäuren
WO1993005184A1 (en) * 1991-09-10 1993-03-18 Love Jack D Dna/rna target and signal amplification
DE4213029A1 (de) * 1991-09-26 1993-04-01 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur spezifischen vervielfaeltigung von nukleins aeuresequenzen
US6100099A (en) 1994-09-06 2000-08-08 Abbott Laboratories Test strip having a diagonal array of capture spots
CA2135073C (en) * 1992-05-06 2002-11-19 Daniel L. Kacian Nucleic acid sequence amplification method, composition and kit
US6093538A (en) * 1992-05-06 2000-07-25 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid probes to ureaplasma
JPH07506254A (ja) * 1992-05-06 1995-07-13 ジェン−プローブ・インコーポレイテッド ヒトｂ型肝炎ウイルスに対する核酸増幅オリゴヌクレオチドおよびプローブ
AU687352B2 (en) * 1992-06-08 1998-02-26 Gen-Probe Incorporated Preparation of nucleic acid from mononuclear cells
US5612200A (en) * 1992-06-24 1997-03-18 Gen-Probe Incorporated Method and kit for destroying ability of nucleic acid to be amplified
WO1994003472A1 (en) * 1992-08-04 1994-02-17 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid sequence amplification
DE4238699A1 (de) * 1992-11-17 1994-05-19 Boehringer Mannheim Gmbh Einfaches Nukleinsäurevermehrungsverfahren
US5605798A (en) 1993-01-07 1997-02-25 Sequenom, Inc. DNA diagnostic based on mass spectrometry
JP4108118B2 (ja) * 1993-03-26 2008-06-25 ジェン−プローブ・インコーポレイテッド ヒト・免疫不全ウイルス１型の検出
JP3026843B2 (ja) * 1993-07-23 2000-03-27 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド 核酸増幅の促進法
FR2708288B1 (fr) 1993-07-26 1995-09-01 Bio Merieux Procédé d'amplification d'acides nucléiques par transcription utilisant le déplacement, réactifs et nécessaire pour la mise en Óoeuvre de ce procédé.
US5459037A (en) * 1993-11-12 1995-10-17 The Scripps Research Institute Method for simultaneous identification of differentially expressed mRNAs and measurement of relative concentrations
EP0682121B1 (en) * 1993-12-01 2002-08-28 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Method of amplifying and detecting target nucleic acid sequence by using thermostable enzymes
WO1995025180A1 (en) * 1994-03-16 1995-09-21 Gen-Probe Incorporated Isothermal strand displacement nucleic acid amplification
DK0776376T3 (da) * 1994-07-15 2002-02-18 Organon Teknika Bv Anvendelse af RNA-polymerase til forbedring af en nucleinsyreamplifikationsproces
US5514551A (en) * 1994-10-14 1996-05-07 Gen-Probe Incorporated Compositions for the detection of Chlamydia trachomatis
EP0709466B1 (en) * 1994-10-28 2006-09-27 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for the simultaneous detection and quantification of multiple specific nucleic acid sequences
DE4441602A1 (de) * 1994-11-23 1996-05-30 Boehringer Mannheim Gmbh Verbessertes Transkriptionsverfahren
US5932450A (en) * 1995-06-07 1999-08-03 Gen-Probe Incorporated Enzymatic synthesis of oligonucleotides using digestible templates
US5916777A (en) * 1995-06-07 1999-06-29 Gen-Probe Incorporated Enzymatic synthesis of oligonucleotides using 3'-ribonucleotide primers
US5739311A (en) * 1995-06-07 1998-04-14 Gen-Probe Incorporated Enzymatic synthesis of phosphorothioate oligonucleotides using restriction endonucleases
US5652126A (en) * 1995-06-07 1997-07-29 Gen-Probe Incorporated Use of restriction endonuclease sequences for cleaving phosphorothioate oligonucleotides
CA2249717A1 (en) * 1996-03-18 1997-09-25 Richard K. Wilkosz Target nucleic acid sequence amplification
CA2255624C (en) 1996-05-22 2007-09-04 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for the detection of mycobacterium kansasii
AU3276497A (en) 1996-06-28 1998-01-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for detecting telomerase activity
JPH1028585A (ja) * 1996-07-16 1998-02-03 Toyobo Co Ltd 耐熱性リボヌクレアーゼｈを用いる核酸増幅法
CA2262019C (fr) 1996-08-02 2011-11-15 Bio Merieux Procede d'amplification d'une sequence d'un acide nucleique cible
CA2270132A1 (en) * 1996-11-06 1998-05-14 Sequenom, Inc. Dna diagnostics based on mass spectrometry
US5962665A (en) 1997-06-16 1999-10-05 Abbott Laboratories Nucleic acid primers and probes for detecting HIV-1 and HIV-2
US6849400B1 (en) 1997-07-23 2005-02-01 Gen-Probe Incorporated Methods for detecting and measuring spliced nucleic acids
US7098025B1 (en) 1997-07-25 2006-08-29 Ligand Pharmaceuticals Incorporated Human peroxisome proliferator activated receptor gamma (pparγ) gene regulatory sequences and uses therefor
DE69804464T2 (de) 1997-08-08 2005-09-08 bioMérieux B.V. Nukleinsäuresequenzen als primer und sonden zur amplifizierung und erkennung von allen hiv-1 subtypen
JP2002509694A (ja) 1997-11-04 2002-04-02 ロシュ ダイアグノスティックス ゲーエムベーハー 特異的かつ高感度な核酸検出方法
JP3736617B2 (ja) * 1997-12-12 2006-01-18 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 細胞型の決定方法
US20040002079A1 (en) * 1998-02-11 2004-01-01 Gunn Robert B. Sodium-phosphate cotransporter in lithium therapy for the treatment of mental illness
ID26107A (id) * 1998-02-27 2000-11-23 Pamgene Bv Metoda untuk amplifikasi tak spesifik dari asam nukleat
CA2754182A1 (en) * 1998-05-01 1999-11-11 Gen-Probe Incorporated Automated diagnostic analyzer and method
JP2002521037A (ja) * 1998-07-23 2002-07-16 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド スプライシングされた核酸を検出および測定する方法
DE69931928T2 (de) 1998-07-31 2007-01-04 Gen-Probe Inc., San Diego Reversibel inhibierende sonden
US20030049657A1 (en) * 1998-11-13 2003-03-13 Cherry Joshua L. Use of primers containing non-replicatable residues for improved cycle-sequencing of nucleic acids
DK1238100T3 (da) 1999-07-23 2006-01-23 Gen Probe Inc Polynucleotid-amplifikationsfremgangsmåde
GB9917816D0 (en) * 1999-07-29 1999-09-29 Cytocell Ltd Chemically modified probes used to regulate nucleic acid amplification assays
US6692918B2 (en) * 1999-09-13 2004-02-17 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for linear isothermal amplification of polynucleotide sequences
CA2384838C (en) 1999-09-13 2006-07-18 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for linear isothermal amplification of polynucleotide sequences
US6582938B1 (en) 2001-05-11 2003-06-24 Affymetrix, Inc. Amplification of nucleic acids
WO2001064959A1 (en) * 2000-03-02 2001-09-07 Akzo Nobel N.V. Detection of hepatitis b virus rna
CA2405450C (en) 2000-03-31 2011-08-16 Merck & Co., Inc. Dermacentor variabilis gaba-gated chloride channels
US6534292B1 (en) 2000-05-08 2003-03-18 Genencor International, Inc. Methods for forming recombined nucleic acids
CN1498274A (zh) * 2000-06-26 2004-05-19 Ŧب������˾ 基于转录的核酸扩增方法和组合物
US7846733B2 (en) * 2000-06-26 2010-12-07 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for transcription-based nucleic acid amplification
CA2835978C (en) 2000-09-01 2016-10-11 Gen-Probe Incorporated Amplification of hiv-1 sequences for detection of sequences associated with drug-resistance mutations
AU2002213096B2 (en) 2000-10-06 2007-03-29 Nugen Technologies, Inc. Methods and probes for detection and/or quantification of nucleic acid sequences
EP1427847B1 (en) 2000-12-13 2010-07-28 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for generation of multiple copies of nucleic acid sequences and methods of detection thereof
US6794141B2 (en) * 2000-12-22 2004-09-21 Arcturus Bioscience, Inc. Nucleic acid amplification
US6770752B2 (en) 2001-01-09 2004-08-03 Becton, Dickinson And Company Sequences for detection of HIV-1
EP1366179A2 (en) * 2001-03-07 2003-12-03 bioMerieux B.V Method for the amplification and detection of dna using a transcription based amplification
US7094536B2 (en) 2001-03-09 2006-08-22 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for amplification of RNA sequences
CA2416963C (en) 2001-03-09 2012-01-10 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for amplification of rna sequences
WO2002097394A2 (en) * 2001-05-31 2002-12-05 Merck & Co., Inc. Rhesus monkey, dog and ferret melanin-concentrating hormone type 2 receptor
US7074558B2 (en) * 2001-06-07 2006-07-11 Pbi Technology, Inc. Nucleic acid amplification using an RNA polymerase and DNA/RNA mixed polymer intermediate products
TWI335938B (en) * 2001-08-15 2011-01-11 Rna replication and amplification
US20050042629A1 (en) 2002-09-13 2005-02-24 Applera Corporation Thermus scotoductus nucleic acid polymerases
US7148340B2 (en) 2001-11-30 2006-12-12 Applera Corporation Thermus thermophilus nucleic acid polymerases
AU2002346498A1 (en) 2001-11-30 2003-06-17 Applera Corporation Thermus brockianus nucleic acid polymerases
KR100446621B1 (ko) * 2001-12-18 2004-09-07 삼성전자주식회사 다중 중합효소 연쇄반응에 의한 ｍｏｄｙ３유전자의 증폭을 위한 프라이머 세트
WO2003064679A2 (en) * 2002-01-30 2003-08-07 Id Biomedical Corporation Methods for detecting vancomycin-resistant microorganisms and compositions therefor
AU2003222269A1 (en) * 2002-03-11 2003-09-29 Nugen Technologies, Inc. Methods for generating double stranded dna comprising a 3' single stranded portion and uses of these complexes for recombination
US20060246434A1 (en) * 2002-03-15 2006-11-02 Erlander Mark G Nucleic acid amplification
AU2003279697A1 (en) * 2002-05-17 2004-02-16 Nugen Technologies, Inc. Methods for fragmentation, labeling and immobilizaton of nucleic acids
EP1513958B1 (en) * 2002-06-14 2011-08-10 Gen-Probe Incorporated Compositions for detecting hepatitis b virus
US7074561B2 (en) 2002-10-22 2006-07-11 Biomerieux, Inc. Isothermal amplification based assay for the detection and quantitation of alpha-fetoprotein mRNA
US6852494B2 (en) * 2003-01-10 2005-02-08 Linden Technologies, Inc. Nucleic acid amplification
JP2006523465A (ja) * 2003-04-14 2006-10-19 ニューゲン テクノロジーズ， インコーポレイテッド ランダムにプライミングされる複合プライマーを用いる大規模増幅
EP1633893B1 (en) 2003-05-19 2012-01-25 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits for determining the presence of trichomonas vaginalis in a test sample
US20050176125A1 (en) * 2003-12-23 2005-08-11 Rosetta Inpharmatics Llc Alternatively spliced isoform of CDC25A phosphatase and methods of use
US20050208538A1 (en) 2003-12-29 2005-09-22 Nurith Kurn Methods for analysis of nucleic acid methylation status and methods for fragmentation, labeling and immobilization of nucleic acids
AU2005245815B2 (en) 2004-05-07 2011-06-09 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Methods of diagnosing or treating prostate cancer using the erg gene, alone or in combination with other over or under expressed genes in prostate cancer
US20050266469A1 (en) * 2004-05-25 2005-12-01 Raymond Christopher K Alternatively spliced isoforms of checkpoint kinase 1 (CHK1)
US20060030036A1 (en) 2004-05-28 2006-02-09 Victor Joseph Chips for multiplex analyses
US7150969B2 (en) * 2004-06-04 2006-12-19 Rosetta Inpharmatics Llc Alternatively spliced isoform of acetyl-CoA carboxylase 2 (ACC2)
US20050277121A1 (en) 2004-06-11 2005-12-15 Ambion, Inc. Crude biological derivatives competent for nucleic acid detection
JP4658660B2 (ja) 2005-03-30 2011-03-23 株式会社日立ハイテクノロジーズ 核酸検出法
JP4773513B2 (ja) 2005-05-06 2011-09-14 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド Ａ型及びｂ型インフルエンザウイルスの核酸を検出するための組成物及びアッセイ
JP2008544214A (ja) 2005-05-09 2008-12-04 セラノス， インコーポレイテッド ポイントオブケア流体システムおよびその使用
EP2623596B1 (en) 2005-05-13 2014-10-08 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Primer and probe for use in detection of Mycobacterium kansasii and method for detection of Mycobacterium kansasii using the same
US7550264B2 (en) 2005-06-10 2009-06-23 Datascope Investment Corporation Methods and kits for sense RNA synthesis
WO2007030759A2 (en) * 2005-09-07 2007-03-15 Nugen Technologies, Inc. Improved nucleic acid amplification procedure
AU2006291054B2 (en) * 2005-09-12 2011-10-13 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Recurrent gene fusions in prostate cancer
US9957569B2 (en) * 2005-09-12 2018-05-01 The Regents Of The University Of Michigan Recurrent gene fusions in prostate cancer
US20100035331A1 (en) 2006-02-15 2010-02-11 Tosoh Corporation Method for extracting of nucleic acid from biological material
EP1992703B1 (en) 2006-03-13 2012-04-11 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Method for detection of mutant gene
US8741230B2 (en) 2006-03-24 2014-06-03 Theranos, Inc. Systems and methods of sample processing and fluid control in a fluidic system
US11287421B2 (en) 2006-03-24 2022-03-29 Labrador Diagnostics Llc Systems and methods of sample processing and fluid control in a fluidic system
WO2007129628A1 (ja) 2006-05-02 2007-11-15 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. マイコバクテリウム・イントラセルラーレ検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたマイコバクテリウム・イントラセルラーレの検出方法
US11001881B2 (en) 2006-08-24 2021-05-11 California Institute Of Technology Methods for detecting analytes
PL2017356T3 (pl) 2006-06-06 2012-03-30 Gen Probe Inc Znakowane oligonukleotydy i ich zastosowanie w sposobach amplifikacji kwasu nukleinowego
CA2656315A1 (en) * 2006-06-30 2008-01-10 Nugen Technologies, Inc. Methods for fragmentation and labeling of nucleic acids
US7501254B2 (en) 2006-07-20 2009-03-10 Ghc Technologies, Inc. Methods and compositions for amplification and capture of nucleic acid sequences
US11525156B2 (en) 2006-07-28 2022-12-13 California Institute Of Technology Multiplex Q-PCR arrays
WO2008014485A2 (en) 2006-07-28 2008-01-31 California Institute Of Technology Multiplex q-pcr arrays
EP2057465A4 (en) 2006-08-09 2010-04-21 Homestead Clinical Corp SPECIFIC ORGAN PROTEINS AND METHODS OF USE
US11560588B2 (en) 2006-08-24 2023-01-24 California Institute Of Technology Multiplex Q-PCR arrays
EP1921156A1 (en) * 2006-11-10 2008-05-14 bioMerieux B.V. Improved multiplex nucleic acid amplification using blocked primers
EP2479273A3 (en) 2006-12-18 2012-10-10 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Primer and probe for detection of mycobacterium avium and method for detection of mycobacterium avium using the same
CA2673017C (en) * 2006-12-21 2015-08-04 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for nucleic acid amplification
CN101605911A (zh) * 2007-01-17 2009-12-16 梅里第安生物科学公司 有效用于核酸的环-介导的等温扩增(lamp)的稳定试剂和试剂盒
GB0701253D0 (en) 2007-01-23 2007-02-28 Diagnostics For The Real World Nucleic acid amplification and testing
EP1978111B1 (en) 2007-04-02 2013-03-27 Gen-Probe Incorporated Compositions, kits and related methods for the detection and/or monitoring of Pseudomonas aeruginosa
JP2009000044A (ja) 2007-06-21 2009-01-08 Hitachi High-Technologies Corp 核酸増幅法
CA2692441C (en) 2007-07-06 2020-01-21 The Regents Of The University Of Michigan Solute carrier family 45 member 3 (slc45a3) and ets family gene fusions in prostate cancer
EP2171094B1 (en) 2007-07-06 2011-11-16 The Regents of the University of Michigan Mipol1-etv1 gene rearrangements
CN108333379B (zh) 2007-10-02 2021-09-07 拉布拉多诊断有限责任公司 模块化现场护理装置及其应用
JP5299986B2 (ja) 2007-11-01 2013-09-25 国立大学法人山口大学 核酸の定量方法
EP2231869B2 (en) 2007-12-21 2022-05-11 Biomerieux Sa Detection of methicillin-resistant staphylococcus aureus
JPWO2009099037A1 (ja) 2008-02-08 2011-05-26 和光純薬工業株式会社 クラミドフィラ・キャビエ検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたクラミドフィラ・キャビエの検出方法
US8034568B2 (en) * 2008-02-12 2011-10-11 Nugen Technologies, Inc. Isothermal nucleic acid amplification methods and compositions
US7846666B2 (en) 2008-03-21 2010-12-07 Nugen Technologies, Inc. Methods of RNA amplification in the presence of DNA
WO2009120801A2 (en) * 2008-03-25 2009-10-01 The Regents Of The University Of Michigan Ikki inhibitor therapies and screening methods, and related ikki diagnostics
WO2009140374A2 (en) 2008-05-13 2009-11-19 Gen-Probe Incorporated Inactivatable target capture oligomers for use in the selective hybridization and capture of target nucleic acid sequences
EP2806054A1 (en) 2008-05-28 2014-11-26 Genomedx Biosciences Inc. Systems and methods for expression-based discrimination of distinct clinical disease states in prostate cancer
US10359424B2 (en) 2008-05-28 2019-07-23 Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation Primer and probe for detection of Mycobacterium intracellulare, and method for detection of Mycobacterium intracellulare using the primer or the probe
AU2009262870B2 (en) 2008-05-30 2014-03-20 Gen-Probe Incorporated Compositions, kits and related methods for the detection and/or monitoring of Salmonella
US20100240024A1 (en) * 2008-09-03 2010-09-23 Abbott Laboratories Assays And Kits For Determining HIV-1 Tropism
EP2331703A2 (en) * 2008-09-12 2011-06-15 Promega Corporation Assessing expression of endogenous and exogenous genes
US8748133B2 (en) 2008-12-30 2014-06-10 Gen-Probe Incorporated Compositions, kits and related methods for the detection and/or monitoring of Listeria
CN102639709A (zh) 2009-01-09 2012-08-15 密歇根大学董事会 癌症中的复现性基因融合体
WO2010114842A1 (en) 2009-03-30 2010-10-07 Ibis Biosciences, Inc. Bioagent detection systems, devices, and methods
CA3128851A1 (en) 2009-06-23 2010-12-29 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting nucleic acid from mollicutes
CA2766391C (en) 2009-07-01 2021-04-20 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for multiplex nucleic acid amplification
US20110059453A1 (en) * 2009-08-23 2011-03-10 Affymetrix, Inc. Poly(A) Tail Length Measurement by PCR
WO2011026139A1 (en) 2009-08-31 2011-03-03 Gen-Probe Incorporated Dengue virus assay
CA2774349C (en) * 2009-09-17 2019-03-19 The Regents Of The University Of Michigan Recurrent gene fusions in prostate cancer
EP3461889A1 (en) 2009-11-19 2019-04-03 Solis Biodyne Compositions for increasing polypeptide stability and activity, and related methods
AU2011207406B2 (en) 2010-01-22 2015-01-15 Gen-Probe Incorporated Probes for detecting the presence of Trichomonas vaginalis in a sample
US9458513B2 (en) 2010-03-23 2016-10-04 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Primer and probe for detecting chlamydia trachomatis, and method for detecting chlamydia trachomatis using same
EP2561094B1 (en) 2010-04-21 2017-03-29 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits to detect herpes simplex virus nucleic acid
JP6066900B2 (ja) 2010-04-26 2017-01-25 エータイアー ファーマ， インコーポレイテッド システイニルｔＲＮＡ合成酵素のタンパク質フラグメントに関連した治療用、診断用および抗体組成物の革新的発見
EP2563381B1 (en) 2010-04-27 2017-08-09 aTyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of isoleucyl trna synthetases
US8993723B2 (en) 2010-04-28 2015-03-31 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of alanyl-tRNA synthetases
US9034320B2 (en) 2010-04-29 2015-05-19 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of Valyl-tRNA synthetases
CA2797374C (en) 2010-04-29 2021-02-16 Pangu Biopharma Limited Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of asparaginyl trna synthetases
CA2797978C (en) 2010-05-03 2019-12-03 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of methionyl-trna synthetases
CN103096925A (zh) 2010-05-03 2013-05-08 Atyr医药公司 与精氨酰-tRNA合成酶的蛋白片段相关的治疗、诊断和抗体组合物的创新发现
CA2797977C (en) 2010-05-03 2019-08-20 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of phenylalanyl-alpha-trna synthetases
WO2011140267A2 (en) 2010-05-04 2011-11-10 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of p38 multi-trna synthetase complex
JP6396656B2 (ja) 2010-05-14 2018-09-26 エータイアー ファーマ， インコーポレイテッド フェニルアラニルβｔＲＮＡ合成酵素のタンパク質フラグメントに関連した治療用、診断用および抗体組成物の革新的発見
CN103096913B (zh) 2010-05-27 2017-07-18 Atyr 医药公司 与谷氨酰胺酰‑tRNA合成酶的蛋白片段相关的治疗、诊断和抗体组合物的创新发现
US8962560B2 (en) 2010-06-01 2015-02-24 Atyr Pharma Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of Lysyl-tRNA synthetases
CN102985566B (zh) 2010-06-30 2015-06-17 简.探针公司 使用分析物和过程控制信号的单次读取确定而鉴定含分析物的样品的方法和设备
DK2591363T3 (en) 2010-07-07 2017-12-11 Univ Michigan Regents DIAGNOSIS AND TREATMENT OF BREAST CANCER
WO2012021247A2 (en) 2010-07-12 2012-02-16 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of glycyl-trna synthetases
EP3305920B1 (en) 2010-07-12 2020-02-12 Gen-Probe Incorporated Compositions and assays to detect seasonal h3 influenza a virus nucleic acid
CN103589627B (zh) 2010-07-23 2015-11-18 贝克曼考尔特公司 用于在pcr反应容器内进行实时pcr的热循环器模块和系统
EP2608801B1 (en) 2010-08-25 2019-08-21 aTyr Pharma, Inc. INNOVATIVE DISCOVERY OF THERAPEUTIC, DIAGNOSTIC, AND ANTIBODY COMPOSITIONS RELATED TO PROTEIN FRAGMENTS OF TYROSYL-tRNA SYNTHETASES
GB2497495B (en) 2010-10-04 2018-06-06 Gen Probe Prodesse Inc Compositions, methods and kits to detect adenovirus nucleic acids
CN103403181B (zh) 2010-11-19 2016-09-07 密执安大学评议会 ncRNA及其用途
US8945556B2 (en) 2010-11-19 2015-02-03 The Regents Of The University Of Michigan RAF gene fusions
CN106290159A (zh) 2011-01-21 2017-01-04 提拉诺斯公司 样品使用最大化的系统和方法
ES2659763T3 (es) 2011-02-14 2018-03-19 The Regents Of The University Of Michigan Composiciones y procedimientos para el tratamiento de obesidad y trastornos relacionados
EP2702166B1 (en) 2011-04-25 2018-06-06 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting bv-associated bacterial nucleic acid
EP2710144B1 (en) 2011-05-19 2020-10-07 Agena Bioscience, Inc. Processes for multiplex nucleic acid identification
US10752944B2 (en) 2011-09-06 2020-08-25 Gen-Probe Incorporated Circularized templates for sequencing
WO2013036685A1 (en) 2011-09-06 2013-03-14 Gen-Probe Incorporated Closed nucleic acid structures
US20140170735A1 (en) 2011-09-25 2014-06-19 Elizabeth A. Holmes Systems and methods for multi-analysis
US9664702B2 (en) 2011-09-25 2017-05-30 Theranos, Inc. Fluid handling apparatus and configurations
US9619627B2 (en) 2011-09-25 2017-04-11 Theranos, Inc. Systems and methods for collecting and transmitting assay results
US8475739B2 (en) 2011-09-25 2013-07-02 Theranos, Inc. Systems and methods for fluid handling
US9268915B2 (en) 2011-09-25 2016-02-23 Theranos, Inc. Systems and methods for diagnosis or treatment
US8840838B2 (en) 2011-09-25 2014-09-23 Theranos, Inc. Centrifuge configurations
US8435738B2 (en) 2011-09-25 2013-05-07 Theranos, Inc. Systems and methods for multi-analysis
US9632102B2 (en) 2011-09-25 2017-04-25 Theranos, Inc. Systems and methods for multi-purpose analysis
US8380541B1 (en) 2011-09-25 2013-02-19 Theranos, Inc. Systems and methods for collecting and transmitting assay results
AU2012312169B2 (en) 2011-09-21 2016-01-14 Gen-Probe Incorporated Methods for amplifying nucleic acid using tag-mediated displacement
US9810704B2 (en) 2013-02-18 2017-11-07 Theranos, Inc. Systems and methods for multi-analysis
JP2014530358A (ja) 2011-09-25 2014-11-17 セラノス， インコーポレイテッド 多重分析のためのシステム及び方法
US9250229B2 (en) 2011-09-25 2016-02-02 Theranos, Inc. Systems and methods for multi-analysis
US10012664B2 (en) 2011-09-25 2018-07-03 Theranos Ip Company, Llc Systems and methods for fluid and component handling
FR2981088B1 (fr) 2011-10-06 2013-11-29 Biomerieux Sa Arn polymerases mutees
CN104080958A (zh) 2011-10-19 2014-10-01 纽亘技术公司 用于定向核酸扩增和测序的组合物和方法
CA2853760A1 (en) 2011-11-04 2013-05-10 Oslo Universitetssykehus Hf Methods and biomarkers for analysis of colorectal cancer
WO2013067413A1 (en) 2011-11-04 2013-05-10 Gen-Probe Incorporated Molecular assay reagents and methods
EP2776844B1 (en) 2011-11-07 2020-09-30 Beckman Coulter, Inc. Specimen container detection
US9910054B2 (en) 2011-11-07 2018-03-06 Beckman Coulter, Inc. System and method for processing samples
EP3373015A1 (en) 2011-11-07 2018-09-12 Beckman Coulter Inc. Aliquotter system and workflow
KR102040996B1 (ko) 2011-11-07 2019-11-05 베크만 컬터, 인코포레이티드 로봇식 아암
US9482684B2 (en) 2011-11-07 2016-11-01 Beckman Coulter, Inc. Centrifuge system and workflow
EP2776847A1 (en) 2011-11-07 2014-09-17 Beckman Coulter, Inc. Magnetic damping for specimen transport system
DE102011120550B4 (de) 2011-12-05 2013-11-07 Gen-Probe Prodesse, Inc. Zusammensetzungen, Verfahren und Kits zur Detektion von Adenovirusnukleinsäuren
WO2013096460A1 (en) 2011-12-20 2013-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Pseudogenes and uses thereof
WO2013096799A1 (en) 2011-12-22 2013-06-27 Ibis Biosciences, Inc. Systems and methods for isolating nucleic acids from cellular samples
WO2013096838A2 (en) 2011-12-22 2013-06-27 Ibis Biosciences, Inc. Systems and methods for isolating nucleic acids
CN104169437B (zh) 2011-12-23 2017-07-11 生物梅里埃公司 甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌的mecA变体菌株的检测
US9970061B2 (en) 2011-12-27 2018-05-15 Ibis Biosciences, Inc. Bioagent detection oligonucleotides
AU2013208757A1 (en) 2012-01-09 2014-07-24 Oslo Universitetssykehus Hf Methods and biomarkers for analysis of colorectal cancer
GB2513793B (en) 2012-01-26 2016-11-02 Nugen Tech Inc Compositions and methods for targeted nucleic acid sequence enrichment and high efficiency library generation
DK2814514T3 (en) 2012-02-16 2017-12-18 Atyr Pharma Inc Histidyl tRNA synthetases for the treatment of autoimmune and inflammatory diseases
EP2817627A2 (en) 2012-02-21 2014-12-31 Oslo Universitetssykehus HF Methods and biomarkers for detection and prognosis of cervical cancer
AU2013229151A1 (en) 2012-03-06 2014-09-25 Aarhus University Gene signatures associated with efficacy of postmastectomy radiotherapy in breast cancer
US9732387B2 (en) 2012-04-03 2017-08-15 The Regents Of The University Of Michigan Biomarker associated with irritable bowel syndrome and Crohn's disease
AU2013205110B2 (en) 2012-04-24 2016-10-13 Gen-Probe Incorporated Compositions, Methods and Kits to Detect Herpes Simplex Virus Nucleic Acids
JP6181751B2 (ja) 2012-06-18 2017-08-16 ニューゲン テクノロジーズ， インコーポレイテッド 望まれない核酸配列のネガティブ選択のための組成物および方法
WO2014005076A2 (en) 2012-06-29 2014-01-03 The Regents Of The University Of Michigan Methods and biomarkers for detection of kidney disorders
US20150011396A1 (en) 2012-07-09 2015-01-08 Benjamin G. Schroeder Methods for creating directional bisulfite-converted nucleic acid libraries for next generation sequencing
CA2881627A1 (en) 2012-08-16 2014-02-20 Genomedx Biosciences Inc. Cancer diagnostics using biomarkers
WO2014042986A1 (en) 2012-09-11 2014-03-20 Theranos, Inc. Information management systems and methods using a biological signature
EP2904120B1 (en) 2012-10-04 2018-01-10 The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University Methods and reagents for detection, quantitation, and serotyping of dengue viruses
US20160046997A1 (en) 2012-10-18 2016-02-18 Oslo Universitetssykehus Hf Biomarkers for cervical cancer
JP6309019B2 (ja) 2012-11-27 2018-04-11 ポンティフィシア・ウニベルシダッド・カトリカ・デ・チレＰｏｎｔｉｆｉｃｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ Ｃａｔｏｌｉｃａ ｄｅ Ｃｈｉｌｅ 甲状腺腫瘍を診断するための組成物および方法
SG11201506421PA (en) 2013-02-18 2015-09-29 Theranos Inc Systems and methods for collecting and transmitting assay results
CN105378108A (zh) 2013-03-13 2016-03-02 雅培分子公司 用于分离核酸的系统和方法
CN105378109B (zh) 2013-03-14 2019-06-14 雅培分子公司 使用尿嘧啶-dna-n-糖基化酶使错误最小化
AU2013202805B2 (en) 2013-03-14 2015-07-16 Gen-Probe Incorporated System and method for extending the capabilities of a diagnostic analyzer
CN105378107A (zh) 2013-03-14 2016-03-02 雅培分子公司 多重甲基化-特异性扩增系统和方法
EP2971139A4 (en) 2013-03-15 2016-12-07 Abbott Molecular Inc SYSTEMS AND METHOD FOR PROVIDING THE CHANGE OF A GENOMIC COPY NUMBER
EP3533884A1 (en) 2013-03-15 2019-09-04 Ibis Biosciences, Inc. Dna sequences to assess contamination in dna sequencing
US20140274738A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Nugen Technologies, Inc. Sequential sequencing
JP2016517687A (ja) 2013-03-27 2016-06-20 サンプル テクノロジーズ，インコーポレイティド 組換えファージ及び細菌検出方法
WO2014176696A1 (en) 2013-04-30 2014-11-06 Université de Montréal Novel biomarkers for acute myeloid leukemia
WO2014179734A1 (en) 2013-05-02 2014-11-06 The Regents Of The University Of Michigan Deuterated amlexanox
CA2915820A1 (en) 2013-06-19 2014-12-24 Michael Sandor Koeris Phage-based bacterial detection assay
CA2917430C (en) 2013-07-25 2020-10-06 Dch Molecular Diagnostics, Inc. Methods and compositions for detecting bacterial contamination
US11545241B1 (en) 2013-09-07 2023-01-03 Labrador Diagnostics Llc Systems and methods for analyte testing and data management
JP6525473B2 (ja) 2013-11-13 2019-06-05 ニューゲン テクノロジーズ， インコーポレイテッド 複製物配列決定リードを同定するための組成物および方法
JP6435334B2 (ja) 2013-12-11 2018-12-05 アキュラジェン ホールディングス リミテッド 稀な配列変異体を検出するための組成物および方法
US11859246B2 (en) 2013-12-11 2024-01-02 Accuragen Holdings Limited Methods and compositions for enrichment of amplification products
US11286519B2 (en) 2013-12-11 2022-03-29 Accuragen Holdings Limited Methods and compositions for enrichment of amplification products
WO2015112949A2 (en) * 2014-01-27 2015-07-30 ArcherDX, Inc. Isothermal methods and related compositions for preparing nucleic acids
WO2015131107A1 (en) 2014-02-28 2015-09-03 Nugen Technologies, Inc. Reduced representation bisulfite sequencing with diversity adaptors
EP3151733B1 (en) 2014-06-06 2020-04-15 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for characterizing and diagnosing periodontal disease
WO2016077426A1 (en) 2014-11-11 2016-05-19 Abbott Molecular Inc. Hybridization probes and methods
DK3259602T3 (da) 2015-02-20 2021-02-15 Takara Bio Usa Inc Fremgangsmåde til hurtig nøjagtig dispensering, visualisering og analyse af enkeltceller
US9708647B2 (en) 2015-03-23 2017-07-18 Insilixa, Inc. Multiplexed analysis of nucleic acid hybridization thermodynamics using integrated arrays
WO2016168755A1 (en) 2015-04-17 2016-10-20 Distributed Bio, Inc. Method for mass humanization of non-human antibodies
JP2018512880A (ja) 2015-04-24 2018-05-24 アジーナ バイオサイエンス， インコーポレイテッド 少量の対立遺伝子および多型の同定ならびに定量のためのマルチプレックス法
EP3286328B1 (en) 2015-04-24 2020-10-21 Agena Bioscience, Inc. Multiplex methods for detection and quantification of minor variants
CN107849603B (zh) 2015-04-24 2022-01-28 阿提拉生物系统公司 利用有限核苷酸组成的引物扩增
CA2986133A1 (en) * 2015-05-18 2016-11-24 Calimmune, Inc. Methods of discriminating between hiv-1 and lentiviral vectors
PL3311158T3 (pl) 2015-06-19 2023-11-27 Sera Prognostics, Inc. Pary biomarkerów do przewidywania przedwczesnego porodu
US9499861B1 (en) 2015-09-10 2016-11-22 Insilixa, Inc. Methods and systems for multiplex quantitative nucleic acid amplification
AU2016334233B2 (en) 2015-10-09 2023-01-05 Accuragen Holdings Limited Methods and compositions for enrichment of amplification products
US20180363039A1 (en) 2015-12-03 2018-12-20 Accuragen Holdings Limited Methods and compositions for forming ligation products
EP3407974A4 (en) 2016-01-29 2019-08-28 The Regents Of The University Of Michigan ANALOGUES OF AMLEXANOX
WO2017155858A1 (en) 2016-03-07 2017-09-14 Insilixa, Inc. Nucleic acid sequence identification using solid-phase cyclic single base extension
WO2017201102A1 (en) 2016-05-16 2017-11-23 Accuragen Holdings Limited Method of improved sequencing by strand identification
US11091795B2 (en) 2016-07-11 2021-08-17 Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Compositions and methods for diagnosing and treating arrhythmias
WO2018017892A1 (en) 2016-07-21 2018-01-25 Takara Bio Usa, Inc. Multi-z imaging and dispensing with multi-well devices
CA3033749A1 (en) 2016-08-15 2018-02-22 Accuragen Holdings Limited Compositions and methods for detecting rare sequence variants
WO2018039490A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 Genomedx Biosciences, Inc. Use of genomic signatures to predict responsiveness of patients with prostate cancer to post-operative radiation therapy
CA3037185A1 (en) 2016-09-15 2018-03-22 ArcherDX, Inc. Methods of nucleic acid sample preparation
CA3037190A1 (en) 2016-09-15 2018-03-22 ArcherDX, Inc. Methods of nucleic acid sample preparation for analysis of cell-free dna
JP6767833B2 (ja) 2016-09-29 2020-10-14 日本特殊陶業株式会社 加熱装置
WO2018058249A1 (en) 2016-09-30 2018-04-05 The Governing Council Of The University Of Toronto System for identifying and targeting individual cells within a heterogeneous population for selective extraction of cellular content
US10427162B2 (en) 2016-12-21 2019-10-01 Quandx Inc. Systems and methods for molecular diagnostics
WO2018127786A1 (en) 2017-01-06 2018-07-12 Oslo Universitetssykehus Hf Compositions and methods for determining a treatment course of action
WO2018132916A1 (en) 2017-01-20 2018-07-26 Genomedx Biosciences, Inc. Molecular subtyping, prognosis, and treatment of bladder cancer
WO2018165600A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 Genomedx Biosciences, Inc. Subtyping prostate cancer to predict response to hormone therapy
CN110573254B (zh) 2017-03-24 2022-12-02 简·探针公司 盖组件和相关的使用方法
CA3062716A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 Decipher Biosciences, Inc. Genetic signatures to predict prostate cancer metastasis and identify tumor agressiveness
EP3668996A4 (en) 2017-08-18 2021-04-21 Sera Prognostics, Inc. CLOCK PREGNANCY PROTEIN FOR PREDICTING THE DATE AND TIME TO BIRTH
US11099202B2 (en) 2017-10-20 2021-08-24 Tecan Genomics, Inc. Reagent delivery system
US11203782B2 (en) 2018-03-29 2021-12-21 Accuragen Holdings Limited Compositions and methods comprising asymmetric barcoding
US12049665B2 (en) 2018-06-12 2024-07-30 Accuragen Holdings Limited Methods and compositions for forming ligation products
US20210310059A1 (en) 2018-08-08 2021-10-07 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits for detecting mycoplasma genitalium
EP3937780A4 (en) 2019-03-14 2022-12-07 InSilixa, Inc. METHODS AND SYSTEMS FOR TIMED FLUORESCENCE-BASED DETECTION
EP4018004A1 (en) 2019-08-23 2022-06-29 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits for detecting treponema pallidum
CA3153514A1 (en) 2019-09-05 2021-03-11 Gen-Probe Incorporated Detection of chlamydia trachomatis nucleic acid variants
CN113275053A (zh) 2020-02-03 2021-08-20 帝肯基因组学公司 试剂存储系统
WO2021252574A1 (en) 2020-06-10 2021-12-16 Sera Prognostics, Inc. Nucleic acid biomarkers for placental dysfunction
US20240271186A1 (en) 2021-08-03 2024-08-15 Wageningen Universiteit Argonaute-based nucleic acid detection system
WO2023021330A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 University Of Oslo Compositions and methods for determining a treatment course of action
AU2023209322A1 (en) 2022-01-20 2024-08-08 Wageningen Universiteit Thermostable rna polymerase
WO2023152568A2 (en) 2022-02-10 2023-08-17 Oslo Universitetssykehus Hf Compositions and methods for characterizing lung cancer
WO2023175434A1 (en) 2022-03-15 2023-09-21 Diagenode S.A. Detection of methylation status of a dna sample

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA559709A (en) * 1958-07-01 International Standard Electric Corporation Travelling wave tubes
US4957858A (en) * 1986-04-16 1990-09-18 The Salk Instute For Biological Studies Replicative RNA reporter systems
DK171161B1 (da) * 1985-03-28 1996-07-08 Hoffmann La Roche Fremgangsmåde til påvisning af forekomst eller fravær af mindst én specifik nukleinsyresekvens i en prøve eller til skelnen mellem to forskellige nukleinsyresekvenser i denne prøve
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
AU606043B2 (en) * 1985-03-28 1991-01-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Detection of viruses by amplification and hybridization
US5075211A (en) * 1986-03-26 1991-12-24 Genetic Systems Corporation Synthetic antigen for the detection of AIDS-related disease
CA1338457C (en) * 1986-08-22 1996-07-16 Henry A. Erlich Purified thermostable enzyme
IL86724A (en) * 1987-06-19 1995-01-24 Siska Diagnostics Inc Methods and kits for amplification and testing of nucleic acid sequences
US4994368A (en) * 1987-07-23 1991-02-19 Syntex (U.S.A.) Inc. Amplification method for polynucleotide assays
JP2774121B2 (ja) * 1987-07-31 1998-07-09 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リーランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ 標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅
CA1340807C (en) * 1988-02-24 1999-11-02 Lawrence T. Malek Nucleic acid amplification process
WO1990001068A1 (en) * 1988-07-22 1990-02-08 Life Technologies, Inc. Sequence specific assay for the detection of a nucleic acid molecule
CA2005589C (en) * 1988-12-16 2001-02-06 Thomas Raymond Gingeras Self-sustained, sequence replication system
US5112734A (en) * 1989-05-26 1992-05-12 Gene-Trak Systems Target-dependent synthesis of an artificial gene for the synthesis of a replicatable rna
CA2020958C (en) * 1989-07-11 2005-01-11 Daniel L. Kacian Nucleic acid sequence amplification methods
US5194370A (en) * 1990-05-16 1993-03-16 Life Technologies, Inc. Promoter ligation activated transcription amplification of nucleic acid sequences

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1964920A1 (en) 2007-03-01 2008-09-03 Hitachi High-Technologies Corporation Instrument and method for nucleic acid isolation
WO2009001737A1 (ja) 2007-06-22 2008-12-31 Tosoh Corporation 改良されたノロウイルスｒｎａ検出方法
WO2009044773A1 (ja) 2007-10-04 2009-04-09 Tosoh Corporation レジオネラ属菌ｒＲＮＡ増幅用プライマー、検出方法および検出キット
WO2010041755A1 (ja) 2008-10-06 2010-04-15 東ソー株式会社 サバイビンｍＲＮＡの測定方法
WO2014051076A1 (ja) 2012-09-28 2014-04-03 株式会社Ｂｎａ Ｂｎａクランプ法

Also Published As

Publication number Publication date
JPH1146778A (ja) 1999-02-23
DE69034177T2 (de) 2005-10-27
FI911152A0 (fi) 1991-03-07
AU677418B2 (en) 1997-04-24
EP0731175A2 (en) 1996-09-11
EP0731174A2 (en) 1996-09-11
EP0408295A2 (en) 1991-01-16
GR3021704T3 (en) 1997-02-28
EP0731174A3 (en) 1998-03-25
JP3350511B2 (ja) 2002-11-25
KR100242252B1 (ko) 2000-03-02
IE902539A1 (en) 1991-02-27
AU7415694A (en) 1994-11-24
DE69028257D1 (de) 1996-10-02
EP0731175A3 (en) 2004-05-26
ATE141956T1 (de) 1996-09-15
DE69034177D1 (de) 2004-12-23
AU6166390A (en) 1991-02-22
WO1991001384A1 (en) 1991-02-07
ES2091225T3 (es) 1996-11-01
JPH04500759A (ja) 1992-02-13
EP0408295B1 (en) 1996-08-28
EP0408295A3 (en) 1991-08-28
NO910902D0 (no) 1991-03-07
US5480784A (en) 1996-01-02
DK0408295T3 (da) 1996-09-16
KR920701478A (ko) 1992-08-11
JP3445131B2 (ja) 2003-09-08
JP2002355099A (ja) 2002-12-10
DE69028257T2 (de) 1997-01-09
EP0731174B1 (en) 2004-11-17
JP2000350592A (ja) 2000-12-19
ATE282716T1 (de) 2004-12-15
AU650622B2 (en) 1994-06-30
PT94662A (pt) 1991-03-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3241717B2 (ja) 核酸配列増幅法
US5824518A (en) Nucleic acid sequence amplification methods
JP4372837B2 (ja) 核酸配列増幅
US5766849A (en) Methods of amplifying nucleic acids using promoter-containing primer sequence
US6063604A (en) Target nucleic acid sequence amplification
EP0487628B1 (en) Enhanced nucleic acid amplification process
US5888729A (en) Oligonucleotide probes and methods for detecting Streptococcus pneumoniae
JPH10510161A (ja) 末端反復増幅方法
US20220267847A1 (en) Crispr multi-target detection method and test kit therefor
US7083922B2 (en) Detection of HIV
US7009041B1 (en) Oligonucleotides for nucleic acid amplification and for the detection of Mycobacterium tuberculosis

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20071019

Year of fee payment: 6

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081019

Year of fee payment: 7

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081019

Year of fee payment: 7

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081019

Year of fee payment: 7

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081019

Year of fee payment: 7

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081019

Year of fee payment: 7

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081019

Year of fee payment: 7

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081019

Year of fee payment: 7

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091019

Year of fee payment: 8

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091019

Year of fee payment: 8

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091019

Year of fee payment: 8

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091019

Year of fee payment: 8

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101019

Year of fee payment: 9

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101019

Year of fee payment: 9

EXPY Cancellation because of completion of term
FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101019

Year of fee payment: 9

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101019

Year of fee payment: 9