PT94662A - Metodos para amplificacao de sequencias de acido nucleico - Google Patents

Metodos para amplificacao de sequencias de acido nucleico Download PDF

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Description

tste pedido de patente è uma continuação em parte de Psdη Pat« N9 de Série 379,501, apresentado em 11 ds Julho de 1989 =
Campo......ds._lnv.en to
Este invento está relacionado com métodos para aumentar α número de cópias de uma sequfncia de ácido nucleico especifica ou -«sequfncia alvo» que possa estar presente sósinha ou como um componente5 grande ou pequeno, de uma mistura homogénea ou heterogénea tís ácidos nucleícos. A mistura de ácidos nucleicos pode ser encontrada numa retirada para testes da diagnóstica, testes do ambiente, estudos de investigação, para a preparação ds reagentes ou materiais para outros processos tais coma clonsgsm ou outros fins, A amplificaçSo selectiva cie sequtncias especificas de ácido nucleico é importante para aumentar a sensibilidade de ensaios aa diagnósticos e ambientais mantendo ao mesmo tempo a especificidades aumentar a sensibilidade, convenifncia, precisão a rsprodutibiϊidade ds uma variedade ds processos de investigação* s proporcionar fontes amplas de oligonucleotídeos específicos para vários fins* 0 presente invento é particularmente adequado para usares testes de ambiente e de diagnóstico devido à conveniWncia com a qual podem ser praticados.
Fundamento da Inventa A detecçSo e/ou quantificação de sequências de ácido nuclsica específicas é uma técnica cada v&z mais importante para a identificação a classificaçao de micrcorganisniOSg diagnóstico ás doenças infecciosasp datecção e caracterização da anormalidades genéticas* identificação de alterações genéticas associadas com cancro? estudo da susceptibilidade genética à doença e medição da resposta a vários tipos de tratamento. Tais processos têm encontrado utilizações crescentes na detecçSo e quantificação de microorganismos em stocks de alimentos, amostras ambientais, stocks de sementes e outros tipos de materiais em que seja necessário controlar a presença de microorganismos específicos» Pode-se encontrar outras aplicações nas ciências forenses, antropologia, arqueologia e biologia sempre que a medição o grau de relação entre sequências de ácido nucleico seja usado para identificar os suspeitos criminais, resolver disputas de paternidade n construir árvores genealógicas e filogenéticss e ajudar a classifieação de uma variedade de formas de vida.
Um método vulgar para a detecçSo a quantifieação c!e sequências especificas de ácido nucleico á a hifaridação de ácidos rmclaicos, Este método baseia-se na capacidade de duas cadeias de ácido nucleico possuírem sequências complementares ou essencial-mente complementares, em condições adequadas, para formar uma estrutura de cadeia dupla. Para detectar e/ou quantificar uma sequência de ácido nucleico específica (conhecida como «sequência sívdSí ? prepara-35 um oligonucleofícreo marcado (conhecido como «sonda»? que contem sequências complementares das da sequência alvo. A sonda é misturada com uma amostra suspeita de conter a sequência alvo e criadas condições adequadas para a formação ds híbridos. A sonda híbrida com a sequência alvo se sla estiver presente na amostra. Os híbridos sonda—alvo são então separados » i
da sonda ds cadeia simples através de uma de várias maneiras* risde-se a quantidade de marca associada aos híbridos* A sensibilidade dos ensaios de hibridsçSo de acidas nuclsicos é limitada principalmsnts pela actlvxoads específica cia sonda,, velocidade e grau da rescçSo de hibridação* a eficácia do método para separação da sonda hibridada e não hibridada e a sensibilidade com a qual a marca pode ser detectsda* Nas melhores condiçõesg os métodos ds hibridação directa tais como os descritos atrás podem dstsctar cerca ds 1 x Í0W a x κ 10w moléculas alvo* Os processos mais sensíveis podem não ter muitas das características necessárias aos testes clínicos e ambientais ds rotina tais como velocidade? conveniência e economia* Ainda9 as suas sensibilidades podem não ser suficientes para muitas aplicações pretendidas* As doenças infecciosas podem estar associadas a um único microorganismo patogánico por 1Θ ml de sangue ou de outra amostra* Os investigadores forenses podem tíispôr de apenas quantidades diminutas ds tecido da uma cena de crime* Os investigadores podem ter necessidade da detectar s/ou quantificar uma •sequtncia genética específica que esteja presente como uma fracção muito pequena ds todas as sequências presentes no material genético de um organismo ou na população de RNft mensageiro de um grupo de células*
Como resultado das interseções entre os vários componentes s os vários passos deste tipo de ensaio existe quase sempre uma relação inversa entre sensibilidade e espscificidade* Assim* os passos usados para aumentar a sensibilidade do ensaio í. coíbo seja o aumento da actividade especifica da sonda) pode resultar numa percentagem mais elevada de resultados falsos positivos* A ligação entre sensibilidade a especificidade à uma barreira significativa ao melhoramento da sensibilidade dos snsaxos de na.bridaçao* Uma solução para este problema seria *
aumentar sspecificaments a quantidade da sequência alvo presente presente usando um processo de amplificação* A amplificaçlo de uma fracçlo única da sequência alva sem necessitar de amplificação de uma fracção significativa da informação codificada nas restantes sequências da amostra poderá dar um aumento da sensibilidade não comprometendo ao mesmo tempo a especificidade= Por exemplo? uma sequência de ácido nucleico de 25 bases da eompri- "2'5 mento tem uma probabilidade as ocorrência ao acaso de X em 4 ou 1 p, __ de i sm 10·"“ uma vez que cada uma das 2p posições na sequência pode estar ocupada por um de quatro nucleotideos diferentes*
Um método para amplificar sspecificamsnts as sequências de ácido nucleico designado a ersacçlo de cadeias cor» polxmerase» d« «PCR» foi descrito por Mui lis et al = * (Ver patentes U»S» 4,ó835 1955 4?683,:2©2 e 458®θ? 159 e pedidos de patentes europeias 30302298*4* 88302299*2 e 87300203*4 e Hethods__ir; Enzlmoloqy* voluma 155=, 1987 5 ρρ* 335-35Θ)* 0 processo utiliza ciclos repetidos de síntese de ácidos nucleicos dependente de iniciador ocorrendo sm simultânea usando cada cadeia de uma sequência complementar como molde* A sequência que ê amplificada é definida pelas localizações das moléculas de iniciador que iniciam a síntese* Os iniciadores s!o complementares da fracção terminal 3S da sequência sivoou do seu complemento e deve complexa?—se com aqueles sítios de modo a dar-ss o inicio tía síntese de ácido nucleico* Após a síntese do produto de extensão» as cadeias sao separada5s geralmente por desnaturação iérmics? antes do passo da síntese seguinte* fio processo de PCRS sao sintetizadas cópias ds ambas as cadeias de uma sequência complesnentar» 0 passo de separação das cadeias usado em PCR para separar as cadeias sxntsczzstíss de novo no final de cada ciclo da reacçSo de PCR è muitas vezes desnaturação térmica» Como resulta-do oieiQj s necessário usar uma enzima termostávsl ou. deve ser
adicionada nova enzima entre os passos de desnaturação térmica e o início ao ciclo seguinte da síntese de DMA» A necessidade de repetir de modo cíclico a reacção de temperatura entre várias temperaturas diferentes e extremas è uma desvantagem do processo de PCR. Para tornar conveniente o PCRS são necessários dispendiosos instrumentos de ciclos térmicos programáveis * 0 processo de PCR foi acoplado á transcrição de rNA através da incorporação de uma sequência de promotor num dos iniciadores usados na rsacçSo de PCR e tíepois3 após amplificação pelo processo as PCR durante vários ciclos? usando DMA de cadeia dupla corno molde para a transcrição de RNA de cadeia simples. íVers e = g . ? Murskana et ai-, DNA 7í287-295 (1988).
Outros métodos para a amplificação da uma sequência de ácido nucleico específica compreendem uma série de passos de hibridação com iniciador^ prolongamento e desnaturação para proporcionar uma molécula de DNA de cadeia dupla intermediária contendo uma sequência de promotor através da utilização tíe um iniciador. 0 DNA de cadeia dupla á usado para produzir múltiplas cópias de RNA tía sequência alvo. As cópias de RNA resultantes podem ser usadas como sequências alvo para produzir outras cópias e podem ser efectuadas múltiplos ciclos. (ver3 e.g. « Burg et ai . V-1D 39/1050 e Gingaras* st al»s WO 88/1Φ315,,) São bem conhecidos métodos para a síntese química in vitro de quantidades relativamente grandes de uma sequência de DNA específicas é agora co?num a produção de DNA desta forma. No entantOj estes processos são demorados e não podem ser facilmente usados para sintetizar oligormcleotídeos com um comprimento muito superior a cerca de 100 bases. Também deve ser conhecida toda a sequência de bases do DNA a ser sintetizado. Estes métodos requerem um instrumento caro capaz de sintetizar apenas uma
sequência de cada vez. A manipulação deste instrumento requere considerável treino s especialização. Tem sido mais díficil o desenvolvimento de métodos para a síntese química de RMA=
Os ácidos nuclsicos podem ser sintetizados por técnicas que envolvem clonagem ou inserção de sequ@nci.as de ácido nueleieo especificas em material genético de microorgan Asíbqs de forma que a que as sequências inseridas sejam replicadas quando o organismo se replica. Se as sequências forem inseridas a seguir e a jusante de uma sequência de promotor adequada podem ser produzidas cópias de RMA da sequência ou produtos proteicos codificados pela sequência. Se bem que a clonagem permita a produção de virtualmente quantidades ilimitadas de sequências especificas de ácido nucleicog devido ao número de manipulações envolvidas pode não ser adsquadapara usar em testes de diagnóstico,, do ambiente ou forenses. A utilização de técnicas de clonagem requere treino e especialização considerável= A clonagem de uma sequência simples poda significar vários meses de esforças ou mais. rodem ser feitas quantidades relativamente grandes de certos RNfts usando uma molécula de RNfí da cadeia simples recambiei ante tendo uma sequência de reconhecimento para a ligação de uma polimerasa dirigida por RNA? da preferência replicas® G£. (ver. <5.q. Patente U.S. Nã 4?786?6©Θ de Kramer, et a_l·~-)„ São necessários uma série de passos para inserir a sequência específica numa sequência numa cópia de DNA da molécula variante,, cloná-la num vsetor de skpressão? transcrevê-la em RMA s depois replicá-la com replicas® QB =
Sumária do Invento 0 presente invento ê dirigido a novos métodos de sínteiss de cópias múltiplas de uma sequfncia d-s ácida nucleica alvo que são autocataliticos Ci.e.» capacss de se repetirem de modo cíclico s automáticamente sem necessidade de modificar as condições de reacçlo tais como temperatura. ρΗ ou força iéniea s usando o produto de um ciclo no ciclo seguinte). 0 presente método inclui Ca) tratamento de uma sequência de RNA alvo com um primeiro oligonucleotídeo que compreende um primeiro iniciador que tem uma sequ§ncia de complexacSc suficientemente complementar da fracçâo terminal 3? do alvo para se cosiplexar com ele e que facultativarosnte fceai uma sequãncia 55 relativamente à sequtncia de iniciação que inclui um promotor de uma RMA-polimsrase em condições que peruiitam a formação de um complexo olioonucieoiídeo/sequãncia alvo e seja iniciada a s síntese de DNh3 <b) prolongamento do primeiro iniciador numa reacção ds extensão usando o alvo como molde para dar um primeiro produto de extensão do DNfi iniciador complementar do RMh alvci5 Cc> separação do produto ds extensão de DNA do RMA alvo usando uma enzima que salectivaments degrada o RNA alvos (d) tratamento do produto de extensão do DNA iniciador com um segundo oiigonu™ claotidea que compreende um iniciador ou u® molde de «splicinq" s que tem uma sequ§*ncia de cotnplexaçSo suficientemente complementar da frscçKo terminal 35 do produto de extensão do iniciador ds DNA para se coraplexar com sis em condições que permite® a formação de um complexo oligonucIsotídeo/sequãncia de DNA alvo e a síntese cie DNA seja iniciada, desde que se α primeiro oligonucleatideo não tiver um promotor? então o segundo olígonucleotídeo é um molde de «spiicmg» que tem uma sequência 55 relativamente à sequ@ncia de complsxaçlo que inclui um promotor de uma RNA-polimerases Ce) prolongamsnto do extremo 3? do segundo cligonucleotídso ou do *
primeiro produto de extensão do iniciador, ou de ambos, numa reacçao de extensão de DNA para produzir um molde da RNA-polims-rases e Cf) utilização da molde para produEir múltiplas cópias de RNA da sequincis alvo usando uma RNA-paiimerase que reconhece a sequência da promotor,, hs cópias tis oiiganucleatideo s tis RNA podem ser usadas para sintetizar autocata!íiicamente múltiplas cópias da sequência alvo*
Num aspecto do presente invento, o método geral inclui ia) tratamento de uma sequência ds RNA alva com um primeiro oligonuclsotideo que compreende um primeiro iniciador que tem uma sequência de compiexaçlo suficientemente complementar da fracçlo terminal 35 do slva para se comalexar com ela s que tem uma sequência 53 relativamente è sequência ds compleKaçSo que inclui um promotor para uma RNA-palimerase em condições que permitem a formação do complexo oligonuc1eotídeo/alvo s o inicio da sintese de DNA, Cb) prolongamento tio primeiro iniciador numa rescção ds extensão usando o alva como molde para dar um DNA produto de extensão da primeira iniciador complementar do RNA alvo, ic) separação do DNA produto de extensão do primeiro iniciador do RNA alva usando uma encima que degrada selsctivameríte α RNA alvo;; (d) tratamento do DNA produto de extensão de iniciador com um segunda o1igonucleotideo que compreende um segundo iniciador que tem uma sequência ds complexaçlo sufieientsflssnte complementar da fracçlo terminal 35 do DNA produto ds extensão de iniciador para ss complsxar com ela em condições que permitem a formação ds um complexo ds oligonunlsotidsD/alvD e que seja iniciada a sintese ds Um-si ís> prolongamento do extremo 3? do segundo iniciador numa reacçSo de extensão ds DNA para dar um DNA produto de extensão da iniciador, produzindo assim um molde para a RNA—polimerase5 e Cf) utilização do molde para produzir múltiplas cópias de RNA da ssquênca alvo usando uma RNA—polimerase que reconhece a sequência do promotor,, 0 ol igonuc leotideo e as cópias ds rNA podem ser usadas para sintetizar autocatalíiicamente múltiplas cópias cia ssqufncia alvo= Este aspecto ainda incluis Cg) tratamento de uma cópia de RNA do passo Cf) com um segundo iniciador em condições que permitam a formação de um complexo Dligcnuclsatidsa/saqufncia alvo s o início da síntese de DNA?; íh> prolongamento do extremo 3S do segunda iniciador numa reacção de extensão tíe DMA para dar um DNA produto de extensão dc3 segundo iniciador usando a cópia de RNA como moltísq í i) separação do segundo DMA produto de extensão da iniciadora do RNA cópia usando uma enzima que degrada sslscti-vsmsnts a cópia de RNAs {j) tratamento do DNA produto de extensão do segundo iniciadora com α primeiro iniciador em condições tais que se possa formar um complexo oligonucleotídeo/sequfncia alvo s seja iniciada a síntese tíe DNfts Ck> prolongamento do extremo 3* tío produto de extensão do segundo iniciador numa rsacçlo da extensão de DNA para produzir um molde para uma RNA-polimerase5 e Cl) utilização do molde do passo (k) para produzir múltiplas cópias da sequfncia alvo usando uma RNA-poli-sisrass que reconhece o promotor,. Usando as cópias da RNA do passo C1)» os passos <g> a ík) podem ser repetidos autocataliticamsnte para sintetizar múltiplas cópias da sequfncia alvo. 0 primeiro iniciador que na passo Ck) actua como um molde «aplica» poda também ser prolongado na reacçao de extensão de DNA do passo ík>»
Um outro aspecto tío método geral do presente invento proporciona um método que se caracteriza por Ca) tratamento de uma sequfncia de RNA alvo com um primeiro oligonucleotideo o qual compreende um primeiro iniciador que tem uma ssqufncia ds complοχ ação suΐzcisntsment® complementar da fracçSo terminal 3? da sequfncia alvo para complexar com ela em condições tais que se possa formar ucn complexo oligonucleotídeo/sequfncia alvo s seja aru.c2.ada a síntese da DNfis (b) prolongamento do extrema ~S? da primeiro iniciador numa reacçao de extensão usando o alvo como molda para dar um DNA produto do prolongamento do iniciador
coiTiplementar do RNA alvos >c5 separação do DMA produto de extensão do iniciador .do alvo RNA usando uma enzima que selectivamente degrada o RNA a!vo| Cd) tratamento da DNA produto da extensão do iniciador com um segundo oligonueJsotideo que compreende um iniciador ou um molde «solices a que tem uma sequência da coraple-xaçlo suficisntemente complementar da frscção terminal 35 da sequência alvo para se complexar com ala s uma sequência 55 relativamente á sequência de complexaçlo que inclui um promotor para uma RNA-ραΙiroerase? e<n condições tais que se possa formar urn complexo oligonucleotideo/sequênc ia alvo e seja iniciada a síntese de DNA= Ce) prolongamento do extreme? 35 tío produto de extensão de iniciadores para lhe adicionar uma sequência complementar do promotor5 produzindo assim um mc?lds para uma RNA-poli-me rasei? <f> utilização do molde do passo Ce) para produzir múltiplas cópias de RNA da sequência alvo usando uma RNA-polime-rase que reconhece a sequência do promotor; e (q) utilização das cópias de RNA da passo (f)s repetição autocatalítica dos passos ía) a (f) para amplificar a sequência alvo» Facultativamente9 o molde «splice» do passe? Cd) pode também funcionar como um iniciador e nd passo (e) ser prolongado para dar um produto de extensão tío segundo iniciador usando como molde o produto de extensão do primeiro iniciador»
Em adição,, num outro aspecto do presente invento5 sempre que a sequência que se pretende amplificar está presente como DMA? a utilização de um Processo Preliminar adequado dà origem a cópias de RNA que podem então ser amplificados de acordo com o Nétodo Beral do presente invento»
Assim» num outro aspecto,, o presente invento é dirigido a Processos Preliminares para usar conjuntamente com o método de ampliTicação do presente mvsnto que não só pode aumentar o número de cópias presentes para serem amplificadas,, mas também
pode proporcionar cépias de KNfi de uma ssquSncia de DNA para amplificação* 0 presente invento é dirigido a métodos para aumentar o número de cópias da uma sequência de ácida nucieica alva especifica numa amostra. Num aspecto, o presente invento envolve s acçSo cooperativa de uma DNA-polimerase (como seja uma trans·-criptas® reversa) © uma RNA-polimerase DNft-dependente Ctrens-criptas®) com um passo de separação ertzlmática do híbrido para produzir produtos que podem eles próprios ser usados para produzir produto adicional, resultando assim numa reacção autocatalí-tica sem requerer a manipulação de condições ds reacção tais como repetição de ciclos térmicos. Nalgumas realizações dos métodos do presente invento que incluem um Processo Preliminar, todos os passos sao efectuados à mesma temperatura exceptuanda o(s) passoCs) do processo preliminar.
Os mátodos do presente inventa podem ser usadas como um componente de ensaios para detestar e/ou quantificar sequências as ácido nucieica alvo especificas em amostras clínicas, ambientais, forenses s amostras similares ou para produzir grandes números de cópias de DNA e/ou RNA da sequência alvo especifica para uma variedade de usos. Estes métodos podem também ser usados para produzir múltiplas cépias ds DNA de uma sequência de DMA alvo para a clonagem ou para gerar sondas ou para produzir cópias ds RMA e DNA para sequenciaçSEo.
Num exemplo de um ensaio típico, uma amostra a ser amplifiçada é misturada com um concentrado ds tampão contendo o tampiso, sais5 magnésio, trifosfatos de nucisotídsos, iniciadores s/ou moldes «solice». ditiotreitol e espermidina» A reacção ê então facultativamenis incubada perto de 1®Θ°0 durante dois minutos para desnaturar qualquer estrutura secundária. Após
arrefscimento até è. temperatura ambiente, se o alvo fSr um alvo ds DMA sem um estremo 39 definida, adiciona-se transcriptase reversa s a mistura ds reacçSo ê incubada durante 12 minutos a 42WC« A rsacção é novamente desnaturadaperto ds i®®wC, desta vez para separar o protíuta de extensão do iniciador do DMA molde. Após arrefecimento, adicionou-se transcriptase reversa, RNft-poli-nserase e RNase H e a reacção foi incubada durante duas a quatro horas a 37WC= A reacçlo pode então ser testada por desnaturação do produto, adição de uma solução ds sonda, incubação 2@ minutos a 6©WC, adição de uma solução para hidrolizar sslectivaments a sonda não hibridada, incubação da rsacçao ò minutos a ò0uC s medição da restante quimioluminiscencia num luminómetro. (Ver, s.g., Arnold, et ajU 5PCT US8S/02746 (entregue a 21 de Setembro ds 1988, publicado em 29 de Março de 1989) a divulgação da qual é aqui incluída com referência e é referida como Os produtos dos métodos do presente invento podem ser usados em muitos outros sistemas de ensaio conhecidos dos familiarizados com a matéria.
Se o alvo possuir um extremo 35 definido ou o alvo for RNA, um ensaio típico inclui mistura do alvo com o concentrado de tampão referido atrás e desnaturação de qualquer estrutura secundária. Após arrefecimento, adiciona-se transcriptase reversa, RMA-polimerase e RMAse H e a mistura é incubada durante duas a quatro noras a 3/~C» A rsacção pode então ser ensaiada como descrito atrás. lis métodos do presente invento e os materiais nele usados podem ser incluídos em «kits» de diagnóstico para usar em processos de diagnóstico.
5MÍ0Í£Í1S
Conforme aqui são usados? os termos que se seguem tesm os significados seguintes a menos que de €>utro modo seja expresso ,, 1» Molde
Um «molde» é uma molécula ds ácido nocisico que está a ser copiada por uma polimerase de ácido nucleico» Um molde pode ser as cadeia simples? cadeia dupla ou parcialmente de cadeia dupla,, dependendo da polimerase,, A cépia sinietisada ê complementar do molde ou pelo menos uma cadeia ds um molde de cadeia dupla ou pareiaimante ds cadeia dupla. Q RNA e o DNA são sempre sintetizados na direcçSo 3S para 35 e as duas cadeias tie um duplex de ácido nucleico slo sempre alinhadas de modo a que os extremos 5iS aas duas cadeias estio em extremos opostos do duplex ís obvismen-te g mesmo acontece aos extremos 35> =
2. IjliiiásSSLL-s__QEl.íllL.-íi3liijdig.?L
Um «iniciador» é um oligonucleotideo que έ complementar de um molde que se complexa (por 1igações de hidrogénio ou hibridaçSo) com o molde para dar um complexa iniciador/molde para a iniciação da síntese por uma BNfi-polimerase e que é prolongado pela adição de bases ligadas covalentemente no seu extremo 3% as quais são complementares do molde no processo de sintsss do DNA„ 0 resultada é um produto de extensão do iniciador» virtualmenie,; todas as DNA-polimerases conhecidas (incluindo transcriptases reversas) necessitam da complexação de um oligonucleotideo com um molde da cadeia simples C«iniciação») para iniciar a síntese de DMA5 enquanto que a replicsçSo do RNA e a transcrição (cépia de DMA para RNA) geralmente não necessita de um iniciador. Em
circunstâncias adequadas um iniciador pode igualmente actuar como molus «splice» «ver a definição de «molde splice» que se segue).
Um «molde splice» é um oligonoelsotideo que ss completa com tm ácido nucleico de cadeia simples e é usado como molde para prolongar o extremo 35 de um ácido nucleico alto para adicionar uma sequência especifica, 0 molde «splice» é suficisntemente complementar do extremo 39 da molécula de ácido nucleico alvo,, a qual se pretende prolongar, para se complexar com ela. Uma DNA-ραΙiroerasa DNA- ou RNA-dependente ê então usada para prolongar a molécula de ácido nucleico alvo usando como molde a sequfn-cia 35 relativamente á região complementar do molde «splice», 0 produto de extensão da molécula prolongada tem a sequência especifica no seu extremo 39 que ê complementar da sequência no extrema 5? da molde «splice»,
Ss a extrema 39 da molde «splice» nSo estiver bloqueado e for complementar da ácido nucleico alvo, ele pode actuar também como um iniciador e ser prolongado pela DNA-polimsrase usando como molda a molécula de ácido nucleico alvo, 0 extremo 3S do molde «splice» pode ser bloqueado de vários modos, incluindo ter um didesoxinu.cleots.deo 33 —terminal ou uma sequência 35—terminal complementar do alvo, ou por outras formas conhecidas dos familiarizados com a matéria.
Tanto um iniciador como um molde «splice» podem comple— xar-se com um ácido nucleico os cadeia simples e servirem na função de iniciação com uma DMA-ραlioserase. 3. Acido Nucleico Alvo, Sequência Alvo
Um «ãcido nucleico alvo» tem uma «sequência alvo» a ser aíspiiticsda s pode ser de cadeia simples du de cadeia dupla 0
pode Incluir outras sequências além da sequência alvaque podem não ser ampllfiçadas, 0 termo «sequência alvo» refere-se à sequência de nucleotidsos particular do ácido nuclsico alvo que se pretende amplificar. A «sequência alvo» Inclui as sequências de compleKa-çlo com as quais os oligonucleotideos <iniciadores e/ou molde «splice») se coapleram durante o processo do presente invento. Sempre que o ácido nucleico alvo é originalmsnte de cadeia simples* o termo «sequência alvo» refere—se também & sequência complementar da «sequência alvo» conforme presente na sequência de ácido nucleico alvo. Sempre que o «ácido nucleico alvo» é originalmente de cadeia dupla o termo «sequência alvo» refere-se ès cadeias (·*·> e C —>« 4. Prosiotor/Seauência de Promotor uma «sequência cie promotor» é uma sequência de ácido nuclsico especifica que é reconhecida par uma RMA-polimarass DNA-dapandenie («transcriptase«) como um sinal para se ligar ao ácido nuclsico e começar a fcranscrlpçSo de RNA num sitio especifico. Para a ligação*·tais transeriptases geralmente requerem DMA que á de cadeia d.upla na fracçlo que inclui a sequência de promotor e o seu complementos a fracçlo do molde (sequência a ser transcrita) nSa necessita de ser ds cadeia dupla. RNA—paiimerases DNA-dependentes individuais reconhecem uma variedade de sequências de promotores diferentes que podem variar marcaosmente na sua eficácia para promover a transcrição. Quando uma RMA-polims-rase se liga a uma sequência de promotor para iniciar a transcrição, a sequência do promotor nlo fas parte da sequência a ser transcrita. Assim* os RMÂs produtos da transcrição nlo incluem aaquals sequência. 5» dMA—dgI inisrass DNA-depenriente
Uma «DMA~polimerase DWA-dependenie» é uma enzima que sintetiza uma cópia ds DMA complementar a partir da u.m ma Ide da DMA» Sao exemplos DNA-polimerase 1 da E»_ coli e DNA~poIimerase da bacteriofago T7. Todas as DNA-palimerases DNA-dependentes conhecidas necessitam de um iniciador complamentar para iniciar a síntese» Sabe-se que em condições adquadas uma DMA—ραΙimerase DN A-dependente pode sintetizar uma cópia de DMA complementar a partir de RMA maIde. 6. BMHrLsglimamsauMMr^^
Uma «DMA—polimerase RMA—dependente» ou «transcriptsss» á uma enzima que sintetiza múltiplas cópias de RMA a partir de uma molécula de DMA de cadeia dupla ou parcialmente de cadeia dupla tendo uma sequfncia de promotor Cgeralmente de cadeia dupla). As moléculas de RMA < «produtos de transeriçla») sSa sintetizadas na tíirecçSo 53 -> 33 começando numa posição específica imediatamente a jusante do promotor. São exemplos de trans-criptasss a RMA-polimerase DNA-dependente de E». coli e dos bacteriofagos T7S T3 e SP6» 7. DNA-polimerase RMA-dependente (Transcriptase Esvsrssi..
Uma «DMA—polimerase RMA—dependente» ou «transcriptsss reversa» è uma enzima que sintetiza uma cópia de DMA complementar de um RMA molde» Todas as transcriptases reversas conhecidas também t‘a‘m a capacidade de fazer uma cópia de DMA como 1 ementar de um uMA moldes assim? elas sao DMA—polimerases ao mesmo tempo RMA— e DMA—dependentes. é. necessária um iniciador para iniciar a síntese com ambos os moldes de RMA e de DMA»
B. KNAsa Η
Uma «RNAse H» é uma enzima que degrada a racçSo de rNA de um duplex RNA-DNA= As RNAse Hs podem ser endonuelesses ou SKonucleases» A maior parte das enzimas transcriptase reversa normalmente contlm uma actividade de RNAse H além da sua aciivi--· ciada d® poIimsrasa= Mo entanto* existem disponíveis outras fontes de RNAse H sem uma actividade de polimsrass associada» A degrada-ção pode resultar na separação do RNA de um duplex RNftsDNA» Como alternativa3 a RNAse H pode simplesmente cortar o RNA em vários pontos de tal forma que frscçSes de RNA fundem separando-se ou permitem a intervenção de enzimas para desenrolar fracç:ões do RNA. ?. Cadeia(s) Nais/menos
As discussões envolvendo síntese tís ácidos nuclsicos são grandemente simplificadas e clarificadas adoptando termos para designar as duas cadeias complementares ds u® duplex de ácido nuclaico» Tradicionalmentes a cadeia codificadora das ssqu@ncias usadas para produzir proteínas ou RNAs estruturais foi designada cadeia «mais» e o seu complemento cadeia «menos»* ± agora conhecido que em muitos casos5 ambas as cadeias slo funcionais e a designação ds uma como «mais» e tíe outra como «menos» deve ser então arbitrária* No entaniop os termos slo muito úteis para a designação da orientação da secjufncia dos âcitíos nuclsicos © será empregue daqui em diante com essa finalidade* ί&Hibrldar, Hibrldaçao
Os termos «hibridar» e «hibridaçao» referem—se á formação de complexos entre sequências de nucleotí.deos que são suficientement complementares para formar complexos via smpars-lhamsnta de bases de Watsan-Crick, Sempra que um iniciador Cou molde «spliee») «hibride» com alvo (molde)5 tais complexos (ou híbridas) sSa suficisntemente estáveis para servir na função de iniciação necessária á DMA—poiimerase para iniciar a sintsse de i1 - SequSncias iniciadoras estio
As sequSncias dos iniciadores aqui referidas descritas aÍ3aÍKo =
Iniciadores de HBV regilo 2 í + > s 5?CACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGG3 5 <->§ 5?AATTTAATACBACTCACTATABBGABACCCGABATTBAB ATCTTCTGCBAC3?
Sonda í +) s 5118STCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTC635
Iniciadores de HlV regilo i (·*) ! 55 AATTTAATACBACTCACTATABBGABACAAGBGACTTTCC GCTSBGGACTTTCC35 <-> ê 5 3BTCThhCCABABABhCCCABThChBBC'35 Sequfncia sondas 55 SCABCTGCTT AT AT BCABSATCTGA66G35 Iniciadores de HIV região 2 ( + )e 55 AATTT AAT ACBACTCACT AT AGBBAOACAAATBGCA GTATTCATCCACA33 (- 5 s 55 CCCTTCACCTTTC-CAGAB35 Sequfncis sondas í“)5 55CTACTATTCTTTCCCCT6CACTBTACCCC3?
Iniciadores de HIV regilo 3 < ’·) s 53 CTCBACBCABBACTCBBCTTBCTB3?
< ™> s 5 5 AATTTAATACBACTCACTATAGBGABACTCCCCCGCTT AATACTBACBCT3?
Sendas <+i3 5*GACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGG35
Iniciadores de HIV regilo 4
< + >5 5AATTT AAT ACBACTCACT AT ABBSASABACCATCAATBABBAA 6CTGCA0hATB3 5 <-)s 55 CCATCCTATTTSTTCCTGAAB8GTAC33
Sondas C -) s 5 *CTTCCCCTTSGTTCTCTCATCT8SCC33
Iniciadores de HIV região 5 <•*•>8 53S8CAAATBSTACATCAS8CCATATCACCTAS33
C-)s 53AATTTAATACGACTCACTATAG8GAGABBB6TBGCTCCTT CT8ATAAT6CT833 Sondas 53 6AASBGTTTCAGCCCABAABTAATACCCAT635 crosnos--
Iniciadores do principal ponto de quebra de translocaçao sómica BCL---2 tíi4[ii8} <-)s 53ΘΑΑΤΎΑΑΪηΟΘΑΒΤΒΑΟΤΑΤΑ68ΘΑΒΑΒΟΤΘΑ88ηΒηΟΒΒΤ8ΑΟΒ33 í t)s 53 TAT8BT88TTT8ACCTTTAG33
Sendas s 55 S8CTTTCTCATBBCTBTCCTTCA835 55 BSTCTTCCT8AAATBCABTBBTC833
Iniciadores de translocação cron^ossoínica CrIL t(9ii22) C-)í 5 30ΑΑΤΤΑΑΤΑΟΒηΟΤΟΑΟΤηΤΑΒΒΒΑΒΑΟΤΟΑ8ηΟ CCTBABGCTCAAABTC35 (+)s 55 GBASCTBCABATBCTBACCAAC35
Sondas 53 8CAGASTTCAAAABCCCTTCABCB633
12. Especificidade
Caracteristica de uma sequência de ácida nucleico que descreve a sua capacidade para distinguir entre sequências alva e nSo alvo dependente da sequência e das condições de ensaio, ireve^escrjcSo dos desenhos FIBs. IA a 1® descreve as Métodos Bersis do presente FIBs. 2A a zh. descreve a realização do presente invento referida ao Processo Preliminar 1= FIB= 3 descreve a realização do presente invento referida ao Processo Preliminar 11= FIBs= 4h a 4D descreve o método de amplificação mel Ho— F!B= 5 mostra os resultsdos das experiências que testam a nzpòtsss d-s a RMAse H do AMv s do MriLV s da Em cal i possuírem sítios de clivagem específicos de RNh. FíB. 6 mostra as resultados da incorporação de inicia— ~Γ-*7 dores marcados com '~’“p durante a amplificação.
Descrição...Detalhadadg invento
De acordo com o presente invento3 slo proporcionados novos métodos e composições para a amplificação de sequências de ácido nucíeico alvo especificas para usar em ensaios com a finalidade de deteetar s/ou quantificar sequências de ácido nucíeico alvo especificas ou para a produção de grandes números de cópias de DNA e/ou RNA de sequências alvo especificas para uma variedade de utilizações. I * Método Geral
Num aspecto preferido? o presente invento proporciona um método ds amplificação autocatalitico que sintetiza grandes números de cópias de RNA e de DMA de uma sequência ds RNA alvo. O ácido nucíeico alvo contem a sequência alvo a ser amplifiçada. A sequência alvo é a região do ácido nucíeico alvo que é definida em ambos os entremos por iniciadores3 moldes«splices s/ou os extremos naturais do ácido nucíeico alvo e inclui ambas as cadeias <-*-> e (-)»
Num aspecto5 este método compreende tratamento de um ácido nucíeico alvo compreendendo uma sequência de RNA alvo com um primeiro oligonucleotideo o qual compreende um primeiro iniciador que tem uma sequência de complexação suficientemente complementar da fracção terminal 3? da sequência alvo para complexar com ela e que facultativamente tem uma sequência 55 relativamente á sequência de compleKaçSo a qual inclui um promotor de uma HNA—palimsrass5 em condições tais que ss possa formar um compleKD oligonuc:leotídso/sequência alvo e seja iniciada a sintsss ds DNA. 0 primeiro iniciador oligonucleotidico pode tampem ter outras sequências o5 relativamente á sequência ds inicisçSo. 0 extrema 3? do primeiro iniciador é prolongado por
uma DNA-pal i<nerase adequada numa rsacção tis sx tensão usando o RNA como molde para dar um primeiro DMA produto de extensão do iniciador que é complementar do RNA molden 0 primsi.ro produto tis eKtensSo do iniciador é separado ípeio menos parcialmente) do RNA molds usando uma encima que degrada selectivaments o RNA molda» BSo encimas adequadas aquelas que aciuam selectivamente na cadeia ds RMfi de um completo RNfi-BNA a incluem encimas que compreendem uma RNfise H» Se bem que algumas transcriptasss reversas incluam uma actividads ds RNfise H„ pode ser preferível adicionar RMAss H exógena» como seja uma BNAse H de E» coli» 0 produto de cadeia simples de eKtensSo do primeiro iniciador ê tratado com um segundo oligonucleotideo que compreende um segundo iniciador ou um molde de «splice« que tem uma sequência de complexaçao suficientemente complementar da fracçSo terminal 35 da sequência alvo contida no produto de eKtensSo do primeiro iniciador para se eomplexar com ele» em condições que permitam a formação de um complexo oligonucleotideo sequência alvo e possa ser iniciada a síntese de DMA» Se o primeiro iniciador nlo possuir um promotor entSo o segundo oligonucleotideo é um fRolde «splice« que tem uma sequência 55 relativaments á ssquincia ds oamplsxsçSo que inclui um promotor para uma RWA-polimerass» Facu11ativamente9 o molde «splics» pode ser bloqueado no seu extremo 3S. 0 extremo 3? do segundo oligonucleotideo e/ou o produto de extensão do iniciador é prolongado numa rsacção tis extensão do uNtt para producir um molde para uma RMfi— polímeras©= As cópias de RNA ou produtos de transcrição producidos podem multiplicar-se autocataliticamente sem posterior manipulação»
Sempre que um oligonucleotideo funcione como um molde «splice»? a sua função de iniciador não é necessária» Assim» o extremo 35 tío molde «solice» pode estar bloqueado ou não» Os componentes da mistura ds rsacção resultante (1»s» » um RNA alvo aua permite a pradução de um produto da extensão de um primeira iniciador com um estrema 35 definido. um primeira iniciador e um molde «splice» bloqueado ou nSo) funcionam na sintsss auiocataiá— tica de grandes quantidades de RNA e DMA»
Num aspecto do presente invento. o primeiro e segundo oligémeros são ambas iniciadores» 0 primeira iniciador tem uma sequência 55 relativamente à sequência de complexação que inclui um promotor para uma RNA-polimerase e pode incluir outras sequências. 0 segundo iniciador pode também incluir uma sequência 53 rslativamsnte à sequência de cDfflplexaçSo que pode incluir um promotor de uma RNA-polimerase e f acultaiivamente outras sequências» Sempre que ambos os iniciadores tenham uma sequência de promotor^ prefere-se que ambas as sequências sejam reconhecidas pela mesma RNA-polimerase excspto se se pretender introduzir um segundo- promotor com outras final idades ? tais como clonagem. 0 extremo 35 do segundo iniciador é prolongado por uma DNA-polimerase adequada numa rsacçlo da extensão para produzir um DSmA produto de extensão de um segundo iniciador complementar do produto de extensão do primeiro iniciador. Note—ss qus como o primeiro iniciador definiu um extremo da sequência alvo? o segundo iniciador define agora o outro extremo. 0 produto de cadeia dupla da segunda reacção de extensão è um molde adequado â produção de RNA por uma RNA—polimerase. Se o segundo iniciador também tiver uma sequência de promotor5 produtos de transcrição complementares ds ambas as cadeias do molde de cadeia dupla serão produzidos durante a reacção autocatalática. Os RNfts produtos ds transcrição podem agora ter estremes diferentes dos do ácido nuclsieo alvo3 mas a segunda sequência entre o primeiro iniciador s o segundo iniciador permanece intacta. 0 RNA produto da transcrição assim produzido pode reciclar automáticamente no sistema atrás sem outra manipulação. Assim, esta reacção é auto-catalítica =
Se a sequtncia de complexação do segunda iniciador se CQSDisMar cora o extremo 35 qq produto de extensão da primeiro Iniciador* o segundo iniciador poda actuar como um molde «spiice» s o produto ds sxtensâa do primeiro iniciador pode ser prolongada para adicionar qualquer sequtncia da segunda iniciador* 5S relativaroente á sequtncia de iniciação* ao produto ds extensão do primeira iniciador» (Ver5 e»g = Figuras 1E e IS)» Se a segunda iniciador actuar coma molde «splice» e incluir uma sequtncia de promotor 5“ relativamente à sequtncia ds complexação* a extensão da produto ds extensão da primeira iniciador para adicionar a sequtncia de promotor produz um molde adicional para uma RWA-po— limsrass que pode ser transcrito para produzir cópias de ENft ds ambas as cadeias» (Ver Figuras 1Ξ e 1S>„ A inclusão de promotores em ambos os iniciadores pode aumentar α número de cópias da sequtncia alvo sintetizada»
Um outro aspecto do método geral do presente invento inclui utilização de um primeiro oligonuc1eotideo que compreende um iniciador e um segundo oligonucleotideo que compreende um molde «splice» e que pode ou não ser capaz de actuar como um iniciador per se (por não ser ele próprio prolongado numa reacção de extensão de iniciador)« Este aspecto do método geral compreenda tratamento de um ácido nuclaico slvc? compreendendo uma sequência alvo de RNA com um primeiro oligonucleotidso d qual compreende um primeiro iniciador que tem uma sequtncia ds complexação suficientemente complementar da fracção terminal 35 da sequtncia alvo para complaxar com ela em condições tais que se possa formar ura complexo oligonucleotídeo/sequtrscia alvo e seja iniciada a sintese de DMA» 0 primeiro iniciador oligonucleotídico pode também ter outras ssqutncias 53 relativamente è sequtncia de complexação* incluindo o promotor» 0 extrema 35 do primeiro iniciador ê prolongado por uma DNA-polimerase adequada numa raacçao de extensão usando α KMA como molde para dar ura DMA
produto de extensão do primeiro iniciador que é complementar do RNA molde* 0 primeiro produto de extensão do iniciador ê separado do RMfi molda usando uma enzima que degrada selectivaroente o RNA molde» SSc encimas adequadas aquelas que autuam selectivaroente na cadeia de RWh de um complexo RNA-DNA a incluem enzimas que compreendem uma RNAse H. Se bem que algumas transeriptases reversas incluam uma actividade de RNAse H = pode ser preferível adicionar RNAse H exógena3 como seja uma RNAse H de E. coli. 0 produto da cadsia simples da extensão do primeiro iniciador é tratado com um molde de «splice« que tem uma sequência de comple-· xação suficientemente complementar do extremo 3S tío produto de extensão do primeiro iniciador para se complexar cosi ele suma sequência 55relativamente à sequência de complexagloque inclua um promotor para uma RNA-ροΙ irnerass em condições que permitam a formação de um complexo oligonucleotídeo/sequência alvo e possa ser iniciada a síntese de DMA» 0 extremo 3* do molde «splies» pode estar bloqueado (como seja pela adição de um didesoxinucleo-tideo) ou não ser complementar do ácido nucleico alvo Cde forma que não funciona como iniciador) ou altsrnativamente não bloqueado» 0 extremo 3;i do produto de extensão do primeiro iniciador ê prolongado usando uma DNA-polimerase adequada numa rsaeção de extensão de DNA para adicionar ao extremo 35 do produto ds extensão do primeiro iniciador uma sequência complementar da sequência do molde «spiice» 5S relativamsnte à sequência ds complsxação que inclui o promotor* Se o extremo 35 não estiver b.loqueadOj d molde «splies pode ser prolongado para dar um produto de extensão do segundo iniciador complementar do produto cie extensão do primeiro iniciador» 0 produto da reacção de extensão com o molde «splice» (bloqueado ou não) poda funcionar como molde para a síntese de RNA usando uma RNA-ραΙimerass que reconhece o promotor» Como se observou atrás3 o RNA produto ds transcrição assim produzido pode reciclar autoroâticsmente no sistema descrito sem qualquer outra manipulação. Assim a reecçãa é autocatalitlca.
Nalgumas realizaçõss,, a sequência alvo a ser amplificada é definida em ambos os extremos pela localização da sequências especificas c doí pi ementares dos iniciadores Cou moldes «splice» > empregues. Noutras realizações. a sequência alvo ê definida numa localização de uma sequência específica? complementar os uma molécula de iniciador empregue e no extremo oposto, pela localização de uma sequência especifica que é cortada por uma endonu-clease de restrição especifica ou por outros meios adequados? que podem incluir um extremo 3fi natural. Noutras realizações, a sequência alvo é definida em ambos os extremos psla localização de sequências especificas que sSo cortadas por uma ou mais sndonuclBâses de restrição específicas.
Numa realização preferida do presente invento,, determina-se a sequência as RNA alvo e analisa-se então para se determinar se a degradação com RNAse H provoca cortes ou remoção da secções ds RMA do duplex. As análises podem ser conduzidas para determinar o efeito da degradação com RNAse da sequência alvo pela RNAse H presente na transcriptass reversa de AMV e na transcripiass de nMLV. pela RNAse H de £. coli ou de outras fontes s pelas suas combinações.
Ao seieceionar-se uma série de iniciadores,, á preferido que ura dos iniciadores seja seleccionarfo ds modo a que híbrida com uma secção tíe RNa que não é suhstancialmante degradada pela RNAse H presente na mistura ds reacção. Se existir uma degradação suosoaneia J.. os cortes na cadeia ds RMA na rsgiSo do iniciador pode inibir a iniciação da síntese de DMA e evitar a extensão do iniciador. Assims prsfsrs-se ssleccianar um iniciador que hibride com uma sequencia qd RNA alvo., localizada ds forma qus quando o
RNA é exposto a RNAse H3 não existe degradação substancial que possa evitar a formação do produto de extensão do iniciador» 0 sitio para a hibridação do promotor-iniciador é escolhido de modo a que se tí'§ suficiente degradação da cadeia de RNA para permitir a remoção da fracção da cadeia de RNA hibrida-da com a fracção da cadeia de DNA cem a qual hibridará c promotor-iniciador» Tipic:aments5 são removidas apenas fracçSes de RNA do duplex RNAsDNA através de degradação com RNAse H e uma parte substancial da cadeia de RNA permanece na duplex»
Na Figura 4 está ilustrada a formação do produto de cadeia dupla contendo promotor para a síntese de RNA» Conforme está apresentado na Figura 4, a cadeia de RNA alvo hibrida com um iniciador que é seleccionado para nihritíar com uma região da cadeia de RNA que não é substsncialmsnte degradada pela RNAse H presente na mistura de reacção» 0 iniciador é então prolongado para formar uma cadeia de DMA complementar da cadeia de RNA„ A partir daqui3 a cadeia de RNA é cortada ou degradada em várias pontos pela RNAse H presente na mistura de reacção» Deve-se entender que este corte ou degradação pode ocorrer nesta fase ou noutra altura no decurso da reacção» Em seguida os fragmentos de RNA dissociam—se da cadeia de DNA nas regISes em que se dá cortes ou degradação significativa» 0 promotor-iniciador hibrida então com a cadeia de DNA no seu extremo 35 onde a cadeia de RNA foi substancialmsnte degradada e separada da cadeia de DNA» Em seguida a cadeia de DNA é prolongada para formar uma sequência de DNA promotor da cadeia dupla» formando assim um molde para a síntese de RNA» Pode-se observar que este molde contem uma sequência de DNA promotor de cadeia dupla» Quando este molde é tratado cora RNfi-poiimerase formam—se múltiplas cadeias de RNA» \
Ss bem que seja desconhecida a natureza exacta da degradação do RNA resultante da RNAse Hs foi demonstrado que o resultado da degradação com RNAse H na cadeia de RIMA de um híbrido de RNftsDNA resultou na dissociação de pequenos pedaços de RNA do híbrido* Foi também demonstrado que podem ser selecciona-dos promotores-iniciadores que se liguem ao DMA após degradação com RNAse H na área onde são removidos os pequenos fragmentos*
As Figuras 1 e 2* tal como estão desenhadas,, não mostram o RNA que pode permanecer após a degradação com RNAse H* Deve-se entender que apesar destas geralmente mostrarem a remoção completa do RNA do duplex RNAsDMAs nas condições preferidas dá-se apenas remoção parcial conforme ilustrada na Figura 3« Por refsr§neia â Figura 1AS pode-se observar que que α mecanismo proposto pode não ocorrer se uma íracçSo substancial da cadeia de RNA da Figura 1 permanecer não degradada evitando assim a hibri-daçao do segundo iniciador ou a extensão do segundo iniciador hibridado para produzir uma cadeia de DNA complementar da sequin-cia do promotor* Mo entanto,, com base nos principias de síntese descobertos e divulgados neste pedido5 podem ser feitas modificações de rotina pelos fami1iarizados com a matéria de acordo com os ensinamentos deste invento para proporcionar um processa eficaz e eficiente para a amplificação de RNA*
Como pode ser observado pelas descrições aqui apresentadas e pelas Figuras IA a ISu o método do presente invento engloba variações facultativas,, A Figura ÍA descreve um método de acordo com o presente invento aro que o ácido nucleico alvo tem sequências adicionais 33 reiacivamente s ssquSncia alvo* 0 primeiro oliqonucleotítíeo compreende um primeiro iniciador tenda um promotor 5» relativa-mencs a sua sequííncxs de ccmplexaçao que se complexa com a fracção terminal 35 da sequência alvo de um ácido nucleico (RkA) que tem sequências adicionais 35 relativamente à sequência alvo» 0 segundo oligonucleotídeo compreenda um segundo iniciador que se complexa cora a fracção terminal 3? do produto de extensão do primeiro iniciador3 coincidindo com o extremo 3? do produto de extensão do primeiro iniciador. No passo C1>5 o primeiro iniciador não actua como um molde «splice» devido ás sequências adicionais 35 rslativamants à sequência alvo? no entãoto5 no passo <1Φ)? o primeiro iniciador pode setuar como um molde «spiice» uma vez que o produto da extensão do segundo iniciador nao possui sequências adicionais 33 rslativamente à sequência alvo» A Figura 1B descreve um método de acordo com o presente invento em que a sequência de ácido nucleico alvo CRrSA) tem sequências adicionais 55 e 3S relativamente à sequência alvo» 0 primeiro oligonucleotídeo é como está descrito na Figura IA» 0 segundo oligonucleotídeo compreende um iniciador gue se complexa com a fracção terminal 3! da sequência alvo do produto de extensão do primeiro iniciador que tem sequências adicionais 3:: rsiativaments à sequência alvo» A Figura 1C descreve um ácido nucleico alvo {RMA) que tem extreme 5? s 3f definidos s5 portanto» não tem sequências adicionais 55 ou 3* relativaments à sequência alvo» 0 primeiro oligonucleotídeo é coroo está descrito nas Figuras IA e IBf mas uma vez que se complexa com o extremo 3? do ácido nucleico alvo? ais actua sirou1têneamente corno iniciador s como molde «splices no Passo Ci> = 0 segundo oligonucleotideo é coroo descrito na Figura IA» relativaroente à A Figura 10 descreve um ácido nucleico alvo (RNA) tendo uro excreroo 3:i detcn3.do e5 portanto, não tem sequências adicionais 3- e5 assim não tem sequências adicionais 3?
sequiYieia alvo, mas tem sequências adicionais 53 relativaraente à sequência alvo* 0 primeiro oligonueleotideo ê como está descrito na Figura iC e funciona como iniciador s molde «splics»* 0 segundo o!igonucleotideo é como está descrito na figura XB» A Figura XE descreve um ácida nucleica alvo <RMh) que te oí um extrema 53 definido mas que tem sequências adicionais 35 rslativamsnte à sequência alvo» D primeiro oligonueleotideo é como está descrito na Figura IA» 0 segundo oligonueleotideo compreende um segundo iniciador que, uma vez que se complexa com o extremo 33 do produto de extensão do primeiro iniciador, também compreende um molde «splice»» 0 segundo oligonueleotideo também tem um promotor 5’ reXativamente à sua sequência de complexaçSo. A Figura 1F descreve um ácido nucleico alvo CRNA) tendo sequências adicionais 53 s 3r' rslativamente à sequência alvo» 0 primeiro oligonueleotideo é como está descrito na Figura IA» 0 segundeu oligonueleotideo é como está descrito na Figura j.E, sxeeptuando nao poder actuar como molde «splice» no passo 4, uma vsz que o produto de extensão do primeiro iniciador tem sequências adicionais 35 rslativamente è sequência alvo» A Figura 18 descreve um ácido nucleico alvo <RNA> que tem extremos b 3:‘ definidos nSo tendo outras sequências além da sequência alvo» 0 primeiro oligonueleotideo á como está descrito na Figura id s o segundo oligonueleotideo á como descrito na tiqura 1E= Uma vsc que o alvo nW.a tem sequências adicionais, ambos os oligonucleotideos aetuam também como moldes «splice*» A Figura :LH descreve um ácido nucleico alvo CRNA) tendo uns extremo 35 definido e sem sequências 3S relativamente à sequência alvo, mas tenda sequências adicionais 59 relativamente à ssquincia aivo= O primeira oligonucleatideó é coma s-stá descrito nas Figuras 1C s IB e funciona como iniciador e molde xspiics». 0 segunda aligonucleotideo e coma está descrita na figura iF. A Figura il descreve um ácida rmcleico siva (RWfi) que tem um extremo 5* definido e não tem sequências adicionais 53 rslativamente è sequfncia alvo, mas tem sequfncias adicionais 3? relativamente à sequfncia alvo. 0 primeiro oligonucleotideo compreende um iniciador sem um promotor. G segundo oligonucleoti-deo compreende um molde «solice» não bloqueado que tem um promotor 35 rslslivamsnte è sua sequência de eompieKaçSo. A Figura ÍJ descreve um ácido nucleico alvo (RIMA) que tam extremos 5! s 33 definidos nlo tendo outras sequfncias além da sequência alvo. 0 primeiro oligonucleotideo compreende um iniciador sem um promotor. 0 segundo oligonucleotideo á como está descrito na Figura 11= A Figura 1K descreve um ácido nucleico alvo \RiMA) que tem um extremo 53 definido e nSo tem sequfncias adicionais 53 rslativamenie à sequfncia alva. mas tem sequfncias adicionais 35 relativaw-en te à sequfncia alvo= 0 segundo ol igonuc leotideo compreende um molde «splice» tendo um promotor 55 relativamente ã sua sequfncia de cDmplexaçSo:= mas que está bloqueado no seu extremo 3J. 0 segundo oligonucleotideo é incapaz de actuar como iniciador. A Figura 1L descreve um ácido nucleico alvo (RIMA) que tem extremos 5! b 3! definidos nSo tendo outras sequfncias alem da sequfncia alvo. 0 primeiro oligonucleotideo actua como iniciador s como molde «splice». 0 segundo oligonuc1eotideo é um molda «splice» bloqueado e é como está descrito na Figura ÍK. A Figura IH descreve um ácido nucleico alvo ÍRMA) que tem um extremo 55 definido es portanto^ nlo tem sequências adicionais 5:i relativamente è sequência alvos mas tem sequências adicionais 35 relativamente à sequência alvo» 0 primeiro oligonu™ clsatídao ê um iniciador coma descrito na Figura 11= 0 segundo oligonucleotideo é um molde «splice» bloqueadotsndo um promotor? como descrito nas Figuras íi< e ÍL. fi Figura IN descreve um ácido nucleico alvo CRNA) que tení extremos 55 e 3? definidos não tendo outras sequências além da sequência alvo» 0 primeira aliganucleotideo compreende um iniciador sem um promotor, como descrio na Figura 10= 0 segundo oligonuclsotideo compreende um molde «splics* bloqueada tenda um promotor, cama descrito nas Figuras li<? 1L e 1M. A Figura i?< descreve um ácido nucleico alva íRNft) que tem um extrema 5* definida e nSo tem sequências adicionais 5? relativamente á sequência alvo? mas tem sequências adicionais 35 re1ativamente á sequência alvo» Um oligonuc1eaiídeo é usado como como primeiro e segundo α 1 igonuc leotideo. 0 ol igonuc: leotideo tem uma sequência iniciadora 3? que se complexa com a fracção terminal 3* da sequência alvo como se mostra no Passo (1) s tem uma sequência molde Ssplice» 5* com um promotor que se complexa com o extremo 35 do produto de extensão de iniciador como se mostra no Passo (4)=
Resumindos os métodos do presente invento proporcionam um método para a síntese autocatalítica de múltiplas cópias ds uma sequência de ácido nucleico alvo sem a manipulação repetitiva das condiçSes da rsacçao tais coma temperatura* força tónica s pH que se caracteriza por fa) combinação numa mistura de reacção um ácido nucleico alvo que se compreende uma sequência alvo de RNA? dois oligonucleotidsos iniciadores= um primeiro oligonucleatídeo tenda uma sequência de ecmplexação suficientemente coffipIeroentar da fracçlo terminal 33 da sequência alvo de RNfí (por exempla a cadeia (·?·>> para se complexar cem ela e um segundo oligonucleoti-dso tendo uma sequência de coraplsxaçSo suficientemente complementar da fracçlo terminal 35 da sequência alvo ou do seu complemento (por exemplo* a cadeia <·->> para se campiexar com ela* em que o primeira a1iganucleotídeo compreende um primeiro iniciador que faeultativamente tem uma sequência 55relativamente à sequência da compisKaçao que inclui um promotor s o segundo oliganucleotídeo compreende um iniciador ou um molde «solicssa desde que se o primeiro oligonucleotídeo nSo possuir um promotor , entlo o segundo oligonucleotideo é ura molde «splice»que tem uma sequência 53 re1ativamsnte à sequência de iniciaçSo que inclui um promotor para uma RMA-polimeras© % uma DNA-polimerase p uma acfcividade enzimática que degrada selectivaments a cadeia de RNft de um complexo RNA-DNA (como seja uma RNAse H) s uma RNA-poiimerase que reconhece d promotor* Os componentes da mistura de reacçSo podem ser passo a passo ou de unia só vez = fi mistura de reacçlo á incubada em condições que permitem a formaçlo de um oligonucleo-tideo/ssquência alvo* incluindo condições ds iniciação de DWA a síntese de ácidos nucleicos (incluindo trifosfatos de ribonucleo-tideos e trifosfatos de desexirribonucleotideos) durante um período de tempo suficiente para que ejam produzidas múltiplas cópias da sequência alvo» Com vantagem a reacçlo decorre em condições adequadas à manutenção da estabilidade dos componentes da reacçaOji tais como enzimas» s sem necessitar ds modificação ou manipulação das condições da rsacçlo durante d processo da reacçSo de aropiificaçSo» Assim, a rsscçSo pode ter lugar em condições que sao substancialmente isotérmicas s incluem força xònica e pH substancialmente constantes» A presente reacçiao nSo requere um passo de desnaturação para separar o complexo HNAsDrviA produzido pela rsaccSo de sktensão da primeiro iniciador,: Tais passos requerem a manipula— ~Sd das candiçSas da reacçSo tais somo aumento substancial da temperaiurs da mistura de reaeção (geralroente da temperatura ambiente até cerca de 8Θ“0 a 1©5WC> 5 a redução da sua força ióniea Cgeralmente 1© vbzbs ou mais> ou alteração do pH (geral-mente aumentando o pH para 1© ou mais)= Tais manipulações das condições de reacçSo afectam muitas vezes de modo adverso as aciivitíades ensimâticasj, necessitando da adição de mais encima e também necessitando de mais manipulações da mistura de reacçSopa r a a fazer voltar às condições adequadas para continuação da síntese de ácidos nuclaicos» DNA-pol iinsrasss adequadas incluem transcriptases reversas» São particularmente adequadas DMA—pol iissrssss que incluem transcriptase reversa de AMv e transcriptass reversa da HHLV.
Os promotores ou sequências de promotores adequadas è incorporação nos iniciadores e/ou moldes «splice» usados nos métodos do presente invento são sequências de ácidos nuclaicos (naturais» produzidas sinteticamente ou um produto da digestão com enzimas de restrição) que são reconhecidas especifiesmente por uma RNA-polimerase que reconhece e se liga àquela sequência s inicia o processo de transcrição pelo qual são produzidos RNfis produtos de transcrição» A sequência pode facultativamsnte incluir bases de nucleotideos que se estevem para lá do sitio de reconhscxmento da KWh—polimerase que pode conferir mais estabilidade ou susceptibilida.de aos processos de degradação ou aumentar a eticãcia da transcrição» As sequências de promotor para as quais eKiste uma polimerase conhecida e disponível que © capaz de reconhecer a sequência de iniciação são particularmente adequadas para serem empregues» Promotores típicos,, conhecidos e úteis incluem os reconhecidos por certas polimerases de bacfceriafaoas
tais ccssío sejam as dos hactériofagos ib5 T7 ou EFà ou au um promotor do E= coli»
Se bem que algumas das transeripiases reversas adequadas para usar nos métodos do presente invsnto tenham uma sctivi-dade de RNAse Hs como seja uma transcriptase reversa de AMV, poda ser preferido adicionar RNAse H exógena, como seja RNAse H de E, coli„ Se bem que? como os exemplos mostram, não seja necessária a adição de RNAse exógena5 em certas condições*. a actividade de RNAse H presente na transcriptase reversa de AMV pode ser iniciada por componentes presentes na mistura de reacçScu Em tais situações* a adição de RNAse H exógena pode ser desejável. Sempre que estejam presentes quantidades relativamente grandes de DMA heterólogo na mistura de rsscçao, a actividade de RNAse H nativa da transcriptase reversa do AMV pode ser até certo grau inibida »ver e::q,Exempla 8) ε portanto o número de cópias da sequência alvo concomitantemente reduzida» Nas situações scn que a sequência alvo compreende apenas uma pequena fracçio do DMA presente Ce»g», quando a amostra contem quantidades significativas de DNA heteró— logo), é particularmente preferida a adiçSo de RNAse H exógena. Uma destas RNAse Hs preferida é a RNAse H de E, coli, A adição de tal RNAse H exógena ultrapassa a inibição provocada por grandes quantidades de DNA, CVer * s = g„,, Exemplo 8), 0 EMA produto de transcrição produzido por estes métodos pode servir como molde para producir cópias adicionais da ssqufncia alvo através dos mecanismos atrás descritos, 0 sistema é autocataiitxco e a ansplificação pelos métodos do presente invento ocorre autocataiíticamente sem necessidade de repetida-mente modificar ou alterar as condições da reacçao tais como temperatura, pH5 força iónica ou similares. Este método nao requere um sistema dispendioso para ciclos tér??;icos, nem requere
várias adições de enzimas ou de outros reagentes no decurso de uma rsacçSo de amplificação.
Os métodos da presente inventa podem ser usados como um componente de ensaios para dstectar e/ou quantificar ssqufncias de ácido nucleico alvo especificas em amostras clinicas,, ambientais, forenses s similares ou para produsir grandes quantidades de cópias ds DMA e/ou RNA de sequência alvo especifica para uma variedade de utilizações.
Num ensaio típico, uma amostra a ser amplificada é misturada com um concentrado de tampão contendo o tampão, sais, magnésio3 trifosfatos, iniciadores e/ou moldes «splice», diiio-treitol s espermidina, A reacção pode ser f acul tativainants incubada perto de 1®®WC durante dois minutos para desnaturar estruturas secundárias no ácido nucleica. Após arrefecimento, se o alvo fôr DMA alvo sem um extremo 35 definido,, adiciona-se transcriptase reversa e amistura de reacção è incubada durante 12 minutos a cerca de 42WC» A reacçao é novaroente desnaturada perto de i®0uC? desta vez para separar o produto de eutensão de iniciador do DMA molde. Após arrsfecirnento, adiciona—se transcriptase reversa,, RMA-polimarass s RNAse H s a reacção é incubada durante duas a quatro horasa 37UC, A reacção pode ser então testada por desnaturação do produto, adição de uma solução ds sonda, incubação 2® minutos a adição de uma solução para hidrolizsr selectivaroenie a marca da sonda não hibridada, incubação da reacção seis minutos a 6©WC s medição da restante marca quimiolu-minescsnts num luminómstro. Os métodos da aplicação tís HPA citados supra são aqui incluídos. Podem ser empregues vários outros métodos para a determinação do produto em vez da hibrida-ção da sonda em solução. J.
Se o alvo tiver um extremo 33 definido e um dos oligo-nuclsotídeos fôr um molde «spli.cs» que tem uma sequência de ecxnplsxsçlo suficientemente complementar do extremo 3’ para se campiexar com ele s uma sequência promotor 5* relativsments à sequência de compiexaçlo ou se o alvo fôr RNA» um ensaio típico inclui mistura da alva com a concentrada de templo referida atrás s desnaturação de qualquer estrutura secundária* Apôs arrefecimento» adiciona-sa transcriptase reversa5 RNÃ-ροΙimarase s» caso se pretenda» RNAse H e a mistura é incubada durante duas a quatro horas a 37~C = A rsacçio pode então ser testada como descrito atrás» ΐI - Processos Preliminares
Seguem-se várias realizações de processos preliminares que facultativamente podem ser empregues conjuntamente com o método preferido do presente invento» Uma vez que alguns ácidos nucleicos requerem modificação antes da amplificação autocatali-tica» estes processos podem ser empregues para se conseguir as modificações» Sempre que o ácido nucleico alvo Ce a sequência alva) for originalmsnte 0ΝΑ;! estes processos podem ser empregues para produzir cópias de RWft da sequência alvo para usar no rlétodo Ssral« Deverá ser apreciado que estes Processos Preliminares podem eles próprios ser repetidos e portanto podem ser usados como métodos de amplifIcsçlo*
Processo......Preliminar I
Este método dá cópias de RNA de uma sequência alvo de um ácido nucleico alvo que compreende uns DMA (cadeia simples) com um extremo 3“ definido» D Processo Preliminar I utiliza dois componentes de ácido nucleicos uma molécula de ácido nucleico alvo e um oligonucleotideo molde «splice»» Este processo requere
Liíii ácida nuclsico alva ds DMA tenda um extrema 3? definida» Ss o extremo 3? nativo nao for conhecida ou não for satisfatório par qualquer ração» pode ser criado us novo extremo 33 definido usando uma nuclease de restrição5 ligação a uma outra sequência ou por outras meias»
Na descrição que se segue? (ver Figs*2A s 20 o ácido nuclsico alva terá arbiiráriamente α sentido «menos»» Assim., o molde «spiice» terá o sentido «mais» de modo a ser suficíentemente complementar do alva para se camplexar com ele» 0 molde «spiice» tem uma sequência de complexaçlo suficientemente complementar do extremo 35 do alvo para se complexar com ele» D molde «splics» também tem uma sequência 5J relativamente è sequência de eamplexação que inclui uma sequência de promotor para uma RNA-po-limsrase» 0 molde «solice» pode facultativamente ter outras sequências 5? rslativamente ao promotors entre o promotor e as sequências ds coroplexação» 0 molde «spiice» pode também ser modificada na extremo 35 para ser «olaqueado» de modo a não poder ser prolongado pela adição de nucleotideos adicionais numa rsacçao ds extensão e foi tornado incapaz ds actuar como um iniciador além de actuar como molde «splics»» 0 Processo Preliminar I utiliza duas actividadas enzimáticass uma DNft—polimerase DNfi-dependente e uma RNA—polIme-rase DNA-dependente» se nlo estiver bloqueado no 0 ácido nucleico alvo é tratado com o molde «spiice» em condições que permitem a formação de um complexo olígonuclsoti···· deo/sequência alvo e que seja iniciada a síntese ds DNA» Numa rsacçao de extsnsãode DNA usando uma DNA—poiimerase adequada, uma sequência complementar da sequência do molde «spiice» 5? relati— varoente â sequência de complsxação é adicionada ao extrema 3? da DNA alvo» 0 molde «spiice».
extremo 3% pode também servir como iniciador para a uN A·--poli me·"·· rase s pode ser prolongada para dar um produto de extensão da iniciador,, 0 produto da reacçSo de extensão, de cadeia dupla ou parcialmsnte de cadeia dupla» complexo alvo/molde «spiics» sctua como unt molde para a síntese de RNA usando uma RNA~polimerase que reconhece o promotor» O RNA pode então ser usado para o método geral ou ser usado para gerar cópias de DMA do RNA como se seques
Um RNA compreendendo a sequência alvo <tendo o sentido «fiiais»)é tratado com um iniciador íqus nominalmente tem o sentido «menos») que tem uma sequência de complexaçlo suficientemente complementar do extremo 35 da sequência alvo do RNA para ss complexar com ele em condiçSes que permitem a formação de um complexo oligonuclsotídeo/sequência alvo e que seja iniciada a síntese de DImA» 0 iniciador é então prolongado numa rsacçao de extensão do DMA usando o RNA como molde para gerar um DNA produto de extensão de iniciador tendo a sequência alvo» A sequfncia de DNA alvo è separada do RNA por desnaturação ou por degradação do RNA e começando com o molde «splice»» o ciclo é repetido» Fscul-tativamsnts5 o iniciador pode também ter sequências adicionais 5:i re1ativaroente a sequência de iniciação» 0 molde «splice» pode também ter sequências adicionais 35 relativamente à sequência de camqlexação»
Numa realisação5 o método atrás pode ser praticado usando um oligonucleotídeopela utilização de um oligonucleotídeo tendo uma sequência que poderá compreender o iniciador 3? rslati--vamente á sequência que poderá compreender o molde «splice»» (ver, Fig» 20» 0 Processo Preliminar I é ainda descrito por referência ás Figuras 2A a 2E= A Figura 2A descreve um ácido nuclsico alvo ΐ iti-j.Hs que tem um extremo -O definido» não tendo sequências
adicionais 35 relativamente â sequência alvo» 0 primeiro ollgonu-cleotldeo compreende um iniciador s um molde «sol ice» e tem um promotor 55 relativamente à sua sequência de cosnplexação* A Figura 2B descreve um ácido nucleico alvo (DMA) como se mostra na Figura 2A» Q primeiro olxgonucleotideo compreende um molde »sqlics» que está bloqueado no seu extremo 39 sá portanto incapaz de actuar como iniciador» A Figura 20 descreve uai DNA alvo como se mostra na sFiguras 2A e 2B„ A Figura 2C descreve a utilização de um oligo-nucleotideo que tem uma sequtncia molde «splice» (com um promotor) 59 relativamente a uma sequência de iniciador no seu extremo 3?» Assim5. o oligonuclec-tideo actua como um molde «splics» bloqueado nos passos íí) a (7) e como iniciador <s molde «splice») no passo (4)= h Figura 2D descreve um ácido nucleico alvo (DMA) que tem um extremo 59 definido e sequências adicionais 39 relativa-menta á sequência alvo que sofre pasos preliminares de complexa-çSos extensão do iniciador e separação (pasos 1 e 2) para gerar um DNA alvo complementar tendo um extremo 35 definido» 0 oligonu.-clsotideo dos passos <i) s (7) compreende um iniciador que se complexa com a fracçlo terminal 39 da sequfncia alvo do DNA alvo original (aqui nominalmente <-*->>„ O outro oligonucleotideo (dos passos (4) e {10)) compreende um molde «splice» nSo bloqueado que ss complexa com o extremo 39 do complemento do alvo original» A Figura 2E descreve um ácido nucleico alvo (DNA) que tem um extremo 35 definido e sequências 35 adicionais relativa- mente á sequência alvo que sofra passos oreiiminarss de complexa— çKo? prolongamsnto e separação (passos (1) e (2)) para gerar um DNA alvo complementar tendo um extremo 35 definido» 0
ο X i g on u c 1 eo t i d eo dcs passos (í) e (7) compreende um iniciador que se complexa com a fracção terminal 3:’: da sequência alvo do DNh alvo original (aqui nominal mente {*}) „ 0 ol igonijc 1 ea tideo dos passos (4) e íl©) compreende um molde «splice» bloqueado qtxe se complexa com a fraeçSo terminal 3? da sequência alvodo complemento do alvo original» 0 molda «splics» ê complexado com α extremo 3* do ácido nucleico alvo em condições de complexaçlo que permite a formação da um complexo aivo/molde «splice» ε que ssja iniciada a síntese de DMA» (passo í) Uma DNA-polimsrase adequada é usada para prolongar o extremo 35 do ácido nucleico alvo para adicionar uma sequência complementar da sequência do molde «splice» 55 relali-vamente á sequência de complexaçao» Se o extremo 3? do molde Ssplice»· nlo estiver bloqueado e for suficisntsments complementar do ácido nucleico alvo e o molde «splicss? puder actu&r como um iniciador de forma a que o extremo 35 do molde «splics» possa também ser prolongado» (Figura 2A> 0 complexo resultante alvo/mol-de «sqlices pode ser parcial ou totalmsnte de cadeia dupla» <Ver Figura 2A vsrsus figura 2B e 20 No mínimo a região de cadeia dupla coiiiprsnde o promotor e a sequência ds iniciação que se conplsxou com o ácido nucleico alvo» 0 molde do Passo 2 é transcrito por uma RNA-polimerasa adequada» A RWA-ροΙimerase produz cerca ds 5—10ΘΘ cópias de RNA para cada molde» Nas Figuras 2A a 2CS o RNA produzido é nominal-mente do sentido «mais» e inclui a sequência desde o xtremo 3? do promotor até ao extremo 55 do ácido nucleico alvo» 0 RNA produto do Passo 3 pode ser usado de acordo com a método geral para amplxtxcar autocataliticamente s sequência alvo ou alternativaments pode ser tratado em condições de complsKaçSo e de iniciaçlo com um iniciador que tem unia sequência de
compisxaçao no seu extremo 33 suficisntsments complementar da fracçSo terminal 3:‘ da sequência alvo no RNA para os compiexar com ela e facultativamente inclui outras sequências 5? relativamente à sequência de eomplexação., 0 iniciador é prolongado usando c RNA como molde por uma DNA-polimsrase RNA-dependents numa reacçlo de SKtsnãio do iniciador,· Isto produz um produto que é pelo menos parcialmsnte de cadeia dupla e que deve ser tornado pela menos parcialmenie de cadeia simplespara posterior síntese por degradação da fracçSo de RNA, como seja por uma RNAse H (passo 5) ou por outro método como seja desnaturação* Q DMA produzido no Passa ò pode ser usado como uma molécula alvo para o Passo 1 s tratado com um molde «splice» como descrito atrás para produzir roais RNA s DNA. Estes passos podem ser tornados cíclicos para produzir qualquer nível pretendido de amplificação* Deverá ser também notado que, pela escolha adequada dos moldes «spiice» e iniciadorCes) esta nova molécula alvo (Passo 6) pode ter extremos diferentes dos da molécula original, Ainda, se o produto de extensão do iniciador do RNA tiver uma sequência de promotor 5S relativamente á sequência de complexa-çSo5 um segunda iniciador tendo uraa sequência da compiexaçãa do sentido«roais« e facultativamente outras sequências 59 relativa-mente à sequência de complexação podem ser usados para copiar o produto da prolongamento do iniciador para produzir um molde de cadeia dupla para uma RNA—polimerase* Um molde assim produzido parmete que a RNft—oolimerase faça RNA de sentido «menos® que pode ser amplificado usando o método geral ou ainda amplificado usando os processos aqui descritos, FHpgcesso.. Prg.l iroinar 11 0 PrucsiíSD Preliminar II difere do Processo Preliminar I na forma como é gerada a espécie auiocatalíiica, Q ácido nucleico DMA alva não necessita ds ter uai extrema 3? definido* Hum aspecto5 um iniciador contendo uma sequência de promotor 55 relativamente à sequência de complexaçso é usado em lugar de um mal.de «splice» para introduzir a sequência da promotor no molde para a RNA-polimerase* □ iniciador tem uma sequência de complexa-ção suficien temente complementar da fracçSo terminal 35 da sequência alvo para ss complexar com ela e uma sequência qua inclui um promotor para uma RNA-polimerase 55 rslativamente á sequência de complexação* 0 iniciador é prolongado com uma DNA-ρα1imerase para dar um produto d extensão ds iniciador*
Após separação das cadeias5 geralmente por desnaturação tárniicas um segundo ol igonucleotídeo do mesma sentido da molécula alvo é usado como um iniciador para sintetizar um complemento de DMA do produto de extensão do primeiro iniciador* Q segundo iniciador pode ter sequências adicionais 59 r e 1 a t ivasiente â região de complexação que pode incluir um promotor* A inclusão de uma sequência ds promotor no segundo iniciador pode aumentar a amplificação. 0 segundo iniciador pode também ser um molde ΐ:· s ρ 1c s r = 0 Processo Preliminar II é ainda descrito com referência à Figura 3* A Figura 3 descreve um DMA alvo que tem sequências adicionais 5? e 3S relativamente à sequência alvo* 0 primeiro iniciador tem uma sequência de camplexação no seu extremo 3? s uma sequência 5? rslatívamente à sequência de complexação qua inclui uma sequência tíe promotor s se complexa suficientamente com o alvo para servir uma função de iniciação e iniciar a síntese tíe DMA* Uma DMA—polimerase adequada prolonqa α iniciador para dar um produto de extensão de iniciador* As cadeias são separadas por desnaturação ou por outros meiso para dar um proDUto 08 extensão de inicxador de cadeia simples contendo um promotor* Ρ
Usa-se um segunde iniciador que tens uma sequência de complexaçSo no seu extremo 35 suficisntements complementar da fracçso terminal 35 da sequência alvo do produto tíe sxtenslo do primeiro iniciador e? facult.ativanmente3 outras sequências 5:i relativsmsnte â sequência de complexação que possam incluir uma sequência de promotor,, 0 segundo iniciador é complexada suficien — temente com o produto de extensão de iniciador do passo 3 para servir uma função de iniciação e iniciar a síntese de DMA* A DMA··"· poli me rase prolonga o segundo iniciador para dar um produto de extensão do segundo iniciador,, A molécula de DMA de cadeia dupla resultante pode agora servir como um molde da RNA-polimerase para gerar RNA para o Método Geral= Como está descrito na Figura 3S as moléculas de RNA produzidas sSo nominalmente de sentido «mais» e podem ser multiplicadas usando o método geral do presente invento„
Sempre que a sequência e complexação cio segundo iniciador seja complementar do extremo 3? do produto de extensão do primeiro iniciador do Passo 3 s α segundo iniciador inclua uma sequência de promotor 55 relaiivsmente è sequência ds complexa-ção=s o segundo iniciador pode servir como um molde de «splice» de tal forma que o extremo 35 do produto de extensão rfo primeiro iniciador do Passo 3 possa ainda ser prolongado para adicionar a sequência do promotor e produzir um molde para a RNA-polimerase que produz RNA de ambos os sentidos= As moléculas da RNA assim produzidas podem ser amplificadas usando o método geral»
Num outro aspecto do presente invsnt? o segundo inicia— dor actua corno um molde «splice» e tem um promotor 5? relativa-mente ã sequência de complexação de tal forma que o primeiro iniciador nSo necessita de ter um promotor» Naquele caso» o produto de extensão do primeiro iniciador do Passo 2 é ainda proiongado para produzir um complemento da sequência do promotor. gerando assim um molde para a produção de RNA as sentido «menos» pela RNA-polimerase»
Repetindo os passos descritos atrás? podem ser produzidas cópias adicionais de RNA e DMA da sequtncia alvo»
Os exemplos que se seguem dos processos préviaments descritos demonstram α mecanismo e utilidade dos métodos do presente invento» Eles nSo sSo limitantes dos inventos e nSo devem ser considerados como tal„
Muitos dos materiais usados num ou mais exemplos sao semelhantes» Para simplificar as descriçSes nos exemplos» alguns dos materiais ssrãc abreviados s descritos aqui» 0 molde referido como «frag 1» â um segmento de cadeia dupla de DMA homólogo de uma região de DMA do genoma da hepatite B» Ele foi removido de um plasmídeo por digestão com nuclsases de restrição e purificado a partir do restante ácido nucleieo por métodos cromatogràficos» Depois da purificação o fragmento foi cortado com uma endonuc1©ase de restrição e purificado por sxtracçla com fenol s precipitação com sianol para dar o fragmenta pretendido» D molde referido como «H13LC-}» é um DMA alvo de cadeia simples contendo» como uma fracçãc? pequena da sequência total» asequtncia alvo de cadeia «menos»»
Foram usados vários iniciadores s moldes «splice» diferentes nos exemplas aqui descritos* D oligonuc1eotidso referido cosa T7proí+) cantes, perto da extremo 5% um promotor da RNft-polimerase de T7 e perto do extremo 3% uma sequência complementar do extrema 35 da sequência alva de cadeia menos para os dois moldes descritos atrás § T7proí-t-) também contem outra sequência ds informação para aumentar a eficácia· A sequência para para T7pra<*> é 5?--AATTT AATAC SACTC ACTAT A8GSA BA86T TATCS CsTSGfiS TSTST CTSCS SCSGT35 .
Um outro ol igonucleotideo semelhante a TTproí·*-; é títiT/proC·?·)» Ele difere ds T7pro(·*·} por o extremo 39 ter sido prolongado com um didesaxinucleotidea usando terminal-dssDxirm-clsotidil-transfsrasa· Ao contrário de ds Τ7ρΓο(4·}? ddTTproC·*-) é incspsz as servir como iniciador para a sintese de DMA por transcriptase reversa mas pode actuar como molde «splice»· HBvC-lrr é um iniciador que hibridará com a cadeia mais do molde frag 1 e é homólogo de uma sequência qus está dentro ds sÍi3LÍ·-·)* CH8V'í~)Pr é complementar de uma sequência 35 relativa-mente à sequência da cadeia mais homóloga de T7pro<*}»3 A sequência de HBvi-)Pr è 55-SABSA CAAAC 8B8CA ACATA CCTTS-39.
Um outro oligonucleotideo contendo uma rsqiSo de promotor é llproi--} Este promotor-iniciador contem uma sequência idêntica a T7proí4> mas substitui a sequência campiementar do alvo menos com uma sequência complementar do alvo mais· 0 extremo 3? ds l/proc—5 e complementar da extremo 33 da cadeia mais do frag 1 ,= A sequência de T7pro<-> é 5^-AATTT AATAC SACTC ACTAT ASSBA SATCC TBBAA TTASA B8ACA AAC8B 8C~3?S Tal como ddT7pro(t)s ddT7pro(-) é oligonucleotideo bloqueado em 3r* obtido por prolongamento do extremo 35 com um didesoxinucleotideo usando
termina1-desoK inuc ieoiid i1-transferase . U ddi7pro(-) não pode servir cosiiO iniciador mas- é semelhante a T7pro<-)=
Os moldes asados nestes exemplos contêm sequência substancial entre as regiões homologas ou complementares dos iniciadores s moldes «splics» descritos atrás» Como a sequência entre os oligonucleotideos será amplificada como resultado do invento^ a quantificação desta sequência proporciona um meio especifico de medição da amplificação,: Foi conveniente testar os produtos por técnicas de hibridação usando sondas de DMA especificas das sequências codificadas entre os oligonucleotideos iniciadores e os moldes sspiiee»= Usaram-se duas sondas nos exemplos apresentados abaixos Sonda í> e Bonda (-) » A Sonda ( + > é complementar do produto de sentido menos s a Sonda í~) é complementar do produto de sentido mais» A sequência da Sonda (*·> é 5?-CCTCT TCATC CTBCT 60ΪΑΤ 6CCTC-35 e a sequência para & Sonda (-? è 5S—GABC ATAGC ABCAG BATBÃ ABhGG—3;; ,, As sondas aqui usadas foram marcadas com uma marca quiffliolufflinescsnte» No ensaio5 a marca na sonda hibridada emite luz que é medida num luminómetro»
Nos exemplos que se ssgusfii5 a amolifieação relativa foi medida como se segue» Uma amostra da mistura de rsacção de amplificação (geralmente 1® pl>foi diluída para 5® μ! com 1® mn TriS“HCl 9 pH 833 s desnaturada dois minutos a 95'"C= Após arrefecimento em gelo» adicionou—se à amostra s misturou—se 5® μΐ de u-ma solução da sonda contendo aproximadaments 75 fmol da Sonda ou Sonda <-)? succinato de litio ©,2 Ms pH õ?25 21% (ρ/v) de laurilsulfato ds litio» 2 mH EDTA s amM EGTA» As reaoçSes foram enfio incubadas 2® minutos a 6®“C s arrefecidas» Para cada re&cção de hlbridaçloadicionou-se 5®®μ1 de uma solução preparada ajustanoo uma solução saturada de borato de sódio a ρΗ Sç. 5 com âcxdo cloridricQj seguido de diluição para levar a concentração ds borato até ®53M finais adição de Tricon Μ—1ΘΘ para 5% (v/v)
final» As raacçSas forara entSa misturadas s incubadas seis minutois a ó©DC para destruir a marca quimiolumineseente da sonda não hibridada» Esta método de destruição da marca quimiolumines-cante da sonda não hibridada é muito especifico;; apenas uma fracção muito pequena da sonda não hibridada permanece quimiolu-minescente» As reaoçSas foram arrefecidas e a quimíoluminescfncia restante foi quantificada num luminóíisetro quando da adição de ΞΘΘμΙ de hidróxido de sódio 1g5M5 ®sl% (v/v) de peróxido da hidragánics» Mo ensaio a sonda hibridada emite luz que é medida num luminéraetro. Uma vez que a rescção que destrói a marca quiisiialuminsscsnte da sonda não hibridada não é 1Θβ% eficaz» existe geralmente um nivel de fundo de sinal presente na gama de cerca de 3#© a 13©# unidades de luz relativas ÍRLU>»
Muitos outros métodos de ensaio são também apliçáveis incluindo ensaios que empregara hibridação com sondas marcadas isotópicamente» técnicas ds transferencia s electroforese»
As enzimas usadas nos exemplos que se seguem são transeriptase reversa do virus da mieioblastose aviária da Seikagaku America., Inc» , RNA-polimerase de T7 da Mew England Biolabs ou Epicsntrs e transcriptase reversa do virus da leucemia murina de Moloney CMMLV) e RNAse H ds E» coli da Beihesda Research Laboratories„ Podem ssr usadas outras enzimas contendo actividatíes semelhantes e enzimas de outras fantesg s podem também ser adequadas para usar outras RMA-polimerases com especi-ficidades de promotor diferentes»
A menos que de outro modo seja especificado as condições da reacção usadas nos exemplos que se seguem foram 4© mtl Tris-HCl s 25 raM MaCl ? 8 raM MgCl^? 5mM ditiotrsitol ? tri-hidroclo™ reto ds esperraidina Ξ mH, 1 raM rATP» i sn rCTP, lmMrSTP, i raM rUTP3 ©»2 mH dfiTP, ©52 raM dCTPs ©s2 raM d8TP? ©?2 mM dCTPs ©,2 raM
dGí κ = ©=.2 iisn dl'iP„ iniciador e molde «splicss ©5iO μΗ cada e quantidades especificadas de molde s encimas em volumes de 10®
Estas condiçSas ds reacção não estão necessáriamente opiimicadas e foram alteradas para alguns sistemas= As sequências de oligonucleotideos usadas são exemplificativas e não pretendem ser limitantes uma vec que podem ser empregues outras sequências para estas e outras sequências alvo»
tteasnlo 1
Processo Preliminar I
Para demonstrar que este sistema funciona? cada um dos quatro oligonucleotideos contendo promotores descritos atrás foram individualmente em reacçSes com ou sem 4 fmol de alvo Cfrsq 1) ,= A reacçSo foi incubada 2 minutos a 95~C para desnaturar o alvo» depois arrefecida para permitir que os oligonucleotideos emparelhem com o alvo» Adicionou-se transcriptase reversa» 13 Unidades? e RNA-polimerase de T7» 1&0 Unidades e a reacção foi incubada 3® minutos a 37WC« Um décimo da reacção foi testada usando d método de hibridação» Os resultados Cem Unidades de Luz Relativas ou «RLUCs>» e fmoles) apresentados na Tabelai mostrasis que tanto os oligonucleotideos bloqueados como os não bloqueados servem como moldes «splice» para produzir o produto» Os sinais medidos para reacçSes sem alvo representam níveis de fundo típicos de sinalg para este tipo de ensaio»
Tabela 1» Comparação de Moldes «aplica» no Prscssso Preliminar I .·= 1 jMalde j «Splice» * Alvo Bonda (-> Produto RLU fmol í j dtíT7pro<-5··/ 4 fmol Sonda (-) 38451 24® jddI7proC-í-) o fmol Sonda (-) 544 €' ^ T7pro C 4·) 4 fmol Sonda (...) 65111 41® |T7pro<+) Φ fmol Sonda C~> ÕÍ7 ® j dcíT7pro(-··) 4 fmol Sonda ( + ) 47756 85 }ddT7pro(-) 0 fmol Sonda ( + ) 879 ® j T7pro(--) 4 fmol Sonda ( + ) 156794 29® |T7pro(-> o fmol Sonda ( + ) 60® ®
Ciclizacio com d Processo Preliminar I 0 sistema ds amplificação foi tornado cíclico com ddT7pro(O e T7pro (*·),, Nesta experiência, 4 amol fraq ϊ, HBvi--)Pr a ddT7pro< + ) ou T7proí-5-) foram misturados em reacçSss convencionais e incubado a 95“C = Após arrefecimento, adicionou-se 1.3
Unidades ds transcriptase reversa s 1Θ® Unidades de RNA-polimera-se ds T7 s a mistura foi incubada 3® minutos a 37^0 = Uni décimo da rsarrgo foi removido para ensaio e o ciclo foi repetido com o restante» Após rspstiçSo do ciclo uma tsrcsira vss, testaram-se amostras de 10 μΐ pelo método de hihritíação usando SondaC->» Os resultados apresentados na Tabela 2indicam que o produto foi amplificado através da ciclizsçSo com ambos os moldes sspllcss bloqueados e nSo bloqueados»
Tabela k*« Uiclizaçlo com o Processo Preliminar 1 f........ jnoltis «splice» Alvo ! [Unidades de Luz Relativas (KLUs) f (Ciclo í .. . I Ciclo 2 Ciclo 3 1 | dtíT7pro( -i··) 4 amol .......i--------- ------------ ! 6©2 1986 1015® I jtíd77proC-H Θ amol [658 592 595 j |T7pro<4> 4 amol 1891 618Θ 5216® 1 jT7pro<v) ! Θ amol 1496 i 504 776 j
Sensibi 1 idade do .Processo Preliwinar.......I
Neste exemplo a molde «sol ices não bloqueado? T7pro<*} a q iniciador5 HBV<-)Pr= foram usados para testar a sensibilidade do método ds amplificaçSo. Carreram-se seis ciclos da Processo Preliminar I como descrito no Exemplo 2co® quantidades decrescentes de frag 1= Após amplificação. α produto foi testado usando o método ds hibridaçlo descrito na Descrição Detalhada do Invento. „ v 1
Usando este método conseguiu-se detestar 4 κ 10 moles do frag 1 Cvsr Tabela 3>=
Tabela 3== Sensibilidade usando 6 ciclos do Processo Preliminar I
Alvo Amostra RLU do < moles) μΐ produto 5 32039© 4X10 2Θ 105364 4x1 Θ~""^ 2Φ 3166 4Κΐ0“^- 20 1927 0 20 S06 ftmplificaçgp Incluindo d Processo. f^liminar. i
No exemplo que ss ssgus,, d alvo a ser amplifiçado foi o írag 1» na primeira séria da raacçSsss várias combinações da alvo a da moldes «splica» foram incubados a 75UC durante dois minutos ε dapois arrefecidos antes da adição da 13 Unidades de transerip-tase rsvsrsa s 1ΦΘ Unidades de DNA-polimerase de 17=, As reacçSes foram incubadas 30 minutos a 37’~'C e em seguida amostras de 5 pi das reacçSes foram testadas com ambas as sondas para quantificar os produtos,. Após este ensaio5 prepararam-se reacçSes usando 5 μΐ das reacçSes 1 e 2 e d molde «splice» T7pro( -·>„ As misturas foram incubadas Ξ minutos a 95°C e depois arrefecidas antes da adição de 13 Unidades de reversa e i®0 Unidades de RNA-polimerase de T7,= As novas rsacçõss foram então misturadas e incubadas a 37""C durante 2 horas» Removeram-se amostras de ΙΘμΙ para um banho de gelo nos tempos indicados na Tabela 4 abaixo» Os produtos foram testados usando o método de hibridação préviamente descrito» Os resultados indicam que ambos os moldes «splice» permitem a produção de Fíwfi a partir do frag i. Os resultados também indicam que são produzidos significativamente mais produtos nas rsacçass contendo RMA e o molde «splicss complementar daquele RNfi» E, finalmente5 a cinética da reacção para a reacção ÍB mostra um aumento geométrico em produto enquanto que a cinéticas para a reacção 2 são de uma forma mais linear» Esta diferença» indica que o produto na reacção ÍB está a servir como substrato para gerar mais produto? assim a reacção é autocatalítica.
Tabala 4« Processo Preliminar I 1----------------------------------------1 j ReacçSo ! í *Ts à. ♦3 4 j ......................1 |Alvo (4 fmol> j Sim Sim SilB ? Não 1 } T7pro ( ) j Bim Não Nlo NSo ] [ T7pro(-) J Não NSo Sim NSo j A 1 Sonda Tempo 1 Unidades de Lu2 Relativas -----_{ (RLUs) | i jSonda<*) 3®? j 115* 105S 2185? .................i 591 j j Bonda C·-) 309 j 11693 771 744 691 | ............I RsacçSo | IA ÍB 2A --------5 2B j ? 1 ReacçSoi j Sim Sini NSo 1 ma I jRsacçlo2 1 Não Não Sim Sim J lT7pro<-) j pj NSo Sim NSo Sim {
Sonda
Soncla <-*·)
Sonda í -) l__________________ í empo (Unidades ! de Lua Relativas 05 r f 714 /5/ 639 661 309 { 686 339 1663 1373 605 I 71B 6331 645 1373 12Θ5 { 816 16889 660 2238 1205 | 3142 6886 637 7B0 J----------------------------__i
EiÇgffiolQ-b
Sj^lÉfeÍ^J^--á^-,.^iS£ããg--5âI^-^EBljÍÍj£â£MB-J.I3£Ji4ái2á3.
Procsso Preliminar 0 exemplo que se ssqus demonstra ainda o potencial desta raalizaçlo dos métodos do invento. Uma quantidade pequena de írag I < i® amai). foi usado em rsacçSes com várias combinaçSes de T7proO>. T7proí-> e HBV(->Pr» As misturas ds rsacçlo foram incubadas a 95“ durante dois minutos para desnaturar o DMA alvo e arrefecidas antes da adição de transcriptass reversa s RNA-polΙοί® rase de T7» Após mistura5 as reacçSes foram incubadas 3® minutos a 37“C. Retiraram-se amostras de quinze oiicrolitros a vários tempos e guardou—se a Θ“0 até serem testadas. 0 ensaia de bibridaçSo foi usado para quantificar os produtos das reacçSes. Os resultados apresentados na Tabela 5 mostrara que o invento requere um molde «splice» s um iniciador. No entanto* é vantajoso um segundo molde «splice». Os resultados com apenas um iniciador ou molde «splice» ficaram abaixo das .limites de detenção do ensaio. Tal como no exemplo anterior. as cinéticas de rsscçla são geométricas* indicando um sistema autocatalitico.
Tabela 5= Cinéticas de Reacção do Processo Preliminar ΙΣ» r......... [Reacção 1 1 2 3 4 5 6 7 1 !A1vo Cl® amol) Não Sim Sim Sim Sim Sim Sim !T7pro(-f·) Sim Nao Sim Nao Não Sim Sim |T7pro<-) Sim Não Não Sim Não Não Sim ]HBV(-)Pr Sim Não Não Mão Sim Sim Mão f \ empoíminutos) Produto Menos CkLUs) 0 619 638 635 703 592 619 656 3© 613 6-30 613 755 626 844 1133 6Θ 635 649 856 894 635 2146 6008 9Θ 593 619 619 925 624 6226 23484 120 621 606 627 946 639 12573 43939 180 678 635 714 930 627 21719 78682 Iíempo'minutos) Produto riais CRLUs) 0 624 646 1661 710 621 636 962 30 637 601 802 629 655 803 758 6ô 639 706 8Θ0 679 664 226 2395 9Θ 638 683 956 633 687 7786 8085 120 643 670 884 647 632 18160 18241 ? 180 _ - 683 617 968 758 712 34412 41165 0 nossó trabalho subsequente demonstrou a síntese continuada de produto durante cerca de 5»Θ horass o que é substancia Intente melhor do que os métodos de trabalhos anteriores» Também demonstrámos aumento de sensibi!idade*
fimplifIcaçõo Incluindo p Processo Preliminar II
Neste exemplo foram usadas várias combinações de iniciadores para amplificar 5®Θ amol de um DMA alvo sem extremos definidos* 0 alvo foi nÍ3Lí--> referenciado atrás* Quando da preparação da reacçao5 as amostras foram incubadas dois minutos a 95’"C? depois arrefecidas antes da adiçSo ds 13 Unidades de transcriptase reversa* As reacções foram então incubadas doce minutos a 42 ”*0» Em seguida as reacções foram novaments aquecidas durante dois minutos a 95WC e arrefecidas* Adicionou-se irsns-ci-iptass reversa e RNA-po 1 imerase de T7 e as reacções foram incubadas durante duas horas a 37~C=·. Amostras de das microlitros da rescção foram testados com a Sonda s com a Sonda (·->* Os resultados apresentados na Tabela 6 mostram que a sintssa ds grandes quantidades de ácido nucleico ocorre quando dois iniciadores sSo empregues* Eles também demonstram o beneficio dos dois promotores-iniciadores reiativamsnte a um promotor-iniciador e um iniciador* 0 ni.vsl baixo de síntsss nas reacções 4 s 5 corresponde à síntese de aproximadamente uma cópia de DWA do molde original:: 0 sistema emprega um passo de desnaturação inicial a 95~C que pode servir para desnaturar alvos ds cadeia dupla ou regiões ds cadeia dupla de ura alvo de cadeia simples assim como inactivar actividadss de nuoleass & proteass indesejáveis*
lahsla 6= Sistema do Processa Preliminar 11= keacçSo 1 3 4 Ô MÍ3LÍ-) Não Não Sim Sim Sim S i í n Sim T7proí*> Sim Sim Não Sim Não Sim Sim 77pro< --) Sim Não Não Não Sim Sim Nlo HBV í ~)Pr Não Sim Não Nlo Não Não Sim Sonda Unidades de Luz Halativa CRLUs) Sonda (-*·> 862 744 762 1Θ89 2577 9622Í 3Θ501 Sonda(·--) 473 42Θ 483 3038 1Θ8Θ 15171 14863
Efeito de RNAse H
Para demonstrar que a adiçlo de RNAse H exógena poda melhorar a amplifícação nos sistemas autocatalíticos descritos do presente invento* foram preparadas várias reacçSes usando diferentes quantidades de alvo* liÍ3L(~) s ô ou 2 Unidades de RNAse H exógena. A RNAse H exógena foi obtida a partir de E. coli. Todas as reacçSes foram preparadas com TJproíf·) e TTproí-). As reacçSes foram sujeitas à desnaturação a 95“G e arrefecidas antes da adição de transcriptase reversa. Apás uma incubação de doze minutos a 42^05 as reacçSes foram novamente desnaturadas a 95UC. Apás arrefecimentos adicionou-se transcriptase reversa* RNA-poli-merase de T7 e5 se indicado Cver Tabela 7)* RNAse H e as reacçSes foram incubadas durante 3 horas a 37”C:= Removeram-se amostras de ΙΦ μΐ de cada rescção em intervalos de uma hora para ensaio pelo método ds hibridaçao„ Os resultados na Tabela 7 mostram que a RNAse H exógena aumentou siqnificativamente as cinéticas de reacção s sustentou a sensibilidade ao invento. Os sinais inferiores a 6©0RLUs foram interpretados como níveis de fundo típicos.
Tabela /» i£feito da KNAse H na Sensibilidade da Amplificação Incluindo o Processo Preliminar II* f-------------- " Γ ...... {Alvo RNAse H HLUs no 1 empo (horas) ] í(moles) 1......................... (Unidades) 0 ----------— 1 2 3 ! 0 — 478 7659 28716 — 60443 j lKie'“lS {IhísT1'7' 0 44© 946 13332 36Θ39 0 413 581 10Θ63 41415 | islô"a 0 406 424 717 452® í 9 !„.......... 0 - _____________________________________ 455 376 579 2075 1 - í R 3 i κ :10 ·-'"· 2 : 419 2©7 Í1 5Θ389 ......— 64073 !ÍKÍ0"'19 2 411 6831 21312 29818 j !. ...... 2 ______ 42© „ 6Θ4 1281 1375
fc;i.S.TOlQ 8
Efeito da DMA Exógeno
Foi demonstrado qus a adição de DMA exógeno pode inibir siqnificativamente este sistema as amplificação sutocaialitico» Para demonstrar melhor o beneficio da adiçlo de RNAse H exógena» prepararam—se reacçoes de amplificação com ou sem 2 ugde DNA de timo de vitela para demonstrar esta inibição» Em reacçSes com o DNA de timo de vitela» empregaram-ss duas concentrações de transcriptase reversa para testar se a adição de mais RNAse H de hHV ultrapassaria a inibição» Também foi adicionada a RNAse H de E» csli a algumas das reacçSes pela mesma razão» As reacçSes diferem das reacçSes convencionais por a concentração de cada um dos ribcnucleotídsos terem aumentado para 2 »5 míi e a concentração de cloreto de nsagnés:Lo ter aumentado para 1258 mil» As reacçSes foram preparadas usando 1ΦΘ amoi de i¥IÍ3LC~) coma alvo e T7pro(4-) s T7pro<-)» Após desnaturação dois minutos a 95 WC» as reacçSes foram arrefecidas s adicionou-se 13 ou 39 Unidades de transerip— tase reversa e as reacçSes foram incubadas 12 minutos a 37~C» As reacçSes foram novamente desnaturadas a 95“C e arrefecidas antes da adição de 13 ou 39 Unidades de transcriptase reversa? 1Θ® ou 3Φ® unidades de RNA-polimerasa de T7 e ® ou 2 unidades de RNAse H de E» coli» Após incubação uma hora a 37“C» testou-se 1® μΐ de recção usando o ensaio de hibridação» Os resultados apresentados na Tabela 8 mostram que o DNA de time? de vitela inibiu, a reacção em 9®% por comparação com um sistema de reacção sem DNA exógeno e que a transcriptase reversa adicional (s a sua RNAse H associada) não afectam signiíicativamsnte a amplificação do produto» A atíxçao cia mais RNA—μα!imersas de T7 não tem um efeito significativo no rendimento do produto5 tendo sido um aumento pequeno relativamente ao obtido com a adição de RNAse H exógena» Não sé
foi eliminada a inibição como a amplificação foi aumentada cerca de cinco vssss relativamente à reacção sem DMA de timo de vitela e RNAse H de E. coli^ Os sinais observados com a quantidade mais elevada de RNAse H de E„ coliforam seturantes para a quantidade de sonda usada no ensaio de hihridação* Para quantificar com precisão estas amestrass será necessário a diluição do produto amplificado antes do ensaio„
Tabela 8» Efeito da RNAse H na Inibição da Amplificação por DNA
Exógeno Transcriptass RNA-polimerase RNAse H de DNA DNA Unidades Reversa de 17 ...... 0 u ui Alvo Exógeno de Lus íUnidades) (Unidades) (Unidades) íamcl) (pg) Relativas 13 10© 0 0 0 458 1 -3 100 0 100 © 55305 13 100 0 10Θ 2 30Θ3 39 100 0 100 V 2786 13 300 0 100 2 5434 39 P00 0 10© 2 6B31 13 100 4 100 2 278666 Λ *3 300 4 10© 2 359101 39 300 4 100 2 375043 1,1,11 ç.êS.jo......pelQ....Mt,a,do......geral.
Este sistema não requere uma transcrição inicial s desnaturação| fas-se um DMA complementar do alvo a □ alvo original è removido por uma RNAse H. 0 DNA pode então ser emparelhado cdo um segundo iniciador ou promotor-iniciador a através da sintsse de DNA produzir ucu molde para a RNA-polImerase» Se a RNAse H nSo estiver activaP o híbrido RNAsDNA produzido primeiro terminará a reacçlei sém produzir um molde para a RNA-palimerase» Numa tentativa para demonstrar o método deste invento* um plasmí-deo contendo um promotor para uma RNA-ροΙimerase a o ácida nucleico alvo foi usado para produzir grandes quantidades de RNA de cadeia simples contendo a sequfncia alvo dentro de outra sequtncia» Prepararam-se também duas reacções semelhantes;; uma contando o plasfaidao sem a RNA-ραΙimerase e a outra com a RNA—po— 1imerase sem d plasmideo* Diluições de cada uma destas reacçSss foram testadas para se quantificar os produtos» Diluições equivalentes das tr@s rsacções foram usadas para preparar reacçSss de amplifieaçSo contendo os dois promotores T7proí*) e T7pro<-)= A reacçSo 1 da Tabela 9 continha è® amol de RNA e ®»6 amol do plasmideo de partida» A reacçSo 2 continha ®*é amol do plasmideo de partida mas sem RNA» A reacçSo 3 nSo continha alvo» As reacçSss nao foram desnaturadas a 95^0§ em vez disto adicionou-ss transcriptase reversa e RNA-polimerase de T7 e a reacçSo foi incubada a 37*C durante quatro horas» Retiraram—se amostras de hora a hora para testar mais tarde pelo método de hibridaçlo» Como se mostra na Tabela 9* a reacçSo contendo o plasmideo e o RNA produzido a partir do plasmideo deu grandes sinais de hibri-daçáop a reacção contendo o plasmideo sozinho produziu bastante procLuco pois a KíMft—polimerase de i7 pode produzir RNA a partir do plasmideo que pode erstSo ssr utilizado de acordo com o Método Sarai para produzir mais ácido rmclaico da ambos os sentidos? s finalmante5 a testemunha (ReacçSo 3) nlo contenda alvo nio produziu nada»
Tabela 9= Cinéticas de Reacçlo do Processo Preliminar IV»
Tssipo Raacção 1 3 1 Cf í horas) RLUs para a Son da (4·) RLUs para a Sondai·-) ·— 9695 189® 886 7979 1Ô74 434 Λ 22266 2819 824 1501B 1487 491 4 33863 4571 828 1654© 231© 556 Rxn ls plasmideo mais RNA.
Rxn 2?. plasmideo» κκη 3s sem alvo»
Exemplo 1θ
Amplificação pelo Método Sarai fi experiência que se segue foi feita para determinar se sao possíveis outros métodos de iniciação para o invento que possam minimizar a necessidade do passo de extensão do primeiro iniciador e d passo de desnaturação para alvos de DMA sem extremos definidos. Nesta experiência5 as quantidades estabelecidas de alvo sSo aiifpiifiçadas com ou sem o primeiro passo de transcripta-se reversa como indicado na Tabela I®. 0 tempo de amplificação uma vec todas as encimas adicionadas foi de quatro horas. 0 alvo usado foi o diluído em soro fisiológico normal. Usaram-ss T7proí-i-> s T7proí->. A 25 μΐ de cada diluição adicionou-se 25 μ! de N KOH. As amostras foram incubadas dec minutos a 98°C e depois arrefecidas. Cada uma das amostras foi levada até 1Θ© μΐ e concentrações finais ds 5® mH de base Iricma5 4® mM de ácido glutlmicoj Ξ5 mrl de hidróxido de potássio^ 1258 mH ds cloreto ds magnésio.; 5 mri ds ditiotreitol,, 2mM ds tri-hidrocloreto de sspermitíina. triíosfatos ds ribonucleotídeos 2,5 mrl cada. trifosfates cie desoxirribonucleotideo &r,2 mSí cada e iniciadores Θ32Ξ μΗ cada. Aos tubos de Protocolo Padrlo? adicionou—se 13 U da trans-criptase reversa s as rsacçSss foram incubadas 12 minutos a 42°C. depois dois minutos a 95°C e arrefecidas. Em seguida adicionou-se a todos tubos 13 U de transcriptase reversa5 1ΦΘ11 de RMA-polime-rase de T7 e ®55U de RNAse H. As reacçSes foram então incubadas durante quatro horas a 37°C e testou—se amostras de ΙΘμι usando o ensaio de sondas quimiolLiminascentes. Os resultados apresentados na ladeia 1$ mostram evidência de alguma amplificação usando o protocolo abreviado. E se bem que o nível de amplificação observado fosse significativaments inferior ao do Protocolo Padrão.; esto pode ainda ser desenvolvido para ser mais eficaz ou pode ser útil nos casos em estjam presentes níveis significativos de ácido nueleieo alvo.
Tabela 10, Amplificação sem Extensão do Primeiro......Iniciador AI vo Moles Protocolo RLLls 1113(4-) 3sBE-17 Padrão 2295451 35 3,83-19 Ss 2374443 ! 3 5 BE-21 ;; 230227 Negativo €> 51 3=0-5 / r!Í3B) 33BE-17 Abreviado 24/55/4 ;« 3 s8E—19 í! 27209 5Í 3sBE-21 53 17144 Negativo © =: 1Ó79 ft explicação provável para estes resultados é que a RNA-ραΙimerass de T7 não é totalmsnte específica, Existe um nível baixo de síntese de RNft ao caso que gera números pequenos de cópias de RNfi tías regiSes alvo. Estas cópias são amplifiçadas pelo método padrão. 0 nossa trabalha inicial demonstrou excelente amplificação com certas séries de iniciadores e alvos sem a adiçSo de RNAse H exógena* 0 nossa trabalho subsequente clarificando o mecanismo da reacção tornou possível aplicar sficasmenis o método a uam variedade roais larga de alvos» Divulgamos a reivindicamos aqui métodos que usam RNAse H exógena na amplificação s os qus se baseiam na actividade de RNAse H associada á transcrip-tase reversa»
Descobrimos que a RNAse de E» coll nlo deve por rotina ser adicionada pois nem sempre melhora a amplificação» Determinámos que algumas formas da RNAse H são especificas de sequências nos pontos em qus cortam o RNA dos híbridos RNAsDNA. Na reacção de amplificação5 não detestámos o iniciador contendo promotor no DMA produto de tamanho completo» Nas realizações que utilizam dois promotores-iniciadores5 apenas um dos promotores-iniciadores s incorporado da modo detsclável em DMA produto da tamanho completo» Todos os outros mecanismos que foram postulados pelos familiarizados com a matéria5 mostram o DMA produto de tamanho completo contendo ambos os iniciadores» Nós atribuímos estes resultados a hipótese de a RNAse H não degradar tatalmente a espécie principal de RNA sintetizado durante a amplificação» Com Bsse nestes resultados? estabeleceu—ssum novo mecanismo ds amplificação qus engloba os nossos resultadas relativos á especificidade de sequências da RNAse H» São aqui descritos novos critérios úteis para projsctar proinotor-iniciadores» Ainda» reivindicamos novos métodos para a síntese de múltiplas cópias de uma sequfncia e ácido nucleico alvo» caracterizados por 1/ selecçSo de um iniciador» complementar de uma fraeção da sequência de RNA alvo5 o qual se complexa com a fraeção do RNA axvoj a rsterxda fraeção do alvo estando situada tíe tal forma que
após cerínanscs capas da formar produto da sstsnslo de iniciador ser exposta a degradação por uma RNAse H ssleccionadas 2) seiecçSo da um promotor-iniciador complementar da uma tracçãD do DNA a ser obtido por extensão do iniciador* o qual se complexa com o DMA numa área onde substancialmente todo o RIMA complementar è removido do duplex através de degradação da RNAse Ka e 3) combinação do RNA alvo com o iniciador» promotor-iniciador, RNAse H* transcriptase reversa e transcriptase a formação de cópias múltiplas do RNA» Os novos métodos aqui descritos nao tacem um número substancialmente equivalente de cópias de DNA da mesma polaridade (ou «sentido») da sequfncia de RNA alvo,.
Este processo proporciona um método que permite a projscçlo de promotores-iniciadores eficazes e iniciadores para novos sitios alvos= Divulgamos s reivindicamos aqui tais combina-çSss de promotor-iniciador e iniciador e e os critérios para a projecçSo dos mesmos» 0 mecanismo aqui descrito envolve um nova intermediário de reacção para a transcrição de cadeias de RNA» Este intermediário ê um complexo de cadeia dupla de RNA e DNA que contem uma região de promotor de DNA de cadeia dupla» Tanto quanto conhecemos não está descrito na literatura nada como isto» De facto5 nenhum dos sistemas anteriores* especificamentenem o de 8uatei li, J = C= et a!»= 87 PNAS 1874-1878 (1990),, nem o de PCT r’ed« de Pat» NS de Série 88/10315 de Singeras* T„R» et ai»» ssleccionam atíequadamente oa sequ@ncia de iniciador e promotor— -iniciador baseado na localização de sitos de degradação pela RflAss ri» Assim os métodos aqui estabelecidos são novos e não óbvios a partir de qualquer um anteriormente divulgado»
0 reconhecimento da importância da especificidade de sequência cia RNAse H e uma compreensão do mecanismo de reacçlo ê chave para a eficácia da aplicação deste método de amplificação de alvo a uma larga variedade de sequências alvo» Ainda? até agora» os investigadores assunsiram que RSMAse H degrada total s sistemát ic amente a cadeia de RNA de um complexo RNAsDNA. I Q naçanismq.....dos......né todos.,_de......Amaiiiiça&So 0 teste de eficácia de amplificação com os métodos anteriarmente descritos revelou um grande grau da variabilidade na eficácia de amplificação com pequenas alterações nas séries de iniciadores usados» 0 método de reacção geralmente aceite nos trabalhos anteriores não proporciona3 em nosso entender, uma SKpiicação razoável para cs facto de uma série ds iniciadores funcionar muito melhor do que outra= A eficácia da iniciação foi examinada para ver se as diferenças na capacidade para iniciar cadeissera responsável pelas diferenças observadas na eficácia das séries ds iniciadores» Não foi encontrada nenhuma correlação entre a eficácia de iniciação e a amplificação global» A análise das séries ds iniciadores quanta à capacidade para formarem estruturas autocomplementares e estruturas de complementaridade cruz&dã indicou que diferenças na eficácia do iniciador nao podiam ser só atribuídas a estes factores»
Encontrámos também que a adição ds RNAse H de E» coll nao maihora uniformemente a amplificação» Como os resultados aqui submetidos mostram5 os resultados observados variam ds alvo para alvo e ds série de iniciadores para série de iniciadores» A quantidade de RNAse H de E» coli adicionada também é muito importante e deve ser mantido dentro de uma gama estreitamento aeTinida» Com um determinado alvo e uma série ds iniciadoresj a aaiçso as RNAse H de E» coli é útil nalguns casos quando a
transcriptase reversa é a do vírus da ?HÍeIobIastc?ss aviária C ” AI-lV ” > mas nso quando a transeriptase reversa è do vírus da leucémia taurina de Moloney < "ilHLV")« SSo aqui. apresentados resultados ilustrativos destas conclusões..
Trabalho anterior sugeriu que a transcriptase reversa de AríV deixa fragmentos rslativamente grandes quando digere o RNA do híbrido de RNAsDNA formado durante a replicação virai= Estes fragmentos servem como iniciadoras para iniciar a síntese da segunda cadeia de DNA = Descrevemos aqui ds nossos resultados evidenciando a sspecificidads ds sequtneias das actividades ds RMhss h de AMV a de HnLV,
Para elucidar o mecanismo da rsacçSo== iniciadores individuais foram marcados terminal mente com "''"F s a incorporação de cada um dos iniciadores em produtos ds DMA foi examinada por slectroforsss em gel da poliacrilaraida. Os acordo com o mecanismo geralmente aceite, ambos os iniciadores serio incorporados em produtos ds DMA de tamanho completo. As nossas experifnelas mostraram* no entanto* que apenas o iniciador complementar das da principal espécie ds RNA sintetizada durante a amplifleaçâo foi incorporado em produto de tamanho completo» 0 iniciador tendo a mesma polaridade da cadeia de RNA principal nunca foi dstectado Sffl produto de DMA de tamanho completo. De facto* ele permanece muito pequena. Estes resultados foram confirmados com uma série tíe alvos e de iniciadores diferentes» 0 facto de não ss dstectar extensão de um dos iniciadores indicou que um durante a amplificação não se acumulou um DNh intermediário totaImante ds cadeia dupla e não foi necessário para a amplificação autocafalitica, Estas observações indicam um mecanismo para os sistemas de amplificação deste invento que tem
eir« consideração prováveis especificidades de sequências da RNAse H» 0 mecanismo está descrito de um modo generalizado na Fig. 4=
Experimentalmente demonstrou-se que a enzima corta o RMA de um híbrido de RNAsBNA em pedaços específicos. Ainda. a localização dos sitios de corte está em regiões especificas. Para confirmar o mecanismo^ preparou—se um híbrido de RNAsDNA que continha α RNA de cadeia mais que seria gerado a partir do nosso _ 4* »»* ___ alvo i/pro/T/pro e da combinação de séries de iniciadores, u 32 RímA marcado com P foi hibridado com DNA complementars xncupadu com transcri+ptase reversa de AMV (contendo a sua actividade associada de RNAse H) e os produtos de reacção foram analisados por electroforese era gel de poliacrilamida (Figura 5) „ Q tamanho dos fragmentos indicou que foram gerados vários pedaços pequenos s que estes foram produzidos por cortas perto de um ou tís ambos os extremos. A região do interior da molécula nlo foi cortada. Esta experiência demonstra que a enzima tem especificidade estrutural ou de sequência nas condições de reacção usadas» Os resultados foram totalmente consistentes com o mecanismo de reacção da Fig. 4.
Foram realizadas outras experiências para determinar se os cortes ocorrem» έ preferido que ocorram múltiplos sitios de corte na região homóloga do iniciador contendo promotor e não na região de ligação do outro iniciador. Ao marcar-se os extremos do RNA individualmente s analisando os produtos de digestão* encontrou-se que nas condições usadas os cortes foram detectados apenas no extremo te do RNA. Isto é consistente com o mecanismo da Fig. 4.
Idantificaram-se
Realizaram-se experiências de ssquenciação para determinar as sequências em que as actividades de RNAse H do AMV a da transcrxptase reversa do nMLv cortaram.
ssqufncias que foram especificaiuente cortadas por cada uma das enzimas, Conforme previsto, a especificidade de sequência das duas enzimas slo diferentes e pensa-se que isto enplica porque é que algumas séries de iniciadores funcionam melhor com uma enzima e alguns com outra, A especificidade de sequfncia obtida para a enzima do lisiLV nas nossas condições de reacçao não condizem com as da literatura numa outra série de condições de reacçao, indicando que a especificidade pode ser influenciada pelas condições de reacçao* 0 escrutínio do papel da RNAse H no mecanismo de amplificação resultou que a remoção completa do produto de transcrição dirigido pelo promotor da cépia do seu cDímh pode não •ssr necessária ou mesmo dssjâvsl para a formação da um novo molde transericlona1mente activo, Assim, nalgumas aplicações, mesmo um nível muito bai>?o de actividade de RNAse H* derivada da RNAse H intrínseca da transcriptass reversa, será suficiente para a amplificção eficaz se a RNASe H fSr mais selectiva de sitio ao permitir que o promotor-iniciador emparelhe com o produto da primeira cadeia de cDNA ou se interferir menos com o emparelha···· mento do outro iniciador com o produto da transcrição*
Uma vez que a RNAse H de E, coli é menos especifica do que as enzimas retrovirais, ela pode clivar na região a que se liga o iniciador não contendo promotor* especialmente se as concentrações deste iniciador * o alvo, a RNAse H de E, coli © os componentes que afastam a actividade eneimática não forem cuida-dosamsnts equilibrados. No nosso ponto de vista estes resultados cornam xndessjávsí a u.t.xlxzaçao de RNAse H de E, coli em aplicações comerciais, A adição de uma outra actividade de RNAse Hs uma com especxtxcxdadas diferentes, pode ser desejável nos casos em que a RNAse H de transcriptass reversa não corte nas regiões pretendidas ou não corte nas condições adequadas, G trabalho com
a transeriptase reversa de MliLV, por exemplo, mostrou que esta enzima é menos sensível do que a enzima de AMV à inibição pelo DMA da amostras έ a melhor maneira para muitos sistemas»
Projectaram-se novas séries de iniciadores e estsbsle-csrsni-se aqui com base no modelo s na informação da especificidade da RNftse H que obtivemos até à data » Obtivsram-ss sínteses significativastente melhores a partir destas séries de iniciadoras do que se obteve com com as anteriormenie projeciadas sem conhecimento do mecanismo s das especif ic idades de ssqui'ncias.0 invento aqui descrito torna possível projectar séries de iniciadores funcionais para regiões de alvos específicos. 0 novo mecanismo que descobrimos envolve um novo intermediária de reacçSo para a transcrição de cadeias tís RNA. Este intermediário é um compleKO de cadeia dupla de RNA e DMA que também contem uma região de promotor da DMA de cadeia dupla, Tanto quanto sabemos a reacção é diferente de qualquer uma anteriorraente descrita»
Uma compreensão do mecanismo de reacçlo é crítico para a utilização destes processos de amplificação de alvos» 0 reconhecimento da importância da especificidade de sequfncia da RNAss H é chave para a aplicação eficaz deste método de amplificação de alvo numa variedade de sequências alvo» Por outro lado» a abordagem empírica à projecção de de promotores-iniciadores é muito intensiva, dispendiosa e tem uma frequência baixa de sucesso» tornando este invento um avanço útil na matéria, A« Sarna ustrsita da Actlvidads para a Concentração de.RNAse.Jj 0 sistema de amplificaçSo com RNAss H de E, coli inicialmente foi considerado como sendo a realização preferida devido a ter-se conseguido uma maior sintese com o alvo e série de iniciadores a serem estudados e a RNAss H de L_coli mostrou- -se útil para ajudar a ultrapassar a inibição pelo DMA da amostra π Na entanto5 a análise da reacçlo indica que a adição de RNAss H tís E.-.- csli é prejudicial à amplificação em muitos casos. Ainda5 as quantidades de RNAss H de E, coli adicionadas devem ser cuidadosamente controladas numa gama estreita uma vez que a presença da demasiado muito ou demasiado pouco é prejudicial. Para a aplicação prática comercial isto é uma desvantagemimpor— tanis, sspecialmsnts se a enzima não far estável ao armazenamento, Em adição, a utilização de RNAse H aumenta significativamente os custos s a complexidade do sistema, 0 custo pode ser proibitivo para muitas aplicações comerciais, A utilização de RNAse H de ENcoli torna o ensaio msis complexo, o que por sua vez aumenta as custos de investigação e de desenvolvimentos pode tornar o ensaio muito delicado para uma aplicação comercial alargada. Assim, a nossa elucidação do mecanismo de ensaio resultou em métodos para uma gama mais larga da aplicações em termos técnicos íaplicabili— dade a sitíos alvo) sendo ao mesmo tempo um processo mais barato ® mais robusto. Uma vez que a adição de RNAse H ds £, coli resultou numa maior amplificação nas experiências iniciais, sxaminou—se em várias experiências o efeito da RNAse H ds E,__çol_i na eficácia do sistema de amplificação em amostras contendo soro ou DMA humano,
Í£SÍD£Ío_JJL uptimlgaclg da......
Raalisaras-se experiências para determinar a quantidade de RNftse H de E= coli necessária para a amplificação em soro» A experiência qua se segue comparou a amplificação com o par de iniciadores T7pro‘/T7pro na presença de Θ?25? ®55 e 1 U de RNftse H por ensaio» 7estou~se HBV + plasma diluido para níveis apresentados em HBV - soro humano ou HBV - soro»
Adicionou-se úez μΐ de soro a um volume igual de KOH iM s cobriu-se com uma camada da 'óleo para evitar a evaporação» Misturaram-se as amostras* aqueceram-se a 95°C e deixaram-se arrefecer até â temperatura ambiente» As amostras foram levada saté 9Θ μΐ de volume de reacção com uma concentração final de 5Θ mH Tris acetato pH 7sòs 28»8 mM liqCl„5 5 mH ditiotreitol 5 Ξ mli hidroclorsto de espermidina» 0,15 μΜ de cada um dos iniciadores., ó525 mM STP, ó525 ®M ATP, 2s5mM UTP5 2,5 mn CTPS dTTP? dATP, tíSTPs dCTP» a,2 mM cada, e 13 U de transcriptase reversa de AMV» As amostras foram misturadas e aquecidas a 37°C durante 12 minutos,; depois aquecidas até 95 °C e arrefecidas até à temperatura ambiente» Adicionou-se trese unidades de RT e 1ΘΘ U de RNA-po-limerass de T7 s as reacçSss foram incubadas durante três horas a 37°C» Testou-se vinte cinco μΐ de cada uma das reacçSes»
Os resultados mostram que existe uma gama estreita de concentrações óptimas de RNAse H de E„ coli centrada á volta de 0,2o U de KMAse H de E» coli por reacção para este sistema» Apesar da HNAse H de E» coli ser díficil de usar» nesta experiência fox benéfico adicionar alguma actividade da RNAse H» Iígíss de Alvo 5 10-"20 5 ;; 10 5 10 0 RNAse H (Unidades) 0 RL.U observado 567809 18041 2938 1634 5 ;i 10 5 ;r 1Q~H 5 x 1Θ © .j -vSí 10 " 5 k -~V 10 “ L"“ -73 10 — 0 nr . . -20 10 3 X -?v 10 5 x 10 "23 Θ 1153366 732109 5566 1423 1Θ01904 29596 1793 1898 610485 13Θ26 4062 1662 fe>íefHSlO-.!£
Em seguida determinou-se a quantidade de RMAse H de E. cali necessária para a amplificação óptima de um para de iniciadores de HlV5 na presença ou na ausência de um lisado contendo 8 μπ de DMA humano» Em cada uma das reacçSes estava presente 2 x _ i o _ 10 moles de alvo virai» 0 oNA alvo foi misturado com 50 pmol de cada um dos iniciadores em 40 mH Tris HCI pH 8„35 25 mH NaCl» 20 SB mfi HgCl^j 5 míi ditioireiiol» 2mn hidrocloreto de espermidina e irifosfatos tíe nucleotideo como descrito para a Tabela 11» aquecido até 95 °C e arrefecido até à temperatura ambiente» Adicionou-se treze unidades de transcripiase reversa de AHv e a reacçiofoi aquecida a 42°C durante 12 minutos» até 95 °C e arrefecida novamente até á temperatura ambiente» Adicionou-se treze unidades de transcriptass reversa s 10® unidades de de EMA-ooli-merase de T7 e as reacçSes foram aquecidas a 37°C durante 335 noras antes do ensaio»
Lisado RNAse. H RLU ~ e U 8 400 - 0 S 5 239 000 - t50 468 000 - 1,5 498 ©0Θ - 2 = 0 439 00Θ - 3 5 Θ 20 10© - 4.Θ s 806 ... Θ i 667 •1- 924 -Ϊ- 1,® ò 635 1,5 579 *í' 2S0 13 40© -i- 3 = 0 1.7 80β 4,0 9 152 Estes resultados ilustram que os níveis de HNAss çL__çaLL devem ssr cuidadosamente controlados uma vez que demasiada RNAss H de E = coli pode ser prejudicial para a amplificaçao = Ainda= a concentração óptima foi alterada pela presença de DMA humana inespecífico s a inibição por DMA humana foi siqnificsti-va em todos os níveis de RNAse H*
Estudámos o efeito de RNAse H de E. coli na ampiifica~ ção ds uma segunda região referida como região 2 da HIV. Os resultados que se seguem demonstram que RNAse H de E. coli aumenta a amplificaçao dentro de uma gama ds concentraçSss estreita. Os iniciadores da região 2 de HIV foram amplificados coma descrito na Tabela 12 na presença ds diferentes concentrações de RNAse H de E, coli. Testou-se dez microlitros ds cada uma das reacçSes e fizeram-se diluições quando necessário. Os sinais foram comparados com uma curva padrão para determinar a quantidade ds alva feito. RNAse H pmole de alvo pmole de produto Amplificação observada .... 0 0 0 — 1,87 X 1Θ"10 2,14 1,3 X 1010 ' S 2 L! 1,67 x 10”1® 0,17 1,0 X 109 0.4 U 1,67 X 1Φ”1® 0,18 1,1 X 109 1,2 U Í,è7 X 1%Γ10 0.012 7 9 6 X i©/ lsô7 X Í0“tí lé50 9,6 X 10B />; Js ·*_ U 1,67 X lô“d 20.Ò 1,2 X 109 ®,4 U 1,87 X lô'”B Θ. 14 8,5 X 10a 1,2 u 1:: 67 K iô"8 0.15 9,0 X 10a
Estes resultados mostram que a amplificação pode ser conseguida sem a adição ds RNAse H de E. coli- ao contrario do defendido por Buatelli, st al„* 87 PNfiS 1874-ÍB7B»
Estudámos a utilisaçao de RNAse H de E»___coli com transcriptase reversa de MnLv sai várias regiões alvo» As reacções decorreram na presença ou auslncia de 8 μα de DNA humano usando as condições descritas no Exemplo 125 com um passo de autocatáli-se de 3 horas» Testaram-se as séries de iniciadores das regiões 1s 3 a 4 do HIV. Seleceionou-se a quantidade de molde virai usada para dar RLU na gama linear do ensaio de hibridaçSo* Usou-se transcriptase reversa de HHLV a 4®® U durante a iniciação* 80& U para a amplificaçSo» 4©€> U de RNA—polimerass de T7 foram incluídas s 1 U de RNAse H de E» coli foi adicionado como indicado» Os valores apresentados nas cabeças das colunas5 -HxNAss Hs -RNAse H=, são RLUs obtidos do ensaio de 1® μΐ das reacçõas»
Tabela 1; vr .J Região Moles de Alvo DNA humano a-RNAss H -KNAse ! Região 1 as HIV •—t X 1®~21 - 54 9Θ® 137 ®0® Região 1 de HIV X 8 m 15 10® 13 800 Regiao ó rfs HIV Ά X i®"20 — 98 10® 391 0©® Região ·.»* de HIV *"> X l®-··20 8 m 124 ®0® 246 0©@ Região 4 de HIV X i® -1 - 2® 4Θ® 1®7 0©0 -21 Região 4 de HIV λ .£ X 1® “ 8 m 5ó ®0® 8 80®
Na presença de DNAS a RNAse H de E» coli aparentemente estimulou a amplificação dirigida pelos iniciadores da região 4 de HIV» Na maior parta dos casos que testámos a amplificação usando transcriptase reversa de flilLv sósinha é pelo menos tio boa quanto quanto a transcriptase reversa de nrlLv usada juntaments com RNAse H ds E» coli» A RNAse H de E» coli não é necessária para uma amplxficaçSo eficac ao contrário da opinião da Guatslli» et al»9 37 PMA3 1374-1878»
Especificidade dg _segufncias da tr5nscristaig__rgvsrga
Também descobrimos que algumas séries de iniciadores funcionam melhor com transcriptase reversa de Al-iV enquanto outros funcionam melhor com transcriptase reversa de MMLV ou com uma das transcriptases reversas conjuntamente com RMAss H de E._coli.» 0 grau de variabilidade observado na eficácia de amplificação com pequenas variçSes nos promotores-iniciadores e iniciadores ou fonte de RNAse H apoia o mecanismo que propomos» Descrevemos a seguir os nossos resultados detalhados que apoiam estes dados» A transcriptase reversa de HHLv foi clonada e pode ser adquirida comercia1rosnte á BRL <Bethesda Research Labs»)» U = S» Biochsmicals e outros numa forma muito concentrada (roais de 30® unidades por μΐ)» Deve-se notar que se obtém actividade sintética ds DImh comparável em moldes de ácido nucleico natural concentrações de unidades aproKimadamente 1® vezes superiores de transcriptase reversa comparado com transcriptase reversa de AMV» A ausfncia de comparação em actividade ds unidades é devido ao facto de as enzimas apresentarem actividades relativas diferentes quando testadas com moldes homopolimêricos (usados no ensaio de de actividade de unidades) e com moldes ds ácidos nucleicos hsieropoliroéricos. Testámos a utilização ds transcriptase reversa tís flnLVsm vários níveis nas nossas reacçSss de amplificação» Exemplos destes resultados estão apresentados nas tabelas abaixes» Nas amostras de transcriptase reversa de AMV? a transcriptase reversa foi usada a 14 U durante o passa de iniciação e 5és li durante o passo de amplificação» A quantidade de transcriptase reversa da ilHLV foi titulada para os passas de iniciação s de amplificação. As condições de incubação usadas foram as descritas para o Exemplo 12 sxceptuando ter—se usado 15 pmal ds cada um dos iniciadores cia região 2 do HIV e 23 mM KC1 ter substituído NaCl» Usou-se polimsrase de T7 a 40® U durante a amplificação» A tabela que se segue mostra a eficácia na ausfncia ou na presença de 8 μα de DNft humano» As colunas encabeçadas com a designação de AMV ou MMLV mostram os resultados das amplificaçSes afectuadas com trsnscríptase reversa de Afw ou com transcripfcase reversa de MMLV5 respectivarnente« Os números referem-se ao número de unidades usadas durante a iniciação e a autocatálise, respec tivarnente* Os valores contidos na Tabela sSo RLUs» Note—se que nlo foram sfestuadas diluições dos produtos de amplificação e os valores >2®0 000 RLU podem significativarnente subestimar o grau de amplificação uma vez que a saturação do sinal ocorre a um nível de hibridação do alvo suficiente para dar cerca de 250©©© RLU nas condições usadas» DNA Anv MMLV MMLV MMLV Moles de Alvo humana 14/56 40Θ/4Θ0 400/Ó00 400/800 © - 495 47Θ .... 3 B00 _ 1,6 κ 1Θ ^ ... 278 0Θ0 77 ©Θ© - 5 60Θ -20 l?ó X 10 292 00® 27B ©©Θ “ 269 ©©Θ 474 547 488 1 352 1,6 jt 1¾ 10 200 62 70© 205 000 149 Θ00
Se bem que a sensibilidade da amplificação dirigida pela transcriptase rsvrssa de rllILv na austncia de DMA humano fosse sensivelmente mais baixa do que a amplificação dirigida por ARv? o MMLV foi muito mais eficaz na presença de DMA exógeno*
Após observação do alto nível de amplificação da região 2 do hiv* testámos as outras regiões alvo na presença de DMA humano e encontrámos que usando transcriptase reversa» RNAss H de £Ls____SíMi sinos era necessária para a amplif icação mais eficaz nessas regiões» Lm seguida testámos cada uma das rsqiSes alva usando transcriptase reversa de MMLV* sem RNAss H de E, coli- para comparar a eficácia com reacções contendo transcriptase reversa de AMV *· RNfise H de E» coli» Um exemplo destes resultados para duas regiões alva está apresentado na Tabela abaiKQ» Os iniciadores para as regiões 3 e 4 de HIV foram usados <3® pmol por raacçSo) coma descrita na Exemplo 12« Nas rsacçõss que utilizam iransriptase reversa de AMV, usou-se 14 U na iniciação, 5à U de transcriptase reversa * 1 U de RMftse H de E« coli foi adicionado para a amplificação» Nas rsacçõss em que se usou transcriptase reversa de MMLV, adicionou-se 4Θ® U na iniciação e ΒΦΘ U na amplificação» Todas as reacções continham 400 U de ENft-palimerass de T7 durante as quatro horas do período de incubaçaõ da amplificação» Os valores dentro das tabelas são RLU obtidos da Ensaio de Protecção Homogénea efectuado usando 1Θ μΐ das reacções de amplificação» Nalguns casos foram efectuadas diluições das reacções antes do ensaio» tabela 1/ DNA Região 3 de Hi. V Região 4 de HIV Moles de alvo humano AMU MMLV AMV MMLV 0 ... 2 ®49 751 1 184 777 ί,ώ X I©“21 — 7® a®® 689 2»1 x 107 305 00© 1,6 x i®“20 - 51© ©0® 1 869 - - 0 4- SSí 40© 1 ®58 1 182 1 ,6 -PI X 10 — -r - .... 13 90Θ 16 20® M: X 10"20 -l· 7©6 I 862 141 ®0© 154 000 i,ó X i0~19 "h - - 683 ®00 723 00© 1,6 X í©~18 10 80© 115 ©00 —
Conforme observado na região 2 de HIV, na ausência de UíW-i humano» a amplificação com MMLV é significativamente menos do que com transcriptase reversa de AMV + RNfise H mas na presença da DNfi a amplificação dirigida par MiiLv é pela menos iSa boa cama a conseguida pala transeriptase reversa de Ariv * RWftse H = 42
Exemplo 14
Iniciadores para a segunda região do senoaa de HBV
Efsctuou-ss a experiência que se segue com séries de iniciadoras dirigidos contra duas regiões do genama de HBV* Os resultados mostram que as séries de iniciadores não amplificam no mesmo grau com AMV RT» A eKperitncia foi efectuada como descrito no Exempla 11 usando plasma HBV positiva diluída em soro negativo» Be2 micro!itros da reacçao de amplificação foram testados no ensaio de hibridaçSo» no 1 es de alvo sabela RLU Regilo 1 18 observado Região 2 45e K 4 ;; S K -71 1© ·'-·· 10 475 849 89® 674 73 114 4 U '< 10 242 452 4 193 0 1 417 1 94®
Estes resultados foram confirmados por experiências adicionais usando protocolos convencionais» Os iniciadores da região 1 deram consistentemente RLU mais altos nestas experiências»
Pelo contrário» quando 8©®U da enzima MMLV foram usadas para amplificar os mesmos dois pares de iniciadores, observou—se o efeito oposto como se mostra a seguir»
Males 9,6 55 de 10 alvo ”20 9*6 η 1Θ Θ
Tabela 19 RLU observado Região 1 37 278 1 858 1 010
Região 2 1 067 95! 4Θ 82 è 1 646
Mesta experiências cada uma reacçSss continha b μΐ de soro,
Assim* o potencial de amplificaçlo de cada um dos pares de iniciadores foi influenciado pela transeriptase reversa presente durante a amplificação, Factores tais como a disponibilidade das sequências* capacidade dos iniciadores para hibridar especificamente e eficácia da síntese de RNA não deverãc? ser afectados significativamente pelo tipo de transcríptase reversa presente, Factores tais como sspecificidade de RNAse H e activi— dada s ds polisnarisação de DMA poderio ser afectados.
Os dados que se seguem ilustram que as combinações de promotor-iniciador usadas nas condições adequadas podem ser destinadas ao aumento da amplificação. tabela vi
Esta SHperifncia foi sfectuada com os iniciadoras da rsgilo 2 do HBV como descrito para a Tabela íí exceptuando tsr~-ss analisado toda a reacçao ds ampiiticarSo por hibridaçMo»
Moléculas alvo Moles de alvo RLU observado 12©0 n X 10 ** 1 094 177 12© 2 X . -“22 1© 44Ξ 137 12 o X 10 “ 24 ©53 1,2 2 X 1©“24 8 654 © 0 1 828 felllJ]]ÊÍ52_15
Spaparecto da transcriptase reversa__ds_AHV__e,.d.a__transcriptase reversa de nni-v A experitncia que se segue comparou a amplificarão de iniciadores para um dos principais pontos de quebra de transioca-;;So crmossómica humana BCL-2 t(14 = iSJencontrado em pacientas com CML usando MMLV <30© unidades) ou AMV <39 unidades)= Q efeito da ElMftss H ds E= coli foi avaliado com cada uma das enzimas» As amplificaçSes foram efectuadas como descrito na Exempla 12 exceptuanda ter-se usado 24 mH SigCl„ e 5© omol de cada um das iniciadores» Mas reacções contendo lisado, esteve presente 4 μπ de DMA ds células brancas do sangu= Todas as rsacçõss continham 3©® unidades de RNA-polimerase de T7 ei© amo! de DNA alvo de cadeia dupla adicionado»
Tabela 22 RT Lisado 0 Unidades de RNAse H 0S5 Unidades de RNAse H 1,0 Unidades 2„0 Unidades de RNASs H de RNAse H AHV 108 018 44 485 2 035 377 204 894 165 972 136 647 MML.V •'Γ 3 015 948 3 #70 136 2 224 666 2 714 257 767 218 105 845
Os resultados mostram que ΚΪ rirlLV e AilV não amplificam no mesmo grau esta série de iniciadores,; particularmente na susãncis da RNAse H de £= coli,, A adição de RNAse H de E, coli às reacções contando trsnscripiass reversa de Aliv melhorou marcadamsnte a amplificação; isto indica que a activídade de RNAse H foi limi- tante nesta rsscçlo= Pelo contrário; RNAse H de E_,__cali nSa aumentou a amplificação quando adicionada a reacçSes contendo RT NríLv* Os resultados também com firmam a capacidade de 111TLV RT para sustentar uma amplificação significativa na presença de grandes quantidades de DNA humano inespecifico-. C„ Um iniciador não foi incorporado no produto de tamanho E2i£lMa
Uma das nossas descobertas mais importantes â que o iniciador da mesma polaridade da principal espécie de RNA não é incorporado de modo detestável no DNA produto de tamanho completo» rara demonstrar isto5 iniciadores individuais foram marcados •Cf *“7 terminalmente com '"'"P e a incorporação de cada um dos iniciadoras nos DNAs produtos foi examinado por electroforese em gel de pol xacrx lamxda,, inxcxaímente esperávamos que ambos os iniciadores fossem incorporados nos produtos de dNA de tamanho completo,. Mo entanto,; não tox observado o iniciador contendo o promotor em
produtos de DMA de tamanho completo. De tactcss ele permaneceu muito pequeno- Estes resultados foram confirmados com uma série de alvos e iniciadores diferentes- 0 nosso método está explicado soaikq a rara identificar a espécie de ci/NA acumulado durante a T'7·* autocatálise5 os iniciadores foram marcados com ’"""K no extremo 5? com polinucleotideo-cinase de T4 s incluídas em reacçSss de amplificação- Os exemplos que se sequem mostram que o CDNA tíe uma polaridade é preferencia1mente acumulado durante a amplificação e que a cadeia acumulada é sempre complementar da espécie de RNA predominante sintetizada durante a autocatálise- A Figura 5 mostra o resultado da incorporação de iniciadores da região 2 de HXV marcados com Pdurante a amplificação- hsta série de incia-dores resulta na síntese de um RNA de 214 pares de bases de sentido (*>- 0 iniciador complementar do RNA foi incorporado em duas bandas principais de 235 s 214 bases quando estãp presentes esquineias alvo (faixa 3)- Nso foram observados fragmentos de tamanha campista na ausência ds alvo <faixa 4)- O fragmento ds 214 bases representa cDNA do mesmo tamanho do RNA enquanto que o fragmento ds 235 bases tem o mesmo tamanho do RNA ·»· 21 bases da sequência do promotor T7 = Pelo contrário- o promotor-iniciador não foi observado em produto ds DNA ds tamanho completo na presença ou ausência de alvo (faixas i e 2. rsspsctivamente>-
As faixas 5-8 da Figura 5 mostram α resultado da incorporação de iniciadores da região 1 de HBV marcados com ~'~P durrani© a amplificação. Estes são conhecidos como T7pro··?· e T7oro--=; Esta série ds iniciadores é capaz de produzir RNA de 132 bases de duas polaridades mas predomina RNA de cadeia í-H 3 77pro™5 ps é complementar do RNA predominante* foi. incorporado nos fragmentos de 132 bases e 153 bases consistente com o nosso mecanismo proposto (faixa 7 alvo (h-)5 faixa 8 alvo (-))= 0
fragmento de 153 bases tem α mesmo comprimento do RHn -*· 21. bases
da ssqu@ncia do promotor de T7 do T7pro-K Pelo contrário, o __ 7JO iniciador ds '! /pro·*· marcado com ”“P nSo foi incorporadto em fragmentos de ambos os comprimentos <faixa 5 alvoC-r>5 faixa 6 a 1 vo (·“); =
As reacçSes analisadas por electroforese sm gsl foram também analisadas por HPA para determinar se se podia tíeieciar oDMA da mesma polaridade do RMA predominante por um outro método, fts sondas de cadeias mais e menos foram usadas para determinar a proporção relativa das cadeias feitas e uma frscçSo da cada uma das reacçSes foi tratada com RNAse A para determinar a proporção de RWh rslativamente à de DMA, Os resultados estão descritos em baixo.
Tabela 23 Polaridade da sonda série de iniciadores RLU RLU tíem tratamento RNAss A tReqião ~ de Hl v 679 1B2 I®37 SRegiSo de HIV 453 675 1464 Região dS :> X 32 92Ξ 1 ®94 249 §Regiãa 2 da HIV 39 494 655 595 sRsgilo 1 ds HBV 567 li® 4 854 Região 1 ds HBV 67 i 656 4 21© $Rsgião 1 de HBV 56 55® 3©3 16® Regilo 1 de HBV 77 983 45® 33Ξ (-> ;2 Ps outross cadeia $ = cadeia <*·> ds iniciador marcado com ds iniciador maracado com '"'‘"P»
Estes resultados mostram que a amplificação funcionou bem, mesmo quando não se observou produto de tamanho completo com o promo™ toriniciador» Estes resultados estão ds acordo com d observado no estudo anteriors ou sejas a maior parte do sinal observado com uma sonda ds um sentido é de RNA e o sinal da cadeia complementar é coma se esperava de DNA= Isto é verdadeiro mesmo para a série ds iniciadores da região 1 de HBv que deverá ter feito RMA ds ambas as polaridades» D» yonfirmacão do mecanismo mostrando que a encima corta KMA do háã^MS-MBZMÊ-JÊm-MÂties__.essec i f 1 c c?s
Com base nas experiências e observações aqui descritas, na Fig» 4 está descrito o mecanismo para os sistemas de amplificação que tem em consideração especificidades de sequências prováveis na KiMAse fi» Para apoiar este mecanismo? uma vsc que a esoecificidade de sequência tíe RNAse H ê o elemento cnave5 s necessário mostrar que de facto as encimas corta® d RMA as um híbrido de RNAèDShíh em sities específicos, Aindas as localicaçBes dos sítios de corte necessitam de ser em regiões especificas de acordo com d modelo de modo a ser obtida uma boa amplificacão,
Para examinar esta questão* preparou-se um híbrido de RNAsDNA que continha o RNA que seria gerado a partir de uma combinação da 30 _ alvo s série de iniciadores conhecida, 0 KNA ιοί marcado com “κ5 incubado com transcriptase reversa de AMV (contendo a sua activi-dade de RNAse H associada) e os produtos de reacção taram analisados por electroforese em gel de poliacrilamida» Os resultados foram totalmente consistentes com o novo mecanismo de reacçãos nomeadamen te * o tamanho do fragmento indicou que foram gerados pequenos pedaços s que estes foram produzidos por cortes perto da um ou de ambos os extremos» A região interna da molécula não foi cortada, Esta experiência confirmou que a encima tem especifici-dade de sequência ou estrutural nas condições de reaeção usadas.
Foram efectuadas outras experiências para determinar onde ocorriam os cortes uma vez que o mecanismo prposto requere que ocorram múltiplos cortes na região de ligação tío iniciador contendo promotor» Através da marcação dos extremos do RNA individualmente s analisando os produtos de digestão» demonstrou-~ss que -os cortes foram feitos apenas no extremo 5" do RNA, Isto também è consistente com o mecanismo proposto. A Figura 4- mostra que as activitíadss de RNAse H de AMV* MhLv e E, coli cortam em sítios de clivagem específicos da RNAse H» As setas na figura indicam a posição do RNA de tamanho completo. A 5- iqura 6 mostra α resultado de u®s sspsriincia asi que T2_ a região 2 ds Hiv foi marcada internamente coíb " ι-'5 mondada com uma sequência alvo de cadeia simples s cortada com RNAss ri ds Anv durante 45 minutos (faixa 2)* MMLv di.iran.ts 5S 15? 45 ou 12® minutos \faixa 3-6) ou RNAse H de E. coli durante 5 minutos ífaixa 7)= Os tamanhos dos fragmentos produzidos foram discretos s diferentes para cada uma das encimasP indicando especificidade da clivagem das enzimas e variedade de especificidade entre as enzimas com este molde* A degradação mais rápida foi observada na presença ds RNAse H de E_*_coli * indicando menor especificidade ou maior actividade ds corte com esta enzima* A Figura 6b mostra os resultados da hihridação do RNA da região 1 ds HBV com uma sequência alvo sintética? seguido ds cortes com RNAse H da transcriptase reversa de A!1V durante 5? 3Θ* 6© ou 12© minutos (faixas 2-5) ou E* coli durante i s 3» 15 ou 6© minutos (faixas 6-9)* Produziram-se fragmentos de tamanho diferente com as duas enzimas* indicando especificidade da clivagem* Quando o RNA ds HBV foi marcado no extremo 35 s cortado com transcriptase reversa de Aíiy? foram observados fragmentos do mesmo tamanho? indicando que os sítios ds clivagem estavam perto do extremo 55 do RNA*
Estes resultados indicam que sitios específicos sao clivadas com RNAse H de AMVS MMLV e E* coli e que pelo menos alguns sítios são diferentes com as três enzimas* A presença de sítios específicos dentro da região a ser amplificada permite que o RNA num híbrido de RNAsDNfi seja clivado* permitindo que a autocatálise ocorra eficazmenta=Os iniciadores projecfeados usando informação acerca do sítio de corte mostrou uma eficácia de amplificação melhorada* Isto â consistente com as nossas Observações de que certas séries de iniciadores amplificaram em diferentes graus dependendo da fonte de RNAse i-L
Identificação da sítios.....de_£^te_fiela_KNftsêJÍ-de„ Oil.V^„Ajw
Para identificar sitio» digeridos pela RMAse H de ftMV» o RNA foi hibridada com uma sequência complementar a a cortado com RíMAse H de AMV, Após desnaturaçãos um iniciador complementar do externo 39 da região a ser sequenciada foi hibridado e prolongado na presença de didesoxinucisotideos pelo roétodo de sequen-ciaçlo de Banger* A terminação da síntese de cDNA5 indicando clivagem de RNA5 foi observada nos seguintes sítios do RNA de HBv ;=:
5 9BSSΑΘA68UUAUCSC$UBBA%U6UBUCUSCSSCSUUUUAUCA$UAU UCCLICUUCA$UCCU6 = = ,35
Para identificar sítios digeridos por RNfise H de MMLV? o RNA foi hibridado com uma sequência complementar e cortado com RNAse H de MMLV. Após desnaturação5 um iniciador complementar do extremo 3’ da região a ser sequenciada foi hibridado s prolongado na presença de didesoxinuc1eotídeos pelo método de sequenciação de Sanger* A terminação da síntese de cDMAfoi observada nos sítios que se seguem do RNA de HBVs 59 BB8ASfiBSUUAUCSC$USSA«USUSUCUGCSSC*8UUUUAUCA« UAUUCCUCUUCAUCCU8CSU8CUAU8CCUCASUCUUC.„.-3s
Os sítios que se seguem foram identificados para uma segunda sequência da RWh de HBvs 55 B88A8ACCCSASAU»USA$eAUCUUCUSCSAC 8C88C8AU $ US A * 8AUCU8C6UCU tGC8AG8C8A88GAGU$UCUΐUCUUSCUA S888ACCU8CCUCS8UCCCSUCf8UCUA.„,39 uma segunda
Os sítios que se seguem foram identificados para sequfncia de RNA de HlVã Ξ 5 66SA6ACAAA SU8SCAGUA*UUCAUCCAC AAUUUUAAAAeAAAAe8BS8AUUG88SSGUA CA8U8CA8888AAA8AAUASUA8ACAUAAUA8CSAftCA8ACA UACtAAACUAAAGAAUUACAAAAAGAAAUUACtAAAAAUUCAA AAUUUUC888UUUAUUACA8B8AC«A8C§A8AAA...3* A maior parta dos sítios de clivagem ocorreu perto dos dirmclso-títíeas CA ou U6= 0 método usado para a detecçSo de sítios de clivagem apenas identificaram sítios que acumularam durante a reacçlo de clivagem,, Pensa-se que sítios adicionais foram clivados que não foram reconhecidos pelo método usado,, F. Inlgiadares.....para.....sistemas..^
Coiíi base na descoberta que as várias enzimas RNAse H têm especificidade de sequência,, testámos várias combinações iniciador/alvo e tentámos optimiz&r a sua eficácia em sistemas ds amplificação» Os resultados obtidos indicam que o tamanho dos fragmentos de dNA produzidos é relativamente grande e que os fragmentos provàvelmente nSo ss dissociam espontêneamente do duple??,. Isto nSo è inesperado uma vez que o trabalho com trans-criptase reversa de AMv na cópia de RNA ds AMV cu de RNA ds policvírus mostrou que os fragmentos de RNA que foram produzidos pela RNAse H foram usados pela enzima para iniciar a síntese ds cuNh a partir da cadeia ds cDNA iniaialmsnte sintetizada„
Se as enzimas RNAse H possuírem especificidade de ssquêncaa? a rescçáo de amplificação decorre como se segue ^começando com o RNA intermediário na reacçSo)n
0 iniciador complementar da principal espécie de RNA produzida durante a amplificação liga-se ao extremo 3? do RNA= Uma vez que a concentração de iniciador é elevada na reacção5 o iniciador em excesso produz duplex de RNAsDNA que podem ser cortados pela aetividade de RNAse H antes de serem capazes de iniciar a síntese» Portanto» é preferível que a região de ligação do iniciador não contenha um grande número de sequências reconhecido peia enzima RNAse H usada na rsacção.
Uma vez que os locais de corte ocorrem frequentementeP pode não ser prático nalguns casos projectar um iniciador de ENA complementar sem sítios de corte reconhecidos? em tais casos os sítios de corte devem estar tão perto quanto possível do extremo 55 para permitir que a fraéçSo terminal 35 do iniciador permaneça emparelhada com o RNA»
Quando da extensão do iniciador por uma DNA-ροΙimerase adequada, o sítio de ligação para o segundo iniciador, o qual contem o promotor da RNA-polimerase, deve agora ser exposto» έ suficiente remover apenas uma fraeçlo do RNA para permitir a formação de núcleos do iniciador à medida que ele hibrida com o cDNA» para permitir a ligação mediada por transcriptase reversa do iniciador e iniciação da síntese ou apenas o corte de RNA de modo a que o fragmenta de RNA que resulta seja deslocado» Urna vez que os nossos resultados mostram que pedaços relativamente grandes de RNA são feitos e que o iniciador contendo promotor nao e incorporado no DMA de tamanho completo» podem ocorrer os seguintes casoss 1» Existem cortes suficientes do RNA para permitir a ligação do promotor-iniciador» Presentemente desconhece-se se um corte no local simplesmente produz um fragmento de RNA suficien— temente pequeno para fundir e expor o sítio de ligação do iniciador ou uma fracção deis ou ss um corte parcnits que uma actividade de dssenrolamento associada a uma ou mais das sníisnas para deslocar o fragmento de RIMA* 2= 0 extremo 3* do cDNA é prolongado pela transcriptase reversa para fazer o DMA de cadeia dupla da região do promotor» 3» 0 RUA é sintetizado a partir do complexo assim feito» Este complexo consistirá num cDNA ligado a RNA e contendo um promotor ds DMA de cadeia dupla»
Assim.; deve existir uma sequência reconhecida pela actividade de RNAss H presente na raacçla algures no sítio ds ligação do iniciador contendo o promotor da RNA-polimerase ou parta dele»
Nalgumas aplicações5 pode também ser desejável nlo ter sítios de reconhecimento da RNAss H dentro da prépria sequência alvo» Os sítios dentro do alvo podem ser clivados e usados para produzir iniciadores de RNA para a síntese ds regiões- ds cDNA de cadeia dupla» Pode ser preferível eliminar a possibilidade desta actividade snzimática»
Projectaram-se novas séries de iniciadores com base no modelo s na informação da especificidade de sequência da RNAse H que obtivémos» Os nossos critérios para o projecto slo os seguintes = tç r-j n i çi ador_de.....II s 1) A região do inciador deverá ter um ou mais sítios da corte por 16 bases» Ξ) A região do iniciador deverá ter um sítio de corte perto do extremo 55„ 3)
A região do iniciador deverá tsr um sítiod a corts perto do extremo 31 2 3 4 5 e possivelmente um um sitio parcial no esítrenio ·...·· :: 4) D comprimento do iniciador deverá ser >18 bases- 5) 0 T4!lest» deverá ser de aproximadamente 55—65C‘C = 1 0 iniciador deverá ter poucos ou nenhuns sítios de corte psla RNAs H= 2
Quaisquer sitios de corte no iniciador deverão ser perto do do extremo 5"- 3 0 comprimento do iniciador deverá ser de aproximadamente 1B--28 bases de comprimento- 4 0 Tn est. deverá ser de aprox imada<nen te 55-650C«
Obteve-se significativamente melhor síntese a partir de séries de iniciadores projectados usando estes critérios s o conhecimento do mecanismo e especificidade de sequ@nci.as.» Isto mostra que a utilidade do invento é tornar possivela projecçSo de séries de iniciadores funcionais para regiões alvo especificas- Estas slo explicadas mais detalhadamente abaixo- 5
Exemplo 13
Os nossos resultados respeitantes á especificidade da RNfiss H foram usados para criar combinações eficaess de promotor iniciador- Os métodos anteriormente descritos apenas ligavam de modo não sslsctivo sequências de promotores e de iniciadores- Nés conseguisíos projectar e opiimizar combinações de promotcr-inicia— dor para aumentar α rendimento do produto amplificada- A experiência que se segue mostra que pequenas alterações na sequência de promotor-iniciador resultam em grandes alterações na eficácia de amplificação*
Os exemplos que se seguem mostram iniciadores de fontes semelhantes que foram comparados quanto aos sítios ds clivagem por RNAse H © eficácia ds amplificação por BP-ϊΙΙ* Em cada um dos exemplos foram realizadas amplificaçSss em duplicado usando reacgsntss comuns esceptuando os iniciadores a serem testados* 1 * iniciadoras não promotores*
No primeiro exemplo5 o sítio iniciador não promotor para a principal rssgião de amplifícação do ponto de quebra CML t(14p 18) foi movido 15 bsses? resultando numa redução no número de sítios de corte putativos pela RNAse H de 4 a 19 assumindo uma sequência de reconhecimento de 4 bases ou ds 5 a 2 assumindo uma sequência de reconhecimento de 3 bases* A reacção foi realizada como descrito no Exemplo 15 exceptuando ter-se incluido 2S5 míi ATP? 16*5 mH MgCl0 s 50 mH KC1= Esta alteração na sequência do iniciador teve um efeito positivo dramático na eficácia de amplificação* No segundo caso;! col.ocou.-ss propositadamente um desemparelhamento no iniciador não promotor da região de HBv para remover o único sítio de corte pela ENAss H putativoassumindo um sitio ds reconhecimento de 4 bases* No caso de um sitio ds corte cie 3 bases* os familiarizados com a iBatêria reconhecerão que o desampareihamento removeu o sitio de corte mals perto do extremo 3?* Esta alteração também teve um efeito positivo definitivo na eficácia ds amplificação* Os resultados demonstram que podem ser usados·, alteração da posição do iniciador ou inclusão de desamparei.hamentos3para aumentar a amplificaçSo* Presumivelmente:· a remoção dos sítios de corte pela RNAse H do iniciador nSo promotor resulta em iniciação maia eficaz da síntese de cDNfi durante a autocatáliss.
RLU sEqusncis b.;iSmplo 2
GGASCTSCASATGCTSACCftAC BhCCAACTCSTBTGTBAAACTCCA TCCT βΒAATTASAS8ACAAACSB8C 78 880 2 552 333 57 710 518 è95
TCCTBSAATT A8AB8AT AAACSGSC 2 . promotores-iniciadores =
Os SKsmplos que se seguem mostram promotores-iniciadores provenientes de regiões semelhantes mas que diferem no número de sítios de corte pela RNAss H putativos. No primeiro caso, os dois sítios promotor-iniciador para a região 5 do HIv foram deslocados 10 bases? mudando o número de sítios de corte pela RNAss putativos de dois para trfs3 assumindo um sitio da reconhecimento da quatro bases ou de 3 para 5 assumindo um sítio da reconhecimento de 3 bases. Isto tem um efeito positivo na eficácia ds amplificacSo. No segundo caso, uma sequfneia contendo sítios ds corte pela RNfise putativos foi inserida a montante do promotor-iniciador para o principal ponto de quebra de transioca-ção t(14sl8) e um desemparelhamenta para o alvo foi incluido para gerar um sítio de corte dentro da região do iniciador. Isto também teve um efeito positivo na eficácia de amplificação. Isto demonstra que a inserção da sítios de corte pela RNAse H no promotor-iniciador pode ser usado para aumentar a eficácia de amplificação. Presumivelmente,, a inclusão de sítios de corte pela RNAse H auxilia o deslocamento da cadeia de RNA. aumentando a srxcaciâ de cépia da região do promotor9 resultando assim sm autocatálise mais eficaz.
Nome do Iniciador
A B C D RLU 45 466 ?0S 147 64 601 2 946 7®6
As sequências dos inci-adorss acima sSos Iniciador As hhTTTTAATAC8ACTCACThTAG0SA8AãATCTTGTGGGGTQGCTCCTTCT-35 Iniciador Bs AATTTftATACGACTCACTATAGGGAGAGGGGTGGCTCCTTCTGATAA 18016-3*
Iniciador Cs ATTTAATA0GACTCACTATAGSGAGACGGTGACC8T88TCCCTTS"3?
Iniciador Ds
T AAATT AAT ACGACTCACTAT AGGGAGATCAGTT ACAATCGC TGGTATCAACGCTGAGCAGACGCTSACCGTGGTCCCTTe~35
Nos sKemplos atrás* a remoção dos sitios de corte pela RNAse H resultou num aumento da amplificação* mesmo quando a remoção do sitio de corte envolveu a incorporação de um desampareihamento com o alvo original* A criação do iniciador contendo promotor para incluir sitios adicionais de corte pela RNAse H também aumentou a smpllficação* novamente* mesmo se a incorporação de sítios de corte envloveu a inclusão de desamparaihamentos com o alvo original* 0 número* distribuição e posição dos sitios de corta pela RNAse H putativos determina* em parte* a utilidade de um dado iniciador* 0 melhoramento da amplificação pela inclusão intencional de dessmparelhamentos ou inserção de sequências entre α
promotor e o iniciadar nla são melhoramentos obvies da método de amplifinação»
Numa realização preferida do presente invento» a sequência alvo de RNA foi determinada e depois analisada para se determinar onde poderia haver cortes pela RNAse H ou remoção de secções de RNA da duplex» Rea 1 isaram-se experiincias para determinar o efeito da degradação pela RNfise da sequfncia alvo pela RMAse H presente na transcriptass reversa da AMV s na transcrip-tase reversa do MrlLVs por RMAse H de E» coii ou por combinações delas» fto seleccionar-se um iniciadors é preferível que o iniciador seja se1eccianada de forma a que hibride com uma secção de RNA que seja substancialmente nlo degradada pela RNAse H presente na mistura de reacção» Se existir degradação substancial 9 os cortes na cadeia de RNA na região .do iniciador pode parar ou inibir a síntese de DMA e evitar a extensão do iniciador» Assim3 é desejável seleccionar um iniciador que hibride com uma sequência do RNA alvo3 situada de modo a que quando o RNA é sujeito à acção de RMAse H» nao exista degradação substancial que evite a formação do produto de extensão do iniciador» 0 sítio para a hibridaçlo do promotor-iniciador é escolhido de forma a que ocorra degradação suficiente da cadeia de RNA para permitir a remoção da fracçSo da cadeia de RNA hibridada com a fraeção da cadeia de DNA com a qual hibridará o promoto-iniciador= Tipicamsnte? slo removidas apenas fracçSes de RNA tío duplex RNA;DNA par degradação com RNAse H e uma parte substancial da cadeia de RNA permanece no duplex» Resulta um duplex RNA;DNA contenda um promotor de DNA de cadeia dupla» A Figura 4a mostra o cicio autocatalitico que ocorro durante a reacçlo de amplificação. 0 produto RNA í-~> emparelha com o primeiro iniciador <·*·> e sintetizasse uma cópia de DMA da RNA pela actividade de DNA-po 1 iínarass RNA-dspendsnts da trans-criptase reversa presanta na mistura de rsacção. Dá-se então degradação selectiva com RNAss H da cadeia de RNA do duplex FlNAs DNA. Na Figura não estão apresentados necessariamente todos os sítios de corte pela RNAss Hp no antantos ocorre degradação suficiente na região homóloga do sitio de ligação do segundo iniciador/molde «splics»para remover fragmentos de RNAnsquela região (estrutura 4). Ossgundo iniciador/molde «splics» em seguida emparelha com a cadeia de DNA e a síntese de DMA DNA—dependente, , também mediada pela transcriptase reversa presente na mistura de rsacçSo. copia uma fracçãodo segundo iniciador/molde Ssplics» para produzir uma região de promotor de cadeia dupla.A estrutura 6 serve então como molde para a síntese de múltiplas cópias de RNA produto C-) peça RNA polímeras» presente na mistura de reacção. A Figura 4b mostra a amplificação de um alvode RNA em que o extremo 5do RNA e o extremo 53 da região alvo slo idênticos. 0 primeiro iniciador <H emparelha com o RNA alvoe sinteti-ca-ss uma cópia de DNA complementar da parte do RNA a Jusante do iniciador peia acts.vidade de DNA—pol i me rase DNA—dependente da transcriptase reversa presente na mistura de reacçSo. A degrada-ç&o com HNfíse li do duplex KNAsDNA resultante produz estrutura 35 em que ocorreu degradação suficiente do RNA para expor a região ds ligação do segundo iniciadar/molde «splice» <->. Podem também estar presentes outros sítios de corte pela RNAse H5 mas não sstão apresentados na Figura. 0 segunda iniciador/malde «splice» emparelha com a cadeia da DMA complementar para produzir a estrutura 4, A sintese ds DMA DNft-dependente9 sediada pela actividade ds DNA-polimerass BNA-dependente presente na mistura ds receção, copia uma região do molde «splicespara produzir uma região de promotor de DMA de cadeia dupla <estrutura 5).A estrutura 5 serve coíbo solde para produzir produto RNA C-) que é então amplificado pelo ciclo autocatalítico mostrado. A Figura 4c mostra a amplificação de um RNA alvo em que o RNA alvo contem sequências adicionais 5?relativamente è região alvo. 0 primeiro iniciador, que contem as sequências de promotor 5* rslativamente às sequências complementares do RNA alvo* emparelha com o RNA alvo a ê prolongado pela actividade de DNA-pol iiíierase RNA-dependente presente na mistura de reacção para produzir a estrutura 2= Dá-se a degradação pela RNAss H tía cadeia ds RNA do duplex RNA:DMA. Nesta figura, a degradação pela RNAse H é suficiente para produzir fragmentos que eventualmente se dissociarão da região alvo ou serão deslocados pela síntese de DNA DNA-tíependenie mediada pelo empareihamento do segunda iniciador (-). a Extensão do segundo iniciador (-> produz uma estrutura ds DNA ds cadeia dupla (estrutura S)? a qual serve coma molde para a RNft-poIimsrase fazermúltiplas cópias de RNA contendo a sequência da região alva. Estes RNAs são ainda mais amplificados pelo ciclo autocatalítico como se mostra. A Figura 4d mostra a amplificação ds um RNA alvo como seja o apresentado na Figura 4c5 e;;ceptuanda aqui os fragmentos produzidos peia digestão com RNAse H não se dissociarem todos ou ssraoi deslocados pela síntese de DMA DNA^dspsndenta* Em vez disso, alguns ou todos os fragmentos de RNA servem como iniciadores paa a síntese de DMA DNA-dependente para produzir a estrutura 5:‘ que pode servir como molde para a RMA-polimerass para produzir cópias de RNA que são amplificadas através de uns ciclo autocata-11tico como se mostra »

Claims (4)

  1. BOVINDICACSES is» - Método de sinlese do cépias múltiplas de uma sequência ds ácido nuclsicc alvo» caractsrizado pors (a) o tratamento de um ácido nucleico que compreende uma sequência ds RNA alvo com ura primeiro oligonuclsatí.-· ciso o qual compreende um primeiro iniciador que tem uma sequência ds complsxaçSa suficientemente · complementar da fracçSo terminal 3? da sequência alvo para complexsr cora ala a que íacultativaiíisn-te tem uma sequência 55 relativaraente è sequência ds compisxaçSo a qual inclui um promotor ds uma RNA-po1imerase* em condições tais que se possa formar um complexo oligonuclectideo/ssquência alvo e seja iniciada a síntese de DNAs (b) o prolongamento do iniciador numa reacçao ds extensSo usando o alvo como molde para dar uni DMA produto do prolongamento do iniciador complementar do RNA alvo? (c) a separaçSo do DNA produto de sxtensão do iniciador do alvo RNA usando uma encima que selectivamsnte degrada o RNA alvog Cd) o tratamento do DMA produto ds extensão do iniciador com um segundo caigonucleotídso que compreende um iniciador ou um molde «splice» s que tem uma sequência ds cora-pisxaçSo suftcientemente complementar da fracçSo terminal 3S da sequência alvo para se complexar cora ela5 em condições tais que se possa formar ura complexo aligonuclsotidsa/saqufncia alvo s seja iniciada a sintese de DNA? desde que se o primeiro núcleo-tideo nHo tivar um promotcrg então o segundo oligonucleotiaso é um molde «spliess que tem uma sequência 55 relativamsnte á sequfncia ds camplej-ísçSo & qual inclui um promotor de uma RNA---ροϊ imerasej Ce) o prolongamento do εκtremo 35 do segundo nucleotiaso ou do primeiro produto de· entenslo do iniciador^ ou ambosj numa reacçSo de extensSo de DNA para produzir um molde para uma RNA-ρα i imerase % s Cf) a utilização do molde do passo <e> para produzir múltiplas cópias ds RNA da sequfncia alvo usando uma RNA---polimerase que reconhece a sequfncia do promotor» Sã= — Método de acordo com a reivindicação i? carscts-rizado por a enzima tio passo Cc) compreender uma RNAss H» 31» -·· Método de acordo com a reivindicação 1P caracts-rizado ainda por compreender a utilização de olIgonucleotidaos e cópias tie RNA para sintetizar auiocataliticaments múltiplas cópias da sequência alvo» 41» - Método ds acordo com a reivindicaclo 3== caracte-rizado por a enzima do passo Cc) compreender uma RMAss H» 5i» - Método de síntese de cópias múltiplas de uma sequfncia ds ácido nuclsico alvo caracterizado por compreenders Ca) o tratamento de um ácido nuclsico que compreende uma sequfncia ds RNA alvo com um primeira olIgonuclectí-deo o qual compreende um primeiro iniciador que tem uma sequfncia ds coiiipleKaçSo suíicientemente complementar tía fracçSo terminal 3da sequfncaa alvo para complsiíar com ela e que facultativansen-t;s tem uma sequfncia 5? relativamente à sequfncia de coinplevaçSo a qual inclui um promotor de uma RNA~polimerase? em condições
    tais que se possa formar um complexo oligonucIeoti.deo/sequ@RCÍa alvo e ssja iniciada a síntese de DNfts íb) o prolongamento do iniciador numa raacçlo tie extensão usando o alvo como molde para dar um DMA produto do prolongamento da iniciador complementar do RNA alvos Cc> a separação do DNA produto de extensão do iniciador do alvo RNA usando uma encima que selectivamente degrada o RNA alvo? (d) o tratamento do DNA produto de extensão do iniciador com um segundo oligonucleotídeo que compreende um iniciador ou um molde «splice» e que tem uma sequência de corapls-xsção suficientemente complementar da írscçSo terminal 35 da sequência alvo para se complexar com ela,, em condições tais que os possa formar um complexo oligonucleot£deo/sequ*®ncia al »·α e seja iniciaria a síntese de DMAp (s) o prolongamento do sxtremo 35 do segundo iniciador numa reacçSo de extensão de DMA para dar um segundo DMA produto da extensão do iniciador, produzindo assim um molde para para uma RNA-polimsrasep e Cf) a utilização do molde do passo Ce) para produzir múltiplas cépias de RNA da sequência alvo usando uma RNA-"-polimerase que reconhece a sequfncia do promotor,, éã= -· Método ds acordo com a reivindicação 5S carac-terizado por a enzima do passo ic) compreender uma RNAse H» 71= ··· Método de acordo com a reivindicação 5= carac te™ rizatfa por o segundo iniciador ter uma sequência 5·* relativamente à ssqufncia de cofBplsxaçSo que inclui uís promotor para uma RNA-polimsrase= 8â. - Método de acordo com a reivindicação 7* caracte-rizado per a enzima do passa Cc) compreender uma RMAss H = 91= - Método ds acordo com a reivindicaçlo 5, caracte- rizado ainda por compreender a u.tilizaçlo de iniciadores e cópias de RNft para sintetizar sutocataliticamente múltiplas cópias da saquSncia ãlvo=, í@i* - Método de acordo com a reivindicação 9? caracte-risada por a segunda iniciador ter uma sequtncia 5S relativaments k sequfncia de complexaçSo que inclui um promotor para uma RNA-ρο1imsrass= ilã» - Método de acordo com a reivindicação 5* caracte™ rizado ainda por compreender3 (g) d tratamento de uma cópia de RMA do passo (f> com o segundo iniciador em condições tais que se possa formar um complexo ol i germe 1 sotí deo/sequSncia alvo s seja iniciada a síntese tís DNAg <h) o prolongamento do extremo d5 do segundo iniciador numa rescçio de extensão para dar um segundo DMA produto do prolongamento do iniciador complementar da RMA cópiap (i) a separação do segundo DMA produto ds extensão ds iniciadores do RNA cópia usando uma enzima que degrada sslec--· tivamente a cópia ds RNAs (j) o tratamento da segundo DNA produto de SHten-sSo ds iniciadores com o primeiro iniciador em condições tais que ss possa formar um completo oliganuclsotideo/sequência alvo s seja iniciada a síntese de DNA5 <k) o prolongamentcs do extrema 3? do primeiro iniciador numa rs&cçMo ds extensão de DNA para dar um primeiro DNA produto ds extensão de iniciadores s o extremo 3? do segundo DMA produto de extensão de iniciadores* produzindo assim um molde para uma RNA-po1imerasep e (1) a utilização do molde do passo <k> para produzir múltiplas cépias da sequência alvo usando uma RNA-poIi-merase que reconhece o promotor . 12ã» “ método de acordo com a reivindicação ií * carac-terizado por o segundo iniciador ter uma sequência 55 relativa-mente â sequência de compieKSçlo que inclui um promotcsr para uma RNA—polimerase. i3§» - Método de acordo com a reivindicação 11 caracterizado ainda por compreender a utilização da iniciadores e copias de RNA para sintetizar sutocataliticamente múltiplas cópias da sequência alvo. 14s= - Método de acordo com a reivindicação li3 carac-terizado por o segundes iniciador ter uma sequência 5? relativa-mente á sequência ds complexação que inclui um promotor para uma RNA-po1imerase« carac- 15â» - Método ds acordo com a reivindicação 11, terizado ainda por compreenders ím) a utilização tias cópias de RNA do -passo < 1 > y repetindo os passos \g) a (!) para sintetizar autocataiiticamsnts múltiplas cópias da sequência alvo, 16e,= - Método ds acordo com a reivindicação 15== csrac--terizada par a enzima dos passos <c) a (i) compreender uma RNAse H. 17iâ = - Método de acordo com a reivindicação 15= carac-terizadc? por o segunde? iniciador ter uma sequência 55 relativa-mente à sequência de complexação que inclui um promotor para uma RNA-polimerase = 18ã„ - Método de acordo com a reivindicação 17* carac-fcsrizado por a enzima dos passos <c) e (i) compreender uma RNAse H. ivã = - Método de acordo com a reivindicação /? carac-teriza ainda por compreendera Cg) o tratamento das cópias de RNA do passo Cf) com os primeira e segundo iniciadores em condições ds complexa-çSos Ch> o prolongamento dos iniciadores numa reaorão ds extensão tis DMA usando as cópias de RNA como moldes para dar DMA como produtos ds extensão ds iniciadores? íi> a separação do segundo DMA produto de extensão ds iniciadores das cópias de RNA usando uma enzima que degrada selectivamente as cópias de RNAs iniciadores (j) d tratamento aos DNAs produtos ds extsnsla de com os iniciadores em condiçSes de compIe>;açSo« | <k> o prolongamento dos iniciadores numa raacçlo ds extensão de DMA para dar um produto ds extensão de iniciadores CQispIsmentar =, produzindo assim um molde para uma RNA—poli msr ase § e (l) a utilização do molde do passo ík/ para produzir múltiplas cópias da sequência alvo usando uma RNA-pali-raerase que reconhece o promotor, 2®i, - Método ds acordo com a reivindicação i9s carac-terizado ainda por compreender s utilização de iniciadores e cópias de RWA para sintetizar autocafcaliiicareente múltiplas cópias da sequência alvo= 21ã. - Método ds acorda com a reivindicação 19, carac-terizando ainda por compreenders (m) utilização das cópias ds RNA do passa íl)5 repetindo os passos <g> a <1) para sintetizar autocataliticamente múltiplas cópias da sequência alvo, 22â= - Método d© acordo com a reivindicação 21, carac-terizado por a enzima dos passos (c) a (i) compreender uma RNAse H. 23s, — Método ds sintsss ds cópias múltiplas ds uma sequência tíe ácido nucleico alvo, carcaterizad?:? por compreenders (a) d tratamento de um ácido nucleico que compreende uma sequência de RNA alvo com um primeiro oligonucleo— tldeo o qual compreende um primeiro iniciador que tem uma sequfncia de complexação sufIcientemente complementar da fracçao terminal 3? da sequfncia alvo para complexar com sis bui condições tais que se possa formar um complexo oligonucleotidsa/sequfncia alvo e seja iniciada a sintese de DNAs (b) o prolongamento do extremo 3 s do primeiro iniciador numa raacçSo de extensão usando o alvo como molde para dar um DMA produto do prolongamento do iniciador complementar do RNA alvos (c) a separação do DMA produto de extensão do iniciador do alvo RNA usando uma encima que selectivamente degrada o RNA alvo 5 (d) o tratamento do DMA produto de extensão de iniciador com um segundo o1igonucleotidea que compreende um iniciador ou um molde «splice» e que tem uma sequência de eompie·-· xaçSo suficisntemente complementar da fracção terminal 35 da sequfncia alvo para se complexar com ela e uma sequfncia 53 rslativamente ã sequfncia de complexação que inclui um promotor para uma RNA-polimerase5 em condiçSes tais que se possa formar um complexo oligonucIsotideo/ssqufncía alvo e seja iniciada a sintese de DNA| íe) o prolongamento do extremo 35 do produto de extensão de iniciadores para lhe adicionar uma sequfncia complementar do promotor*, produzindo assim um molde para uma RNA-poli-ííieraseij íf> a utilização do molde do passo <e> para produzir múltiplas cópias de RNA da sequfncia alvo usando uma RNfi-poiimerase que reconhece a sequfncia do promotor=
    carac- 24§. Método da acorda com a reivindicação 23s terixado ainda por compreender a utilização de iniciadores e cópias ds RNA para sintetizar autocataliticamenta múltxpi.as cópias aa sequência alvo. 25ã« -· Método ds acordo com a reivindicação 24s carácter is ado por cs extremo 3:‘ do molde «splice» estar oioqusado,, 2óã» - Método de acordo com a reivindicação 23? carac-ierixatío ainda por compreenders Cg) a utilização das cópias de RNA do passo Cf)s repetindo os passos Cg) a Cf) para sintetizar au. toca tal i ticamen te múltiplas cópias da sequência alvo. 27â» - Método de acordo com a reivindicação 26s carac-tsrizado por a enzima do passo <c> compreender uma RSdAse H» 28§» - riétodo de acordo coos a reivindicação 265 carac··· terizado por o extremo 3S do molda «splice» astar bloqueada. 29ã» - Método as acordo com a reivindicação 26. carac— terixado par no passa Cs) o molde «splice» actuar como um segundo iniciador e o estremo 35 do molde «splice» ser prolongado numa reacçlo de extensão de DMA para dar um segundo produto de smtensão de iniciadores que é complementar do primeira produto de extensão de iniciadores. 3®s. - Método de acordo com a reivindicação 29? carac— terixado por o primeiro iniciador ter uma sequência 5? relativa-mente á sequência de complexaçlo que inclui um promotor para uma RNA-ρο1imerase =
    terizado Slã* - Método de acordo com a reivindicação 3®=. carac-por a enzima do passo Cc> compreender uma RNAss H = 321 = “ Método de acordo com a reivindicação 2S* carac-terizado por o referido iniciador eo referido molde ssplices compreender um única oligonucleotideo tendo uma ssaufncxa que compreende o molde «splíce» 55 rslativaments à sequência que constitui o iniciador, 331= - Método de síntese de cópias múltiplas de uma sequência ds ácido rmcleico alvo caracterisada par compreenders ia) o tratamento de um ácido nucleico alvo de cadeia simples que compreende uma sequência de DMA alvo tendo um extremo 33 definido com um primeiro oligonucleotideo o qual compreende um molde «splice» que tem uma sequência de complexação suficientemente complementar da fracçSo terminal 35 da sequência alvo para complexar com ela e que facultatiyamente tem uma sequência 5? relativamente a sequência ds coníplexaçao a qual inclui um promotor ds uma RNA-polimerase* em condições tais que se possa formar um complexo oligonucleotídeo/saquincia alvo e seja iniciada a síntese de DNA = Cb) o prolongamento do extremo 3S do alvo para adicionar uma sequência complementar do promotor produzindo assim ixm molde para uma RNA-polimerases e (c) a utilização do molde do passo Cb) para produzir múltiplas cópias de RNA da sequência alvo usando uma RNA-polimerase que reconhece o promotor.. 341= - Método ds acordo com a reivindicação 33* carac- fcsrizatío por o extremo 3? do molde «splice» estar bloqueado..
    carac- .5¾¾ = - Método tíe acordo com a reivindicação 3-5 5 terizado ainda por comprandsrs <d) a tratamento de uma cópia da RNft da passa Cc> com um segundo oligonucleotídea que compreende um iniciador possuidor ds uma sequência de complexsção suficisntemente complementar da fraceão terminal 35 da cópia de RNA para se complexar com ela? em condiçSas tais que se possa formar um complexo oligonucleotídeo/sequêncis alvc? e seja iniciada a síntese ds DNAii <e> o prolongamento do extremo 3S do iniciador numa reacçSo ds extensão de DMA para dar um DNft produto do prolongamento do iniciador complementar do RNA cópias (f) a separação do DNA produto de extensão do iniciador da cópia de RNAp Cg) o tratamento do DNA produto de extensão do iniciador com um molde «splice» em condições tais que se possa formar uni complexo oligonucleotideo/sequência alvo e seja iniciada a síntese de DNA= íh) o prolongamento do extremo 35 do produto ds extensão do iniciador numa reacçSo de extensão ds DNA para adicionar uma sequência complementar do promotor produzindo assim um molde para uma RNA~polimerassj e (i) a utilização do molde do passo (h) para produzir múltiplas cópias de RNA da sequência alvo usando uma RNA--pr.il imerase que reconhece o promotor.,
    3éã. - Método da acordo com a reivindicação -SoP csrac-terizaoo por o passo Cf) usar uma enzima que seiectxvainsnts degrada a cópia de RNA. 37s« ~ Método de acordo com a relvindlcaçlD 3ès carac-tsrizado ainda por compreender a utilização dos oligonuclootideos o as sépias de Rímr do passo CI>P para sintetizar autocatalitica-msnts múltiplas cópias da sequência alvo. 38§. - Método de acordo com a reivindicarão 37 P carac-terizsdo por o sktremo 3* do molde «splice» estar bloqueado. 39ϋ= - Método de acordo com a reivindicação 36 = csrac™ tsrizado ainda por compreenders Cj) a utilização das cópias de RNA do passo Ci)P repetindo os passos Cd) a Ci> para sintetizar autocataliticamente múltiplas cópias da sequência alvo. 4©§. - Método de síntese de cópias múltiplas de uma sequência de ácido nucleico alvo? caracterizado por compreender5 Ca) o tratamento de um ácido nucleico alvo de cadeia simples que compreende uma sequência de DNfi alvo com um primeiro oligonuc1eotídeo o qual compreende um primeiro iniciador que tem uma sequência de complsMação suficientemente complementar as fracção terminal 35 da sequência alvo para compleKar com ela a uma sequência de complexaçaD a qual inclui um promotor de uma RNA-ραΙimersssj em condições tais que se possa formar um complsKO oliqonucleotídeo/ssquência alvo e seja iniciada a sintsse de DMA? Cb) o prolongamento do iniciador numa reacçSo de shtensão usando o alvo como molde para dar um primeiro DMA produto da prolongamento do iniciador complementar da sequtncia de DMA alvo? ic) a separação do primeiro produto de eutensão do iniciador do alvop s (d) o tratamento do primeiro produto de extensão do iniciador com um segundo oligonucleotideo que compreende um segundo iniciado que tem usíiâ sequtncia de complexação suficiente-mente complementar da fracção terminal 3S da sequtncia alvo para se complsxar com elas em condições tais que se possa formar um complexo oligonuclectídeo/sequfncia alvo e seja iniciada a síntese de DNAj (e) o prolongamento do extremo 35 do segundo iniciador numa reacção de extensão de DMA para dar um segundo DMA produto da extensão do iniciador* produzindo assim um molde para uma RNA-polimerases íf) a utilização do molde do passo (e) para produzir múltiplas copias de RNA da sequtncia alvo usando uma RNA-polimerase que reconhece a sequtncia do promotor, (g) o tratamento de uma cópia de RNA da passo <f) com o segundo iniciador em condições tais que se possa formar um complexo oligonucleotideo/sequtncia alvo e seja iniciada a síntese de DNAp íh) o prolongamento do extremo 35 do segundo iniciador numa reacção de extensão de DMA para dar um segundo DMA produto da extensão do iniciador complementar da cópia de RNh| (i) a separação do DMA produto de extensão do iniciador da cópia de RNA usando uma encima que selectivaments degrada a cópia de RNAs (j) o tratamento do segundo produto de extensão do iniciador com o primeiro iniciador em condições tais que se possa formar um complexo oligonuclsotideo/sequãncia alvo e seja inicia-tía a síntese de DNA| (k) o prolongamento do extremo 3* do primeiro iniciador numa rsacção de extensão de DMA para dar um primeiro DMA produto de extensão de iniciadores e o extremo 35 do segundo DMA produto de extensão de iniciadores? produzindo assim vm molde para uma RNA-poliraerase p s CI) a utilização do molde do passo Ck) para produzir múltiplas cópias da sequência alvo usando uma RNA-poli~ merase que reconhece o promotor» 4i§ = - Método de acordo com a reivindicação 4®» carac-tsrizado por a enzima do passo Ci) compreender uma RNAse H» 42su - Método de acordo com a reivindicação 4Θ5 carac™ terisada por o segundo iniciador ter uma sequência 55 relativa-mente a sequência de complexaçlo que inclui um promotor para uma RNA-pol imerase 43s= ·- Método de acordo com a reivindicação 425 carac— tsrizado por a enzima do passo <i> compreender uma RNAse H* 44§« - Método de acordo com a reivindicação 42 caracts-rizado ainda por compreender a utilização dos oligonuclsotideos s
    as cópias ds KMA para sintetizar autocrata 1 i ticamen te múltiplas cópias da sequência alvo. 45ã« - Método ds acordo com a reivindicação 445 csrsc-tsrizado por a enzima do passo Ci) compreender uma RNAse H« 461 = - Método ds acordo com a reivindicação 42 csracte-rizado ainda por compreendera <m> a utilização das cópias ds RNfi do passo (1)5 repetindo os passos (g) a Cl) para sintetizar autocataliticamente múltiplas cópias da sequência alvo. 471= — nétodo de acordo com a reivindicaçao 4é? carac-ierlzado por a enzima do passo ci) compreender uma RNfiss H. 481= - nétodo de sintese de cópias múltiplas de uma sequência de ácida nucleico alvo caracteri zado por compreendars Ca) o tratamento de um ácido nucleico alvo de cadeia simples que compreende uma sequência de DNA alvo coai um primeiro oligonucieotítieo o qual compreende um primeiro iniciador que tem uma sequência de complexaçao suficisntemente complementar da fracçSo terminal 3? da sequência alvo para complexar cqí?í sla em condições tais que se possa formar um complexo oligonucleoti·-dso/sequência alvo s seja iniciada a síntese de DNfip Cb) o prolongamento do iniciador numa reacçlo de extensão usando c§ alvo como molde para dar um DMA produto do prolongamento do iniciador complementar da sequência de DNA alvos <c> a separação do primeiro produto ds extensão do iniciador do alvo5
    Cd) o tratamento do DNA produto do extenslo da iniciador com um segundo oliqonucleotidso que compreende um iniciador ou um molde «splics& e que tem uma sequência de comple-· xacão suficientemente complementar da fracçSo terminal 35 da sequência alvo para se complexar com ela s uma sequência relativsmsnte è sequência de complsxação que inclui um promotor para uma RNft-polimerase, em condições tais que se possa formar um complexo oligonuclactídso/sequfncia alvo e seja iniciada a síntese de DNA5 ís) o prolongamento do extremo 3S do produto de extensão de iniciadores para lhe adicionar uma sequência complementar do promotor3 produzindo assim um molde para uma RNA-poli-msrases íf) a utilizaçSo do molde do passo (e) para produzir múltiplas cópias ds RNA da sequência alvo usando uma RNA-polimerase que reconhece o promotor. 491 = - Método ds acordo com a rsivindicaçlo 7= carscts-rizado ainda por compreenders (g) o tratamento das cópias ds RNA do passo íf) com o iniciador® em condições tais que se possa formar um complexa aliaonuclsotideo/sequência alvo s seja iniciada a síntese de DNfis ih) ο μΓυϊDnyaiiiSTítq da iniciador numa reacpSo ds extensão de liNA para tíar um produto tíe extensão do iniciadorn Ci> a separação do segundo DMA produto de extensão 00 iniciador tía cópia tíe RNA usando uma enzima que tísqrada selectivamenie a cópia ds RNAs ν' <j) ο tratamento do produto de extensão do iniciador com o molde «splice» em condições tais que se possa formar um complexo oi igonuc ieotídeo/sequfnc ia alvo e seja iniciada a síntese de DMA? % ik) o prolongamento do extremo 3g do produto de extensão do iniciador para lhe adicionar uma sequência complementar do promotor produzindo assim um molde para uma RNA-poIime-rases e (l) a utilização do molde do passo (k) para produzir múltiplas cópias da sequência alvo usando ussa RNA—polímeras© que reconhece o promotor= 5®â= - Método de acordo com a reivindicação 49» csrac-tsrizado por o extremo 3* da molde «splics» estar bloqueado» 5is= - Método de acordo com a reivindicaçlo 49 caracte-rizado ainda por compreender a utilização os aliaonucleotídeos e as cópias tíe RNA para sintetizar autocatalIticamente múltiplas cópias da sequência alvo» 52ã= - Método de acordo com a reivindicação 51s carac-terisado por a enzima do passo <i) compreender uma RNAse H= 53§ = - Método de acordo com a reivindicação 51» carac-terizada ainda por compreender? (m) a utilização das cópias de RNA do passo Cl), repetindo os passos Cg) a Cl) para sintetizar autocata1i ticamente múltiplas cópias da sequência alvo»
    ’o4ã» - Método do acordo com a reivindicação 03s carac-terizado por a enzima do passo Ci> compreender uma RNAse H. 55§ = - Método para sintetizar autocataliticaments múltiplas cópias do uma soquincia do ácido nucleico alvo sm condições substancialmente constantes de temperaturas força iónica s pH caracterizado por compreenders (a) a combinação de Cl) um ácido nucleico alvo que compreende uma sequência de RNA alvo de cadeia simpless C2> um primeiro oligonuc1eotídeo que compreende um iniciador que tem uma sequência de cosnolexação sufi-cientemente complementar da fracçlo terminal 3* da sequência de RNA alvo para se complexar coo; ela e que facultativamente tem uma sequência 55 rslativaments â sequência de complexação que inclui um promotor para uma RNA-polimarass§ C3) um segundo oligonucleotideo que compreende um iniciador ou um molde «splice» a que tem uma sequência de complexação suficientemente complementar da fracção terminal 3“ de um complemento da sequência alvo de RNA para se completar com ela3 desde que sa a primeiro oligonucleotideo não possua um promotor? então o segundo oligonucleotideo ê um molde «splice» que tem uma sequência 5S relativaments è sequência de complexação que inclui um promotor de uma RNA-ροΙimerasap <4> uma DNA—polimerase DMA—dependentes uma i/NA-polimerase ΚΙΜΑ—dependentejj
    (6) uma encima que degrada slectivaments a cadeia de RNA de um duplex RNAsDMA§ s </> uma RMH-poIisarass que reconhece o premofcory s <b) a incubação da mistura do passo Ca) em condi™ çSes de iniciação com DMA e de síntese de ácidos nucleiccs, que englobam temperatura, força iénica e pH substancialmente constan™ tss = 56d= - Método de acordo com a reivindicação oos carac™ tarisado por a enzima do passo Ca) Ca) compreender uma RNAse H,
  2. 571. - Método de adordo com a reivindicação 55 5 carac™ tericado por o primeiro iniciador ter um promotor* 58§* - Método de acordo com a reivindicação 57 5 carac™ terizado por α segundo α1igonuc1eotídeo compreender um segundo iniciador qua tem uma sequfncia 5* relativamente à sequtncia de compiexaçlo a qual inclui um promotor para uma RNA-polimerase» 59ã= ™ Método de acorda com a reivindicação 58* carac™ terizado por aa actividades de DMA™polimerase e ss actividades de RNAse H dependentes de DMA s dependentes tíe RNA compreenderem uma transcripiase reversa* é0§. - Método para sintetizar autocataliticamente ínúlfciplas cópias de uma sequfncia de àcitío nucleico alvo em condições substancialmen te constantes de temperatura ? força iónica e pH5 caracterizado por compreenderá Ca) a combinação de (1) ura ácido nucleico alvo que compreende uma ssqufncia de RNA alvog (2) uíti iniciador e um molde do «spiicings eis anti-codoss em qus um tem uma sequência da complexacSo suficisn-tements complementar da fraceSa tsroúnal 35 da sequência alvo do RNA alvo para se ccmplexar com sla s o outro tem uma sequência ds CGffiplSKaçSo suficientements complementar da fracçSa terminal 33 do complemento da sequência alvo para se complsxar com ela e em que o molde «splice»tsm uma sequência 55 relativamente à sequência ds complsxaçáo qus inclui um prometorp Í3> uma DNA-polimerase BNA—dependenteρ (4) uma DNA-ραlimerase RNA-dependentep ío> uma snsirna que degrada selectivaments a cadeia de RNA de um duplex RNAsDNAf e (ó) uma RNfi-pDlifflsrass que reconhece o promotor do molde «splice»s s (d) a incubação da mistura do passo Ca) em condi-ceies de iniciação com DMA e de síntese de ácidos nuclsicos, que englobam temperatura, força iónica e pH substanc ialmente constantes» êll» - Método para sintetizar autocataliticamente múltiplas eõpias de uma sequência de ácido nucleico alvo, carácter içado por§ (a) a combinação de
    íl) um ácido nuclelca alva que compreende uma sequência de DNA alvo ds cadeia simples? (2) um primeira iniciador que tem uma sequência de complexação suficientemente complementar da fracção terminal 35 da sequência alvo para se complexar com ela e uma sequência 55 relativamente á sequência de complexação que inclui um promotor para uma RNA-polimarasas (3) uma DMA-polimerasep Cb) a incubação da mistura do passo <a) em condições de iniciação com DNA e de síntese de ácidos nueleicos através das quais é sintetizado um produto ds extensão da iniciador complementar da sequência alvo usando a sequência alvo como moldes <c> o tratamento da mistura de reacçlo do passo (b) para sravac&r a separação dos duplexes de DMA Cd) a adiçlo à mistura de rsacçlo do passo Cc) des Cl) um segundo iniciador que tem uma sequência de complexação suficientemente complementar da fracção carminai 35 da sequência alvo do produto de extensão ds iniciadores para ss eomplsxar com ela» (2) uma DNA-polimerase DNfi-dependentes (3) uma DNA-ρα 1 isnerase RNA—dependente? %4> uma enzima que degrada slectivamente a cadeia ds RNA ds um duplex RMAsDNA| e (5) uma RNA-polimerass que reconhece o promotorh e Cs) a incabaçao da mistura do passo (d) em condi-çSss ds iniciaçlo com DMA e de si.ntsss ds ácidos nucIsieos;: qus englobam temperaturas força iónica e pH substancialmante constantes * 621« - Método para sintetizar autocataliticaments múltiplas cópias ds unsa sequfncia de ácido rmclsico alvo em condiçSes substancialment© constantes cie temperatura ? força iónica e pHs carscterisado por compreender? Ca) a combinação de Cl) um ácido nucleico alvo que compreende uma sequfncia alvos (Ξ) um primeiro oligonucleotidso que compreende um iniciador qus tem uma sequfncia ds complegação sufi— c lar» temente complementar da fracçao terminal 3* da sequfncia alvo para se complsxar com ela s que faculiativamenie tem uma sequfncia 5? rslativamente è sequfncia de complexação que inclui um promotor para uma RWA-ροΙimsrasss C3> um segundo oligonucleotideo que compreende um segundo iniciador ou um molde ds «splicing» e qus tem uma sequfncia de co®ple«açMo suficíentemente complementar da fracçao terminal 35 de um complemento da sequfncia alvo para se complexar com sla5 dssds qus ss o primeiro oligonucleotideo nSo possua um promotors então o segundo oliaonueleotitíeo -é um molde «splice» que tem uma sequfncia 5* relatívamente à sequfncia de complexação qus inclui um promotor de uma RNA—pclimerass? (4) uma DNA-polimerase LíNA-dependentej <5) uma DNA-polImerase RNft-dependsntef <ò> uma encima que degrada slectivaments a cadeia da RNA ds um duplsvi RNAúDNAf e <7> uma RlMA-polimsrases a <b> a incubação da mistura do passo ía> em condições de iniciação com DMA s ds síntese ds ácidos nuclaicosy que englobam temperaturaf força iénica e pH substancialmsnte constantes = 63i» - Método de acordo com a reivindicação 615 carac-tsricado por o primeiro oligonucleotídeo ter uma sequência ds promotor„ è4ã= - Método ds acordo com a reivindicação 625 csrac-tericado por a encima do passo (a) <6> compreender uma RMAss H» 65§.-. - Método ds acordo com a reivindicação 635 carac·· tsricado por a ensima do passo (a) <6> compreender uma actividads ds RNAse H na transcriptase reversa* òòã* - Método ds acorda com a reivindicação 64s carac-tsnzádD por a encima do passo (a) (5) compreender RHAse H SKégsns adicionada» carac- 6/§» - Método de acordo com a reivindicação 65 5 tericado por o segundo oligonucleotídeo ter um promotor»
    sriZâdQ èSã» - Método de acordo com a reivindicação ài, carac-por a enzima do passo ía> (6) compreender uma RNAss H« 691 = - nétodo de acordo com a reivindicação 67, carac-terizado por a enzima do passo (a) C6> compreender uma actividads tís RNAss H na transcriptase reversa= 7®ã» - Método de acordo com a reivindicação 67, carácter izado por a enzima do passo <a> (6) compreender RNAss H exógena adicionada =, 711,= - Método para sintetizar múltiplas cópias de uma ssqutncis de ácido nucleico alvo caracterizado por compreenders (a) a selscçao de um iniciador, complementar de uma fracçSo de uma sequência de RNA alvo, o qual se complexa com a referida fracção do RNA alvo situada de tal modo que permanece praticame-nte nSo degradadas \b> a selecção de uns promotor-iniciador? complementar da uma fracção do DNA obtida por extensão do referido iniciador» que se complexa com o DNA numa área, em que sabstan— cialmsnts todo o RMA è removido do duplex por degradação do referido RNfij e (c) a combinação do referido RMA alvo com o retendo promotor-iniciador, transcriptase reversa tendo associadas actividades de RNAse H s transcriptase s formação de múltiplas cópias da referida sequência de ácido nucleico alvo» carac- 721« - Método de acordo com a reivindicação 71,, terizado por a RNAss H exógena ser adicionada no passo Cc> = 73â, ~ Método ds acordo com a reivindicação 72, carac-tsrizado por a transcriptase reversa do passo <c> nao ter activi-dads do RNftse H associada, 74â, - nétodo para sintetizar múltiplas cópias ds uma ssqu‘@ncia ds ácido nucleico alvo, caractsrizado por compreenders (a) s selecção de um iniciador, complementar ds uma fracçSo de uma seqifincis de RNfi alvo, o qual se complexa com a referida fracção do RMA alvo situada de tal modo que permanece capaz ds formar um produto de extensão do iniciador após ter sido exposta à degradação por uma RMrss H ssleccionadan (b) a selecção de um promotor-iniciador, complementar ds uma fracção do DNA obtida por extensão do referido iniciador, que se complexa com o DMA numa área em que substancialmente todo o RWA é removido do duplex por degradação do referido RMAp e (c> a combinação do referido RNA alvo com o referido promotor-iniciador, transcriptase reversa tendo associadas aciividades ds RNAse H e transcriptase e formação de múltiplas cópias da referida ssqufncia ds ácido nucleico alvo, 75s, -- Método ds acordo coo a reivindicação 71, carac-tsrizado por a RNAse H exógena ser adicionada no passo <c>, 7è‘!= - Método ds acordo com a reivindicação 72, carac-tsrizado por a transcriptase reversa do passo Cc) não ter activi-dade de RMAse H associada, /7ã = - Método para sintetizar múltiplas cópias tís uma sequãncia de ácido nucleico alvo, caracterizado por compreender (a) a selscçlo de um iniciador, complementar de uma fraeção de uma ssqusncia de RNA alvo, o qual ss cotiipleKa com a referida fracçSo do RNA alvo situada de tal modo que permanece praticamente nao degradadaf (. o) a selscção da um profisatar—iniciador 5 complementar de uma fracçlo do DNA obtida por extensão do referido iniciador, que se complexa com o DNA numa área em que substan— cialmsnte todo o RNA é removido do duplex por degradação do referido RNA § a tc) a cofRbinaçSo do referido RIMA alvo com o referida promotor-iniciador, transcriptase reversa tendo associadas actividades de RNAse H e transeriptase e formação de múltiplas cópias da referida RNA e múltiplas cópias ds DNA complementar qg referido RNA sem se fazer um número substancialmente equivalente de cópias ds DNA da mesma polaridade da referida BsqusfuciB ds RNA alvo, 78§» - Método de acordo com a reivindicação 77, carac-tsricado por a RNAse H exógena ser adicionada no passo (c)a 79ã, - Método de acordo com a·reivindicaçlso 78, carac-terícatío por a transcriptase reversa da passa íc> não ter activi— dade ds RMAse H associada, 8®§:= - nétodo para sintetizar múltiplas cópias ds unia sequfncia ds ácido nucleico alvo, caracterizado por compreenderi fa) a selecçla de um iniciador, complementar de uma TracçSo de uma sequência de RNA alvo, o qual se complexa com a referida fraeçãa da RIMA alvo, a referida fracçlo do RNA alvo situada de tal modo que permanece capaz de formar um produto de
    extensão do iniciador após ter sido exposta à. degradação par u.cna RNAse H seIaccionada§ (b) a sslecçSo de um promotor-iniciador* complementar ds uma fracção do DNA obtida por extensão da referido iniciador* que se complexa com o DNA numa área em que sabstan-eialments todo o RNA è removido do duplex por degradação da referido RNA = s <c> a combinação do referido RNA alvo com o referido promotor-iniciador* transcriptase reversa tendo associadas actívidades ds RNAss H e transcriptase e formação de múltiplas cópias ds DNA complementar do referida RNA sem se fazer um número substaneialmente equivalente ds cópias ds DMA da mesma polaridade da referida ssqufncia ds RNA alvo* 81â. - Método de acordo com a reivindicação B©* carac-tsrlzado por a RMAse H exógena ser adicionada no passo <c)=
  3. 821. - Método de acordo com a reivindicação 81* carac-terizado por a transcriptase reversa do passa <c) não ter activi-dada ds RMAse H assoeiada=
  4. 831. - Método para sintetizar múltiplas cópias de uma sequência ds ácido nucleico alvo* caracterizado por compreenders <a> a sslscção ds um iniciador* complementar ds uma traeçao de uma sequência de RNA alvo* o qual se complexa com a referida fracção do RNA alvo* a referida fraeção do RNA alvo situada de tal modo que permanece capaz ds formar um produto de extensão da iniciador após ter sido exposta à degradação par uma RNfiss H selsccionadaj
    (ta) a selecção tíe uns prorootor—iniciador? compls-iBsntar de uma fracçSo do DNft obtida por extensão do referido iniciador5 que se complexa com o DNA numa área em que uma quantidade suficiente do extremo 55 do referida RNA é removido do duplex de modo a permitir ainda o prolongamento do DNA produto de extensão do iniciador para produzir um complemento do referido promotor-iniciador § s (c) a combinação do referido RNA alvo com o referido promotor-iniciador¥ transcriptass reversa tendo associadas actividades de RNAss H e transcriptass s formação de múltiplas cópias da referida sequtncia de ácido nucleico alvoB 84ã„ - Método de acordo com a reivindicação 835 csrac-tsrizado por a RNAse H exógena ser adicionada no passo íc>» 85ã„ - Método de acordo com a reivindicação 84? csrac-terieado por a transcriptass reversa do passo Cc) não ter activi-dada de RMAse H associada* 86â,= - Método para sintstiear múltiplas cópias de uma sequtncia de ácido nucleico alvo* caracterizado por compreender;; ía) selecçlo de um iniciador, complementar de uma frscçlo cie uma sequtncia ds RNA alvo5 o qual se complexa com a referida fracçSo do RNA alvo, a referida fracçSo do RNA alvo situada ds tal modo que permanece capas de formar um produto da extensão do iniciador após ter sido exposta à degradação por uma RNftss H seleceionadap <h> a selecção de um promotor-iniciador5 complementar os uma tracçifio do Dnh ootida por extensão tío referido iniciador,: que se complexa com o DNA numa área em que
    uma quantidade suficiente do extremo 55 do referido RIMA é removido de modo a permitir que o referido promotor-iniciador se complexa com o extremo 3S da referida DMA obtida par extensão da referida iniciador» <c> s combinação da referida RflA alvo com o referido promotor-iniciador» transcriptass reversa tenda associadas actividades de RNAse H e transcriptass e formação de múltiplas cópias da referida sequência de ácido nucleico alvo» 87§» - Método de acordo com a reivindicação 86» carac- berizatío por a RNAse H exógena ser adicionada no passo <c>= S8ã» - Método de acordo com a reivindicação 37» carae- terizado por a transcriptass reversa do passo íc) nlo ter activi-d&de de RNAse H associada» 89â= - Método para sintetizar múltiplas cópias ds uma sequência de ácido nucleico alvo» caracterizado por compreenders (a) o tratamento de um ácido nucleico que compreenda uma sequência de RNA alvo com um primeiro oligonuclsotí-dso que compreende um primeiro iniciador tendo uma sequência ds complsxaçlo suficientemente complementar da fracção terminal 39 aa sequência alvo para ss complexsr com ela em condições que permitem o inicio da síntese de DMA? ib) d prolongamento do iniciador numa rescçSo de extensão usando o alvo coroa molde para dar um DMA produto de extensão do iniciador complementar do RIMA alvog (c) a digestão selectiva ao extremo 53 do referido RNA alvo5 Cd) o tratamento do DMA produto de extensão do iniciador com um segundo oligormclsotideo que compreende um iniciador ou um molde «splice» s que tem uma sequência de comple-azçMa suficientemente complementar da fracçSa terminal 39 do referido DMA produto de extensão cio iniciador em condiçSes qus permitam o início da síntese de DMA;; (e) o prolongamento do extremo 39 do produto de extensão ao primeiro iniciador numa reaeçSo ds extensão de DMA para produzir um molde para uma RMA-polimerases e ir) a utilização do molde do passo Ce) para produzir múltiplas cépias de RNA da sequência alva ussnda uma RKA-ραlimerase que reconhece a sequência do promotor„ 9&Ê* - Método de acordo com a reivindicação 89 ? carac-terizado por d passo ds degradação do passo (c) ser enzimático- 9íâ„ - Método ds acordo com a reivindicação 9Θ? carac~ tsrizado por utilizar RNAse H para a degradação snzimática. 92§L - método de acordo com a reivindicação 8Φ caracts-rizado ainda por compreender a utilização de oligonucleotideos s cópias de RNA para sintetizar autocataliiicamsnte múltiplas copias da sequência alvo* Lisboa? 11 da Julho de 199®
    J. PEREIRA DA CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 10-A 3« 1200 LISBOA
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